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WO2019107354A1 - 神経系細胞の作製方法 - Google Patents

神経系細胞の作製方法 Download PDF

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WO2019107354A1
WO2019107354A1 PCT/JP2018/043573 JP2018043573W WO2019107354A1 WO 2019107354 A1 WO2019107354 A1 WO 2019107354A1 JP 2018043573 W JP2018043573 W JP 2018043573W WO 2019107354 A1 WO2019107354 A1 WO 2019107354A1
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WO
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cells
positive
sendai virus
producing
mrna
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PCT/JP2018/043573
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English (en)
French (fr)
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剛士 田邊
井上　誠
亜峰 朱
豊隆 森
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ID Pharma Co Ltd
I Peace Inc
Original Assignee
ID Pharma Co Ltd
I Peace Inc
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Publication date
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Priority to US16/768,526 priority patent/US20200392455A1/en
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Priority to JP2019557236A priority patent/JP6783954B2/ja
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
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    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
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    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
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    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to cell technology and relates to a method of producing neural cells.
  • iPS cells Induced pluripotent stem cells
  • iPS cells can be transformed into any cell that constitutes the body. Therefore, iPS cells that can be converted to various types of somatic cells and tissues are expected to be used for cell transplantation therapy and drug discovery research. Also, for example, in 2014, retinal cells generated from iPS cells were applied to transplantation treatment. Not only in Japan, but in various countries all over the world, projects of preparing brain cells and cells of various organs from iPS cells are in progress for transplantation treatment.
  • the method of inducing iPS cells and embryonic stem cells (ES cells) to differentiated cells combines hormones and growth factors that determine the properties of the cells, and low molecular weight compounds, and changes their quantitative ratio and concentration over time It has been carried out by imitating the process of development. However, it is difficult to imitate the developmental process completely in vitro and it is inefficient. In addition, in the case of humans, a very long induction period is required as compared with the induction period of mouse somatic cells, and conventionally, for example, three months or more are required to produce a mature nerve.
  • somatic cells derived from human ES / iPS cells using a method of utilizing hormones or chemicals are somatic cells at the fetal stage at an early stage.
  • the induction of human mature somatic cells is extremely difficult and requires long-term culture over several months.
  • drug discovery and transplantation for individuals whose development has been completed it is important to produce somatic cells that match the degree of maturity of the individual.
  • a method has been proposed in which a target somatic cell is produced by directly introducing a gene that defines a specific somatic property into ES / iPS cells using a deoxyribonucleic acid (DNA) virus that integrates into the genome.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • the method using a DNA virus that integrates into the genome can specifically generate mature neurons in a very short period of time, for example, two weeks, as compared to methods using hormones or chemicals.
  • nerve cells are produced by specific gene transfer, for example, only excitatory nerves can be uniformly obtained. Therefore, specific neural subtype specific drug discovery screening is possible, and it is considered that in transplantation medicine, it is possible to concentrate and transplant only specific cells having a disease.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing neural cells, which can efficiently produce neural cells in a short period of time without damaging cell genes.
  • stem cells are prepared by preparing stem cells, and introducing Sendai virus into stem cells by infection, and expressing messenger ribonucleic acid (mRNA) which synthesizes an inducer to Sendai virus in stem cells.
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • a method of producing neural cells comprising inducing neural cells.
  • the stem cells may be induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the stem cells may be embryonic stem cells (ES cells).
  • the inducer may contain neurogenin (NGN).
  • the inducer may comprise only neurogenin (NGN).
  • the inducer may contain achaete-scute homolog (ASCL).
  • ASCL achaete-scute homolog
  • the inducer may contain myelin transcription factor (MYT).
  • MYT myelin transcription factor
  • the inducer may include distant-less homeobox (DLX).
  • DLX distant-less homeobox
  • the neural cells may be any of neural cells, neural stem cells and neural progenitor cells.
  • the nerve cell may be at least one selected from the group consisting of excitatory nerve cells, inhibitory nerve cells, dopamine producing nerve cells, motor nerve cells, and cerebral nerve cells.
  • the neural cells may be oligodendrocyte precursor cells and oligodenrodocytes.
  • neural cells may be at least one selected from NGN gene positive, ASCL gene positive, MYT gene positive, and DLX gene positive.
  • neural cells are tyrosine hydroxylase (TH) positive, TUJ1 positive, BRN2 positive, BRN2 positive, NGN positive, ⁇ -III Tubulin positive, MAP2 positive, PSA-NCAM positive, vGLUT positive, SATB2 positive And at least one selected from the group consisting of chAT positive, HB9 positive, MUNC 13 positive, HOMER1 positive, vGAT positive, and GAD 65/67 positive.
  • TH tyrosine hydroxylase
  • Sendai virus may express mRNA of a drug resistant gene in stem cells.
  • the drug resistant gene may be at least one selected from the group consisting of a puromycin resistant gene, a blasticidin resistant gene, a hygromycin resistant gene, and a neomycin resistant gene.
  • the above method for producing neural cells may include selecting cells exhibiting drug resistance after stem cells are infected with Sendai virus.
  • the above method for producing neural cells comprises, after infection of stem cells with Sendai virus, cells showing at least one drug resistance selected from the group consisting of puromycin resistance, blastcidin resistance, hygromycin resistance, and neomycin resistance. It may include selecting.
  • the density of stem cells upon infection with Sendai virus is 0.2 ⁇ 10 5 cells / well to 1.0 ⁇ 10 6 cells / well in the wells of a 12-well plate May be
  • the multiplicity of infection (MOI: multiplicity of infection) may be 0.1 to 100.0 per round.
  • the medium used to infect stem cells with Sendai virus may be any one selected from mTeSR (registered trademark) 1, TeSR2 (registered trademark) and Stem Fit.
  • the present invention it is possible to provide a method for producing neural cells that can efficiently produce neural cells in a short period of time without damaging the cell gene.
  • FIG. 1 is a photomicrograph of cells according to Example 1.
  • FIG. 7 is a fluorescence-microscope photograph of the cell fluorescently labeled using the anti- BRN2 antibody which concerns on Example 1.
  • FIG. 7 is a fluorescence micrograph of a cell fluorescently labeled using an anti-HOMER1 antibody according to Example 2.
  • FIG. 7 is a fluorescence micrograph of a cell fluorescently labeled using an anti-MAP2 antibody according to Example 3.
  • FIG. FIG. 16 is a fluorescence micrograph of a cell fluorescently labeled using an anti-UNC13-1 antibody according to Example 4.
  • FIG. 7 is a fluorescence micrograph of a cell fluorescently labeled using an anti-SATB2 antibody according to Example 5.
  • FIG. 5 is a fluorescence micrograph of a cell fluorescently labeled using an anti-SATB2 antibody according to Example 5.
  • FIG. 12 (a) and 12 (b) are photomicrographs of cells according to Example 11.
  • FIG. 12 (a) and 12 (b) are photomicrographs of cells according to Example 11.
  • FIG. 12 (c) is a fluorescence micrograph of a cell fluorescently labeled using the anti-TUJ1 antibody according to Example 11.
  • 21 is a fluorescence micrograph of a cell fluorescently labeled using an anti-BRN2 antibody according to Example 12.
  • FIG. It is a fluorescence-microscope photograph of the cell fluorescently labeled using the anti-GAD65 / 67 antibody based on Example 13.
  • FIG. It is a fluorescence-microscope photograph of the cell fluorescently labeled using the anti-MAP2 antibody which concerns on Example 14.
  • FIG. 15 is a fluorescence micrograph of a cell fluorescently labeled using an anti-vGAT antibody according to Example 15.
  • FIG. 16 It is a fluorescence-microscope photograph of the cell fluorescently labeled using the anti-TUJ1 antibody based on Example 16.
  • FIG. It is a fluorescence-microscope photograph of the cell fluorescently labeled using the anti-MAP2 antibody based on Example 17.
  • FIG. It is a fluorescence-microscope photograph of the cell fluorescently labeled using the anti- BRN2 antibody based on Example 18.
  • FIG. It is a fluorescence-microscope photograph of the cell fluorescently labeled using the anti-vGAT antibody which concerns on Example 19.
  • FIG. It is a fluorescence-microscope photograph of the cell fluorescently labeled using the anti-GAD65 / 67 antibody which concerns on Example 20.
  • FIG. 21 is a fluorescence micrograph of a cell fluorescently labeled using the anti-vGLUT antibody according to Example 23.
