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WO2019151478A1 - 核酸送達用ポリマー化合物 - Google Patents

核酸送達用ポリマー化合物 Download PDF

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WO2019151478A1
WO2019151478A1 PCT/JP2019/003617 JP2019003617W WO2019151478A1 WO 2019151478 A1 WO2019151478 A1 WO 2019151478A1 JP 2019003617 W JP2019003617 W JP 2019003617W WO 2019151478 A1 WO2019151478 A1 WO 2019151478A1
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WO
WIPO (PCT)
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peg
group
polymer
chain
primary amine
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2019/003617
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English (en)
French (fr)
Inventor
オラシオ カブラル
智士 内田
拓也 宮崎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to CN201980010230.7A priority patent/CN111655758B/zh
Priority to EP19747294.7A priority patent/EP3747928A4/en
Priority to JP2019569607A priority patent/JP7352958B2/ja
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    • C08L53/00—Compositions of block copolymers containing at least one sequence of a polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L53/005—Modified block copolymers

Definitions

  • the present invention belongs to the technical field related to nucleic acid delivery to target cells or tissues, and more specifically relates to the use of a polycation chargeable polymer as a nucleic acid delivery carrier and a novel polycation charge polymer.
  • Non-Patent Document 1 MRNA is attracting attention as a nucleic acid drug because it translates a therapeutic protein in the cytoplasm.
  • plasmid DNA which is one of nucleic acid drugs
  • the superiority of mRNA over plasmid DNA has been confirmed from the necessity of insertion into host genomic DNA and transport to the cell nucleus (for example, Non-Patent Document 1).
  • it is necessary to develop an mRNA transport carrier because even if mRNA alone is administered systemically, it is rapidly degraded by the enzyme, is not easily taken up by cells due to negative charges derived from phosphate groups, and receives an immune reaction. (For example, Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 3 As one of the mRNA transport carriers, development of polyion complex (PIC) type polymer micelles is in progress. For example, if mRNA is added to a block copolymer consisting of polyethylene glycol and polycation as a transport carrier, the block copolymer and mRNA can form polymer micelles by electrostatic interaction, and the mRNA can be encapsulated in the core. Has been confirmed (for example, Non-Patent Document 3). In addition, by using a block copolymer consisting of polyethylene glycol and polyamino acid as a block copolymer, inhibition of mRNA enzymatic degradation, increase in cellular uptake due to charge neutralization, and high gene expression levels have been achieved ( For example, Non-Patent Document 3). However, for application to living bodies, further enzymatic degradation and improvement of stability against polyanions that are abundant in living bodies are important.
  • PIC polyion complex
  • the present invention aims to provide polymers for the delivery of nucleic acids such as RNA.
  • the present inventor designed a block copolymer composed of polyethylene glycol and polyglycidylamine, and introduced a primary amine into the side chain of the polyglycidyl chain.
  • the present inventors have succeeded in solving the above problems and completed the present invention.
  • the homopolymer has the following formula I: (Wherein R 1 represents a primary amine via a methylene group or an ester bond, and R 5a and R 5b each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, or —OCOCH (NH 2 ) R 3 ( R 3 is a hydrogen atom, or (R 4 represents an optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 20 carbon atoms, or an optionally substituted heterocyclic functional group, and j represents an integer of 0 to 5) And m represents an integer of 2 to 5,000. )
  • R 1 represents a primary amine via a methylene group or an ester bond
  • R 5a and R 5b each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, or —OCOCH (NH 2 )
  • R 3 is a hydrogen atom
  • R 4 represents an optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 20 carbon atoms, or an optionally substituted heterocyclic functional group
  • j represents an integer of
  • a primary amine via a methylene group or an ester bond has the following formula: (R 3 is a hydrogen atom, or (R 4 represents an optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 20 carbon atoms, or an optionally substituted heterocyclic functional group, and j represents an integer of 0 to 5) Or R 3 and R 4 each independently represents a side chain structure in a protein of any amino acid, and R 6 represents a hydrogen atom, or one or more arbitrary amino acids. And k represents an integer of 0 to 5. )
  • the polymer compound according to (2) which is represented by:
  • the block copolymer has the following formula II: [Wherein, R 1 represents a primary amine via a methylene group or an ester bond, and R 2a and R 2b each independently represent a hydrogen atom, or (R 20 represents a group represented by —O—CH 3 or a ligand molecule, L 2 represents a linking group, and n represents an integer of 5 to 20,000). L 1a and L 1b each independently represent a linking group, m represents an integer of 2 to 5,000. ]
  • the polymer compound according to (1) which is represented by:
  • a primary amine via a methylene group or an ester bond has the following formula: (R 3 is a hydrogen atom, or (R 4 represents an optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 20 carbon atoms, or an optionally substituted heterocyclic functional group, and j represents an integer of 0 to 5) Or R 3 and R 4 each independently represents a side chain of any amino acid, R 6 represents a hydrogen atom, or one or more arbitrary amino acids, k represents an integer of 0 to 5.
  • the polymer compound according to (4) which is represented by
  • R 1 is represented by —CH 2 NH 2 or —CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 .
  • R 1 is (R 3 is a hydrogen atom, or (R 4 represents a propyl group, an indolyl group which may have a substituent, or a phenyl group which may have a substituent).
  • R 2 is (N represents an integer of 5 to 20,000.)
  • a polyion complex comprising the polymer compound according to any one of (1) to (7) and a nucleic acid.
  • the polyion complex according to (11), wherein the DNA is antisense DNA, DNA aptamer, pDNA (plasmid DNA), or MCDNA (minicircle DNA).
  • a kit for producing a nucleic acid delivery device to a target cell or tissue comprising the polymer compound according to any one of (1) to (9).
  • a nucleic acid delivery device to a target cell or tissue comprising the polyion complex according to any one of (10) to (13).
  • a method for producing a block copolymer of a polyglycidyl chain having a side chain containing a primary amine and a polyethylene glycol chain, wherein polyethylene glycol is dehydrated and then subjected to epoxy ring-opening polymerization A process comprising obtaining a block copolymer with a polyglycidyl chain having a side chain, and introducing a primary amine into the side chain of the polyglycidyl chain.
  • the method according to (16), wherein the dehydration is performed using toluene.
  • the epoxy ring-opening polymerization is carried out using 1,2-epoxy-5-hexene or epichlorohydrin.
  • the present invention has made it possible to apply RNA medicine to medicine.
  • siRNA can suppress the expression of a gene causing a disease in vivo, and mRNA can provide a therapeutic protein safely and continuously. Furthermore, it has become possible to markedly suppress RNA enzymatic degradation and increase RNA introduction efficiency.
  • the present invention relates to a block copolymer composed of polyethylene glycol and polyglycidylamine, or a homopolymer composed of polyglycidylamine, wherein a primary amine is introduced into the side chain of the polyglycidyl chain.
  • polyion complexes consisting of double-stranded nucleic acids with low flexibility such as plasmid DNA and polyamino acids with low flexibility
  • entropy does not change before and after the formation of polymeric micelles, but high flexibility such as mRNA1
  • polyion complexes consisting of single-stranded nucleic acids and low-flexibility polyamino acids it is considered that entropy is greatly reduced since the movement of mRNA is greatly restricted by polyamino acids after the formation of polymer micelles (for example, K. Hayashi et . Al., Macromol. Rapid Commun. 37 (2016) 486-493.).
  • a highly flexible block copolymer could increase the mobility of mRNA after the formation of polymer micelles and reduce entropy reduction.
  • a highly flexible block copolymer was designed by making the structure of the main chain of the polycation chain into a polyglycidyl chain composed of an ether bond.
  • the influence on the stability of the number of side chain methylene groups was confirmed by designing a block copolymer having a small number of side chain methylene groups in the polycation chain.
  • biodegradable polymers were designed for medical application to living bodies. Specifically, amino acids were introduced into the side chain structure of the polyglycidyl chain via a biodegradable ester bond.
  • Polymer Compound The present invention is a polymer compound selected from the following (a) homopolymer and (b) block copolymer.
  • (b) A block copolymer of a polyglycidyl chain having a side chain containing a primary amine and a polyethylene glycol chain For example, those represented by the following formula I or II.
  • examples of the primary amine via a methylene group or the primary amine via an ester bond include the following formula: (R 3 is a hydrogen atom, or (R 4 represents an optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 20 carbon atoms, or an optionally substituted heterocyclic functional group, and j represents an integer of 0 to 5) Or R 3 and R 4 each independently represents a side chain structure in a protein of any amino acid, and R 6 represents a hydrogen atom, or one or more arbitrary amino acids. And k represents an integer of 0 to 5. ) The thing shown by is mentioned. R 3 and R 4 are, for example, side chain structures in a protein of any amino acid (for example, 20 kinds of amino acids).
  • R 6 of —NHR 6 may be any amino acid (for example, 20 kinds of natural amino acids or artificial amino acids), and may be a dipeptide, tripeptide, tetrapeptide or the like. When R 6 is one or more arbitrary amino acids, an amide bond can be formed and added.
