WO2019163900A1

WO2019163900A1 - Ｒｎａ修飾を利用した分析・診断法

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Publication number: WO2019163900A1
Application number: PCT/JP2019/006588
Authority: WO
Inventors: 秀始石井; 雅允今野; 森　正樹
Original assignee: Osaka University NUC
Current assignee: University of Osaka NUC
Priority date: 2018-02-22
Filing date: 2019-02-21
Publication date: 2019-08-29
Anticipated expiration: 2020-08-22
Also published as: CN112004942A; EP3763826A4; CN112004942B; US20230175066A1; JP7125782B2; JPWO2019163900A1; EP3763826A1

Abstract

本願は、生物学的状態または医学的状態を分析するための新たな方法を提供する。本発明は、ＲＮＡの修飾情報を、生物学的状態または医学的状態の分析に用いることができることを見出したことに基づき、生物学的状態または医学的状態を分析するための新たな方法を提供する。本発明は、疾患を含む種々の生物学的状態または医学的状態を分析することができ、早期のがん(例えば、膵臓がん、大腸がん、胃がんなど)など十分に予測することができる。

Description

ＲＮＡ修飾を利用した分析・診断法

　本発明は生物学的対象の特徴分析法および分類に関する。より特定すると、本発明はＲＮＡ上の修飾情報に基づく生物学的対象の分類および特徴分析手法に関する。

　リボ核酸（ＲＮＡ）は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と同様に生物が有する情報を担う分子である。ＤＮＡはメチル化などの修飾を受けてその機能が制御されることが知られているが、近年、ＲＮＡ上にも修飾が起こる例が報告されている。

　疾患を含む種々の生物学的状態を分析するために、ＤＮＡの変異、ｍＲＮＡ発現量、タンパク質発現量などの情報を生物学的状態と関連付けることが試みられているが、これらの情報を使用しても、早期のがんなど十分に予測することができない状態も多い。

Pagliarini　DJ,　Cell　Metab.　2016　Jul　12;24(1):13-4.　doi:　10.1016/j.cmet.2016.06.018.

　本発明は、ＲＮＡの修飾情報を、生物学的状態または医学的状態の分析に用いることができることを見出したことに基づき、生物学的状態または医学的状態を分析するための新たな方法を提供する。

　したがって、本発明は以下を提供する。

　（診断方法）
（項目Ａ１）　対象における少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報＜ＲＮＡ　ｍｏｄ＞を取得するステップと、該修飾情報に基づいて該対象の状態を分析するステップと
を含む、対象の状態を分析する方法。
（項目Ａ２）　前記ＲＮＡはマイクロＲＮＡを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３）　前記修飾はメチル化を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３－１）　前記修飾はヌクレオシド上のメチル化を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３－２）　前記修飾は核酸塩基上のメチル化を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４）　前記ＲＮＡ上の修飾はマイクロＲＮＡのメチル化を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４－１）　前記ＲＮＡ上の修飾情報はマイクロＲＮＡのヌクレオシド上のメチル化を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４－２）　前記ＲＮＡ上の修飾情報はマイクロＲＮＡの核酸塩基上のメチル化を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ５）　前記修飾がｍ^６Ａである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ６）　前記修飾情報が修飾位置情報を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ７）　前記修飾情報が修飾されたＲＮＡの量の情報を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（状態）
（項目Ａ８）　前記状態が、医学的状態または生物学的状態である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ９）　前記状態が、前記対象における微生物（例えば、腸内細菌、表皮細菌）の状態である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１０）　前記生物学的状態が、老化または細胞の分化状態である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１１）　前記医学的状態が、がん、炎症性腸疾患または腸管免疫を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１２）　前記がんが、膵臓がん（例えば、早期膵臓がん）、肝臓がん、胆嚢がん、胆道がん、胃がんおよび大腸がんのうちの少なくとも１つを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１３）　前記状態が、前記対象の薬剤または処置に対する応答性である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（薬剤、処置）
（項目Ａ１４）　前記処置が、放射線処置または手術である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１５）　前記処置が、重粒子線（例えば、Ｃａｒｂｏｎ／ＨＩＭＡＣ）またはＸ線による処置である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１６）　前記薬剤が、抗がん剤、分子標的薬、抗体医薬、生物製剤（例えば、核酸、タンパク質）、または抗生物質である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１７）　前記薬剤が、ロンサーフ（ＴＡＳ１０２）、ゲムシタビン、ＣＤＤＰ、５－ＦＵ、セツキシマブ、核酸医薬またはヒストン脱メチル化酵素阻害剤である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１８）　前記薬剤が抗がん剤であり、前記応答性が、前記対象が該抗がん剤に対する耐性を有するかどうかの応答性を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１９）　前記応答性に基づいて、前記対象を処置するための薬剤および／または前記対象に対する処置が示される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ２０）　複数の薬剤についての前記応答性に基づいて、該複数の薬剤の中から前記状態を処置するための薬剤が示される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ２１）　前記分析は、前記薬剤の投与または前記処置の前後の前記対象における前記修飾情報の比較に基づく、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（周辺情報）
（項目Ａ２２）　前記対象の年齢、性別、人種、家系情報、病歴、治療歴、喫煙状態、飲酒状態、職業情報、生活環境情報、疾患マーカー情報、核酸情報（前記対象における細菌の核酸情報を含む）、代謝物情報、タンパク質情報、腸内細菌情報、表皮細菌情報およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの情報にさらに基づいて、前記対象の前記状態を分析するステップを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ２３）　前記核酸情報が、ゲノム情報、エピゲノム情報、トランスクリプトームの発現量情報、ＲＩＰシークエンシング情報、マイクロＲＮＡの発現量情報およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ２４）　前記ＲＩＰシークエンシング情報が、薬剤耐性ポンプＰ－糖蛋白のＲＩＰシークエンシング情報を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ２５）　前記ＲＩＰシークエンシング情報が、前記対象の糞便のＲＩＰシークエンシング情報を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ２６）　前記ＲＩＰシークエンシング情報が、前記対象の糞便中の大腸菌のＲＩＰシークエンシング情報を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（修飾情報についての付加的情報）
（項目Ａ２７－１）　薬剤または処置に対する耐性株、または該耐性株と該耐性株が由来した細胞株との組み合わせにおける前記ＲＮＡ上の修飾情報にさらに基づいて、前記対象の前記状態を分析するステップを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ２７－２）　前記薬剤または処置が、ロンサーフ（ＴＡＳ１０２）、ゲムシタビン、ＣＤＤＰ、５－ＦＵ、セツキシマブ、核酸医薬、ヒストン脱メチル化酵素阻害剤、あるいは重粒子線（例えば、Ｃａｒｂｏｎ／ＨＩＭＡＣ）またはＸ線による処置を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ２８）　少なくとも２０００種類のＲＮＡ上の修飾情報を分析する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ２９）　複数の前記修飾情報に基づいて前記状態の確率を計算するステップを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３０）　前記修飾情報が、同じ配列を含むＲＮＡ上の複数の修飾情報を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３１）　ＲＮＡの構造情報にさらに基づいて、前記対象の前記状態を分析するステップを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３２－１）　メチル化酵素（例えば、Ｍｅｔｔｌ３、Ｍｅｔｔｌ１４、Ｗｔａｐ）、脱メチル化酵素（例えば、ＦＴＯ、ＡｌｋＢＨ５）およびメチル化認識酵素（例えば、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＴＨＤＦ３などのＹＴＨドメインを持つファミリー分子）のうちの少なくとも１つがノックダウンされた生物におけるＲＮＡの修飾情報にさらに基づいて、前記対象の前記状態を分析するステップを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３２－２）　メチル化酵素（例えば、Ｍｅｔｔｌ３、Ｍｅｔｔｌ１４、Ｗｔａｐ）、脱メチル化酵素（例えば、ＦＴＯ、ＡｌｋＢＨ５）およびメチル化認識酵素（例えば、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＴＨＤＦ３などのＹＴＨドメインを持つファミリー分子）のうちの少なくとも１つの認識モチーフ情報にさらに基づいて、前記対象の前記状態を分析するステップを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３３）　主成分解析を行うステップを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（試料）
（項目Ａ３４）＜市販キットで得られた試料の分析ビジネス＞
　送付された前記対象由来の試料から前記修飾情報を取得する、上記項目のいずれか一項のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３５）　前記試料が、凍結輸送される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３６）　オンサイトで前記対象から取得された試料をオンサイトで分析する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３７－１）　前記試料が、血液、生検試料（例えば、液体生検試料）、口腔粘膜、唾液、汗、涙、尿、糞便または皮膚表皮のうちの少なくとも１つを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３７－２）　前記ＲＮＡが、前記対象における微生物由来のＲＮＡを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（精製）
（項目Ａ３８）　精製手段によって前記ＲＮＡを精製するステップを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ３９）　修飾ＲＮＡを精製するステップを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４０）　前記精製手段が、前記ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的な核酸を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４１）　前記精製手段が、抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４２）　前記抗体が、前記修飾に特異的である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４３）　前記抗体が、前記ＲＮＡに特異的である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４４）　前記抗体が、修飾された前記ＲＮＡに特異的である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４５）　前記精製手段がプレートの所定の位置に配置されている、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４６）　前記プレートの所定の位置がモンテカルロ法によって決定されている、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（測定手段）
（項目Ａ４７）　ＰＣＲによって前記修飾情報を取得する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４８）　質量分析によって前記修飾情報を取得する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４９）　ＭＡＬＤＩ－ＭＳによって前記修飾情報を取得する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（測定の前処理）
（項目Ａ５０）　前記ＲＮＡをブロモアセトアルデヒドまたはクロロアセトアルデヒドで処理するステップを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ５１）　３-ヒドロキシピコリン酸を含む塗布剤を使用する、上記項目のいずれ
か一項に記載の方法。

（食品の検査方法）
（項目Ｂ１）　前記対象が食品である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ２）　前記食品が肉である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ３）　前記対象の状態が食品の品質である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ４）　前記食品の品質が、食品の産地、年齢、加工後経過時間、加工後変性、味質、活性酸素状態、脂肪酸状態または熟成度である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ５）　代謝物の情報にさらに基づいて、前記対象の前記状態を分析するステップを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。

（種の分類方法）
（項目Ｃ１）　前記状態が種の分類である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ２）　前記状態が微生物集団における少なくとも１種の微生物の種の分類である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ３）　前記状態が麹の種の分類である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。

（システム）
（項目Ｄ１）　ＲＮＡの修飾情報に基づいて、対象の状態を判定するためのシステムであって、
　ＲＮＡの修飾状態を測定する測定部と
　該測定の結果に基づいてＲＮＡ上の修飾状態を計算する計算部と、
　該修飾状態に基づいて該対象の状態を分析・判定する分析・判定部と
を含む、システム。
（項目Ｄ２）　前記測定部が、質量分析計である、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｄ３）　前記測定部が、ＭＡＬＤＩ－ＭＳである、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｄ４）項目Ａ２～Ａ１２のいずれか一項に記載の特徴を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。

（測定デバイス（プレート））
（項目Ｅ１）　ＲＮＡの修飾情報に基づいて対象の状態を判定するためのデバイスであって、
　該デバイスは、該対象由来の試料から精製した少なくとも１種類のＲＮＡを配置するための配置部を含み、
　該配置部は、検出器によって読み取られて該少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報を提供するように構成され、
　該修飾情報に基づいて、該対象の該状態が判定される、
デバイス。
（項目Ｅ２）　質量分析用である、上記項目のいずれか一項に記載のデバイス。
（項目Ｅ３）　ＭＡＬＤＩ－ＭＳ用である、上記項目のいずれか一項に記載のデバイス。

（濃縮用ビーズ）
（項目Ｆ１）　ＲＮＡの修飾情報に基づいて対象の状態を判定するためにＲＮＡを精製するための組成物であって、
　該組成物は、該対象における少なくとも１種類のＲＮＡを捕捉するための手段を含み、
　捕捉された該ＲＮＡは、検出器によって読み取られて該ＲＮＡ上の修飾情報を提供することを特徴とし、
　該修飾情報に基づいて、該対象の状態が判定される、
組成物。
（項目Ｆ２）　前記手段が前記ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的な核酸を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ｆ３）　前記手段が修飾されたＲＮＡを捕捉するための手段である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ｆ４）　前記手段が修飾されたＲＮＡに特異的な分子を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ｆ５）　前記手段が修飾された前記ＲＮＡに特異的な分子を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ｆ６）　前記分子が抗体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ｆ７）　前記手段が磁気を帯びた担体を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。

（キット）
（項目Ｈ１）　ＲＮＡの修飾情報に基づいて対象の状態を判定するためのキットであって、
　該キットは、上記項目のいずれか一項に記載の組成物および該対象から試料を取得するための機器のうち少なくとも１つと、該組成物および機器のうち少なくとも１つを使用するための説明書とを含む、キット。
（項目Ｈ２）　上記項目のいずれか一項に記載のデバイスをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載のキット。
（項目Ｈ３）　前記デバイスに配置されたＲＮＡ上に塗布するための塗布剤をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載のキット。
（項目Ｈ４）　前記塗布剤が、３-ヒドロキシピコリン酸を含む、上記項目のいずれか一項に記載のキット。
（項目Ｈ５）　前記試料の送付先が示されている、上記項目のいずれか一項に記載のキット。
（項目Ｈ６）　前記試料が、血液、液体生検試料などの生検試料、口腔粘膜、唾液、汗、涙、尿、糞便または皮膚表皮のうちの少なくとも１つを含む、上記項目のいずれか一項に記載のキット。

（プログラム）
（項目Ｉ１）　ＲＮＡの修飾情報に基づいて対象の状態を判定するためのプログラムであって、該プログラムは、該対象における少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報を、該ＲＮＡの参照修飾情報と比較するステップと、該比較するステップの出力結果に基づいて該対象の該状態を判定するステップと、を実行するように構成されている、プログラム。
（項目Ｉ２）　前記参照修飾情報が、前記対象とは異なる対象における前記ＲＮＡ上の修飾情報に基づいて構成されている、上記項目のいずれか一項に記載のプログラム。
（項目Ｉ３）　前記参照修飾情報が、前記修飾情報とは別の時点で取得された前記対象における前記ＲＮＡ上の修飾情報である、上記項目のいずれか一項に記載のプログラム。

（耐性株の利用方法）
（項目Ｊ１）　薬剤に対する耐性に関与するＲＮＡの修飾情報を決定するための方法であって、該方法は、該薬剤に対して耐性を有する細胞株由来の少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報を取得するステップ、を含み、該耐性を有する細胞株と、該耐性を有する細胞株が由来した細胞株との間の前記ＲＮＡ上の修飾情報を比較して、差が観察された場合に、該ＲＮＡ上の該修飾情報が該薬剤に対する耐性に関与すると決定される、方法。
（項目Ｊ２）　複数のＲＮＡ上の複数の修飾情報の差の組み合わせが前記薬剤に対する耐性に関与すると決定される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。