  • FIG. 24 is a graph showing the results of flow cytometry according to Example 25.
  • a method of producing a somatic cell from a stem cell comprises preparing a stem cell, introducing a Sendai virus into the stem cell by infection, and expressing an mRNA which synthesizes an inducer to the Sendai virus in the stem cell. And inducing stem cells into neurons.
  • stem cells both induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells) can be used.
  • the stem cells may be human stem cells or non-human animal stem cells.
  • Induction refers to reprogramming, reprogramming, transformation, transdifferentiation or lineage reprogramming, differentiation induction, cell fate reprogramming, etc.
  • induced neural cells include neural cells, neural stem cells and neural progenitor cells.
  • nerve cells include excitatory nerve cells, inhibitory nerve cells, dopamine producing nerve cells, motor nerve cells, and cerebral nerve cells.
  • neural cells may be oligodendrocyte precursor cells, oligodenrodocytes and the like.
  • Sendai virus (SeV) introduced into stem cells has an RNA genome that expresses mRNA that synthesizes an inducer that induces stem cells to neurons.
  • production of a recombinant Sendai virus vector capable of expressing an arbitrary mRNA is, for example, commissioned by ID Pharma Co., Ltd. using patent technology.
  • mRNA for synthesizing an inducer include mRNA of NGN gene such as NGN2, mRNA of ASCL gene such as ASCL1, mRNA of MYT gene such as MYT1L, and mRNA of DLX gene such as DLX2.
  • NGN2, ASCL1, MYT1L, and DLX2 are switch proteins necessary for neural cell generation.
  • NGN2 can generate excitatory neurons.
  • Each of ASCL1, MYT1L, and DLX2 can generate inhibitory neurons.
  • the combination of ASCL1 and MYT1L can generate excitatory neurons, suppressive neurons, and dopaminergic neurons.
  • Sendai virus introduced into stem cells may be mRNA of an NGN gene such as NGN2, mRNA of an ASCL gene such as ASCL1, mRNA of an MYT gene such as MYT1L, and DLX gene such as DLX2 as mRNA for synthesizing an inducer. At least one selected from mRNA is expressed.
  • Sendai virus may have an RNA genome that expresses mRNA of a drug resistance gene.
  • the drug is, for example, an antibiotic such as puromycin, blasticidin, hygromycin, neomycin, G418, and zeocin.
  • Sendai virus introduced into stem cells expresses mRNA of a drug resistant gene. Cells expressing the drug resistant gene mRNA exhibit drug resistance.
  • Sendai virus When Sendai virus expresses mRNA of a drug resistant gene, cells showing drug resistance may be selected after infection.
  • Sendai virus expresses at least one of puromycin resistance gene, blasticidin resistance gene, hygromycin resistance gene, neomycin resistance gene, G418 resistance gene, and mRNA of Zeocin (registered trademark) resistance gene
  • the Sendai virus may have, for example, an RNA capable of expressing an mRNA including the mRNA of the NGN2 gene and an mRNA of the puromycin resistance gene (hereinafter referred to as “NGN2-Puro mRNA”).
  • NGN2-Puro mRNA an RNA capable of expressing an mRNA including the mRNA of the NGN2 gene and an mRNA of the puromycin resistance gene
  • the sequence of mRNA of NGN2 gene corresponds to, for example, the sequence of DNA shown in SEQ ID NO: 1 (mouse) or SEQ ID NO: 2 (human). Cells in which NGN2-Puro mRNA is expressed produce NGN2 and show puromycin resistance.
  • the Sendai virus has, for example, an RNA capable of expressing the mRNA of the ASCL1 gene, the mRNA of the MYT1L gene, and the mRNA containing the puromycin resistance gene (hereinafter referred to as "ASCL1-MYT1L-Puro mRNA"). It is also good.
  • the sequence of mRNA of the ASCL1 gene corresponds to, for example, the sequence of DNA shown in SEQ ID NO: 3 (mouse) or SEQ ID NO: 4 (human).
  • the sequence of mRNA of MYT1L gene corresponds to, for example, the sequence of DNA shown in SEQ ID NO: 5 (mouse), SEQ ID NO: 6 (mouse), SEQ ID NO: 7 (mouse) or SEQ ID NO: 8 (human).
  • Cells expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA produce ASCL1 and MYT1L and show puromycin resistance.
  • the Sendai virus may have, for example, an RNA capable of expressing the mRNA of the DLX2 gene and the mRNA containing the blasticidin resistant gene (hereinafter referred to as "DLX2-Blast mRNA").
  • the sequence of mRNA of the DLX2 gene corresponds to, for example, the sequence of DNA shown in SEQ ID NO: 9 (mouse) or SEQ ID NO: 10 (human). Cells expressing DLX2-Blast mRNA produce DLX2 and are blasticidin resistant.
  • Sendai virus is introduced into stem cells by being suspended in a cell culture solution. Sendai virus recognizes cell surface antigens and infects stem cells.
  • the density of stem cells upon infection with Sendai virus is, for example, 0.2 ⁇ 10 5 cells / well to 1.0 ⁇ 10 6 cells / well, 0.5 ⁇ 10 5 cells / well in a well of a 12-well plate From 8.0 ⁇ 10 5 per well, or from 1.0 ⁇ 10 5 per well to 4 ⁇ 10 5 per well.
  • the titer of Sendai virus to be used is, for example, 1 ⁇ 10 12 CIU / mL to 1 ⁇ 10 5 CIU / mL, 1 ⁇ 10 10 CIU / mL to 1 ⁇ 10 6 CIU / mL, or 1 ⁇ 10 9 CIU. / ML to 1 ⁇ 10 7 CIU / mL.
  • the multiplicity of infection (MOI: multiplicity of infection) of Sendai virus is, for example, 0.1 to 100.0, 1.0 to 50.0, or 1.0 to 20.0 at one time.
  • Media used for infection with Sendai virus are, for example, stem cell media such as mTeSR1, TeSR2, (registered trademark, STEMCELL Technologies Inc.), and Stem Fit (Reprocel Co., Ltd.).
  • the medium may be replaced with a medium suitable for inducing neural cells (hereinafter also referred to as "neural induction medium”).
  • nerve induction media for example, NDiff 227 (registered trademark, TAKARA BIO INC.), Neurobasal (registered trademark, Thermo Fisher Scientific Inc.), Human ES / iPS Neuronal Differentiation Medium (Merck KGaA), N3 medium, etc. are listed.
  • Be N3 medium is prepared, for example, by adding 10 mL of B27, 5 mL of N2 supplement (Thermo Fisher Scientific Inc.) and 1.6 mL of insulin at a concentration of 6.25 mg / mL to 500 mL of DMEMF12.
  • the medium used during and after Sendai virus infection may contain B18R protein.
  • B18R protein attenuates the cell's innate antiviral response.
  • B18R proteins may be used to suppress cell death associated with the immune response associated with viral infection.
  • the medium since the method according to the embodiment can produce neural cells from stem cells in a short period of time, the medium may not contain the B18R protein, or the B18R protein may be 0.01% to 1%. It may be contained at a low concentration.
  • Stem cells are induced to neural cells within 25 days, 20 days, 10 days, 9 days, 8 days, 7 days, 6 days, 5 days or 4 days of infection with Sendai virus .
  • Whether stem cells are induced to neural cells or not can be determined by, for example, MAP2, TUJ1 ( ⁇ -IIITubulin), BRN2, HOMER1, NGN such as NGN, PSA-NCAM, MUNC13-1, SATB2, vGLUT, chAT, HB9, LHX3 , GAD 65, GAD 67, TH, ASCL1 (MASH1), etc. whether at least one selected from ASCL, vGAT, SOX1, SOX2, CD133, Nestin, HB9, ISL1, O4, PLP1, MOG, and MBP is positive or not Confirmed by
  • NGN2 is a switch protein necessary for neural cell generation, and is a marker for excitatory neurons.
  • TUJ1 ⁇ -IIITubulin
  • MAP2, BRN2, ASCL1 MASH1
  • PSA-NCAM PSA-NCAM
  • HOMER1 and MUNC13-1 are markers of mature neurons that make synapses.
  • SATB2 is a marker of cerebral cortical neurons.
  • vGLUT is a marker for excitatory neurons such as glutamatergic neurons.
  • chAT is a marker of motor neurons such as cholinergic neurons.
  • HB9 is a marker for motor neurons.