  • cysteine, histidine, and other basic amino acids can be used instead of leucine and tryptophan of PGLeu and PGGTry described in the Examples.
  • cysteine disulfide crosslinking is possible, and when histidine is used, endosome escape ability can be imparted to the polymer.
  • a basic amino acid is used, the cationic charge can be increased.
  • a dipeptide (PGLeu-Trp) in which tryptophan is bound to PGLeu a dipeptide (PGLeu-Cys) in which cysteine is bound to PGLeu, and a dipeptide (PGLeu-His) in which histidine is bound to PGLeu can also be used.
  • the NH moiety of —NHR 6 is not a primary amine, but since the bonded amino acid has a primary amine, these compounds are also referred to as “1 via an ester bond” in the present invention.
  • R 6 of —NHR 6 include those represented by — (COCR 3 NH) p —H.
  • R 3 is the same as described above.
  • p is a repeating unit and represents an integer of 1 to 10,000.
  • examples of the heterocyclic functional group which may have a substituent include an indolyl ring, a pyrrolidone group, a furan ring, a pyridine ring, a morpholine ring, an epoxy ring, a purine ring, and a pyrimidine ring.
  • examples of the halogen atom include F, Cl, Br, and I.
  • R 5a and R 5b are Br (bromine) for a primary amine via a methylene group and —OCOCH (NH) R 3 for a primary amine via an ester bond. Can take structure.
  • R 1 represents a primary amine via a methylene group or a primary amine via an ester bond, and details of these primary amines are the same as described above.
  • R 2a and R 2b each independently represent a hydrogen atom or a hydrophilic group.
  • the hydrophilic group for example, (R 20 represents a group represented by —O—CH 3 or a ligand molecule, L 2 represents a linking group, and n represents an integer of 5 to 20,000) (for example, polyethylene glycol). It is done.
  • R 2a and R 2b may be other hydrophilic groups (hydrophilic polymers) in addition to the group represented by the above formula (polyethylene glycol).
  • hydrophilic groups include polyethyleneimine, 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, 2-acryloyloxyethyl phosphorylcholine, N- (2-methacrylamide) ethyl phosphorylcholine, 4-methacryloyloxybutylphosphorylcholine and the like.
  • Ligand molecule means a compound used for the purpose of targeting a specific biomolecule, and examples thereof include antibodies, proteins, amino acids, low molecular drugs, biopolymer monomers, and the like.
  • L 1a and L 1b each independently represent a linking group, and m represents an integer of 2 to 5,000.
  • the linking group means a spacer between each block of the block copolymer, and can represent, for example, a single bond or a group represented by —CH 2 CH 2 O—.
  • R 1 examples include those represented by —CH 2 NH 2 or —CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 .
  • R 1 is (R 3 is a hydrogen atom, or (R 4 represents a propyl group, an indolyl group which may have a substituent, or a phenyl group which may have a substituent). ).
  • R 2a and / or R 2b may be, for example: (N represents an integer of 5 to 20,000.) The thing shown by is mentioned.
  • the hydrocarbon group is saturated or unsaturated acyclic or cyclic. When the hydrocarbon group is acyclic, it may be linear or branched.
  • the hydrocarbon group has 1 to 20 carbon atoms (indicated as “C 1-20 ”, the same applies to other carbon numbers) alkyl group, C 2-20 alkenyl group, C 2-20 alkynyl group, C 2 4-20 alkyldienyl group, C 6-18 aryl group, C 7-20 alkylaryl group, C 7-20 arylalkyl group, C 3-20 cycloalkyl group, C 3-20 cycloalkenyl group, C 1- 20 alkoxy group, C 6-20 aryloxy group, C 7-20 alkylaryloxy group, C 2-20 alkoxycarbonyl group and the like are included.
  • Examples of the C 1-6 alkyl group include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, hexyl group and the like.
  • Examples of the C 1-20 alkyl group include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, hexyl group, octyl group, nonyl group, decyl group. Group, undecyl group, dodecyl group and the like.
  • Examples of the C 2-20 alkenyl group include vinyl group, allyl group, propenyl group, isopropenyl group, 2-methyl-1-propenyl group, 2-methylallyl group, 2-butenyl group and the like.
  • Examples of the C 2-20 alkynyl group include ethynyl group, propynyl group, butynyl group and the like.
  • Examples of the C 4-20 alkyldienyl group include a 1,3-butadienyl group.
  • Examples of the C 6-18 aryl group include a phenyl group, a 1-naphthyl group, a 2-naphthyl group, an indenyl group, a biphenyl group, an anthryl group, and a phenanthryl group.
  • Examples of the C 7-20 alkylaryl group include an o-tolyl group, m-tolyl group, p-tolyl group, 2,3-xylyl group, 2,5-xylyl group, o-cumenyl group, m-cumenyl group, Examples thereof include a p-cumenyl group and a mesityl group.
  • Examples of the C 7-20 arylalkyl group include benzyl group, phenethyl group, 1-naphthylmethyl group, 2-naphthylmethyl group, 1-phenylethyl group, phenylpropyl group, phenylbutyl group, phenylpentyl group, phenylhexyl group. Methylbenzyl group, dimethylbenzyl group, trimethylbenzyl group, ethylbenzyl group, methylphenethyl group, dimethylphenethyl group, diethylbenzyl group and
  • Examples of the C 3-20 cycloalkyl group include a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, a cyclooctyl group, and the like.
  • Examples of the C 3-20 cycloalkenyl group include a cyclopropenyl group, a cyclobutenyl group, a cyclopentenyl group, a cyclopentadienyl group, a cyclohexenyl group, and the like.
  • Examples of the C 1-20 alkoxy group include methoxy group, ethoxy group, propoxy group, butoxy group, pentyloxy group and the like.
  • Examples of the C 6-20 aryloxy group include a phenyloxy group, a naphthyloxy group, a biphenyloxy group, and the like.
  • Examples of the C 7-20 alkylaryloxy group include a methylphenyloxy group, an ethylphenyloxy group, a propylphenyloxy group, a butylphenyloxy group, a dimethylphenyloxy group, a diethylphenyloxy group, a dipropylphenyloxy group, and a dibutylphenyl group. Examples thereof include an oxy group, a methylethylphenyloxy group, a methylpropylphenyloxy group, and an ethylpropylphenyloxy group.
  • Examples of the C 2-20 alkoxycarbonyl group include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a 2-methoxycarbonyl group, a t-butoxycarbonyl group, and the like.
  • substituent in the hydrocarbon group which may have a substituent and the heterocyclic functional group which may have a substituent include, for example, a halogen atom (F, Cl, Br, I), Hydroxyl group, thiol group, nitro group, cyano group, formyl group, carboxyl group, amino group, silyl group, methanesulfonyl group, C 1-6 alkyl group, C 2-6 alkenyl group, C 2-6 alkynyl group, C 3
  • An -8 cycloalkyl group, a C 6-10 aryl group, a C 1-6 alkoxy group, a C 1-7 acyl group, a C 2-7 alkoxycarbonyl group and the like can be mentioned.
  • a phenyl group which may have a substituent and a heterocyclic functional group which may have a substituent are preferable, but are not limited thereto.
  • the molecular weight (Mn) of the polymer of formula I is not limited, but is 200 to 500,000, preferably 1,000 to 100,000.
  • the molecular weight (Mn) of the block copolymer represented by the formula II is not limited, but is 400 to 1,400,000, preferably 1,000 to 144,000.
  • the molecular weight of the PEG part is, for example, 200 to 200,000, preferably 200 to 44,000.
  • the molecular weight of the polyglycidyl chain moiety is, for example, 200 to 500,000, preferably 1,000 to 100,000.
  • epichlorohydrin, 1,2-epoxy-5-hexene, 1-allyl-2,3-epoxy Propane, epibromohydrin, 3,4-epoxy-1-butane, 1,2-epoxy-9-decene, 2,3-epoxypropylpropargyl ether, and the like can be used.
  • a primary amine is introduced into the side chain of the polyglycidyl chain of the obtained block copolymer.
  • the polyglycidyl chain obtained by introducing a primary amine into the side chain thus obtained is also referred to as polyglycidylamine.
  • Epoxy ring-opening polymerization is not particularly limited as long as it has an epoxy group structure as a polymerization monomer.
  • epichlorohydrin, 1,2-epoxy-5-hexene, 1-allyl-2,3-epoxy Propane, epibromohydrin, 3,4-epoxy-1-butane, 1,2-epoxy-9-decene, 2,3-epoxypropylpropargyl ether, and the like can be used. After the polymerization, it is preferable to analyze the molecular weight distribution and degree of polymerization of the chemically synthesized block copolymer.
  • a primary amine is introduced into the side chain of the polyglycidyl chain of the obtained block copolymer.
  • a high yield can be achieved by appropriately selecting the solvent in the hydroboration amination.
  • the polyglycidyl chain obtained by introducing a primary amine into the side chain thus obtained is also referred to as polyglycidylamine.
  • specific examples of the polymer compound represented by the formula II include the polymers described in Production Examples 2 to 7 described later.
