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WO2019102802A1 - クロマトグラフィー用のキット - Google Patents

クロマトグラフィー用のキット Download PDF

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WO2019102802A1
WO2019102802A1 PCT/JP2018/040314 JP2018040314W WO2019102802A1 WO 2019102802 A1 WO2019102802 A1 WO 2019102802A1 JP 2018040314 W JP2018040314 W JP 2018040314W WO 2019102802 A1 WO2019102802 A1 WO 2019102802A1
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WO
WIPO (PCT)
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region
salt
kit according
plate
kit
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2018/040314
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English (en)
French (fr)
Inventor
泰 吉正
河村　英孝
彰大 田谷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Canon Inc
Original Assignee
Canon Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Canon Inc filed Critical Canon Inc
Publication of WO2019102802A1 publication Critical patent/WO2019102802A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G01N30/46—Flow patterns using more than one column
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography
    • G01N30/92—Construction of the plate
    • G01N30/93—Application of the sorbent layer

Definitions

  • the present invention relates to a kit for chromatography.
  • TLC Thin-layer chromatography
  • a carrier and a solvent are selected, and conditions under which separation ability is improved by trial and error will be searched.
  • the type of carrier is limited, and it takes time to study the type of solvent and the mixing ratio, and often the desired separation ability can not be obtained.
  • Patent Document 1 discloses a TLC plate with a concentrating portion as one for improving resolution and sensitivity.
  • the plate with a concentrated portion is a plate in which a portion coated with a carrier having a small specific surface area and no adsorption activity is connected in front of the adsorption layer. Since the applied sample is not adsorbed in the concentration part, it is concentrated in the connection part with the adsorption layer, and the separation ability and sensitivity are improved.
  • the target that can be concentrated is limited depending on the type of the carrier, and the configuration does not enable concentration of various detection targets.
  • an object of the present invention is to provide chromatography that enables concentration of various detection targets.
  • a kit for chromatography is a kit for separating an object to be detected from a sample containing an object to be detected, which comprises a plate containing a carrier and a salt provided on the carrier, The carrier comprises a first region and a second region different from and in contact with the first region, the first region being provided with a first salt, An object to be detected is characterized in that it is separated in the first area or the second area.
  • the chromatography kit of the present invention various detection targets can be concentrated from the sample. As a result, the ability to separate specific detection targets is high. Furthermore, concentration of the detection target allows detection of even a small amount of the detection target. That is, it is possible to provide a kit with high detection sensitivity of the detection target.
  • the chromatography kit is for separating the detection target from a sample containing the detection target.
  • the kit comprises a plate containing the carrier and a salt provided on the carrier.
  • the carrier includes a first region, and a second region different from and in contact with the first region, the first region being provided with a first salt, and the detection target being , In the first region or in the second region.
  • the development rate of an object changes depending on the strength of interaction between the carrier and the object.
  • the rate of deployment is slower for stronger interactions and faster for weaker interactions.
  • the electrostatic interaction particularly the acid-base interaction, has a great influence on the development speed.
  • the acid / basicity of the silica gel is changed and the interaction is changed by containing the salt, and as a result, the development speed is changed and the separation ability can be improved.
  • a salt is applied which makes use of this property and rapidly slows down only the development rate of a part of the material, it is possible to selectively concentrate only the part of the material. Can also greatly improve the sensitivity.
  • the plate included in the kit for thin layer chromatography in the present embodiment has at least a carrier.
  • the carrier is a substance that exhibits properties such as adsorption and is a base on which other substances are immobilized.
  • the plate in the present embodiment may be configured to include the structure in which the carrier is provided on the support, or may be configured to include only the carrier without the support.
  • the support on the support may be in the form of a thin layer such as so-called TLC, or may be in the form of a column such as a so-called microchannel plate.
  • the plate according to the present embodiment has a carrier 106 on a support 103.
  • the carrier comprises a first region 101 and a second region 102 different from and in contact with the first region 101, wherein the first region 101 is provided with a first salt.
  • the second region 102 may be provided with a second salt different from the first salt.
  • the first salt may be provided in both the first region 101 and the second region 102. In this case, the concentration of the first salt provided in the first region 101 and the concentration of the first salt provided in the second region 102 are made different.
  • a developing solution to be described later is introduced in the direction of 104 or 105 to perform development.
  • FIG. 2 shows a plate having two areas coated with salt and three areas not coated with salt in the long side direction of the rectangular plate.
  • the carrier 207 is provided on the support 206, and the first region 201, the second region 202, the third region 203, the fourth region 204, and the fifth region 205 are provided.
  • the second region 202 and the fourth region 204 are provided with different types of salts, respectively.
  • salts with different concentrations are provided.
  • one or more regions in which the salt is not provided may be included. When two or more regions where salt is not provided are included, regions where the salt is not provided are not in contact with each other. That is, the salt is provided in one of the regions in contact with each other.