  • GAD65 and GAD67 are markers of inhibitory neurons such as GABAergic neurons.
  • TH is a marker for dopaminergic neurons.
  • vGAT is a marker of inhibitory neurons.
  • SOX1, SOX2, CD133, and Nestin are markers of neural stem cells.
  • LHX3, HB9 and ISL1 are markers for motor neurons.
  • O4, PLP1, MOG and MBP are markers of oligodendrocyte precursors.
  • GFAP and CD44 can be used as markers of astrocyte precursor and astrocyte.
  • the neural cells can be efficiently integrated without causing damage to the stem cell genes. It is possible to make.
  • the method of producing neural cells from stem cells using only hormones and chemical substances only a part of the stem cells become target neural cells.
  • most of the cells in which Sendai virus infection has been established can be the target nervous system cells.
  • mRNA of the drug resistance gene can be simultaneously expressed, so drug selection of cells into which Sendai virus has been introduced is possible. Therefore, it is possible to avoid the risk of contaminating cells and formation of teratoma which have not been induced, which is suitable for transplantation medical treatment.
  • the Sendai virus is used, and the virus for inserting a gene into the genome is not used. Therefore, since it is integration free, stem cell genes are not damaged, and there is no risk of canceration in the produced nervous system cells, clinical application is possible.
  • iPS cells are produced from cells of blood in a completely closed clean environment, and subsequently, by the method according to the embodiment of the present invention, neural cells from iPS cells are completely closed clean environment It is possible to produce more clean and safe nervous system cells if produced under.
  • Example 1 A Sendai virus capable of expressing NGN2-Puro mRNA was prepared by ID Pharma Co., Ltd. The titer of Sendai virus prepared was 1 ⁇ 10 9 CIU / mL.
  • ROCK Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho binding kinase inhibitor
  • the iPS cells were dispersed in tissue / cultured cell detachment / separation / dispersion solution (Accutase, Innovative Cell Technologies) and seeded in 12-well dishes.
  • Sendai virus infected iPS cells were seeded at a density of 2 ⁇ 10 5 cells per well.
  • Control iPS cells not infected with Sendai virus were also seeded at a density of 2.0 ⁇ 10 5 cells per well.
  • iPS cells were cultured in a feeder-free medium under gaseous conditions of 5% carbon dioxide and 20% oxygen for 24 hours.
  • the iPS cells were infected with a Sendai virus capable of expressing NGN2-Puro mRNA so that the MOI was 20.
  • the medium in the wells was replaced with neural induction medium (N3 medium) containing puromycin at a concentration of 2 ⁇ g / mL to kill uninfected cells.
  • N3 medium was prepared by adding 10 mL of B27, 5 mL of N2 and 1.6 mL of insulin at a concentration of 6.25 mg / mL to 500 mL of DMEMF12.
  • FIG. 1 Photomicrographs of the cells on days 2, 3, 5, and 7 after Sendai virus infection are shown in FIG. 1 (a).
  • FIG. 1 it was morphologically confirmed that cells were induced to neural cells after Sendai virus infection.
  • the medium was removed from the plate and the cells were washed with PBS.
  • 4% paraformaldehyde (PFA) was added to the plate and reacted for 15 minutes at 4 ° C. to fix the cells.
  • the primary antibody was diluted with PBS medium containing 5% CCS and 0.1% Triton, and added to the plate.
  • a primary antibody a goat monoclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology) against BRN2, which is a marker for nerve cells, was used.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, a Sendai virus capable of expressing NGN2-Puro mRNA is used to infect iPS cells, and a rabbit monoclonal antibody (SYNAPTIC SYSTEMS) against HOMER1, which is a marker of mature neurons that form synapses as a primary antibody, is used. The cells were then fluorescently labeled and observed with a fluorescent microscope. As a result, as shown in FIG. 3, it was confirmed that the induced neural cells expressed HOMER1.
  • SYNAPTIC SYSTEMS rabbit monoclonal antibody against HOMER1
  • Example 3 As in Example 1, iPS cells are infected with Sendai virus capable of expressing NGN2-Puro mRNA, and the cells are fluorescent using a mouse monoclonal antibody (Sigma Aldrich) against MAP2 which is a marker of nerve cells as a primary antibody. It was labeled and observed with a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 4, it was confirmed that the induced nervous system cells expressed MAP2.
  • Example 4 Similar to Example 1, iPS cells are infected with a Sendai virus capable of expressing NGN2-Puro mRNA, and a rabbit monoclonal antibody (SYNAPTIC SYSTEMS) against MUNC13-1, which is a marker of mature neurons that form synapses as a primary antibody The cells were fluorescently labeled using and observed with a fluorescent microscope. As a result, as shown in FIG. 5, it was confirmed that the induced neural cells expressed MUNC13-1.
  • SYNAPTIC SYSTEMS rabbit monoclonal antibody
  • Example 5 As in Example 1, iPS cells are infected with Sendai virus capable of expressing NGN2-Puro mRNA, and the cells are fluorescent using a mouse monoclonal antibody (Abcam) against SATB2, which is a marker of cerebral neurons, as a primary antibody. It was labeled and observed with a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 6, it was confirmed that the induced nervous system cells expressed SATB2.
  • Abcam mouse monoclonal antibody against SATB2
  • Example 6 As in Example 1, iPS cells are infected with Sendai virus capable of expressing NGN2-Puro mRNA, and the cells are fluorescently labeled using a mouse monoclonal antibody (Biolegend) against TUJ1 which is a marker for neurons as a primary antibody. And observed with a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 7, it was confirmed that the induced nervous system cells expressed TUJ1.
  • Example 7 Similar to Example 1, iPS cells are infected with Sendai virus capable of expressing NGN2-Puro mRNA, and a rabbit monoclonal antibody against vGLUT, which is a marker for excitatory neurons such as glutamatergic neurons as a primary antibody ( The cells were fluorescently labeled using SYNAPTIC SYSTEMS) and observed under a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 8, it was confirmed that the induced neural cells expressed vGLUT.
  • Example 8 As in Example 1, iPS cells are infected with Sendai virus capable of expressing NGN2-Puro mRNA, and the cells are fluorescent using a mouse monoclonal antibody (Millipore) against chAT, a marker of motor neurons as a primary antibody. It was labeled and observed with a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 9, it was confirmed that the induced neural cells expressed chAT.
  • Example 9 As in Example 1, iPS cells are infected with Sendai virus capable of expressing NGN2-Puro mRNA, and the cells are fluorescent as primary antibodies using a mouse monoclonal antibody (Thermo) to HB9, a marker of motor neurons. It was labeled and observed with a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 10, it was confirmed that the induced nervous system cells expressed HB9.
  • Example 10 As in Example 1, iPS cells are infected with Sendai virus capable of expressing NGN2-Puro mRNA, and cells are used as a primary antibody using sheep monoclonal antibody (Pel Freez) against TH which is a marker of dopamine producing neurons. Were fluorescently labeled and observed with a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 11, it was confirmed that the induced nervous system cells expressed TH.
  • Example 11 Sendai virus was used to infect iPS cells in the same manner as in Example 1 except that Sendai virus capable of expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA and DLX2-Blast mRNA was used. Photomicrographs of the cells on days 2, 5, 11, and 21 after Sendai virus infection are shown in FIG. 12 (a). A photomicrograph of the cells on day 24 after Sendai virus infection is shown in FIG. 12 (b). As shown in FIGS. 12 (a) and 12 (b), it was morphologically confirmed that the cells were induced to neural cells after Sendai virus infection.
  • TUJ1 is a general marker of nerve cells as a primary antibody and observed under a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 12 (c), it was confirmed that the induced nervous system cells expressed TUJ1.
  • Example 12 Similar to Example 11, iPS cells are infected with Sendai virus capable of expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA and DLX2-Blast mRNA, and a goat monoclonal antibody against BRN2, which is a neuronal marker, as a primary antibody ( The cells were fluorescently labeled using Santa Cruz Biotechnology) and observed with a fluorescent microscope. As a result, as shown in FIG. 13, it was confirmed that the induced neural cells expressed BRN2.
  • Example 13 As in Example 11, iPS cells are infected with Sendai virus capable of expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA and DLX2-Blast mRNA, and it is a marker of inhibitory (GABAergic) neurons as a primary antibody. Cells were fluorescently labeled using a mouse monoclonal antibody (Millipore) against certain GAD 65/67 and observed under a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 14, it was confirmed that the induced neural cells expressed GAD65 / 67.
