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WO2019198995A1 - 엑소좀 기반의 면역세포의 교차분화 방법 - Google Patents

엑소좀 기반의 면역세포의 교차분화 방법 Download PDF

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WO2019198995A1
WO2019198995A1 PCT/KR2019/004143 KR2019004143W WO2019198995A1 WO 2019198995 A1 WO2019198995 A1 WO 2019198995A1 KR 2019004143 W KR2019004143 W KR 2019004143W WO 2019198995 A1 WO2019198995 A1 WO 2019198995A1
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WO
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macrophages
macrophage
exosomes
derived
cell
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Application number
PCT/KR2019/004143
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English (en)
French (fr)
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홍연선
김효석
양유수
김선화
김인산
권익찬
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Korea Institute of Science and Technology KIST
Original Assignee
Korea Institute of Science and Technology KIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Definitions

  • the present invention relates to a cross differentiation method, and more particularly, to a method for inducing cross-differentiation of immune cells based on exosomes.
  • Direct cell conversion technique is a technique that induces the conversion between cells that have completed differentiation, and recently, studies using the same to convert to therapeutic cells having the functions of insulin-producing endocrine cells, neurons and cardiomyocytes have been reported. It became.
  • direct cross-differentiation of hepatocytes Mild Rezavani and UCANG University and Guangqi Song and colleagues at the University of Hannover, Germany, used a virus to express four to six reprogramming factors in vivo .
  • a study that induces direct cross-differentiation into hepatocytes by delivery to (myofibroblast) has been reported, but the cell conversion rate is very low as ⁇ 1%, and there is a limit in clinical applications because of the use of virus.
  • iPSs used a method of dedifferentiating differentiated cells into stem cells using a redifferentiation technique and then re-differentiating them into cells of a desired type.
  • Such redifferentiation methods require genetic manipulation. And inefficient. Therefore, there is a need for development of a method for cross-differentiating differentiated cells into other cell types having common ancestry.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 2012-0124282 discloses a direct cross-differentiation method from somatic cells to stem cells of blastocyst epithelial cells.
  • the present invention is to solve a number of problems, including the above problems, in order to solve the problem of low efficiency of conventional anti-cancer immunotherapy, tumor reprogramming by tumor cross-linked immune cells by direct cross-differentiation of tumor-supporting cells in cancer tissues It is an object of the present invention to provide a method for inducing immune cell cross differentiation based on exosomes.
  • problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • a method of cross-differentiation of a first immune cell into a second immune cell comprising:
  • a method of cross-differentiation of M2 macrophages into M1 macrophages comprising:
  • a method of cross differentiation of M1 macrophages into M2 macrophages comprising:
  • a method of cross differentiation of M1 macrophages and / or M2 macrophages into dendritic cells comprising:
  • a method for enhancing an M1 macrophage-mediated immune response in a subject comprising:
  • exosomes induce differentiation of M2 macrophages into M1 macrophages and enhance the M1 macrophage-mediated immune response in the subject by increased M1 macrophage function.
  • a wound healing method in a subject comprising:
  • exosomes induce differentiation of M1 macrophages to M2 macrophages in the subject, and the wound healing of the subject is enhanced by increased M2 macrophage function.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising an exosome isolated from M1 macrophages as an active ingredient and one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • a pharmaceutical composition for treating wounds comprising an exosome isolated from M2 macrophages as an active ingredient and one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • the exosome-based immune cell cross-differentiation induction method of the present invention can be reprogrammed into tumor-enhanced immune cells by directly cross-differentiating tumor-supporting cells in cancer tissues It can be used as a novel anti-cancer immunity or as a cell therapy for wound healing.
  • the scope of the present invention is not limited by these effects.
  • Figure 1 is a photograph showing the results confirmed by Western blot analysis of cell markers specific for each cell type differentiation from the raw 264.7 macrophage line M1 and M2 type.
  • Figure 2 is a photograph showing the results of Western blot analysis observing the phenotype of M0, M1 and M2 derived exosomes differentiated from Raw 264.7 macrophages.
  • Figure 3 is a graph analyzing the size of M0, M1 and M2 derived exosomes differentiated from Raw 264.7 macrophages.
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • BMDM mouse bone marrow derived macrophages
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • FIG. 12 shows that M1 exosomes (tumor challenge) extracted from M1 macrophages differentiated from mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM) were treated with M2 macrophages (tumor support) and analyzed for reprogramming to M1. It is a gel photograph observing the expression of iNOS and Arginase, an M2 marker.
  • FIG. 13 shows M1 exosomes (tumor challenge type) extracted from M1 macrophages differentiated from mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM) differentiated with L929 to M2 macrophages (tumor support) and analyzed for reprogramming to M1.
  • M1 exosomes tumor challenge type
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • L929 to M2 macrophages tumor support
  • FIG. 14 shows M1 exosomes (tumor challenge type) extracted from M1 macrophages differentiated from mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM) differentiated with M-CSF and treated with M2 macrophages (tumor support) to reprogram to M1. It was analyzed by the fluorescence micrographs observed the expression of the M1 marker iNOS.
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • M2 macrophages tumor support
  • M1 markers CD86 and MHCII, which are analyzed by M1 exosomes (tumor attack type) to M2 macrophages (tumor support type) and analyzed for reprogramming to M1.
  • FIG. 16 is a graph illustrating tumor growth of experimental groups to which M1 exosomes were administered, in which tumors were treated with M1 macrophage-derived exosomes differentiated from mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM) and treated with tumors.
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • FIG. 17 is a graph illustrating the anti-tumor effect of tumors treated with M1 macrophage-derived exosomes differentiated from mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM) and the weight of the control group and the experimental group.
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • FIG. 18 is a graph illustrating tumor weights of experimental groups to which M1 exosomes were administered, in which tumors treated with M1 macrophage-derived exosomes differentiated from mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM) were observed for tumors.
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • FIG. 19 is a photograph showing the tumor size of the experimental group to which the M1 exosome was administered to observe the anti-tumor effect by treating the tumor with M1 macrophage derived exosomes differentiated from mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM).
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • FIG. 20 shows immunohistochemistry of i1 OS expression in tumor tissues treated with M1 exosomes in which tumors were treated with M1 macrophage-derived exosomes differentiated from mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM). It is a dyed picture.
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • FIG. 21 is a fluorescence photograph of uptake conditions after treatment of M2 exosomes in M1 macrophages by concentration.
  • 22 is a graph analyzing the relative fluorescence intensity after treatment of M2 exosomes in M1 macrophages by concentration.
  • Figure 23 is a gel photograph observing the expression of the marker over time after the exosomes of M2 macrophages to M1 macrophages.
  • M1 macrophage (BMDM) M1 macrophage
  • BMDM M1 macrophage
  • M2 Exosome 50 ⁇ g 24h 1 M1 macrophage (BMDM) + M2 Exosome 50 ⁇ g 24h 1
  • 3 M1 macrophage (BMDM) + M2 Exosome 50 ⁇ g 48h 1
  • 4 M1 macrophage (BMDM) + M2 Exosome 50 ⁇ g 72h 1 time
  • FIG. 24 is a photograph observing the effect of wound healing according to M1 and M2 macrophage-derived exosomes treatment using a wound healing animal model.
  • FIG. 25 is a graph analyzing wound healing effects according to M1 and M2 macrophage-derived exosomes using a wound healing animal model.
  • FIG. 26 is a representative immunohistochemical staining photograph 24 days after subcutaneous injection of PBS, M1-derived exosomes, and M2-derived exosomes to a wound.
  • 27 is a representative phase-control photograph of scratched fibroblasts incubated with macrophages.
  • Figure 28 is a graph quantifying the wound closure degree of scratched fibroblasts incubated with macrophages.
  • Figure 29 is a photograph confirming the expression level of MMP2 in macrophages / fibroblast coculture supernatant supernatant 24 hours after the wound.
  • FIG. 30 is a representative photograph of a tube formation assay for coculture of endothelial cells and macrophage subsets.
  • 31 is a graph quantitatively evaluating the number and length of tube branches after 24 hours of incubating endothelial cells and macrophages together.
  • FIG. 32 is a photograph confirming the expression level of VEGF in macrophages / fibroblast coculture supernatant 24 hours after wounding by Western blot.
  • exosome refers to extracellular vesicles, which are cell-derived vesicles that may be present in any biological fluid, including many culture media of blood, urine, and cell culture. Also called vesicles or microvesicles. Exosomes are known to be between 50 and 150 nm in size and are secreted from cells or directly through the cell membrane when the multivesicular body fuses with the cell membrane. Exosomes are known to play an important role in various processes such as coagulation, intercellular signaling, and management of metabolic waste.
  • the term "immunocyte reprogramming” refers to cancer-associated fibroblasts (CAF) and cancer metastasis, which accumulate excessively among the constituents of the tumor microenvironment and interfere with anticancer drug access to cancer cells.
  • CAF cancer-associated fibroblasts
  • TAMs tumor-associated macrophages
  • the term "direct cell conversion technique” refers to the process of inducing conversion between mature (differentiated) cells with completely different cell types in higher organisms. In other words, it is a technology that directly differentiates into other types of somatic cells. Unlike the process of reprogramming into induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) and re-differentiating them into cells of interest, they induce conversion into cells of interest without going through the stages of induced pluripotent stem cells. There is a difference. Direct cross-differentiation is currently recognized for its potential use in disease modeling and discovery of new drugs, and is expected to be applied to gene therapy and regenerative medicine in the future. Recently, studies have shown that reprogramming is possible from fibroblasts to various cells such as blood, blood vessels, muscles, etc., as well as organs that cannot regenerate tissues such as brain and heart cells. It's getting higher.
  • a method of cross-differentiation of a first immune cell into a second immune cell comprising:
  • the first immune cells may be M1 macrophages, M2 macrophages or dendritic cells.
  • the second immune cells may be M1 macrophages, M2 macrophages or dendritic cells.
  • the first immune cells may be M1 macrophages
  • the second immune cells may be M2 macrophages.
  • the first immune cells may be M2 macrophages
  • the second immune cells may be M1 macrophages.
  • the M1 macrophage or the M2 macrophage may be derived from monocyte-derived macrophages (MDM) or bone marrow-derived macrophages (BMDM).
  • MDM monocyte-derived macrophages
  • BMDM bone marrow-derived macrophages
  • the macrophages may be non-polarized or differentiated from a M0 macrophage line.
  • the non-polarized macrophage line may be THP-1, U937, J774A.1 or Raw 264.7.
  • the second immune cells can be isolated from the subject in need of administering the first immune cells.
  • the exosomes can be isolated from the cell culture of the second immune cells.
  • the exosomes can be isolated from the culture medium of the cell culture.
  • the exosomes may be 1 ⁇ g / ml to 1 mg / ml, 10 ⁇ g / ml to 100 ⁇ g / ml, 10 ⁇ g / ml to 50 ⁇ g / ml, or 10 ⁇ g / ml to 20 May be treated at a concentration of ⁇ g / ml.
  • the first immune cell may be a M1 macrophage and the subject may be a subject in need of anticancer therapy.
  • the first immune cell may be M2 macrophages and the subject may be a subject in need of wound (or wound) healing.
  • the M1 macrophages or M2 macrophages may be derived from monocyte derived macrophages (MDM) or bone marrow derived macrophages (BMDM).
