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WO2019202994A1 - サイズ排除クロマトグラフィ担体、その製造方法、および微小物質の回収方法 - Google Patents

サイズ排除クロマトグラフィ担体、その製造方法、および微小物質の回収方法 Download PDF

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Publication number
WO2019202994A1
WO2019202994A1 PCT/JP2019/014825 JP2019014825W WO2019202994A1 WO 2019202994 A1 WO2019202994 A1 WO 2019202994A1 JP 2019014825 W JP2019014825 W JP 2019014825W WO 2019202994 A1 WO2019202994 A1 WO 2019202994A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
exclusion chromatography
size exclusion
carrier
hydrophilic organic
amount
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2019/014825
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English (en)
French (fr)
Inventor
久美子 諏訪
中島　亮
慎之介 有光
浩嘉 宮原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AGC Si Tech Co Ltd
AGC Inc
Original Assignee
Asahi Glass Co Ltd
AGC Si Tech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asahi Glass Co Ltd, AGC Si Tech Co Ltd filed Critical Asahi Glass Co Ltd
Publication of WO2019202994A1 publication Critical patent/WO2019202994A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/283—Porous sorbents based on silica
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B01J20/288—Polar phases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B37/00—Compounds having molecular sieve properties but not having base-exchange properties
    • C01B37/02—Crystalline silica-polymorphs, e.g. silicalites dealuminated aluminosilicate zeolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a size exclusion chromatography carrier, a method for producing the size exclusion chromatography carrier, and a method for collecting a minute substance.
  • extracellular vesicles such as exosomes as biomarkers
  • the use of extracellular vesicles requires a technique for isolating and purifying extracellular vesicles from a biological sample, and conventionally, for example, differential centrifugation including an ultracentrifugation step has been used.
  • differential centrifugation including an ultracentrifugation step has been used.
  • the method using ultracentrifugation requires special equipment and takes time to recover, and the purity is not sufficient, so it cannot be diagnosed with high accuracy, so that extracellular vesicles can be recovered efficiently. There is a need for a method that can do this.
  • Patent Document 1 as a method for easily fractionating extracellular vesicles based on size, polyethylene glycols having different molecular weights are mixed with a biological sample, and then a precipitate is obtained by centrifugation. A method for fractionating outer vesicles has been proposed. In the method described in Patent Document 1, although the amount of extracellular vesicles recovered is large, since the extracellular vesicles are precipitated by binding with polyethylene glycol, it is difficult to separate them. It was.
  • Patent Document 2 describes a technique for subjecting porous silica particles having high alkali resistance to surface treatment according to the type of chromatography, and includes an affinity chromatography carrier, a cation exchange chromatography carrier, an anion exchange chromatography carrier, Examples include reverse phase chromatography carriers, size exclusion chromatography carriers and the like.
  • the technique of Patent Document 2 is optimized for protein purification using a method of adsorbing a protein using a ligand and recovering the adsorbed protein, and the technique of Patent Document 2 can be used as it is.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is a size-exclusion chromatography carrier capable of efficiently recovering a biologically-derived minute substance, particularly an extracellular vesicle, without losing physiological activity, and the size.
  • An object is to provide a method for producing an exclusion chromatography carrier.
  • Another object of the present invention is to provide a method for efficiently recovering biologically-derived minute substances, particularly extracellular vesicles, without losing physiological activity.
  • the present invention has the following configuration.
  • a carrier for size exclusion chromatography having inorganic porous particles and a hydrophilic organic material layer immobilized on the surface of the inorganic porous particles, wherein the amount of carbon in the carrier is 1.5% by mass Size exclusion chromatography carrier that is ⁇ 10% by weight.
  • a method for producing a size exclusion chromatography carrier according to any one of [1] to [10] A method for producing a size-exclusion chromatography carrier, comprising applying a hydrophilic resin having a mass average molecular weight of 200 to 2000 to the surface of the inorganic porous particles as the hydrophilic organic material layer and curing the hydrophilic resin.
  • a method for producing a size exclusion chromatography carrier according to any one of [1] to [10] Applying the hydrophilic organic layer forming composition containing a precursor of a hydrophilic resin having a mass average molecular weight of 200 to 2000 to the surface of the inorganic porous particles as the hydrophilic organic layer, and curing the composition.
  • a method for producing a size exclusion chromatography carrier [13] The production method according to [12], wherein the precursor of the hydrophilic resin contains three or more diol groups and has a mass average molecular weight of 200 to 2,000. [14] The production method according to [12] or [13], wherein the precursor of the hydrophilic resin includes at least one selected from glycerol polyglycidyl ether and polyglycerol polyglycidyl ether. [15] A method for recovering a minute substance from a cell culture supernatant or a biological fluid using the size exclusion chromatography carrier according to any one of [1] to [14].
  • a size exclusion chromatography carrier capable of efficiently recovering a biologically-derived minute substance, particularly an extracellular vesicle, without losing physiological activity
  • a method for producing the size exclusion chromatography carrier can be provided.
  • the present invention can also provide a method for efficiently recovering a biologically-derived minute substance, particularly an extracellular vesicle, without losing physiological activity.
  • a value representing a numerical range includes an upper limit value or a lower limit value of the range.
  • the size exclusion chromatography carrier of the present invention (hereinafter also simply referred to as “carrier”) has inorganic porous particles and a hydrophilic organic material layer immobilized on the surface of the inorganic porous particles,
  • the amount of carbon is 1.5% by mass to 10% by mass.
  • the inorganic porous particles included in the carrier of the embodiment are usually particles having a large number of pores on the surface.
  • the carrier has a hydrophilic organic layer on the surface of the inorganic porous particles, and the amount of carbon in the carrier is 1.5% by mass or more and 10% by mass or less.
  • the amount of carbon in the carrier is an index indicating the amount of organic material in a layer containing an organic material such as a hydrophilic organic material layer of the carrier. Even when the carrier has a layer containing an organic substance such as a hydrophilic organic substance layer, if the carbon content in the carrier is 10% by mass or less, the organic substance such as the hydrophilic organic substance layer is formed on the surface of the inorganic porous particles.
  • the layer containing can follow. Therefore, the surface of the carrier of the embodiment has a large number of pores substantially the same as the surface of the inorganic porous particles.
  • the carrier has a hydrophilic organic layer on the surface and the amount of carbon in the carrier is 1.5% by mass or more, the hydrophilic organic layer on the surface of the carrier when the biological sample passes through the column.
  • the hydrophilic organic layer on the surface of the carrier when the biological sample passes through the column.
  • the ratio of the amount of carbon in the hydrophilic organic layer to the total amount of the carrier is preferably 1.5% by mass or more, and thereby it is possible to effectively suppress the adherence of biological components to the carrier surface.
  • the ratio of the carbon amount is more preferably 1.75% by mass or more.
  • the amount of carbon in the carrier is 10% by mass or less, preferably 9% by mass or less.
  • the ratio of the carbon amount of the hydrophilic organic layer to the total amount of the carrier is 10% by mass or less, and 9% by mass or less. preferable.
  • the amount of carbon in the carrier can be obtained, for example, by analyzing the carrier by elemental analysis.
  • the carbon amount of the inorganic porous particles is 0 (zero). Therefore, the carbon amount of the layer containing an organic substance such as the hydrophilic organic substance layer is equal to the carbon amount contained in the carrier.
  • the content of nitrogen atoms (N) in the carrier (hereinafter also referred to as “N amount”) is preferably 0.5% by mass or less.
  • the N amount is more preferably 0.1% by mass or less, and further preferably 0.01% by mass or less.
  • the content of chlorine atoms (Cl) in the carrier (hereinafter also referred to as “Cl amount”) is preferably 0.5% by mass or less.
  • Cl amount is more than 0.5% by mass, not only the recovered amount may be lowered, but also the physiologically active function of the minute substance may be impaired.
  • a Cl content of 0.01% to 0.5% by mass is preferred from the viewpoint of industrial productivity.
  • the amounts of N and Cl in the carrier can be obtained, for example, by analyzing the carrier by a known elemental analysis method such as fluorescent X-ray analysis or CHN elemental analysis.
  • the carrier of the embodiment may contain components other than the inorganic porous particles and the hydrophilic organic material layer as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the carrier of the embodiment may have an adhesion layer between the inorganic porous particles and the hydrophilic organic material layer in order to improve the adhesion of the hydrophilic organic material layer to the inorganic porous particles.
  • the inorganic porous particles and the hydrophilic organic layer constituting the carrier of the embodiment, and the adhesion layer as an optional component will be described.
  • the inorganic porous particle is not particularly limited as long as it is a porous particle having an inorganic material as a constituent material and having pores on at least the surface, which is conventionally used in size exclusion chromatography.
  • Examples of inorganic materials include metal oxides, glass, and ceramics.
  • Examples of the metal oxide include silicon oxide (silica), aluminum oxide (alumina), and zirconium oxide. These may be used alone or in combination of two or more. When using 2 or more types, a mixture may be sufficient and complex oxide may be sufficient.
  • the inorganic material preferably contains a metal oxide, particularly silica as a main component.
  • the inorganic material may contain an inorganic component other than the metal oxide, for example, a phosphate.
  • that an inorganic material contains a metal oxide as a main component means that 70 mass% or more of a metal oxide is included with respect to the total amount of the inorganic material.
  • the inorganic porous particles are preferably spherical. The spherical shape can prevent the pressure loss from increasing.
  • porous silica particles made of an inorganic material containing silica as a main component are preferable, and silica gel is particularly preferable.
  • the inorganic material containing silica as a main component may include zirconium oxide, phosphate, and the like.
  • silica gel those containing 99% by mass or more, preferably 99.9% by mass or more, more preferably 99.99% by mass or more of silicon oxide are used.
  • the pore volume and pore diameter of the inorganic porous particles can be optimized according to the type of target sample and the size of the target fraction component in size exclusion chromatography.
  • the pore volume and pore diameter of the inorganic porous particles can be measured by a mercury intrusion method.
  • the pore volume of the inorganic porous particles is preferably 0.8 mL / g to 2.5 mL / g.
  • the pore volume is more preferably 1.0 mL / g or more, and further preferably 1.5 mL / g or more. If the pore volume of the inorganic porous particles is larger than 2.5 mL / g, the particle strength generally decreases, which is not preferable.
  • the pore volume is more preferably 1.95 mL / g or less, further preferably 1.9 mL / g or less.
  • the pore diameter of the inorganic porous particles is preferably 40 nm to 115 nm, and preferably 70 nm to 110 nm, for example, when fractionating a fine substance having an average particle diameter of about 50 to 100 nm from a sample. Is more preferable. This is, for example, an average pore size suitable for separating and purifying exosomes from a biological sample. For example, when fractionating a fine substance having an average particle size of about 70 to 150 nm from a sample, the average pore size is preferably 80 nm to 115 nm, and more preferably 90 nm to 115 nm.
  • the pore diameters are uniform, and when the pore distribution is obtained by a mercury intrusion method, the distribution is preferably sharp.
  • the value obtained by dividing the half width of the main peak of the pore distribution curve by the pore diameter of the peak top of the main peak is preferably 0.6 or less, and 0.5 or less Is more preferable.
  • the average particle size of the inorganic porous particles is preferably 1 to 500 ⁇ m, more preferably 7 to 200 ⁇ m, and particularly preferably 10 to 160 ⁇ m.
  • the average particle diameter of the inorganic porous particles is the average particle diameter of aggregated particles (secondary particles) in which primary particles are aggregated.
  • the average particle diameter is a 50% integrated value (D50) obtained from a volume-based particle size distribution measured by a laser diffraction / scattering method.
  • the inorganic porous particles have a uniform particle size distribution because the separation performance is improved. More specifically, the particle diameter is 10% (D10) when the cumulative particle size or volume-based cumulative amount is 10% of the total particle amount (D10), and 90% when the particle size is 90%. When setting it as a diameter (D90), it is preferable in the value of D90 / D10 being 3 or less.
  • the particle diameter means a value measured by a laser diffraction / scattering method including an average particle diameter.
  • D90 and D10 when calculating the value of D90 / D10 are values measured by the electric resistance method.
  • the shape of the inorganic porous particles is not particularly limited.
  • a so-called crushed material can be used, but a spherical material can be suitably used from the viewpoints of packing into a column used for size exclusion chromatography and suppression of pressure loss during operation.
  • a spherical shape including a true sphere and an ellipsoid is preferable, and a shape close to a true sphere is particularly preferable.