  • Example 14 Similar to Example 11, iPS cells are infected with Sendai virus capable of expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA and DLX2-Blast mRNA, and as a primary antibody, a mouse monoclonal antibody against MAP2 which is a marker of neural cells ( Cells were fluorescently labeled using Sigma Aldrich) and observed with a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 15, it was confirmed that the induced nervous system cells expressed MAP2.
  • Example 15 Similar to Example 11, iPS cells are infected with a Sendai virus capable of expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA and DLX2-Blast mRNA, and a rabbit monoclonal for vGAT, a marker of inhibitory neurons as a primary antibody. Cells were fluorescently labeled using an antibody (SYNAPTIC SYSTEMS) and observed under a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 16, it was confirmed that the induced neural cells expressed vGAT.
  • Example 16 Sendai virus was used to infect iPS cells in the same manner as Example 1 except that Sendai virus capable of expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA was used. Twenty-one days after Sendai virus infection, cells were fluorescently labeled using a mouse monoclonal antibody (Biolegend) against TUJ1 which is a general marker of nerve cells as a primary antibody, and observed with a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 17, it was confirmed that the induced neural cells expressed TUJ1.
  • Example 17 A Sendai virus capable of expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA as in Example 22 is used to infect iPS cells, and a mouse monoclonal antibody (Sigma Aldrich) against MAP2 which is a marker of nerve cells is used as a primary antibody. Cells were fluorescently labeled and observed with a fluorescent microscope. As a result, as shown in FIG. 18, it was confirmed that the induced nervous system cells expressed MAP2.
  • Example 18 A Sendai virus capable of expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA as in Example 22 is used to infect iPS cells, and a goat monoclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology) against BRN2, which is a marker for neuronal cells, is used as a primary antibody. Cells were fluorescently labeled and observed with a fluorescent microscope. As a result, as shown in FIG. 19, it was confirmed that the induced neural cells expressed BRN2.
  • Example 19 Sendai virus capable of expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA is used to infect iPS cells, and a rabbit monoclonal antibody (SYNAPTIC SYSTEMS) against vGAT, a marker of inhibitory neurons, is used as a primary antibody.
  • the cells were fluorescently labeled and observed with a fluorescent microscope. As a result, as shown in FIG. 20, it was confirmed that the induced neural cells expressed vGAT.
  • Example 20 A Sendai virus capable of expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA as in Example 22 is used to infect iPS cells, and a mouse against GAD65 / 67, which is a marker of inhibitory neurons (GABAergic neurons) as a primary antibody.
  • the cells were fluorescently labeled using a monoclonal antibody (Millipore) and observed under a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 21, it was confirmed that the induced neural cells expressed GAD65 / 67.
  • Example 21 A Sendai virus capable of expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA as in Example 22 is used to infect iPS cells, and a sheep monoclonal antibody (Pel Freez) against TH which is a marker of dopamine producing neurons is used as a primary antibody.
  • the cells were fluorescently labeled and observed with a fluorescent microscope. As a result, as shown in FIG. 22, it was confirmed that the induced nervous system cells expressed TH.
  • Example 22 A Sendai virus capable of expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA as in Example 22 is used to infect iPS cells, and a goat monoclonal antibody (Millipore) against chAT, a marker of cholinergic neurons, is used as a primary antibody.
  • the cells were fluorescently labeled and observed with a fluorescent microscope. As a result, as shown in FIG. 23, it was confirmed that the induced neural cells expressed chAT.
  • Example 23 A Sendai virus capable of expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA as in Example 22 is used to infect iPS cells, and a rabbit monoclonal antibody against vGLUT, which is a marker of excitatory nerve (glutamatergic neurons), as a primary antibody ( The cells were fluorescently labeled using SYNAPTIC SYSTEMS) and observed under a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 24, it was confirmed that the induced neural cells expressed vGLUT.
  • Example 24 As in Example 22, iPS cells are infected with Sendai virus capable of expressing ASCL1-MYT1L-Puro mRNA, and cells are used as a primary antibody using a mouse monoclonal antibody (Abcam) against SATB2, which is a marker of cerebral nerve cells. Were fluorescently labeled and observed with a fluorescence microscope. As a result, as shown in FIG. 25, it was confirmed that the induced neural cells expressed SATB2.
  • Abcam mouse monoclonal antibody
  • Control cells which were not infected with Sendai virus capable of expressing the NGN2-Puro mRNA prepared in Example 1 were analyzed by flow cytometry to find that they are markers of nerve cells as shown in FIG. 26 (a).
  • PSA-NCAM was negative.
  • the cells infected with Sendai virus capable of expressing the NGN2-Puro mRNA prepared in Example 1 were analyzed by flow cytometry 7 days after infection, and as shown in FIG. PSA-NCAM which is a marker of was positive.