  • the polyion complex (polymer complex) of the present invention is a complex of a polymer compound that can be obtained by mixing a nucleic acid and the polymer compound of the present invention in a buffer solution.
  • the polyion complex (PIC) Alternatively, it is also called a polyion complex type polymer micelle (PIC micelle).
  • the polymer that forms the polyion complex of the present invention is a block copolymer composed of PEG and polyglycidylamine
  • the nucleic acid and the polycation moiety interact with each other to form a core portion, and the outer side is formed with PEG. It becomes the form which covers.
  • the polymer complex of the present invention can be easily prepared, for example, by mixing a nucleic acid and a polymer compound in an arbitrary buffer.
  • the size of the PIC of the present invention is, for example, a particle size of 60 to 80 nm by dynamic light scattering measurement (DLS).
  • the mixing ratio of the polymer compound and the nucleic acid is not limited.
  • the total number (N) of cationic groups (for example, amino groups) in the block copolymer and the total number (P) of phosphate groups in the nucleic acid is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 3.
  • N total number of cationic groups
  • P total number of phosphate groups in the nucleic acid.
  • the ratio (N / P ratio) is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 3.
  • specific examples of the production method reference can be made to the synthesis schemes described in Examples described later.
  • the function as a nucleic acid transport carrier can be evaluated by using stability in serum and protein translation efficiency as indices.
  • the stability as a polyanion that is abundant in a living body, or the function as a transport carrier in an in vivo environment can be evaluated using blood retention.
  • a biodegradable block copolymer in which an amino acid is introduced into the side chain of a polyglycidyl chain via an ester bond is designed. You can also.
  • cleavage of the ester bond reduces the toxicity of the polymer in vivo.
  • the cleavage of the ester bond can be evaluated by quantifying the primary amine in the polymer under physiological salt conditions. Evaluation of polymer toxicity can also be performed using living cells.
  • biodegradable polymers into which leucine, one of the amino acids is introduced are evaluated for their stability in polyanions and serum that are abundant in the living body as functional evaluation as RNA transport carriers.
  • the hydrophobic interaction of the polyion complex is enhanced by the isobutyl group in leucine.
  • the micelles of the present invention showed significantly more stability than the micelles composed of polylysine chains, and as a result showed high translation efficiency. Furthermore, since stability against polyanions abundantly present in the living body has been improved, it is expected to show high stability in the living body. In particular, the retention in blood in an in vivo environment was evaluated using mRNA, which has a major problem with enzyme resistance. As a result, the micelles of the present invention showed better blood retention than micelles having a polylysine chain. From this, the introduction of a polyglycidyl chain having a small strain ether bond has improved the resistance to enzymatic degradation of mRNA in vivo.
  • biodegradable transport carrier cleavage of the ester bond introduced between the polymer and the amino acid under physiological salt conditions was evaluated. As a result, a decrease in primary amine accompanying hydrolysis was confirmed, and toxicity to cultured cells decreased.
  • nucleic acid in the polyion complex of the present invention is, in one embodiment, DNA or RNA.
  • RNA include mRNA, siRNA (small interfering RNA), antisense nucleic acid (antisense RNA), aptamer (RNA aptamer), self-replicating RNA, miRNA (micro RNA), and lncRNA (long non cording RNA).
  • DNA include antisense nucleic acid (antisense DNA), aptamer (DNA aptamer), pDNA (plasmid DNA), MCDNA (minicircle DNA) and the like.
  • the siRNA is not particularly limited as long as it can suppress the expression of the target gene using RNA interference (RNAi).
  • the target gene includes a cancer (tumor) gene, an anti-apoptotic gene, a cell cycle-related gene.
  • Preferred examples include growth signal genes.
  • the base length of siRNA is usually limited to less than 30 bases (for example, 19 to 21 bases), and is not limited. Since a nucleic acid molecule such as siRNA becomes a polyanion, it can bind (associate) with the side chain of the polycation portion of the block copolymer by electrostatic interaction.
  • Kit for nucleic acid delivery device comprises the polymer compound of the present invention.
  • the kit can be preferably used for gene therapy using RNAi and protein therapy using mRNA for various target cells, for example.
  • the storage state of the polymer is not limited, and a solution state or a powder state can be selected in consideration of its stability (storage property) and ease of use.
  • the kit of the present invention may contain other components in addition to the polymer compound.
  • other components include nucleic acids to be introduced into cells, various buffers for lysis or dilution, lysis buffers, various proteins, and instructions for use (use manual). And can be appropriately selected according to the type of polymer used.
  • the kit of the present invention is used to prepare a polyion complex (PIC) having a desired nucleic acid (for example, mRNA or siRNA) introduced into a target cell as a core part, and the prepared PIC is used for nucleic acid delivery to the target cell. It can be used effectively as a device.
  • PIC polyion complex
  • nucleic acid delivery device In this invention, the nucleic acid delivery device containing the polyion complex mentioned above is provided.
  • the delivery device of the present invention can improve the resistance to enzymatic degradation and stabilize the nucleic acid, which has been difficult to deliver stably into target cells.
  • the delivery device of the present invention can be applied to various animals such as humans, mice, rats, rabbits, pigs, dogs, cats and the like, but is not limited thereto.
  • parenteral methods such as intravenous infusion are usually adopted, and each condition such as dose, number of administrations and administration period can be appropriately set according to the type and condition of the test animal. it can.
  • the delivery device of the present invention can be used for treatment (gene therapy) for introducing a desired nucleic acid into cells that cause various diseases.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating various diseases comprising the polyplex, a gene therapeutic agent for various diseases comprising the pharmaceutical composition as an active ingredient, and a method for treating various diseases using the aforementioned PIC (In particular, a gene therapy method) can also be provided.
  • the administration method and conditions are the same as described above.
  • various diseases include cancer (eg, lung cancer, pancreatic cancer, brain tumor, liver cancer, breast cancer, colon cancer, neuroblastoma, and bladder cancer), cardiovascular disease, motor organ disease, and central system disease.
  • excipients eg, excipients, fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, surfactants, dispersants, buffering agents, preservatives, solubilizers commonly used in drug production.
  • An agent, an antiseptic, a flavoring agent, a soothing agent, a stabilizer, an isotonic agent and the like can be appropriately selected and used, and can be prepared by a conventional method.
  • the form of a pharmaceutical composition normally employs an intravenous injection (including infusion), and is provided, for example, in the state of a unit dose ampoule or a multi-dose container.
  • Polyethylene glycol terminated with amino group is dehydrated by vacuum drying, and polymerization monomer ⁇ -trifluoroacetic acid-L-lysine-N-carboxylic anhydride (Lys (TFA) -NCA) is N, N-dimethylformamide
  • Lys (TFA) -NCA polymerization monomer ⁇ -trifluoroacetic acid-L-lysine-N-carboxylic anhydride
  • the polymer was dissolved in (DMF) and polymerized overnight at 35 ° C. After the reaction, purification was performed by a reprecipitation method using diethyl ether, and a powdery polymer was obtained by vacuum drying. Next, the polymer was dissolved in methanol, and an aqueous sodium hydroxide solution was added to react overnight at room temperature.
  • Polyethylene glycol having a hydroxyl group at the terminal was dissolved in toluene, and the polyethylene glycol was dehydrated by heating at 180 ° C. for 1 hour. Polymerization monomer 1,2-epoxy-5-hexene and catalyst triisobutylaluminum were added, and the polymerization reaction was carried out overnight at room temperature. After the reaction, purification was performed by a reprecipitation method using diethyl ether, and a powdery polymer was obtained by vacuum drying. Next, the polymer was dissolved in tetrahydrofuran, borane was added, and the mixture was refluxed at 66 ° C overnight. Powdered hydroxylamine-O-sulfonic acid was added and allowed to react overnight at room temperature.
  • Polyethylene glycol having a hydroxyl group at the terminal was dissolved in toluene, and the polyethylene glycol was dehydrated by heating at 180 ° C. for 1 hour.
  • a polymerization monomer epichlorohydrin and a catalyst triisobutylaluminum were added, and a polymerization reaction was performed overnight at room temperature.
  • purification was performed by a reprecipitation method using diethyl ether, and a powdery polymer was obtained by vacuum drying.
  • the polymer was dissolved in DMF, and sodium azide was added and reacted at 180 ° C. overnight.
  • purification was performed by a reprecipitation method using diethyl ether, and a powdery polymer was obtained by vacuum drying.
  • Polyethylene glycol having a hydroxyl group at the terminal was dissolved in toluene, and the polyethylene glycol was dehydrated by heating at 180 ° C. for 1 hour.
  • a polymerization monomer epichlorohydrin and a catalyst triisobutylaluminum were added, and a polymerization reaction was performed overnight at room temperature.
  • purification was performed by a reprecipitation method using diethyl ether, and a powdery polymer was obtained by vacuum drying.
  • an aqueous sodium hydroxide solution was added to react overnight, and after the reaction, purification was carried out by dialysis against water, and a powdery polymer was obtained by lyophilization.