  • the adhesion layer is a layer for firmly adhering both arbitrarily provided between the inorganic porous particles and the hydrophilic organic material layer.
  • the adhesion layer is preferably formed using a coupling agent having both a reactive group on the surface of the inorganic porous particle and a reactive group on the hydrophilic organic layer in one molecule.
  • a coupling agent an organometallic coupling agent is preferable.
  • a silane coupling agent, a titanium coupling agent, an aluminum coupling agent, or the like can be used, and a silane coupling agent is preferable.
  • the organometallic coupling agent is preferably a compound in which a hydrolyzable group is bonded to a metal atom (Si, Ti, Al, etc.) and an organic reactive group having reactivity with a hydrophilic organic substance or its raw material. Is appropriately selected depending on the constituent material of the hydrophilic organic layer.
  • the hydrophilic organic material layer preferably has a glycidyl group as described below.
  • the organic reactive group is preferably a group having an epoxy group, a carboxy group or a hydroxyl group at the terminal, and an organic reactive group having an epoxy group is preferable.
  • a silane coupling agent having an epoxy group is preferably used.
  • the silane coupling agent having an epoxy group ⁇ -glycidoxypropyltrimethoxysilane, ⁇ -glycidoxypropylmethyldiethoxysilane, ⁇ - (3,4-epoxycyclohexyl) ethyltrimethoxysilane, etc. can be used. .
  • a coupling agent such as an organometallic coupling agent and the inorganic porous particles may be brought into contact under a predetermined temperature condition.
  • the OH group bonded to the metal oxide or the metal atom of the glass on the surface of the inorganic porous particle reacts with the hydrolyzable group of the organometallic coupling agent.
  • the temperature during the reaction is preferably 30 to 400 ° C, more preferably 100 to 300 ° C.
  • the reaction time, that is, the contact time is preferably 0.5 to 40 hours, and more preferably 3 to 20 hours.
  • the contact between the coupling agent and the inorganic porous particles is preferably performed in the presence of a solvent.
  • Any solvent can be used without particular limitation as long as it does not react with the coupling agent and is stable at the reaction temperature.
  • Benzene, toluene, xylene, octane, isooctane, tetrachloroethylene, chlorobenzene, bromobenzene, etc. from the viewpoint of the solubility of the coupling agent, boiling point, and affinity with other solvents (ie, removal during washing) are preferably used.
  • the reaction by contact is desirably performed under reflux of the solvent used.
  • a catalyst made of an amine compound such as triethylamine, pyridine, N, N-diisopropylethylamine may be used.
  • the amount of the coupling agent to be immobilized is preferably an amount that densely covers the entire surface of the inorganic porous particles from the viewpoint of enhancing the adhesion between the inorganic porous particles and the hydrophilic organic material layer.
  • the immobilization amount of the coupling agent per specific surface area of the inorganic porous particles is 1.5 ⁇ mol / m 2 or more. Is preferable, 1.5 to 50 ⁇ mol / m 2 is more preferable, and 2.5 to 50 ⁇ mol / m 2 is particularly preferable.
  • the amount of the coupling agent immobilized per unit mass of the inorganic porous particles is preferably 45 ⁇ mol / g or more, more preferably 50 to 320 ⁇ mol / g, and particularly preferably 100 to 300 ⁇ mol / g.
  • the specific surface area of the inorganic porous particles can be measured by, for example, a mercury intrusion method. Further, the amount of the coupling agent immobilized is determined based on a known method. For example, based on the carbon content measured by elemental analysis for the inorganic porous particles after fixing the coupling agent, that is, the inorganic porous particles with an adhesion layer, the amount of carbon contained in one molecule of the coupling agent, And the immobilization amount of the coupling agent can be calculated using the specific surface area of the inorganic porous particles.
  • the organic reactive group of the coupling agent may be further subjected to a treatment for enhancing the reactivity with the hydrophilic organic substance.
  • a treatment for enhancing the reactivity with the hydrophilic organic substance for example, when the organic reactive group that the coupling agent has has an epoxy group, the inorganic porous particles with an adhesive layer may be treated with an acid such as hydrochloric acid to ring-open the epoxy group to form a diol.
  • the carbon amount of the adhesion layer should not exceed the carbon amount of the entire carrier.
  • the carrier is composed of inorganic porous particles, an adhesion layer, and a hydrophilic organic material layer
  • the total carbon amount of the adhesion layer and the hydrophilic organic material layer is adjusted to be within the range of the carbon amount of the entire carrier.
  • the N amount and Cl amount of the adhesion layer do not exceed the N amount and Cl amount of the entire carrier.
  • a hydrophilic organic substance layer is a layer which comprises the outermost layer of the support
  • the hydrophilic organic material layer is made of a hydrophilic organic material having a hydrophilic group, and usually contains a hydrophilic resin having a hydrophilic group.
  • hydrophilic resins include resins having polysaccharides such as agarose and cellulose, resins having an amide group such as polyacrylamide, acrylic resins having a methacrylic ester group such as 2-hydroxylmethacrylate, and diol groups. And a resin having a polyoxyethylene group.
  • the hydrophilic organic material may be composed of only a hydrophilic resin, may contain an adhesion component that causes the inorganic porous particles and the hydrophilic organic material layer to adhere to each other, or may contain other optional components.
  • the hydrophilic group possessed by the hydrophilic organic substance is preferably a group that does not adsorb biological components. Specifically, a diol group, a polyoxyethylene group, and the like are preferable, and a polyoxyethylene group and a diol group are particularly preferable. In particular, it is preferable to have a polyoxyethylene group or a diol group on the surface of the hydrophilic organic layer from the viewpoint of preventing non-specific adsorption without affecting the surface of the biological sample.
  • the ratio of the amount of Cl in the hydrophilic organic layer to the total amount of the carrier is preferably 0.5% by mass or less from the viewpoint of keeping the amount of Cl in the carrier within the above range. When the amount is more than 0.5% by mass, the amount of Cl in the carrier may exceed the above range.
  • a ratio of the amount of Cl in the hydrophilic organic layer to the total amount of the carrier is preferably 0.01% by mass to 0.5% by mass from the viewpoint of industrial productivity.
  • the ratio of the N amount of the hydrophilic organic layer to the total amount of the carrier is preferably 0.5% by mass or less from the viewpoint of keeping the N amount in the carrier within the above range.
  • the ratio of the N amount of the hydrophilic organic layer to the total amount of the carrier is more preferably 0.1% by mass or less, and further preferably 0.01% by mass or less.
  • the hydrophilic organic substance usually has a hydrophilic group because the hydrophilic resin it contains has a hydrophilic group.
  • the hydrophilic resin include the above-described resins having a hydrophilic group, and a resin having a diol group is particularly preferable.
  • the resin having a diol group is preferable in that it has a crosslinked structure, so that the hydrophilic organic layer can have a dense structure.
  • the resin having a diol group is preferably a cured product of a compound having a plurality of glycidyl groups in one molecule (hereinafter referred to as “polyepoxide”).
  • Polyepoxide is a raw material component of a resin having a diol group, and is also referred to as a “precursor” in the present specification.
  • the number of glycidyl groups in the polyepoxide may be two or more, and three or more are preferable from the viewpoint of increasing the number of crosslinking points. From the viewpoint of availability, the number of glycidyl groups is preferably 10 or less.
  • a hydrophilic organic layer is formed using a polyepoxide
  • a reactive group of a glycidyl group or a cross-linking agent described later is bonded to a reactive group on the surface of the inorganic porous particle or an adhesion layer in the process of curing the polyepoxide.
  • it reacts with the reactive group on the surface of the adhesion layer and crosslinks between molecules.
  • the hydrophilic organic material layer is immobilized directly on the surface of the inorganic porous particles or, if it has an adhesion layer, it is immobilized on the surface of the inorganic porous particles via the adhesion layer.
  • the hydrophilic organic material layer is immobilized on the surface of the inorganic porous particles when the hydrophilic organic material is immobilized through a layer existing between the inorganic porous particles and the hydrophilic organic material layer. including.
  • the hydrophilic organic layer formed using polyepoxide in this way a plurality of diol groups remain by hydrolysis.
  • the diol group is also present inside the hydrophilic organic material layer, but is particularly present on the surface and contributes to the property of not adsorbing biological components on the surface of the hydrophilic organic material layer.
  • polyepoxide examples include glycidyl ether-based polyepoxide, glycidyl ester-based polyepoxide, glycidylamine-based polyepoxide, and cyclic aliphatic polyepoxide, which are used as a raw material component of a normal cured epoxy resin.
  • a polyepoxide having a structure in which a glycidyloxy group is substituted for a phenolic hydroxyl group of a polyphenol having two or more phenolic hydroxyl groups or an alcoholic hydroxyl group of a polyol having two or more alcoholic hydroxyl groups (or a polyepoxide of the polyepoxide).
  • a glycidyl ether polyepoxide which is an oligomer) is preferred.
  • glycidyl ether polyepoxides obtained from aliphatic polyols are preferred.
  • aliphatic polyols include alkane polyols, etheric oxygen atom-containing polyols, sugar alcohols, polyoxyalkylene polyols, and polyester polyols.
  • the polyoxyalkylene polyol is obtained by ring-opening addition polymerization of a monoepoxide such as propylene oxide or ethylene oxide to a relatively low molecular weight polyol such as an alkane polyol, an etheric oxygen atom-containing polyol or a sugar alcohol.
  • the polyester polyol includes a compound having a structure in which an aliphatic diol and an aliphatic dicarboxylic acid are condensed, a compound having a structure in which a cyclic ester is ring-opening polymerized, and the like.
  • glycidyl ether-based polyepoxide derived from an aliphatic polyol examples include ethylene glycol diglycidyl ether, propylene glycol diglycidyl ether, dipropylene glycol diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether, 1,4-butanediol diglycidyl.
  • Ether 1,6-hexanediol diglycidyl ether, glycerol polyglycidyl ether, diglycerol polyglycidyl ether, trimethylolpropane polyglycidyl ether, sorbitol polyglycidyl ether, pentaerythritol polyglycidyl ether, polyethylene glycol diglycidyl ether, polyoxypropylene Diol diglycidyl ether, polyoxypropylene triol tri Glycidyl ether, poly (oxypropylene-oxyethylene) triol triglycidyl ether and the like.
  • Such polyepoxides include, for example, triol triglycidyl ether, tetraol tetraglycidyl ether, a mixture of triol triglycidyl ether and the same triol diglycidyl ether, tetraol tetraglycidyl ether, triglycidyl ether and diol.
  • triol triglycidyl ether tetraol tetraglycidyl ether
  • a mixture of triol triglycidyl ether and the same triol diglycidyl ether tetraol tetraglycidyl ether
  • triglycidyl ether and diol examples thereof include a mixture of glycidyl ether, a mixture of triglycidyl ether of triol and diglycidyl ether of diol, and the like.
  • glycerol polyglycidyl ether diglycerol polyglycidyl ether, polyglycerol polyglycidyl ether, trimethylolpropane polyglycidyl ether, pentane having an average number of glycidyl groups per molecule of preferably 3 to 10 is preferable.
  • examples include erythritol polyglycidyl ether and sorbitol polyglycidyl ether.
  • glycerol polyglycidyl ether polyglycerol polyglycidyl ether and the like are preferable as the polyepoxide which is a raw material component of the resin having a diol group, and polyglycerol polyglycidyl ether is particularly preferable.
  • the mass average molecular weight (Mw) of the polyepoxide is preferably 200 to 2000, and more preferably 550 to 1800. If the Mw is 200 or more, the surface of the inorganic porous particles can be sufficiently covered, and if it is 2000 or less, the surface treatment can be performed while maintaining the shape of the pores on the surface of the inorganic porous particles. Is possible.
  • Mw in this specification says the mass mean molecular weight which uses polystyrene as a standard measured by gel permeation chromatography (GPC).
  • the epoxy equivalent in polyepoxide (gram number of resin containing 1 gram equivalent of epoxy group [g / eq]) is preferably 120 to 200 g / eq, more preferably 140 to 185 g / eq.
  • polyepoxide Commercially available products can be used as the polyepoxide.
  • all manufactured by Nagase ChemteX Corporation are trade names of glycerol polyglycidyl ether, Denacol EX-313 (Mw: 383), Denacol EX-314 (Mw: 454), Polyglycerol
  • polyglycidyl ethers such as Denacol EX-512 (Mw: 630), Denacol EX-521 (Mw: 1294), and sorbitol polyglycidyl ether include Denacol EX-622 (Mw: 930).