  • regions different from the first region and the second region may further include third to n-th regions (n is an integer of 3 or more).
  • the k-th region is in contact with at least the k-1th region (k is an integer satisfying 2 ⁇ k ⁇ n).
  • the k-th region can be distinguished from the (k-1) -th region depending on the presence, concentration, and type of salt. A developing solution to be described later is introduced in the direction of 208 or 209 shown in FIG.
  • FIG. 3 shows a plate having four areas coated with salt in the direction of the long side and the short side of the plate.
  • An adsorption layer 306 is provided on a support 305, and a first area 301, a second area 302, a third area 303, and a fourth area 304 are provided.
  • the first region 301 is in contact with the second region 302, the second region 302 is in contact with the third region 303, and the third region 303 is in contact with the fourth region 304.
  • the first region 301, the second region 302, the third region 303, and the fourth region 304 contain salts of different types and / or concentrations.
  • a developing solution to be described later is introduced in the direction of 307 or 308 shown in FIG.
  • FIG. 5 shows an example of a plate using a column-shaped carrier.
  • An adsorption layer 506 is provided on a support 503, and further a first region 501 and a second region 502 are provided.
  • a developing solution to be described later is introduced in the direction of 504 or 505 shown in FIG.
  • the concentration of the salt is preferably 1.0 mg / mm 3 or more, more preferably 2.0 mg / mm 3 or more.
  • concentration means the mass of salt per mm 3 of carrier.
  • the salt in the present invention refers to a compound in which an anion derived from an acid and a cation derived from a base are ionically bonded.
  • inorganic salts include NaCl, NH 4 Cl, (NH 4 ) 2 SO 4 , LiCl, CaCl 2 , KCl, NaHSO 4, KH 2 PO 4 , NaH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , Na 2 SO 3 , K 3 PO 4 , NaHCO 3 , KHCO 3 , K 2 CO 3 , KNO 3 , NaBr and the like can be used.
  • organic salt examples include CH 3 COOK, CH 3 COONa, Na 2 C 2 O 4 , CaC 2 O 4 , HCOO Na, NaH 2 (C 3 H 5 O (COO) 3 ), Na 2 H (C 3 H) 5 O (COO) 3 ), Na 3 (C 3 H 5 O (COO) 3 ), or the like can be used.
  • the first salt is preferably a salt whose aqueous solution exhibits basicity.
  • H 5 O (COO) 3 ), Na 2 H (C 3 H 5 O (COO) 3 ), Na 3 (C 3 H 5 O (COO) 3 ) is used be able to.
  • the second salt is preferably a salt in which the aqueous solution exhibits neutral or acidic properties.
  • a salt in which the aqueous solution exhibits neutral or acidic properties For example, at least one selected from the group consisting of NaCl, NH 4 Cl, KCl, KNO 3 , (NH 4 ) 2 SO 4 , NaHSO 4, KH 2 PO 4 , NaH 2 PO 4 can be used. Among them, it is preferable to use KH 2 PO 4 or NaH 2 PO 4 .
  • the salt may be dissolved or dispersed in a suitable solvent such as water, and applied to the above-mentioned plate, or a plate in which the salt and the carrier are mixed beforehand may be used.
  • a brush, a spray, a pipette, an air brush or the like may be used as appropriate.
  • the plate may be immersed in a solution of salt.
  • sample containing the object is not particularly limited. However, if this method is used, analysis can be performed even if the concentration of the object is dilute or a sample having a complicated composition. For example, even trace components in body fluids of complex composition such as urine, blood and sweat can be analyzed.
  • 3-carbamyl-1-methylpyridinium chloride, quinaldic acid, adenosine, uracil, nicotinic acid, 4-pyridoxic acid, nicotinamide, 4-hydroxyphenylacetic acid, 4-hydroxy-3-methoxyphenyl Acetic acid, theophylline, 4-aminobenzoic acid, 8 oxo 2 'deoxy guanosine, caffeine, theobromine etc. may be mentioned.
  • the object to be detected includes 8 oxo 2 'deoxy guanosine and the like.
  • (Support) Glass, plastic, aluminum or the like is used as the material of the support 103, and can be appropriately selected depending on the type of sample, the type of developing solution, and the like.
  • a square having a length of 3 cm to 15 cm and a width of 1 cm to 5 cm in the moving direction of the sample is preferable in terms of ease of handling.
  • carrier silica gel, alumina, cellulose, diatomaceous earth and the like can be used.
  • chemically modified silica gel in which an organic moiety is chemically bonded to a silanol group in silica gel can also be used.
  • Chemically modified silica gel is known as reverse phase, NH 2 , CN, DIOL type, etc., and may be selected appropriately according to the sample to be analyzed.