　本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。　

　本発明により、ＲＮＡの修飾情報に基づき、対象の状態（生物学的状態または医学的状態）を従来とは異なる方法で分析し、予測することができる。

合成マイクロＲＮＡ２００－ｃ－５ｐのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ測定の結果を示す図である。３’末端フラグメントおよび５’末端フラグメントの両方のシリーズが観察された。マイクロＲＮＡ－３６９－３ｐと相補的な配列を有する合成オリゴＤＮＡと、そのアンチセンスの合成ＤＮＡとのＤＮＡ２本鎖のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ測定の結果を示す図である。二本鎖の合成ｍｉＲ－３６９のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ測定の結果を示す図である。培養細胞のＲＮＡにおいてｍｉＲ－３６９に該当するプレカーサーを選択しＩＳＤによりフラグメント化したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ測定の結果を示す図である。メチル化されたｍｉＲ－２１－５ｐ（上）およびｌｅｔ－７ａ－５ｐ（下）を示すＭＳシグナルの強度を正常組織および腫瘍組織について示す図である。矢印の位置のｍ／ｚがメチル化ＲＮＡ由来のフラグメントのシグナルである。縦軸は質量分析計で測定されたシグナル強度を示す。メチル化されたｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ（上）およびｍｉＲ－２００ｃ－５ｐ（下）を示すＭＳシグナルの強度を正常組織および腫瘍組織について示す図である。矢印の位置のｍ／ｚがメチル化ＲＮＡ由来のフラグメントのシグナルである。縦軸は質量分析計で測定されたシグナル強度を示す。メチル化されたｍｉＲ－１７ｃ－５ｐを示すＭＳシグナルの強度を正常組織および腫瘍組織について示す図である。矢印の位置のｍ／ｚがメチル化ＲＮＡ由来のフラグメントのシグナルである。縦軸は質量分析計で測定されたシグナル強度を示す。ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－ｌｅｔ７ａ－５ｐおよびｍｉＲ－１７－５ｐについて、大腸の正常組織と腫瘍組織との間で対象の配列のＲＮＡ中のメチル化ＲＮＡの割合（％）（上）およびＲＮＡ発現量（下）を比較した図である。Ｎ．Ｓ．は有意差がなかったことを示す。メチル化されたｍｉＲ－２００ｃ－５ｐの存在を示すＭＳシグナルを示す図である。内部配列確認のためアンモニア処理を行っている。両矢印で示される幅が対応するヌクレオチドの質量差として検出されたことを示す。原発腫瘍切除後１から２年後までの間で転移が見つかったヒト大腸がん患者由来の原発腫瘍切除前のサンプル（Before）および転移が見つかった際に取得したサンプル（After）、ならびに炎症性腸疾患（ＩＢＤ）およびクローン病（Ｃｒｏｈｎ）患者由来血清のサンプルにおけるｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｌｅｔ７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐのメチル化率の比較を示す。縦軸は、質量分析によって測定した対象ｍｉＲＮＡのメチル化率を示す。成熟ｍｉＲＮＡにおけるメチル化塩基の検出の例を示す。（ｃ）膵臓がん患者由来組織から得られたｍｉＲ－１７およびｌｅｔ－７ａの質量スペクトルを示し、メチル化体および非メチル化体の両方のピークが検出されたことを示す。（ｄ）各ｍｉＲＮＡ中の修飾ヌクレオシドの位置を示す。膵臓がん患者の血清試料から濃縮したｌｅｔ－１７ａのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳによるメチル化解析。上段は、親イオンの分析結果を示し（ＭＳ分析）、メチル化体および非メチル化体の両方のピークが検出されたことを示す。下段は、フラグメントイオン（１２～１９の塩基）の分析結果を示し（ＭＳ／ＭＳ分析）、１９位のアデニンにメチル化が生じていることを示す。膵臓がん患者の血清試料から濃縮したｍｉＲ－１７のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳによるメチル化解析。上段は、親イオンの分析結果を示し（ＭＳ分析）、メチル化体および非メチル化体の両方のピークが検出されたことを示す。下段は、フラグメントイオン（１１～２０の塩基）の分析結果を示し（ＭＳ／ＭＳ分析）、１３位のアデニンにメチル化が生じていることを示す。膵臓がん患者の血清試料から濃縮したｍｉＲ－２１のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳによるメチル化解析。上段は、親イオンの分析結果を示し（ＭＳ分析）、メチル化体および非メチル化体の両方のピークが検出されたことを示す。下段は、フラグメントイオン（５～１１の塩基）の分析結果を示し（ＭＳ／ＭＳ分析）、９位のシトシンにメチル化が生じていることを示す。膵臓がん患者の血清試料から濃縮したｍｉＲ－２００ｃのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳによるメチル化解析。上段は、親イオンの分析結果を示し（ＭＳ分析）、メチル化体および非メチル化体の両方のピークが検出されたことを示す。下段は、フラグメントイオン（４～１０の塩基）の分析結果を示し（ＭＳ／ＭＳ分析）、９位のシトシンにメチル化が生じていることを示す。膵臓がん組織においてｍｉＲＮＡメチル化レベルが上昇することを示す。（ａ、ｂ）膵臓がん患者における正常組織（ｎ＝１２、左）および膵臓がん組織（ｎ＝１２、右）におけるｍｉＲ－１７（ａ）およびｌｅｔ－７ａ（ｂ）のメチル化レベルの比較を示す。＊Ｐ＜０．０１（ｔ検定）。（ｃ、ｄ）健康な対照（ｎ＝５、左）および膵臓がん患者（ｎ＝５、右）から取得した血清中のｍｉＲ－１７（ｃ）およびｌｅｔ－７ａ（ｄ）のメチル化レベルの比較を示す。健康な対照の血清は、内視鏡検査、ＣＴ、およびいくつかの腫瘍マーカーの検出によってがんを有しないと確認した肝移植ドナーから得た。＊Ｐ＜０．０１（ｔ検定）。（ｅ、ｆ）膵臓がん患者の手術前（ｎ＝２１、左）および手術後（ｎ＝２１、右）の血清中のｍｉＲ－１７（ｅ）およびｌｅｔ－７ａ（ｆ）のメチル化レベルの比較を示す。健康な対照の血清は、内視鏡検査、ＣＴ、およびいくつかの腫瘍マーカーの検出によってがんを有しないと確認した肝臓移植ドナーから得た。＊Ｐ＜０．０１（ｔ検定）。左からｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１７、ｌｅｔ－１７ａおよびｍｉＲ－２００ｃについて、膵臓がん患者の手術前および手術後の血清中のｍｉＲＮＡのメチル化レベルの比較を示す。同じ患者を手術前後で対応付けている。ｍｉＲ－２００ｃ－３ｐおよびｍｉＲ－ｌｅｔ７ａ－５ｐについて、胃における正常組織と腫瘍組織との間で対象の配列のＲＮＡ中のメチル化ＲＮＡの割合（％）を比較した図である。結腸直腸がん患者における結腸直腸がん組織（塗りつぶしのバー）および正常組織（網掛けのバー）における各ｍｉＲＮＡの特定の位置のメチル化率を示す。グラフ下部の数字は患者番号を示し、患者１～６はステージＩの結腸直腸がん患者であり、患者７～１２はステージＩＶの結腸直腸がん患者である。＊Ｐ＜０．０５（ｔ検定）。５－ＦＵ耐性株およびＦＴＤ耐性株ならびにその元となった親株のＲＩＰシークエンシング情報およびＲＮＡ発現情報に基づいて２次元の主成分分析を行った結果を示す。 The　Cancer　Genome　Atlas(TCGA)から取得した膵臓腺癌（ＰＡＡＤ、ｎ＝４）患者における正常組織（Ｎ）および腫瘍組織（Ｔ）における各ｍｉＲＮＡの発現量を示す図である。縦軸は、シークエンスデータにおける全リード中の対象のｍｉＲＮＡのカウントの割合（カウント／１００万リード）を示す。 The　Cancer　Genome　Atlas(TCGA)から取得した直腸腺癌（ＲＥＡＤ、ｎ＝３）患者における正常組織（Ｎ）および腫瘍組織（Ｔ）における各ｍｉＲＮＡの発現量を示す図である。縦軸は、シークエンスデータにおける全リード中の対象のｍｉＲＮＡのカウントの割合（カウント／１００万リード）を示す。 The　Cancer　Genome　Atlas(TCGA)から取得した胆管癌（ＣＨＯＬ、ｎ＝９）患者における正常組織（Ｎ）および腫瘍組織（Ｔ）における各ｍｉＲＮＡの発現量を示す図である。縦軸は、シークエンスデータにおける全リード中の対象のｍｉＲＮＡのカウントの割合（カウント／１００万リード）を示す。 The　Cancer　Genome　Atlas(TCGA)から取得した結腸腺癌（ＣＯＡＤ、ｎ＝８）患者における正常組織（Ｎ）および腫瘍組織（Ｔ）における各ｍｉＲＮＡの発現量を示す図である。縦軸は、シークエンスデータにおける全リード中の対象のｍｉＲＮＡのカウントの割合（カウント／１００万リード）を示す。分子ダイナミクス分析によるＡＧＯ２タンパク質へのｍｉＲ－２００ｃの結合予測。（ａ）エネルギー最小化によって推定した場合の、非メチル化ｍｉＲ－２００ｃ（オレンジ）およびメチル化ｍｉＲ－２００ｃ（青）それぞれの複合体の安定立体配座の重ね合わせを示す。最初の６つの塩基はほとんど重なった。他方、メチル化部位の周辺では結合相互作用の変化が見出された。（ｂ）メチル基とＡＧＯ２タンパク質との間のファンデルワールス相互作用が増強されたためにメチル基の周囲の空間が減少することを示す。（ｃ）メチル基の存在により配向が変化することを示す。（ｄ）非メチル化ｍｉＲ－２００ｃの複合体では、メチル化ｍｉＲ－２００ｃの複合体よりも自由空間が大きいことを示す。分子ダイナミクス分析によるＡＧＯ２タンパク質へのｌｅｔ－７ａの結合予測。（ａ）エネルギー最小化によって推定した場合の、非メチル化ｌｅｔ－７ａ（オレンジ）およびメチル化ｌｅｔ－７ａ（青）それぞれの複合体の安定立体配座の重ね合わせを示す。骨格の配置は類似していたが、各塩基の配向は非メチル化ｌｅｔ－７ａとメチル化ｌｅｔ－７ａとの間で大きく異なる。ｌｅｔ－７ａのアデニンメチル化は、複合体全体の構造変化（ｂ）、およびＲＮＡ認識部位の空間の大きさの変化（ｃ、ｄ）をもたらす。分子ダイナミクス分析によるＡＧＯ２タンパク質へのｍｉＲ－１７の結合予測。（ａ）エネルギー最小化によって推定した場合の、非メチル化ｍｉＲ－１７（オレンジ）およびメチル化ｍｉＲ－１７（青）それぞれの複合体の安定立体配座の重ね合わせを示す。骨格および塩基側鎖の配向は、非メチル化ｍｉＲ－１７とメチル化ｍｉＲ－１７との間で有意に異なる。ｍｉＲ－１７のアデニンメチル化は、複合体全体の構造変化（ｂ）、およびＲＮＡ認識部位の空間の大きさの変化（ｃ、ｄ）をもたらす。非修飾ｍｉＲ－２００ｃ（青）、ｍ５Ｃ修飾ｍｉＲ－２００ｃ（赤）、およびｍ６Ａ修飾ｍｉＲ－２００ｃ（緑）による遺伝子抑制効果を遺伝子濃縮分析によって決定した結果を示す。非修飾ｍｉＲ－２００ｃおよびｍ５Ｃ修飾ｍｉＲ－２００ｃは強力な遺伝子抑制効果を示した（それぞれ、Ｐ＜０．００５およびＰ＜０．００１；ｔ検定）が、ｍ６Ａ修飾ｍｉＲ－２００ｃの遺伝子発現抑制効果は弱かった。非修飾ｌｅｔ－７（水色）およびｍ６Ａ修飾ｌｅｔ－７（赤）による遺伝子抑制効果を遺伝子濃縮分析によって決定した結果を示す。非修飾ｌｅｔ－７ａは標的遺伝子発現を抑制した（Ｐ＝０．０５、ｔ検定）が、メチル化ｌｅｔ－７ａは抑制しなかった（Ｐ＝０．０７、ｔ検定）。膵臓のＰ５３とＲＢが不活性化したＥＬ１－ＳＶ４０マウス（上の折れ線）と、このマウスおよびＭｅｔｔｌ３遺伝子の過剰発現マウスから作製したダブルトランスジェニックマウス（下の折れ線）との間で生存率を比較した図である。縦軸に生存率を示し、横軸に週齢を示す。膵臓のＰ５３とＲＢが不活性化したＥＬ１－ＳＶ４０マウス（左）と、このマウスおよびＭｅｔｔｌ３遺伝子の過剰発現マウスから作製したダブルトランスジェニックマウス（右）との間で２０週齢時点で摘出した腫瘍を比較した図である。縦軸に生存率を示し、横軸に週齢を示す。上段は腫瘍の写真であり、下段は組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色である。磁気ビーズを使用した目的のＲＮＡを精製する方法の概略図である。エキソソーム濃縮を行うＲＮＡ精製法の概略図である。システムの構成の概略図である。

　以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。

　（定義等）
　本明細書において、「リボ核酸（ＲＮＡ）」少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β－Ｄ－リボ－フラノース部分の２’位においてヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。ＲＮＡには、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡが含まれる。

　本明細書において、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、ＤＮＡ鋳型を使用することによって作製され、ペプチドまたはポリペプチドをコードしている転写物に関連するＲＮＡを指す。典型的には、ｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、および３’－ＵＴＲを含む。ｍＲＮＡの具体的な情報（配列など）は、例えば、ＮＣＢＩ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照することで利用可能である。例えば、ヒトにおけ
る成熟マイクロＲＮＡは以下の表のものが挙げられる。

　本明細書において、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」とは、ゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て最終的に２０から２５塩基長の微小ＲＮＡとなる機能性核酸を指す。ｍｉＲＮＡの具体的な情報（配列など）は、例えば、ｍｉｒｂａｓｅ（http://mirbase.org）を参照することで利用可能である。例えば、ヒトにおける成熟マイクロＲＮＡは以下の表のものが挙げられる。

　本明細書において、「ロングノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）」とは、タンパク質へ翻訳されずに機能する２００ｎｔ以上のＲＮＡを指す。ｌｎｃＲＮＡの具体的な情報（配列など）は、例えば、ＲＮＡｃｅｎｔｒａｌ（http://rnacentral.org/）を参照することで利用可能である。例えば、ヒトにおける成熟マイクロＲＮＡは以下の表のものが挙げられる。

　本明細書において、「リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）」とは、リボソームを構成するＲＮＡを指す。ｒＲＮＡの具体的な情報（配列など）は、例えば、ＮＣＢＩ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照することで利用可能である。例えば、ヒトにおける成熟マイクロＲＮＡは以下の表のものが挙げられる。

　本明細書において、「トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）」とは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によりアミノアシル化されることが公知であるｔＲＮＡを指す。ｔＲＮＡの具体的な情報（配列など）は、例えば、ＮＣＢＩ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照することで利用可能である。例えば、ヒトにおける成熟マイクロＲＮＡは以下の表のものが挙げられる。

　本明細書において、核酸の文脈において使用される「修飾」とは、核酸の構成単位またはその末端の一部または全部が他の原子団と置換されること、または官能基が付加されている状態を指す。ＲＮＡの修飾の集合は「ＲＮＡ　Ｍｏｄｏｍｉｃｓ」「ＲＮＡ　Ｍｏｄ」などとよぶことがあり、これらは、ＲＮＡがトランスクリプトであることから、エピトランスクリプトームと呼ばれることもあり、本明細書では同義で使用される。

　ＲＮＡの修飾として以下の表に示されるものが挙げられるがこれらに限定されず、修飾に該当するものであれば、任意物を利用することができることが理解される。

　これらの修飾は、例えば、質量分析、特異的化学反応、標準合成品との比較（例えば、ＬＣによる保持時間の比較）などの当該分野で公知の任意の方法によって、必要に応じてそれまでに蓄積された情報を利用して、区別することができる。

　本明細書において、核酸の文脈において使用される「メチル化」とは、任意の種類のヌクレオチドの任意の位置のメチル化を指すが、代表的には、アデニンのメチル化（例えば、６位；ｍ６Ａ、１位；ｍ１Ａ）、シトシンのメチル化（例えば、５位；ｍ５Ｃ、３位；ｍ３Ｃ）である。検出された修飾部位は、当該分野で公知の手法を用いて特定することができる。例えばｍ１Ａとｍ６Ａ、ｍ３Ｃとｍ５Ｃについては、それぞれ化学修飾により確定は可能である。例えば、スタンダードとなる合成ＲＮＡを利用して、化学修飾及びＭＡＬＤＩでの測定による挙動が正しいのかを確定することができる。

　この他、例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡなどにて見いだされているＲＮＡ修飾のうち相当程度の種類は質量数の差異として識別することができる。例えば、化学修飾により質量数の差異を作り出して、理論的には識別することができる。ただし、質量数が同じものについては、当該分野で公知の他の手法を用いて識別することができる。

　本明細書において、「測定」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、ある対象について、量がどれほどか測って求めることをいう。本明細書において「検出」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、物質や成分等を検査して見つけだすことをいい、「同定」とは、ある対象について、そのものにかかわる既存の分類のなかからそれの帰属先をさがす行為をいい、化学分野において使用される場合、対象となる物質の化学物質としての同一性を決定する（例えば、化学構造を決定する）ことをいい、「定量」とは、対象となる物質の存在する量を決定することをいう。

　本明細書で使用されるとき、試料中の分析物の「量」は、一般には、試料の体積中で検出し得る分析物の質量を反映する絶対値を指す。しかし、量は、別の分析物量と比較した相対量も企図する。例えば、試料中の分析物の量は、試料中に通常存在する分析物の対照レベルまたは正常レベルより大きい量であってもよい。

　用語「約」は、イオンの質量の測定を含まない定量的測定に関連して本明細書で使用されるとき、示された値プラスまたはマイナス１０％を指す。なお、「約」と明示的に示されない場合でも「約」があると同義で解釈されうる。質量分析機器は、所与の分析物の質量の決定においてわずかに異なり得る。イオンの質量またはイオンの質量／電荷比との関連において用語「約」は、＋／－０．５原子質量単位を指す。

　本明細書において「対象」とは、本発明の分析、診断または検出等の対象となる対象（例えば、食品、微生物、ヒト等の生物または生物から取り出した細胞、血液、血清等）をいう。

　本明細書において使用され得る「器官」とは「臓器」とも称し、生物のうち、動物や植物などの多細胞生物の体を構成する単位で、形態的に周囲と区別され、それ全体としてひとまとまりの機能を担うもののことをいう。例えば、代表的には、肝臓、脾臓およびリンパ節が挙げられ、このほか、腎臓、肺、副腎、すい臓、心臓等の他の臓器などを挙げることができるがそれらに限定されない。

　本明細書において「バイオマーカー」は、ある対象の状態または作用の評価の指標となるものである。本明細書において特に断らない限り、「バイオマーカー」は「マーカー」と称することがある。

　本発明の検出剤または検出手段は、検出可能とする部分（例えば、抗体等）に他の物質（例えば、標識等）を結合させた複合体または複合分子であってもよい。本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、基材、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。２以上の部分がポリペプチドの場合は、キメラポリペプチドとも称しうる。従って、本明細書において「複合体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子を含む。

　本明細書においてポリヌクレオチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、マーカー検出剤への結合または相互作用を含む、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得るが、本発明では、ＰＣＲ産物の量をもって測定することができる。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、免疫沈降法（ＩＰ）、免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子分析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat　Genet．2002　Dec；32　Suppl：526-32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄシステム、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム分析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。

　本明細書において「手段」とは、ある目的（例えば、検出、診断、治療）を達成する任意の道具となり得るものをいい、特に、本明細書では、「選択的に認識（検出）する手段」とは、ある対象を他のものとは異なって認識（検出）することができる手段をいう。

　本明細書において「（核酸）プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。本明細書においてプライマーはマーカー検出手段として使用され得る。

　通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とするポリヌクレオチド（例えば、マイクロＲＮＡ）の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、LASERGENE，PrimerSelect，DNAStar）を用いて行ってもよい。

　本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチド、特異的抗体またはそのフラグメントなどが挙げられるがそれに限定されない。本明細書においてプローブは、マーカー検出手段としてもちいられる。

　本明細書において「質量分析」または「ＭＳ」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、化合物をその質量により同定するための分析手法を指し、原子、分子、クラスター等の粒子を何らかの方法で気体状のイオンとし（イオン化）、真空中で運動させ電磁気力等を用いて、あるいは飛行時間差等によりそれらイオンを質量電荷比に応じて分離・検出する技術をいう。ＭＳは、イオンをこの質量対電荷比、すなわち「ｍ／ｚ」に基づきフィルタし、検出し、および測定する方法を指す。近年の検出感度や質量分解能の飛躍的な向上に伴い、益々その応用範囲が広がり、多くの分野で活用されている。代表的には、Clark　J　et　al.，　Nat　Methods.　2011　March　;　8(3):　267-272.doi:10.1038/nmeth.1564.に例示される方法を用いることができる。ＭＳ技術は、一般には、（１）化合物をイオン化して荷電化合物を形成するステップ：および（２）荷電化合物の分子量を検出し、質量対電荷比を計算するステップを含む。化合物は、適切な手段によりイオン化および検出し得る。「質量分析計」は、一般には、イオン化装置、質量分析器およびイオン検出器を含む。一般に、目的とする１つまたは複数の分子がイオン化され、イオンはこの後、質量分析機器に導入され、ここでイオンは、磁場および電場の組み合わせのために、質量（「ｍ」）および電荷（「ｚ」）に依存する空間中の経路を辿る。質量分析計についての総説は、例えば、Jurgen　H、「マススペクトロメトリー」、丸善出版（２０１４）を参照のこと。質量分析計には、例えば、磁場型、電場型、四重極型、飛行時間型等が挙げられる。定量におけるイオンの検出は、目的とするイオンのみを選択的に検出する、選択イオンモニタリングや、１つ目の質量分析部で精製したイオン種のうち１つを前駆イオンとして選択し、２つ目の質量分析部で、その前駆イオンの開裂によって生じるプロダクトイオンを検出する、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）等が挙げられる。ＳＲＭでは、選択性が増し、ノイズが減ることによってシグナル／ノイズ比が向上する。

　本明細書で使用されるとき、用語「分解能」または「分解能（ＦＷＨＭ）」（「ｍ／Δｍ50%」としても当技術分野で公知の）は、最大高さの５０％での質量ピークの幅（全幅半値、「ＦＷＨＭ」）で除した観察された質量対電荷比を指す。分解能が高くなるほど、定性性および定量性が良くなり得る。

　本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、安定同位体標識法、蛍光法、ビオチン法、ラマン散乱を利用した光学手法、化学発光法等を挙げることができる。本発明のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。本発明のマーカーまたはそれを捕捉する因子または手段を複数、ラマン散乱を利用した光学手法によって標識する場合には、ラマン散乱が互いに異なる物質によって標識を行う。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。

　本明細書において「診断」とは、被験体における状態（例えば、疾患、障害）などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。本発明の技術は、このような診断技術に応用可能である。

　本明細書において「治療」とは、ある状態（例えば、疾患または障害）について、そのような状態になった場合に、そのような状態の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の状態、もしくは状態に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。事前に診断を行って適切な治療を行うことは「コンパニオン治療」といい、そのための診断薬を「コンパニオン診断薬」ということがある。本発明の技術を用いてＲＮＡの修飾を特定できると、特定の状態と関連づけられ得ることから、このようなコンパニオン治療またはコンパニオン診断において有用であり得る。

　本明細書において「予後」という用語は、がん等の疾患または障害などに起因する死亡または進行が起こる可能性を予測することを意味する。予後因子とは疾患または障害の自然経過に関する変数のことであり、これらは、いったん疾患または障害を発症した患者の再発率等に影響を及ぼす。予後の悪化に関連した臨床的指標には、例えば、本発明で使用される任意の細胞指標が含まれる。予後因子は、しばしば、患者を異なった病態をもつサブグループに分類するために用いられる。本発明の技術を用いてＲＮＡの修飾を特定できると、特定の疾患状態と関連づけられ得ることから予後因子を提供する技術として有用であり得る。

　本明細書において「検出機器（機）（器）」とは、広義には、目的の対象を検出または検査することができるあらゆる機器をいう。本明細書において「診断薬」とは、広義には、目的の状態（例えば、がん、種分類、老化など）を診断できるあらゆる薬剤をいう。

　本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、試薬、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、試薬、標識などをどのように使用するか、あるいは、どのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、検査薬、診断薬、治療薬、試薬、標識等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。検査機器、診断機器等を組み合わせる場合は、「キット」は「システム」として提供され得る。

　本明細書において「指示書」は、医師または他の使用者に対して本発明を使用する方法の説明を記載したものである。この指示書は、本発明の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、経口、食道への投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（FDA）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（package　insert）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。

　本明細書において「プログラム」は、当該分野で使用される通常の意味で用いられ、コンピュータが行うべき処理を順序立てて記述したものであり、法律上「物」として扱われるものである。すべてのコンピュータはプログラムに従って動作している。現代のコンピュータではプログラムはデータとして表現され、記録媒体または記憶装置に格納される。

　本明細書において「記録媒体」は、本発明を実行させるプログラムを格納した記録媒体であり、記録媒体は、プログラムを記録できる限り、どのようなものであってもよい。例えば、内部に格納され得るＲＯＭやＨＤＤ、磁気ディスク、ＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリなどの外部記憶装置でありうるがこれらに限定されない。

　本明細書において「システム」とは、本発明の方法またはプログラムを実行する構成をいい、本来的には、目的を遂行するための体系や組織を意味し、複数の要素が体系的に構成され、相互に影響するものであり、コンピュータの分野では、ハードウェア、ソフトウェア、OS、ネットワークなどの、全体の構成をいう。

　（本発明の方法の概略）
　（ＲＮＡ修飾）
　本発明は、ＲＮＡ上の修飾情報に基づいて対象の状態を分析する方法を提供する。ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）上の修飾（例えば、メチル化）情報が種々の対象（ヒトなどの哺乳動物、大腸菌などの微生物）の状態（例えば、疾患および薬剤耐性などの後天的な状態）に密接に関連しており、ＲＮＡ上、特にマイクロＲＮＡ上の修飾情報を分析することで対象の状態を高精度に分析可能であることは驚くべきことであった。特に、早期膵臓がんなどの診断が困難な状態を区別可能であったことは、本発明が医療および産業上非常に有意義であることを示す。一つの実施形態では、修飾情報は、マイクロＲＮＡ上の修飾情報を含む。一つの実施形態では、修飾情報は、メチル化情報を含む。一つの実施形態では、修飾情報は、マイクロＲＮＡ上のメチル化情報を含む。

　（直接連結ビーズ濃縮分析）
　一つの局面では、本発明は、質量分析計を使用してＲＮＡ上の修飾を分析する方法を提供し、この方法は、
（Ａ）目的のＲＮＡと相補的な核酸が共有結合により連結されたビーズを使用して目的のＲＮＡを精製するステップと、
（Ｂ）精製したＲＮＡをＭＡＬＤＩによってイオン化して質量分析計で測定するステップと、を含む。
　捕捉核酸とビーズとを直接結合させることで、捕捉核酸とビーズとがビオチン－ストレプトアビジン結合で間接的に結合されている場合と比較して、より過酷な条件で洗浄を行うことができることにより、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ測定の強度が大きく向上することを見出した。