  • the resin having a diol group may be a resin having a diol group generated by hydrolysis after crosslinking and curing by reaction between glycidyl groups of the polyepoxide, and a reactive group that reacts with the polyepoxide and the glycidyl group of the polyepoxide.
  • a resin having a diol group produced by hydrolysis after crosslinking by a reaction with a crosslinking agent having two or more thereof may be used.
  • the reactive group possessed by the crosslinking agent include amino groups having active hydrogen, carboxy groups, and thiol groups.
  • Specific examples of the crosslinking agent include polyamines, polycarboxylic acid anhydrides, polyamides, polythiols and the like.
  • the resin having a diol group used in the hydrophilic organic material a resin having a diol group generated by hydrolysis after crosslinking and curing by reaction between glycidyl groups of polyepoxide is preferable in consideration of the above-mentioned N amount and the like.
  • a curing catalyst is usually used in order to obtain a resin having a diol group generated by hydrolysis after curing the polyepoxide. Therefore, the hydrophilic organic substance may contain a curing catalyst together with a resin having a diol group.
  • organic substances having a polyoxyethylene group used for hydrophilic organic substances include 2- [METHOXY (POLYETHYLENEOXY) 6-9PROPYL] TRIMETHOXYXYLLANEXYY -24PROPYL] TRIMETHOXYSILANE (all are Gerest).
  • the curing catalyst examples include curing catalysts such as tertiary amines, imidazoles, Lewis acids, onium salts, dicyandiamides, organic acid dihydrazides, and phosphines.
  • a catalyst-type curing agent examples include 2-methylimidazole, 2-ethyl-4-methylimidazole, tris (dimethylaminomethyl) phenol, boron trifluoride-amine complex, dicyandiamide, diphenyliodonium hexafluoro.
  • Examples include phosphate, triphenylsulfonium hexafluorophosphate, tris (pentafluorophenyl) borane, and boron trifluoride.
  • tris (pentafluorophenyl) borane, boron trifluoride and the like that do not contain a nitrogen atom are preferable.
  • the amount of the curing catalyst with respect to the polyepoxide is preferably 1 to 20 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the polyepoxide or, when a crosslinking agent is used, with respect to 100 parts by mass in total of the polyepoxide and the crosslinking agent. Part is more preferable, and 1 to 5 parts by weight is particularly preferable.
  • the hydrophilic organic layer contains a hydrophilic resin, preferably a resin having a diol group.
  • the hydrophilic organic layer may contain, as an optional component, for example, various components used in the manufacturing process of the hydrophilic resin such as the curing catalyst, and other optional components within a range not impairing the effects of the present invention. May be included. In the future, it is conceivable to use the organic substance itself that forms the hydrophilic organic substance layer in the present invention as a carrier.
  • the amount of the hydrophilic organic layer immobilized relative to the unit mass of the inorganic porous particles is preferably 200 ⁇ mol / g to 1600 ⁇ mol / g.
  • the amount of the hydrophilic organic material layer immobilized is 200 ⁇ mol / g or more, it is possible to effectively suppress the adherence of the biological component to the surface of the carrier.
  • the immobilization amount of the hydrophilic organic material layer is more preferably 330 ⁇ mol / g or more, and further preferably 350 ⁇ mol / g or more.
  • the hydrophilic organic substance layer can fully follow the surface shape of an inorganic porous particle because the fixed amount of a hydrophilic organic substance layer is 1600 micromol / g or less.
  • the immobilization amount of the hydrophilic organic layer is more preferably 1500 ⁇ mol / g or less, and further preferably 1400 ⁇ mol / g or less.
  • the amount of immobilization of the hydrophilic organic layer can be calculated from the amount of carbon in the hydrophilic organic layer.
  • the amount of carbon obtained by analyzing the carrier by elemental analysis is the total amount of carbon derived from the adhesion layer and carbon derived from the hydrophilic organic material layer. Therefore, when the carrier has an adhesion layer, the amount of carbon derived from the hydrophilic organic layer is obtained by subtracting the carbon amount derived from the adhesion layer obtained in advance from the total amount of the carbon, and the hydrophilic organic layer is fixed from the value. The amount of conversion may be calculated.
  • the carbon content in the hydrophilic organic substance that is, the carbon content relative to the total amount of the hydrophilic organic substance constituting the hydrophilic organic substance layer is an amount such that the carbon amount in the carrier falls within the above range.
  • the carrier of the embodiment can be obtained by forming a hydrophilic organic material layer on the surface of the inorganic porous particles, or in the case of having an adhesion layer, on the surface of the adhesion layer.
  • the “surface of the inorganic porous particle” includes the surface of the adhesion layer when the adhesion layer is provided.
  • the hydrophilic organic material layer contains a hydrophilic resin
  • the hydrophilic organic material layer forming composition containing a hydrophilic resin having a mass average molecular weight of 200 to 2000 or a precursor thereof on the surface of the inorganic porous particles.
  • a hydrophilic organic material layer can be formed on the surface of the inorganic porous particles by applying and curing.
  • the hydrophilic organic layer forming composition contains a hydrophilic resin or a precursor thereof.
  • the composition for forming a hydrophilic organic layer contains the hydrophilic resin itself when the hydrophilic resin is not reactive, and when the hydrophilic resin is a hydrophilic resin obtained by a curing reaction or a crosslinking reaction, the hydrophilic resin
  • the precursor which is a raw material component of is contained.
  • the hydrophilic resin is preferably the latter, and more preferably a resin having a diol group.
  • the precursor preferably contains a polyepoxide, and may contain a crosslinking agent and a curing catalyst as necessary as described above.
  • composition for hydrophilic organic substance layer formation contains this other arbitrary component, when a hydrophilic organic substance layer contains another arbitrary component.
  • composition for forming a hydrophilic organic layer may further optionally contain a solvent.
  • a solvent used for the composition for forming a hydrophilic organic layer a solvent having good solubility with respect to a blending component including a hydrophilic resin or a raw material component of the hydrophilic resin and an inert solvent for these blending components is used. If it is, it will not specifically limit, Specifically, alcohol, ester, ethers, ketones, water, etc. are mentioned.
  • the hydrophilic organic layer forming composition As a method for applying the hydrophilic organic layer forming composition to the surface of the inorganic porous particles, a known method can be used.
  • the inorganic porous particles and the hydrophilic organic layer forming composition are heated in a solvent. Examples thereof include a dip coating method and a spray coating method, and a dip coating method or a method of heating in a solvent is preferred.
  • the solvent After the coating treatment, if the hydrophilic organic layer forming composition contains a solvent, the solvent is removed and a curing treatment is performed. The removal of the solvent may be performed by a usual method such as heat drying.
  • Curing conditions depend on the type of hydrophilic resin.
  • the hydrophilic resin is an epoxy resin having a glycidyl group
  • a curing treatment at a temperature of 30 to 150 ° C. for 0.5 to 40 hours can be mentioned.
  • the temperature of the curing treatment is preferably 50 to 250 ° C., and the curing time in that case is 0.5 to 40 hours.
  • the operation of applying and curing the hydrophilic organic material layer forming composition on the surface of the inorganic porous particles only needs to be able to fix a predetermined amount of the hydrophilic organic material by one operation. The curing operation is repeated.
  • the precursor of the hydrophilic resin contains a polyepoxide and an optional crosslinking agent and a curing catalyst
  • the first composition containing the polyepoxide and optionally the crosslinking agent
  • the second composition containing the curing catalyst
  • the second composition is applied, and the surface of the inorganic porous particles is subjected to a curing treatment and a hydrolysis treatment, thereby providing a hydrophilic organic substance on the surface of the inorganic porous particles.
  • a layer may be formed.
  • the carrier of the embodiment when having an adhesion layer, the ratio of the total carbon amount of the adhesion layer and the hydrophilic organic material layer to the total amount of the carrier suppresses the adhesion of biologically derived components to the surface of the carrier, while suppressing the inorganic porous particles.
  • the hydrophilic organic material layer can sufficiently follow the surface shape, it is preferably 1.5% by mass to 10% by mass, and more preferably 1.75% by mass to 9% by mass.
  • the shape and size of the carrier can be said to be substantially the same as the shape and average particle size of the inorganic porous particles.
  • the shape of the carrier is preferably spherical, and the average particle diameter is generally 1 to 500 ⁇ m, preferably 7 to 200 ⁇ m, particularly preferably 10 to 160 ⁇ m.
  • the surface shape of the carrier for example, the pore volume and the average pore diameter are substantially the same as the pore volume and the average pore diameter of the inorganic porous particles.
  • the pore volume of the carrier is preferably 0.8 mL / g to 2.5 mL / g, more preferably 1.0 mL / g to 1.95 mL / g, and 1.5 mL / g to 1.9 mL / g. Further preferred.
  • the average pore diameter of the carrier is preferably 40 nm to 115 nm, and more preferably 70 nm to 110 nm.
  • the carrier of the embodiment is used for size exclusion chromatography in which a minute substance contained in a sample is fractionated based on the size, usually the particle diameter.
  • the minute substance to be fractionated is a minute substance derived from a living body, the effect of shortening the passage time of the column tends to be remarkable.
  • the minute substance to which the present invention is applied is not particularly limited as long as it is a minute substance having an average particle diameter of approximately 30 ⁇ m or less. Specifically, when applied to a fine substance having an average particle diameter of 1 nm to 10 ⁇ m, a remarkable effect can be obtained from the viewpoint of work efficiency. If the average particle size of the fine substance is 1 nm to 500 nm, the effect of the method of the present invention is more remarkable.
  • the type of minute substance is not particularly limited as long as it is a dispersion liquid in which extracellular vesicles are dispersed and contained in a liquid medium, and is particularly limited as long as it has a viscosity enough to pass through a column.
  • various colloidal particles other than a living cell and a living cell etc. are mentioned. Specific examples include bacteria, yeast cells, fungal cells, erythrocytes, tissues, DNA, RNA, genes, viruses, exosomes, microvesicles, extracellular vesicles such as apoptosis, microRNAs, proteins such as albumin, and the like.
  • Extracellular vesicles are generally separated from the cytoplasmic matrix by a phospholipid bilayer.
  • Size exclusion chromatography using the carrier of the present invention is useful for separation and purification of extracellular vesicles, particularly exosomes, from biological samples.
  • the average particle size of exosome is approximately 40 to 150 nm.
  • the biological sample containing a minute substance is not limited as long as it contains a minute substance, whether it is a solid or a liquid.
  • Size exclusion chromatography usually targets liquid materials.
  • the biological sample when the biological sample is a solid, the biological sample may be dissolved and dispersed in a liquid medium to form a liquid and subjected to size exclusion chromatography.
  • biological samples containing minute substances include cell culture supernatants and biological fluids.
  • the biological fluid include blood (plasma, serum), urine, saliva, bone marrow fluid, semen, breast milk, amniotic fluid, tears, lymph, and biopsy tissue.
  • cell culture supernatants include cell culture supernatants obtained from human tumor cells cultured in the presence of non-human serum, cell culture supernatants obtained from mouse tumor cells, and the like.
  • the carrier of the embodiment When the carrier of the embodiment is used for size exclusion chromatography, it is usually used by filling a column for size exclusion chromatography.
  • exosomes and proteins are fractionated from the same sample, for example, a serum sample containing exosomes and proteins, compared to when inorganic porous particles are used as the carrier.
  • the time required for processing can be shortened, and the efficiency is improved.
  • the accuracy of fractionation is high, and the purity of the obtained exosome fraction can be improved.
  • Examples according to the carrier of the present invention will be described below.
  • Examples 1 to 3 and 6 are examples, and examples 4, 5, and 7 are comparative examples.
  • Example 8 shows a reference example by ultracentrifugation.
  • silica gel 1 As the inorganic porous particles, porous silica particles (manufactured by AGC S-Tech, trade name, “MS GEL SIL D-75-1000AW”) were used. Hereinafter, this porous silica particle is referred to as silica gel 1. Silica gel 1 has an average particle diameter of 73.2 ⁇ m, an average pore diameter of 110.1 nm, a pore volume of 0.85 mL / g, and a specific surface area of 30 m 2 / g, measured by the following method.
  • the average particle diameter of the silica gel 1 was measured by a laser light scattering method using LA-950V2 (manufactured by Horiba Seisakusho).