  • polar solvents and / or nonpolar solvents which are usually used can be used alone or in combination. It may be appropriately selected in accordance with the sample to be analyzed.
  • the sample can be applied in the form of dots or a surface using a capillary or a micropipette. Alternatively, one side of the plate can be brought into contact with the sample solution, sucked up, and applied. If the carrier is in the form of a column, the sample can also be applied through the flow channel.
  • the detection of the sample can be performed by recognizing the absorption of UV light by visual observation or a camera. Moreover, it can also be carried out by visually recognizing, using a camera or the like, a product in which a target substance is colored using a coloring reagent.
  • the Rf value means (the distance from the center of gravity of the target substance existing area before expansion to the center of gravity of the target substance existing area after expansion) / (target before expansion) It means the distance from the center of gravity of the substance existing region to the tip of the solvent.
  • the value of Rf k / Rf k-1 is 2 or more or 0.5 or less It is preferable that one or more of k be present, and it is more preferable that one or more of k be 5 or more or 0.2 or less.
  • the chromatography kit according to the present embodiment can be used for purifying a specific detection target from a sample, as well as for detecting the presence or absence and concentration of the detection target.
  • Plate 1 Silica gel with an average pore diameter of 60 ⁇ (containing the fluorescent indicator F254) coated on a glass with a film thickness of 250 ⁇ m
  • Plate 2 Plate diameter of 60 ⁇ with a 1,2-dihydroxy-3-propoxypropyl group modified on the surface Of silica gel (containing fluorescent indicator F254s) at a film thickness of 200 ⁇ m on plate plate 3: Silica gel (containing fluorescent indicator F254s) having an average pore diameter of 60 ⁇ with amino group modified on the surface, glass with a film thickness of 200 ⁇ m
  • the plate plate 5 coated on a glass with a thickness of 200 ⁇ m the average surface modified on the surface of octadecyl group 60 ⁇ pore size silica gel (containing fluorescent indicator F254s)
  • Example 19 the carrier was previously dipped in a salt solution, filtered, and dried to apply a salt before packing into a column.
  • ⁇ Development method 1> The first region side of the short side of the thin layer plate was used as a base, and 1 ⁇ l of a sample was applied using a glass tube dropper at a position of 10 mm from the base. The sample was dried on a 60 ° C. hot plate. The developing solution was added to the bottom of the TLC developing layer (manufactured by As One) to a depth of about 2 mm, and the developing layer was covered and allowed to stand for 10 minutes. Then, the bottom of the silica gel plate was placed in the spreading layer so that the bottom side was down, and the solution was allowed to stand until it rose 20 mm from the sample application position.
  • ⁇ Expansion method 3> The third region and the fourth region side of the short side of the thin layer plate were used as a base, and 1 ⁇ l of a sample was applied at a position of 10 mm from the base in the region 4 with a glass tube dropper. The sample was dried on a 60 ° C. hot plate. The developing solution was added to the bottom of the TLC developing layer (manufactured by As One) to a depth of about 2 mm, and the developing layer was covered and allowed to stand for 10 minutes. Then, the bottom of the silica gel plate was placed in the spreading layer so that the bottom side was down, and the solution was allowed to stand until it rose 20 mm from the sample application position. The plate was then removed, dried on a 60 ° C. hot plate and allowed to return to ambient temperature. After that, it was placed in the spreading layer so that the side of the area 1 and the area 4 was on the bottom, and was allowed to stand until the developing solution rose to 20 mm above the sample application position.
  • TLC developing layer manufactured by
  • ⁇ Development method 4> The development was carried out in the same manner as in the development method 1 except that one short side of the thin layer plate was used as the base.
  • ⁇ Development method 5> A PEEK tube (manufactured by Jinrei Kogyo) and a microsyringe pump MSP-1D (manufactured by As One Corporation) were connected to a microchannel plate, and development was performed at a flow rate of 500 ⁇ L / min. A gas tight syringe (manufactured by Hamilton) was used as the syringe.
  • Examples 1 to 13 and 15 to 18 use the plate having the configuration shown in FIG. 1.
  • the first region corresponds to 101 and the second region corresponds to 102.
  • Example 15 uses a plate having a configuration shown in FIG. 4, and the first area is 401, the second area is 402, the third area is 403, and the fourth area is 404.