  • MDM monocyte derived macrophages
  • BMDM bone marrow derived macrophages
  • the macrophages may be nonpolarized or differentiated from a M0 macrophage line.
  • the non-polarized macrophage line may be THP-1, U937, J774A.1 or Raw 264.7.
  • the second immune cells can be isolated from the subject in need of administering M1 macrophages.
  • the exosomes can be isolated from the cell culture of the first immune cells.
  • the exosomes may be separated from the culture medium of the cell culture.
  • the exosomes may be 1 ⁇ g / ml to 1 mg / ml, 10 ⁇ g / ml to 100 ⁇ g / ml, 10 ⁇ g / ml to 50 ⁇ g / ml, or 10 ⁇ g / ml to 20 May be treated at a concentration of ⁇ g / ml.
  • a method of cross differentiation of M2 macrophages into M1 macrophages comprising:
  • the M1 macrophage or the M2 macrophage may be derived from monocyte-derived macrophages (MDM) or bone marrow-derived macrophages (BMDM).
  • MDM monocyte-derived macrophages
  • BMDM bone marrow-derived macrophages
  • the macrophages may be non-polarized or differentiated from a M0 macrophage line.
  • the non-polarized macrophage line may be THP-1, U937, J774A.1 or Raw 264.7.
  • the M2 macrophages can be isolated from an individual in need of administration of M1 macrophages.
  • the subject may be a subject in need of chemotherapy.
  • the exosomes can be isolated from the cell culture of the M1 macrophages.
  • the exosomes can be isolated from the culture of the cell culture.
  • the exosomes may be 1 ⁇ g / ml to 1 mg / ml, 10 ⁇ g / ml to 100 ⁇ g / ml, 10 ⁇ g / ml to 50 ⁇ g / ml, or 10 ⁇ g / ml to 20 May be treated at a concentration of ⁇ g / ml.
  • a method of cross differentiation of M1 macrophages into M2 macrophages comprising:
  • the M1 macrophage or the M2 macrophage may be derived from monocyte-derived macrophages (MDM) or bone marrow-derived macrophages (BMDM).
  • MDM monocyte-derived macrophages
  • BMDM bone marrow-derived macrophages
  • the macrophages may be non-polarized or differentiated from a M0 macrophage line.
  • the non-polarized macrophage line may be THP-1, U937, J774A.1 or Raw 264.7.
  • the M1 macrophages may be isolated from an individual in need of administration of M2 macrophages.
  • the subject may be a subject in need of treatment of the wound.
  • the exosomes can be isolated from the cell culture of the M2 macrophages.
  • the exosomes can be isolated from the culture of the cell culture.
  • the exosomes may be 1 ⁇ g / ml to 1 mg / ml, 10 ⁇ g / ml to 100 ⁇ g / ml, 10 ⁇ g / ml to 50 ⁇ g / ml, or 10 ⁇ g / ml to 20 May be treated at a concentration of ⁇ g / ml.
  • a method of cross differentiation of M1 macrophages and / or M2 macrophages into dendritic cells comprising:
  • the dendritic cells may be derived from bone marrow or monocytes.
  • the dendritic cell may be a dentritic cell-like cell line, wherein the dendritic cell-like cell line DC2.4, JAWSII, Thp-1, HL-60, U937, KG-1, Or MUTZ-3.
  • the M1 macrophages and / or M2 macrophages may be isolated from an individual in need of administration of dendritic cells.
  • the subject may be a subject in need of chemotherapy.
  • the exosomes can be isolated from the cell culture of the dendritic cells.
  • the exosomes can be isolated from the culture of the cell culture.
  • the exosomes may be 1 ⁇ g / ml to 1 mg / ml, 10 ⁇ g / ml to 100 ⁇ g / ml, 10 ⁇ g / ml to 50 ⁇ g / ml, or 10 ⁇ g / ml to 20 May be treated at a concentration of ⁇ g / ml.
  • a method of enhancing an M1 macrophage-mediated immune response in a subject comprising:
  • exosomes induce differentiation of M2 macrophages into M1 macrophages and enhance the M1 macrophage-mediated immune response in the subject by increased M1 macrophage function.
  • the subject may be a subject in need of chemotherapy.
  • the M1 macrophages may be derived from monocyte-derived macrophages (MDM) or bone marrow-derived macrophages (BMDM).
  • MDM monocyte-derived macrophages
  • BMDM bone marrow-derived macrophages
  • the macrophages may be non-polarized or differentiated from a M0 macrophage line.
  • the non-polarized macrophage line may be THP-1, U937, J774A.1 or Raw 264.7.
  • the exosomes can be isolated from the cell culture of the M1 macrophages.
  • the exosomes can be isolated from the culture of the cell culture.
  • the exosomes may be from 1 ⁇ g / kg body weight to 100 mg / kg body weight, 5 ⁇ g / kg body weight to 50 mg / kg body weight, 20 ⁇ g / kg body weight to 20 mg / kg body weight, or It may be administered at a dosage of 100 ⁇ g / kg body weight to 10 mg / kg body weight.
  • the exosomes may be administered systemically or topically.
  • the exosomes can be administered intravenously, intramuscularly or intraperitoneally.
  • the exosomes can be administered intratumorally, transdermally or subcutaneously.
  • the administration method is not limited thereto, and a method suitable for treatment may be used.
  • a wound healing method in a subject comprising:
  • exosomes induce differentiation of M1 macrophages to M2 macrophages in the subject, and the wound healing of the subject is enhanced by increased M2 macrophage function.
  • the M2 macrophages may be derived from monocyte derived macrophages (MDM) or bone marrow derived macrophages (BMDM).
  • MDM monocyte derived macrophages
  • BMDM bone marrow derived macrophages
  • the macrophages may be non-polarized or differentiated from a M0 macrophage line.
  • the non-polarized macrophage line may be THP-1, U937, J774A.1 or Raw 264.7.
  • the exosomes can be isolated from the cell culture of the M2 macrophages.
  • the exosomes can be isolated from the culture of the cell culture.
  • the exosomes may be from 1 ⁇ g / kg body weight to 100 mg / kg body weight, 5 ⁇ g / kg body weight to 50 mg / kg body weight, 20 ⁇ g / kg body weight to 20 mg / kg body weight, or It may be administered at a dosage of 100 ⁇ g / kg body weight to 10 mg / kg body weight.
  • the exosomes may be administered systemically or topically.
  • the exosomes can be administered intravenously, intramuscularly or intraperitoneally.
  • the exosomes can be administered intratumorally, transdermally or subcutaneously.
  • the administration method is not limited thereto, and a method suitable for treatment may be used.
  • compositions for treating cancer comprising an exosome isolated from M1 macrophages as an active ingredient and one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • a pharmaceutical composition for treating wounds comprising an exosome isolated from M2 macrophages as an active ingredient and one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • the pharmaceutically acceptable carrier means an excipient, diluent or adjuvant.
  • carriers include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, physiology Saline, buffers such as PBS, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils.
  • the composition may include fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in any formulation according to conventional methods.
  • the compositions can be formulated, for example, in oral dosage forms (e.g. powders, tablets, capsules, syrups, pills and granules) or parenteral formulations (e.g. injections).
  • the compositions may also be formulated in systemic or topical formulations.
  • the preferred dosage of the active substance depends on the condition and weight of the patient, the severity of the disease, the form of the drug, the route of administration and the interval of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art. Art. Such dosages range from, for example, about 0.001 mg / kg body weight to about 100 mg / kg body weight, about 0.01 mg / kg body weight to about 10 mg / kg body weight or about 0.1 mg / kg body weight to about 1 mg / kg body weight. Can be. Administration can be carried out once a day, several times a day, once a week, once every two weeks, once every three weeks, once every four weeks or once a year.
  • Exosome derived from M1 macrophages is treated in M2 macrophages isolated from the patient in vitro conditions or a cell population including the M2 macrophages to cross-differentiate M2 macrophages M1 macrophages Can be used.
  • the cross-differentiated M1 macrophages or cell populations comprising the M1 macrophages may be used in a kind of ex vivo therapy that is re-administered to the patient as a cell therapy.
  • Treatment with patient-derived macrophages is a very effective method for minimizing side effects that can occur when using a taga-derived cell therapy such as an immune rejection reaction.
  • exosomes are extracellular vesicles of 50-150 nm size, secreted by cells, and contain intracellular proteins, membrane proteins, lipids and nucleic acids such as RNA, miRNA, DNA, etc. Because it contains a combination of factors related to growth, migration and signaling, it has unlimited potential to be used as a cell reprogramming inducing factor and a carrier including the same. Moreover, exosomes are cell-derived materials with excellent biocompatibility, and because they are composed of lipid bilayers such as cells, they can safely and efficiently deliver various active substances (drugs, genes, proteins).
  • BMDM bone marrow-derived macrophages
  • M-CSF macrophage colony-stimulating factor
  • L929 cell culture medium RPMI medium supplemented with 10% fetal calf serum and 1% antibiotics.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • Exosomes can be isolated by known methods. For example, exosomes in cell culture medium may be subjected to continuous centrifugation (e.g. 300 xg 10 minutes, 2000 xg 10 minutes, 10,000 xg 30 minutes, filtered with a 0.22 ⁇ m filter and an additional ultracentrifugation at 150,000 xg for 3 hours). Can be separated by.
  • the exosomes may be cell strainer and bottle-top filter (e.g. 2,000 xg, centrifuged at 4 ° C, first filtration using a cell strainer (40 ⁇ m), using a bottle top filter (0.22 ⁇ m) Second filtration).
  • the filtered exosomes can be concentrated with TFP (Tangential Flow Filtration).
  • the exo-bit is Prior Art (Korea Patent Publication No. 10-2016-0116802 call; Pin, such as Li, Theranostics, 7 (3): .. 789-804, 2017; Coumans , etc., Circ Res, 120: 1632- 1648, 2017).
  • the amount of total protein was determined by the BCA assay kit, and equivalent amounts (20 ⁇ g) of cell lysate and exosome protein were used for Western blot analysis. Proteins were separated by SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose membrane. The membrane was then blocked with 5% skim milk powder for 1 hour in 1 ⁇ Tris-buffered saline (0.05% tween 20). The blot was overnight at 4 ° C.
  • anti-iNOS antibody 500, Abcam, ab15323; anti-CD206 antibody, 1: 500, Santacruz, sc34577; anti-Arginase antibody, 1: 500, Santacruz, sc18355; Or anti-Actin antibody, 1: 2000, Merck Millipore, MABT219; anti-GAPDH antibody, 1: 2000, Merck Millipore, AB2302).
  • the membrane was then reacted with HRP-conjugated anti-mouse or -rabbit secondary antibody (Sigma-Aldrich) and the results visualized by chemiluminescence (Bio-Rad).
  • BMDM Mouse bone marrow-derived macrophage lines
  • BMDM Mouse bone marrow-derived macrophage lines
  • M2 macrophages were treated with M1 macrophages-derived exosomes for 24 hours, followed by APC anti-mouse F4 / 80 antibody (BioLegend, 123116), PE anti-mouse CD86 antibody (BioLegend, 105008), FITC anti-mouse MHCII Antibodies (BioLegend, 107605) were added and stained for 1 hour and analyzed using Accuri TM C6 flow cytometer.
  • Tumor tissue was excised, fixed overnight with 10% neutral formaldehyde and paraffin-embedded.
  • the paraffin-embedded tissue was sliced and antigen extracted, and then the slices were reacted with anti-iNOS antibody (1: 200, Abcam, ab15323) at 4 ° C. overnight.