  • the polymer was dissolved in DMF, and N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] -L-glycine and dimethylaminopyridine, 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide were added. Reacted overnight. After the reaction, purification was performed by a reprecipitation method using diethyl ether, and a powdery polymer was obtained by vacuum drying. Next, the polymer was dissolved in DMF, and piperidine was added to react overnight. After the reaction, it was purified by dialysis against water, and a powdery polymer was obtained by freeze-drying.
  • Polyethylene glycol having a hydroxyl group at the terminal was dissolved in toluene, and the polyethylene glycol was dehydrated by heating at 180 ° C. for 1 hour.
  • a polymerization monomer epichlorohydrin and a catalyst triisobutylaluminum were added, and a polymerization reaction was performed overnight at room temperature.
  • purification was performed by a reprecipitation method using diethyl ether, and a powdery polymer was obtained by vacuum drying.
  • an aqueous sodium hydroxide solution was added to react overnight, and after the reaction, purification was carried out by dialysis against water, and a powdery polymer was obtained by lyophilization.
  • the polymer was dissolved in DMF, and N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] -L-leucine and dimethylaminopyridine and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide were added to add 1 Reacted overnight. After the reaction, purification was performed by a reprecipitation method using diethyl ether, and a powdery polymer was obtained by vacuum drying. Next, the polymer was dissolved in DMF, and piperidine was added to react overnight. After the reaction, it was purified by dialysis against water, and a powdery polymer was obtained by freeze-drying.
  • Polyethylene glycol having a hydroxyl group at the terminal was dissolved in toluene, and the polyethylene glycol was dehydrated by heating at 180 ° C. for 1 hour.
  • a polymerization monomer epichlorohydrin and a catalyst triisobutylaluminum were added, and a polymerization reaction was performed overnight at room temperature.
  • purification was performed by a reprecipitation method using diethyl ether, and a powdery polymer was obtained by vacuum drying.
  • an aqueous sodium hydroxide solution was added to react overnight, and after the reaction, purification was carried out by dialysis against water, and a powdery polymer was obtained by lyophilization.
  • the polymer was dissolved in DMF, and N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] -L-tryptophan and dimethylaminopyridine and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide were added to add 1 Reacted overnight. After the reaction, purification was performed by a reprecipitation method using diethyl ether, and a powdery polymer was obtained by vacuum drying. Next, the polymer was dissolved in DMF, and piperidine was added to react overnight. After the reaction, it was purified by dialysis against water, and a powdery polymer was obtained by freeze-drying.
  • Polyethylene glycol having a hydroxyl group at the terminal was dissolved in toluene, and the polyethylene glycol was dehydrated by heating at 180 ° C. for 1 hour.
  • a polymerization monomer epichlorohydrin and a catalyst triisobutylaluminum were added, and a polymerization reaction was performed overnight at room temperature.
  • purification was performed by a reprecipitation method using diethyl ether, and a powdery polymer was obtained by vacuum drying.
  • an aqueous sodium hydroxide solution was added to react overnight, and after the reaction, purification was carried out by dialysis against water, and a powdery polymer was obtained by lyophilization.
  • the polymer was dissolved in DMF, and N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl] -L-tyrosine and dimethylaminopyridine, 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide were added to add 1 Reacted overnight. After the reaction, purification was performed by a reprecipitation method using diethyl ether, and a powdery polymer was obtained by vacuum drying. Next, the polymer was dissolved in DMF, and piperidine was added to react overnight. After the reaction, it was purified by dialysis against water, and a powdery polymer was obtained by freeze-drying.
  • Enzyme resistance test in serum using PEG-PLL, PEG-PGBA, PEG-PGMA, PEG-PGLeu polymeric micelles consisting of PEG-PLL, PEG-PGBA, PEG-PGMA, PEG-PGLeu
  • FBS fetal bovine serum
  • the N / P ratio here is an amount defined by the following equation, and unless otherwise noted, the N / P ratio refers to this amount.
  • N / P ratio (total number of amino groups of polymer in solution) / (total number of phosphate groups of nucleic acid in solution)
  • FBS was diluted to 50% with 10 mM HEPES buffer (pH 7.3), added with a micelle solution, and allowed to stand at 37 ° C. for 15 minutes. Then, mRNA was extracted from the solution using RNeasy Mini Kit (QIAGEN). The extracted mRNA was reverse transcribed into complementary DNA (cDNA), and the remaining cDNA was quantitatively evaluated by qRT-PCR. Relative values were shown with the amount of mRNA in the absence of 37 ° C standing in the presence of FBS as 100%.
  • micelles composed of PEG-PGBA showed higher enzyme resistance than micelles composed of PEG-PLL. This indicates that the enzyme resistance was improved by the flexible polyglycidyl chain of PEG-PGBA.
  • micelles composed of PEG-PGMA showed enzyme resistance comparable to that of micelles composed of PEG-PGBA, and thus it was confirmed that the number of side chain methylene groups did not affect enzyme resistance.
  • micelles composed of PEG-PGLeu showed higher enzyme resistance than micelles composed of PEG-PGBA. This indicates that the enzyme resistance was improved by the hydrophobic isobutyl group of PEG-PGLeu.
  • mice with PEG-PLL, PEG-PGBA, PEG-PGMA and luciferase mRNA are prepared by mixing PEG-PLL, PEG-PGBA, PEG-PGMA solution and mRNA solution so that the N / P ratio is 3. did.
  • HuH-7 cells were seeded at 1.0 ⁇ 10 4 cells / well in a 96-well plate, replaced with DMEM containing 10% FBS (200 ⁇ L / well), and each prepared micelle solution was dropped into the medium. The transfection was performed. 200 ng / well was administered as the amount of mRNA. After incubating for 24 hours, the luminescence intensity in the medium was measured.
  • PEG-PLL Polyanion resistance test in heparin using PEG-PLL, PEG-PGBA, PEG-PGMA, PEG-PGGly, PEG-PGLeu, PEG-PGTry, PEG-PGTyr
  • PEG-PLL PEG-PGBA
  • the stability of polymer micelles composed of PEG-PGMA, PEG-PGGly, PEG-PGLeu, PEG-PGTry, and PEG-PGTyr against polyanions is evaluated by heparin.
  • mice with PEG-PLL, PEG-PGBA, PEG-PGMA, PEG-PGGly, PEG-PGLeu, PEG-PGTry, PEG-PGTyr and fluorescently labeled luciferase mRNA are PEG-PLL, PEG-PGBA, PEG-PGMA, PEG -PGGly, PEG-PGLeu, PEG-PGTry, PEG-PGTyr solution and mRNA solution were mixed by mixing so that the N / P ratio was 3.
  • Heparin was diluted with 10 mM HEPES buffer (pH 7.3), mixed with the micelle solution at various S / P ratios, and allowed to stand at room temperature for 6 hours.
  • the S / P ratio here is an amount defined by the following equation.
  • S / P ratio (total number of heparin anions in solution) / (total number of phosphate groups of nucleic acids in solution)
  • the micelle solution was diluted with 10 mM HEPES buffer (pH 7.3), and the diffusion coefficient of the fluorescence-labeled mRNA was measured by fluorescence correlation spectroscopy.
  • micelles composed of PEG-PGTry showed higher polyanion resistance than micelles composed of PEG-PGGly. This indicates that polyanion resistance was improved by the interaction of PEG-PGTry with the purine base in the mRNA.
  • micelles composed of PEG-PGTyr showed higher polyanion resistance than micelles composed of PEG-PGGly. This indicates that the polyanion resistance was improved by the interaction with the pyrimidine base in the mRNA of PEG-PGTry.
  • mice with PEG-PLL, PEG-PGBA, PEG-PGMA and luciferase mRNA are prepared by mixing PEG-PLL, PEG-PGBA, PEG-PGMA solution and mRNA solution so that the N / P ratio is 3. did.
  • 200 ⁇ L of micelle solution containing 40 ⁇ g of mRNA was administered from the tail vein of Balb / C mice. After 2.5, 5, and 10 minutes, 2 ⁇ L of blood was collected from the tail vein. From the collected blood, mRNA was extracted using RNeasy Mini Kit (QIAGEN), the extracted mRNA was reverse transcribed into cDNA, and cDNA was quantitatively evaluated by qRT-PCR.
  • PEG-PLL and PEG-PGLeu were dissolved in PBS (pH 7.4) and allowed to stand at 37 ° C for 1, 3, 6 and 24 hours. Thereafter, L-leucine released by hydrolysis was removed by ultrafiltration, and a powdery polymer was obtained by lyophilization. The polymer was dissolved in PBS, fluorescamine dissolved in PBS was added, and the fluorescence intensity was measured. Based on N-butylamine, the fluorescence intensity was converted to the number of primary amines to obtain the number of primary amines in the polymer.
  • Toxicity test for cultured cells using PEG-PLL and PEG-PGLeu In this example, the toxicity of PEG-PLL and PEG-PGLeu to cultured cells was evaluated by cell viability after addition of polymer.
  • PEG-PLL and PEG-PGLeu were dissolved in 10 mM HEPES buffer (pH 7.3) to prepare a dilution series of the polymer solution.