  • PSA-NCAM which is a marker for nerve cells, was positive even when analyzed by flow cytometry on day 4 after infection.
  • PSA-NCAM which is a marker for nerve cells
  • PSA-NCAM which is a marker for nerve cells
  • FIG. 26 The cells infected with Sendai virus capable of expressing the ASCL1-MYT1L-Puro mRNA prepared in Example 22 were analyzed by flow cytometry 7 days after infection, as shown in FIG. 26 (d), The marker for nerve cells, PSA-NCAM, was positive.
  • PSA-NCAM which is a marker for nerve cells

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Abstract

幹細胞を用意することと、幹細胞にセンダイウイルスを感染により導入し、幹細胞内でセンダイウイルスに誘導因子を合成するｍＲＮＡを発現させることで、幹細胞を神経系細胞に誘導することと、を含む、神経系細胞の作製方法。

Description

神経系細胞の作製方法
　本発明は、細胞技術に関し、神経系細胞の作製方法に関する。
　人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体を構成するあらゆる細胞に変化することができる。そのため、様々な種類の体細胞や組織に変化することができるｉＰＳ細胞は、細胞移植治療や創薬研究に利用されることが期待されている。また、例えば、２０１４年にはｉＰＳ細胞から作製された網膜の細胞が移植治療に応用された。日本のみならず、世界各国でも、ｉＰＳ細胞から脳の細胞や、各種臓器の細胞を作製し、移植治療に用いるプロジェクトが進んでいる。
　従来、ｉＰＳ細胞を分化細胞に変化させる方法は数多くある。しかし、ｉＰＳ細胞を移植治療に利用するためには、ｉＰＳ細胞の効率の良い誘導方法を確立することが重要である。具体的には、ｉＰＳ細胞を分化細胞へと誘導するときに用いる技術を確立し、誘導の効率及び精度を向上させ、作製した分化細胞の機能性などが移植治療に耐えうるものである必要がある。
　従来、ｉＰＳ細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から分化細胞へ誘導する方法は、細胞の性質を決定するホルモンや成長因子、並びに低分子化合物を組み合わせ、それらの量比や濃度を経時的に変える事で、発生の過程を模倣して行なわれてきている。しかし、発生の過程を試験管内で完全に模倣することは難しく効率が悪い。また、マウスの体細胞の誘導期間に比べてヒトの場合は非常に長い誘導期間が必要であり、例えば成熟した神経を作製するためには、従来、３ヶ月以上を要する。
　さらに、ＥＳ／ｉＰＳ細胞株によって誘導の効率が大きく異なり、誘導された体細胞の性質が不均一である等の問題がある。実際に、複数のＥＳ細胞クローンに化学物質を添加し、様々な細胞を作製したところ、膵臓の細胞に誘導しやすいクローンや、心臓の細胞に誘導しやすいクローンなどが存在し、クローンによって誘導されやすさに違いがあることが示された（例えば、非特許文献１参照。）。また、無血清凝集浮遊培養法（ＳＦＥＢｑ法）とよばれる、血清や神経細胞への誘導を阻害する化学物質を含まない培地でｉＰＳ細胞を培養することで、ｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞から神経細胞を作製する方法を利用し、数十種類のｉＰＳ細胞から神経細胞を作製したところ、神経細胞に変化しにくいｉＰＳ／ＥＳ細胞クローンが存在することが証明された（例えば、非特許文献２参照。）。
　具体的には、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞からホルモンや化学物質を利用する方法を用いて誘導された細胞は、初期の段階では胎児段階の体細胞であることが確認されている。ヒトの成熟した体細胞の誘導は極めて難しく、数か月にわたる長期の培養が必要である。しかし、発生が完了した個体を対象とする創薬や移植医療において、個体の成熟度に一致する体細胞を作製することは重要である。
　また、神経細胞には、様々なサブタイプの細胞が存在するが、ホルモンや化学物質を利用する方法では、これらのサブタイプ神経を均一にＥＳ／ｉＰＳ細胞から誘導できない。そのため、特定の神経サブタイプ特異的な創薬スクリーニングができない。したがって、創薬スクリーニングの効率が低い。また、移植医療においても、疾患のある特定の細胞だけを濃縮して移植することができない。
　これに対し、ゲノムにインテグレートするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ウイルスを用いて特定の体細胞の性質を規定する遺伝子をＥＳ／ｉＰＳ細胞に直接を導入し、目的の体細胞を作製する方法が提案されている。ゲノムにインテグレートするＤＮＡウイルスを用いる方法は、ホルモンや化学物質を利用する方法に比べて、例えば２週間のような非常に短い期間で成熟した神経細胞を特異的に作製可能である。また、特定の遺伝子導入により神経細胞を作製すると、例えば興奮性神経のみを均一に得ることができる。そのため、特定の神経サブタイプ特異的な創薬スクリーニングが可能であり、移植医療においても、疾患のある特定の細胞だけを濃縮して移植できると考えられている。
　しかし、特定の遺伝子を発現させるためにゲノムにインテグレートするＤＮＡウイルスを用いて幹細胞を体細胞に誘導する方法においては、ＥＳ／ｉＰＳ細胞のゲノム上に遺伝子が挿入され、内在性の遺伝子に傷を付けてしまう。その結果、創薬スクリーニングが正しく行なわれず、移植においては癌化のリスクが伴うという問題がある（例えば、非特許文献３、４参照。）。
Nature Biotechnol 26(3): 313-315, 2008. PNAS, 111:12426-12431, 2014 N Eng J Med, 346:1185-1193, 2002 Science 302: 415-419, 2003
　本発明は、細胞の遺伝子を傷つけることなく、短期間で効率よく神経系細胞を作製可能な、神経系細胞の作製方法を提供することを課題とする。
　本発明の態様によれば、幹細胞を用意することと、幹細胞にセンダイウイルスを感染により導入し、幹細胞内でセンダイウイルスに誘導因子を合成するメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を発現させることで、幹細胞を神経系細胞に誘導することと、を含む、神経系細胞の作製方法が提供される。
　上記の神経系細胞の作製方法において、幹細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）であってもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法において、幹細胞が胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法において、誘導因子が、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ（ＮＧＮ）を含んでいてもよい。誘導因子が、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ（ＮＧＮ）のみを含んでいてもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法において、誘導因子が、ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ（ＡＳＣＬ）を含んでいてもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法において、誘導因子が、ｍｙｅｌｉｎ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＴ）を含んでいてもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法において、誘導因子が、ｄｉｓｔａｌ－ｌｅｓｓ　ｈｏｍｅｏｂｏｘ（ＤＬＸ）を含んでいてもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法において、神経系細胞が、神経細胞、神経幹細胞及び神経前駆細胞のいずれかであってもよい。神経細胞が、興奮性神経細胞、抑制性神経細胞、ドーパミン産生神経細胞、運動神経細胞、及び大脳神経細胞からなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。神経系細胞が、オリゴデンドロサイト前駆細胞及びオリゴデンロドサイトであってもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法において、神経系細胞が、ＮＧＮ遺伝子陽性、ＡＳＣＬ遺伝子陽性、ＭＹＴ遺伝子陽性、及びＤＬＸ遺伝子陽性から選択される少なくとも一つであってもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法において、神経系細胞が、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性、ＴＵＪ１陽性、ＢＲＮ２陽性、ＮＧＮ陽性、β－ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ陽性、ＭＡＰ２陽性、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ陽性、ｖＧＬＵＴ陽性、ＳＡＴＢ２陽性、ｃｈＡＴ陽性、ＨＢ９陽性、ＭＵＮＣ１３陽性、ＨＯＭＥＲ１陽性、ｖＧＡＴ陽性、及びＧＡＤ６５／６７陽性からなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法において、センダイウイルスが、幹細胞内で、薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡを発現させてもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法において、薬剤耐性遺伝子が、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストシジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法が、幹細胞にセンダイウイルスを感染した後、薬剤耐性を示す細胞を選択することを含んでいてもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法が、幹細胞にセンダイウイルスを感染した後、ピューロマイシン耐性、ブラストシジン耐性、ハイグロマイシン耐性、及びネオマイシン耐性からなる群から選択される少なくとも一つの薬剤耐性を示す細胞を選択することを含んでいてもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法において、センダイウイルスに感染させる際の幹細胞の密度が、１２ウェルプレートのウェルにおいて、０．２×１０５個／ウェルから１．０×１０６個／ウェルであってもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法において、センダイウイルスの感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が１回あたり０．１から１００．０であってもよい。
　上記の神経系細胞の作製方法において、幹細胞をセンダイウイルスに感染させる際の培地が、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、ＴｅＳＲ２（登録商標）及びＳｔｅｍ　Ｆｉｔから選択されるいずれかであってもよい。
　本発明によれば、細胞の遺伝子を傷つけることなく、短期間で効率よく神経系細胞を作製可能な神経系細胞の作製方法を提供可能である。