  • the next day the slices were incubated with secondary antibody (1: 200, GBILabs, D43-18) for 2 hours at room temperature and control stained for 30 seconds. Images were obtained using an optical microscope (BX51, Olympus, USA).
  • NIH-3T3 cells were plated in fresh culture medium at a density of 2 ⁇ 10 5 cells / well in 6 well plates (SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea). Cells were incubated overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 to form a 70% density. M1, M2 or reporgrammed-M2 macrophages (RM2) were then added to each well at 2.5 ⁇ 10 5 cell density per well. After culturing cocultured cells for an additional 12 hours, scrape the cell layer with a 200 ⁇ L pipette tip and carefully with PBS before taking microscopic images with a CK40 culture microscope (Olympus, Tokyo, Japan) at 0 and 24 hours. Washed. All experiments were performed in multiples of four.
  • SVEC4-10 endothelial cells (ATCC ® CRL-2181 TM (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) were seeded at a density of 2x10 4 cells / 100 ⁇ l, and each macrophage was cultured in CK40 after 24 hours of density. Tube formation was captured under a microscope (Olympus, Tokyo, Japan) and tube branch number and tube length were analyzed with ImageJ software (NIH).
  • Example 1 Raw cell macrophage phenotype confirmation
  • M1 and M2 macrophages have been shown to be tumor aggressive and have anti-cancer effects (M1 marker: iNOS), M2 macrophages are cancer-friendly tumor-supported macrophages, and TAM (tumor associated macrophage) is typical (M2 marker).
  • M1 marker iNOS
  • M2 macrophages are cancer-friendly tumor-supported macrophages
  • TAM tumor associated macrophage
  • CD206 Arginase
  • IFN- ⁇ (40 ng / ml) was treated for 48 hours to induce differentiation of Raw 264.7 macrophage into M1 macrophages, tumor-enhanced cells, and IL to induce differentiation into tumor-supporting cells, M2 macrophages.
  • -4 (20 ng / ml) and IL-13 (20 ng / ml) were treated for 48 hours.
  • IFN- ⁇ (40 ng / ml) was treated in Raw 264.7 macrophage line for 48 hours to differentiate into M1 macrophages or IL-4 (20 ng / ml) and IL-13 (20 ng / ml) to 48 After treatment for a time to differentiate into M2 macrophages and incubated for 48 hours in serum-free medium (serum-free media) to extract the exosomes and markers were analyzed. First, centrifugation was sequentially performed at 300 xg for 10 minutes, 2000 xg for 10 minutes, and 10,000 xg for 30 minutes in a culture medium containing exosomes. The culture solution was filtered through a 0.22 ⁇ m filter and then 70 Ti rotor (Beckman Instruments).
  • the blot then contains anti-iNOS antibody (1: 500, Abcam, ab15323), anti-CD206 antibody (1: 500, Santa Crus, sc-34577) and anti-Arginase antibody (1: 500, Santa Crus, sc- 18355) was added and left overnight at 4 ° C., and an anti-Alix antibody (1: 500, Santa Crus, sc-99010) was used as an exosome marker.
  • HRP-bound secondary antibody (1: 4000, Sigma-Aldrich) was then added to the membrane and visualized by chemiluminescence.
  • the size distribution of the exosomes was analyzed by dynamic light scattering (DLS) using Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Ltd., UK) and the exosome size was 173 at 25 ° C using software provided by the instrument. The analysis was carried out via z-average at a fixed angle of °.
  • DLS dynamic light scattering
  • M1 and M2 macrophages have been shown to be tumor aggressive and have anti-cancer effects (M1 marker: iNOS), M2 macrophages are cancer-friendly tumor-supported macrophages, and TAM (tumor associated macrophage) is typical (M2 marker).
  • M1 marker iNOS
  • M2 macrophages are cancer-friendly tumor-supported macrophages
  • TAM tumor associated macrophage
  • CD206 Arginase
  • IFN- ⁇ (20 ng / ml) and LPS (100 ng / ml) were treated for 48 hours and induced differentiation into M2 macrophages.
  • IL-4 (20 ng / ml) was treated for 48 hours.
  • M1 and M2 macrophages We differentiated into M1 and M2 macrophages according to the schedule and conditions of FIG. 4 to establish differentiation conditions of mouse bone marrow-derived macrophages (BMDM).
  • BMDM mouse bone marrow-derived macrophages
  • M1 macrophages showed a fried egg shape
  • M2 macrophages showed a mixed population of fried egg and spindle cells (FIG. 5).
  • ECM extracellular matrix
  • M1 macrophages A marker of M1 macrophages, known to have anticancer effects, was iNOS, a tumor-supporting macrophage cell that is involved in reconstruction of extracellular matrix (ECM), cell proliferation and angiogenesis, and is cancer-friendly. Markers of known M2 macrophages were CD206 and Arginase (FIG. 6).
  • BMDM mouse bone marrow derived macrophages
  • mouse bone marrow-derived macrophages were treated with IFN- ⁇ (20 ng / ml) and LPS (100 ng / ml) for 48 hours to differentiate into M1 macrophages or IL-4 (20 ng / ml) was treated for 48 hours to differentiate into M2 macrophages and then cultured for 48 hours in serum-free media to extract exosomes and analyzed markers.
  • centrifugation was sequentially performed at 300 xg for 10 minutes, 2000 xg for 10 minutes, and 10,000 xg for 30 minutes in a culture medium containing exosomes.
  • the culture solution was filtered through a 0.22 ⁇ m filter and then 70 Ti rotor (Beckman Instruments).
  • the blot then contains anti-iNOS antibody (1: 500, Abcam, ab15323), anti-CD206 antibody (1: 500, Santa Crus, sc-34577) and anti-Arginase antibody (1: 500, Santa Crus, sc- 18355) was added and left overnight at 4 ° C., and an anti-Alix antibody (1: 500, Santa Crus, sc-99010) was used as an exosome marker.
  • HRP-bound secondary antibody (1: 4000, Sigma-Aldrich) was then added to the membrane and visualized by chemiluminescence.
  • the samples were first placed on copper grids equipped with a carbon film (Electron microscopy science), and stained negatively using a uranil acetate solution, and a transmission electron microscope (Tecnai) was used. The analysis was carried out.
  • the size distribution of the exosomes was analyzed by dynamic light scattering (DLS) using Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Ltd., UK) and the exosome size was 173 at 25 ° C using software provided by the instrument. The analysis was carried out via z-average at a fixed angle of °.
  • M1 marker iNOS and M2 marker arginase were detected in the exosomes of M1 and M2 macrophages, respectively (FIG. 7).
  • exosomes of M1 and M2 macrophages were measured to have a spherical shape of about 70-80 nm (FIGS. 8 and 9).
  • the present inventors extracted exosomes from M1 and M2 macrophages differentiated in BMDM (bone marrow-derived macrophages) and analyzed cytokines (cytokine) contained in the exosomes.
  • BMDM bone marrow-derived macrophages
  • cytokines cytokine
  • the membrane to which the primary antibodies to various cytokines are bound was blocked for 30 minutes at room temperature with a blocking buffer, and then 30 ⁇ g of M1 and M2 exosome lysates were treated to the membrane and reacted at 4 ° C. overnight.
  • the membrane was then treated with a biotin-bound antibody cocktail to react at 4 ° C. overnight, and then reacted with HRP-streptavidin at room temperature for 2 hours, and the results were visualized by chemiluminescence (Bio-Rad).
  • cytokine measurement showed that M1 exosomes have higher expression of MIG and RANTES than M2 exosomes, which are factors involved when M1 macrophages recruit T cells (Figure 10).
  • the expression of cytokines such as CXCL16, IL-2, IL-3 ⁇ , etc. was relatively high compared to M1 exosomes (FIG. 11).
  • the present inventors treated M1 exosomes (tumor attack type) to M2 macrophages (tumor support type) and analyzed whether they reprogrammed to M1.
  • M1 exosomes (40 ⁇ g) in serum-free medium were incubated for 24, 48, and 72 hours after treatment with M2 macrophages.
  • Intracellular protein was extracted from each cell using a lysis buffer, and the protein concentration of the extracted cells was measured using a BCA protein analysis kit (Bio-Rad). Protein equivalents (20 ⁇ g) were analyzed by SDS-PAGE and transcribed into nitrocellulose membranes. The blot then contains anti-iNOS antibody (1: 500, Abcam, ab15323), anti-CD206 antibody (1: 500, Santa Crus, sc-34577) and anti-Arginase antibody 1: 500, Santa Crus, sc-18355 ) was added and left overnight at 4 ° C. HRP-linked secondary antibody (1: 4000, Sigma-Aldrich) was then added to the membrane, which was visualized by chemiluminescence.
  • M1 exosomes were treated with M2 macrophages
  • the expression of M1 marker iNOS was increased and the expression of M2 marker Arginase was decreased as the amount of treated M1 exosomes was increased (FIG. 12).
  • the expression of M1 marker iNOS was not observed in macrophages (M0) and M2 macrophage undifferentiated groups with L929 cell culture, but M2 treated with M1 exosomes differentiated with L929 cell culture for 24 hours.
  • INOS expression in the macrophage experimental group was shown to increase rapidly compared to the BMDM (M0) experimental group (Fig. 13).
  • M1 macrophage untreated group derived from M-CSF-differentiated macrophages did not observe the expression of the M1 marker iNOS but treated with M1 exosomes derived from M-CSF-differentiated macrophages for 24 hours.
  • INOS expression in one M2 macrophage experimental group was shown to increase rapidly (FIG. 14).
  • M1 exosomes (40 ⁇ g) in serum-free medium were incubated for 24 hours after treatment with M2 macrophages. Each cell was added with APC anti-mouse F4 / 80 antibody (BioLegend, 123116), PE anti-mouse CD86 antibody (BioLegend, 105008), FITC anti-mouse MHCII antibody (BioLegend, 107605), and then 1 hour at 4 ° C. Staining, which was analyzed by Accuri TM C6 flow cytometry.
  • the present inventors analyzed the reprogramming with M2 by treating M1 macrophages with exosomes of M2 macrophages that promote wound healing.
  • exosomes of the isolated M2 macrophages 50 ⁇ g were added to M1 macrophages in a serum free media once in a treatment group and once in 48 hours for 24, 48, 72, and 96 hours. The groups were treated and then the expression of markers was observed.
  • the present inventors observed the wound healing effect of M1 and M2 macrophage-derived exosomes using a wound healing animal model.
  • a mouse wound healing model was prepared, and then classified into groups treated with M1 or M2 macrophage-derived exosomes (100 ⁇ g / 100 ⁇ l), a control group treated with PBS, and an untreated group treated with nothing. Wound size).
  • the skin tissue of the mouse in which the wound of the wound healing model was completely healed was extracted and subjected to immunohistochemistry (IHC) analysis.
  • IHC immunohistochemistry
  • M2 macrophages To correlate wound healing by reprogrammed M2 macrophages (RM2) and the expression of pro-protective factors such as matrix metalloproteinase-2 (MMP2), the expression level of MMP2 was expressed in a medium in which macrophages and fibroblasts were co-cultured. Measured. Similar to the wound scratch analysis, expression of MMP2 was highest in the group cultured with M2 macrophages, and the group cultured with reprogrammed M2 macrophages showed similar expression amounts (FIG. 29).