  • 10 mM HEPES buffer pH 7.3
  • HEK293 cells were seeded on a 96-well plate at 1.0 ⁇ 10 4 cells / well, replaced with DMEM containing 10% FBS (200 ⁇ L / well), and each polymer solution was dropped into the medium. After incubating as it was for 24 hours, it was replaced with DMEM containing 10% FBS, and the cell viability was measured by the Cell counting kit-8 (CCK-8) method. Cell viability was calculated using 100% of 10 mM HEPES buffer added instead of the polymer solution.
  • CCK-8 Cell counting kit-8
  • thermodynamic stability of mRNA micelles using PEG-PGBA and PEG-PLL was measured by isothermal titration calorimetry ( ITC).
  • the fluorescence intensity is measured by the interaction between the polymer and mRNA in the polymer micelle composed of PEG-PGTrp and PEG-PGTyr. It was evaluated by.
  • mice of PEG-PGTrp, PEG-PGTyr and luciferase mRNA were prepared by mixing PEG-PGTrp, PEG-PGTyr solution and mRNA solution so that the N / P ratio was 3.
  • micelles with PEG-PGTrp, PEG-PGTyr and Homo-poly (L-aspartate) Homo-PAsp, PAsp chain polymerization degree of 80
  • Homo-PAsp Homo-PAsp, PAsp chain polymerization degree of 80
  • Homo-PAsp was synthesized by the NCA polymerization method using n-butylamine as an initiator in the same manner as PEG-PLL.
  • the fluorescence intensity (Ex / Em 280/350 nm) of the polymer and the prepared micelle solution was measured by Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, USA). The obtained fluorescence intensity was normalized by setting the fluorescence intensity of the polymer to 1.
  • results As shown in FIG. 9 and FIG. 10, the fluorescence intensity decreased by adding mRNA to the polymer. This indicates that tryptophan and tyrosine in the polymer are interacting with other polymers or bases in mRNA by ⁇ - ⁇ . In addition, the fluorescence intensity increased by adding Homo-PAsp without a base. This indicates that tryptophan and tyrosine in the polymer have a ⁇ - ⁇ interaction with the base in the mRNA.
  • mice with PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGly and luciferase mRNA have a N / P ratio of PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGly solution and mRNA solution It was prepared by mixing to be 3. FBS was diluted to 50% with 10 mM HEPES buffer (pH 7.3), added with a micelle solution, and allowed to stand at 37 ° C. for 15 minutes. Then, mRNA was extracted from the solution using RNeasy Mini Kit (QIAGEN).
  • the extracted mRNA was reverse transcribed into complementary DNA (cDNA), and the remaining cDNA was quantitatively evaluated by qRT-PCR. Relative values were shown with the amount of mRNA in the absence of 37 ° C standing in the presence of FBS as 100%.
  • micelles composed of PEG-PGLeu showed better stability than micelles composed of PEG-PGGly. This indicates that the enzyme resistance was improved by the hydrophobic isobutyl group of PEG-PGLeu.
  • micelles composed of PEG-PGTrp and PEG-PGTyr showed better stability than micelles composed of PEG-PGGly. This indicates that the enzyme resistance was improved by the ⁇ - ⁇ interaction between tryptophan and tyrosine and the base in mRNA.
  • mice with PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGly and luciferase mRNA have a N / P ratio of PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGly solution and mRNA solution It was prepared by mixing to be 3.
  • HuH-7 cells were seeded at 1.0 ⁇ 10 4 cells / well in a 96-well plate, replaced with DMEM containing 10% FBS (200 ⁇ L / well), and each prepared micelle solution was dropped into the medium. The transfection was performed. 200 ng / well was administered as the amount of mRNA. After incubating for 24 hours, the luminescence intensity in the medium was measured.
  • micelles composed of PEG-PGLeu showed gene expression efficiency superior to micelles composed of PEG-PGGly. This indicates that the enzyme resistance and polyanion resistance were improved by the hydrophobic isobutyl group of PEG-PGLeu, and the stability under culture conditions was improved.
  • micelles composed of PEG-PGTrp and PEG-PGTyr showed better stability than micelles composed of PEG-PGGly. This indicates that the enzyme resistance and the polyanion resistance are improved by the ⁇ - ⁇ interaction between tryptophan and tyrosine and the base in mRNA, and the stability under culture conditions is improved.
  • mice with PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGly and luciferase mRNA have a N / P ratio of PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGly solution and mRNA solution It was prepared by mixing to be 3. 200 ⁇ L of micelle solution containing 40 ⁇ g of mRNA was administered from the tail vein of Balb / C mice. After 2.5, 5, and 10 minutes, 2 ⁇ L of blood was collected from the tail vein. From the collected blood, mRNA was extracted using RNeasy Mini Kit (QIAGEN), the extracted mRNA was reverse transcribed into cDNA, and cDNA was quantitatively evaluated by qRT-PCR.
  • RNeasy Mini Kit QIAGEN
  • micelles composed of PEG-PGLeu showed better retention in blood than micelles composed of PEG-PGGly.
  • the hydrophobic isobutyl group of PEG-PGLeu has improved enzyme resistance and polyanion resistance, improving stability in the living body.
  • micelles composed of PEG-PGTrp and PEG-PGTyr are The retention in blood was superior to that of micelles composed of PEG-PGGly. This indicates that the enzyme resistance and polyanion resistance are improved by the ⁇ - ⁇ interaction between tryptophan and tyrosine and the base in mRNA, and the stability in the living body is improved.
  • the gene transfer efficiency of polymer micelles composed of PEG-PGBA and PEG-PLL in vivo is determined by the luciferase expression efficiency in the mouse lung. evaluate.
  • mice of PEG-PGBA, PEG-PLL and luciferase mRNA were prepared by mixing PEG-PGBA, PEG-PLL solution and mRNA solution so that the N / P ratio was 3. 200 ⁇ L of micelle solution containing 67 ⁇ g of mRNA was administered from the trachea of Balb / C mice. The lungs were removed 24 hours later. Cell lysate (1x passive lysis buffer, Promega, USA) was added to the extracted lung, and the luminescence intensity in the solution was measured after crushing with a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.).
  • micelles composed of PEG-PGBA and PEG-PLL showed better gene expression efficiency than the administration group of mRNA alone. This indicates that inclusion of mRNA in polymer micelles improved enzyme resistance and polyanion resistance, and improved gene transfer efficiency in the living body. Furthermore, micelles composed of PEG-PGBA showed superior gene expression efficiency than micelles composed of PEG-PLL. This indicates that the PEG-PGBA polyether skeleton improved enzyme resistance and polyanion resistance, and improved gene transfer efficiency in the living body.
  • the gene transfer efficiency into the living body of the polymer micelle composed of PEG-PGTrp and PEG-PGGly is determined by the luciferase expression efficiency in the mouse lung. evaluate.
  • mice of PEG-PGTrp, PEG-PGGly and luciferase mRNA were prepared by mixing PEG-PGTrp, PEG-PGGly solution and mRNA solution so that the N / P ratio was 3. 200 ⁇ L of micelle solution containing 67 ⁇ g of mRNA was administered from the trachea of Balb / C mice. The lungs were removed 24 hours later. Cell lysate (1x passive lysis buffer, Promega, USA) was added to the extracted lung, and the luminescence intensity in the solution was measured after crushing with a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.).
  • micelles composed of PEG-PGTrp showed better gene expression efficiency than micelles composed of PEG-PGGly. This indicates that the enzyme resistance and polyanion resistance were improved by the ⁇ - ⁇ interaction between the tryptophan of PEG-PGTrp and the base in mRNA, and the gene transfer efficiency in the living body was improved.
  • PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, and PEG-PGGly were dissolved in PBS (pH 7.4) and allowed to stand at 37 ° C for 1, 3, 6, and 24 hours. Thereafter, L-leucine released by hydrolysis was removed by ultrafiltration, and a powdery polymer was obtained by lyophilization. The polymer was dissolved in PBS, fluorescamine dissolved in PBS was added, and the fluorescence intensity was measured. Based on N-butylamine, the fluorescence intensity was converted to the number of primary amines to obtain the number of primary amines in the polymer.