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Abstract

検出対象物を含む試料から、前記検出対象物を分離するクロマトグラフィー用のキットであって、担体を含むプレートと、前記担体に設けられた塩とを有し、前記担体は、第一の領域と、前記第一の領域とは異なり、かつ前記第一の領域と接する第二の領域とを含み、前記第一の領域には第一の塩が設けられ、前記検出対象物は、前記第一の領域又は前記第二の領域において分離されることを特徴とする。

Description

クロマトグラフィー用のキット
　本発明はクロマトグラフィー用のキットに関する。
　薄層クロマトグラフィー（以下ＴＬＣともいう）は、ガラスやアルミなどの支持体上にシリカゲルやアルミナなどの担体を薄く塗ったプレートに試料を付与し、溶媒で展開することで、混合物を分離する手法である。安価で迅速な分析が可能であることから、化学反応の追跡や簡易的な薬物検査などに広く用いられている。
　ＴＬＣを用いて混合物から対象物を分離する場合、担体、溶媒を選択し、試行錯誤によって分離能がよくなる条件を探すことになる。しかし、担体の種類は限られており、溶媒の種類と混合比の検討には時間を要するため、望みの分離能が得られないこともしばしばあった。
　またＴＬＣは、ＨＰＬＣなどの高価な分析法に比べて感度が低い。したがって試料が希薄な場合には、何度も付与して感度を稼ぐ必要がある。また、付与した時点では見えていても、展開による拡散の影響で見えなくなってしまうこともある。特許文献１には、分離能と感度を向上させるものとして、濃縮部付きＴＬＣプレートが開示されている。濃縮部付きプレートとは、吸着層の手前に、比表面積が小さく吸着活性のない担体を塗布した部分を連結したプレートである。付与された試料は、濃縮部では吸着されないため、吸着層との連結部に濃縮され、分離能と感度が向上する。しかし、特許文献１の構成では、担体の種類によって、濃縮できる対象物が限られ、様々な検出対象物の濃縮を可能とする構成ではなかった。
特開昭５３－１４９３９３号公報
　そこで本発明では、様々な検出対象物の濃縮を可能とするクロマトグラフィーを提供することを目的とする。
　本発明に係るクロマトグラフィー用のキットは、検出対象物を含む試料から、前記検出対象物を分離するキットであって、担体を含むプレートと、前記担体に設けられた塩とを有し、前記担体は、第一の領域と、前記第一の領域とは異なり、かつ前記第一の領域と接する第二の領域とを含み、前記第一の領域には第一の塩が設けられ、前記検出対象物は、前記第一の領域又は前記第二の領域において分離されることを特徴とする。
　本発明に係るクロマトグラフィー用のキットによれば、試料から様々な検出対象物を濃縮することができる。その結果、特定の検出対象物を分離する能力が高い。さらに、検出対象物が濃縮されることにより、微量の検出対象物でも検出できる。すなわち、検出対象物の検出感度が高いキットを提供することができる。
本発明の実施形態に係るクロマトグラフィー用のキットを説明するための図。 本発明の実施形態に係るクロマトグラフィー用のキットを説明するための図。 本発明の実施形態に係るクロマトグラフィー用のキットを説明するための図。 本発明の実施例１４に係るクロマトグラフィー用のキットを説明するための図。 本発明の実施例１９に係るクロマトグラフィー用のキットを説明するための図。
　以下、本発明の実施形態について、主に薄層クロマトグラフィーを例として説明するが本発明はこれらに限られない。
　本実施形態に係るクロマトグラフィー用のキットは、検出対象物を含む試料から、前記検出対象物を分離するものである。キットは、担体を含むプレートと、担体に設けられた塩とを有する。担体は、第一の領域と、第一の領域とは異なり、かつ第一の領域と接する第二の領域とを含み、第一の領域には第一の塩が設けられ、検出対象物は、第一の領域又は第二の領域において分離される。このようなキットを用いることで、検出対象物を分離する能力を向上させることができる。また、試料が濃縮されることにより、キットによる検出対象物の検出感度を向上することができることも見出した。
　薄層クロマトグラフィーでは、担体と対象物の相互作用の強さによって対象物の展開速度が変わると言われている。展開速度は相互作用が強いほど遅くなり、相互作用が弱いほど速くなる。そして、静電相互作用、特に酸塩基相互作用が展開速度に及ぼす影響が大きい。本実施形態においては、塩を含有させることで、シリカゲルの酸・塩基性が変化し、相互作用が変化する結果、展開速度が変化し分離能を向上することができるようになったと考えられる。また、この性質を利用し、一部の物質の展開速度のみを急激に遅くする塩を塗布すれば、それら一部の物質のみを選択的に濃縮することができるため、希薄な試料であっても感度を大きく向上させることができる。
　すなわち、従来は、シリカゲルに化学修飾を施すことで酸塩基性の調整を行っていたが、本実施形態の手法を用いれば塩を含有させるだけで、様々な酸塩基性のシリカゲルを簡便に作成することができる。また、本手法を用いれば、１枚のプレートにいくつもの領域を配置することができる。これにより、対象物に合わせて自在に調整ができるため、分離しづらい物質の分離能を向上することができる。さらに、濃縮したい物質を選択的に濃縮し、感度を向上することもできる。