  • MMP2 macrophages To correlate wound healing by reprogrammed M2 macrophages (RM2) and the expression of pro-protective factors such as matrix metalloproteinase-2 (MMP2), the expression level of MMP2 was expressed in a medium in which macrophages and fibroblasts were co-cultured. Measured. Similar to the wound scratch analysis, expression of MMP2 was highest in the group cultured with M2 macrophages, and the group culture
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF was increased in the group co-cultured with M2 macrophages and in the group of recombinant M2 recombinant macrophages, compared to the control group in the group treated with M1 macrophages (FIG. 32).
  • the exosome-based immune cell cross-differentiation induction method of the present invention is a cell reprogramming technique through direct cross-differentiation using exosomes as a new technology that can dramatically regulate and control immune responses that have not been reported to date. It is a fundamental treatment method that converts cells within and is applied to treatment. Therefore, it can be utilized as a new concept in vivo cell therapy platform technology for various refractory and immune diseases in addition to cancer treatment.
  • Methods and compositions according to one embodiment of the present invention can be usefully used in the development of medicines, in particular for the treatment of cancer or wound treatment.

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Abstract

본 발명은 분화가 완료된 제2면역세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 상기 면역세포와 공통의 선조세포를 가지며 다른 유형으로 분화가 완료된 제1면역세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계를 포함하는, 상기 제1면역세포의 상기 제2면역세포로의 교차분화 방법을 제공한다.

Description

엑소좀 기반의 면역세포의 교차분화 방법
본 발명은 2018년 4월 10일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/655,313에 대한 우선권을 주장한다. 상기 문서는 전체로 본 출원에 참조로 삽입된다.
본 발명은 교차분화 방법에 관한 것으로 더 상세하게는 엑소좀 기반의 면역세포 교차분화 유도방법에 관한 것이다.
직접교차분화 기술(direct cell conversion technique)은 분화가 완료된 세포간의 전환을 유도하는 기술로 최근 이를 이용하여 인슐린을 생산하는 내분비 세포, 뉴런, 심근세포의 기능을 가지는 치료용 세포로 전환하는 연구들이 보고되었다. 특히, 간세포(hepatocyte)의 직접교차 분화 연구의 경우, 미국의 UCSF 대학의 Milad Rezavani 연구팀과 독일의 하노버 대학의 Guangqi Song 연구팀에서 바이러스를 이용하여 4~6개 리프로그래밍 인자를 in vivo에서 마우스 근섬유아세포(myofibroblast)에 전달하여 간세포로 직접교차분화를 유도한 연구가 보고되었으나 세포 전환율이 ~1% 정도로 매우 낮을 뿐 아니라, 바이러스를 이용하였기 때문에 임상으로 적용에는 한계가 있다. 또한, 역분화줄기세포(iPS)의 연구는 분화 완료된 세포를 역분화기술을 이용하여 줄기세포로 역분화시킨 후 이를 원하는 유형의 세포로 재분화시키는 방법을 사용하였는데 이와 같은 재분화 방법은 유전자 조작이 필요하고 효율성이 떨어진다. 따라서 분화가 완료된 세포를 선조를 공통으로 하는 다른 세포 유형으로 교차분화시키는 방법의 개발이 요구되고 있다.
한편, 직접교차분화(direct conversion)를 통한 치료제 개발에 필수적인 요소이나 현재의 in vivo 세포 리프로그래밍 기술의 경우, 세포전환 효율이 매우 낮아 만족할 만한 치료효과를 얻기가 어려운 실정이다. 더욱이 대부분이 바이러스 전달체를 이용하여 리프로그래밍 인자를 세포에 전달하고 있는 실정이며, 바이러스의 체내 염색체로의 무작위 삽입으로 인한 안정성의 문제가 있어 임상에서 치료제로 활용하기에는 한계가 있다. 따라서 직접교차분화 기술의 임상적용을 위해서는 표적세포를 높은 효율로 전환할 수 있는 세포 리프로그래밍 기술개발이 필수적이다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2012-0124282호는 체세포에서 배반엽 상피 세포의 줄기세포로의 직접 교차분화 방법에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 유전자 조작에 따른 세포 전환 효율성이 감소하는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 종래의 항암면역치료 효율이 낮은 문제점을 해결하고자 종양 지지형 세포를 암조직에서 직접교차분화시켜 종양 공격형 면역 세포로 리프로그래밍이 가능한 엑소좀 기반의 면역세포 교차분화 유도방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 제1면역세포의 제2면역세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 제2면역세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 상기 제2면역세포와 공통의 선조세포를 가지며 다른 유형으로 분화가 완료된 제1면역세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 M1 대식세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 M2 대식세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 M1 대식세포의 M2 대식세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 M2 대식세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 M1 대식세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포의 수지상 세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 수지상 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 개체에서 M1 매크로파지-매개 면역반응을 강화시키는 방법이 제공된다:
M1 대식세포 배양물로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
치료적으로 유효한 양의 분리된 엑소좀을 개체에게 투여하는 단계
(여기서, 상기 엑소좀은 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 분화를 유도하고, 증가된 M1 대식세포의 기능에 의해 개체에서 M1 대식세포-매개 면역반응이 향상됨).
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 하기를 포함하는 개체에서의 상처 치유 방법이 제공된다:
분화가 완료된 M2 대식세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
치료적으로 유효한 양의 분리된 엑소좀을 개체에게 투여하는 단계
(여기서, 상기 엑소좀은 상기 개체에서 M1 대식세포의 M2 대식세포로의 분화를 유도하고, 증가된 M2 대식세포의 기능에 의해 상기 개체의 상처 치유가 향상됨).
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 유효성분으로 M1 대식세포로부터 단리 된 엑소좀 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 치료용 약학 적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 유효성분으로 M2 대식세포로부터 단리 된 엑소좀 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 상처 치료용 약학 적 조성물이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 엑소좀 기반의 면역세포 교차분화 유도방법은 종양 지지형 세포를 암조직에서 직접교차분화시켜 종양 공격형 면역 세포로 리프로그래밍이 가능하므로 신규 항암면역 치료제 또는 창상 치유를 위한 세포 치료제로 활용할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 Raw 264.7 대식세포주로부터 M1 및 M2 타입의 대식세포로의 분화를 각 세포 유형에 특이적인 세포 표지자에 대한 웨스턴블랏 분석으로 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 Raw 264.7 대식세포로부터 분화된 M0, M1 및 M2 유래 엑소좀의 표현형을 관찰한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 Raw 264.7 대식세포로부터 분화된 M0, M1 및 M2 유래 엑소좀의 크기를 분석한 그래프이다.
도 4는 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)의 분화 조건을 확립하기 위한 조건 및 스케줄을 도식화한 개요도이다.
도 5는 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)를 M1 및 M2 대식세포로 분화시킨 후 형태를 관찰한 현미경 사진이다.
도 6은 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)에서 분화된 M0, M1 및 M2 대식세포의 마커의 발현을 관찰한 겔 사진이다.
도 7은 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)로부터 분화된 M0, M1 및 M2 대식세포로부터 엑소좀의 형태를 관찰한 현미경 사진이다.
도 8은 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)에서 분화된 M0, M1 및 M2 대식세포로부터 분리한 엑소좀의 크기를 분석한 그래프이다.
도 9는 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)에서 분화된 M0, M1 및 M2 대식세포로부터 분리한 엑소좀의 마커의 발현을 관찰한 겔 사진이다.
도 10은 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)에서 분화시킨 M1 및 M2 대식세포로부터 추출한 엑소좀에 포함되어 있는 MIG과 RANTES의 발현을 측정한 사이토카인 어레이 키트 사진이다.
도 11은 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)로부터 분화된 M1 및 M2 대식세포로부터 추출한 엑소좀에 포함되어 있는 사이토카인의 상대적인 발현을 분석한 그래프이다.
도 12는 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포로부터 추출한 M1 엑소좀 (종양 공격형)을 M2 대식세포 (종양 지지형)에 처리하여 M1으로의 리프로그래밍 여부를 분석한 것으로 M1 마커인 iNOS와 M2 마커인 Arginase의 발현을 관찰한 겔 사진이다.
도 13는 L929로 분화시킨 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포로부터 추출한 M1 엑소좀 (종양 공격형)을 M2 대식세포 (종양 지지형)에 처리하여 M1으로의 리프로그래밍 여부를 분석한 것으로 M1 마커인 iNOS의 발현을 관찰한 형광 현미경 사진이다.
도 14는 M-CSF로 분화시킨 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포로부터 추출한 M1 엑소좀 (종양 공격형)을 M2 대식세포 (종양 지지형)에 처리하여 M1으로의 리프로그래밍 여부를 분석한 것으로 M1 마커인 iNOS의 발현을 관찰한 형광 현미경 사진이다.
도 15는 M1 엑소좀(종양 공격형)을 M2 대식세포(종양 지지형)에 처리하여 M1으로의 리프로그래밍 여부를 분석한 것으로 M1 마커인 CD86, MHCⅡ의 발현을 측정한 유세포 분석 그래프이다.
도 16은 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포 유래 엑소좀을 종양에 처리하여 항-종양 효과를 관찰한 것으로 M1 엑소좀을 투여한 실험군의 종양 성장을 분석한 그래프이다.
도 17은 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포 유래 엑소좀을 종양에 처리하여 항-종양 효과를 관찰한 것으로 대조군과 실험군의 몸무게를 분석한 그래프이다.
도 18은 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포 유래 엑소좀을 종양에 처리하여 항-종양 효과를 관찰한 것으로 M1 엑소좀을 투여한 실험군의 종양 무게를 분석한 그래프이다.
도 19은 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포 유래 엑소좀을 종양에 처리하여 항-종양 효과를 관찰한 것으로 M1 엑소좀을 투여한 실험군의 종양의 크기를 나타내는 사진이다.
도 20은 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)로부터 분화된 M1 대식세포 유래 엑소좀을 종양에 처리하여 항-종양 효과를 관찰한 것으로 M1 엑소좀을 처리한 종양 조직에서 iNOS 발현을 관찰한 면역조직화학염색 사진이다.
도 21은 M1 대식세포에 M2 엑소좀을 농도별로 처리한 후 흡수(uptake) 조건을 관찰한 형광 사진이다.
도 22은 M1 대식세포에 M2 엑소좀을 농도별로 처리한 후 상대적 형광 세기를 분석한 그래프이다.
도 23는 M1 대식세포에 M2 대식세포의 엑소좀을 처리한 후 시간에 따라 해당 마커의 발현을 관찰한 겔 사진이다. 1 : M1 macrophage (BMDM), 2 : M1 macrophage (BMDM) + M2 Exosome 50 μg 24h 1번, 3 : M1 macrophage (BMDM) + M2 Exosome 50 μg 48h 1번, 4 : M1 macrophage (BMDM) + M2 Exosome 50 μg 72h 1번, 5 : M1 macrophage (BMDM) + M2 Exosome 50 μg 96h 1번, 6 : M1 macrophage (BMDM) + M2 Exosome 50 μg 96 h(48+48) 2번.
도 24은 상처 치유(wound healing) 동물모델을 이용하여 M1 및 M2 대식세포 유래 엑소좀 처리에 따른 상처 치유 효과를 관찰한 사진이다.
도 25는 상처 치유(wound healing) 동물모델을 이용하여 M1 및 M2 대식세포 유래 엑소좀 처리에 따른 상처 치유 효과를 분석한 그래프이다.