  • the average pore diameter, pore volume and specific surface area were measured by mercury porosimetry using Autopore IV9510 (manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the physical property in the following silica gel was measured by the same method.
  • silica gel 1 To 50 g of silica gel 1, 400 mL of toluene, 11.5 mL of diisopropylethylamine, and 14.9 mL of ⁇ -glycidoxypropyltrimethoxysilane were added and refluxed for 4.5 hours. After allowing to cool, the mixture was filtered, washed with 1000 mL of toluene, 500 mL of tetrahydrofuran (THF), 660 mL of methanol, and dried at 70 ° C. overnight to obtain silica gel 1 with an adhesive layer having a coupling agent-treated epoxy group. .
  • THF tetrahydrofuran
  • silica gel 1 treated with the coupling agent was immersed in 84 mL of 0.5 mass% aqueous hydrochloric acid solution at room temperature overnight, filtered, washed with 630 mL distilled water, 630 mL methanol, and dried at 70 ° C. overnight.
  • a silica gel 1 with an adhesion layer in which an epoxy group was opened to form a diol was obtained.
  • Denacol EX-521 (trade name, manufactured by Nagase ChemteX Corp .; polyglycerol polyglycidyl ether, Mw: 1294) and 8.5 mL of methanol were added to 10 g of the resulting diolated silica gel 1 with an adhesion layer. And mixed at room temperature for 30 minutes. Then, it was dried at 70 ° C. all day and night.
  • the ratio of the amount of carbon contained in the carrier 1 to the total amount of the carrier 1 was 3.45% by mass.
  • the carbon content in the silica gel 1 with a diol-formed adhesion layer measured in the same manner was 0.95% by mass. From these, the ratio of the amount of carbon contained in the hydrophilic organic layer to the total amount of the carrier 1 is determined to be 2.50% by mass.
  • the amount of adhesion layer immobilized is determined to be 132 ⁇ mol / g, and the amount of hydrophilic organic material layer immobilized is determined to be 463 ⁇ mol / g.
  • the ratio (mass%) of the N amount with respect to the total amount of the carrier was similarly determined.
  • the ratio (mass%) of the Cl amount was determined using a wavelength dispersive X-ray fluorescence analyzer ZSX100e (manufactured by Rigaku). Table 1 shows the results.
  • the carbon content is indicated as “C content”.
  • the ratio of the C amount in the adhesion layer and the hydrophilic organic material layer is the ratio (% by mass) of the C amount contained in the adhesion layer or the hydrophilic organic material layer with respect to the total amount of the carrier.
  • the ratio of N amount (mass%) and the ratio of Cl amount (mass%) in the total amount of the carrier are the ratio of N amount (mass%) and Cl in the hydrophilic organic layer because the adhesion layer does not contain N or Cl. It corresponds to the ratio (mass%) of the amount.
  • the amount of exosome-derived CD9 contained in the fractions obtained at each recovery time was measured by the exoscreen method using Perkin Elmer (En spire). Similarly, the total protein amount was quantified using a fluorometer (product name: QUIBIT) manufactured by Thermo Fisher Scientific. For each fraction, the value of the ratio of the exosome CD9 amount and the total protein amount obtained above (exosome CD9 amount / total protein amount) was used as an indicator of purity.
  • the collection time (elapsed time from the start of discharge) at which the fraction with the largest exosome collection amount was obtained was defined as the exosome collection processing time.
  • the purity was calculated by taking the ratio between the exosome CD9 intensity and the total protein amount in the fraction with the largest exosome recovery. Table 1 shows the processing time of exosome recovery, the exosome CD9 intensity and the total protein amount of the fraction at the processing time, and the ratio thereof.
  • Example 2 In the production of the carrier 1 according to Example 1 described above, silica gel 2 (manufactured by AGC S-Tech, trade name: “MS GEL SIL D-50-1000AW”) was used as the porous silica particles. Thus, carrier 2 was produced.
  • the average particle diameter of silica gel 2 is 45.6 ⁇ m
  • the average pore diameter is 96.8 nm
  • the pore volume is 1.77 mL / g
  • the specific surface area is 71 m 2 / g.
  • the ratio of the amount of carbon contained in the carrier 2 to the total amount of the carrier 2 was 8.07% by mass.
  • the ratio of the carbon content in the diol-formed silica gel 1 with the adhesion layer measured in the same manner was 2.09% by mass. From these, the ratio of the amount of carbon contained in the hydrophilic organic layer to the total amount of the carrier 2 is determined to be 5.98% by mass. Further, from the amount of carbon obtained, the amount of adhesion layer immobilized is determined to be 290 ⁇ mol / g, and the amount of hydrophilic organic material layer immobilized is determined to be 1108 ⁇ mol / g.
  • silica gel 3 manufactured by AGC S-I-Tech, trade name: “MS GEL SIL D-50-700AW”) was used as the porous silica particles.
  • carrier 3 was produced.
  • the silica gel 3 has an average particle diameter of 45.1 ⁇ m, an average pore diameter of 69.5 nm, a pore volume of 0.81 mL / g, and a specific surface area of 47 m 2 / g.
  • the ratio of the amount of carbon contained in the carrier 3 to the total amount of the carrier 3 was 3.57% by mass.
  • the ratio of the carbon content in the silica gel 3 with the adhesion layer measured in the same manner was 1.44% by mass. From these, the ratio of the amount of carbon contained in the hydrophilic organic layer to the total amount of the carrier 3 is determined to be 2.13% by mass. Further, from the obtained carbon amount, the immobilization amount of the adhesion layer is determined to be 200 ⁇ mol / g, and the immobilization amount of the hydrophilic organic material layer is determined to be 394 ⁇ mol / g.
  • Example 4 In the same manner as in Example 1 above, a diol-formed silica gel 1 with an adhesion layer was prepared and used as a carrier 4. The silica gel 1 used in Example 1 was used as the carrier 5.
  • Example 6 As the inorganic porous particles, porous silica particles (manufactured by AGC S-Tech, trade name, “MS GEL SIL DM-35-700AW”) were used. Hereinafter, the porous silica particles are referred to as silica gel 4.
  • Silica gel 4 has an average particle diameter of 35.5 ⁇ m, an average pore diameter of 72.7 nm, a pore volume of 1.74 mL / g, and a specific surface area of 92 m 2 / g, measured by the following method.