　（プレート）
　本実施形態に薄層クロマトグラフィー用のキットに含まれるプレートは、少なくとも担体を有する。なお、本実施形態において担体とは吸着等の性質を示し、他の物質を固定する土台となる物質のことである。本実施形態におけるプレートは支持体上に担体が設けられた構造を含み構成されていてもよいし、支持体がなく、担体のみを含み構成されていても良い。支持体上の担体は、所謂ＴＬＣのように薄層の形態でもよいし、所謂マイクロ流路プレートのようにカラム状の形態でもよい。
　本実施形態に係るプレートの一例について図１を用いて説明する。本実施形態に係るプレートは支持体１０３上に担体１０６を有する。担体は、第一の領域１０１と、第一の領域１０１とは異なり、かつ第一の領域１０１と接する第二の領域１０２とを含み、第一の領域１０１には第一の塩が設けられている。また、第二の領域１０２には、第一の塩とは異なる第二の塩が設けられていてもよい。また、第一の領域１０１と第二の領域１０２にともに第一の塩が設けられていてもよい。この場合、第一の領域１０１に設けられた第一の塩の濃度と、第二の領域１０２に設けられた第一の塩の濃度とは異なるようにする。１０４あるいは１０５の方向に後述する展開液を導入して展開を行う。
　図２には、他の一例として矩形状のプレートの長辺方向に、塩を塗った領域を２つ、塩を塗っていない領域を３つ有するプレートを示している。支持体２０６上に担体２０７を有しており、また、第一の領域２０１、第二の領域２０２、第三の領域２０３、第四の領域２０４、第五の領域２０５を有しており、第二の領域２０２、第四の領域２０４にはそれぞれ異なる種類の塩が設けられる。または、５つの領域のうち接する領域同士に設けられる塩の種類が同じ場合、各々異なる濃度の塩が設けられる。なお、塩が設けられない領域を１以上含んでいても良い。塩が設けられない領域を２以上含む場合、塩が設けられない領域同士が接する構成とならないようにする。すなわち、互いに接する領域の一方には、塩が設けられる構成とする。
　なお、第一の領域、及び第二の領域と異なる位置に、さらに第三の領域から第ｎの領域（ｎは３以上の整数）の領域を有していてもよい。だだし、第ｋの領域は少なくとも第ｋ－１の領域と接している（ｋは２≦ｋ≦ｎをみたす整数）。第ｋの領域は、塩の有無、濃度、種類によって第ｋ－１の領域と区別できるものとする。図２に示す２０８あるいは２０９の方向に、後述する展開液を導入して展開を行う。
　図３には、さらに他の一例として、プレートの長辺および短辺方向に、塩を塗った領域を４つ有するプレートを示している。支持体３０５上に吸着層３０６を有しており、また、第一の領域３０１、第二の領域３０２、第三の領域３０３、第四の領域３０４を有している。第一の領域３０１は第二の領域３０２と接しており、第二の領域３０２は第三の領域３０３と接しており、第三の領域３０３は第四の領域３０４と接している。第一の領域３０１、第二の領域３０２、第三の領域３０３、第四の領域３０４にはそれぞれ種類かつ／あるいは濃度の異なる塩を含有する。図３に示す３０７あるいは３０８の方向に、後述する展開液を導入して展開を行う。
　図５には、カラム状の担体を用いたプレートの一例を示している。支持体５０３上に吸着層５０６を有しており、さらに第一の領域５０１、第二の領域５０２を有している。図５に示す５０４あるいは５０５の方向に、後述する展開液を導入して展開を行う。
　塩の濃度は１．０ｍｇ／ｍｍ３以上であることが好ましく、２．０ｍｇ／ｍｍ３以上であることがより好ましい。本発明において「濃度」とは、担体１ｍｍ３あたりの塩の質量を意味する。
　（塩）
　本発明における塩とは、酸由来の陰イオンと塩基由来の陽イオンがイオン結合した化合物のことを指す。無機塩としては、たとえば、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＮａＨＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ３、Ｋ３ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＫＮＯ３、ＮａＢｒなどを用いることができる。有機塩としては、たとえば、ＣＨ３ＣＯＯＫ、ＣＨ３ＣＯＯＮａ、Ｎａ２Ｃ２Ｏ４、ＣａＣ２Ｏ４、ＨＣＯＯＮａ、ＮａＨ２（Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３）、Ｎａ２Ｈ（Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３）、Ｎａ３（Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３）などを用いることができる。
　第一の塩は、水溶液が塩基性を示す塩であることが好ましい。例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣＨ３ＣＯＯＫ、ＣＨ３ＣＯＯＮａ、Ｎａ２Ｃ２Ｏ４、ＣａＣ２Ｏ４、ＨＣＯＯＮａ、ＮａＨ２（Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３）、Ｎａ２Ｈ（Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３）、Ｎａ３（Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３）で構成される群から選択される少なくとも一種を用いることができる。その中で、ＮａＨＣＯ３あるいはＫＨＣＯ３を用いることが好ましい。