実施例１に係る細胞の顕微鏡写真である。 実施例１に係る抗ＢＲＮ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例２に係る抗ＨＯＭＥＲ１抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例３に係る抗ＭＡＰ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例４に係る抗ＭＵＮＣ１３－１抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例５に係る抗ＳＡＴＢ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例６に係る抗ＴＵＪ１抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例７に係る抗ｖＧＬＵＴ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例８に係る抗ｃｈＡＴ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例９に係る抗ＨＢ９抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１０に係る抗ＴＨ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 図１２（ａ）及び図１２（ｂ）は、実施例１１に係る細胞の顕微鏡写真である。図１２（ｃ）は、実施例１１に係る抗ＴＵＪ１抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１２に係る抗ＢＲＮ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１３に係る抗ＧＡＤ６５／６７抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１４に係る抗ＭＡＰ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１５に係る抗ｖＧＡＴ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１６に係る抗ＴＵＪ１抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１７に係る抗ＭＡＰ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１８に係る抗ＢＲＮ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１９に係る抗ｖＧＡＴ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例２０に係る抗ＧＡＤ６５／６７抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例２１に係る抗ＴＨ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例２２に係る抗ｃｈＡＴ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例２３に係る抗ｖＧＬＵＴ抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例２４に係る抗ＳＡＴＢ２抗体を用いて蛍光標識した細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例２５に係るフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
　本発明の実施の形態に係る幹細胞から体細胞を作製する方法は、幹細胞を用意することと、幹細胞にセンダイウイルスを感染により導入し、幹細胞内でセンダイウイルスに誘導因子を合成するｍＲＮＡを発現させることで、幹細胞を神経細胞に誘導することと、を含む。
　幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及び胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の両方が使用可能である。幹細胞は、ヒトの幹細胞であってもよいし、非ヒト動物の幹細胞であってもよい。
　誘導とは、リプログラミング、初期化、形質転換、分化転換(Transdifferentiation or Lineage reprogramming)、分化誘導及び細胞の運命変更(Cell fate reprogramming)等を指す。
　誘導される神経系細胞の例としては、神経細胞、神経幹細胞及び神経前駆細胞が挙げられる。神経細胞の例としては、興奮性神経細胞、抑制性神経細胞、ドーパミン産生神経細胞、運動神経細胞、及び大脳神経細胞が挙げられる。あるいは、神経系細胞は、オリゴデンドロサイト前駆細胞及びオリゴデンロドサイト等であってもよい。
　幹細胞に導入されるセンダイウイルス（ＳｅＶ）は、幹細胞を神経細胞に誘導する誘導因子を合成するｍＲＮＡを発現するＲＮＡゲノムを有する。なお、任意のｍＲＮＡを発現可能な組換えセンダイウイルスベクターの作製は、例えば、株式会社ＩＤファーマが特許技術を利用して受託している。誘導因子を合成するｍＲＮＡとしては、例えば、ＮＧＮ２等のＮＧＮ遺伝子のｍＲＮＡ、ＡＳＣＬ１等のＡＳＣＬ遺伝子のｍＲＮＡ、ＭＹＴ１Ｌ等のＭＹＴ遺伝子のｍＲＮＡ、及びＤＬＸ２等のＤＬＸ遺伝子のｍＲＮＡが挙げられる。ＮＧＮ２、ＡＳＣＬ１、ＭＹＴ１Ｌ、及びＤＬＸ２は、神経細胞生成に必要なスイッチタンパク質である。ＮＧＮ２は、興奮性神経細胞を生成することができる。ＡＳＣＬ１、ＭＹＴ１Ｌ、ＤＬＸ２のそれぞれは、抑制性神経細胞を生成することができる。ＡＳＣＬ１とＭＹＴ１Ｌの組み合わせは、興奮性神経細胞、抑制性神経細胞、及びドーパミン産生神経細胞を生成することができる。
　例えば、幹細胞に導入されたセンダイウイルスは、誘導因子を合成するｍＲＮＡとして、ＮＧＮ２等のＮＧＮ遺伝子のｍＲＮＡ、ＡＳＣＬ１等のＡＳＣＬ遺伝子のｍＲＮＡ、ＭＹＴ１Ｌ等のＭＹＴ遺伝子のｍＲＮＡ、及びＤＬＸ２等のＤＬＸ遺伝子のｍＲＮＡから選択される少なくとも一つを発現させる。
　センダイウイルスは、薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡを発現するＲＮＡゲノムを有していてもよい。薬剤とは、例えばピューロマイシン、ブラストサイジン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８、及びゼオシン等の抗生物質である。例えば、幹細胞に導入されたセンダイウイルスは、薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡを発現させる。薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡが発現した細胞は、薬剤耐性を示す。
　センダイウイルスが、薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡを発現させた場合、感染の後、薬剤耐性を示す細胞を選択してもよい。例えば、センダイウイルスによって、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、及びゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ、登録商標）耐性遺伝子のｍＲＮＡの少なくともいずれかを発現させた場合、感染の後の細胞を対応する抗生物質に曝すことにより、センダイウイルスが導入された細胞以外を死滅させ、センダイウイルスが導入された細胞を選別することが可能である。
　センダイウイルスは、例えば、ＮＧＮ２遺伝子のｍＲＮＡ及びピューロマイシン耐性遺伝子のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ（以下、「ＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡ」という。）を発現可能なＲＮＡを有していてもよい。ＮＧＮ２遺伝子のｍＲＮＡの配列は、例えば、配列番号１（マウス）又は配列番号２（ヒト）に示すＤＮＡの配列に対応する。ＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡが発現した細胞は、ＮＧＮ２を産生し、かつ、ピューロマイシン耐性を示す。
　センダイウイルスは、例えば、ＡＳＣＬ１遺伝子のｍＲＮＡ、ＭＹＴ１Ｌ遺伝子のｍＲＮＡ、及びピューロマイシン耐性遺伝子のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ（以下、「ＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡ」という。）を発現可能なＲＮＡを有していてもよい。ＡＳＣＬ１遺伝子のｍＲＮＡの配列は、例えば、配列番号３（マウス）又は配列番号４（ヒト）に示すＤＮＡの配列に対応する。ＭＹＴ１Ｌ遺伝子のｍＲＮＡの配列は、例えば、配列番号５（マウス）、配列番号６（マウス）、配列番号７（マウス）又は配列番号８（ヒト）に示すＤＮＡの配列に対応する。ＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡが発現した細胞は、ＡＳＣＬ１及びＭＹＴ１Ｌを産生し、かつ、ピューロマイシン耐性を示す。
　センダイウイルスは、例えば、ＤＬＸ２遺伝子のｍＲＮＡ及びブラストサイジン耐性遺伝子のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ（以下、「ＤＬＸ２－Ｂｌａｓｔ　ｍＲＮＡ」という。）を発現可能なＲＮＡを有していてもよい。ＤＬＸ２遺伝子のｍＲＮＡの配列は、例えば、配列番号９（マウス）又は配列番号１０（ヒト）に示すＤＮＡの配列に対応する。ＤＬＸ２－Ｂｌａｓｔ　ｍＲＮＡが発現した細胞は、ＤＬＸ２を産生し、かつ、ブラストサイジン耐性を示す。
　センダイウイルスは、細胞培養液に懸濁されることにより幹細胞に導入される。センダイウイルスは、細胞表面抗原を認識し、幹細胞を感染する。
　センダイウイルスの感染の際の幹細胞の密度は、例えば、１２ウェルプレートのウェルにおいて、０．２×１０５個／ウェルから１．０×１０６個／ウェル、０．５×１０５個／ウェルから８．０×１０５個／ウェル、あるいは１．０×１０５個／ウェルから４×１０５個／ウェルである。
　用いられるセンダイウイルスの力価は、例えば、１×１０１２ＣＩＵ／ｍＬから１×１０５ＣＩＵ／ｍＬ、１×１０１０ＣＩＵ／ｍＬから１×１０６ＣＩＵ／ｍＬ、あるいは、１×１０９ＣＩＵ／ｍＬから１×１０７ＣＩＵ／ｍＬである。センダイウイルスの感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は、例えば、１回あたり０．１から１００．０、１．０から５０．０、あるいは１．０から２０．０である。
　センダイウイルスの感染の際に用いられる培地は、例えばｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）、及びＳｔｅｍ　Ｆｉｔ（株式会社リプロセル）等の幹細胞培地である。センダイウイルスの感染の後、培地を神経系細胞への誘導に適した培地（以下、「神経誘導培地」ともいう。）に交換してもよい。神経誘導培地としては、例えば、ＮＤｉｆｆ　２２７（登録商標、ＴＡＫＡＲＡ　ＢＩＯ　ＩＮＣ．）、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）、Ｈｕｍａｎ　ＥＳ／ｉＰＳ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ　ＫＧａＡ）、及びＮ３培地等が挙げられる。Ｎ３培地は、例えば、５００ｍＬのＤＭＥＭＦ１２に、１０ｍＬのＢ２７と、５ｍＬのＮ２サプルメント（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）と、濃度が６．２５ｍｇ／ｍＬの１．６ｍＬのインスリンを加えることにより調製される。
　センダイウイルスの感染の際、及びその前後に用いられる培地は、Ｂ１８Ｒタンパク質を含んでいてもよい。Ｂ１８Ｒタンパク質は、細胞の先天性抗ウイルス反応を緩和する。Ｂ１８Ｒタンパク質は、ウイルス感染に伴う免疫反応に伴う細胞死を抑制するために使用されることがある。ただし、実施の形態に係る方法は、短期間で幹細胞から神経系細胞を作製可能であるため、培地はＢ１８Ｒタンパク質を含まなくともよく、あるいは、Ｂ１８Ｒタンパク質を０．０１％から１％のような薄い濃度で含有してもよい。
　センダイウイルスの感染から２５日以内、２０日以内、１０日以内、９日以内、８日以内、７日以内、６日以内、５日以内あるいは４日以内に幹細胞が神経系細胞に誘導される。幹細胞が神経系細胞に誘導されたか否かは、例えば、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１(β－ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ)、ＢＲＮ２、ＨＯＭＥＲ１、ＮＧＮ２等のＮＧＮ、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、ＭＵＮＣ１３－１、ＳＡＴＢ２、ｖＧＬＵＴ、ｃｈＡＴ、ＨＢ９、ＬＨＸ３、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、ＴＨ、ＡＳＣＬ１(ＭＡＳＨ１)等のＡＳＣＬ、ｖＧＡＴ、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＣＤ１３３、Ｎｅｓｔｉｎ、ＨＢ９、ＩＳＬ１、Ｏ４、ＰＬＰ１、ＭＯＧ、及びＭＢＰから選択される少なくとも一つが陽性であるか否かによって確認される。