도 26는 PBS, M1 유래 엑소좀, M2 유래 엑소좀을 상처에 피하주사 한 후 24일 후의 대표적인 면역조직화학염색 사진이다.
도 27은 대식세포와 함께 배양된 스크래치 입은 섬유 아세포의 대표적인 위상 - 대조 사진이다.
도 28은 대식세포와 함께 배양된 스크래치 입은 섬유아세포의 상처봉합 정도를 정량화 한 그래프이다.
도 29은 상처 입은 후 24 시간후에 대식세포 / 섬유아세포 공동배양 상층액에서 MMP2의 발현수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 사진이다.
도 30는 내피 세포와 대식세포 서브 세트의 공 배양에 대한 튜브 형성 분석의 대표적인 사진이다.
도 31은 내피 세포와 대식 세포를 함께 배양 한 후 24 시간 후에 튜브 가지 수와 길이를 정량적으로 평가한 그래프이다.
도 32은 상처 입은 후 24 시간후에 대식세포/섬유아세포 공배양 상층액에서 VEGF의 발현수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 사진이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "엑소좀(exosome)"은 많은 어쩌면 혈액, 소변, 및 세포배양의 배양배지를 포함하는 모든 생물학적 액체에 존재할지 모르는 세포-유래의 소포(vesicle)로 세포외 소포(extracellular vesicle) 또는 소수포(microvesicle)라고도 불리운다. 엑소좀이 크기는 50 및 150 nm 사이인 것으로 알려지고 있으며, 다소포체(multivesicular body)가 세포막과 융합할 때 세포로부터 분비되거나 세포막을 통해 직접 분비된다. 엑소좀은 응고, 세포간 신호전달, 및 대사폐기물의 관리와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려지고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "면역세포 리프로그래밍(immunocyte reprogramming)"은 종양 미세환경을 이루고 있는 구성성분 중 과도하게 축적되어서 암세포로의 항암제 접근을 방해하는 암 유관 섬유아세포(CAF) 및 암의 전이·성장을 돕는 종양 관련 대식세포(TAM)를 엑소좀을 활용하여 변형, 제어함으로써 암세포 친화적인 종양 미세환경을 조성하고 항암면역효과가 극대화된 종양 미세환경으로 리모델링하는 새로운 접근법을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "직접 교차분화기술(direct cell conversion technique)"은 고등생물에서 전혀 다른 세포타입을 갖는 성숙한(분화가 끝난) 세포간의 전환을 유도하는 과정으로 이미 분화가 끝난 세포의 운명을 다시 바꾸어 다른 종류의 체세포로 직접 분화시키는 기술이다. 이는 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)로 리프로그래밍하고 이를 재분화하여 목적하는 세포로 만들어야 하는 과정과 달리, 유도만능줄기세포단계를 거치지 않고 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도한다는 점에서 차이가 있다. 현재 직접교차분화는 질병모델링과 신약 발굴 등에 이용될 가능성을 인정받고 있으며, 미래에는 유전자 치료 그리고 재생의학 등에도 응용될 수 있을 것이라 기대된다. 최근 들어 섬유아세포(fibroblast)에서 부터 뇌, 심장 세포 등 조직 재생이 불가능한 장기들뿐 아니라, 혈액, 혈관, 근육, 등의 다양한 세포로 리프로그래밍이 가능하다는 연구들이 발표되고 있어, 치료제로서의 응용 가능성이 점차 높아지고 있는 현실이다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 제1면역세포의 제2면역세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 제2면역세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 상기 제2면역세포와 공통의 선조세포를 가지며 다른 유형으로 분화가 완료된 제1면역세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계.
상기 방법에 있어서, 상기 제1면역세포는 M1 대식세포, M2 대식세포 또는 수지상 세포일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제2면역세포는 M1 대식세포, M2 대식세포 또는 수지상 세포일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제1면역세포는 M1 대식세포이고, 상기 제2면역세포는 M2 대식세포일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제1면역세포는 M2 대식세포이고, 상기 제2면역세포는 M1 대식세포일 수 있다.
상기 방법 중 어느 하나에 있어서, 상기 M1 대식세포 또는 상기 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 상기 대식세포는 비극화(non-polarized) 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것일 수 있다. 이 경우, 비극화 대식세포주는 THP-1, U937, J774A.1 또는 Raw 264.7일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2면역세포는 상기 제1면역세포를 투여할 필요가 있는 개체로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 제2면역세포의 세포 배양물로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 세포 배양물의 배양 배지로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 10㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 또는 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖의 농도로 처리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1면역세포는 M1 대식세포일 수 있고 상기 개체는 항암 요법을 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1면역세포는 M2 대식세포일 수 있고, 상기 개체는 상처(또는 창상) 치유를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 M1 대식세포 또는 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 상기 대식세포는 비극화 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것일 수 있다. 상기 비극화 대식세포주는 THP-1, U937, J774A.1 또는 Raw 264.7일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2면역세포는 M1 대식세포를 투여 할 필요가 있는 개체로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑조좀은 상기 제1면역세포의 세포 배양물으로부터 분리될 수 있다. 또한, 상기 세포 배양물의 배양액으로부터 상기 엑소좀을 분리 할 수도 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 10㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 또는 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖의 농도로 처리될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 M1 대식세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
시험관내 조건에서 M2 대식세포를 상기 분리된 엑소좀으로 처리하는 단계.
상기 방법에 있어서, 상기 M1 대식세포 또는 상기 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 상기 대식세포는 비극화(non-polarized) 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것일 수 있다. 이 경우, 비극화 대식세포주는 THP-1, U937, J774A.1 또는 Raw 264.7일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 M2 대식세포는 M1 대식세포의 투여를 필요로 하는 개체로부터 분리될 수 있다. 이 경우 상기 개체는 항암 치료가 필요한 개체일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 M1 대식세포의 세포 배양물로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 세포 배양물의 배양액으로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 10㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 또는 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖의 농도로 처리될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 M1 대식세포의 M2 대식세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 M2 대식세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및 시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 M1 대식세포에 처리하는 단계.
상기 방법에 있어서, 상기 M1 대식세포 또는 상기 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 상기 대식세포는 비극화(non-polarized) 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것일 수 있다. 이 경우, 비극화 대식세포주는 THP-1, U937, J774A.1 또는 Raw 264.7일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 M1 대식세포는 M2 대식세포의 투여를 필요로 하는 개체로부터 분리될 수 있다. 이 경우 상기 개체는 상처의 치료가 필요한 개체일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 M2 대식세포의 세포 배양물로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 세포 배양물의 배양액으로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 10㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 또는 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖의 농도로 처리될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포의 수지상 세포로의 교차분화 방법이 제공된다:
분화가 완료된 수지상 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계.
상기 방법에 있어서, 상기 수지상 세포는 골수 또는 단핵구로부터 유래된 것일 수 있다. 선택적으로, 상기 수지상 세포는 수지상 세포-유사 세포주(dentritic cell-like cell line)일 수 있는데, 상기 수지상 세포-유사 세포주 DC2.4, JAWSII, Thp-1, HL-60, U937, KG-1, 또는 MUTZ-3일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포는 수지상 세포의 투여를 필요로 하는 개체로부터 분리될 수 있다. 이 경우 상기 개체는 항암 치료를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 수지상 세포의 세포 배양물로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 세포 배양물의 배양액으로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 1 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 10㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖, 또는 10 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖의 농도로 처리될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 하기를 포함하는 개체에서 M1 매크로파지-매개 면역반응을 강화시키는 방법이 제공된다:
M1 대식세포 배양물로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
치료적으로 유효한 양의 분리된 엑소좀을 개체에게 투여하는 단계
(여기서, 상기 엑소좀은 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 분화를 유도하고, 증가된 M1 대식세포의 기능에 의해 개체에서 M1 대식세포-매개 면역반응이 향상됨).
상기 방법에 있어서, 상기 개체는 항암 치료를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 M1 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 상기 대식세포는 비극화(non-polarized) 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것일 수 있다. 이 경우, 비극화 대식세포주는 THP-1, U937, J774A.1 또는 Raw 264.7일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 M1 대식세포의 세포 배양물로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 세포 배양물의 배양액으로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 1 μg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중, 5 μg/kg 체중 내지 50 mg/kg 체중, 20 μg/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중, 또는 100 μg/kg 체중 내지 10 mg/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 전신 또는 국소 투여될 수 있다. 전신 투여의 경우, 상기 엑소좀은 정맥 내, 근육 내 또는 복강 내 투여될 수 있다. 국소 투여의 경우, 상기 엑소좀은 종양 내, 경피 또는 피하로 투여될 수 있다. 그러나, 투여 방법은 이에 한정되는 것은 아니며, 치료에 적합한 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 하기를 포함하는 개체에서의 상처 치유 방법이 제공된다:
분화가 완료된 M2 대식세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
치료적으로 유효한 양의 분리된 엑소좀을 개체에게 투여하는 단계
(여기서, 상기 엑소좀은 상기 개체에서 M1 대식세포의 M2 대식세포로의 분화를 유도하고, 증가된 M2 대식세포의 기능에 의해 상기 개체의 상처 치유가 향상됨).
상기 방법에 있어서, 상기 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 상기 대식세포는 비극화(non-polarized) 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것일 수 있다. 이 경우, 비극화 대식세포주는 THP-1, U937, J774A.1 또는 Raw 264.7일 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 M2 대식세포의 세포 배양물로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 세포 배양물의 배양액으로부터 분리될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 1 μg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중, 5 μg/kg 체중 내지 50 mg/kg 체중, 20 μg/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중, 또는 100 μg/kg 체중 내지 10 mg/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있다.
상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 엑소좀은 전신 또는 국소 투여될 수 있다. 전신 투여의 경우, 상기 엑소좀은 정맥 내, 근육 내 또는 복강 내 투여될 수 있다. 국소 투여의 경우, 상기 엑소좀은 종양 내, 경피 또는 피하로 투여될 수 있다. 그러나, 투여 방법은 이에 한정되는 것은 아니며, 치료에 적합한 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 유효성분으로 M1 대식세포로부터 단리 된 엑소좀 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 치료용 약학 적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 유효성분으로 M2 대식세포로부터 단리 된 엑소좀 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 상처 치료용 약학 적 조성물이 제공된다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 의미한다. 담체의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 검, 알긴산 염, 젤라틴, 인산 칼슘, 규산 칼슘, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 생리 식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항-응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 통상적인 방법에 따라 임의의 제형으로 제조될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어 경구 투여형(예: 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 환제 및 과립) 또는 비경구 제형(예: 주사제형)으로 제제화될 수 있다. 상기 조성물은 또한 전신 투여제형 또는 국소 제형으로 제제화될 수 있다.
유효물질의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질환의 중증도, 약물 형태, 투여 경로 및 투여 간격에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택 될 수있다. 미술. 이러한 투여량은 예를 들어 약 0.001 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 0.01 mg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중 또는 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 1 mg/kg 체중의 범위일 수 있다. 투여는 하루에 한 번, 하루에 여러 번, 일주일에 한 번, 2 주에 한 번, 3 주에 한 번, 4 주에 한 번 또는 일 년에 한 번 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 M1 대식세포 유래의 엑소좀은 시험관내 조건에서 환자로부터 분리된 M2 대식세포 또는 상기 M2 대식세포를 포함한 세포군집에 처리되어 상기 M2 대식세포를 M1 대식세포 교차분화 시키는데 사용될 수 있다. 이렇게 교차분화된 M1 대식세포 또는 상기 M1 대식세포를 포함하는 세포군집은 세포치료제로 상기 환자에게 재투여되는 일종의 엑스 비보(ex vivo) 치료법에 사용될 수 있다. 환자 유래의 대식세포를 이용한 치료법은 면역거부 반응과 같은 타가 유래 세포치료제 사용 시 발생할 수 있는 부작용을 최소화할 수 있는 매우 효과적인 방법이다.