　第二の塩は水溶液が中性あるいは酸性を示す塩であることが好ましい。例えば、ＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＣｌ、ＫＮＯ３、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮａＨＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４で構成される群から選択される少なくとも一種を用いることができる。その中で、ＫＨ２ＰＯ４あるいはＮａＨ２ＰＯ４を用いることが好ましい。
　塩は水などの適切な溶媒に溶解あるいは分散させたものを、前述のプレートに塗布してもよいし、塩と担体を予め混ぜておいたプレートを用いてもよい。塗布する際は、筆やスプレー、ピペット、エアブラシなどを適宜使用すればよい。あるいは、塩の溶液にプレートを浸漬させてもよい。
　（試料）
　対象物を含有する試料としては特に限定されないが、本手法を用いれば、対象物の濃度が希薄であったり、複雑な組成の試料であったりしても分析することができる。たとえば、尿、血液、汗など複雑な組成の体液中の微量成分であっても分析することができる。
　試料に含まれる物質としては、３－カルバミル－１－メチルピリジニウムクロリド、キナルジン酸、アデノシン、ウラシル、ニコチン酸、４－ピリドキシン酸、ニコチンアミド、４－ヒドロキシフェニル酢酸、４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル酢酸、テオフィリン、４－アミノ安息香酸、８オキソ２’デオキシグアノシン、カフェイン、テオブロミン等が挙げられる。その中で検出対象物は、８オキソ２’デオキシグアノシン等が挙げられる。
　（支持体）
　支持体１０３の材質は、ガラス、プラスチック、アルミ等が用いられ、試料の種類、展開液の種類等により適宜選択できる。支持体１０３の寸法や形状については、取り扱いの簡便さからは試料が移動する方向の長さ３ｃｍ～１５ｃｍ、幅１ｃｍ～５ｃｍの方形が好ましい。
　（担体）
　担体としては、シリカゲル、アルミナ、セルロース、けいそう土などを用いることができる。また、シリカゲル中のシラノール基に有機部位を化学結合した化学修飾型シリカゲルも用いることができる。化学修飾型シリカゲルは逆相、ＮＨ２、ＣＮ、ＤＩＯＬタイプなどが知られており、分析したい試料にあわせ、適宜選択すればよい。
　（展開溶媒）
　展開溶媒は、通常用いられている極性溶媒及び／または非極性溶媒を単独または混合して用いることができる。分析したい試料に合わせ、適宜選択すればよい。
　（試料の付与方法）
　試料はキャピラリーやマイクロピペットなどを用いて、点状や面状に付与することができる。あるいは、プレートの一辺を試料溶液に接触させ、吸い上げて付与することもできる。担体がカラム状の形態をとっている場合は、流路を通じて試料を付与することもできる。
　（検出方法）
　試料の検出は、ＵＶ光の吸収を目視やカメラなどで認識することで行うことができる。また、呈色試薬を用いて目的物質を呈色させたものを、目視やカメラなどで認識することでも行うことができる。
　（Ｒｆ値）
　本実施形態において、Ｒｆ値とは、展開を一方向に行った際の、（展開前の対象物質存在領域の重心から展開後の対象物質存在領域の重心までの距離）／（展開前の対象物質存在領域の重心から溶媒の先端までの距離）を意味する。Ｒｆ値を比較する際には、比較対象とする構成要素以外の構成や条件は互いに同じにする。例えば、プレートに設ける塩の種類を変えたときのＲｆの値を算出する際、検出対象物、担体、展開液といった他の構成要素や条件は同じにする。なお、二次元展開を行った際は、一回目と二回目でそれぞれＲｆ値を定義する。第ｋの領域と同様の組成を持つプレートで測定した、前記検出対象物のＲｆ値をＲｆｋとしたとき、Ｒｆｋ／Ｒｆｋ－１の値が２以上あるいは０．５以下となるようなｋが１つ以上存在することが好ましく、５以上あるいは０．２以下となるようなｋが１つ以上存在することがより好ましい。
　（用途）
　本実施形態に係るクロマトグラフィー用のキットは、検出対象物の有無や濃度の検出をする用途のほかに、試料から特定の検出対象物を精製することにも使うことができる。
　以下に、実施例および比較例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　（サンプルの調製）
　下記表１に記載の含有量（何れも単位は質量％）となるように各材料を混合した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（展開液の調製）
　下記表２に記載の含有量（何れも単位は体積％）となるように各材料を混合した。
　ＩＰＡ：２－プロパノール
　ＭｅＯＨ：メタノール
　ＥｔＯＨ：エタノール
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　（プレート）