　この手法では、従来では想定されていなかったRNAを対象にしたことが有利である点であり、従来内部配列や修飾塩基の位置を確認することができなかったが、本発明では、in　source　decayの設定を最適化することにより、改善することができた。アンモニアを用いたアルカリ加水分解を併用することで、内部配列及び、修飾塩基の位置が観察出来るようになったことも本発明における特徴であるといえる。また、新しい、「開始材料（ホモジネートや細胞ライセート、血清など）に変性剤を加え、直接ハイブリダイゼーションを行って特定配列のmiRNAを精製する」プロトコルでは、捕捉核酸とビーズとを直接結合させる技術と、J.Engbergらの方法（J.Engbergら、Eur.J.Biochem,41,321-328(1974)）を組み合わせることで効率を高めることができたことも一つの実施形態では重要な側面であるといえる。

　（エキソソーム濃縮分析）
　一つの局面では、本発明は、質量分析計を使用してＲＮＡ上の修飾を分析する方法を提供し、この方法は、
（Ａ－１）細胞分画法によってエキソソームを精製するステップと、
（Ａ－２）抗ＣＤ６３抗体を使用してエキソソームを精製するステップと、
（Ｂ）目的のＲＮＡと相補的な核酸を使用して目的のＲＮＡを精製するステップと、
（Ｃ）精製したＲＮＡをイオン化法（例えば、ＭＡＬＤＩ）によってイオン化して質量分析計で測定するステップと、を含む。

　相補的な核酸で目的の核酸を精製する場合、エキソソームを精製する工程を事前に行うことにより、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）測定の強度が大きく向上することを見出した。

　この発明は、理論に束縛されることを望まないが、ステップ（Ａ）とステップ（Ｂ）とを、または、ステップ（Ａ）とステップ（Ｃ）とを組み合わせることで精製が改善され、あるいは質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）測定の強度が大きく向上することが見いだされた。また、（Ａ－１）および（Ａ－２）を両方行ったときにＭＡＬＤＩ－ＭＳシグナルの強度が約２．５倍になった効果になっており、これは、従来予測できなかった効果であるといえる。

　本発明の方法を実施するための具体的手順を以下で説明する。
　（試料）
　本発明の方法は、ＲＮＡを含む任意の試料を使用して実施することができるが、臨床的に入手しやすいものが好ましい。一つの実施形態では、試料は、対象に由来し、ここで、対象としては、哺乳動物（例えば、ヒト、チンパンジー、サル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウマ、ブタ、ネコなど）、微生物（例えば、病原菌、発酵に使用する微生物、大腸菌などの細菌、寄生虫、真菌、ウイルスなど）、食用生物（鳥類、魚類、爬虫類、菌類、植物など）、鑑賞・愛玩生物、環境指標生物、が挙げられるがこれらに限定されない。一つの実施形態では、試料は、特定の状態であるか、または特定の状態である可能性のある対象に由来する。一つの実施形態では、特定の状態として、疾患、年齢、性別、人種、家系、病歴、治療歴、喫煙状態、飲酒状態、職業、生活環境情報などが挙げられるがこれらに限定されない。一つの実施形態では、試料は、対象から得られた器官、組織、細胞（例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）など）、血液（例えば、血漿、血清など）、粘膜表皮（例えば、口腔、鼻腔、耳腔、膣などにおけるもの）、皮膚表皮、生体分泌液（例えば、唾液、鼻水、汗、涙、尿、胆汁など）、糞便、表皮上微生物またはその部分である。一つの実施形態では、試料は、培養細胞（例えば、対象から得られた細胞に基づくオルガノイド、特定の細胞株など）である。一つの実施形態では、試料は、食品またはその部分、あるいは、食品上微生物である。

　（ＲＮＡ精製方法）
　一つの実施形態では、ＲＮＡ修飾を分析するために事前にＲＮＡを精製してもよいし、精製しなくてもよい。本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、遺伝子マーカー等のＲＮＡまたはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質は、好ましくは「精製された」物質である。本明細書において「単離」されたとは、天然に存在する状態で付随する任意のものを少なくとも１つ除去したものをいい、例えば、全ＲＮＡ配列から特定のマイクロＲＮＡ配列を取り出した場合も単離といいうる。従って、本明細書において使用されるＲＮＡは、単離されたものでありうる。一つの実施形態では、全ての種類のＲＮＡを区別することなく他の成分から精製してもよい。一つの実施形態では、ポリＡを使用してＲＮＡを他の成分から精製してもよい。一つの実施形態では、全てのマイクロＲＮＡを他の成分から精製してもよい。一つの実施形態では、目的の配列（単一の種類または複数の種類）を有するＲＮＡを他の成分から精製してもよい。一つの実施形態では、複数種類の目的の配列を有するＲＮＡを配列毎に別々に精製してもよい。一つの実施形態では、修飾（単一の種類または複数の種類）を有するＲＮＡを他の成分から精製してもよい。一つの実施形態では、メチル化修飾を有するＲＮＡを他の成分から精製してもよい。一つの実施形態では、目的の配列（単一の種類または複数の種類）を有し、かつ修飾（単一の種類または複数の種類）を有するＲＮＡを他の成分から精製してもよい。

　一つの実施形態では、目的のＲＮＡは配列番号１～５：
CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG（配列番号１）
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA（配列番号２）
CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG（配列番号３）
UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA（配列番号４）
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU（配列番号５）
からなる群から選択される配列の少なくとも一部を含む。

　ＲＮＡの精製には任意の公知の手法を用いることができる。一つの実施形態では、ＲＮＡ特異的な分子を使用して全ＲＮＡを精製してもよい。一つの実施形態では、ＤＮＡ分解酵素を作用させた後に、核酸分子を精製することで目的のＲＮＡを精製してもよい。複数種類のＲＮＡは、別々に精製してもよいし、並行して精製してもよいし、混合状態で精製してもよい。一つの実施形態では、１、２、３、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００または３０００種類のＲＮＡを並行して精製してもよい（例えば、担体に結合した配列特異的なＲＮＡ捕捉分子を使用して）。一つの実施形態では、目的の配列と少なくとも部分的に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）を使用して、目的の配列を有するＲＮＡを精製してもよく、ここで、該相補的な核酸分子は、精製のための任意の部分を含んでいてもよい。例えば、精製のための任意の部分の例として、ビーズなどの担体（必要に応じて、磁性を帯びていてもよい）、ビオチンおよびストレプトアビジンなどの互いに結合するペア分子のうちの一方、互いに結合するペア分子を結合させるための部分（例えば、クリックケミストリーにおけるアルキン部分）、抗体認識部分などが挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態では、特異的な結合分子（例えば、抗体）を使用して目的のＲＮＡを精製してもよい。一つの実施形態では、ＲＮＡ修飾（例えば、メチル化）に特異的な結合分子（例えば、抗体）を使用して目的のＲＮＡを精製してもよい。一つの実施形態では、特定の種類のＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）に特異的な結合分子（例えば、抗体）を使用して目的のＲＮＡを精製してもよい。一つの実施形態では、特定の配列に特異的な結合分子（例えば、抗体）を使用して目的のＲＮＡを精製してもよい。一つの実施形態では、特定の修飾および特定の配列に特異的な結合分子（例えば、抗体）を使用して目的のＲＮＡを精製してもよい。

　一つの実施形態では、配列番号６～１０
CTACCTGCACTGTAAGCACTTTG（配列番号６）
TCAACATCAGTCTGATAAGCTA（配列番号７）
CCAAACACTGCTGGGTAAGACG（配列番号８）
TCCATCATTACCCGGCAGTATTA（配列番号９）
AACTATACAACCTACTACCTCA（配列番号１０）
からなる群から選択される配列の少なくとも一部を含むＤＮＡを使用してＲＮＡを精製する。

　一つの実施形態では、修飾ＲＮＡ（場合によってＤＮＡ）における修飾は、人工的に導入された修飾である。例えば、人工的に導入された修飾には、化学合成によって導入された修飾が含まれるが、これに限定されず、薬剤で生物（ウイルスを含む）を処理した場合にその薬剤が生物中のＲＮＡに結合することで生じた修飾も含まれる。例えば、生体内の核酸と直接化学的に相互作用する薬剤（例えば、抗がん剤）で生物を処置すると、この薬剤に由来する部分が導入された修飾ＲＮＡ（場合によってＤＮＡ）が生じ得る。本発明の方法によれば、このような人工的な修飾が導入される可能性が高い核酸（種類、位置など）を容易に特定することができ、このような人工的な修飾が導入される可能性が高い核酸は、薬剤の研究開発のための指標またはバイオマーカーなどとして有用に使用され得る。また、ＲＮＡの修飾情報と組み合わせて、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）における人工的に導入された修飾情報を使用してもよい。

　一つの実施形態では、人工的に導入された修飾を有する核酸の検出のためには、質量分析法、放射性同位体標識などを使用してもよいし、修飾部分の化学構造に基づいてこの化学構造に特異的に結合する分子（例えば、抗体（ＢｒｄＵ抗体など）、ビオチン部分を導入した修飾部分に対してストレプトアビジンなど）を設計することが可能であるため、このような特異的結合分子を利用した検出法（例えば、精製後のシークエンシング、蛍光検出など）を使用してもよい。

　一つの実施形態では、細胞内小器官（例えば、エクソソーム）を精製することで目的のＲＮＡを精製してもよい。一つの実施形態では、遠心分離により細胞内小器官（例えば、エクソソーム）を精製してもよい。一つの実施形態では、細胞内小器官に存在する分子に結合する分子（例えば、抗体）を使用することで目的のＲＮＡを精製してもよい（例えば、抗ＣＤ６３抗体を使用してエキソソームを精製する）。

　目的のＲＮＡの精製は、単一の段階で実施してもよいし、複数の段階で実施してもよい。例えば、目的の配列を有するＲＮＡの精製は、試料から目的の配列を有するＲＮＡを直接精製してもよいし、試料から全ＲＮＡを精製した後に、目的の配列を有するＲＮＡを精製してもよい。

　一つの実施形態では、複数種類の目的のＲＮＡを精製する場合、この目的のＲＮＡのうちの少なくとも２種類が混合された状態で精製してもよいし、各目的のＲＮＡが別々に精製されてもよい。例えば、複数の目的の配列を有するＲＮＡを別々に精製する場合、試料を複数に分割して、それぞれの分割試料からそれぞれ異なる配列を有する目的の核酸を精製してもよいし、目的の各配列に相補的な核酸分子が複数の離れた位置に配置された担体に試料を適用することで目的の核酸を精製してもよい。

　（修飾の検出および同定）
　ＲＮＡ上の修飾の検出および同定は任意の公知の手法を用いて行うことができる。例えば、このようなＲＮＡ上の修飾の検出および同定する方法として、修飾特異的な抗体による蛍光検出、修飾および／またはＲＮＡ特異的なタンパク質（抗体など）によって免疫沈降したＲＮＡのシークエンシング、精製ＲＮＡの質量分析、バイサルファイトシークエンシングなどの化学処理を施したＲＮＡのシークエンシング（必要に応じてＰＣＲと組み合わせる）、ナノポアシークエンシング（例えば、オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズのもの）、トンネル電流シークエンス（Scientific　Reports　2,doi:　10.1038/srep00501(2012)）が挙げられる。

　一つの実施形態では、ＲＮＡ上の修飾の検出および同定は、ＲＮＡの配列情報の特定と並行して実施されてもよい。本発明では、任意のＲＮＡ修飾情報が同定され得る。一つの実施形態では、目的のＲＮＡ上の修飾の種類（１つのヌクレオチド上の異なる位置に導入された同じ種類の官能基による修飾の種類を含む）、修飾された目的のＲＮＡの量および割合、目的のＲＮＡ上の修飾の量および割合、および目的のＲＮＡ上の修飾の位置のうちの少なくとも１つが、必要に応じて該ＲＮＡの量とともに、同定される。一つの実施形態では、目的のＲＮＡ上の修飾状態は、その修飾状態の信頼度（例えば、真陽性の確率）を含み得る。一つの実施形態では、ＲＮＡ上のメチル化が同定される。一つの実施形態では、ヌクレオシド上のメチル化が同定される。一つの実施形態では、ＲＮＡの核酸塩基上のメチル化が同定される。一つの実施形態では、ヌクレオシド上のメチル化が同定される。一つの実施形態では、ＲＮＡのｍ^６Ａが同定される。一つの実施形態では、修飾を付加する酵素の認識モチーフ情報、修飾を除去する酵素の認識モチーフ情報、および修飾に結合するタンパク質の認識モチーフ情報のうちの少なくとも１つに基づいてＲＮＡの修飾状態（例えば、修飾の位置、修飾状態の信頼度など）が同定される。

　一つの実施形態では、
CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG配列番号１の１３番目のＡのメチル化（配列番号１５）
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA配列番号２の９番目のＣのメチル化（配列番号１６）
CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG配列番号３の１３番目のＣのメチル化（配列番号１７）
UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA配列番号４の９番目のＣのメチル化（配列番号１８）
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU配列番号５の１９番目のＡのメチル化（配列番号１９）
からなる群から選択される修飾を含む修飾が同定される。

　一つの実施形態では、ＲＮＡ上の修飾は、その修飾を構成する部分（例えば、メチル部分）に含まれる放射性原子から放出された放射線によって検出および同定され得る。一つの実施形態では、ＲＮＡ上の修飾は、修飾に特異的に結合する分子（例えば、修飾特異的抗体）の結合の検出（例えば、蛍光の検出）、または修飾に特異的に反応する分子と反応して生成された反応物の検出（例えば、反応物である光の検出、反応して生成されたビオチン誘導体のストレプトアビジンによる検出など）によって特定され得る。

　一つの実施形態では、ＲＮＡ上の修飾は、バイサルファイトシークエンシング、修飾特異的抗体で濃縮したＲＮＡのシークエンシング（ＲＩＰシークエンシング）などの核酸の配列決定法において同定することができる。任意の適切な配列決定法を本発明に従って使用することができる。次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術が好ましい。本明細書において「次世代シークエンシング」または「ＮＧＳ」という用語は、サンガー化学として公知の「従来の」シークエンシング法に対して、種々の核酸全体を小片に分割することによって核酸鋳型を核酸全体に沿って並行してランダムに読み取る、すべての新規ハイスループットシークエンシング技術を意味する。ＮＧＳ技術（超並列シークエンシング技術とも称する）は、全ゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム（ゲノムのすべての転写配列）またはメチローム（ゲノムのすべてのメチル化配列）の核酸配列情報を非常に短期間、例えば１～２週間以内、好ましくは１～７日間以内、または最も好ましくは２４時間未満内に送達することができ、原理上は、単一細胞シークエンシングアプローチを可能にする。市販されているかまたは文献中で言及されている任意のＮＧＳプラットフォームを本発明の実施のために使用することができる。一つの実施形態では、ＰＣＲにより増幅した核酸を配列決定することでＲＮＡ上の修飾を同定することができる。

　一つの実施形態では、ＲＮＡは、修飾特異的な結合分子（例えば、抗ｍ６Ａ抗体などの抗体）によって精製されたことに基づいて修飾ＲＮＡであると同定される。シークエンシングで得られたデータは、任意の分析法によって処理してＲＮＡ修飾情報へと変換することができる。例えば、このような分析法の例として、ＭｅｔＰｅａｋ（Cuiら、Bioinformatics(2016)32(12):i378-i385を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。

　一つの実施形態では、ＲＮＡ上の修飾は、質量分析計によって同定することができる。本発明において使用することができる質量分析計として、磁場型、電場型、四重極型、飛行時間型（ＴＯＦ）等が挙げられる。一つの実施形態では、質量分析計によって、単鎖ＲＮＡを測定してもよいし、ＤＮＡまたはＲＮＡとともに二本鎖を形成したＲＮＡを測定してもよい。

　質量分析は任意のイオン化法と組み合わせることができる。本発明において使用することができるイオン化法として、例えば、電子イオン化法（ＥＩ）、化学イオン化法（ＣＩ）、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＥＳＩは、液体クロマトグラフィー、超臨界クロマトグラフィーなどを組み合わせることができ、クロマトグラフィーにより複数の種類のＲＮＡを分離しながら測定することが可能である。クロマトグラフィーに使用することができるカラムとして、例えば、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）カラム、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーカラムなどが挙げられる。

　ＭＡＬＤＩにおいては、試料は、マトリックスとしてレーザー光によってイオン化しやすい物質（塗布剤）と予め混合され、ターゲットプレート上のスポット（アンカーポジション）に配置され、これにレーザー光が照射されることでイオン化が起こる。本発明において使用することができる塗布剤として、３－ＨＰＡ（３-ヒドロキシピコリン酸）、ＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）、ＣＨＣＡ（α－シアノ－４－ヒドロキシけい皮酸）などが挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態では、ターゲットプレート上の１つのスポット（アンカーポジション）に配置されるＲＮＡは複数の配列を有するＲＮＡを含んでもよいが、好ましくは、ターゲットプレート上の１つのスポットに配置されるＲＮＡは同じ配列を共有する一群のＲＮＡである。１つのアンカーポジション上に存在するＲＮＡの配列の種類が増加するにつれて、配列の確認および／または修飾位置の確認が困難となり得る。

　一つの実施形態では、断片化されていないイオン（親イオン）および／または断片化されたイオン（娘イオン）の測定値に基づいてＲＮＡの修飾状態（例えば、修飾の有無、修飾の位置、修飾の数、修飾の信頼度など）を同定することができる。一つの実施形態では、対照分子（例えば、安定同位体標識化核酸、非修飾核酸、相補的な二本鎖を形成していたペアのもう一方の核酸など）との比較によってＲＮＡの修飾状態（例えば、修飾の量など）を同定することができる。一つの実施形態では、参照情報（例えば、標準試料の測定結果、既知の修飾情報など）に基づいてＲＮＡの修飾状態を同定することができる。質量分析のデータは、任意のソフトウェアによって処理してＲＮＡ修飾状態へと変換することができる。例えば、このようなソフトウェアの例として、ＤＮＡメチル化分析システムMassARRAY（登録商標）EpiTYPER（シーケノム）が挙げられるがこれらに限定されない。

　（事前処理）
　一つの実施形態では、目的のＲＮＡは、測定の前に物理的、化学的または生物的に事前処理されていてもよい。事前処理を行うことで、例えば、目的のＲＮＡの測定における感度、正確さおよび／または精度の向上、異なる種類の修飾の区別、試料間比較における定量性の向上、測定機器における分離の向上などの効果が得られ得る。このような事前処理として、例えば、硫酸ジメチル処理、ハロゲン化合物処理、アルカリ加水分解処理、安定同位体標識導入処理、検出向上剤（例えば、蛍光色素など、ＭＡＬＤＩにおいてレーザーの吸収が良好な部分を含む化合物）処理が挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態では、事前処理は、ＲＮＡを担持した基材（ビーズなど）に対して実施され得る。一つの実施形態では、事前処理に用いる薬剤は、ＲＮＡの塩基上のアミン部分、末端のリン酸基または水酸基に基を導入するように設計され得る。

　硫酸ジメチル処理は、ＲＮＡのアデニンのプリン環の１位の窒素原子を選択的にメチル化して、＋１４Ｄａの質量を与えることができるが、プリン環の１位の窒素原子がすでにメチル化されている場合にはこの反応は進行せず、１－ｍＡとＮ６－ｍＡとの区別が可能である。同様に、トリフルオロメタンスルホン酸メチルも使用され得る。ハロゲン化合物処理には、例えば、ハロゲン化アセトアルデヒドを使用することができ、ＲＮＡのシトシンの３位の窒素原子と４位のアミノ基との間を架橋して新たな５員環を形成して、質量数を変化させるが、シトシンの３位の窒素原子がメチル化されている場合にはこの反応は進行しない。ハロゲン化アセトアルデヒドとしては、ブロモアセトアルデヒドおよびクロロアセトアルデヒドが挙げられ、これらの化合物の沸点は約６０℃であるためＲＮＡを分解させずに真空乾燥による除去が可能である。アルカリ加水分解は、例えば、ＲＮＡをアンモニアで処理することでＲＮＡを断片化する。