　ＮＧＮ２は、神経細胞生成に必要なスイッチタンパク質であり、興奮性神経細胞のマーカーである。ＴＵＪ１(β－ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ)、ＭＡＰ２、ＢＲＮ２、ＡＳＣＬ１(ＭＡＳＨ１)及びＰＳＡ－ＮＣＡＭは、神経細胞のマーカーである。ＨＯＭＥＲ１及びＭＵＮＣ１３－１は、シナプスを作る成熟した神経細胞のマーカーである。ＳＡＴＢ２は、大脳皮質神経細胞のマーカーである。ｖＧＬＵＴは、グルタミン酸作動性神経細胞のような興奮性神経細胞のマーカーである。ｃｈＡＴは、コリン性神経細胞等の運動神経細胞のマーカーである。ＨＢ９は、運動神経細胞のマーカーである。ＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７は、ＧＡＢＡ作動性神経細胞のような抑制性神経細胞のマーカーである。ＴＨは、ドーパミン産生神経細胞のマーカーである。ｖＧＡＴは、抑制性神経細胞のマーカーである。ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＣＤ１３３、及びＮｅｓｔｉｎは、神経幹細胞のマーカーである。ＬＨＸ３、ＨＢ９及びＩＳＬ１は運動神経細胞のマーカーである。Ｏ４、ＰＬＰ１、ＭＯＧ、及びＭＢＰは、オリゴデンドロサイト前駆体のマーカーである。また、アストロサイト前駆体及びアストロサイトのマーカーとして、ＧＦＡＰ及びＣＤ４４が利用可能である。
　以上説明した本発明の実施の形態に係る方法によれば、幹細胞に誘導因子を合成するｍＲＮＡを発現させることで、幹細胞の遺伝子に傷をつけることなく、インテグレーションフリーで、神経系細胞を効率よく作製することが可能である。
　ホルモンや化学物質のみを利用して幹細胞から神経系細胞を作製する方法では、神経系細胞が作製されるまで非常に長い時間が必要である。これに対し、本発明の実施の形態に係る方法によれば、短い時間で神経系細胞を作製することが可能である。
　また、ホルモンや化学物質のみを利用して幹細胞から神経系細胞を作製する方法においては、幹細胞のうちの一部のみが目的の神経系細胞になる。これに対し、本発明の実施の形態に係る方法によれば、センダイウイルスの感染が成立した細胞のほとんどが目的の神経系細胞になり得る。
　さらに、ホルモンや化学物質のみを利用して幹細胞から神経系細胞を作製する方法においては、同じプロトコールに従っても、目的の神経系細胞になるクローンと、ならないクローンがあり、クローン間にばらつきが生じる。これに対し、本発明の実施の形態に係る方法によれば、複数のクローンで高い誘導効率を得ることが可能である。
　また、未分化な細胞集団からサイトカイン等を用いて誘導を行って移植用細胞を作製する場合、移植用細胞の中に誘導されなかった細胞が残存する可能性がある。この残存した誘導されなかった細胞は移植位置で独自に細胞分裂、増殖をし、テラトーマ等を形成する危険性がある。これに対し、本発明の実施の形態に係る方法によれば、薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡも同時に発現させることができるため、センダイウイルスが導入された細胞の薬剤選択が可能である。そのため誘導されなかった細胞の混入やテラトーマ形成などの危険性を回避することが可能であり、移植医療に適している。
　さらに、本発明の実施の形態に係る方法によれば、センダイウイルスを用いており、ゲノムに遺伝子を挿入するウイルスを利用していない。そのため、インテグレーションフリーであり、幹細胞の遺伝子に傷がつかず、作製される神経系細胞に癌化のリスクがないため、臨床への利用が可能である。
　またさらに、例えば血液の細胞からｉＰＳ細胞を完全閉鎖系のクリーンな環境下で作製し、引き続き、本発明の実施の形態に係る方法によって、ｉＰＳ細胞から神経系細胞を完全閉鎖系のクリーンな環境下で作製すれば、より清潔で安全な神経系細胞を作製することが可能である。
　加えて、本発明の実施の形態に係る方法によれば、短期間で神経系細胞を作製することが可能であるため、Ｂ１８Ｒ等を使用しなくてもよく、また、使用する場合も、非常に薄い濃度にすることが可能である。
　（実施例１）
　株式会社ＩＤファーマにて、ＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスを用意した。用意したセンダイウイルスの力価は、１×１０９ＣＩＵ／ｍＬであった。
　可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされた１２ウェルディッシュを用意し、各ウェルに１０ｎｍｏｌ／ｍＬの濃度でＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むフィーダーフリー培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた。ＲＯＣＫ阻害剤は、細胞死を抑制する。
　ｉＰＳ細胞を組織・培養細胞の剥離／分離／分散溶液（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分散させ、１２ウェルディッシュにまいた。センダイウイルスに感染されるｉＰＳ細胞は、１ウェルあたり、２×１０５個の密度でまかれた。センダイウイルスに感染されないコントロールｉＰＳ細胞も、１ウェルあたり、２．０×１０５個の密度でまかれた。その後、ｉＰＳ細胞を、フィーダーフリー培地中で、５％二酸化炭素濃度及び２０％酸素濃度の気体条件下で、２４時間培養した。
　ＭＯＩが２０になるよう、ＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させた。センダイウイルス感染後２日目に、ウェル内の培地を、２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む神経誘導培地（Ｎ３培地）に置換し、未感染の細胞を死滅させた。Ｎ３培地は、５００ｍＬのＤＭＥＭＦ１２に、１０ｍＬのＢ２７と、５ｍＬのＮ２と、濃度が６．２５ｍｇ／ｍＬの１．６ｍＬのインスリンを加えて調製した。
　センダイウイルス感染後２日目、３日目、５日目、及び７日目の細胞の顕微鏡写真を図１（ａ）に示す。センダイウイルス感染後２４日目の細胞の顕微鏡写真を図１（ｂ）に示す。図１に示すように、センダイウイルス感染後、細胞が神経系細胞に誘導されていることが、形態的に確認された。
　センダイウイルス感染後２８日目、プレートから培地を除き、ＰＢＳで細胞を洗った。次に、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）をプレートに入れ、１５分４℃で反応させ、細胞を固定した。さらに、ＰＢＳで細胞を２回洗浄後、５％ＣＣＳ及び０．１％トライトンを含むＰＢＳ培地で一次抗体を希釈し、プレートに添加した。一次抗体としては、神経細胞のマーカーであるＢＲＮ２に対するヤギモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用した。
　室温で一時間反応後、プレートにＰＢＳを添加し、プレートによくなじませた後、ＰＢＳを廃棄した。再度、ＰＢＳを添加、廃棄し、蛍光標識されたゴリラ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ、登録商標、５５５、ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む溶液をプレートに加えて、室温で３０分間反応させた。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２に示すように、誘導された神経系細胞は、ＢＲＮ２を発現していることが確認された。
　（実施例２）
　実施例１と同様にＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体としてシナプスを作る成熟した神経細胞のマーカーであるＨＯＭＥＲ１に対するウサギモノクローナル抗体（ＳＹＮＡＰＴＩＣ　ＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図３に示すように、誘導された神経系細胞は、ＨＯＭＥＲ１を発現していることが確認された。
　（実施例３）
　実施例１と同様にＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２に対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図４に示すように、誘導された神経系細胞は、ＭＡＰ２を発現していることが確認された。
　（実施例４）
　実施例１と同様にＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体としてシナプスを作る成熟した神経細胞のマーカーであるＭＵＮＣ１３－１に対するラビットモノクローナル抗体（ＳＹＮＡＰＴＩＣ　ＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図５に示すように、誘導された神経系細胞は、ＭＵＮＣ１３－１を発現していることが確認された。
　（実施例５）
　実施例１と同様にＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として大脳神経細胞のマーカーであるＳＡＴＢ２に対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図６に示すように、誘導された神経系細胞は、ＳＡＴＢ２を発現していることが確認された。
　（実施例６）
　実施例１と同様にＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１に対するマウスモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図７に示すように、誘導された神経系細胞は、ＴＵＪ１を発現していることが確認された。
　（実施例７）
　実施例１と同様にＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体としてグルタミン酸作動性神経細胞のような興奮性神経細胞のマーカーであるｖＧＬＵＴに対するウサギモノクローナル抗体（ＳＹＮＡＰＴＩＣ　ＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図８に示すように、誘導された神経系細胞は、ｖＧＬＵＴを発現していることが確認された。
　（実施例８）
　実施例１と同様にＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として運動神経細胞のマーカーであるｃｈＡＴに対するマウスモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図９に示すように、誘導された神経系細胞は、ｃｈＡＴを発現していることが確認された。
　（実施例９）
　実施例１と同様にＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として運動神経細胞のマーカーであるＨＢ９に対するマウスモノクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１０に示すように、誘導された神経系細胞は、ＨＢ９を発現していることが確認された。
　（実施例１０）
　実施例１と同様にＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体としてドーパミン産生神経細胞のマーカーであるＴＨに対するヒツジモノクローナル抗体（Ｐｅｌ　Ｆｒｅｅｚ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１１に示すように、誘導された神経系細胞は、ＴＨを発現していることが確認された。
　（実施例１１）
　ＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡと、ＤＬＸ２－Ｂｌａｓｔ　ｍＲＮＡと、を発現させることができるセンダイウイルスを用いた以外は、実施例１と同様にセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させた。センダイウイルス感染後２日目、５日目、１１日目、及び２１日目の細胞の顕微鏡写真を図１２（ａ）に示す。センダイウイルス感染後２４日目の細胞の顕微鏡写真を図１２（ｂ）に示す。図１２（ａ）及び図１２（ｂ）に示すように、センダイウイルス感染後、細胞が神経系細胞に誘導されていることが、形態的に確認された。