일반적으로 엑소좀(exosome)은 세포가 분비하는 50-150 nm 크기의 소포체 (extracellular vesicles)로서, 세포 내 단백질, 세포막 단백질, 지질 및 RNA, miRNA, DNA 등 핵산 등이 포함되어 있고 세포의 분화, 성장, 이동 및 신호전달에 관련된 여러 인자들을 복합적으로 포함하고 있으므로 특히 세포 리프로그래밍 유도 인자 및 이를 포함한 전달체로 활용 가능한 무한한 잠재력을 가지고 있다. 더욱이 엑소좀은 세포에서 유래한 물질로서 생체 적합성이 매우 우수하며, 세포와 같은 지질 이중층으로 구성되어 있기 때문에 다양한 활성물질(약물, 유전자, 단백질)을 안전하고 효율적으로 전달 가능하다. 그러나 엑소좀 내에는 다양한 기능을 지닌 여러 인자들이 혼재되어 있어 특정 방향으로 세포를 리프로그래밍 하기에는 어려움이 있어 원하는 방향으로 세포의 거동 및 운명을 유도하기 위해서는 특정 기능을 특화 및 강화 시킬 수 있는 엑소좀 엔지니어링 기술이 요구되었다. 이에 본 발명자들은 종래 암 치료에 있어서 암의 성장을 돕는 종양친화 세포로 인해 항암면역치료 효율이 매우 낮은 문제점을 근본적으로 해결하고자, 예의노력한 결과 종양 지지형 세포를 암조직에서 직접교차분화시켜 종양 공격형 면역세포로 리프로그래밍이 가능한 엑소좀 기반 세포교차분화기술을 활용한 직접 교차분화 방법을 개발하였다. 대식세포 유래 엑소좀을 이용한 직접 교차분화를 이용한 면역세포 리프로그래밍(reprogramming) 기술은 면역반응을 획기적으로 조절·통제할 수 있는 신기술로 현재까지 보고된 바가 없으며, 특히 생체 내에서 세포를 전환시켜 치료에 적용하고자 하는 기술은 근본적인 치료를 위한 것으로 암치료 외에 다른 난치성 질환에 신개념의 생체 내 세포치료 플랫폼 기술을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
일반적 방법
세포배양
골수 유래 대식세포(BMDM)를 제조하기 위해, 먼저 BALB/c 마우스를 희생시키고 다리뼈에서 골수세포(myelocyte)를 분리하였다. 상기 분리된 골수세포를 10% 우태아 혈청 및 1% 항생제가 보충된 RPMI 배지에 대식세포 콜로니-자극 인자(M-CSF) 또는 L929 세포 배양액을 첨가하여 7일 동안 배양하였고 Raw 264.7 대식세포주는 10% 우태아 혈청 및 1% 항생제가 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 성장시켰다.
엑소좀의 분리
엑소좀은 공지된 방법으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 세포배양 배지 내의 엑소 좀은 연속 원심분리(예: 300 xg 10분, 2000 xg 10분, 10,000 xg 30분, 0.22 μm 필터로 여과하고 150,000 xg에서 추가로 초원심분리 3시간)에 의해 분리될 수 있다. 선택적으로, 엑소좀은 세포 스트레이너와 바틀탑(bottle-top) 필터(예: 2,000 xg, 4℃에서 원심 분리, 셀 스트레이너(40 ㎛)를 사용한 첫 번째 여과, 바틀탑 필터(0.22 ㎛)를 사용한 두 번째 여과)를 이용하여 분리될 수 있다. 여과된 엑소좀은 TFP(Tangential Flow Filtration)로 농축될 수 있다. 선택적으로, 엑소좀은 선행문헌(한국 특허공개공보 제10-2016-0116802호; Pin Li 등, Theranostics, 7 (3): 789-804, 2017; Coumans 등, Circ. Res., 120: 1632-1648, 2017)에 기재된 방식으로 분리될 수도 있다.
웨스턴 블랏 분석
총 단백질의 양은 BCA 분석키트에 의해 결정되었고, 동량(20 μg)의 세포 용해물 및 엑소좀 단백질은 웨스턴 블랏 분석에 사용되었다. 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스막으로 옮겼다. 그 후 상기 막을 1X TBST(Tris-buffered saline, 0.05% tween 20)에서 1시간 동안 5% 탈지분유로 차단하였다. 상기 블롯을 밤새 4℃에서 1차 항체(항-iNOS 항체, 1:500, Abcam, ab15323; 항-CD206 항체, 1:500, Santacruz, sc34577; 항-Arginase 항체, 1:500, Santacruz, sc18355; 또는 항-Actin 항체, 1:2000, Merck Millipore, MABT219; 항-GAPDH 항체, 1:2000, Merck Millipore, AB2302)와 반응시켰다. 이어서, 막을 HRP-접합 항-마우스 또는 -토끼 이차항체(Sigma-Aldrich)와 반응시키고, 결과를 화학발광(Bio-Rad)에 의해 시각화하였다.
면역형광분석
마우스 골수 유래 대식세포주(BMDM)를 4-웰 챔버에 파종하였고, M2 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 IL-4(20 ng/ml)을 48시간 동안 처리하여 배양한 다음 37℃에서 24시간 동안 처리한 뒤, 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 7분간 고정하였다. 그 후 항-iNOS 항체(1:400, Abcam, ab15323) 및 Alexa fluor 488-결합된 2차 항체(1:800, Jackson ImmunoResearch)를 첨가하여 염색하였다. 잔류 비-특이성 신호(non-specific signals)의 제거 후에 상기 세포는 Hoechst 33258를 이용하여 25℃에서 10분 동안 핵 염색 후에 형광현미경(Nikon Eclipse Ti, Nikon)으로 관찰하였다.
유세포 분석
마우스 골수 유래 대식세포주 (BMDM)를 35파이 페트리 디쉬에 파종하였고, M1 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 LPS(100 ng/ml)과 IFN-γ(20 ng/ml)을 24시간 동안 처리 또는 M2 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 IL-4 (20 ng/ml)을 24시간 동안 처리하였다. M2 대식세포에 M1 대식세포 유래의 엑소좀을 24 시간 동안 처리한 뒤, APC 항-mouse F4/80 항체(BioLegend, 123116), PE 항-mouse CD86 항체(BioLegend, 105008), FITC 항-mouse MHCⅡ 항체(BioLegend, 107605) 를 첨가하여 1시간 동안 염색한 후에 Accuri TM C6 유세포 계측기로 분석하였다.
면역조직화학 분석
종양조직을 절제하고, 밤새 10% 중성 포름알데히드로 고정하고 파라핀 봉입처리하였다. 파라핀 봉입된 조직을 박편화하고 항원 인출 후, 박편을 항-iNOS 항체(1:200, Abcam, ab15323)와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날 박편을 실온에서 2시간동안 2차 항체(1:200, GBILabs, D43-18)와 함께 항온 반응시키고 30초 동안 대조 염색시켰다. 이미지는 광학현미경(BX51, Olympus, USA)을 사용하여 수득하였다.
상처 스크래치 이동 분석
NIH-3T3 세포를 6 웰 플레이트(SPL Life Sciences, Gyeonggi-do, Korea)에 2x10 5 cells/well의 밀도로 새로운 배양 배지에 도말 하였다. 세포를 37℃ 및 5 % CO 2에서 밤새 배양하여 70% 밀도를 형성시켰다. 이어서 M1, M2 또는 reporgrammed-M2 macrophages(RM2)를 웰 당 2.5x10 5 세포 밀도로 각 웰에 첨가 하였다. 추가로 12 시간 동안 공 배양 된 세포를 배양 한 후, 세포 층을 200 μL 피펫 팁으로 긁어 내고 0시간 및 24시간에 CK40 배양 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 현미경 이미지를 취하기 전에 PBS로주의 깊게 세척하였다. 모든 실험은 4배수로 수행되었다.
튜브 형성 분석
96-웰 플레이트에서, 50 μl의 Matrigel(BD Biosciences)을 첨가하고 37 ℃에서 30분 동안 고체화시켰다. 이어서, SVEC4-10 내피 세포(ATCC ® CRL-2181 TM (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)를 2x10 4 cells/100 ㎕의 밀도로 접종하고, 각각의 대식세포를 밀도 24 시간 후 CK40 배양 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 튜브의 형성을 포착하고 튜브 가지 수와 튜브 길이를 ImageJ 소프트웨어(NIH)로 분석 하였다.
실시예 1: Raw cell 대식세포(macrophage) 표현형 확인
본 발명자들은 Raw 264.7 대식세포로부터 M1 및 M2 대식세포의 분화 조건을 확립하였다. 일반적으로 M1 대식세포는 종양 공격성을 나타내어 항암 효과가 있는 것으로 알려졌고(M1 마커: iNOS), M2 대식세포는 암에 친화적인 종양 지지형 대식세포이며, TAM(tumor associated macrophage)이 대표적이다(M2 마커: CD206, Arginase).
Raw 264.7 대식세포주를 종양 공격형 세포인 M1 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 IFN-γ(40 ng/ml)을 48시간 동안 처리하였고 종양 지지형 세포인 M2 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 IL-4(20 ng/ml) 및 IL-13(20 ng/ml)을 48시간 동안 처리하였다.
그 결과, Raw 264.7 대식세포주로부터 M1 및 M2 대식세포로의 분화를 확인하였다(도 1).
실시예 2: Raw cell M1 엑소좀의 표현형 확인
본 발명자들은 Raw 264.7 대식세포주에서 분화한 M0, M1 및 M2 유래 엑소좀의 표현형을 관찰하였다.
구체적으로, Raw 264.7 대식세포주에 IFN-γ(40 ng/ml)을 48시간 동안 처리하여 M1 대식세포로 분화 또는 IL-4(20 ng/ml) 및 IL-13(20 ng/ml)을 48시간 동안 처리하여 M2 대식세포로 분화시킨 후 무혈청배지(serum-free media)에서 48시간 배양하여 엑소좀을 추출하였고 이에 대한 마커를 분석하였다. 먼저, 엑소좀을 포함하는 배양액에서 300 xg으로 10분, 2000 xg으로 10분 및 10,000 xg으로 30분간 순차적으로 원심분리를 하였고 상기 배양액을 0.22 μm 필터로 여과 후 70 Ti rotor(Beckman Instruments)를 이용하여 150,000 xg에서 3 시간 동안 초원심분리 (ultracentrifugation)를 수행하였다. 이후 수득한 M1 유래 엑소좀은 단백질 분해효소 억제제(Roche)를 포함하는 PBS에 재현탁하였고 BCA 단백질 분석키트(Bio-Rad)를 이용하여 상기 분리된 엑소좀의 단백질 농도를 측정하였다. 엑소좀 단백질 동량(20 μg)을 SDS-PAGE로 분석하였으며, 나이트로셀룰로스 막(membranes)으로 전사시켰다. 그 후, 블랏에 항-iNOS 항체(1:500, Abcam, ab15323), 항-CD206 항체(1:500, Santa Crus, sc-34577) 및 항-Arginase 항체(1:500, Santa Crus, sc-18355)를 첨가한 후 4℃의 조건으로 하룻밤 동안 방치하였고, 항-Alix 항체(1:500, Santa Crus, sc-99010)를 엑소좀 마커(exosome marker)로 사용하였다. 그 후 상기 막에 HRP-결합된 2차 항체(1:4000, Sigma-Aldrich)를 첨가하였고 화학발광(chemiluminescence)에 의해 시각화되었다. 또한, 엑소좀의 크기 분포는 Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Ltd., UK)이용한 동적 광산란 분석법(dynamic light scattering, DLS)을 통하여 분석하였고 엑소좀 크기는 장비에서 제공된 소프트웨어를 이용하여 25℃조건으로 173°의 고정된 각도에서 수 비율(z-average)을 통해 분석하였다.