　（分析）
　取得されたＲＮＡ修飾情報を使用して、種々の状態を分析することができる。一つの実施形態では、取得されたＲＮＡ修飾情報を使用して、対象の医学的状態または生物学的状態を分析する。対象の医学的状態または生物学的状態として、例えば、疾患、老化、免疫状態（例えば、腸管免疫、全身免疫など）、細胞分化状態、薬剤または処置に対する応答性、対象の微生物（例えば、腸内細菌、表皮細菌）の状態、が挙げられるがこれらに限定されない。本発明が分析しうる疾患としては、例えば、脳神経疾患、公害病、小児外科の病気、真菌症、特定疾患、感染症、がん(悪性腫瘍)、消化器病（炎症性腸疾患を含む）、神経変性疾患、アレルギー疾患、寄生虫病、動物の感染症、尿路系腫瘍、種々の症候群、呼吸器疾患、乳腺腫瘍、人格障害、皮膚疾患、性行為感染症、歯科疾患、精神疾患、腎泌尿器疾患、眼疾患、食中毒、赤星病中間宿主、肝炎、循環器病、奇病、膠原病、症候、人獣共通感染症、パラフィリア、免疫病（腸管免疫を含む）、先天性疾患、発達障害、皮疹、先天性心疾患、領域別病名、恐怖症、ウイルス感染症、男性生殖器疾患、動物の病気、魚病、増殖性疾患、ポリープ、歯周疾患、乳腺疾患、遺伝子疾患、血液疾患、代謝内分泌疾患、婦人科疾患、発熱と発疹を起こす病気、軟部腫瘍、植物の病気等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。本発明が特に好適に分析しうる疾患としては、例えば、がん、炎症性腸疾患、アルツハイマー型もしくは血管障害性認知症、境界領域精神疾患、拡張型心筋症、肥大型心筋症、心不全（隠れた軽度のものを含む）、心臓疾患（例えば、致死性を含め、不整脈による突然死を誘発するもの）などが挙げられるがこれらに限定されず、これらの疾患は、細胞の特異的な代謝を介してＲＮＡの修飾状態に影響を与え得る。対象の微生物の状態としては、例えば、熱処理および消毒薬などに対する耐性状態（例えば、調理が不完全な食品に寄生するＥ型肝炎ウイルスなどの芽胞形成状態）などの公衆衛生上のインシデントとなり得る状態、宿主に侵入したウイルス（例えば、肝炎ＲＮＡウイルス、パピローマＤＮＡウイルス）の核酸の修飾状態（メチル化など）などが挙げられるがこれらに限定されない。

　本発明は、膵臓がん（例えば、早期膵臓がん）、肝臓がん、胆嚢がん、胆道がん、胃がん、大腸がん（直腸がん、結腸がん）、膀胱がん、腎がん、乳がん、肺がん、脳腫瘍、皮膚がんなどのがんも対象としうるということで医学的な見地からも意義が高い。また、本発明によって、がん（例えば、膵臓がん、肝臓がん、胆嚢がん、胆道がん、胃がん、大腸がん、膀胱がん、腎がん、乳がん、肺がん、脳腫瘍、皮膚がん）の進行の程度（ステージ）が分析され得る。一つの実施形態では、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１７、ｌｅｔ－１７ａおよびｍｉＲ－２００ｃのうちの少なくとも１つのメチル化に基づいて、がん（例えば、膵臓がん、肝臓がん、胆嚢がん、胆道がん、胃がん、大腸がん、膀胱がん、腎がん、乳がん、肺がん、脳腫瘍、皮膚がん）の状態が分析され得る。一つの実施形態では、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１７、ｌｅｔ－１７ａおよびｍｉＲ－２００ｃのうちの少なくとも１つのメチル化に基づいて、がん（例えば、膵臓がん、肝臓がん、胆嚢がん、胆道がん、胃がん、大腸がん、膀胱がん、腎がん、乳がん、肺がん、脳腫瘍、皮膚がん）の状態が分析され得る。let-7、miR-21、miR-100、miR-222、miR-92a、miR-10a、miR-99b、miR-30d、miR-26a、miR-320a、miR-148a、miR-125a、miR-423、miR-182、miR-7641、miR-378a、miR-1307、miR-221、miR-183、miR-25、miR-24、miR-30a、miR-128、miR-941、miR-1246、miR-92b、miR-122、miR-5100、miR-106b、miR-181a、miR-27b、miR-29a、miR-224、miR-191、miR-146b、miR-27a、miR-3182、miR-532、miR-3184、miR-30c、miR-181b、miR-744、miR-7706、miR-148b、miR-629、miR-103b、miR-103a、miR-98、miR-23a、miR-425、miR-192、miR-22、miR-3615、miR-5701、miR-155、miR-149、miR-7704、miR-1180、miR-1275、miR-769、miR-1273g、miR-484、およびmiR-17のうちの少なくとも１つのメチル化に基づいて、がん（例えば、膵臓がん）の状態が分析され得る。

　本発明はまた、対象生物の薬剤（例えば、抗がん剤、分子標的薬、抗体医薬、生物製剤（例えば、核酸、タンパク質）、抗生物質など）または処置に対する応答性を分析することができる。例えば、薬剤耐性なども分析することができ、例えば、抗がん剤の応答性、適切な治療剤の選択、抗生物質耐性の分析などにも応用することができる。本発明の分析はまた、重粒子線（例えば、Ｃａｒｂｏｎ／ＨＩＭＡＣ）またはＸ線による処置などの手術または放射線処置などの経過や予後の分析にも用いることができる。本発明を用いて、ロンサーフ（ＴＡＳ１０２）、ゲムシタビン、ＣＤＤＰ、５－ＦＵ、セツキシマブ、核酸医薬またはヒストン脱メチル化酵素阻害剤などの種々の医薬の分析が可能であり、治療戦略の基礎情報として活用し得ることが理解される。例えば、薬剤が抗がん剤である場合、対象がその抗がん剤に対する耐性を有するかどうかの応答性を検査することで、治療戦略を立てることができることが本発明で達成されている。したがって、本発明を用いることによって、薬剤等の処置に対する応答性に基づいて、対象を処置するための薬剤および／または前記対象に対するさらなる処置の選択などを行うことができる。本発明を用いる場合、複数の薬剤についての応答性を検討する場合、複数の薬剤の中から前記状態を処置するための薬剤を示すことができる。分析を行う場合、薬剤の投与または前記処置の前後の前記対象における本発明のＲＮＡの修飾情報（例えば、メチル化）の比較に基づいて分析を行うことができる。

　本発明の１つの実施形態では、生物学的状態または医学的状態の分析の対象について、その年齢、性別、人種、家系情報、病歴、治療歴、喫煙状態、飲酒状態、職業情報、生活環境情報、疾患マーカー情報、核酸情報（対象における細菌の核酸情報を含む）、代謝物情報、タンパク質情報（例えば、発現量情報、構造情報）、腸内細菌情報、表皮細菌情報およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの情報をさらに考慮して、分析を行うことができる。本発明の方法において、利用し得る核酸情報としては、ゲノム情報、エピゲノム情報、トランスクリプトームの発現量情報、ＲＩＰシークエンシング情報、マイクロＲＮＡの発現量情報およびこれらのいずれかの組み合わせを挙げることができる。個々で利用され得るＲＩＰシークエンシング情報としては、薬剤耐性ポンプＰ－糖蛋白のＲＩＰシークエンシング情報、糞便のＲＩＰシークエンシング情報、糞便中の大腸菌のＲＩＰシークエンシング情報等を含み得る。

　本発明では、薬剤または処置に対する耐性株、または該耐性株と該耐性株が由来した細胞株との組み合わせにおける前記ＲＮＡ上の修飾情報にさらに基づいて、前記対象の前記状態を分析することができる。そのような薬剤または処置としては、例えば、ロンサーフ（ＴＡＳ１０２）、ゲムシタビン、ＣＤＤＰ、５－ＦＵ、セツキシマブ、核酸医薬、ヒストン脱メチル化酵素阻害剤、あるいは重粒子線（例えば、Ｃａｒｂｏｎ／ＨＩＭＡＣ）またはＸ線による処置を挙げることができるがそれらに限定されない。

　本発明が分析対象とするＲＮＡの種類は、分析の目的に応じて増減させることができ、例えば、少なくとも５種類、少なくとも１０種類、少なくとも２０種類、少なくとも３０種類、少なくとも５０種類、少なくとも１００種類、少なくとも２００種類、少なくとも３００種類、少なくとも５００種類、少なくとも１０００種類、少なくとも１５００種類、少なくとも２０００種類のＲＮＡ上の修飾情報を分析することができる。あるいは、マイクロＲＮＡを対象とする場合、利用可能なすべてのマイクロＲＮＡを対象としてもよい。ＲＮＡの種類は、特に限定されないが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを単独種類または複数の種類を組み合わせて用いてもよい。１つの実施形態では、同じ配列を含むＲＮＡ上の複数の修飾情報を分析することができる。別の実施形態では、ＲＮＡの構造情報にさらに基づいて、対象の状態を分析することができる。

　１つの実施形態では、メチル化酵素（例えば、Ｍｅｔｔｌ３、Ｍｅｔｔｌ１４、Ｗｔａｐ）、脱メチル化酵素（例えば、ＦＴＯ、ＡｌｋＢＨ５）およびメチル化認識酵素（例えば、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＴＨＤＦ３などのＹＴＨドメインを持つファミリー分子）のうちの少なくとも１つがノックダウンされた生物におけるＲＮＡの修飾情報、および／またはメチル化酵素（例えば、Ｍｅｔｔｌ３、Ｍｅｔｔｌ１４、Ｗｔａｐ）、脱メチル化酵素（例えば、ＦＴＯ、ＡｌｋＢＨ５）およびメチル化認識酵素（例えば、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＴＨＤＦ３などのＹＴＨドメインを持つファミリー分子）のうちの少なくとも１つの認識モチーフ情報にさらに基づいて、前記対象の前記状態を分析するステップを含んでいてもよい。

　１つの実施形態では、複数の修飾情報に基づいて状態の確率を計算する工程を実施してもよい。計算工程としては、任意の統計学的手法を実施することができ、例えば、主成分解析などが実施され得る。

　１つの実施形態では、臨床エビデンスが蓄積される抗がん剤（例えば、ロンサーフ（ＴＡＳ１０２）、ゲムシタビン、ＣＤＤＰ、５－ＦＵ、セツキシマブ、核酸医薬またはヒストン脱メチル化酵素阻害剤）の腫瘍組織に対する薬効を検討し治療戦略を立てることができる。

　１つの実施形態では、種々の薬剤の新たな作用機序を解明して更なる治療戦略で応用できる中分子化合物を創薬することができ、例えば、難治性進行がんを克服する戦略の立案に利用することができる。

　１つの実施形態では、マイクロＲＮＡを本発明の手法で分析することにより、作用機序の更なる解明を行うことができる。すなわち、本発明の方法を用いて、抗がん剤等の薬剤に特異的なマイクロＲＮＡを分析することができ、これを用いてコンパニオン診断薬を設計することができる。

　１つの実施形態では、低侵襲のリキッドバイオプシーで得られる末梢血中のｍｉＲＮＡを用いたコンパニオン診断を実施することができる。例えば、薬剤（例えば、ロンサーフ（ＴＡＳ１０２）、ゲムシタビン、ＣＤＤＰ、５－ＦＵ、セツキシマブ、核酸医薬またはヒストン脱メチル化酵素阻害剤）を使用した臨床情報と末梢血中のｍｉＲＮＡのデータを照合し、さらにその薬剤の耐性細胞でのメカニズム解析とを照合して、その薬剤暴露に応答してクロマチンから転写されるｍｉＲＮＡと、末梢血中にエクソゾームとして分泌されるｍｉＲＮＡを、６０個のパネルとして同定することができた。本発明は、このようなパネルマイクロＲＮＡを同定し、さらにこれを分析する技術を提供するものである。

　１つの実施形態では、本発明は、がん幹細胞またはCancer　Initiating　Cell（CIC）に関する分析を行うことができる。

　１つの実施形態では、本発明の分析は、修飾されたＲＮＡ自体が、薬の標的分子となる場合にも応用することができる。すなわち、本発明の分析技術を用いて、ＲＮＡの修飾または非修飾を検出することによって、新規薬剤のスクリーニングを行うことができる。特に、マイクロＲＮＡなどのＲＮＡの修飾（例えば、メチル化）をこのような新規薬剤のスクリーニングに応用することが従来知られておらず、本発明は新たな作用機序での薬剤を提供し得るものである。

　別の実施形態では、修飾されたＲＮＡ自体が薬の成分分子となる場合にも、本発明の分析を応用することができる。例えば、本発明の分析技術を用いて、ＲＮＡの修飾または非修飾を検出することによって、対象となるＲＮＡ修飾物またはその修飾を担う酵素などの外部因子が薬剤として利用可能かどうかを分析することで、新規薬剤のスクリーニングを行うことができる。

　本発明はまた、ＲＮＡ修飾の他、ＲＮＡ修飾以外の他の核酸の情報、例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）の塩基置換および／または修飾の情報を組み合わせて、分析を行うことができることが理解される。マルチオミクスの分析については、Sijia　Huang　et　al.,　Front　Genet.2017;8:84、Yehudit　Hasin　et　al.,Genome　Biol.2017;18:83などのＲＮＡ修飾（エピトランスクリプトーム）以外のオミクスのマルチオミクス分析の技術と組み合わせることができる。

　他の核酸の情報については、例えば、質量分析などにより、分析することができ、例えば、ＲＮＡには、ＲＩＰ－ｓｅｑを応用し、ＤＮＡにはＤＩＰ－ｓｅｑを応用し、ＦＤＮＡでは、ＢｒｄＵなどでＦＤＩＰ－ｓｅｑを行うことで分析することができる。

　１つの実施形態では、本発明の分析技術は、臨床エビデンスに基づく新しい機序の解明を行うことができる。

　さらなる実施形態では、本発明は、創薬ターゲット研究を行うことができる。例えば、複数の分子の複合体と標的との間の相互作用を標的とした低または中分子化合物の創薬を行うことができ、ライブラリーのスクリーニング、オルガノイドや動物個体を用いたフェノタイプのスクリーニングを行う際に本発明のＲＮＡ　ｍｏｄの分析技術を利用することができる。

　1つの実施形態では、本発明は、腫瘍多様性に対応した創薬において利用することができる。本発明のＲＮＡ　ｍｏｄ（例えば、マイクロＲＮＡのメチル化情報）に加えて、ＣｈＩＰ－ｓｅｑやＦＴＤを取り込んだ修飾ＤＮＡの一分子計測、さらには腫瘍組織の間質のＣＡＦ（Cancer　Associated　Fibroblasts）やリンパ球のシングル細胞分析（Ｃ1)などを組み合わせて応用することができる。患者に薬剤を投与したきに、がん細胞のみでなく腫瘍間質などのホスト側の応答も含めて統合的に把握することができる。ＲＮＡ　ｍｏｄの情報を活用して阻害剤を分類することができれば、がん細胞側または間質側を差別化できる革新的な医薬品を創出できる。

　１つの実施形態では、本発明は、ある薬剤について、（１）適応疾患を他に広げる、（２）他の先行する薬剤との非劣性を示して２ｎｄライン治療以前に遡らせる、（３）新たな作用機序の解明と治療薬に結びつく可能性を検証することなどに応用することができる。

　１つの実施形態では、例えば、がん患者などの患者の液体生検として血清エキソソーム内ｍｉＲＮＡの発現情報を整備し、分析対象の治療後の患者の血清エキソソーム内ｍｉＲＮＡの発現情報や本発明の修飾情報の分析を行うことができる。そのために、例えば、大腸がんであれば、例えば、全例１０００例のデータベース（The　Cancer　Genome　Atlas-Cancer　Genome；ＴＣＣＡ）を用いて、進行期大腸がん患者の血清エキソソーム内ｍｉ
ＲＮＡの発現情報や修飾情報を分析することができる。

　また、治療後の大腸がん患者の血清エキソソーム内ｍｉＲＮＡの発現情報や修飾情報を分析することができる。

　１つの実施形態では、本発明は、分析結果をもとに、ＲＮＡ修飾情報に基づく次世代型ＲＮＡバイオマーカーを提供することができ、これを臨床応用することができる。本発明は、例えば、マイクロＲＮＡモドミクスによる組織恒常性の把握を行うことができ、これを用いて臨床応用を行うことができる。

　本発明のＲＮＡの情報を用いた分析では、標的は転写因子であるということ、つまり、標的の遺伝子の発現を（多くの場合に正に）制御する鍵となる誘導因子であることが重要な点でもありうる。この場合には、独立の転写因子を厳選することにより、数を絞っていくことができる。例えば、本発明の方法を用いると、がんの診断において、がん遺伝子としての作用がある「ｃ－ｍｙｃ」を早々と手放したことができることが見出されたことは特筆に値する。がん遺伝子があると転写因子の限定的な独立性が失われて、ｃｅｌｌ　ｃｏｎｔｅｘｔ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔにいろいろな作用が出てくることから、クリアに最小数を求めることができなくなると理解される。この場合、「ｃ－ｍｙｃ」は横に多く作用する、対多作用があるので、ノイズとなるということが分かった。

　本発明の好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲ）が使用されるが、この場合、多対多対応であることが特徴である。つまり、１つのマイクロＲが複数に多く作用して、かつ異なった分子としてのマイクロＲＮＡ間でも共通した標的をシェアしているということも重要な点の一つであるといえる。このような「多対多対応」の制御系で、ある事象を誘導する重要なセットが存在するとして、それが１つの分子でなかったからといって、驚くことはない。むしろ、それが限定性されたセットであるとか、そのセットの中のヒエラルヒーを表現できる重み値をつけて表出でききることができることも本発明が提供する分析の特徴であるといえる。

　１つの実施形態では、マイクロＲＮＡのＲＮＡｍｏｄｏｍｉｃｓでがんの診断が想定されるがそれらに限定されず、このほか薬剤耐性（抗がん剤だけでなく、分子標的薬、抗体医薬品、また核酸などの生物製剤、さらに広くは、微生物由来の抗生剤など）、種の集団の分類、炎症性腸疾患、大腸菌、食品分類（産地、年齢、味、品質、賞味期限、味覚）なども想定されうる。麹を選択するためにＲＮＡｍｏｄｏｍｉｃｓを用いることができる。

　１つの実施形態では、例えば、５－ＦＵとＣＤＤＰなどの他の薬剤では、ＩＣ５０の分布が大きく異なっていて、５－ＦＵは効くものは良く効くが、効かないものは全くと言っていいほど効かないことがわかっており、これもエピトランスクリプトームで知ることができる。例えば、マイクロＲＮＡに関して見てみると、発現を見るよりも、エピトランスクリプトームを見た方が、主成分分析（ＰＣＡ）で大きく差別化して詳細に分類線を引くことが可能である、ことがわかっている（実施例を参照）。

　ＲＮＡメチル化は、サーカディアン・リズムと関わっていることが知られている（Sanchezら、Nature.　2010　Nov　4;468(7320):112-6およびJean-Michelら、Cell　Vol.　155,　Issue　4,　pp.　793-806　7　November　2013など）。１つの実施形態では、時差に関わる睡眠活動（時差ボケなど）を分析するためにＲＮＡ修飾情報を使用することができる。例えば、このような分析に基づいて、対象の睡眠活動が時差の影響を受ける可能性の決定およびそれに関連した人事または医療管理、パイロットまたはフライトアテンダントの管理、メラトニンを服用することが推奨されるかどうかの層別化などを実施することができる。１つの実施形態では、宇宙飛行の時差ボケを分析するためにＲＮＡ修飾情報を使用することができる。

　１つの実施形態では、対象の睡眠が十分であるかどうかを分析するためにＲＮＡ修飾情報を使用することができる。隠れ睡眠不足が問題になっているが、多くの場合、本人の自覚がない。そこで、これを矯正するために、ＲＮＡ修飾情報を使用することができる。１つの実施形態では、睡眠生活療法と合致させる。１つの実施形態では、長距離バス運転手の健康管理のために、ＲＮＡ修飾情報を使用することができる。１つの実施形態では、厚生管理のために、ＲＮＡ修飾情報を使用することができる。１つの実施形態では、夜勤業務者（製鉄、原発、病院、医療関係者、ガードマン、ビル管理会社などの）の健康管理のために、ＲＮＡ修飾情報を使用することができる。

　１つの実施形態では、血液試料のＲＮＡ修飾情報を使用して対象の年齢を分析し（必要に応じて、核酸の塩基配列情報を使用せず）、犯罪捜査における利用に供することができる。

　１つの実施形態では、ドーピングの有無を分析するためにＲＮＡ修飾情報を使用することができる。

　（バイオマーカースクリーニング）
　一つの実施形態では、取得されたＲＮＡ修飾情報を使用して、新たなバイオマーカーの探索を行うことができる。一つの実施形態では、ある状態である対象において取得されたＲＮＡ修飾情報を、その状態でない対象において取得されたＲＮＡ修飾情報と比較して、ＲＮＡ修飾状態（例えば、量、修飾位置など）に差（例えば、統計的有意差）が観察されたＲＮＡまたはＲＮＡの群を、その状態を予測するためのバイオマーカーとすることができる。

　一つの実施形態では、薬物および／または処置を施した対象において取得されたＲＮＡ修飾情報を、その薬物および／または処置を施していない対象において取得されたＲＮＡ修飾情報と比較して、ＲＮＡ修飾状態（例えば、量、修飾位置など）に差（例えば、統計的有意差）が観察されたＲＮＡまたはＲＮＡの群を、その薬物および／または処置に対しての応答性および／または耐性を予測するためのバイオマーカーとすることができる。

　（耐性株）
　一つの実施形態では、薬物および／または処置に対して耐性のある耐性株において取得されたＲＮＡ修飾情報を、その耐性株の元となった野生株において取得されたＲＮＡ修飾情報と比較して、ＲＮＡ修飾状態（例えば、量、修飾位置など）に差（例えば、統計的有意差）が観察されたＲＮＡまたはＲＮＡの群を、その薬物および／または処置に対しての応答性および／または耐性を予測するためのバイオマーカーとすることができる。