  • Example 7 The silica gel 2 used in Example 2 was used as the inorganic porous particles, and a diol-formed silica gel with an adhesion layer was obtained in the same manner as in Example 1.
  • a carrier 7 was produced in the same manner as in the production of the carrier 2 according to Example 2, except that 0.865 g of polyglycerol polyglycidyl ether (Mw: 2580) was used.
  • Silica gel 2 has an average particle size of 45.6 ⁇ m, an average pore size of 96.8 nm, a pore volume of 1.77 mL / g, and a specific surface area of 71 m 2 / g.
  • Example 8 Exosomes were collected by ultracentrifugation using an ultracentrifuge (SCP85H manufactured by Hitachi Koki Co., Ltd.). The specimen was a 500 ⁇ L serum sample containing exosomes having a predetermined amount of CD9 and protein similar to that used in Example 1. The total processing time in the ultracentrifuge was 480 minutes, and the fraction obtained was measured for the amount of exosome CD9 and the amount of total protein in the same manner as in Example 1, and the ratio value (the amount of exosome CD9 / the amount of total protein). was 0.5.
  • carrier which can collect
  • Such a size exclusion chromatography carrier of the present invention is likely to be able to separate a target minute substance with high purity, and since it is possible to recover extracellular vesicles without impairing physiological activity, It can be used in the field of testing / diagnosis, for example, because it can be used for specimens with higher accuracy.
  • the entire contents of the specification, claims and abstract of Japanese Patent Application No. 2018-078169 filed on Apr. 16, 2018 are incorporated herein by reference as the disclosure of the specification of the present invention. It is.

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Abstract

生体由来の微小物質、特には細胞外小胞を生理活性を失わない状態で効率よく回収することが可能なサイズ排除クロマトグラフィ担体、および該サイズ排除クロマトグラフィ担体の製造方法、並びに該サイズ排除クロマトグラフィ担体を用いた微小物質の回収方法の提供。　無機多孔質粒子と、前記無機多孔質粒子の表面に固定化された親水性有機物層と、を有するサイズ排除クロマトグラフィの担体であって、前記担体全量に対する前記親水性有機物層のカーボン量の割合が１．５質量％以上１０質量％以下であるサイズ排除クロマトグラフィ担体、および、該サイズ排除クロマトグラフィ担体を用いて細胞培養上清または生体液から微小物質を回収する方法。

Description

サイズ排除クロマトグラフィ担体、その製造方法、および微小物質の回収方法
　本発明は、サイズ排除クロマトグラフィ担体、該サイズ排除クロマトグラフィ担体の製造方法、および微小物質の回収方法に関する。
　近年、エクソソーム等の細胞外小胞をバイオマーカーとして用いた病理診断等が注目されている。細胞外小胞の使用に際しては、生体試料から細胞外小胞を単離および精製する技術が必要とされ、従来から、例えば、超遠心分離ステップを含む、分画遠心分離法が用いられている。しかしながら、超遠心分離を用いた方法では、特殊な機器を要する上に、回収までに時間がかかり、また、純度も十分ではなく、精度の高い診断ができないため、細胞外小胞を効率よく回収できる方法が求められている。また、ただ回収すればよいわけではなく、エクソソーム等の細胞外小胞の膜タンパク質解析を目的として細胞外小胞の膜タンパク質を生理活性を損なわない状態で回収し病理診断へつなげる試みもなされており、細胞外小胞を生理活性を損なわない状態で回収できる方法も求められている。
　特許文献１には、大きさに基づいた細胞外小胞の分画を簡便に行う方法として、生体試料に対して分子量の異なるポリエチレングリコールを混合後、遠心分離により沈殿物を得ることで、細胞外小胞を分画する方法が提案されている。なお、特許文献１に記載の方法では、細胞外小胞の回収量は多いものの、細胞外小胞はポリエチレングリコールと結合して沈殿しているため、その分離が困難である点が問題であった。
　サイズ排除クロマトグラフィにより生体試料から細胞外小胞を分画する方法が知られているが、細孔容積、サイズをコントロールすることができる基材を用いたものは知られておらず目的物の純度が不十分である点が問題であった。
　一方、サイズ排除クロマトグラフィを含む、各種クロマトグラフィの担体として多孔質シリカ粒子が広く使用されている。例えば、特許文献２には、耐アルカリ性が高い多孔質シリカ粒子にクロマトグラフィの種類に応じて表面処理を施す技術が記載されており、アフィニティクロマトグラフィ担体、陽イオン交換クロマトグラフィ担体、陰イオン交換クロマトグラフィ担体、逆相クロマトグラフィ担体、サイズ排除クロマトグラフィ担体等の例示がなされている。しかしながら、特許文献２の技術は、タンパク質をリガンドを用いて吸着し、吸着したタンパク質を回収する手法を用いたタンパク質精製用途として最適化されたものであり、特許文献２の技術をそのまま用いても、必ずしも、細胞外小胞を効率よく回収できるわけではない。
国際公開第２０１６／１８５５６４号 国際公開第２０１６／１６３４８０号
　本発明は、上記状況に鑑みてなされたものであって、生体由来の微小物質、特には細胞外小胞を、生理活性を失わない状態で効率よく回収可能なサイズ排除クロマトグラフィ担体、および該サイズ排除クロマトグラフィ担体の製造方法の提供を課題とする。本発明は、また、生体由来の微小物質、特には細胞外小胞を、生理活性を失わない状態で効率よく回収する方法の提供を課題とする。
　本発明は、以下の構成を有する。
［１］無機多孔質粒子と、前記無機多孔質粒子の表面に固定化された親水性有機物層と、を有するサイズ排除クロマトグラフィの担体であって、前記担体中のカーボン量が１．５質量％～１０質量％であるサイズ排除クロマトグラフィ担体。
［２］前記担体中のＮ量が０．５質量％以下である［１］に記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
［３］前記担体中のＣｌ量が０．５質量％以下である［１］または［２］に記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
［４］前記親水性有機物層がポリオキシエチレン基を含む、［１］～［３］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
［５］前記無機多孔質粒子の単位質量に対する前記親水性有機物層の固定化量が、２００μｍｏｌ／ｇ～１６００μｍｏｌ／ｇである［１］～［４］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
［６］前記親水性有機物層がジオール基を含む、［１］～［５］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
［７］前記親水性有機物層がアクリル基由来、またはメタクリル基由来のカルボニル構造を含まない［１］～［６］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
［８］前記無機多孔質粒子は、多孔質シリカ粒子である、［１］～［７］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
［９］前記無機多孔質粒子は、平均粒子径が１μｍ～５００μｍである、［１］～［８］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
［１０］前記無機多孔質粒子は、水銀圧入法により測定される平均細孔径が４０ｎｍ～１１５ｎｍである、［１］～［９］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
［１１］［１］～［１０］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体を製造する方法であって、
　前記親水性有機物層として、質量平均分子量が２００～２０００である親水性樹脂を、前記無機多孔質粒子の表面に塗布し、硬化させることを含むサイズ排除クロマトグラフィ担体の製造方法。
［１２］［１］～［１０］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体を製造する方法であって、
　前記親水性有機物層として、質量平均分子量が２００～２０００である親水性樹脂の前駆体を含む親水性有機物層形成用組成物を、前記無機多孔質粒子の表面に塗布し、硬化させることを含むサイズ排除クロマトグラフィ担体の製造方法。
［１３］前記親水性樹脂の前駆体は、３個以上のジオール基を含み、質量平均分子量が２００～２０００である［１２］に記載の製造方法。
［１４］前記親水性樹脂の前駆体は、グリセロールポリグリシジルエーテルおよびポリグリセロールポリグリシジルエーテルから選ばれる少なくとも１種を含む、［１２］または［１３］に記載の製造方法。
［１５］［１］～［１４］のいずれかに記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体を用いた、細胞培養上清または生体液から微小物質を回収する方法。
　本発明によれば、生体由来の微小物質、特には細胞外小胞を、生理活性を失わない状態で効率よく回収することが可能なサイズ排除クロマトグラフィ担体、および該サイズ排除クロマトグラフィ担体の製造方法が提供できる。本発明は、また、生体由来の微小物質、特には細胞外小胞を、生理活性を失わない状態で効率よく回収する方法を提供できる。
　以下に、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、下記説明に限定して解釈されるものではない。
　また、本明細書において、数値範囲を表す値は、その範囲の上限値又は下限値を含む。
　本発明のサイズ排除クロマトグラフィ担体（以下、単に「担体」ともいう。）は、無機多孔質粒子と、無機多孔質粒子の表面に固定化された親水性有機物層と、を有し、担体中のカーボン量が１．５質量％～１０質量％である。
　実施形態の担体が有する無機多孔質粒子は、通常、表面に多数の細孔を有する粒子である。担体は、無機多孔質粒子の表面に親水性有機物層を有し、担体中のカーボン量は１．５質量％以上１０質量％以下である。担体中のカーボン量は、担体が有する親水性有機物層等の有機物を含有する層の有機物量を示す指標である。担体が親水性有機物層等の有機物を含有する層を有する場合であっても、担体中のカーボン量が１０質量％以下であれば、無機多孔質粒子表面の形状に親水性有機物層等の有機物を含有する層が追従できる。したがって、実施形態の担体の表面は、無機多孔質粒子の表面と略同様の多数の細孔を有する。
　よって、サイズ排除クロマトグラフィにおいて、例えば、実施形態の担体をカラムに充填して用いれば、各種サイズの生体由来成分を含有する生体試料をカラム入口から出口に向かって通過させる際に、サイズの小さい成分程、細孔内への出入りを繰り返す現象により通過時間が長くなり、生体由来成分のサイズによる分画が可能となる。
　また、担体が表面に親水性有機物層を有し、担体中のカーボン量が１．５質量％以上であれば、生体試料がカラムを通過する際に、担体が表面に有する親水性有機物層が含水することで、担体表面に生体由来成分が付着するのを効果的に抑制できる。これにより、無機多孔質粒子をそのまま担体として用いた場合に比べて、生体試料中の各種サイズの生体由来成分におけるカラム通過時間の短縮が可能となり、生体由来成分の分画を効率よく行うことが可能となる。
　実施形態の担体において、担体全量に対する親水性有機物層のカーボン量の割合は１．５質量％以上が好ましく、これにより担体表面に生体由来成分が付着するのを効果的に抑制できる。該カーボン量の割合は、１．７５質量％以上がより好ましい。
　担体中のカーボン量は、上記観点から、１０質量％以下であり、９質量％以下が好ましい。実施形態の担体において、担体が親水性有機物層以外に有機物を含有する層を有しない場合、担体全量に対する親水性有機物層のカーボン量の割合は、１０質量％以下であり、９質量％以下が好ましい。担体中のカーボン量は、例えば、担体を元素分析法により分析して得られる。無機多孔質粒子のカーボン量は０（ゼロ）であり、したがって、親水性有機物層等の有機物を含有する層のカーボン量は、担体が含有するカーボン量に等しい。
　また、微小物質の回収量を上げる観点から、担体中の窒素原子（Ｎ）の含有量（以下、「Ｎ量」ともいう。）が０．５質量％以下であるのが好ましい。Ｎ量は、０．１質量％以下がより好ましく、０．０１質量％以下がさらに好ましい。