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Abstract

【課題】核酸送達のためのポリマーの提供。 【解決手段】以下の(a)のホモポリマー及び(b)のブロック共重合体から選ばれる、ポリマー化合物。 （ａ）１級アミンを含む側鎖を有するポリグリシジル鎖からなるホモポリマー （ｂ）１級アミンを含む側鎖を有するポリグリシジル鎖とポリエチレングリコール鎖とのブロック共重合体

Description

核酸送達用ポリマー化合物
　本発明は、標的細胞または組織への核酸のデリバリーに関する技術分野に属し、より具体的には、ポリカチオン荷電性ポリマーの核酸デリバリー用キャリアとしての使用および新規なポリカチオン荷電性ポリマーに関する。
　mRNAは、細胞質において治療用タンパク質を翻訳することから、核酸医薬として注目されている。また、核酸医薬の1つであるプラスミドDNAに関してはホストゲノムDNAへの挿入や細胞核への輸送の必要性から、mRNAのプラスミドDNAに対する優位性が確認されている(例えば、非特許文献１)。しかしながら、mRNA単体を全身投与しても、酵素による分解を速やかに受けること、リン酸基由来の負電荷により細胞に取り込まれにくいこと、免疫反応を受けることなどから、mRNA輸送担体の開発が必要とされている(例えば、非特許文献２)。
　mRNA輸送担体の1つとして、ポリイオンコンプレックス（PIC）型高分子ミセルの開発が進められている。例えば、ポリエチレングリコールとポリカチオンからなるブロック共重合体を輸送担体としてこれにmRNAを加えると、ブロック共重合体とmRNAとは静電相互作用により高分子ミセルを形成し、mRNAをコアに内包できることが確認されている(例えば、非特許文献３)。また、ブロック共重合体としてポリエチレングリコールとポリアミノ酸からなるブロック共重合体を用いることにより、mRNAの酵素分解の抑制、電荷中和による細胞取り込み量の増加、高い遺伝子発現量を達成している(例えば、非特許文献３)。
  しかしながら、生体への応用に向けては、さらなる酵素分解や生体に豊富に存在するポリアニオンに対する安定性の向上が重要である。
U. Sahin et. al., Nat. Rev. Drug Discovery 13 (2014) 759-780. N. B. Tsui et. al., Clin. Chem. 48 (2002) 1647-1653. S. Uchida et. al., Biomaterials 82 (2016) 221-228.
  本発明は、RNAなどの核酸送達のためのポリマーを提供することを目的とする。
  本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ポリエチレングリコールとポリグリシジルアミンからなるブロック共重合体を設計し、ポリグリシジル鎖の側鎖に１級アミンを導入することにより、上記課題を解決することに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の(a)のホモポリマー及び(b)のブロック共重合体から選ばれる、ポリマー化合物。
（ａ）１級アミンを含む側鎖を有するポリグリシジル鎖からなるホモポリマー
（ｂ）１級アミンを含む側鎖を有するポリグリシジル鎖とポリエチレングリコール鎖とのブロック共重合体
（２）ホモポリマーが、次式Ｉ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （式中、Ｒ１は、メチレン基又はエステル結合を介した１級アミンを表し、Ｒ５ａ及びＲ５ｂは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、又は－ＯＣＯＣＨ（ＮＨ２）Ｒ３（Ｒ３は水素原子、又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （Ｒ４は置換基を有していてもよい炭素数１～２０の炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複素環式官能基を表し、ｊは０～５の整数を表す。）で示される基を表し、ｍは2～5,000の整数を表す。）
で示されるものである、（１）に記載のポリマー化合物。
（３）メチレン基又はエステル結合を介した１級アミンが、次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （Ｒ３は水素原子、又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （Ｒ４は置換基を有していてもよい炭素数１～２０の炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複素環式官能基を表し、ｊは０～５の整数を表す。）で示される基を表すか、又はＲ３及びＲ４は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸のタンパク質における側鎖構造を表し、Ｒ６は、水素原子、又は１若しくは複数の任意のアミノ酸を表し、ｋは０～５の整数を表す。）
で示されるものである、（２）に記載のポリマー化合物。
（４）ブロック共重合体が、次式II：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 〔式中、Ｒ１は、メチレン基又はエステル結合を介した１級アミンを表し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して、水素原子、又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （Ｒ２０は－Ｏ－ＣＨ３で示される基、又はリガンド分子を表し、Ｌ２は連結基を表し、ｎは5～20,000の整数を表す。）で示される基を表し、
Ｌ１ａ及びＬ１ｂは、それぞれ独立して連結基を表し、
ｍは2～5,000の整数を表す。〕
で示されるものである、（１）に記載のポリマー化合物。
（５）メチレン基又はエステル結合を介した１級アミンが、次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （Ｒ３は水素原子、又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （Ｒ４は置換基を有していてもよい炭素数１～２０の炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複素環式官能基を表し、ｊは０～５の整数を表す。）で示される基を表すか、又はＲ３及びＲ４は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸の側鎖を表し、Ｒ６は、水素原子、又は１若しくは複数の任意のアミノ酸を表し、ｋは０～５の整数を表す。）で示されるものである、（４）に記載のポリマー化合物。
（６）Ｒ１が－ＣＨ２ＮＨ２又は－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２で示されるものである、（２）～（５）のいずれか１項に記載の化合物。
（７）Ｒ１が
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （Ｒ３は水素原子、又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 （Ｒ４はプロピル基、置換基を有していてもよいインドリル基、又は置換基を有していてもよいフェニル基を表す。）で示される基を表す。）で示されるものである、（２）～（５）のいずれか１項に記載の化合物。
（８）Ｌ１ａ及び／又はＬ１ｂが、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－で示されるものである、（４）～（７）のいずれか１項に記載の化合物。
（９）Ｒ２が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 （ｎは5～20,000の整数を表す。）
で示されるものである、（４）～（８）のいずれか１項に記載の化合物。
（１０）（１）～（７）のいずれか１項に記載のポリマー化合物及び核酸を含む、ポリイオンコンプレックス。
（１１）核酸がRNA又はDNAである（１０）に記載のポリイオンコンプレックス。
（１２）RNAがsiRNA、mRNA、アンチセンスRNA、RNAアプタマー、self-replicating RNA、miRNA（micro RNA）、又はlncRNA (long non cording RNA)である（１１）に記載のポリイオンコンプレックス。
（１３）DNAがアンチセンスDNA、DNAアプタマー、pDNA（plasmid DNA）、又はMCDNA（minicircle DNA）である（１１）に記載のポリイオンコンプレックス。
（１４）（１）～（９）のいずれか１項に記載のポリマー化合物を含む、標的細胞又は組織への核酸送達デバイス作製用キット。
（１５）（１０）～（１３）のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックスを含む、標的細胞又は組織への核酸送達デバイス。
（１６）１級アミンを含む側鎖を有するポリグリシジル鎖とポリエチレングリコール鎖とのブロック共重合体の製造方法であって、ポリエチレングリコールを脱水した後にエポキシ開環重合を行って、ポリエチレングリコールと、側鎖を有するポリグリシジル鎖とのブロック共重合体を得、当該ポリグリシジル鎖の側鎖に１級アミンを導入することを特徴とする、前記方法。
（１７）脱水がトルエンを用いて行われるものである、（１６）に記載の方法。
（１８）エポキシ開環重合が、1,2-エポキシ-5-ヘキセン又はエピクロロヒドリンを用いて行われるものである、（１６）又は（１７）に記載の方法。
  本発明により、RNA医薬の医療への応用が可能となった。例えば、siRNAでは生体内で疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制することができ、mRNAでは、治療用タンパク質を安全かつ持続的に供給することができる。さらに、RNAの酵素分解を著明に抑制し、RNA導入効率を高めることが可能となった。
PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGLeuからなる高分子ミセルの分解酵素に対する安定性試験を行った結果を示す図である。 PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMAを用いた培養細胞への遺伝子導入試験結果を示す図である。 PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGGly、PEG-PGLeu、PEG-PGTry、PEG-PGTyrを用いたヘパリン中でのポリアニオン耐性試験を行った結果を示す図である。 PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGGly、PEG-PGLeu、PEG-PGTry、PEG-PGTyrを用いたヘパリン中でのポリアニオン耐性試験を行った結果を示す図である。 PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMAを用いた生体内における安定性試験を行った結果を示す図である。 PEG-PLLおよびPEG-PGLeuを用いた加水分解試験を行った結果を示す図である。 PEG-PLL、PEG-PGLeuを用いた培養細胞に対する毒性試験を行った結果を示す図である。 ミセル形成に伴う反応熱を示す図である。 PEG-PGTrpポリマーおよびミセルの蛍光強度を示す図である。 PEG-PGTyrポリマーおよびミセルの蛍光強度を示す図である。 mRNAミセルの血清中での酵素分解に対する安定性を示す図である。 mRNAミセルの培養細胞へのルシフェラーゼ遺伝子の導入を示す図である。 mRNA内包ミセルの血中滞留性を示す図である。 mRNA内包ミセルによるルシフェラーゼ遺伝子の導入を示す図である。 mRNA内包ミセルによるルシフェラーゼ遺伝子の導入を示す図である。 生理塩条件下におけるポリマー中の1級アミン量を示す図である。 生理塩条件下におけるポリマー中の1級アミン量を示す図である。