　このような耐性株は、例えば、薬物および／または処置の存在下で野生株を維持培養することによって作製することができ、一つの局面において、本発明は、このような耐性株の作製方法を提供する。一つの局面において、薬物および／または処置に対する耐性株は、該薬物および／または処置に対するＩＣ_５０に基づいて耐性株であるかどうか評価され得る。一つの局面において、本発明は、トリフルリジン（ＦＴＤ）、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ゲムシタビン、シスプラチン、セツキシマブ、Ｃａｒｂｏｎ／ＨＩＭＡＣ（重粒子線）、およびＸ線のそれぞれに対して耐性を有する耐性株を提供する。

　（薬物スクリーニング）
　一つの実施形態では、取得されたＲＮＡ修飾情報を使用して、新たな薬物を評価することができる。一つの実施形態では、ある薬物で処置した対象において取得されたＲＮＡ修飾情報を、別の薬物で処置した対象において取得されたＲＮＡ修飾情報と比較することによって、各薬物の処置で変動したＲＮＡに基づいて、薬物間で分類を行うことができる。

　（種分類）
　一つの実施形態では、取得されたＲＮＡ修飾情報を使用して、生物種を分類することができる。一つの実施形態では、取得されたＲＮＡ修飾情報を使用して、微生物（例えば、大腸菌）を分類することができる。一つの実施形態では、取得されたＲＮＡ修飾情報を使用して、微生物（例えば、大腸菌）を分類することができる。一つの実施形態では、薬剤耐性ポンプＰ－糖蛋白をコードするＲＮＡ上の修飾情報を使用して、微生物（例えば、大腸菌）を分類することができる。一つの実施形態では、微生物（例えば、大腸菌）の分類結果に基づいて、該微生物が取得された対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物、食品など）を分析することができる。

　（食品）
　一つの実施形態では、取得されたＲＮＡ修飾情報を使用して、食品の品質を分析することができる。食品の品質として、例えば、産地、年齢、加工後経過時間、鮮度、加工後変性、味質、活性酸素状態、微生物汚染（大腸菌、サルモネラ菌、ボツリヌス菌、ウイルス、寄生虫など）、発酵状態（発酵に係る微生物の状態を含む）、化学的要因（例えば、農薬、添加物など）、物理的要因（例えば、異物、放射線等）、脂肪酸状態または熟成度などが挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態では、行政機関などの公的機関による食品の品質管理のために取得されたＲＮＡ修飾情報を使用して食品の品質が分析され得る。一つの実施形態では、消費者が製品の品質を判断するための指標を提供するために取得されたＲＮＡ修飾情報を使用して食品の品質が分析され得る（味、においで表現されていた事柄を客観的に表現する）。

　また、本発明を用いることで、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質とは異なり、ＲＮＡ修飾（例えば、メチル化）では、視点を変えれば新たな展開を提供する。例えば、ＤＮＡ，　ＲＮＡ、は、分解とともに連続した塩基配列の情報が失われていく（短く断片化していく）ことになるが、メチル化はその質を表現するものとして、標的サイトがある限り、メチル化率として表されますから、「もとあった素因が、経時的な変化の中で、どのように減衰していき、それが残っているか」をモニターできる点で、ユニークである。タンパク質は、両者の中間にあるだけでなく、本件では標的が定まっていないので、追跡ツール、トレーサーとしては限界があるため、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質とは異なって、格別優れた効果を奏するといえる。

　（追加情報の利用）
　一つの実施形態では、対象から取得したＲＮＡ修飾情報に加えて、他の情報、例えば、別の時点で対象から取得したＲＮＡ修飾情報（例えば、処置の前後）、該対象に関する情報、修飾に関連するタンパク質のモチーフ情報、他の対象から取得したＲＮＡ修飾に関する情報、ＲＮＡと結合する物質（タンパク質、脂質など）とＲＮＡとの複合体に関する情報（必要に応じて、さらにＲＮＡ修飾状態に関連した状態）などを使用して対象の状態を分析することができる。

　追加で使用することができる対象に関する情報として、例えば、対象の年齢、性別、人種、家系情報、病歴、治療歴、喫煙状態、飲酒状態、職業情報、生活環境情報、疾患マーカー情報、核酸情報（対象における微生物の核酸情報を含む）、代謝物情報、タンパク質情報、腸内細菌情報、表皮細菌情報などが挙げられる。核酸情報として、例えば、ゲノム情報、ゲノム修飾情報、トランスクリプトーム情報（発現量および配列の情報を含む）、ＲＩＰシークエンシング情報、マイクロＲＮＡの情報（発現量および配列の情報を含む）が挙げられる。個々で利用され得るＲＩＰシークエンシング情報としては、薬剤耐性ポンプＰ－糖蛋白のＲＩＰシークエンシング情報、糞便のＲＩＰシークエンシング情報、糞便中の大腸菌のＲＩＰシークエンシング情報等が挙げられ得る。

　追加で使用することができる修飾に関連するタンパク質のモチーフ情報として、修飾を付加する酵素の認識モチーフ情報、修飾を除去する酵素の認識モチーフ情報、および修飾に結合するタンパク質の認識モチーフ情報が挙げられ、具体的には、メチル化酵素（例えば、Ｍｅｔｔｌ３、Ｍｅｔｔｌ１４、Ｗｔａｐ）、脱メチル化酵素（例えば、ＦＴＯ、ＡｌｋＢＨ５）およびメチル化認識酵素（例えば、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＴＨＤＦ３などのＹＴＨドメインを持つファミリー分子）などのモチーフ情報が挙げられる。

　追加で使用することができる他の対象から取得したＲＮＡ修飾に関する情報として、例えば、ある状態の対象におけるＲＮＡ修飾情報、修飾に関連するタンパク質の発現について遺伝子操作された生物におけるＲＮＡ修飾情報、薬物および／または処置に耐性を有する耐性株におけるＲＮＡ修飾情報、薬物および／または処置が施された対象におけるＲＮＡ修飾情報、ＲＮＡと結合する物質（タンパク質、脂質など）とＲＮＡとの複合体に関する情報（必要に応じて、さらにＲＮＡ修飾状態に関連した状態）が挙げられるが、これらに限定されない。

　（対象状態分析方法）
　一つの実施形態では、本発明は、対象における少なくとも１種類のＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）上の修飾（例えば、メチル化）情報を取得するステップと、該修飾情報に基づいて該対象の状態を分析するステップとを含む、対象の状態を分析する方法を提供する。修飾情報は、対象に由来する試料を測定することで取得することができる。一つの実施形態では、分析は、試料を取得した後短期間で（例えば、１日以内、１０時間以内、５時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内、１５分以内など）測定を行うオンサイト分析である。一つの実施形態では、オンサイト分析の分析結果は、試料の取得から短期間で（例えば、１日以内、１０時間以内、５時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内、１５分以内など）出力される。一つの実施形態では、試料を取得した後、試料が測定器および／または分析器のある場所に送達されて、そこで分析が実施される。試料の取得は対象自身が行なってもよい。一つの実施形態では、取得した試料は凍結して送達される。分析結果は、送達元に伝えられてもよいし、インターネット上のサイトにアクセスすることで利用可能であってもよい。

　例えば、病院などの医療機関において本発明の方法を実施する場合には、対象（例えば、患者または疾患などの危険性のある被験者など）から試料（例えば、血液、摘出器官、糞便など）を取得し、この試料を処理して目的のＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）を精製し、この目的のＲＮＡの修飾情報を同定する。このように同定したＲＮＡの修飾情報に基づいて、対象の状態（例えば、がんの罹患および再発の可能性、特定の薬物治療に耐性を獲得する可能性など）を分析することができる。一度取得したＲＮＡの修飾情報は、他の対象の状態の分析に使用してもよいし、同じ対象の別の時点における状態の分析に使用してもよいし、データベースに蓄積してもよい。

　例えば、製薬会社などの研究機関において本発明の方法を実施する場合には、対象から取得した試料（例えば、実験動物の組織または器官、臨床試料、培養細胞など）を処理して目的のＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）を精製し、この目的のＲＮＡの修飾情報を同定する。このように同定したＲＮＡの修飾情報を、他の分析により確認した同じ対象の状態（例えば、がんの状態、薬物耐性を獲得した状態、薬物が治療効果を奏した状態など）と関連付けて情報を蓄積することができる。このように取得したＲＮＡの修飾情報に基づいて、対象（患者または疾患などの危険性のある被験者など）の状態に適当に適用できる薬物を決定することができる。

　（プログラム）
　１つの局面において、本発明は、ＲＮＡの修飾情報に基づいて対象の状態を分析する方法をコンピュータに実装させるプログラムを提供する。このプログラムが実装する方法は：（ａ）対象における少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報を、該ＲＮＡの参照修飾情報と比較するステップ；および（ｂ）該比較するステップの出力結果に基づいて該対象の該状態を判定するステップ、を包含する。一つの実施形態では、参照修飾情報は、前記対象とは異なる対象における前記ＲＮＡ上の修飾情報を含む。一つの実施形態では、参照修飾情報は、前記修飾情報とは別の時点で取得された前記対象における前記ＲＮＡ上の修飾情報を含む。

　１つの局面において、本発明は、ＲＮＡの修飾情報に基づいて対象の状態を分析する方法をコンピュータに実装させるプログラムを格納する記録媒体を提供する。この記録媒体が格納するプログラムが実行する方法は：（ａ）対象における少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報を、該ＲＮＡの参照修飾情報と比較するステップ；および（ｂ）該比較するステップの出力結果に基づいて該対象の該状態を判定するステップ、を包含する。一つの実施形態では、参照修飾情報は、前記対象とは異なる対象における前記ＲＮＡ上の修飾情報を含む。一つの実施形態では、参照修飾情報は、前記修飾情報とは別の時点で取得された前記対象における前記ＲＮＡ上の修飾情報を含む。

　（システム）
　１つの局面において、本発明は、ＲＮＡの修飾情報に基づいて対象の状態を分析するシステムを提供する。システムは：（ａ）ＲＮＡを測定する測定部；（ｂ）該測定の結果に基づいてＲＮＡ上の修飾状態を計算する計算部；および（ｃ）該修飾状態に基づいて該対象の状態を分析する分析部、を包含する。一つの実施形態では、システムは試料を処理して目的のＲＮＡを精製する試料処理部をさらに含む。

　測定部は、ＲＮＡの修飾情報を提供する機能および配置を有する限り、どのような構成をとっていてもよい。計算部や分析部とは同一または異なる構造物として提供され得る。一つの実施形態では、測定部は、質量分析計（例えば、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）である。一つの実施形態では、測定部は、シークエンシング装置である。

　計算部は、測定データに基づいてＲＮＡ上の修飾状態（例えば、修飾位置、修飾の量など）を同定する。

　分析部は、得られたＲＮＡ修飾情報に基づいて、対象の状態を分析する。一つの実施形態では、分析は、さらに上記の追加情報を参照して実施されてもよい。

　図３４の機能ブロック図を参照して、本発明のシステムの構成を説明する。なお、本図においては、単一のシステムで実現した場合を示しているが、複数のシステムで実現される場合も本発明の範囲に包含されることが理解される。このシステムで実現される方法は、プログラムとして記載することができる。このようなプログラムは記録媒体に記録することができ、方法として実現することができる。

　本発明のシステム１０００は、コンピュータシステムに内蔵されたＣＰＵ１００１にシステムバス１０２０を介してＲＡＭ１００３、ＲＯＭ、ＳＳＤやＨＤＤ、磁気ディスク、ＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリなどの外部記憶装置１００５及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｆ）１０２５が接続されて構成される。入出力Ｉ／Ｆ１０２５には、キーボードやマウスなどの入力装置１００９、ディスプレイなどの出力装置１００７、及びモデムなどの通信デバイス１０１１がそれぞれ接続されている。外部記憶装置１００５は、情報データベース格納部１０３０とプログラム格納部１０４０とを備えている。何れも、外部記憶装置１００５内に確保された一定の記憶領域である。

　このようなハードウェア構成において、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムがＣＰＵ１００１によってＲＡＭ１００３上に呼び出されて展開され実行されることで、ＯＳ（オペレーションシステム）と協働して本発明の機能を奏するようになっている。もちろん、このような協働する場合以外の仕組みでも本発明を実装することは可能である。

　本発明の実装において、ＲＮＡ試料の測定（例えば、質量分析および／またはシークエンシング）を行ってＲＮＡ修飾データを得た場合、この測定を行って得られたＲＮＡ修飾データまたはこれと同等の情報（例えば、シミュレーションを行って得られたデータ）は、入力装置１００９を介して入力され、あるいは、通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介して入力されるか、あるいは、データベース格納部１０３０に格納されたものであってもよい。該ＲＮＡ試料の測定（例えば、質量分析および／またはシークエンシング）を行ってＲＮＡ修飾データを得て、該ＲＮＡ修飾データを分析するステップは、プログラム格納部１０４０に格納されたプログラム、または、入力装置１００９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１０１１等を介してコマンドを受信することで、この外部記憶装置１００５にインストールされたソフトウェアプログラムによって実行することができる。このような分析を行うソフトウェアは、実施例に例示されるものを使用してよいが、これに限定されず、当該分野で公知の任意のソフトウェアを利用することができる。分析が行われたデータは、出力装置１００７を通じて出力されるかまたは情報データベース格納部１０３０等の外部記憶装置１００５に格納されてもよい。

　データベース格納部１０３０には、これらのデータや計算結果、もしくは通信デバイス１０１１等を介して取得した情報が随時書き込まれ、更新される。各入力配列セット中の各々の配列、参照データベースの各ＲＮＡ情報ＩＤ等の情報を各マスタテーブルで管理することにより、蓄積対象となる試料に帰属する情報を、各マスタテーブルにおいて定義されたＩＤにより管理することが可能となる。

　データベース格納部１０３０には、上記計算結果が、同じ試料から得られた別の核酸情報などの各種情報、生体情報等の既知の情報と関連付けて格納されてもよい。このような関連付けは、ネットワーク（インターネット、イントラネット等）を通じて入手可能なデータをそのまままたはネットワークのリンクとしてなされてもよい。

　また、プログラム格納部１０４０に格納されるコンピュータプログラムは、上記した処理システム、例えば、データ提供、修飾状態の分析、参照データとの比較、分類、クラスタリング、その他の処理等を実施するシステムとしてコンピュータを構成するものである。これらの各機能は、それぞれが独立したコンピュータプログラムやそのモジュール、ルーチンなどであり、上記ＣＰＵ１００１によって実行されることでコンピュータを各システムや装置として構成させるものである。
　（試薬）

　一つの実施形態では、本発明は、ＲＮＡの修飾情報に基づいて対象の状態を判定するために修飾が該状態と関連するＲＮＡを精製するための組成物であって、該対象における少なくとも１種類のＲＮＡを捕捉するための手段を含む、組成物を提供する。一つの実施形態では、捕捉するための手段は目的のＲＮＡと少なくとも部分的に相補的な核酸を含む。一つの実施形態では、捕捉するための手段は修飾されたＲＮＡを捕捉するための手段（例えば、修飾特異的な抗体など）を含む。一つの実施形態では、捕捉するための手段は修飾された目的のＲＮＡに特異的な分子を含む。一つの実施形態では、捕捉するための手段は、精製するための部分（例えば、磁気を帯びていてもよい担体、相互に結合可能なペアの一方（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン））を含む。一つの実施形態では、捕捉するための手段は、精製するための部分に連結されたリンカーを含む。
　（プレート、チップ）

　一つの実施形態では、本発明は、少なくとも１種類のＲＮＡの修飾情報に基づいて対象の状態を判定するためのプレートまたはチップを提供し、プレートまたはチップの表面には、該ＲＮＡを捕捉するための手段が配置されている。一つの実施形態では、このプレートまたはチップはＭＡＬＤＩ測定用である。一つの実施形態では、このプレートまたはチップは複数のスポットを有し、各スポットには、それぞれ異なる配列を有するＲＮＡを捕捉する手段が配置されている。一つの実施形態では、各スポットの大きさは、例えば、直径１０μｍ～１００μｍであり得る。一つの実施形態では、１つのプレートまたはチップ上に、１、２、３、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００または３０００のスポットが形成され得る。一つの実施形態では、各スポットには、１０^７以上の捕捉する手段が配置され得る。一つの実施形態では、捕捉する手段は目的のＲＮＡと少なくとも部分的に相補的な核酸である。プレートまたはチップの基材としては、限定されないが、例えば、導電性を付与したガラス及びプラスチック（ポリエチレン）等が挙げられる。

　異なるスポット同士が互いに近接している場合、スポットに含まれるＲＮＡをＭＡＬＤＩなどによってイオン化するためにスポットにレーザーを照射すると目的のスポットの周囲の他のスポットにもレーザーが照射され得る。その結果、質量分析による断片化測定において、近接するスポットに由来するシグナルによる干渉が生じ、目的のスポットの計測値に影響が生じ得る。そのため、一つの実施形態では、プレートまたはチップ上のスポットは、シグナル間の干渉の影響を低減または最小化するように配置され得る。一つの実施形態では、シグナル間の干渉の影響は、各スポットに配置する各ＲＮＡの断片化（実測による結果に基づいてもよいし、理論に基づいてもよい）によって生じるｍ／ｚの値の間の重なりおよび／または差に基づいて評価される。このとき、各ＲＮＡの断片化によって生じるｍ／ｚの値は、修飾の存在による質量数の増減が考慮されてもよいし、考慮されなくてもよい。一つの実施形態では、プレートまたはチップ上のスポットは、モンテカルロ法などの数理的統計的手法に基づいて配置される。
　（キット）

　一つの実施形態では、本発明は、ＲＮＡの修飾情報に基づいて対象の状態を判定するためのキットであって、目的のＲＮＡを精製するための組成物、目的のＲＮＡを捕捉する手段が配置されたプレートまたはチップ、および該対象から試料を取得するためのデバイスのうち少なくとも１つと、キットを使用するための説明書とを含む、キットを提供する。一つの実施形態では、キットは、試料からＲＮＡを精製するための手段を含む。

　一つの実施形態では、キットは、試料をＭＡＬＤＩ測定に適応するように処理するためのものである。一つの実施形態では、キットは、ＭＡＬＤＩ測定において使用するための塗布剤（例えば、３-ヒドロキシピコリン酸を含む）をさらに含む。

　一つの実施形態では、キットは、対象から試料を取得するためのものである。一つの実施形態では、対象から試料を取得するためのデバイスを含むキットは、試料の送付先が記載された説明書を含む。一つの実施形態では、キットは、採取した試料を凍結保存するための手段を含む。一つの実施形態では、キットは、対象から血液、粘膜表皮（例えば、口腔、鼻腔、耳腔、膣などにおけるもの）、皮膚表皮、生体分泌液（例えば、唾液、鼻水、汗、涙、尿、胆汁など）、糞便、表皮上微生物を取得するためのデバイスを含む。
　（一般技術）

　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Current　Protocols　in　Molecular　Biology（http://onlinelibrary.wiley.com/book/10.1002/0471142727）およびMolecular　Cloning:　A　Laboratory　Manual　(Fourth　Edition)（http://www.molecularcloning.com）などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。

　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

　以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

　以下に実施例を記載する。
　試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Sigma－Aldrich、和光純薬、ナカライ、R&D　Systems、USCN　Life　Science　INC等）の同等品でも代用可能である。

　（略号）
　本明細書において説明した略称の他、以下の略称も用いる。
３－ＨＰＡ（３－ヒドロキシピコリン酸）
ＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）

　以下の実施例では、ＲＮＡのメチル化の検出は、以下のマイクロＲＮＡ上のメチル化を例として用いて実施した（表中、下線はメチル化を示す。）。これ以外のＲＮＡの誘導についても同様の分析が可能であると当業者は理解する。

・共通プロトコル
　本明細書において使用した標準的なプロトコルを以下に例示する。

　（ＲＮＡ抽出）
　試料から全ＲＮＡを抽出するときには、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン）を説明書通りに使用した。

　（目的ＲＮＡの精製）
　特定のＲＮＡの精製には、それぞれのＲＮＡと相補的なオリゴＤＮＡを使用した。
　本明細書では、以下の表のヒトｍｉＲＮＡについてそれぞれ相補的なオリゴＤＮＡを設計した。

　これらの標的ＲＮＡと相補的なＤＮＡ（捕捉オリゴＤＮＡ）を合成した。

　これらの捕捉オリゴＤＮＡが目的のＲＮＡ以外のＲＮＡとハイブリダイゼーションを起こす可能性が低いことを公知の配列データベースと照合することで確認した。

　（直接結合ビーズ）
　直接結合ビーズは以下のように作製した。上記捕捉オリゴＤＮＡの５’端のリン酸部分に６－アミノヘキシル基を導入した。それぞれの修飾捕捉オリゴＤＮＡを、２価のアミノクロスリンカー（ＢＳ３、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート）によって表面にアミノ基が共有結合した磁気ビーズ（Dynabeads　M270　Amine、サーモフィッシャーサイエンティフィック、東京）と連結させた。

　（ストレプトアビジン結合ビーズ）
　別のタイプのビーズも作製した。上記捕捉オリゴＤＮＡの５’端のリン酸部分にビオチンを導入した。表面にストレプトアビジンが共有結合している磁気ビーズ（Dynabeads　M270　Streptoavidin、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を、上記のビオチン化した捕捉オリゴＤＮＡと混合してアビジン－ビオチン結合を生じさせて、捕捉オリゴＤＮＡを磁気ビーズ上に固定した。