　実験には下記表３に記載のプレートを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
プレート１：平均細孔径６０Åのシリカゲル（蛍光指示薬Ｆ２５４含有）を、２５０μｍの膜厚でガラスに塗布したプレート
プレート２：表面に１，２－ジヒドロキシー３－プロポキシプロピル基を修飾した平均細孔径６０Åのシリカゲル（蛍光指示薬Ｆ２５４ｓ含有）を、２００μｍの膜厚でガラスに塗布したプレート
プレート３：表面にアミノ基を修飾した平均細孔径６０Åのシリカゲル（蛍光指示薬Ｆ２５４ｓ含有）を、２００μｍの膜厚でガラスに塗布したプレート
プレート４：表面にアルキルシアノ基を修飾した平均細孔径６０Åのシリカゲル（蛍光指示薬Ｆ２５４ｓ含有）を、２００μｍの膜厚でガラスに塗布したプレート
プレート５：表面にオクタデシル基を修飾した平均細孔径６０Åのシリカゲル（蛍光指示薬Ｆ２５４ｓ含有）を、２５０μｍの膜厚でガラスに塗布したプレート
プレート６：平均細孔径６０Åのシリカゲル（蛍光指示薬Ｆ２５４含有）を、２５０μｍの膜厚でガラスに塗布したプレートに不活性な担体からなる濃縮ゾーンを連結したプレート
プレート７：平均細孔径６０Åのシリカゲル（蛍光指示薬Ｆ２５４含有）を充填した直径３ｍｍの細管を有するガラス製マイクロ流路プレート
　各実施例、比較例では、下記表４に記載のサンプル、展開液、プレートをそれぞれ用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（塩の塗布）
　実施例１から１８、比較例１から３では、３ｃｍ×５ｃｍに切断した薄層プレートを用いた。塩の塗布は、マイクロピペット（エッペンドルフ社製）を用いて塩の水溶液（９ｗｔ％）を付与することで行った。塩は、一方の短辺からもう一方の短辺に向けて、下記表５に記載の割合となるように均一に塗布した。
　実施例１９では、カラムへの充填前に、あらかじめ塩水溶液に担体を浸漬させ、ろ過、乾燥することで塩の塗布を行った。
　また、塩の濃度を下記表５に示した。
　（展開方法）
　＜展開方法１＞
　薄層プレートの短辺の第一の領域側を底辺とし、底辺から１０ｍｍの位置に、ガラス管のスポイトにてサンプルを１μｌ付与した。サンプルは６０℃のホットプレート上で乾燥させた。ＴＬＣ用展開層（アズワン社製）の底部に２ｍｍ程度の深さとなるように展開液を入れ、展開層に蓋をして１０分静置した。その後、展開層中にシリカゲルプレートの底辺が下になるように入れ、展開液がサンプル付与位置から２０ｍｍ上に上がるまで静置した。
　＜展開方法２＞
　薄層プレートの短辺の第二の領域側を底辺とした以外は、展開方法１と同様の方法で展開を行った。
　＜展開方法３＞
　薄層プレートの短辺の第三の領域と第四の領域側を底辺とし、領域４内の底辺から１０ｍｍの位置に、ガラス管のスポイトにてサンプルを１μｌ付与した。サンプルは６０℃のホットプレート上で乾燥させた。ＴＬＣ用展開層（アズワン社製）の底部に２ｍｍ程度の深さとなるように展開液を入れ、展開層に蓋をして１０分静置した。その後、展開層中にシリカゲルプレートの底辺が下になるように入れ、展開液がサンプル付与位置から２０ｍｍ上に上がるまで静置した。次に、プレートを取り出し、６０℃のホットプレート上で乾燥させ、常温に戻るまで放置した。その後、領域１と領域４の側が下になるように展開層中に入れ、展開液がサンプル付与位置から２０ｍｍ上に上がるまで静置した。
　＜展開方法４＞
　薄層プレートのどちらか一方の短辺を底辺とした以外は、展開方法１と同様の方法で展開を行った。
　＜展開方法５＞
　ＰＥＥＫチューブ（仁礼工業製）とマイクロシリンジポンプＭＳＰ－１Ｄ（アズワン社製）をマイクロ流路プレートに接続し、流速５００μＬ／分で展開をおこなった。シリンジにはガスタイトシリンジ（ハミルトン社製）を用いた。
　各実施例における展開方法は、下記表５中に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　なお、表５において、実施例１～１３、及び１５～１８は、図１で示す構成のプレートを用いており、第一の領域が１０１、第二の領域が１０２に対応する。実施例１５は、図４で示す構成のプレートを用いており、第一の領域が４０１、第二の領域が４０２、第三の領域が４０３、第四の領域が４０４となっている。
　（評価）
　＜分離能の評価＞
　各スポット同士のＲｆ値の比を１以上になるように算出したときの最小値が１．５以上である場合はＡＡ（特に好ましいレベル）、１．２以上である場合はＡ（好ましいレベル）、１．１以上である場合はＢ（許容できるレベル）、それ以外をＣとした。なお、１成分しか含まれない場合は、未評価とした。実施例１４については、１回目、２回目の展開においてそれぞれＲｆ値を求めて算出した。
　＜濃縮能の評価＞
　各対象物質について、（展開前の対象物質存在領域の展開方向の最大幅）／（展開後の対象物質存在領域の展開方向の最大幅）の最大値が５以上である場合はＡＡ（特に好ましいレベル）、２以上である場合はＡ（好ましいレベル）、１以上である場合はＢ（許容できるレベル）、それ以外をＣとした。実施例１４については、２回目の展開時の濃縮幅を用いて算出した。
　＜総合評価＞
　分離能、濃縮能の評価で、どちらもＣ評価がない場合○（好ましいレベル）、どちらか一つでもＣ評価がある場合は×（許容できないレベル）とした。