  本発明は、ポリエチレングリコールとポリグリシジルアミンからなるブロック共重合体、又はポリグリシジルアミンからなるホモポリマーに関するものであり、ポリグリシジル鎖の側鎖に１級アミンを導入したものである。
  本発明者等はブロック共重合体の主鎖の化学構造に注目した。プラスミドDNAなどの柔軟性の低い2本鎖核酸と柔軟性の低いポリアミノ酸からなるポリイオンコンプレックスにおいては、高分子ミセルの形成前後でエントロピーの変化は見られないが、mRNAなどの柔軟性の高い1本鎖核酸と柔軟性の低いポリアミノ酸からなるポリイオンコンプレックスにおいては、高分子ミセルの形成後にポリアミノ酸によりmRNAの動きが大きく制限されることからエントロピーが大きく減少すると考えられる(例えば、K. Hayashi et. al., Macromol. Rapid Commun. 37 (2016) 486-493.)。
  そこで本発明者は、柔軟性の高いブロック共重合体により高分子ミセル形成後のmRNAの運動性を高め、エントロピー減少を低減できるのではないかと考えた。具体的には、ポリカチオン鎖に関して主鎖の構造をエーテル結合からなるポリグリシジル鎖とすることにより、柔軟性の高いブロック共重合体を設計した。また、ポリカチオン鎖の側鎖メチレン基数の少ないブロック共重合体を設計することにより、側鎖メチレン基数の安定性に対する影響を確認した。さらに、生体への医療応用に向けて、生分解性ポリマーの設計を行った。具体的には、生分解性エステル結合を介してポリグリシジル鎖の側鎖構造にアミノ酸を導入した。
１．ポリマー化合物
  本発明は、以下の(a)のホモポリマー及び(b)のブロック共重合体から選ばれる、ポリマー化合物である。
（ａ）１級アミンを含む側鎖を有するポリグリシジル鎖からなるホモポリマー
（ｂ）１級アミンを含む側鎖を有するポリグリシジル鎖とポリエチレングリコール鎖とのブロック共重合体
  本発明のポリマー化合物は、例えば次式I又はIIに示されるものである。
（ａ）１級アミンを含む側鎖を有するポリグリシジル鎖からなるホモポリマー：
  次式Ｉ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 （式中、Ｒ１は、メチレン基又はエステル結合を介した１級アミンを表し、Ｒ５ａ及びＲ５ｂは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、又は－ＯＣＯＣＨ（ＮＨ２）Ｒ３（Ｒ３は水素原子、又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 （Ｒ４は置換基を有していてもよい炭素数１～２０の炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複素環式官能基を表し、ｊは０～５の整数を表す。）で示される基を表し、ｍは2～5,000の整数を表す。）
で示されるホモポリマー。
  上記式Iに示されるポリマーにおいて、メチレン基を介した１級アミン又はエステル結合を介した１級アミンとしては、例えば次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 （Ｒ３は水素原子、又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 （Ｒ４は置換基を有していてもよい炭素数１～２０の炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複素環式官能基を表し、ｊは０～５の整数を表す。）で示される基を表すか、又はＲ３及びＲ４は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸のタンパク質における側鎖構造を表し、Ｒ６は、水素原子、又は１若しくは複数の任意のアミノ酸を表し、ｋは０～５の整数を表す。）
で示されるものが挙げられる。
  Ｒ３及びＲ４は、例えば任意のアミノ酸（例えば２０種類のアミノ酸）のタンパク質における側鎖構造である。
  また本発明においては、－ＮＨＲ６のＲ６を任意のアミノ酸（例えば２０種類の天然アミノ酸や人工アミノ酸）とし、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド等にすることもできる。また、Ｒ６を１若しくは複数の任意のアミノ酸とする場合には、アミド結合を形成させて付加することができる。
  例えば、実施例に記載のPGLeu, PGGTryのロイシンやトリプトファンに代えて、システイン、ヒスチジン、その他塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン）にすることができる。システインにすると、ジスルフィド架橋が可能となり、またヒスチジンにすると、ポリマーにエンドソーム脱出能を付与することができる。塩基性アミノ酸にすると、カチオン電荷を増やすことが可能となる。また、PGLeuにトリプトファンを結合したジペプチド（PGLeu-Trp）、PGLeuにシステインを結合したジペプチド（PGLeu-Cys）、PGLeuにヒスチジンを結合したジペプチド（PGLeu-His）とすることもできる。
  任意のアミノ酸を結合させると、－ＮＨＲ６のＮＨ部分は１級アミンではなくなるが、結合したアミノ酸が１級アミンを有しているので、これらの化合物も本発明における「エステル結合を介した１級アミン」に包含される。
  本発明において、－ＮＨＲ６のＲ６は、-(COCR3NH)ｐ-Hで示されるものが挙げられる。Ｒ３は前記と同様である。ｐは繰り返し単位であり、1～10,000の整数を表す。
  ここで、置換基を有していてもよい複素環式官能基としては、例えばインドリル環、ピロリドン基、フラン環、ピリジン環、モルホリン環、エポキシ環、プリン環、ピリミジン環等が挙げられる。
  また、式Iにおいて、ハロゲン原子としてはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなどが挙げられる。
  式Iに示されるポリマーにおいて、Ｒ５ａ及びＲ５ｂは、メチレン基を介した１級アミンの場合はＢｒ（臭素）、エステル結合を介した１級アミンの場合は－ＯＣＯＣＨ（ＮＨ）Ｒ３の構造をとることができる。
（ｂ）１級アミンを含む側鎖を有するポリグリシジル鎖とポリエチレングリコール鎖とのブロック共重合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
  式IIにおいて、Ｒ１は、メチレン基を介した１級アミン又はエステル結合を介した１級アミンを表すが、これらの１級アミンの詳細は前記と同様である。
  Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して、水素原子、又は親水性基を表す。親水性基としては、例えば、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 （Ｒ２０は－Ｏ－ＣＨ３で示される基、又はリガンド分子を表し、Ｌ２は連結基を表し、ｎは5～20,000の整数を表す。）で示される基（例えばポリエチレングリコール）が挙げられる。
  Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、上記式で示される基（ポリエチレングリコール）のほか、他の親水性基（親水性ポリマー）とすることもできる。そのような親水性基としては、例えば、ポリエチレンイミン、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２－アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、Ｎ－（２－メタクリルアミド）エチルホスホリルコリン、４－メタクリロイルオキシブチルホスホリルコリンなどが挙げられる。
  リガンド分子は、特定の生体分子を標的する目的で使用される化合物を意味し、例えば抗体、タンパク質、アミノ酸、低分子薬剤、生体高分子のモノマーなどが挙げられる。
  本発明において、Ｌ１ａ及びＬ１ｂは、それぞれ独立して連結基を表し、ｍは2～5,000の整数を表す。連結基は、ブロック共重合体の各ブロック間のスペーサーを意味し、例えば単結合又は－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－で示される基を表すことができる。
  Ｒ１としては、例えば－ＣＨ２ＮＨ２又は－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２で示されるものが挙げられる。また、Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 （Ｒ３は水素原子、又は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 （Ｒ４はプロピル基、置換基を有していてもよいインドリル基、又は置換基を有していてもよいフェニル基を表す。）で示される基を表す。）で示されるものが挙げられる。
  Ｒ２ａ及び／又はＲ２ｂは、例えば次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 （ｎは5～20,000の整数を表す。）
で示されるものが挙げられる。
＜炭化水素基、置換基等について＞
  炭化水素基は、飽和又は不飽和の非環式又は環式である。炭化水素基が非環式の場合には、直鎖状でも分岐状でもよい。炭化水素基には、炭素数１～２０（「Ｃ１－２０」と表記する。他の炭素数の場合も同様。）アルキル基、Ｃ２－２０アルケニル基、Ｃ２－２０アルキニル基、Ｃ４－２０アルキルジエニル基、Ｃ６－１８アリール基、Ｃ７－２０アルキルアリール基、Ｃ７－２０アリールアルキル基、Ｃ３－２０シクロアルキル基、Ｃ３－２０シクロアルケニル基、Ｃ１－２０アルコキシ基、Ｃ６－２０アリールオキシ基、Ｃ７－２０アルキルアリールオキシ基、Ｃ２－２０アルコキシカルボニル基などが含まれる。
  Ｃ１－６アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n‐ブチル基、ｓｅｃ-ブチル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。
  Ｃ１－２０アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n‐ブチル基、ｓｅｃ-ブチル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等が挙げられる。