　また、ビオチン化した捕捉オリゴＤＮＡを目的のＲＮＡとハイブリダイズさせた後に磁気ビーズで精製するプロトコルも使用した。

　（直接結合ビーズのための精製プロトコル）
　このプロトコルは、J.Engbergら、Eur.J.Biochem,41,321-328(1974)の方法を改変したものである。

　複数種類の捕捉オリゴＤＮＡを使用する場合、試料を分割して、それぞれの分割試料に対して１種類の捕捉オリゴＤＮＡを使用した。

　具体的には、以下の通りである。
１．　試料に、上記捕捉オリゴＤＮＡ結合ビーズのうちの１種類と、６ｘＳＳＰＥ（０．９Ｍ　ＮａＣｌ、６０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、７．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）１０ｍＬを添加した。
２．　変性液Ｄ（４Ｍグアニジンチオシアネート、２５ｍＭクエン酸（ｐＨ７．０）、０．５％サルコシン、０．１Ｍ　２－メルカプトエタノール）５ｍＬを加えた（グアニジンチオシアネートの終濃度は１．２５Ｍ）。
３．　６０℃で１０分間加熱した後、室温で４５分旋回させた。
４．　磁石スタンドを使用して上清を除き、ビーズをBW　Buffer（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２．０Ｍ　ＮａＣｌ）１ｍＬで４回、Volatile　Rinse　Buffer（１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．０）１ｍＬで２回洗浄した。
５．　洗浄液を完全に除いた後、ビーズに、１００μＬのRNase　free　SDWを加えて７０℃で３分間加熱した後、氷上で急冷し、上清を回収した。
６．　濃度が低い場合には、上清を凍結乾燥した。
　（ストレプトアビジン結合ビーズのための精製プロトコル）

１．　精製ＲＮＡに塩類溶液および上記ビオチン化捕捉オリゴＤＮＡを添加して終濃度１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ　ＫＣｌとした。
２．　混合物をＰＣＲ装置にセットして、９０℃で１分間変性させ、４５℃まで徐冷してアニーリングさせた。
３．　アビジン磁気ビーズ（Dynabeads　M-280　Streptavidin）を添加した。
４．　磁気スタンド上で非吸着画分（上清）を破棄した。
５．　１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０、５０ｍＭ　ＫＣｌを用いて磁気スタンド上でビーズを３回洗浄した。
６．　１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）を用いて磁気スタンド上でビーズを３回洗浄した後、RNase　free　waterを用いて溶出した。
７．　濃度が低い場合には、上清を凍結乾燥した。

　（硫酸ジメチル処理）
　硫酸ジメチル処理を、以下に示す手順に従って反応を行った。精製したＲＮＡを１００μＭとなるように１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、それぞれ個別に溶解し、用時調整した１５％硫酸ジメチルのエタノール溶液を終濃度０．５％添加し、２５℃で１分処理を行った。終濃度２％となるようβメルカプトエタノールを添加し、十分に攪拌することで、反応を停止させた。

　（クロロアセトアルデヒド処理）
　クロロアセトアルデヒド処理を、以下に示す手順に従って反応を行った。精製したＲＮＡを１００μＭとなるように１０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ５）に、それぞれ個別に溶解し、終濃度１％となるようにブロモアセトアルデヒドあるいはクロロアセトアルデヒドを添加し、３７℃で２時間処理を行った。過剰のブロモアセトアルデヒドあるいはクロロアセトアルデヒドをジエチルエーテル抽出により除去した後、水層を乾燥させて残渣を得た。

　（精製ＲＮＡの質量分析測定）
　ＲＮＡ試料は、必要に応じてZip　Tip　C18（ミリポア）を使用して精製した。

　アセトニトリル：０．１％　ＴＦＡ水溶液＝１：１の溶液に３－ＨＰＡ（３－ヒドロキシピコリン酸）を１０ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、この溶液と１０ｍｇ／ｍＬのＤＨＣ（クエン酸二アンモニウム）水溶液とを１：１の比で混合した混合液１μＬをＭＡＬＤＩ用マトリクス（塗布剤）としてターゲットプレート（Target　Plate　MTP　Anchor　Chip　384(600micrometer）、Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｏｔｎｉｃｓ）に塗布し乾燥させた。この同じ位置に１μＬの精製したＲＮＡ水溶液を重層して乾燥させた。完全な乾燥を確認した後、ＭＡＬＤＩ型質量分析計（ultrafleXtreme-TOF/TOF質量分析計、Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｏｔｎｉｃｓ社製）にて質量分析を行った。

　ＭＡＬＤＩの装置設定は以下の通りであった。
ｐｏｓｉｔｉｖｅ－ｍｏｄｅ（陽イオン検出モード）
ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ－ｍｏｄｅ（反射モード）
Ｌａｓｅｒ　Ｐｏｗｅｒ　Ｍａｘ（設定可能な最大の出力）
　（質量分析計による測定結果の分析）

　ＭＡＬＤＩで得られた測定結果の分析は以下のように行った。
　予想される質量のリストを、miRBase(Release　21)（http://www.mirbase.org）から取得したマイクロＲＮＡの配列情報に基づいて作成し、測定で得られたマススペクトログラムと比較してマニュアルで配列および修飾を特定した。

　（ＲＩＰシークエンシング測定）
　ＲＩＰシークエンシングは、以下のプロトコルに従って実施した。
　１５ｃｍデッシュ３枚サブコンフレントの細胞を１サンプルとする場合のプロトコルである。１５ｃｍデッシュ１枚につき２ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（インビトロジェン）を使用して、１５ｃｍデッシュ３枚から５００μｇ～７００μｇのＲＮＡが回収できる。また、１ｍｌの血清につき２ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（インビトロジェン）を使用して、ＲＮＡが回収できる。
使用した試薬等

　（Ａ）ｐｌｏｙＡ　ＲＮＡの精製
　Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（登録商標）（タカラバイオ）キットのプロトコルに従いｐｌｏｙＡ精製を行った。
　＊抽出は７５℃のＤＷ　３０μＬで３回行い、合計９０μＬを回収した。
　＊全ＲＮＡから１～３％のｐｏｌｙＡ　ＲＮＡが得られる。
　＊１サンプルにつき、ｐｏｌｙＡ　ＲＮＡ　５μｇが必要。

　（Ｂ）ＲＮＡ断片化

１．　ＲＮＡを７５０ｎｇ／１８μＬに調節する。
２．　ＲＮＡ　７５０ｎｇ／１８μＬ＋１０ＸFragmentation　Buffer　２μＬの合計２０μＬを８連チューブの各ウェルに分けた。
３．　９０℃で２分間インキュベーションした。
４．　２０μＬの反応液に、素早くＥＤＴＡ（０．５Ｍ）２μＬを入れ、反応を止めた。
５．　反応液をサンプル毎に集め、エタノール沈殿を行った。
　例：ＲＮＡ　２００μＬ
　　　＋３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）２０μＬ（ＲＮＡの１／１０量）
　　　＋グリコーゲン（２０ｍｇ／ｍｌストック）３．６μＬ　（２００倍）
　　　＋１００％エタノール５００μＬ　　　　　　　（ＲＮＡの２．５倍）
６．　－８０℃で１時間インキュベーションした。
７．　遠心分離（１２０００Ｇ、３０分、４℃）
　　上清を除き、７５％エタノール１ｍを加えた。
　　遠心分離（１２０００Ｇ、１５分、４℃）
　　上清を除き、２００μＬのRNAse　free　waterで溶解した。
８．　各サンプル１０μＬをＩＮＰＵＴとして－８０℃で保存した。

　（Ｃ）ＲＮＡ抗体複合体の形成

以上を混合し、ローテーションしながら4℃で２時間インキュベーションした。

　（Ｄ）磁気ビーズによる免疫沈降
１．　Dynabeads　ProteinG（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を１サンプル
につき５０μＬ使用し、１ｘIP　Buffer　１ｍｌで２回洗浄した。
２．　磁気で分離したビーズに１ｘIP　Buffer　１ｍｌ＋ＲＶＣ　１０μＬ＋RNAse　inhibitor　１μＬ＋ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）５０μＬを加え、ローテーションしながら４℃で２時間インキュベーションした（ビーズの非特異的結合の抑制）。
３．　ビーズを、１ＸIP　Buffer　１ｍｌ＋ＲＶＣ　１０μＬ＋RNAse　inhibitor　１μＬで２回洗浄した。
４．　サンプル毎に分け、磁気で分離したビーズにステップ（Ｃ）の反応液を加え、ローテーションしながら４℃で２時間（または一晩）インキュベートした。

　（Ｅ）溶出
１．　洗浄バッファー（１ＸIP　Buffer　１０ｍｌ＋ＲＶＣ　１０μＬ＋RNAse　inhibitor　５μＬ）で、ステップ（Ｄ）のビーズを３回洗浄した。

２．　Elution　bufferを１サンプルにつき１００μＬ加え、１５分毎にボーテックスしながら、４℃で２時間インキュベートした。
３．　ビーズを磁気分離し、上清を回収した。
４．　ビーズにさらに、（１ＸIP　Buffer　１ｍｌ＋ＲＶＣ　１０μＬ＋RNAse　inhibitor　１μＬ）から１００μＬを加えてタッピングし、ビーズを磁気分離し、上清を回収した。
５．　上の５～７のステップを繰り返し、上清を回収し、２回分を合わせた。
６．　上清４００μＬ＋酢酸ナトリウム４０μＬ＋１００％エタノール１０００μＬを混合し、エタノール沈殿を行った。（グリコーゲンなどのキャリアは加えない）
７．　－８０℃で一晩静置した。
８．　遠心分離（１２０００Ｇ、３０分、４℃）
　　　上清を除き、７５％エタノール１ｍｌを加えた。
　　　遠心分離（１２０００Ｇ、１５分、４℃）
９．　ペレットを１５μＬのRNAse　free　waterで溶解した。
ステップ（Ｂ）の８のＩＮＰＵＴとともにシークエンシングに供した。

　シークエンシングはHi-seq（2000　Ilumina）を使用して実施した。

　ＲＩＰシークエンシングで得られたデータを分析するプロトコルを以下に示す（Ｌｉｎｕｘ／Ｒ）。

　（ｆａｓｔｑファイルからピークの検出まで）
　ＳＲＡ　Ｔｏｏｌｋｉｔ、ｂｏｗｔｉｅ、ｓａｍｔｏｏｌｓ、ｍａｃｓをインストールし、ｈｇ１９のアノテーションファイルをダウンロードした（ＤＲＹ解析教本（秀潤社）などを参照）。

　データのクオリティチェックを行い、ＩＰ、ＩＮＰＵＴのデータをまとめた。例えば、免疫沈降サンプル（ＩＰ１、ＩＰ２、ＩＰ３：３つのレプリケート）と、それに対応するＩＮＰＵＴ（ＩＮＰＵＴ１、ＩＮＰＵＴ２、ＩＮＰＵＴ３）があった場合には以下の通りである。

　ｆａｓｔｑファイルをｂｏｗｔｉｅでマッピングし、ｓａｍファイルを作成し、ｓａｍファイルからｂａｍファイルを作成した。

　データを染色体順でソートし、インデックスをつけ、ｍａｃｓでピークを検出した。

　（Ｒによるピークの分析）
　以下のパッケージを使用した。
(Guitar)
(MeTPeak)
(openxlsx)
(ChIPpeakAnno)
(BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg19)
(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)
(rGADEM)
(ChIPseeker)

　（１．ｍａｃｓの出力エクセルファイルからのｍｅｔａｇｅｎｅ　ｐｌｏｔ）
　ｈｇ１９から、トランスクリプトームの情報だけ取り出し、ｇｃ＿ｔｘｄｂに格納し、エクセルは読み込めない上部を削除して、ｘｌｓからｘｌｓｘに変換して保存した。

　倍数変化が４倍以上かつＦＤＲ５％以下のものを有意なピークとして抽出し、ファイルをＧｒａｎｇｅｓファイルに変更した。

　Ｇｒａｎｇｅｓファイルをつなげてリスト化し、リストの各要素に名前をつけた。

　（２．モチーフ検索）
　サミットから前後５０塩基、合計１００塩基を抽出し、モチーフ検索に供し、ＦＤＲの低い方から１０００個を選択した。

　ファイルをＧｒａｎｇｅｓファイルに変更した。

　ＣｈＩＰｐｅａｋＡｎｎｏパッケージで配列を取得した。

　（３．ピークがある遺伝子のアノテーションを得る）

（４．ＭｅｔＰｅａｋ（ＲＩＰシークエンシングに特化した分析パッケージ）による分析）
　（Cuiら、Bioinformatics(2016)32(12):i378-i385を参照）

　（実施例１）マイクロＲＮＡのメチル化分析
　本実施例では、マイクロＲＮＡのメチル化分析を行った。具体的には以下のとおりである。

　メチル化アデニンとメチル化シトシンを含むように合成したマイクロＲＮＡ２００－ｃ－５ｐ（ヒト配列、配列番号11）をRNase　Free超純水に溶解し吸光度測定により濃度を確認し、１ｐｍｏｌ／μＬに調整した。このマイクロＲＮＡ水溶液１μＬを使用し、上記のプロトコルに従いＭＡＬＤＩ型質量分析計にて質量分析を行った。内部配列確認のためアンモニア処理によるＲＮＡ分解（５’→３’）を行った。また、観測されたプリカーサーイオンに対して、in　source　decay（インソース分解、ＩＳＤ）を用いた測定を実施した（図１）。

　マイクロＲＮＡ３６９－３ｐと相補的な配列を有する合成オリゴＤＮＡ（ヒト３６９－３ｐの相補鎖、配列番号12）と、そのアンチセンスの合成ＤＮＡ（配列番号13）を同じモル数ずつ混合し、加熱した後、徐冷することでアニールさせ、ＤＮＡ２本鎖を形成させ、濃度を１ｐｍｏｌ／μＬに調整した。また、それぞれ単独も同様に調製した。上記と同様に、質量分析を行い、ＤＮＡそれぞれの鎖のプリカーサーイオンを観察して全体の質量を確認し、ＩＳＤを行った。ＤＮＡのそれぞれの鎖単独の場合と同様に２本鎖状態でもそれぞれの鎖の識別および配列決定が可能であることを確認された（図２）。

　合成マイクロＲＮＡ３６９－３ｐ（ヒト、配列番号14）から形成させた二本鎖についても同様の分析を行った。ＲＮＡ二本鎖からでも配列決定が可能であることを確認した（図３）。

　生体内のＲＮＡも同様に質量分析によって配列決定可能であることを確認するために次の実験を行った。ＨＥＫ２９３培養細胞からＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン）を使用して小分子ＲＮＡ画分を取得した。得られたＲＮＡ画分をRNase　Free超純水に溶解して、吸光度測定により濃度を確認した後、濃度を１００ｐｍｏｌ／μＬに調整した。上記と同様に、質量分析を行い、プリカーサーイオンを観察することでｍｉＲＮＡ３６９－３ｐ（ヒト）に相当する質量数の親イオンを同定し、そのプリカーサーイオンに対してＩＳＤを適用して内部配列を確認したところ、ｍｉＲＮＡ３６９－３ｐであることが確認された（図４）。このように、特異的な配列を精製しなくとも特定のＲＮＡを観察可能であり得る。

　以上のように、適当な質量分析法とＲＮＡ精製を組み合わせて、ＲＮＡ修飾を分析可能であることが確認された。

　（実施例２）ＲＮＡ修飾を利用したがんの分析
　本実施例では、がんがＲＮＡ修飾に及ぼす影響を分析し、ＲＮＡ修飾を用いることにより癌を検出または診断することができることを実証した。

（実施例２－１：細胞株におけるＲＮＡ修飾分析）
　ヒト膵臓がん細胞株であるＢｘＰＣ３、Ｐａｎｃ１０．５、ＰＳＮ１およびＣａｐａｎ２をAmerican　Type　Culture　Collection(Manassas,　VA,　USA)から入手した。これら４つの株についてそれぞれ抗ｍ６Ａ抗体を使用したＲＩＰ－Ｓｅｑによるメチル化ｍｉＲＮＡ分析を行ったところ、４つの膵臓がん細胞株に共通するメチル化ｍｉＲＮＡとして以下の表に示す６３種類が見出された。

　これらのｍｉＲＮＡのメチル化はがん（例えば、膵臓がん）の判定に有用に使用され得る。

　（実施例２－２：大腸がん）
　事前にインフォームド・コンセントを得たヒト患者よりステージ２～４の原発巣のみの大腸がん（３名）の組織検体を手術時に採取した。同時に、健常組織として悪性腫瘍領域から５ｃｍ以上離間した領域から組織検体を採取した。

　上記の捕捉１７－５ｐ、捕捉２１－５ｐ、捕捉２００ｃ－３ｐ、捕捉２００ｃ－５ｐおよび捕捉ｌｅｔ７ａ－５ｐを、ストレプトアビジン結合ビーズとして製した。上記組織検体試料からＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡを生成し、その後、ビーズを使用して標的ｍｉＲＮＡを精製し、ultrafleXtreme-TOF/TOF質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｏｔｎｉｃｓ）で測定した。

　その結果、これらのｍｉＲＮＡについて非メチル化ＲＮＡが観察されるとともに、表に示す位置でメチル化が起こっているＲＮＡも観察された。

　これらのそれぞれのメチル化の根拠となるＭＳシグナルを正常組織と腫瘍組織との間で比較した（図５～７）。その結果、正常組織と腫瘍組織とでＲＮＡのメチル化状態に差があることが見出された。これらのシグナル強度に基づいて、対象の配列の各ＲＮＡの中のメチル化ＲＮＡの割合（％）を計算した結果を、以下の表に示す。

　また、ｑＲＴ－ＰＣＲによりＲＮＡの発現量分析を行った。ｑＲＴ－ＰＣＲは以下のように実施した。TaqMan　microRNA　reverse　transcription　kitおよびTaqMan　microRNA　assays（Applied　Biosystem）を、製品プロトコルに従って使用した。ＰＣＲマスターミックスとしてTHUNDERBIRD　SYBR(登録商標)qPCR　Mix（東洋紡）を用いた。ｑＲＴ－ＰＣＲのための装置としてLightCycler（登録商標）システム(Roche)を使用した。

　ｑＲＴ－ＰＣＲにより上記ｍｉＲＮＡのそれぞれの発現量を正常組織と腫瘍組織との間で比較した。各ｍｉＲＮＡについて、上記のメチル化率（ＭＳ）と発現量との結果を比較した（図８）。

　その結果、これらのｍｉＲＮＡの発現量は正常組織と腫瘍組織との間で差がほとんど見られなかったのに対して、メチル化率（ＭＳ）における差は顕著であった。そのため、ＲＮＡのメチル化率（ＭＳ）は、発現量（ＲＴ－ＰＣＲ）より、有用なマーカーとなり得ることが示された。

　さらに、ｍｉＲ－２００ｃ－５ｐに関して、内部配列確認のためアンモニア処理によるＲＮＡ分解（５’→３’）を行い、質量分析を行った（図９）。図９に示すように、質量分析法によって特定のＲＮＡの特定の位置における修飾を正確に決定可能であることが確認された。

　ヒト大腸がん患者からサンプルを取得して、４種類のｍｉＲＮＡ上のメチル化率を調べた。これらの患者は、大腸がんと診断され、原発腫瘍切除手術を受けた後、１から２年後までに転移が見出された。転移は肝臓およびリンパ節に見出された。Beforeは原発腫瘍切除前の患者から取得した血清サンプルである。Afterは、原発切除後１から２年後までの間で転移が見つかった際に取得した血清サンプルである。

　これらのBeforeおよびAfterのサンプル、ならびに炎症性腸疾患（ＩＢＤ）およびクローン病（Ｃｒｏｈｎ）患者由来血清のサンプルについて、共通プロトコルの通り、質量分析によってのメチル化のレベルを分析した（図１０）。

　体内にがん細胞が存在しない状態(After、IBDおよびCrohn)では、がん細胞が存在する状態(Before)に比べてメチル化が低下していた。これらのｍｉＲＮＡのメチル化が高度であることは、がん（例えば、大腸がん）の指標となり得る。

　（実施例２－３：膵臓がん）
　生体メチル化検出
　膵臓がん組織において、共通プロトコルの通り、抗ｍ６Ａ抗体を使用したＲＩＰ－Ｓｅｑによってメチル化ｍｉＲＮＡを同定した。メチル化が検出されたｍｉＲＮＡのうちＬｅｔ－７ａおよびｍｉＲ－１７についてさらに解析を行った。
　膵臓がん組織試料に対して、上記のＬｅｔ－７ａおよびｍｉＲ－１７用の捕捉ビーズで目的のｍｉＲＮＡを濃縮し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳによりメチル化を検出した（図１１）。その結果、メチル化の位置が決定され、メチル化量の定量も可能であった。