그 결과, M2 마커인 CD206 및 arginase는 검출되지 않았으나 M1 마커인 iNOS가 검출되었다(도 2). DLS 측정 시, M1 및 M2 대식세포의 엑소좀은 약 70 - 80 nm 크기로 측정되었다(도 3).
실시예 3: 마우스 골수 유래 대식세포(macrophage) 표현형 확인
본 발명자들은 BMDM(골수 유래 대식세포)으로부터 M1 및 M2 대식세포의 분화 조건을 확립하였다. 일반적으로 M1 대식세포는 종양 공격성을 나타내어 항암 효과가 있는 것으로 알려졌고(M1 마커: iNOS), M2 대식세포는 암에 친화적인 종양 지지형 대식세포이며, TAM(tumor associated macrophage)이 대표적이다(M2 마커: CD206, Arginase).
마우스 골수 유래 대식세포주(BMDM)의 M1 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 IFN-γ(20 ng/ml)와 LPS(100 ng/ml)을 48시간 동안 처리하였고 M2 대식세포로의 분화를 유도하기 위해 IL-4(20 ng/ml)을 48시간 동안 처리하였다.
그 결과 BMDM(골수 유래 대식세포)으로부터 M1 및 M2 대식세포로의 분화를 확인하였다(도 2).
실시예 4: 마우스 골수 유래 대식세포 분화조건 확립 및 표현형 확인
본 발명자들은 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)의 분화 조건을 확립하기 위하여 도 4의 스케줄과 조건으로 M1 및 M2 대식세포로 분화시켰다. 상기 분화된 세포를 현미경으로 확인한 결과 M1 대식세포는 프라이드 에그(fried egg) 모양을 나타내었고 M2 대식세포는 프라이드 에그 형태 및 스핀들 형태 세포의 혼합군(mixed population)을 나타내었다(도 5). 또한, 상기 M1 및 M2 대식세포의 마커를 확인한 결과, 상처 치유(wound healing) 초기에 염증(inflammation)과 관련하여 세포외 기질(ECM)의 구축과 세포사멸 (apoptosis)에 관여하며 종양 공격성을 나타내어 항암 효과가 있다고 알려진 M1 대식세포의 마커는 iNOS로 나타났고, 세포외 기질(ECM)의 재건과 세포 증식(proliferation) 및 혈관생성(angiogenesis)에 관여하며, 암에 친화적인 종양 지지형 대식세포로 알려진 M2 대식세포의 마커는 CD206 및 Arginase로 나타났다(도 6).
실시예 5: 마우스 골수 유래 대식세포 유래 엑소좀의 표현형 및 특성확인
본 발명자들은 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)에서 분화한 M0, M1 및 M2 유래 엑소좀의 표현형을 관찰하였다.
구체적으로, 마우스 골수 유래 대식세포 (BMDM)에 IFN-γ(20 ng/ml) 및 LPS (100 ng/ml)를 48시간 동안 처리하여 M1 대식세포로 분화 또는 IL-4(20 ng/ml)을 48시간 동안 처리하여 M2 대식세포로 분화시킨 후 무혈청배지(serum-free media)에서 48시간 배양하여 엑소좀을 추출하였고 이에 대한 마커를 분석하였다. 먼저, 엑소좀을 포함하는 배양액에서 300 xg으로 10분, 2000 xg으로 10분 및 10,000 xg으로 30분간 순차적으로 원심분리를 하였고 상기 배양액을 0.22 μm 필터로 여과 후 70 Ti rotor(Beckman Instruments)를 이용하여 150,000 xg에서 3시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)를 수행하였다. 이후 수득한 M0, M1 및 M2 유래 엑소좀은 단백질 분해효소 억제제(Roche)를 포함하는 PBS에 재현탁하였고 BCA 단백질 분석키트(Bio-Rad)를 이용하여 상기 분리된 엑소좀의 단백질 농도를 측정하였다. 엑소좀 단백질 동량(20 μg)을 SDS-PAGE로 분석하였으며, 나이트로셀룰로스 막(membranes)으로 전사시켰다. 그 후, 블랏에 항-iNOS 항체(1:500, Abcam, ab15323), 항-CD206 항체(1:500, Santa Crus, sc-34577) 및 항-Arginase 항체(1:500, Santa Crus, sc-18355)를 첨가한 후 4℃의 조건으로 하룻밤 동안 방치하였고, 항-Alix 항체(1:500, Santa Crus, sc-99010)를 엑소좀 마커(exosome marker)로 사용하였다. 그 후 상기 막에 HRP-결합된 2차 항체(1:4000, Sigma-Aldrich)를 첨가하였고 화학발광(chemiluminescence)에 의해 시각화되었다. 상기 엑소좀의 형태는 먼저, 샘플을 탄소 필름(Electron microscopy science)이 구비된 구리격자(copper grids)에 위치하였고, 아세트산 우라닐 용액을 이용하여 음성으로 염색하였으며, 투과전자현미경(Tecnai)을 이용하여 분석하였다. 또한, 엑소좀의 크기 분포는 Zetasizer Nano ZS Malvern Instruments, Ltd., UK)이용한 동적 광산란 분석법(dynamic light scattering, DLS)을 통하여 분석하였고 엑소좀 크기는 장비에서 제공된 소프트웨어를 이용하여 25℃조건으로 173°의 고정된 각도에서 수 비율(z-average)을 통해 분석하였다.
그 결과, M1 및 M2 대식세포의 엑소좀에서 각각 M1 마커인 iNOS와 M2 마커인 arginase가 검출되었다(도 7). DLS 측정 시, M1 및 M2 대식세포의 엑소좀은 약 70 - 80 nm 크기의 구형으로 측정되었다(도 8 및 9).
실시예 6: 마우스 골수 유래 대식세포 유래 엑소좀의 사이토카인 분석
본 발명자들은 BMDM(골수 유래 대식세포)에서 분화시킨 M1 및 M2 대식세포로부터 엑소좀을 추출하였고 상기 엑소좀이 포함하고 있는 사이토카인(cytokine)을 분석하였다.
구체적으로 엑소좀이 포함하고 있는 사이토카인을 분석하기 위해, M1 및 M2 엑소좀 용해물(lysate) 30 ㎍을 사용하였으며, 사이토카인 어레이 키트(AAM-CYT-1)에서 제공된 실험방법을 활용하였다. 먼저, 여러 사이토카인에 대한 1차 항체가 결합되어 있는 막을 차단 완충액으로 상온에서 30분간 차단한 후, M1 및 M2 엑소좀 용해물 30 ㎍을 막에 처리하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 막에 바이오틴이 결합된 항체 칵테일을 처리하여 4℃에서 밤새 반응시킨 후, HRP-스트렙타비딘을 상온에서 2시간 반응시키고, 결과를 화학발광(Bio-Rad)에 의해 시각화하였다.
그 결과, 사이토카인 측정 결과, M1 엑소좀에서는 M1 대식세포가 T 세포를 충원(recruiting)할 때 관여하는 인자인 MIG과 RANTES의 발현이 M2 엑소좀에 비해 높은 것으로 나타났고(도 10), M2 엑소좀에서는 CXCL16, IL-2, IL-3β 등의 사이토카인의 발현이 M1 엑소좀과 비교하여 상대적으로 높게 나타났다(도 11).
실시예 7: M1 엑소좀을 이용한 M2 대식세포 리프로그래밍
본 발명자들은 M1 엑소좀(종양 공격형)을 M2 대식세포(종양 지지형)에 처리하여 M1으로의 리프로그래밍 여부를 분석하였다.
구체적으로, 무혈청배지에서 M1 엑소좀(40 ㎍)을 M2 대식세포에 처리 후 24, 48, 및 72시간 동안 배양하였다. 각 세포에서 용해 버퍼를 이용하여 세포 내 단백질을 추출하였으며, BCA 단백질 분석키트(Bio-Rad)를 이용하여 상기 추출된 세포의 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 동량(20 μg)을 SDS-PAGE로 분석하였으며, 나이트로셀룰로스 막(membranes)으로 전사시켰다. 그 후, 블랏에 항-iNOS 항체(1:500, Abcam, ab15323), 항-CD206 항체(1:500, Santa Crus, sc-34577) 및 항-Arginase 항체 1:500, Santa Crus, sc-18355)를 첨가한 후 4℃의 조건으로 하룻밤 동안 방치하였다. 그 후 상기 막에 HRP-결합된 2차 항체(1:4000, Sigma-Aldrich)를 첨가하였고, 이는 화학발광(chemiluminescence)에 의해 시각화되었다.
그 결과, M2 대식세포에 M1 엑소좀을 처리하면, 처리한 M1 엑소좀의 양이 증가함에 따라 M1 마커인 iNOS의 발현은 증가하고, M2 마커인 Arginase의 발현은 감소하는 것으로 나타났다(도 12). 또한, L929 세포 배양액으로 분화한 대식세포(M0) 및 M2 대식세포 미처리군에서는 M1 마커인 iNOS의 발현을 관찰하지 못했으나 L929 세포 배양액으로 분화한 대식세포 유래 M1 엑소좀을 24시간 동안 처리한 M2 대식세포 실험군의 iNOS 발현은 BMDM(M0) 실험군과 비교하여 급증한 것으로 나타났다(도 13). 뿐만 아니라, M-CSF로 분화한 대식세포에서 유래한 M2 대식세포 미처리군에서는 M1 마커인 iNOS의 발현을 관찰하지 못했으나 M-CSF로 분화한 대식세포에서 유래한 M1 엑소좀을 24시간 동안 처리한 M2 대식세포 실험군의 iNOS 발현은 급증한 것으로 나타났다(도 14).
구체적으로, 무혈청배지에서 M1 엑소좀(40 ㎍)을 M2 대식세포에 처리 후 24, 동안 배양하였다. 각 세포를 APC 항-mouse F4/80 항체(BioLegend, 123116), PE 항-mouse CD86 항체(BioLegend, 105008), FITC 항-mouse MHCⅡ 항체(BioLegend, 107605) 를 첨가한 후, 4℃에서 1시간 동안 염색하였고, 이는 Accuri TM C6 유세포 계측기로 분석하였다.
그 결과, M2 대식세포에 M1 엑소좀을 처리하면, M1 마커인 CD86, MHCⅡ의 발현이 M1 대식세포에서의 CD86, MHCⅡ의 발현량과 비슷한 수준으로 증가하는 것으로 나타났다(도 15).