　さらに、微小物質の回収量を上げる観点から、担体中の塩素原子（Ｃｌ）の含有量（以下、「Ｃｌ量」ともいう。）が０．５質量％以下であるのが好ましい。０．５質量％より多い場合は、回収量が下がる可能性があるだけでなく、微小物質の生理活性機能を損なう恐れがある。Ｃｌ量が０．０１質量％～０．５質量％である場合には、工業的生産性の点から好ましい。担体中のＮ量、Ｃｌ量は、例えば、担体を蛍光Ｘ線分析やＣＨＮ元素分析などの公知の元素分析法により分析して得られる。
　実施形態の担体は、本発明の効果を損なわない範囲で、無機多孔質粒子および親水性有機物層以外の構成要素を含んでよい。例えば、実施形態の担体は、親水性有機物層の無機多孔質粒子への密着性を高めるために、無機多孔質粒子と親水性有機物層の間に密着層を有してもよい。以下、実施形態の担体を構成する無機多孔質粒子および親水性有機物層、並びに任意の構成要素である密着層について説明する。
（無機多孔質粒子）
　無機多孔質粒子としては、従来、サイズ排除クロマトグラフィで使用されている、無機材料を構成材料とした、少なくとも表面に細孔を有する多孔質粒子であれば特に限定されない。
　無機材料としては、例えば、金属酸化物、ガラス、セラミックス等が挙げられる。金属酸化物としては、酸化ケイ素（シリカ）、酸化アルミニウム（アルミナ）、酸化ジルコニウム等を挙げることができる。これらは単独でまたは２種以上を組み合せて用いられる。２種以上を用いる場合、混合物であってもよく、複合酸化物であってもよい。無機材料は、金属酸化物、特にシリカを主成分として含むことが好ましい。この場合、無機材料には金属酸化物以外の無機成分、例えば、りん酸塩が含まれてもよい。なお、無機材料が、金属酸化物を主成分として含むとは、無機材料全量に対して金属酸化物を７０質量％以上含むことをいう。また、無機多孔質粒子は、球状であることが好ましい。球状であることで、圧力損失が高くなることを防ぐことができる。
　無機多孔質粒子としては、シリカを主成分として含有する無機材料からなる多孔質シリカ粒子が好ましく、シリカゲルが特に好ましい。シリカを主成分として含有する無機材料には酸化ジルコニウム、りん酸塩等が含まれてもよい。シリカゲルとしては、酸化ケイ素を通常、９９％質量以上、好ましくは９９．９質量％以上、より好ましくは９９．９９質量％以上含むものが使用される。
　無機多孔質粒子の細孔容積および細孔径は、サイズ排除クロマトグラフィで対象とする試料の種類や目的の分画成分のサイズに合わせて最適化できる。無機多孔質粒子の細孔容積および細孔径は水銀圧入法により測定できる。
　無機多孔質粒子の細孔容積は０．８ｍＬ／ｇ～２．５ｍＬ／ｇが好ましい。細孔容積が０．８ｍＬ／ｇ以上であると、サイズ排除クロマトグラフィにおいて、生体試料等の試料中の成分のサイズによるカラムの通過時間に差を生じさせやすい。細孔容積は１．０ｍＬ／ｇ以上がより好ましく、１．５ｍＬ／ｇ以上がさらに好ましい。無機多孔質粒子の細孔容積を２．５ｍＬ／ｇより大きくすると、一般的には粒子強度が低下するので好ましくない。細孔容積は、１．９５ｍＬ／ｇ以下がより好ましく、１．９ｍＬ／ｇ以下がさらに好ましい。
　無機多孔質粒子の細孔径は、例えば、試料から５０～１００ｎｍ程度の平均粒子径の微小物質を分画する場合に、平均細孔径が４０ｎｍ～１１５ｎｍであるのが好ましく、７０ｎｍ～１１０ｎｍであるのがより好ましい。これは、例えば、生体試料からエクソソームを分離、精製する場合に好適な平均細孔径である。また、例えば、試料から７０～１５０ｎｍ程度の平均粒子径の微小物質を分画する場合に、平均細孔径は、８０ｎｍ～１１５ｎｍであるのが好ましく、９０ｎｍ～１１５ｎｍであるのがより好ましい。また、細孔径はそろっていることが好ましく、水銀圧入法で細孔分布を求めた場合、分布がシャープであることが好ましい。例えば、水銀圧入法に基づく細孔分布において、細孔分布曲線の主ピークの半値幅を該主ピークのピークトップの細孔径で除した値が０．６以下であると好ましく、０．５以下であるとより好ましい。
　サイズ排除クロマトグラフィへの適用において、無機多孔質粒子の平均粒子径は小さいほど分離特性が向上するが、操作時の圧力損失が大きくなるので、使用する装置の仕様も勘案して適切な値のものを採用する。無機多孔質粒子の平均粒子径は、１～５００μｍであることが好ましく、７～２００μｍであることがより好ましく、１０～１６０μｍであることが特に好ましい。なお、本明細書において、無機多孔質粒子の平均粒子径は、一次粒子が凝集した凝集粒子（二次粒子）の平均粒子径である。また、平均粒子径は、レーザー回折・散乱法によって測定された体積基準の粒度分布から求められる５０％積算値（Ｄ５０）である。
　また、無機多孔質粒子は、粒子径分布が揃っているほど、分離性能が向上するので好ましい。具体的には、粒子径の小さいものから累積して、質量もしくは体積基準の累積量が全粒子量の１０％になる粒子径を１０％径（Ｄ１０）、９０％になる粒子径を９０％径（Ｄ９０）とするとき、Ｄ９０／Ｄ１０の値が３以下であると好ましい。本明細書において、特に断りのない限り、粒子径は、平均粒子径を含めて、レーザー回折・散乱法によって測定された値をいう。ただし、Ｄ９０／Ｄ１０の値を算出するときのＤ９０、Ｄ１０は、電気抵抗法によって測定された値をいう。
　無機多孔質粒子の形状は特に限定されない。いわゆる破砕状のものも使用できるが、サイズ排除クロマトグラフィに用いるカラムへの充填性、操作時の圧力損失の抑制の観点から、球状のものが好適に使用できる。さらに、真球体および楕円体を含めた球状であることが好ましく、真球体に近い形状であることが特に好ましい。
（密着層）
　密着層は無機多孔質粒子と親水性有機物層の間に任意に設けられる両者を強固に密着するための層である。密着層は、一分子中に無機多孔質粒子の表面と反応性の基および親水性有機物層と反応性の基の両方を有するカップリング剤を用いて形成されることが好ましい。カップリング剤としては、有機金属系カップリング剤が好ましい。有機金属系カップリング剤としては、シランカップリング剤、チタン系カップリング剤、アルミニウム系カップリング剤等が使用でき、シランカップリング剤が好ましい。
　有機金属系カップリング剤は、金属原子（Ｓｉ、Ｔｉ，Ａｌ等）に加水分解性基と、親水性有機物またはその原料に反応性を有する有機反応基とが結合した化合物が好ましく、有機反応基は親水性有機物層の構成材料により適宜選択される。親水性有機物層は以下に説明するとおりグリシジル基を有することが好ましい。この場合、有機反応基は、末端にエポキシ基、カルボキシ基または水酸基を有する基が好ましく、エポキシ基を有する有機反応基が好ましい。
　エポキシ基を含有する有機金属系カップリング剤としては、エポキシ基を有するシランカップリング剤が好ましく用いられる。エポキシ基を有するシランカップリング剤としては、γ－グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、γ－グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、β－（３，４－エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン等が使用できる。
　無機多孔質粒子の表面に密着層を形成するには、有機金属系カップリング剤等のカップリング剤と無機多孔質粒子を所定の温度条件下で接触させればよい。これにより、無機多孔質粒子の表面の、例えば、金属酸化物やガラスの金属原子と結合するＯＨ基と有機金属系カップリング剤の加水分解性基等が反応する。該反応の際の温度は３０～４００℃が好ましく、１００～３００℃がより好ましい。反応時間、すなわち上記接触の時間は、０．５～４０時間が好ましく、３～２０時間がより好ましい。カップリング剤と無機多孔質粒子の接触は、溶媒の存在下で行うのが好ましい。
　溶媒としては、カップリング剤と反応せず、かつ、反応温度下で安定なものであれば、特に限定することなく使用可能である。カップリング剤の溶解性、沸点、さらには他の溶媒との親和性（すなわち洗浄時における除去性）などの観点から、通常、ベンゼン、トルエン、キシレン、オクタン、イソオクタン、テトラクロロエチレン、クロロベンゼン、ブロモベンゼン等が好適に使用される。また、接触による反応は使用溶媒の還流下に行うことが望ましい。
　カップリング剤と無機多孔質粒子の接触に際しては、さらに、トリエチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン等のアミン化合物からなる触媒を用いてもよい。
　カップリング剤の固定化量は、無機多孔質粒子の表面全体を緻密に覆う量であることが、無機多孔質粒子と親水性有機物層の密着性を高める観点から好ましい。具体的には、無機多孔質粒子の比表面積あたりのカップリング剤の固定化量（カップリング剤の固定化量を無機多孔質粒子の比表面積で除した値）は１．５μｍｏｌ／ｍ２以上が好ましく、１．５～５０μｍｏｌ／ｍ２がより好ましく、２．５～５０μｍｏｌ／ｍ２が特に好ましい。また、無機多孔質粒子の単位質量あたりのカップリング剤の固定化量は、４５μｍｏｌ／ｇ以上が好ましく、５０～３２０μｍｏｌ／ｇがより好ましく、１００～３００μｍｏｌ／ｇが特に好ましい。
　なお、無機多孔質粒子の比表面積は、例えば、水銀圧入法により測定できる。また、カップリング剤の固定化量は公知の方法に基づいて求められる。例えば、カップリング剤を固定化した後の無機多孔質粒子、すなわち密着層付き無機多孔質粒子について元素分析法により測定したカーボン含有量をもとに、カップリング剤１分子に含まれる炭素量、および、無機多孔質粒子の比表面積を用いて、カップリング剤の固定化量を算出できる。
　無機多孔質粒子にカップリング剤を固定化した後、さらに、カップリング剤の有機反応基に、親水性有機物との反応性を高めるための処理を施してもよい。例えば、カップリング剤が有する有機反応基がエポキシ基を有する場合、密着層付き無機多孔質粒子を塩酸等の酸で処理してエポキシ基を開環させることでジオール化してもよい。
　実施形態の担体が密着層を有する場合は、密着層のカーボン量が担体全体のカーボン量を超えないようにする。例えば、担体が無機多孔質粒子と密着層と親水性有機物層からなる場合には、密着層と親水性有機物層の合計のカーボン量が、担体全体のカーボン量の範囲内となるように調整する。同様に、密着層のＮ量およびＣｌ量は、担体全体のＮ量およびＣｌ量を超えないことが好ましい。
（親水性有機物層）
　親水性有機物層は、実施形態の担体の最表層を構成し、担体表面への生体由来成分の付着を抑制する機能を有する層である。親水性有機物層は、親水性基を有する親水性有機物からなり、通常、親水性基を有する親水性樹脂を含有する。親水性樹脂としては、アガロースやセルロースのような多糖類を有する樹脂、ポリアクリルアミドのようなアミド基を有する樹脂、メタクリル酸２－ヒドロキシルエチルのようなメタクリル酸エステル基を有するアクリル樹脂、ジオール基を有する樹脂、ポリオキシエチレン基を有する樹脂、などが挙げられる。親水性有機物は、親水性樹脂のみからなってもよく、無機多孔質粒子と親水性有機物層とを密着させる密着成分が含まれていてもよく、それ以外の任意成分を含有してもよい。
　親水性有機物が有する親水性基としては、生体由来成分を吸着しない基が好ましい。具体的には、ジオール基、ポリオキシエチレン基等が好ましく、ポリオキシエチレン基、ジオール基が特に好ましい。特に、生体試料表面に影響を与えず、非特異吸着を防止する観点から親水性有機物層の表面にポリオキシエチレン基、ジオール基を有することが好ましい。
　担体全量に対する親水性有機物層のＣｌ量の割合は、担体中のＣｌ量を上記範囲内にする観点から０．５質量％以下であるのが好ましい。０．５質量％より多い場合は、担体中のＣｌ量が上記範囲を超える恐れがある。担体全量に対する親水性有機物層のＣｌ量の割合が０．０１質量％～０．５質量％である場合には工業的生産性の点から好ましい。
　担体全量に対する親水性有機物層のＮ量の割合は、担体中のＮ量を上記範囲内にする観点から、０．５質量％以下であるのが好ましい。担体全量に対する親水性有機物層のＮ量の割合は、０．１質量％以下がより好ましく、０．０１質量％以下がさらに好ましい。また、親水性有機物層は、微小物質の回収量を向上させる観点から、アクリル基またはメタクリル基（ＣＨ２＝ＣＲ－Ｃ（＝Ｏ）－、ただしＲはＨまたはＣＨ３）由来のカルボニル構造（－Ｃ（＝Ｏ）－）を含まないことが好ましい。
＜親水性樹脂＞
　親水性有機物は、通常、含有する親水性樹脂が親水性基を有することで、親水性基を有する。親水性樹脂としては、上記した親水性基を有する樹脂が挙げられ、ジオール基を有する樹脂が特に好ましい。ジオール基を有する樹脂は、架橋構造を有することで、親水性有機物層を緻密な構造とできる点で好ましい。
　ジオール基を有する樹脂は、例えば、一分子内に複数のグリシジル基を有する化合物（以下、「ポリエポキシド」という）の硬化物であるのが好ましい。ポリエポキシドはジオール基を有する樹脂の原料成分であり、本明細書においてはこれを「前駆体」ともいう。ポリエポキシドにおけるグリシジル基の数は、２個以上であればよく、架橋点を増やす観点から３個以上が好ましい。入手容易性の観点からグリシジル基の数は１０個以下が好ましい。
　ポリエポキシドを用いて親水性有機物層を形成すると、ポリエポキシドの硬化の過程で、グリシジル基または後述の架橋剤が有する反応性基が、無機多孔質粒子の表面の反応性基と、または、密着層を有する場合は密着層表面の反応性基と、反応すると共に、分子間で架橋する。これにより、親水性有機物層が無機多孔質粒子の表面に直接、または、密着層を有する場合は密着層を介して無機多孔質粒子の表面に固定化される。親水性有機物層が無機多孔質粒子の表面に固定化されるとは、このように、無機多孔質粒子と親水性有機物層の間に存在する層を介して親水性有機物が固定化される場合を含む。
　このようにポリエポキシドを用いて形成された親水性有機物層中には、加水分解により複数のジオール基が残存する。該ジオール基は、親水性有機物層の内部にも存在するが、特に表面に存在し、親水性有機物層表面における生体成分を吸着しない性質に寄与している。
　ポリエポキシドとしては、通常の硬化エポキシ樹脂の原料成分として用いられる、グリシジルエーテル系ポリエポキシド、グリシジルエステル系ポリエポキシド、グリシジルアミン系ポリエポキシド、環式脂肪族ポリエポキシド等が挙げられる。
　これらのうちでも、フェノール性水酸基を２個以上有するポリフェノール類のフェノール性水酸基やアルコール性水酸基を２個以上有するポリオール類のアルコール性水酸基をグリシジルオキシ基に置換した構造を有するポリエポキシド（またはそのポリエポキシドのオリゴマー）であるグリシジルエーテル系ポリエポキシドが好ましい。