　次に、ｌｅｔ－１７ａ、ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－２１、およびｍｉＲ－２００ｃについて、膵臓がん組織または膵臓がん患者血清中のメチル化レベルを、種々の対照試料（正常組織、正常被験体、手術によるがんの除去）におけるメチル化レベルと比較した。なお、定量的逆転写ＰＣＲを行ったところ、ｍｉＲＮＡ発現レベルの差は検出されなかった。それぞれのｍｉＲＮＡ用の捕捉ビーズで目的のｍｉＲＮＡを濃縮し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳによりメチル化を検出した（図１２～１５）。膵臓がん組織においてｌｅｔ－１７ａ、ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－２１、およびｍｉＲ－２００ｃのメチル化レベルおよびメチル化位置が検出できた。
　膵臓がん試料におけるこれらのｍｉＲＮＡのメチル化レベルは、正常組織、正常被験体、および手術によるがんを除去した後の被験体のいずれの対照試料と比較しても上昇していた（図１６、１７）。
　これらのｍｉＲＮＡのメチル化が高度であることは、がん（例えば、膵臓がん）の指標となり得る。

　（実施例２－３Ａ：早期膵臓がん）
　本実施例では、１７名のヒト膵臓がん患者から採取した血清検体を用いてＲＮＡ修飾状態を調べた。これらの膵臓がんは、ステージＩ～ＩＩと診断された早期膵がん（４名がステージＩＡ、５名がステージＩＩＡ、７名がステージＩＩＢ）であった。正常検体として、健常者の血清検体を使用した。

　上記の捕捉１７－５ｐ、捕捉２１－５ｐ、捕捉２００ｃ－３ｐ、捕捉２００ｃ－５ｐおよび捕捉ｌｅｔ７ａ－５ｐの直接結合ビーズを使用した。上記血清検体からＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡを精製し、その後、ビーズを使用して標的ｍｉＲＮＡを精製し、ultrafleXtreme-TOF/TOF質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｏｔｎｉｃｓ）で測定した。

　全ての膵がんの血清検体においてｍｉＲ－１７－５ｐのメチル化が検出されたが、正常検体からはこのメチル化は検出されないか、またはメチル化の程度が低かった。

　また、既存の膵がんマーカーであるＣＡ１９－９およびＣＥＡによる判定結果と比較して、ｍｉＲ－１７のメチル化の程度は、膵がんの検出においてより正確な指標となり得ることが示された。

　mRNAの８割以上がm6Aの修飾を受けており、さらにModomics（http://modomics.genesilico.pl/）にはＲＮＡ修飾の情報を多数収載されている。これに加え、本発明者らの開発した網羅性の高いＲＩＰシークエンシングによれば、少なくとも過半数、また頻度を問わなければ全アデニンの中でメチル化酵素に結合するものは、全てメチル化・脱メチル化を受ける可能性があると考えられる。本発明者らは、消化器のがんで重要と考えているマイクロRNAの中から５０種類についてメチル化状態を調べ、４種類のマイクロRNAが膵がんを含む消化器のがんの早期段階で重要であることが明らかとなった。他の疾患についても、同様にRNAの修飾情報は、その状態を反映するものであると考えられる。

　このように、健常者と比較して早期膵臓がん患者で有意に相違することが本実施例で明らかになった。

　（実施例２－５：他のがん試料）
　本実施例では、他のがん試料の分析を行った。
　実施例２－２と同様の手法を用いて、種々のがん試料について実施例２－３のＲＮＡの範囲において、メチル化を分析した。事前にインフォームド・コンセントを得たヒト患者より胃がん（４名）の組織検体を手術時に採取した。同時に、健常組織として悪性腫瘍領域から５ｃｍ以上離間した領域から組織検体を採取した。

　上記の捕捉１７－５ｐ、捕捉２１－５ｐ、捕捉２００ｃ－３ｐ、捕捉２００ｃ－５ｐおよび捕捉ｌｅｔ７ａ－５ｐを、ストレプトアビジン結合ビーズとして製した。上記試料からＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡを生成し、その後、ビーズを使用して標的ｍｉＲＮＡを精製し、ultrafleXtreme-TOF/TOF質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｏｔｎｉｃｓ）で測定した。

　胃がんにおける結果を示す（図１８）。実施例２－２と同様に、胃がんにおいてもマイクロＲＮＡのメチル化率（ＭＳ）は、胃がんの診断の有用なマーカーとなり得ることが示された。

　結腸直腸がん患者における結果を示す（図１９）。それぞれの患者は、以下の通りであった。
結腸直腸がん患者の特徴付け

*Tumor-node-metastasis(TNM)分類は、TNM　staging　of　the　Union　for　International　Cancer　Control(https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/f_guidelines.asp)の第7版に従った。
　結腸直腸がん患者における結腸直腸がん組織および正常結腸直腸組織の間でｍｉRNAのメチル化を比較した。早期大腸がん(StageI)と進行期大腸がん(StageIV)では正常部に比べてメチル化が亢進していることがわかった。
　このように、RNAの修飾を観察することで、がん（例えば、大腸がん）の進行の程度が予測され得る。

　また、事前にインフォームド・コンセントを得たヒト患者より肝臓がん、胆嚢がんについても同様の実験を行い、統計解析するのに十分な数を得て行ったところ、同様の結果を得ることができた。

　（実施例２－７）
　ＣＴＣ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ）の分析
　ＣＴＣ試料を実施例２－３と同様の手法を用いて、このＣＴＣ試料について全てのマイクロＲＮＡのメチル化を分析する。

　（実施例３）ＲＮＡ修飾を用いた耐性株の分析
　本実施例では、ＲＮＡ修飾を用いて耐性株が分析できることを実証した。

　（実施例３－１：耐性株の作製（Chm^Rcell））
　本実施例では、耐性株（Chm^Rcell）を作製した。
　ATCC、RIKENなどの細胞バンクから入手したがん細胞株ＤＬＤ－１をトリフルリジン（ＦＴＤ）（Aldrich-Sigma）（約１０ｍｇ／ｍＬ）の存在下で６ヶ月以上維持培養した。維持培養は、プラスチックディッシュ上で血清１０％添加ＤＭＥＭ培地において、３７℃で、６０～８０％コンフエント状態を維持するように、週に約２回継代を行った。この培養細胞についてトリフルリジンに対するＩＣ_５０を計測した結果、ＩＣ_５０＝３００μｍｏｌ／Ｌという結果が得られ、トリフルリジン耐性株の確立が確認された。

　同様にして、ＡＴＣＣ、ＲＩＫＥＮなどの細胞バンクから入手したがん細胞株ＨＣＴ１１６、ＲＫＯなどから、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ゲムシタビン、シスプラチン、核酸医薬、ヒストン脱メチル化酵素阻害剤、セツキシマブ（抗体医薬）、Carbon/HIMAC（重粒子線）、X線の耐性株を作製した。上記薬物は、Aldrich-Sigmaから購入し、約１０ｍｇ／ｍＬで使用した。６ヶ月以上培養して耐性株を確立した。各薬物について、ＩＣ_５０＝３００μｍｏｌ／Ｌという結果が得られ、それぞれの耐性株の確立が確認された。X線源としてリニア型のGammacell（登録商標）40　Exactor(Best　Theratronics　Ltd.)を使用し、約０～１０Gyの線量で処理し、Carbon/HIMACの線源は放射線医学総合研究所のHIMACを使用し約０～１０Gyの線量で処理した（Katsutoshi　Satoら、Cancer　Sci.2017　Oct;108(10):2004-2010およびKatsutoshi　Satoら、Sci　Rep.2018;8:1458を参照のこと）。

　（実施例３－２：耐性株のＲＮＡ修飾分析）
　本実施例では、耐性株のＲＮＡ修飾分析を行った。

　オリジナルのＤＬＤ－１細胞株および各耐性株（５－ＦＵ耐性株およびＦＴＤ耐性株）について、それぞれ、上記のＲＩＰシークエンシングのプロトコルに従うＲＮＡメチル化分析およびマイクロアレイまたは実施例２－２のｑＲＴ－ＰＣＲと同様のｍＲＮＡ発現分析を行った。

　測定の結果、合計で１０２４種類のマイクロＲＮＡ上にメチル化が観察された。代表的な例を以下の表に示す。

　また、以下の表のｍｉＲＮＡのメチル化が特に注目される。

　個別のマイクロＲＮＡについて、例えば、ｍｉＲ－３７８ａのメチル化は、トリフルリジン耐性株では減少したのに対して、５－ＦＵ耐性株では増加した。耐性株におけるこのようなＲＮＡ上の修飾情報を使用して、例えば、患者にある薬物を投与した場合に、その後、耐性を生じることなく同じ薬物を継続して使用することができるかどうかなどの予測を行うことができる（例えば、５－ＦＵ投与後にｍｉＲ－３７８ａのメチル化が上昇した場合には、５－ＦＵに対して耐性となる可能性があるという予測）。

　ＲＩＰシークエンシングおよびＲＮＡ発現情報に基づいて主成分分析（分散が最大となる成分を用いて２次元に射影）を行った。結果は、３つの独立した実験に基づく平均±標準偏差（ＳＤ）として表される。結果の統計的有意性は、Microsoft　Excel（登録商標）ソフトウェア（Microsoft　Campus、Redmond、WA、USA）上のＲバージョン３．４．３（
２０１７－１１－３０）を用いたペアワイズＴ－ＴＥＳＴによって評価した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。その結果、野生株および各耐性株は明確に区別され、また、ＲＮＡ修飾状態は、ＲＮＡ発現状態よりも緊密に耐性株の特徴を表していることが示唆された（図２０）。

　次に、メチル化部位およびその周辺配列に基づいて、モチーフ解析を行い、メチル化関連酵素との相関を調べた（下の表）。その結果、いくつかのマイクロＲＮＡが、Ｍｅｔｔｌ３、Ｍｅｔｔｌ１４およびＹＴＨＤＦ１に強く相関することが示唆された。このようなモチーフ解析の結果に基づいて、ＲＮＡ修飾と他の生体因子との相互関係を明らかにして、ネットワーク解析を行うことができ、演繹的に生物の状態を分析するのに利用できる。

　解析の結果、以下に示すｍｉＲＮＡ上のメチル化が特にFTD耐性を評価するためのバイ
オマーカーとして好適に使用され得ることが示唆された。

　（実施例４）ＲＮＡ修飾による処置の影響の分析
　本実施例では、手術、治療や予防などの処置がＲＮＡ修飾に及ぼす影響を分析し、ＲＮＡ修飾の分析により手術、治療や予防などの処置が及ぼす効果を分析した。

　（実施例４－１：ＲＮＡ修飾を用いた手術の影響の分析）
　本実施例では、手術がＲＮＡ修飾に及ぼす影響を調べた。

　オリジナルのＤＬＤ－１細胞株および各耐性株（５－ＦＵ耐性株およびＦＴＤ耐性株）からＴｒｉｚｏｌ（インビトロジェン）のプロトコルに従って全ＲＮＡを精製し、その後、上記のＲＩＰシークエンシングのプロトコルに従うＲＮＡメチル化分析を行った。ここで、ｒＲＮＡの除去には、Ribo-Zero　rRNA　Removal　Kit(Illumina)を使用した。

　The　Cancer　Genome　Atlas(TCGA)（https://cancergenome.nih.gov/）からｍｉＲＮＡの発現情報を取得し、手術後に１／２以下の発現量となるものを以下の通り選択した。

　これらの術後に減少するｍｉＲＮＡについて、薬物耐性で変化することが観察されたｍｉＲＮＡメチル化情報との関係を以下の表に示す。

　術後に減少するｍｉＲＮＡでは、そのメチル化状態が薬物耐性に伴って大きく変化し得ることが観察された。

　また、これらの術後に減少するｍｉＲＮＡ上に、一般的なメチル化モチーフＲＲＡＣが見出されるかどうかを調べたところ以下の部位にメチル化の可能性があることが見出された。

＊表中、ＲＲＡＣモチーフ、およびモチーフと一塩基ミスマッチの配列におけるアデニンを下線で示す。

　さらに、The　Cancer　Genome　Atlas(TCGA)（https://cancergenome.nih.gov/）から膵臓腺癌（ＰＡＡＤ、ｎ＝４、図２１）、直腸腺癌（ＲＥＡＤ、ｎ＝３、図２２）、胆管癌（ＣＨＯＬ、ｎ＝９、図２３）および結腸腺癌（ＣＯＡＤ、ｎ＝８、図２４）におけるｍｉＲＮＡの発現データを取得し、その中で術後に減少するｍｉＲＮＡの発現を、正常部および癌部（同一患者）の間で比較した。

　以上のように、ＲＮＡ修飾情報に基づいて、がん、手術および薬物耐性の関連性を分析することができた。このような分析により、ＲＮＡ修飾情報に基づいて、手術の切除範囲、術後の薬物療法、放射線療法の強さ（レジメン）、および再発リスクの観点から退院後のフォローアップを決定することが可能であることが予測される。また、ＲＮＡ修飾情報に基づいて、処置の必要な患者を選択すること可能であることが予測される。

　上の結果から、メチル化ｍｉＲＮＡとして、特に、ｍｉＲ－３１３１、ｍｉＲ－３６９０、ｍｉＲ－６８８７－５ｐ、ｍｉＲ－６８８７－３ｐ、ｍｉＲ－３７８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－４４３５およびｍｉＲ－４４６７が好適に使用され得ることが示唆された。

　（実施例４－２：他の処置の分析）
　本実施例では、他の処置がＲＮＡ修飾に及ぼす影響を分析し、同様に他の処置の分析が可能かどうかを分析する。例えば、温度、低酸素（例えば１％、＋１９％は窒素置換）、低栄養（グルコース、グルタミン、アミノ酸の欠乏）、温度（３２度～４２度の範囲）など、低酸素であれば１％、＋１９％は窒素置換など）を分析することができる。

　５－ＦＵ、ゲムシタビン、シスプラチン、上記の核酸医薬、上記のヒストン脱メチル化酵素阻害剤、セツキシマブ（抗体医薬）、Carbon/HIMAC（重粒子線）、およびX線による処置の前後でＲＮＡ修飾がどのように変化するのかを調べることができる。

（実施例５：ＲＮＡ修飾による影響）
（実施例５－１：ＲＮＡメチル化がＲＮＡ－タンパク質間相互作用に及ぼす影響）
　ＲＮＡメチル化がＲＮＡ－タンパク質間相互作用に及ぼす影響を検討した。
　分子ダイナミクスシミュレーション
　メチル化および非メチル化ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－２００ｃ、ｌｅｔ－１７ａ、ｍｉＲ－１７）のヒトＡＧＯ２タンパク質への結合を予測するために、ＡＧＯ２／ＲＮＡ複合体のＸ線構造をガイドとして使用した（ＰＤＢ　ＩＤ：４ＯＬＢ^２５および４Ｗ５Ｎ^２６）。最初に、ＲＮＡ結合塩基を各ｍｉＲＮＡ中の対応する塩基と置換した。各ｍｉＲＮＡ複合体構造について、１気圧および約３７℃条件下で分子ダイナミクスシミュレーションを実施した。熱力学的サンプリングの後、構造のドッキングを予測するためにエネルギー最小化を実施した。全ての計算は、Ａｍｂｅｒ１２プログラム（ｈｔｔｐ：／／ａｍｂｅｒｍｄ．ｏｒｇ／）を用いて行った。結果を図２５～２７に示す。

　図２５において、ｍｉＲ－２００ｃでは、９位のメチル化シトシンはＲＮＡの認識塩基に近接していた。ＡＧＯ複合体中のメチル化および非メチル化ｍｉＲ－２００ｃの最初の６つのヌクレオチドの間には大きな相違はなかったが、メチル化部位の周辺では、ＡＧＯとｍｉＲＮＡとの間の結合相互作用の変動が観察された。これによりメチル化部位の周囲のスペースが減少した。また、９位のシトシンのメチル基がおそらく立体障害によりＡＧＯのＳｅｒ２２０との水素結合を妨害し、８位のグアニンの位置のシフトをもたらした。これは、ＡＧＯのＡｒｇ７６１との相互作用によって引き起こされたものとも考えられる。

　図２６、２７において、ｍｉＲ－１７およびｌｅｔ－７ａでは、メチル化アデニンはＲＮＡ結合部位から離れて位置していた。しかし、アデニンメチル化は、ＲＮＡ認識部位周辺を含め複合体全体に大きな構造的変化をもたらし、これは標的ＲＮＡ認識効率に影響を与え得る。これらの知見は、ｍ６Ａ修飾が生じることで、ｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡ翻訳抑制能力が低下され得ることを示している。

（実施例５－２：ＲＮＡメチル化が生体に及ぼす影響）
　ＲＮＡメチル化が実際に生体に及ぼす影響を検討した。
　合成オリゴヌクレオチドのトランスフェクション
　メチル化および非メチル化二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｍｉＲ－２００ｃ、ｌｅｔ－７ａ）を、ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ（大阪、日本）に依頼して合成した。これらの合成ＲＮＡの配列はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ／ＭＳにより確認した。ｍｉＲＮＡ配列は、ｍｉＲＢＡＳＥ（ｒｅｌｅａｓｅ　２１；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）から入手した。メチル化または非メチル化合成ｍｉＲＮＡを、製造者のプロトコルに従ってリポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて内因性ｍｉＲＮＡの発現レベルが非常に低いＤＩＣＥＲエクソン５破壊大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ＨＣＴ１１６^ＥＸ５）（Bert　Vogelstein(Johns　Hopkins　University,　Baltimore,　MS,　USA)から譲り受けた）にトランスフェクトした。

　発現データ解析
　Ｔａｒｂａｓｅ１４（ｈｔｔｐ：／／ｄｉａｎａ．ｉｍｉｓ．ａｔｈｅｎａ－ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ．ｇｒ／ＤｉａｎａＴｏｏｌｓ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｒ＝ｔａｒｂａｓｅ／ｉｎｄｅｘ）に報告されているそのｍＲＮＡがｍｉＲ－２００ｃ、ｌｅｔ－７ａに結合する遺伝子を、標的遺伝子として用いた。ｍｉＲ－２００ｃについては、マイクロアレイによって観察された標的遺伝子の発現レベルを比較した（図２８）。ｌｅｔ－７ａについては、配列から推定して１００万リードあたりのエクソンのうちのキロベースあたりのリードについて同様に分析した（図２９）。
　遺伝子発現プロファイリングによって、非修飾ｍｉＲ－２００ｃおよびｍ５Ｃ修飾ｍｉＲ－２００ｃは強力な遺伝子抑制効果を示すが、ｍ６Ａ修飾ｍｉＲ－２００ｃの遺伝子発現抑制効果は弱く、非メチル化ｌｅｔ－７ａと比較して、ｍ６Ａ修飾ｌｅｔ－７ａは標的ｍＲＮＡ発現を減少させないことが分かった。

　以上のように、ＲＮＡの修飾状態が生体の状態に影響を及ぼすことが確認され、このことから、ＲＮＡの修飾状態は、生体の状態を反映するものであり、これを調べることで生体の状態が予測されることが裏付けられた。

　（実施例６：ＲＮＡ修飾を用いた遺伝子のノックダウン分析）
　本実施例では、ＲＮＡ修飾を用いて遺伝子のノックダウン分析をしうるかどうかを分析した。

　（実施例６－１）Ｍｅｔｔｌ３のノックダウンがＲＮＡ修飾に及ぼす影響
　本実施例では、ＲＮＡ修飾を用いて遺伝子のノックダウン分析をしうるかどうかを分析した。ヒト膵臓腺癌細胞株ＭＩＡ　ＰａＣａ－２細胞を、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを使用した標準的な方法で処理してＭｅｔｔｌ３ノックダウン細胞株を作製した（Kosuke　Taketoら、Int　J　Oncol.2018　Feb;52(2):621-629を参照のこと）。その後、ＲＩＰシークエンシングを行った。

　（実施例６－２）Ｍｅｔｔｌ３過剰発現の影響
　マウスのＭｅｔｔｌ３遺伝子をCAG発現ベクターに組み込み、これをＢＬ６マウスの受精卵に注入して仮親の子宮に移植してＭｅｔｔｌ３遺伝子の過剰発現マウスを作製した。マウスの膵臓酵素遺伝子の下流にウイルスタンパク質SVを繋いだベクターを作製し、これをＢＬ６マウスの受精卵に注入して仮親の子宮に移植して膵臓のＰ５３およびＲＢが不活性化したＥＬ１－ＳＶ４０マウスを作製した。このように作製したＭｅｔｔｌ３遺伝子過剰発現マウスと、ＥＬ１－ＳＶ４０マウスとを通常の方法で掛け合わせてダブルトランスジェニックマウスを作製した。その後、PCRなどによってこのダブルトランスジェニックマウスに、目的の遺伝子が組み込まれていることを確認した。マウスの飼育は、通常の動物実験施設においてＳＰＦ環境で行った。

　これらのマウスでは腫瘍が自然発生的に生じるが、このダブルトランスジェニックマウス（１０匹）と、ＥＬ１－ＳＶ４０マウス（１０匹）とについて、生存を観察した（図３０）。写真（図３１）は、２０週齢時点でのそれぞれのマウスから摘出した腫瘍を示す（左：ＥＬ１－ＳＶ４０マウス、右：ダブルトランスジェニックマウス）。ダブルトランスジェニックマウスでは、腫瘍の増殖がより速く、マウスの生存率が低かった。