　各評価結果は下記表６に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。
　本願は、２０１７年１１月２４日提出の日本国特許出願特願２０１７－２２６０１１を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。

Claims (17)

  1. 　検出対象物を含む試料から、前記検出対象物を分離するクロマトグラフィー用のキットであって、
    　担体を含むプレートと、前記担体に設けられた塩とを有し、
    　前記担体は、第一の領域と、前記第一の領域とは異なり、かつ前記第一の領域と接する第二の領域とを含み、
    　前記第一の領域には第一の塩が設けられ、
    　前記検出対象物は、前記第一の領域又は前記第二の領域において分離されることを特徴とするキット。
  2. 　前記第二の領域には、前記第一の塩とは異なる第二の塩が設けられていることを特徴とする請求項１に記載のキット。
  3. 　前記第二の領域には、前記第一の塩が設けられ、前記第一の領域に設けられた前記第一の塩の濃度と、前記第二の領域に設けられた前記第一の塩の濃度とは異なることを特徴とする請求項１に記載のキット。
  4. 　前記第一の塩は、水溶液が塩基性を示す塩であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のキット。
  5. 　前記第一の塩は、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＣＨ３ＣＯＯＫ、ＣＨ３ＣＯＯＮａ、Ｎａ２Ｃ２Ｏ４、ＣａＣ２Ｏ４、ＨＣＯＯＮａ、ＮａＨ２（Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３）、Ｎａ２Ｈ（Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３）、Ｎａ３（Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３）
    　で構成される群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項４に記載のキット。
  6. 　前記第一の塩はＮａＨＣＯ３あるいはＫＨＣＯ３であることを特徴とする請求項５に記載のキット。
  7. 　前記第二の塩は水溶液が中性あるいは酸性を示す塩であることを特徴とする請求項２に記載のキット。
  8. 　前記第二の塩はＮａＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＣｌ、ＫＮＯ３、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮａＨＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４で構成される群から選択される少なくとも一種であることを特徴とする請求項７に記載のキット。
  9. 　前記第二の塩はＫＨ２ＰＯ４あるいはＮａＨ２ＰＯ４であることを特徴とする請求項８に記載のキット。
  10. 　前記第一の領域、及び前記第二の領域における、前記第一の塩の濃度が１．０ｍｇ／ｍｍ３以上であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載のキット。
  11. 　前記第一の領域、及び前記第二の領域における、前記第一の塩の濃度が２．０ｍｇ／ｍｍ３以上であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載のキット。
  12. 　前記第一の領域、及び前記第二の領域と異なる位置に、さらに第三から第ｎの領域（ｎは３以上の整数）を有することを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のキット。
  13. 　前記第１の領域から前記第ｎの領域のうち、第ｋの領域で測定した前記検出対象物のＲｆ値をＲｆｋとしたとき、Ｒｆｋ／Ｒｆｋ－１の値が２以上あるいは０．５以下となるようなｋ（ｋは２≦ｋ≦ｎ）が１つ以上存在することを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか一項に記載のキット。
  14. 　前記Ｒｆｋ／Ｒｆｋ－１の値が５以上あるいは０．２以下となるようなｋが１つ以上存在することを特徴とする請求項１３に記載のキット。
  15. 　前記プレートが長辺と短辺とを有する矩形であり、前記プレートの長辺方向に、前記第一から第ｋの領域が配置されていることを特徴とする請求項１３または１４に記載のキット。
  16. 　前記プレートが長辺と短辺とを有する矩形であり、前記プレートの長辺方向及び短辺方向に、前記第一の領域から前記第ｋの領域が配置されていることを特徴とする請求項１３乃至１５のいずれか一項に記載のキット。
  17. 　前記検出対象物は、８オキソ２’デオキシグアノシンであることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか一項に記載のキット。
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