　さらにグリシジルエーテル系ポリエポキシドのうちでも、脂肪族ポリオールから得られるグリシジルエーテル系ポリエポキシドが好ましい。脂肪族ポリオールとしては、アルカンポリオール、エーテル性酸素原子含有ポリオール、糖アルコール、ポリオキシアルキレンポリオール、ポリエステルポリオール等がある。ポリオキシアルキレンポリオールとしては、アルカンポリオール、エーテル性酸素原子含有ポリオール、糖アルコール等の比較的低分子量のポリオールに、プロピレンオキシド、エチレンオキシド等のモノエポキシドを開環付加重合して得られる。ポリエステルポリオールは、脂肪族ジオールと脂肪族ジカルボン酸が縮合した構造を有する化合物や環状エステルが開環重合した構造を有する化合物等がある。
　脂肪族ポリオール由来のグリシジルエーテル系ポリエポキシドとして、具体的には、エチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ジプロピレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，６－ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリオキシプロピレンジオールジグリシジルエーテル、ポリオキシプロピレントリオールトリグリシジルエーテル、ポリ（オキシプロピレン・オキシエチレン）トリオールトリグリシジルエーテル等が挙げられる。
　このようなポリエポキシドとしては、たとえば、トリオールのトリグリシジルエーテル、テトラオールのテトラグリシジルエーテル、トリオールのトリグリシジルエーテルと同じトリオールのジグリシジルエーテルとの混合物、テトラオールのテトラグリシジルエーテル、トリグリシジルエーテルおよびジグリシジルエーテルの混合物、トリオールのトリグリシジルエーテルとジオールのジグリシジルエーテルとの混合物等が挙げられる。
　より具体的には、１分子当たり平均のグリシジル基の数が、好ましくは３～１０個の、グリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル等が挙げられる。これらのうちでも、ジオール基を有する樹脂の原料成分であるポリエポキシドとして、グリセロールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル等が好ましく、ポリグリセロールポリグリシジルエーテルが特に好ましい。
　また、ポリエポキシドの質量平均分子量（Ｍｗ）は、２００～２０００が好ましく、５５０～１８００がより好ましい。Ｍｗが２００以上であれば、無機多孔質粒子表面を十分に覆うことが可能であり、２０００以下であることで、無機多孔質粒子表面の細孔の形状を維持したまま表面処理を行うことが可能である。なお、本明細書におけるＭｗは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定されるポリスチレンを標準とする質量平均分子量をいう。また、ポリエポキシドにおけるエポキシ当量（１グラム当量のエポキシ基を含む樹脂のグラム数［ｇ／ｅｑ］）としては、１２０～２００ｇ／ｅｑが好ましく、１４０～１８５ｇ／ｅｑがより好ましい。
　ポリエポキシドとしては市販品を用いることが可能である。市販品として、具体的には、ナガセケムテックス社製のいずれも商品名で、グリセロールポリグリシジルエーテルである、デナコールＥＸ－３１３（Ｍｗ：３８３）、デナコールＥＸ－３１４（Ｍｗ：４５４）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテルである、デナコールＥＸ－５１２（Ｍｗ：６３０）、デナコールＥＸ－５２１（Ｍｗ：１２９４）、ソルビトールポリグリシジルエーテルとして、デナコールＥＸ－６２２（Ｍｗ：９３０）等が挙げられる。
　ジオール基を有する樹脂としては、ポリエポキシドのグリシジル基同士の反応により架橋し硬化後、加水分解により生じるジオール基を有する樹脂であってもよく、ポリエポキシドと、ポリエポキシドが有するグリシジル基と反応する反応性基を２個以上有する架橋剤との反応により架橋し硬化後、加水分解により生じるジオール基を有する樹脂であってもよい。架橋剤が有する反応性基としては、活性水素を有するアミノ基、カルボキシ基、チオール基等が挙げられる。架橋剤として、具体的には、ポリアミン類、ポリカルボン酸無水物、ポリアミド類、ポリチオール類等が挙げられる。
　親水性有機物に用いられるジオール基を有する樹脂としては、上記のＮ量等を勘案すると、ポリエポキシドのグリシジル基同士の反応により架橋し硬化後、加水分解により生じるジオール基を有する樹脂が好ましい。なお、ポリエポキシドを硬化させた後、加水分解により生じるジオール基を有する樹脂を得るためには、通常、硬化触媒が用いられる。したがって、親水性有機物はジオール基を有する樹脂とともに硬化触媒を含有してもよい。
　親水性有機物に用いられるポリオキシエチレン基を有する有機物としては、２－［ＭＥＴＨＯＸＹ（ＰＯＬＹＥＴＨＹＬＥＮＥＯＸＹ）６－９ＰＲＯＰＹＬ］ＴＲＩＭＥＴＨＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、２－［ＭＥＴＨＯＸＹ（ＰＯＬＹＥＴＨＹＬＥＮＥＯＸＹ）９－１２ＰＲＯＰＹＬ］ＴＲＩＭＥＴＨＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、２－［ＭＥＴＨＯＸＹ（ＰＯＬＹＥＴＨＹＬＥＮＥＯＸＹ）２１－２４ＰＲＯＰＹＬ］ＴＲＩＭＥＴＨＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、（いずれもゲレスト社）等が挙げられる。
　硬化触媒としては、例えば、３級アミン類、イミダゾール類、ルイス酸類、オニウム塩類、ジシアンジアミド類、有機酸ジヒドラジド類、ホスフィン類等の硬化触媒が挙げられる。このような触媒型硬化剤として、具体的には、２－メチルイミダゾール、２－エチル－４－メチルイミダゾール、トリス（ジメチルアミノメチル）フェノール、三フッ化ホウ素－アミン錯体、ジシアンジアミド、ジフェニルヨードニウムヘキサフルオロホスフェート、トリフェニルスルホニウムヘキサフルオロホスフェート、トリス（ペンタフルオロフェニル）ボラン、三フッ化ホウ素等が挙げられる。硬化触媒としては、窒素原子を含まない、トリス（ペンタフルオロフェニル）ボラン、三フッ化ホウ素等が好ましい。
　ポリエポキシドに対する硬化触媒の量としては、ポリエポキシドの１００質量部に対して、または架橋剤を用いる場合は、ポリエポキシドと架橋剤の合計１００質量部に対して１～２０質量部が好ましく、１～１０質量部がより好ましく、１～５質量部が特に好ましい。
　親水性有機物層は、親水性樹脂、好ましくは、ジオール基を有する樹脂を含有する。親水性有機物層は、任意成分として、例えば、上記硬化触媒等の親水性樹脂の製造過程で用いる各種成分を含有してもよく、さらに本発明の効果を損なわない範囲で、その他の任意成分を含んでもよい。なお、本発明における親水性有機物層を形成する有機物自体を担体とすることも今後考えられる。
　実施形態の担体において、無機多孔質粒子の単位質量に対する親水性有機物層の固定化量は、２００μｍｏｌ／ｇ～１６００μｍｏｌ／ｇであるのが好ましい。親水性有機物層の固定化量が、２００μｍｏｌ／ｇ以上であることで、担体表面に生体由来成分が付着するのを効果的に抑制できる。親水性有機物層の固定化量は、３３０μｍｏｌ／ｇ以上がより好ましく、３５０μｍｏｌ／ｇ以上がさらに好ましい。また、親水性有機物層の固定化量が１６００μｍｏｌ／ｇ以下であることで、無機多孔質粒子の表面形状に、親水性有機物層が十分に追従できる。親水性有機物層の固定化量は、１５００μｍｏｌ／ｇ以下がより好ましく、１４００μｍｏｌ／ｇ以下がさらに好ましい。親水性有機物層の固定化量は、親水性有機物層のカーボン量から算出できる。
　なお、担体が密着層を有する場合、担体を元素分析法により分析して得られるカーボン量は、密着層由来のカーボン量と親水性有機物層由来のカーボン量の合計量である。したがって、担体が密着層を有する場合は、該カーボン量の合計量から予め求めた密着層由来のカーボン量を差し引いて親水性有機物層由来のカーボン量を求め、その値から親水性有機物層の固定化量を算出すればよい。
　実施形態の担体において、親水性有機物中のカーボン含有量、すなわち親水性有機物層を構成する親水性有機物全量に対するカーボン含有量は、担体中のカーボン量が上記範囲内となる量とする。
（担体の製造方法）
　実施形態の担体は、無機多孔質粒子の表面に、または、密着層を有する場合は密着層の表面に親水性有機物層を形成することで得られる。以下の説明において、「無機多孔質粒子の表面」という場合、密着層を有する場合の密着層の表面を含む。
　例えば、親水性有機物層が親水性樹脂を含有する場合は、無機多孔質粒子の表面に、質量平均分子量が２００～２０００である親水性樹脂またはその前駆体を含む親水性有機物層形成用組成物を塗布し、硬化させることで無機多孔質粒子の表面に親水性有機物層を形成できる。
　親水性有機物層形成用組成物は、親水性樹脂またはその前駆体を含む。親水性有機物層形成用組成物は、親水性樹脂が反応性でない場合は親水性樹脂それ自体を含有し、親水性樹脂が硬化反応や架橋反応により得られる親水性樹脂の場合、該親水性樹脂の原料成分である前駆体を含有する。親水性樹脂は、好ましくは後者であり、より好ましくはジオール基を有する樹脂である。親水性樹脂がジオール基を有する樹脂の場合、前駆体はポリエポキシドを含有することが好ましく、また、上記のとおり、必要に応じて架橋剤、硬化触媒を含有してもよい。
　なお、親水性有機物層形成用組成物は、親水性有機物層がその他の任意成分を含有する場合は、該その他の任意成分を含有する。親水性有機物層形成用組成物は、さらに、任意に溶媒を含有してもよい。
　親水性有機物層形成用組成物に用いる溶媒としては、親水性樹脂または親水性樹脂の原料成分を含む配合成分についての溶解性が良好であり、かつこれらの配合成分に対して不活性な溶媒であれば特に限定されず、具体的には、アルコール類、エステル類、エーテル類、ケトン類、水等が挙げられる。
　無機多孔質粒子の表面に親水性有機物層形成用組成物を塗布する方法としては、既知の方法によることができ、無機多孔質粒子と親水性有機物層形成用組成物とを溶媒中で加熱する方法、ディップコート法、スプレーコート法等が挙げられるが、ディップコート法や溶媒中で加熱する方法が好ましい。塗布処理後、親水性有機物層形成用組成物が溶媒を含む場合は溶媒を除去し、硬化処理を行う。溶媒の除去は加熱乾燥等通常の方法で行えばよい。
　硬化処理の条件は、親水性樹脂の種類による。親水性樹脂がグリシジル基を有するエポキシ樹脂の場合、３０～１５０℃の温度で、０．５～４０時間の硬化処理が挙げられる。硬化処理の温度は、５０～２５０℃が好ましく、その場合の硬化時間として０．５～４０時間が挙げられる。
　なお、無機多孔質粒子の表面への親水性有機物層形成用組成物の塗布、硬化の操作は、１回の操作で所定量の親水性有機物の固定化ができればよいが、できない場合は、塗布、硬化の操作を繰り返し行う。
　また、上記において親水性樹脂の前駆体が、ポリエポキシドおよび任意の架橋剤と、硬化触媒を含む場合、ポリエポキシドおよび任意に架橋剤を含む第１の組成物と、硬化触媒を含む第２の組成物を準備し、無機多孔質粒子の表面に第１の組成物の塗布後、第２の組成物を塗布し、硬化処理、加水分解処理を行うことで、無機多孔質粒子の表面に親水性有機物層を形成してもよい。
　このようにして、実施形態の担体が得られる。実施形態の担体において、密着層を有する場合、担体全量に対する密着層と親水性有機物層の合計カーボン量の割合は、担体表面に生体由来成分が付着するのを抑制しつつ、無機多孔質粒子の表面形状を親水性有機物層が十分に追従できる観点から、１．５質量％～１０質量％が好ましく、１．７５質量％～９質量％がより好ましい。
　親水性有機物層が無機多孔質粒子の表面形状に追従した薄層であることから、担体の形状およびサイズ、例えば、平均粒子径は、無機多孔質粒子の形状、平均粒子径と略同様といえる。すなわち、担体の形状は球状が好ましく、平均粒子径は、一般的には１～５００μｍであり、７～２００μｍが好ましく、１０～１６０μｍが特に好ましい。担体の表面形状、例えば、細孔容積および平均細孔径は、無機多孔質粒子の細孔容積および平均細孔径と略同様といえる。すなわち、担体の細孔容積は、０．８ｍＬ／ｇ～２．５ｍＬ／ｇが好ましく、１．０ｍＬ／ｇ～１．９５ｍＬ／ｇがより好ましく、１．５ｍＬ／ｇ～１．９ｍＬ／ｇがさらに好ましい。担体の平均細孔径は、４０ｎｍ～１１５ｎｍであるのが好ましく、７０ｎｍ～１１０ｎｍであるのがより好ましい。
（微小物質の回収方法）
　実施形態の担体は、試料が含有する微小物質をサイズ、通常は粒子径に基づいて分画するサイズ排除クロマトグラフィに用いられる。
　実施形態の担体を用いたサイズ排除クロマトグラフィにおいて、分画の対象とする微小物質は、生体由来の微小物質であるとカラムの通過時間が短縮される効果が顕著になりやすい。本発明が適用される微小物質としては、平均粒子径が概ね３０μｍ以下の微小物質であれば特に制限されない。具体的には、平均粒子径が１ｎｍ～１０μｍの微小物質に適用した場合に、作業効率的の観点から顕著な効果が得られる。微小物質の平均粒子径は、１ｎｍ～５００ｎｍであれば、より本発明の方法による効果は顕著である。
　微小物質の種類としては、液状媒体に細胞外小胞が分散して含まれる分散液であれば特に限定されるものではなく、カラムを通過できる程度の粘度を有するものであれば特に限定されるものではないが、生体細胞および生体細胞以外の各種コロイド粒子等が挙げられる。具体的には、バクテリア、酵母細胞、菌類の細胞、赤血球、組織、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子、ウイルス、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス等の細胞外小胞、ミクロＲＮＡ、アルブミン等のタンパク質等が挙げられる。細胞外小胞は一般にリン脂質二重層によって細胞質基質と区切られているものである。
　本発明の担体を用いたサイズ排除クロマトグラフィは、生体試料からの細胞外小胞、特にエクソソームの分離、精製に有用である。なお、エクソソームの平均粒子径は、概ね４０～１５０ｎｍである。
　また、微小物質を含有する生体試料としては、微小物質を含有していれば固体であっても、液体であっても制限されない。サイズ排除クロマトグラフィは、通常、液状物質を対象としている。例えば、生体試料が固体の場合、生体試料を液状の媒体に溶解、分散させて液状にして、サイズ排除クロマトグラフィを行えばよい。
　微小物質を含有する生体試料として、具体的には細胞培養上清または生体液が挙げられる。生体液としては、血液（血漿、血清）、尿、唾液、骨髄液、精液、母乳、羊水、涙、リンパ液、生検組織が挙げられる。細胞培養上清としては、非ヒト血清の存在下で培養したヒト腫瘍細胞から得られた細胞培養上清、マウス腫瘍細胞から得られた細胞培養上清等が挙げられる。