실시예 8: 항 종양 효과
본 발명자들은 BMDM(골수 유래 대식세포)에서 분화시킨 M1 대식세포 유래 엑소좀을 종양에 처리하여 항-종양 효과를 관찰하였다.
구체적으로, 4T1 마우스 유방암 세포(1x10 6)를 면역 감응 BALB/c 마우스의 왼쪽 아래 유방에 이식한 후, 종양의 크기가 약 100 mm 3에 도달한 시점(Day 7)에서 3일 간격으로 M1 엑소좀(100 ㎍)을 종양 내로 5번 주입하였고 대조군으로 PBS를 주입한 후 종양 성장을 관찰하였다. 또한, 상기 마우스 모델의 종양을 Day 25 시점에서 적출한 후 종양 무게 측정 및 면역조직화학염색(IHC)을 수행하였다.
그 결과, 종양의 성장은 대조군과 비교하여 M1 엑소좀을 투여한 실험군에서 감소하는 것으로 나타났으나(도 16), 대조군과 실험군의 몸무게는 시간에 따라 유사한 것으로 나타났다(도 17). 또한 종양의 무게도 M1 엑소좀을 투여한 실험군의 종양의 무게가 대조군과 비교하여 감소한 것으로 나타났다(도 18 및 19). 아울러, 면역조직화학분석(immunohistochemical assay)을 수행한 결과, M1 엑소좀을 처리한 종양 조직에서 상대적으로 iNOS(M1 마커, 갈색)의 발현이 높은 것을 확인하였다(도 20).
실시예 9: M1 대식세포 흡수 조건 확인
본 발명자들은 흡수(uptake)되는 엑소좀의 양과 세포 리프로그래밍과의 상관관계를 확인하기 위해 M1 대식세포에 M2 엑소좀을 농도별로(10, 25, 50, 100 ㎍/ml) 1 및 4시간 동안 처리한 후 흡수조건을 확인하였다. 그 결과, 엑소좀의 농도 및 처리 시간의 증가에 따라 흡수도 증가하는 것을 확인하였다(도 21 및 22).
실시예 10: M1 대식세포 리프로그래밍
본 발명자들은 상처 치유를 촉진하는 M2 대식세포의 엑소좀을 M1 대식세포에 처리하여 M2로 리프로그래밍 여부를 분석하였다. 먼저, 무혈청 배지(serum free media)에서 M1 대식세포에 상기 분리한 M2 대식세포의 엑소좀(50 ㎍)을 24, 48, 72, 및 96 시간 동안 1회 처리 그룹 및 48시간에 1회 추가 처리한 그룹으로 분류하였고 그 후 마커의 발현을 관찰하였다.
그 결과, M1 대식세포에 M2 대식세포의 엑소좀을 처리하면 M2 마커인 Arginase가 약 72시간 정도 유지되고 48시간에 1회 추가 처리한 그룹(2회 처리, 6 lane)은 96시간에도 발현이 유지 되는 것을 확인하였다(도 23).
실시예 11: 상처 치유 효과
본 발명자들은 상처 치유(wound healing) 동물모델을 이용하여 M1 및 M2 대식세포 유래 엑소좀 처리에 따른 상처 치유 효과를 관찰하였다. 먼저 마우스 상처 치유 모델을 제조한 후에 M1 또는 M2 대식세포 유래 엑소좀(100 ㎍/100 ㎕)을 처리한 그룹, PBS를 처리한 대조군, 아무것도 처리하지 않은 무처리군으로 분류하였고 4일 간격(4~20 day)으로 상처의 사이즈를 측정하였다. 또한, 상기 상처 치유 모델의 상처가 완전하게 치유된 마우스의 피부조직을 적출하여 면역조직화학(IHC) 분석을 수행하였다.
그 결과, 대조군과 비교하여 M1 대식세포 유래 엑소좀을 처리한 그룹의 상처 봉합(closure) 정도는 느리게 진행되었으나 M2 대식세포 유래 엑소좀을 처리한 그룹은 상처가 빨리 치유되는 것을 확인하였다(도 24 및 25). 또한 면역조직화학(IHC) 분석 결과, M1 엑소좀을 처리한 그룹과 비교하여 M2 그룹에서 상피세포(epithelial cell, 보라색 점)가 많이 집중되어 있는 것을 관찰하였다(도 26). 따라서 M2 대식세포 유래 엑소좀은 우수한 상처 치유 효과가 있는 것을 확인하였다.
실시예 12: 섬유아세포 이동 촉진
상처 치유 특성에 대한 재프로그램 된 M2 대식세포의 영향을 조사하기 위해, 시험 관내 섬유아세포 상처 봉합 능을 상처를 가한 후 재 프로그래밍 된 M2 대식세포를 포함하는 M1, M2 대식 세포와 함께 배양하여 분석 하였다. M2 대식세포로 배양 한 군은 섬유아세포 만 배양 한 군에 비해 현저한 상처 봉합률을 보였고, 재 프로그램 된 M2 대식 세포 (RM2) 군도 M2 대식세포와 동일한 상처 폐쇄 율을 나타냈다(도 27 및 28). 재프로그램 된 M2 macrophages (RM2)에 의한 상처 치유와 matrix metalloproteinase-2(MMP2)와 같은 pro-protective factors의 발현을 상호 연관시키기 위해, MMP2의 발현 수준을 대식세포와 섬유아세포가 함께 배양 된 배지에서 측정 하였다. 상처 스크래치 분석 결과와 유사하게, MMP2의 발현은 M2 대식세포로 배양 된 군에서 가장 높았으며, 재 프로그래밍 된 M2 대식 세포로 배양 된 군은 유사한 발현 양을 나타냈다 (도 29).
실시예 13: 튜브 형성 효과
상처 치유에 매우 관여하는 혈관 신생에서의 대식세포의 역할을 연구하기 위해, Matrigel 매트릭스 상에 내피 세포와 대식세포를 함께 배양함으로써 in vitro 튜브 형성 검정을 수행했다. M2 대식 세포로 치료 한 군과 재프로그램 한 M2 대식세포로 치료 한 군에서 내피 세뇨관 형성이 현저히 증가한 것을 보여 주었다. 또한, M1 대식 세포 처리 군에서, 관 형성은 전혀 처리되지 않은 대조군보다는 감소하는 경향이 있었다 (도 30 및 31). 이들 대식세포의 혈관 신생 효과를 조사하기 위해 혈관 신생과 관련된 분비 된 성장 인자 인 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 발현 수준을 비교 하였다. 튜브 형성 결과와 유사하게, VEGF는 M2 대식 세포와 공 배양 된 군 및 재조합 된 M2 재조합 대식세포 군에서 증가하였고, M1 대식 세포로 처리 된 군에서 대조군보다 증가 하였다 (도 32).
결론적으로 본 발명의 엑소좀 기반의 면역세포 교차분화 유도방법은 엑소좀을 이용한 직접교차분화를 통한 세포 리프로그래밍 기술로 현재까지 보고된 바가 없는 면역반응을 획기적으로 조절·통제할 수 있는 신기술로 생체 내에서 세포를 전환시켜 치료에 적용하는 근본적인 치료방법이다. 따라서 암 치료 외에 다양한 난치성 및 면역성 질환에 신개념의 생체 내 세포치료 플랫폼 기술로 활용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 방법 및 조성물은 의약 특히 암치료나 창상 치료를 위한 의약의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (31)

  1. 분화가 완료된 제2면역세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
    시험관 내에서 상기 분리된 엑소좀을 상기 면역세포와 공통의 선조세포를 가지며 다른 유형으로 분화가 완료된 제1면역세포를 포함하는 세포집단에 처리하는 단계를 포함하는, 상기 제1면역세포의 상기 제2면역세포로의 교차분화 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1면역세포는 M1 대식세포, M2 대식세포 또는 수지상 세포(dendritic cell)인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제2면역세포는 M1 대식세포, M2 대식세포 또는 수지상 세포(dendritic cell)인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1면역세포는 M1 대식세포이고, 상기 제2면역세포는 M2 대식세포인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1면역세포는 M2 대식세포이고, 상기 제2면역세포는 M1 대식세포인, 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 M1 대식세포 또는 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포 또는 골수 유래 대식세포로부터 유래한 것인, 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 M1 대식세포 또는 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포 또는 골수 유래 대식세포로부터 유래한 것인, 방법.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 대식세포는 비극화 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것인, 방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 대식세포는 비극화 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 제1면역세포는 상기 제2면역세포의 투여를 필요로 하는 개체로부터 분리된 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀은 상기 제2면역세포의 세포 배양물로부터 분리되는, 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 제2면역세포는 M1 대식세포이고 상기 개체는 항암치료를 필요로 하는 개체인, 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 제2면역세포는 M2 대식세포이고 상기 개체는 상처 치료를 필요로 하는 개체인, 방법.
  14. 하기를 포함하는 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포의 수지상 세포로의 교차분화 방법:
    이미 분화가 완료된 수지상 세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
    시험관 내에서 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포를 포함하는 세포집단에 상기 분리된 엑소좀으로 처리하는 단계.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 수지상 세포가 골수 또는 단핵구로부터 유래된 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 수지상 세포가 수지상 세포-유사 세포주인 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 수지상 세포-유사 세포주는 DC2.4, JAWSII, Thp-1, HL-60, U937, KG-1 또는 MUTZ-3인 방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 M1 대식세포 및/또는 M2 대식세포는 수지상 세포의 투여를 필요로 하는 개체로부터 분리된 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 개체는 항암 치료를 필요로 하는 개체인, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 엑소좀은 수지상 세포의 배양물로부터 분리된 것인, 방법.
  21. 하기를 포함하는 개체에서 M1 대식세포-매개 면역반응을 증강시키는 방법:
    M1 대식세포 배양물로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
    치료적으로 유효한 양의 상기 분리된 엑소좀을 상기 개체에 투여하는 단계
    (여기서, 상기 엑소좀은 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 분화를 유도하고, 증가된 M1 대식세포의 기능에 의해 상기 개체에서 M1 대식세포-매개 면역반응이 향상됨).
  22. 제21항에 있어서,
    상기 개체는 항암 치료를 필요로 하는 개체인, 방법.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 M1 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래된 것인, 방법.
  24. 제21항에 있어서,
    상기 대식세포는 비분화 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것인, 방법.
  25. 제21항에 있어서,
    상기 엑소좀은 M1 대식세포의 배양물로부터 분리된 것 인, 방법.
  26. 하기를 포함하는 개체의 상처 치료 방법:
    분화가 완료된 M2 대식세포로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 및
    치료적으로 유효한 양의 상기 분리된 엑소좀을 상기 개체에게 투여하는 단계
    (여기서, 상기 엑소좀은 상기 개체에서 M1 대식세포의 M2 대식세포로의 분화를 유도하고, 증가된 M2 대식세포의 기능에 의해 상기 개체의 상처 치유가 향상됨).
  27. 제26항에 있어서, 상기 M2 대식세포는 단핵구 유래 대식세포(MDM) 또는 골수 유래 대식세포(BMDM)로부터 유래 된 것인, 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 대식세포는 비극화 또는 M0 대식세포주로부터 분화된 것인, 방법.
  29. 제26항에 있어서,
    상기 엑소좀은 M2 대식구 배양물로부터 분리되는, 방법.
  30. 유효성분으로 M1 대식세포로부터 분리된 엑소좀 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  31. 유효성분으로 M2 대식세포로부터 분리된 엑소좀 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물.
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