　Ｍｅｔｔｌ３はＲＮＡメチル化酵素であるが、これらの結果から、１）ＲＮＡ修飾（エピトランスクリプトーム）はがんの発症・進行において重要な役割を果たすこと、２）がんへの寄与が大きいと従来考えられていた遺伝子（Ｐ５３、ＲＢ）における変化よりも、ＲＮＡ修飾の変化がより大きくがんに影響を及ぼすことが明らかとなった。なお、上記実施例において示されるように、ＲＮＡ修飾はｍＲＮＡの修飾だけに限定されず、同じ酵素によってｍｉＲＮＡにも修飾が起こるので、ｍｉＲＮＡ（例えば血中に存在する）をモニターすることにより、体の深部の細胞におけるエピトランスクリプトームをモニターすることができる。そのため、この結果は、ＲＮＡ修飾自体のバイオマーカーとしての重要性を支持するだけでなく、液体生検のバイオマーカーとしてのマイクロＲＮＡの重要性も示している。

　（実施例７）疾患とＲＮＡ修飾との関連
　本実施例では、がん、認知症、心不全、炎症性腸疾患、老化、腸管免疫の試料において、ＲＮＡ修飾分析を行う。その結果、ＲＮＡ修飾情報がこれらの状態の予測に有用であることが示される。
　これらの分析のために、例えば、
　（１）代謝の鍵酵素であるプロテインキナーゼＭ（PKM）の遺伝子操作による脳内の酸化的リン酸化反応によるアルツハイマー型認知症のモデルであるマウス、
　（２）消化器のがん抑制遺伝子の操作によるモデルで、消化管を含む消化器臓器において、老化や炎症の結果、免疫との相互作用で生じるマウス、を用いて、糞便中のマイクロフローラからリボゾームRＮＡ等のメチル化を調ベる、
　（３）がん代謝に関わる遺伝子の改変マウスなどの糞便の調査
などを行うことができる。

　（実施例８）ＲＮＡ修飾による薬剤スクリーニング
　本実施例では、ＲＮＡ修飾による薬剤スクリーニングが可能であることを実証する。

　細胞株を、任意の化合物ライブラリーで処理する。これらの細胞のＲＮＡ修飾を分析する。ＲＮＡ修飾情報に基づいて、これらの化合物を分類すると、化合物の一部は１つのクラスターを形成し、分析することができる。これは、上記実施例において各薬剤での耐性株でのコンセプトを参照することによって、化合物ライブラリーのスクリーニングに応用することができる。例えば、実施例４の記載を適宜参酌することができ、これに加え、バイオプシーから、悪性度の判定。細胞診からがんの診断。悪性度の判定。原発不明がんの診断、治療。あらたな薬剤標的の探索を行うことができる。

　（実施例９）大腸菌のＲＮＡ修飾分析
　本実施例では、ＲＮＡ修飾分析を用いた大腸菌の分類が可能かどうかを実証する。

　例えば、ある大腸菌株について、ＲＮＡ修飾を分析する。ＲＩＰ－シークエンシングを行った。また、薬剤耐性ポンプＰ－糖蛋白の遺伝子情報も併せて使用することができる。
　ＲＮＡ修飾情報を利用することで非常に容易に微生物の種分類が可能であることが見出される。
　また、マウスの糞便について、ＲＮＡ修飾を分析することができる。
　その結果、提示した大腸菌種のｉｄｅｎｔｉｔｙを分析することができ、マウスの状態と大腸菌の状態の関連を示唆することができる。

　また、食品に含まれる大腸菌等の微生物の情報について、ＲＮＡ修飾を分析することができる。
　その結果、食品中の微生物種（例えば、大腸菌種）を分析でき、食品の品質と大腸菌の状態の関連を示唆することができる。

　（実施例１０）食品のＲＮＡ修飾分析
　本実施例では、ＲＮＡ修飾情報を用いた食品の分析の例を示す。

　例えば、食品（例えば、精肉）について、ＲＮＡ修飾情報に基づいて品質（例えば、加工日からの日数）を分類可能であることを示すことができる。

　（実施例１１－１）ＲＮＡ上の種々の修飾の分析
　本実施例では、他のＲＮＡ修飾を用いた分析を実証する。

　ＲＮＡ－ｍｏｄの修飾の種類が広範囲にわたることを実証するものである。質量分析のデータを再解析し、マイクロＲＮＡ上のメチル化以外の修飾を分析することができ、これらの情報を用いて、ＲＮＡ上の種々の修飾の分析を行うことができる。

　（実施例１１－２）種々のＲＮＡ上の修飾の分析
　マイクロＲＮＡ以外のＲＮＡの修飾情報と、何らかの状態を関連付けるデータを結び付けることができる。例えば、質量分析でのピークは多数あり、１つ１つを手作業で当てることもできるし、機械学習で行うこともできる。また、これらについては、ブルカのMaldiの仕様書を参酌することができる。

　（実施例１２）ＲＮＡ修飾情報を他のデータと組み合わせた分析
　本実施例では、ＲＮＡ修飾情報を他のデータと組み合わせた分析を実証する。

　例えば、トランスオミックス(RNA;例えば、Pagliarini　DJ^,Cell　Metab.　2016　Jul　12;24(1):13-4.　doi:　10.1016/j.cmet.2016.06.018.)。メチローム(メチル化結合蛋白；例えば、Shabalin　AA.,　Bioinformatics.　2018　Feb　12.　doi:　10.1093/bioinformatics/bty069.)、トランスクリプトーム(RNAseq；例えば、Jeong　Ｈ，　Front　Neurosci.　2018　Feb　2;12:31.　doi:　10.3389/fnins.2018.00031.　eCollection　2018)、本発明のエピトランスクリプトーム(今回の、低密度または高密度)、メタボローム(質量分析；例えば、Gupta　R　ｅｔ　ａｌ．、Proteomics.　2018　Feb　19.　doi:　10.1002/pmic.201700366)などを参照することができる。これらの例示した論文は、あくまで例示であり、これら以外でも、適宜の情報源を用いて、応用することができる。

　本発明のＲＮＡ修飾情報とその他の情報を組み合わせてさらに分析精度が上がった結果、またはそのように分析精度を向上させることができることが理解される。

　例えば、実施例４－１の「術後に減少するｍｉＲＮＡの情報」とマイクロＲＮＡ以外の情報を組み合わせて参照すると、これらのマイクロＲＮＡ以外の情報は、「術後に減少するｍｉＲＮＡの情報」との組み合わせることで、有用性が増すといえる。

　例えば、Gene　Expression　Omnibus(GEO)のデータセット(GDS4103)を使用して解析すると、膵管腺癌（PDAC）の患者において、RNAメチル化酵素であるMETTL3およびMETTL14のＲＮＡ発現レベルの上昇がみられることが分かる。このような情報と組み合わせて、例えばメチル化酵素と検出されたメチル化ＲＮＡとを関連付ける分析を行うことができる。

　（実施例１３）高密度アレイ設計
　本実施例では、メチル化ＲＮＡチップの設計例を用いた分析を実証する。

　ＭＡＬＤＩにおいて、レーザー照射は、マトリックス分子の急速な加熱と共に、リン酸結合が部分断裂した複数のＲＮＡの気化・イオン化を生じる。メチル化ＲＮＡチップには、効率化のため１枚のプレートに異なる複数のＲＮＡに対する捕捉核酸が配置される。目的の捕捉核酸が配置されたウェルにレーザーを照射すると、周囲のウェルにもレーザーが照射され、目的のＲＮＡとは異なるＲＮＡが検出される場合がある。そのため、周囲のウェルに捕捉されたＲＮＡ由来の質量ピークが、目的のウェルから観測される質量ピークと区別されるように、プレート上の捕捉核酸の配置を最適化することが望まれる。そこで以下の手順に従い、捕捉核酸の配置を決定する。
１．各ＲＮＡに対して「観測される部分ＲＮＡの理論上の質量」を算出
２．モンテカルロ法を用いてプレート上に捕捉核酸をランダムに配置
３．隣接したウェル間で、観測される部分ＲＮＡの理論上の質量の差を算出
４．（繰り返し２回目以降で）
理論上の質量の差が前回を上回った場合：今回の配置を採択
　　　　　　　　　　　　下回った場合：今回の配置を棄却
５．２に戻りモンテカルロ・サンプリングを繰り返す。

　一定回数以上、上記の手順を繰り返した後に得られる捕捉核酸の配置を、計測誤差が最も小さくなると期待される（隣接したウェル間で捕捉されるＲＮＡの部分ＲＮＡの質量差が最大となる）最適な配置とする。

　以下に複数種類のRNAを捕捉し得る捕捉核酸の組み合わせの中で、隣接しても問題ない
と考えられる組み合わせの例を示す。

　（実施例１４）オリゴＤＮＡによる精製の最適化（図３２）
　本実施例では、オリゴＤＮＡによる精製の最適化を行うことで、ＲＮＡ修飾の分析効率が改善されることを示す。

　上記直接結合ビーズおよびストレプトアビジン結合ビーズを使用した場合の修飾ＲＮＡの検出を比較した。

　培養したＨeＬa細胞およびヒト皮膚線維芽細胞からＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン）により全ＲＮＡを精製した。捕捉オリゴＤＮＡを、上記の直接結合ビーズまたはストレプトアビジン結合ビーズとして製し、精製した全ＲＮＡから、上記のそれぞれのプロトコルに従って標的ｍｉＲＮＡを精製し、ultrafleXtreme-TOF/TOF質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｏｔｎｉｃｓ）で測定した。捕捉オリゴＤＮＡは、上記の捕捉１７－５ｐ、捕捉２１－５ｐ、捕捉２００ｃおよび捕捉ｌｅｔ７ａ－５ｐを使用した。

　その結果、以下の表の強度のシグナルが得られた。

　直接結合ビーズでは、ストレプトアビジン結合ビーズの場合と比較して約２倍のＲＮＡのＭＳシグナル強度が得られた。

　ＭＡＬＤＩでは、ターゲットプレート上のサンプルをレーザーによりイオン化するため、ターゲットプレート上に測定対象とマトリクス以外にイオン化する夾雑物質が存在すると、レーザーのエネルギーが夾雑物質のイオン化に浪費され、シグナル強度が低下し得る。そのため、夾雑物質の抑制が有効であり得る。

　直接結合ビーズは、ストレプトアビジン結合ビーズよりもビーズとオリゴＤＮＡとの結合が安定なので、ハイブリダイゼーション後により高い温度で洗浄および溶出することができる。そのため、捕捉核酸および磁気ビーズに非特異的に結合される夾雑物質が抑制されたことで、高感度化が達成されることが示唆された。

　（実施例１５）エキソソーム濃縮
　本実施例では、エキソソーム濃縮を行うことによって、ＲＮＡ修飾の分析精度が改善することを示す（図３３）。

　エキソソームの濃縮による修飾ＲＮＡの検出強度の変化を調べた。
　血清・血漿（同仁化学研究所から購入）を試料として使用した。

　上記の捕捉１７－５ｐ、捕捉２１－５ｐ、捕捉２００ｃおよび捕捉ｌｅｔ７ａ－５ｐを、ストレプトアビジン結合ビーズとして製し、これらのビーズを使用し、以下の処理１および処理２のぞれぞれの試料から標的ｍｉＲＮＡを精製した。その後、ultrafleXtreme-TOF/TOF質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｏｔｎｉｃｓ）で測定した。
・処理１（免疫沈降（ＩＰ）処理なし）
　ＴＲＩｚｏｌによってｍｉＲＮＡを抽出・精製した後、ハイブリダイゼーションによる各ｍｉＲＮＡ精製を行った。
・処理２（抗ＣＤ６３抗体によるＩＰ処理あり）
　ExoQuick（システムバイオサイエンス）で簡易精製したエキソソーム画分に抗ＣＤ６３抗体（Santa　Cruz　Biotechnology）を加えて得た免疫沈降物に対して、ハイブリダイゼーションによる各ｍｉＲＮＡ精製を行った。

　その結果、以下の表の強度のシグナルが得られた。

　ＣＤ６３抗体による免疫沈降で精製することにより、同じ開始材料（血清血漿）から得られる対象ｍｉＲＮＡのＭＳシグナル強度は約２．５倍となった。

　上記の結果より、抗体によってエキソソームのみを選別・濃縮することで、開始材料中の夾雑物を除去することができることが示唆された。

　この方法により、より強いシグナルが得ることができるため、以前の方法よりも確実にメチル化率を測定可能となることが期待される。

　（実施例１６）凍結のＲＮＡ修飾への影響
　本実施例では、試料を凍結した場合のＲＮＡ修飾の分析の精度に対する影響を分析した。

　市販の血清、ヒト採血由来血清を使用して、温度に対する修飾ＲＮＡの安定性を調べた。

　目的のＲＮＡの精製は、上記のｌｅｔ７ａ特異的捕捉オリゴＤＮＡを使用して実施した。

　合成２００ｃは、ジーンデザイン社に依頼して作製した。

　採血により取得した血液から、血清分離チューブを使用して血清を分離した。

　市販の血清および採血由来血清を表中のそれぞれの条件で処理した後、捕捉オリゴＤＮＡ結合ビーズでｌｅｔ７ａを精製し、ultrafleXtreme-TOF/TOF質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ
　Ｄａｌｏｔｎｉｃｓ）で測定した。

　合成２００ｃを表中のそれぞれの条件で処理した後、ultrafleXtreme-TOF/TOF質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｏｔｎｉｃｓ）で測定した。

　採血後および血清分離した後では４℃または２５℃での放置は影響が大きかった。合成品では、４℃の純水中で安定であった。

　シリンジで採血した血液に、ＥＤＴＡまたはヘパリンを添加して、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を得た。

ヘパリン添加により目的のＲＮＡの品質がより低下することが観察された。合成品は５回程度凍結融解を繰り返しても殆ど分解しないことが観察された。

　（注記）
　以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

　本発明は、生物が関与するおよそ任意の分野における分析において利用可能性があり、特に医療分野での応用は計り知れない。

　本明細書における配列の名称および、その具体的配列を以下に示す。
miR-17-5p　CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG　(配列番号1)
miR-21-5p　UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA　(配列番号2)
miR-200c-5p　CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG　(配列番号3)
miR-200c-3p　UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA　(配列番号4)
miR-let7a-5p　UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU　(配列番号5)
捕捉17-5p　CTACCTGCACTGTAAGCACTTTG　(配列番号6)
捕捉21-5p　TCAACATCAGTCTGATAAGCTA　(配列番号7)
捕捉200c-5p　CCAAACACTGCTGGGTAAGACG　(配列番号8)
捕捉200c-3p　TCCATCATTACCCGGCAGTATTA　(配列番号9)
捕捉let7a-5p　AACTATACAACCTACTACCTCA　(配列番号10)
合成miR-200c-5p　CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG　(#7,mA;#13,mC)　(配列番号11)
合成miR-369-3p　AAUAAUACAUGGUUGAUCUUU　(配列番号12)
相補DNA　369-3p　AATAATACATGGTTGATCTTT　(配列番号13)
アンチセンス相補DNA　369-3p　AAAGATCAACCATGTATTATT　(配列番号14)
miR-21-5p　UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA　(#9,mC)　(配列番号15)
miR-17-5p　CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG　(#13,mA)　(配列番号16)
let-7a-5p　UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU　(#19,mA)　(配列番号17)
miR-200c-3p　UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA　(#9,mC)　(配列番号18)
miR-200c-5p　CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG　(#13,mC)　(配列番号19)
miR378a-3p　ACUGGACUUGGAGUCAGAAGGC　(配列番号20)
miR378d　ACUGGACUUGGAGUCAGAAA　(配列番号21)
miR378e　ACUGGACUUGGAGUCAGGA　(配列番号22)
miR378f　ACUGGACUUGGAGCCAGAAG　(配列番号23)
miR378h　ACUGGACUUGGUGUCAGAUGG　(配列番号24)
miR378i　ACUGGACUAGGAGUCAGAAGG　(配列番号25)
miR492　AGGACCUGCGGGACAAGAUUCUU　(配列番号26)
miR3690　ACCUGGACCCAGCGUAGACAAAG　(配列番号27)
miR4754　AUGCGGACCUGGGUUAGCGGAGU　(配列番号28)
miR6861-5p　ACUGGGUAGGUGGGGCUCCAGG　(配列番号29)
miR3122　GUUGGGACAAGAGGACGGUCUU　(配列番号30)
miR3131　UCGAGGACUGGUGGAAGGGCCUU　(配列番号31)
miR6847-3p　GGCUCAUGUGUCUGUCCUCUUC　(配列番号32)
miR6887-3p　UCCCCUCCACUUUCCUCCUAG　(配列番号33)
miR-6887-5p　UGGGGGGACAGAUGGAGAGGACA　(配列番号34)
miR-16-1-3p　CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA　(配列番号35)
miR-34b-5p　UAGGCAGUGUCAUUAGCUGAUUG　(配列番号36)
miR369-5p　AGAUCGACCGUGUUAUAUUCGC　(配列番号37)
miR-431-5p　UGUCUUGCAGGCCGUCAUGCAG　(配列番号38)
miR-494-3p　UGAAACAUACACGGGAAACCUC　(配列番号39)
miR-519-d-5p　CCUCCAAAGGGAAGCGCUUUCUGUU　(配列番号40)
miR-3181　AUCGGGCCCUCGGCGCCGG　(配列番号41)
miR-4435　AUGGCCAGAGCUCACACAGAGG　(配列番号42)
miR-4467　UGGCGGCGGUAGUUAUGGGCUU　(配列番号43)
miR-5581-5p　AGCCUUCCAGGAGAAAUGGAGA　(配列番号44)
miR-5587-5p　AUGGUCACCUCCGGGACU　(配列番号45)
miR-629-3p　GUUCUCCCAACGUAAGCCCAGC　(配列番号46)
miR-16-5p　UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG　(配列番号47)
miR-711　GGGACCCAGGGAGAGACGUAAG　(配列番号48)
miR-3977　GUGCUUCAUCGUAAUUAACCUUA　(配列番号49)
共通配列2　GGGAGGUGUG　(配列番号50)
miR-6799-5p　GGGGAGGUGUGCAGGGCUGG　(配列番号51)
miR-3689d　GGGAGGUGUGAUCUCACACUCG　(配列番号52)
miR-3689a-3p　CUGGGAGGUGUGAUAUCGUGGU　(配列番号53)
miR-3689c　CUGGGAGGUGUGAUAUUGUGGU　(配列番号54)
miR-6825-5p　UGGGGAGGUGUGGAGUCAGCAU　(配列番号55)
共通配列3　CUCCCUGCCC　(配列番号56)
miR-6756-3p　UCCCCUUCCUCCCUGCCCAG　(配列番号57)
miR-7113-3p　CCUCCCUGCCCGCCUCUCUGCAG　(配列番号58)
miR-6743-3p　AGCCGCUCUUCUCCCUGCCCACA　(配列番号59)
共通配列4　GACUUGGAGUCA　(配列番号60)
miR-378c　ACUGGACUUGGAGUCAGAAGAGUGG　(配列番号61)
共通配列5　CCCUUUAGAGUGU　(配列番号62)
miR-521　AACGCACUUCCCUUUAGAGUGU　(配列番号63)
miR-517a-3p　AUCGUGCAUCCCUUUAGAGUGU　(配列番号64)
miR-522-3p　AAAAUGGUUCCCUUUAGAGUGU　(配列番号65)
miR-520g-3p　ACAAAGUGCUUCCCUUUAGAGUGU　(配列番号66)

Claims

　対象における少なくとも１種類のＲＮＡ上の修飾情報を取得するステップと、
　該修飾情報に基づいて該対象の状態を分析するステップと
を含む、対象の状態を分析する方法。
　前記ＲＮＡがマイクロＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
　前記修飾がマイクロＲＮＡのメチル化を含む、請求項１または２に記載の方法。
　前記修飾がｍ^６Ａである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
　前記修飾情報が、修飾位置情報および修飾されたＲＮＡの量の情報のうちの少なくとも１つを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
　前記状態が、がんを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
　前記がんが、膵臓がん（例えば、早期膵臓がん）、肝臓がん、胆嚢がん、胆道がん、胃がんおよび大腸がんのうちの少なくとも１つを含む、請求項６に記載の方法。
　前記状態が、前記対象の抗がん剤に対する耐性を有するかどうかの応答性を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
　前記応答性に基づいて、前記対象を処置するための薬剤および／または前記対象に対する処置が示される、請求項８に記載の方法。
　ＲＮＡの修飾情報に基づいて、対象の状態を判定するためのシステムであって、
　ＲＮＡの修飾状態を測定する測定部と
　該測定の結果に基づいてＲＮＡ上の修飾状態を計算する計算部と、
　該修飾状態に基づいて該対象の状態を分析・判定する分析・判定部と
を含む、
システム。
　前記ＲＮＡがマイクロＲＮＡを含む、請求項１０に記載のシステム。
　前記修飾がマイクロＲＮＡのメチル化を含む、請求項１０または１１に記載のシステム。
　前記修飾情報が、修飾位置情報および修飾されたＲＮＡの量の情報のうちの少なくとも１つを含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のシステム。
　前記状態が、がんを含む、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のシステム。
　前記状態が、前記対象の抗がん剤に対する耐性を有するかどうかの応答性を含む、請求項１０～１４のいずれか一項に記載のシステム。