　実施形態の担体を、サイズ排除クロマトグラフィに用いる場合、通常、サイズ排除クロマトグラフィ用のカラムに充填して用いられる。
　実施形態の担体を、サイズ排除クロマトグラフィに用いた場合、例えば、無機多孔質粒子を担体として用いた場合に比べて、同じ試料、例えば、エクソソームとタンパク質を含む血清試料からエクソソームとタンパク質を分画する場合、処理に要する時間を短縮でき、効率が向上する。さらに、無機多孔質粒子を担体として用いた場合に比べて、分画の精度が高く、得られるエクソソーム画分の純度の向上が図れる。
　以下に本発明の担体に係る実施例を説明する。例１～３、６が実施例であり、例４、５、７が比較例である。また、例８に超遠心分離法による参考例を示す。
［例１］
　無機多孔質粒子として多孔質シリカ粒子(ＡＧＣエスアイテック社製、商品名、「Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ　ＳＩＬ　Ｄ－７５－１０００ＡＷ」)を用いた。以下、この多孔質シリカ粒子をシリカゲル１と記す。シリカゲル１は、以下の方法で測定される、平均粒子径が７３．２μｍ、平均細孔径が１１０．１ｎｍ、細孔容積が０．８５ｍＬ／ｇ、比表面積が３０ｍ２／ｇである。
　シリカゲル１の平均粒子径は、ＬＡ－９５０Ｖ２（堀場製作所製）を用いてレーザー式光散乱法によって測定した。平均細孔径、細孔容積および比表面積は、オートポアＩＶ９５１０（島津製作所社製）を用いて水銀圧入法によって測定した。なお、以下のシリカゲルにおける物性も同様の方法で測定した。
　シリカゲル１の５０ｇに４００ｍＬのトルエン、１１．５ｍＬのジイソプロピルエチルアミン、１４．９ｍＬのγ－グリシドキシプロピルトリメトキシシランを加えて４．５時間還流させた。放冷後、ろ過し、１０００ｍＬのトルエン、５００ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、６６０ｍＬのメタノールで洗浄し、７０℃で一昼夜乾燥させて、カップリング剤処理したエポキシ基を有する密着層付きシリカゲル１を得た。
　カップリング剤処理したシリカゲル１の２１ｇを８４ｍＬの０．５質量％の塩酸水溶液に室温で一昼夜浸漬させ、ろ過し、６３０ｍＬの蒸留水、６３０ｍＬのメタノールで洗浄し、７０℃で一昼夜乾燥させて、エポキシ基が開環してジオール化された密着層付きシリカゲル１を得た。
　得られたジオール化された密着層付きシリカゲル１の１０ｇに、０．２８ｇのデナコールＥＸ－５２１（商品名、ナガセケムテックス社製；ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、Ｍｗ：１２９４）と８．５ｍＬのメタノールとの混合液を加えて、室温で３０分混合した。その後、７０℃で一昼夜乾燥させた。
　これに４０ｍＬのデカン、９．２ｍｇのトリス（ペンタフルオロフェニル）ボランを加えて、１００℃で４時間撹拌した。放冷後、ろ過し、２００ｍＬのトルエン、２００ｍＬのメタノール、２００ｍＬの塩酸水溶液、２００ｍＬのメタノールで洗浄し、７０℃で一昼夜乾燥させた。
　これに再度０．２８ｇのデナコールＥＸ－５２１と８．５ｍＬのメタノールとの混合液を加えて、室温で３０分混合した。その後、７０℃で一昼夜乾燥させた。さらに４０ｍＬのデカン、９．２ｍｇのトリス（ペンタフルオロフェニル）ボランを加えて、１００℃で４時間撹拌した。放冷後、ろ過し、２００ｍＬのトルエン、２００ｍＬのメタノール、２００ｍＬの塩酸水溶液で洗浄し、７０℃で一昼夜乾燥させて、シリカゲル１の表面に密着層を介して親水性有機物層を有する担体１を得た。
　得られた担体１をＳＵＭＩＧＲＡＰＨ　ＮＣ－８０（住友化学社製）を用いて元素分析した結果、担体１全量に対する担体１が含有するカーボン量の割合は、３．４５質量％であった。なお、同様にして測定されたジオール化された密着層付きシリカゲル１中のカーボン含有量は、０．９５質量％であった。これらから、担体１全量に対する親水性有機物層が含有するカーボン量の割合は、２．５０質量％と求められる。また、得られたカーボン量から密着層の固定化量が１３２μｍｏｌ／ｇ、親水性有機物層の固定化量が４６３μｍｏｌ／ｇと求められる。さらに、同様にして担体全量に対するＮ量の割合（質量％）を求めた。さらに、波長分散型蛍光Ｘ線分析装置ＺＳＸ１００ｅ（リガク製）を用いてＣｌ量の割合（質量％）を求めた。表１に結果を示す。
　なお、表１においてはカーボン量を「Ｃ量」と表示した。密着層、親水性有機物層における、Ｃ量の割合は、担体全量に対する密着層または親水性有機物層が含有するＣ量の割合（質量％）である。担体合計におけるＮ量の割合（質量％）およびＣｌ量の割合（質量％）は、密着層がＮ、Ｃｌを含有しないことから、親水性有機物層における、Ｎ量の割合（質量％）およびＣｌ量の割合（質量％）に相当する。
［評価］
　得られた担体１の４．５ｇを、カラム（内径；１５ｍｍ、長さ；８５ｍｍ）に充填して、サイズ排除クロマトグラフィ１とした。所定量のＣＤ９を有するエクソソームとタンパク質を含む血清試料５００μＬをサイズ排除クロマトグラフィ１の入口から注入して、出口から順次排出されるフラクションを排出開始時からの経過時間毎（１分毎）に回収し分析に用いた。
　各回収時間で得られたフラクションについて含有するエクソソーム由来ＣＤ９量を、パーキンエルマー社製（Ｅｎ　ｓｐｉｒｅ）を用いて、エクソスクリーン法にて測定した。同様に、総タンパク質量をＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製フルオロメーター（製品名：ＱＵＢＩＴ）を用いて定量した。各フラクションについて、上記で得られたエクソソームＣＤ９量と総タンパク質量の比の値（エクソソームＣＤ９量／総タンパク質量）を純度の指標として用いた。エクソソームの回収量が最も大きいフラクションが得られた回収時間（排出開始時からの経過時間）をエクソソーム回収の処理時間とした。エクソソームの回収量が最も大きいフラクションのエクソソームＣＤ９強度と総タンパク質量の比をとり純度を算出した。エクソソーム回収の処理時間、該処理時間におけるフラクションのエクソソームＣＤ９強度と総タンパク質量、およびその比を、結果を表１に示す。
［例２］
　上記した例１による担体１の作製において、多孔質シリカ粒子として、シリカゲル２(ＡＧＣエスアイテック社製、商品名、「Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ　ＳＩＬ　Ｄ－５０－１０００ＡＷ」）を用いた以外は同様にして、担体２を作製した。なお、シリカゲル２の平均粒子径は４５．６μｍ、平均細孔径が９６．８ｎｍ、細孔容積が１．７７ｍＬ／ｇ、比表面積が７１ｍ２／ｇである。
　担体２全量に対する担体２が含有するカーボン量の割合は、８．０７質量％であった。なお、同様にして測定されたジオール化された密着層付きシリカゲル１中のカーボン含有量の割合は、２．０９質量％であった。これらから、担体２全量に対する親水性有機物層が含有するカーボン量の割合は、５．９８質量％と求められる。また、得られたカーボン量から密着層の固定化量が２９０μｍｏｌ／ｇ、親水性有機物層の固定化量が１１０８μｍｏｌ／ｇと求められる。
［例３］
　上記した例１による担体１の作製において、多孔質シリカ粒子として、シリカゲル３(ＡＧＣエスアイテック社製、商品名、「Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ　ＳＩＬ　Ｄ－５０－７００ＡＷ」）を用いた他は同様にして、担体３を作製した。なお、シリカゲル３の平均粒子径は４５．１μｍ、平均細孔径は６９．５ｎｍ、細孔容積は０．８１ｍＬ／ｇ、比表面積は４７ｍ２／ｇである。
　担体３全量に対する担体３が含有するカーボン量の割合は、３．５７質量％であった。なお、同様にして測定されたジオール化された密着層付きシリカゲル３中のカーボン含有量の割合は、１．４４質量％であった。これらから、担体３全量に対する親水性有機物層が含有するカーボン量の割合は、２．１３質量％と求められる。また、得られたカーボン量から密着層の固定化量が２００μｍｏｌ／ｇ、親水性有機物層の固定化量が３９４μｍｏｌ／ｇと求められる。
［例４、例５］
　上記した例１と同様にしてジオール化された密着層付きシリカゲル１を作製し担体４とした。また、上記した例１に用いたシリカゲル１を担体５とした。
［例６］
　無機多孔質粒子として多孔質シリカ粒子(ＡＧＣエスアイテック社製、商品名、「Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ　ＳＩＬ　ＤM－３５－７００ＡＷ」)を用いた。以下、この多孔質シリカ粒子をシリカゲル４と記す。シリカゲル４は、以下の方法で測定される、平均粒子径が３５．５μｍ、平均細孔径が７２．７ｎｍ、細孔容積が１．７４ｍＬ／ｇ、比表面積が９２ｍ２／ｇである。
　シリカゲル４の１０ｇに８０ｍＬのトルエン、７．０ｍＬのジイソプロピルエチルアミン、１７．８ｍＬの２－［メトキシ（ポリエチレンオキシ）６－９プロピル］トリメトキシシランを加えて４．５時間還流させた。放冷後、ろ過し、２０００ｍＬのトルエン、２００ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、２６４ｍＬのメタノールで洗浄し、７０℃で一昼夜乾燥させて、親水性有機物層を有する担体６を得た。
　担体６全量に対する担体６が含有するカーボン量の割合は、４．１３質量％であった。また、得られたカーボン量から固定化量が１８４μｍｏｌ／ｇと求められる。
［例７］
　無機多孔質粒子として例２で使用したシリカゲル２を使用し、例１と同様にジオール化された密着層付きシリカゲルを得た。
　例２による担体２の作製において、０．８６５ｇのポリグリセロールポリグリシジルエーテル（Ｍｗ：２５８０）を用いた他は同様にして、担体７を作製した。なお、シリカゲル２の平均粒子径は４５．６μｍ、平均細孔径は９６．８ｎｍ、細孔容積は１．７７ｍＬ／ｇ、比表面積は７１ｍ２／ｇである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［例８］
　超遠心分離機（日立工機製ＳＣＰ８５Ｈ）を用いて超遠心分離法によりエクソソームの回収を行った。検体は、例１で用いたのと同様の、所定量のＣＤ９を有するエクソソームとタンパク質を含む血清試料５００μＬとした。超遠心分離機における総処理時間を４８０分とし、得られた分画について、例１と同様にしてエクソソームＣＤ９量と総タンパク質量を測定し、その比の値（エクソソームＣＤ９量／総タンパク質量）を求めたところ０．５であった。
　本発明によれば、生体由来の微小物質、特には細胞外小胞を効率よく回収することが可能なサイズ排除クロマトグラフィ担体が提供できる。このような、本発明のサイズ排除クロマトグラフィ担体は、高い純度で目的の微小物質を分離できる可能性があり、また、生理活性を損なわずに細胞外小胞を回収することが可能であるため、精度を上げた検査の検体に利用可能であるなど、検査・診断分野等への利用が期待できる。
　なお、２０１８年４月１６日に出願された日本特許出願２０１８－０７８１６９号の明細書、特許請求の範囲および要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (15)

  1. 　無機多孔質粒子と、前記無機多孔質粒子の表面に固定化された親水性有機物層と、を有するサイズ排除クロマトグラフィの担体であって、前記担体中のカーボン量が１．５質量％～１０質量％であるサイズ排除クロマトグラフィ担体。
  2. 　前記担体中のＮ量が０．５質量％以下である請求項１に記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
  3. 　前記担体中のＣｌ量が０．５質量％以下である請求項１または２に記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
  4. 　前記親水性有機物層がポリオキシエチレン基を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
  5. 　前記無機多孔質粒子の単位質量に対する前記親水性有機物層の固定化量が、２００μｍｏｌ／ｇ～１６００μｍｏｌ／ｇである請求項１～４のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
  6. 　前記親水性有機物層がジオール基を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
  7. 　前記親水性有機物層がアクリル基由来、またはメタクリル基由来のカルボニル構造を含まない請求項１～６のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
  8. 　前記無機多孔質粒子は、多孔質シリカ粒子である、請求項１～７のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
  9. 　前記無機多孔質粒子は、平均粒子径が１μｍ～５００μｍである、請求項１～８のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
  10. 　前記無機多孔質粒子は、水銀圧入法により測定される平均細孔径が４０ｎｍ～１１５ｎｍである、請求項１～９のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体を製造する方法であって、
    　前記親水性有機物層として、質量平均分子量が２００～２０００である親水性樹脂を、前記無機多孔質粒子の表面に塗布し、硬化させることを含むサイズ排除クロマトグラフィ担体の製造方法。
  12. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体を製造する方法であって、
    　前記親水性有機物層として、質量平均分子量が２００～２０００である親水性樹脂の前駆体を含む親水性有機物層形成用組成物を、前記無機多孔質粒子の表面に塗布し、硬化させることを含むサイズ排除クロマトグラフィ担体の製造方法。
  13. 　前記親水性樹脂の前駆体は、３個以上のジオール基を含み、質量平均分子量が２００～２０００である請求項１２に記載の製造方法。
  14. 　前記親水性樹脂の前駆体は、グリセロールポリグリシジルエーテルおよびポリグリセロールポリグリシジルエーテルから選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１２または１３に記載の製造方法。
  15. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のサイズ排除クロマトグラフィ担体を用いた、細胞培養上清または生体液から微小物質を回収する方法。
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