　センダイウイルス感染後２８日目、一次抗体として一般的な神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１に対するマウスモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１２（ｃ）に示すように、誘導された神経系細胞は、ＴＵＪ１を発現していることが確認された。
　（実施例１２）
　実施例１１と同様にＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡと、ＤＬＸ２－Ｂｌａｓｔ　ｍＲＮＡと、を発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として神経細胞のマーカーであるＢＲＮ２に対するヤギモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１３に示すように、誘導された神経系細胞は、ＢＲＮ２を発現していることが確認された。
　（実施例１３）
　実施例１１と同様にＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡと、ＤＬＸ２－Ｂｌａｓｔ　ｍＲＮＡと、を発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として抑制性（ＧＡＢＡ作動性）神経細胞のマーカーであるＧＡＤ６５／６７に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１４に示すように、誘導された神経系細胞は、ＧＡＤ６５／６７を発現していることが確認された。
　（実施例１４）
　実施例１１と同様にＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡと、ＤＬＸ２－Ｂｌａｓｔ　ｍＲＮＡと、を発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２に対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１５に示すように、誘導された神経系細胞は、ＭＡＰ２を発現していることが確認された。
　（実施例１５）
　実施例１１と同様にＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡと、ＤＬＸ２－Ｂｌａｓｔ　ｍＲＮＡと、を発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として抑制性神経細胞のマーカーであるｖＧＡＴに対するラビットモノクローナル抗体（ＳＹＮＡＰＴＩＣ　ＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１６に示すように、誘導された神経系細胞は、ｖＧＡＴを発現していることが確認された。
　（実施例１６）
　ＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスを用いた以外は、実施例１と同様にセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させた。センダイウイルス感染後２１日目、一次抗体として一般的な神経細胞のマーカーであるＴＵＪ１に対するマウスモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１７に示すように、誘導された神経系細胞は、ＴＵＪ１を発現していることが確認された。
　（実施例１７）
　実施例２２と同様に配ＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２に対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１８に示すように、誘導された神経系細胞は、ＭＡＰ２を発現していることが確認された。
　（実施例１８）
　実施例２２と同様にＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として神経細胞のマーカーであるＢＲＮ２に対するヤギモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１９に示すように、誘導された神経系細胞は、ＢＲＮ２を発現していることが確認された。
　（実施例１９）
　実施例２２と同様にＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として抑制性神経細胞のマーカーであるｖＧＡＴに対するラビットモノクローナル抗体（ＳＹＮＡＰＴＩＣ　ＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２０に示すように、誘導された神経系細胞は、ｖＧＡＴを発現していることが確認された。
　（実施例２０）
　実施例２２と同様にＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として抑制性神経細胞(ＧＡＢＡ作動性神経細胞)のマーカーであるＧＡＤ６５／６７に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２１に示すように、誘導された神経系細胞は、ＧＡＤ６５／６７を発現していることが確認された。
　（実施例２１）
　実施例２２と同様にＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体としてドーパミン産生神経細胞のマーカーであるＴＨに対するヒツジモノクローナル抗体（Ｐｅｌ　Ｆｒｅｅｚ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２２に示すように、誘導された神経系細胞は、ＴＨを発現していることが確認された。
　（実施例２２）
　実施例２２と同様にＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体としてコリン性神経細胞のマーカーであるｃｈＡＴに対するヤギモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２３に示すように、誘導された神経系細胞は、ｃｈＡＴを発現していることが確認された。
　（実施例２３）
　実施例２２と同様にＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として興奮性神経(グルタミン酸作動性神経細胞)のマーカーであるｖＧＬＵＴに対するウサギモノクローナル抗体（ＳＹＮＡＰＴＩＣ　ＳＹＳＴＥＭＳ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２４に示すように、誘導された神経系細胞は、ｖＧＬＵＴを発現していることが確認された。
　（実施例２４）
　実施例２２と同様にＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞を感染させ、一次抗体として大脳神経細胞のマーカーであるＳＡＴＢ２に対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２５に示すように、誘導された神経系細胞は、ＳＡＴＢ２を発現していることが確認された。
　（実施例２５）
　実施例１で用意したＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスに感染させなかったコントロール細胞をフローサイトメトリーで分析したところ、図２６（ａ）に示すように、神経細胞のマーカーであるＰＳＡ－ＮＣＡＭは陰性であった。実施例１で用意したＮＧＮ２－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスに感染させた細胞を感染後７日目にフローサイトメトリーで分析したところ、図２６（ｂ）に示すように、神経細胞のマーカーであるＰＳＡ－ＮＣＡＭは陽性であった。なお、感染後４日目にフローサイトメトリーで分析しても、神経細胞のマーカーであるＰＳＡ－ＮＣＡＭは陽性であった。
　実施例１１で用意したＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡと、ＤＬＸ２－Ｂｌａｓｔ　ｍＲＮＡと、を発現させることができるセンダイウイルスに感染させた細胞を感染後７日目にフローサイトメトリーで分析したところ、図２６（ｃ）に示すように、神経細胞のマーカーであるＰＳＡ－ＮＣＡＭは陽性であった。なお、感染後４日目にフローサイトメトリーで分析しても、神経細胞のマーカーであるＰＳＡ－ＮＣＡＭは陽性であった。実施例２２で用意したＡＳＣＬ１－ＭＹＴ１Ｌ－Ｐｕｒｏ　ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスに感染させた細胞を感染後７日目にフローサイトメトリーで分析したところ、図２６（ｄ）に示すように、神経細胞のマーカーであるＰＳＡ－ＮＣＡＭは陽性であった。なお、感染後４日目にフローサイトメトリーで分析しても、神経細胞のマーカーであるＰＳＡ－ＮＣＡＭは陽性であった。

Claims (12)

  1. 　幹細胞を用意することと、
    　前記幹細胞にセンダイウイルスを感染により導入し、前記幹細胞内で前記センダイウイルスに誘導因子を合成するｍＲＮＡを発現させることで、前記幹細胞を神経系細胞に誘導することと、
    　を含む、神経系細胞の作製方法。
  2. 　前記幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の神経系細胞の作製方法。
  3. 　前記幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１に記載の神経系細胞の作製方法。
  4. 　前記誘導因子が、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ（ＮＧＮ）を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  5. 　前記誘導因子が、ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ（ＡＳＣＬ）を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  6. 　前記誘導因子が、ｍｙｅｌｉｎ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ（ＭＹＴ）を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  7. 　前記誘導因子が、ｄｉｓｔａｌ－ｌｅｓｓ　ｈｏｍｅｏｂｏｘ（ＤＬＸ）を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  8. 　前記神経系細胞が、興奮性神経細胞、抑制性神経細胞、ドーパミン産生神経細胞、運動神経細胞、及び大脳神経細胞からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１から７のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  9. 　前記神経系細胞が、ＴＨ陽性、ＴＵＪ１陽性、ＢＲＮ２陽性、ＮＧＮ陽性、β－ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ陽性、ＭＡＰ２陽性、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ陽性、ｖＧＬＵＴ陽性、ＳＡＴＢ２陽性、ｃｈＡＴ陽性、ＨＢ９陽性、ＭＵＮＣ１３陽性、ＨＯＭＥＲ１陽性、ｖＧＡＴ陽性、及びＧＡＤ６５／６７陽性からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１から７のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  10. 　前記センダイウイルスが、前記幹細胞内で、薬剤耐性遺伝子のｍＲＮＡを発現させる、請求項１から９のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  11. 　前記薬剤耐性遺伝子が、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストシジン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項１０に記載の神経系細胞の作製方法。
  12. 　前記幹細胞に前記センダイウイルスを感染した後、薬剤耐性を示す細胞を選択することを含む、請求項１０又は１１に記載の神経系細胞の作製方法。
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