  Ｃ２－２０アルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、プロペニル基、イソプロペニル基、2-メチル-1-プロペニル基、2-メチルアリル基、2-ブテニル基等が挙げられる。
  Ｃ２－２０アルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基等が挙げられる。
  Ｃ４－２０アルキルジエニル基としては、例えば1,3-ブタジエニル基等が挙げられる。
  Ｃ６－１８アリール基としては、例えばフェニル基、1-ナフチル基、2-ナフチル基、インデニル基、ビフェニル基、アントリル基、フェナントリル基等が挙げられる。
  Ｃ７－２０アルキルアリール基としては、例えばo-トリル基、m-トリル基、p-トリル基、2,3-キシリル基、2,5-キシリル基、o-クメニル基、m-クメニル基、p-クメニル基、メシチル基等が挙げられる。
  Ｃ７－２０アリールアルキル基としては、例えばベンジル基、フェネチル基、1-ナフチルメチル基、2-ナフチルメチル基、1-フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基、ジエチルベンジル基等が挙げられる。
  Ｃ３－２０シクロアルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。
  Ｃ３－２０シクロアルケニル基としては、例えばシクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基等が挙げられる。
  Ｃ１－２０アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基等が挙げられる。
  Ｃ６－２０アリールオキシ基としては、例えばフェニルオキシ基、ナフチルオキシ基、ビフェニルオキシ基等が挙げられる。
  Ｃ７－２０アルキルアリールオキシ基としては、例えばメチルフェニルオキシ基、エチルフェニルオキシ基、プロピルフェニルオキシ基、ブチルフェニルオキシ基、ジメチルフェニルオキシ基、ジエチルフェニルオキシ基、ジプロピルフェニルオキシ基、ジブチルフェニルオキシ基、メチルエチルフェニルオキシ基、メチルプロピルフェニルオキシ基、エチルプロピルフェニルオキシ基等が挙げられる。
  Ｃ２－２０アルコキシカルボニル基としては、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、2‐メトキシカルボニル基、t‐ブトキシカルボニル基等が挙げられる。
  置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい複素環式官能基における置換基の具体例としては、例えば、ハロゲン原子（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、水酸基、チオール基、ニトロ基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、シリル基、メタンスルホニル基、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ２－６アルケニル基、Ｃ２－６アルキニル基、Ｃ３－８シクロアルキル基、Ｃ６－１０アリール基、Ｃ１－６アルコキシ基、Ｃ１－７アシル基又はＣ２－７アルコキシカルボニル基などを挙げることができる。
  本発明においては、置換基を有していてもよいフェニル基、置換基を有していてもよい複素環式官能基が好ましいが、これらに限定されるものではない。
  式Iで示されるポリマーの分子量（Mn）は、限定はされないが、200～500,000であり、好ましくは1,000～100,000である。
  また、式IIで示されるブロックコポリマーの分子量（Mn）は、限定はされないが、400～1,400,000であり、好ましくは1,000～144,000である。また、個々のブロック部分については、PEG部分の分子量は、例えば200～200,000であり、好ましくは200～44,000である。ポリグリシジル鎖部分の分子量は、例えば200～500,000であり、好ましくは1,000～100,000である。
２．ポリマー化合物の製造
（１）式Iで示されるポリマーの製造
  式Iで示されるポリマーの製造方法を以下に示す。
  テトラ-n-オクチルアンモニウムブロミドを開始剤とするエポキシ開環重合により、側鎖を有するポリグリシジル鎖からなるホモポリマーを得る。エポキシ開環重合は、重合モノマーとしてエポキシ基の構造を有する限り特に限定されるものではなく、例えば、エピクロロヒドリン、1,2-エポキシ-5-ヘキセン、1-アリル-2,3-エポキシプロパン、エピブロモヒドリン、3,4-エポキシ-1-ブタン、1,2-エポキシ-9-デセン、2,3-エポキシプロピルプロパルギルエーテル、などを使用することができる。
  重合後は、化学合成したブロック共重合体の分子量分布及び重合度を分析しておくことが好ましい。
  さらに、RNAとの静電相互作用によるポリプレックスを調製するため、得られたブロック共重合体のポリグリシジル鎖の側鎖に１級アミンを導入する。ポリグリシジル鎖の側鎖への１級アミンの導入については、ヒドロホウ素化アミノ化において溶媒を適切に選択することで、高い収率を達成することができる。このようにして得られた、側鎖に１級アミンを導入したポリグリシジル鎖を、ポリグリシジルアミンともいう。
（２）式IIで示されるポリマーの製造
  式IIで示されるポリマーの製造方法を以下に示す。
  ブロック共重合体の化学合成に関して、開始剤であるポリエチレングリコール鎖の吸水性が重合を阻害することが考えられる。そこで、ポリエチレングリコールを重合前に共沸により脱水する。次いで、エポキシ開環重合を行って、ポリエチレングリコールと、側鎖を有するポリグリシジル鎖とのブロック共重合体を得る。この場合、ポリエチレングリコールをトルエン等により脱水することにより、エポキシ開環重合が進行し、分子量分布及び重合度の制御されたブロック共重合体を合成することができる。エポキシ開環重合は、重合モノマーとしてエポキシ基の構造を有する限り特に限定されるものではなく、例えば、エピクロロヒドリン、1,2-エポキシ-5-ヘキセン、1-アリル-2,3-エポキシプロパン、エピブロモヒドリン、3,4-エポキシ-1-ブタン、1,2-エポキシ-9-デセン、2,3-エポキシプロピルプロパルギルエーテル、などを使用することができる。
  重合後は、化学合成したブロック共重合体の分子量分布及び重合度を分析しておくことが好ましい。
  さらに、RNAとの静電相互作用による高分子ミセルを調製するため、得られたブロック共重合体のポリグリシジル鎖の側鎖に１級アミンを導入する。ポリグリシジル鎖の側鎖への１級アミンの導入については、ヒドロホウ素化アミノ化において溶媒を適切に選択することで、高い収率を達成することができる。このようにして得られた、側鎖に１級アミンを導入したポリグリシジル鎖を、ポリグリシジルアミンともいう。
  本発明においては、式IIで示されるポリマー化合物の具体例として、後述の製造例２～７に記載のポリマーを挙げることができる。
３．ポリイオンコンプレックス
　本発明のポリイオンコンプレックス（ポリマー複合体）は、核酸と本発明のポリマー化合物とを緩衝液中で混合することにより得ることができる高分子化合物の複合体であり、ポリイオンコンプレックス（PIC)、又はポリイオンコンプレックス型高分子ミセル（PICミセル）とも呼ばれる。
  本発明のポリイオンコンプレックスを形成するポリマーがPEGとポリグリシジルアミンからなるブロック共重合体の場合は、核酸とポリカチオン部分とが静電的相互作用をしてコア部分を形成し、その外側をPEGが覆う形態となっている。
　本発明のポリマー複合体は、例えば、核酸とポリマー化合物とを任意のバッファー中で混合することにより容易に調製することができる。
　本発明のPICの大きさは、例えば、動的光散乱測定法（DLS）による粒径が60～80nmである。
　ポリマー化合物と核酸との混合比は限定されるものではなく、例えば、ブロックコポリマー中のカチオン性基（例えばアミノ基）の総数（N）と、核酸中のリン酸基の総数（P）との比（N/P比）が、1～30であることが好ましく、より好ましくは1～10、さらに好ましくは1～3である。
  当該製造方法の具体例としては、後述する実施例に記載の合成スキームを参照することができる。
 本発明のポリイオンコンプレックスにおいて、核酸の輸送担体としての機能は、血清中での安定性及びタンパク質翻訳効率を指標として評価することができる。また、生体内に豊富に存在するポリアニオンに対する安定性の評価、あるいはin vivo環境における輸送担体としての機能は、血中滞留性を指標として評価することができる。
  本発明の別の態様では、臨床応用に向けた生分解性輸送担体の設計のため、ポリグリシジル鎖の側鎖にエステル結合を介してアミノ酸を導入した生分解性ブロック共重合体を設計することもできる。この場合、エステル結合の開裂により、生体内におけるポリマーの毒性が減少する。エステル結合の開裂は、生理塩条件におけるポリマー内の１級アミンの定量を行うことで評価できる。ポリマー毒性の評価には、生細胞を用いて行うことも可能である。
  例えば、アミノ酸の一つであるロイシンを導入した生分解性ポリマーについて、RNAの輸送担体としての機能評価として、生体内に豊富に存在するポリアニオン及び血清中での安定性の評価を行う。ここでは、ロイシン中のイソブチル基によりポリイオンコンプレックスの疎水性相互作用が高まる。
  さらに、本願発明のミセルの血清中における安定性を評価したところ、ポリリジン鎖からなるミセルよりも著明な安定性を示し、結果的に高い翻訳効率を示した。さらに、生体内に豊富に存在するポリアニオンに対する安定性も向上したことから、生体内において高い安定性を示すことが期待される。とりわけ酵素耐性が大きな問題となるmRNAを用いて、in vivo環境における血中滞留性を評価した。すると、本願発明のミセルでは、ポリリジン鎖を有するミセルよりも優れた血中滞留性を示した。このことから、ひずみの小さなエーテル結合を有するポリグリシジル鎖の導入により、生体内でのmRNAの酵素分解に対する耐性向上が達成された。
   生分解性輸送担体について、ポリマーとアミノ酸との間に導入したエステル結合の生理塩条件における開裂を評価したところ、加水分解に伴う１級アミンの減少が確認され、培養細胞に対する毒性が減少した。また、疎水性アミノ酸の一つであるロイシンを導入した生分解性ポリマーからなる高分子ミセルについて生体内に豊富に存在するポリアニオンに対する安定性を評価したところ、疎水性官能基であるイソブチル基を持たないポリマーよりもさらなる安定性の向上が示された。このことから、生体内において高い安定性及び低い毒性を有する輸送担体の開発に成功した。
４．核酸
　本発明のポリイオンコンプレックスにおいて、コア部分の構成成分として内包する核酸は、１つの態様ではDNA又はRNAである。RNAとしては、mRNA、siRNA（small interfering RNA）、アンチセンス核酸（アンチセンスRNA）、アプタマー（RNAアプタマー）、self-replicating RNA、miRNA（micro RNA）、lncRNA (long non cording RNA)などが挙げられる。DNAとしては、アンチセンス核酸（アンチセンスDNA）、アプタマー（DNAアプタマー）、pDNA（plasmid DNA）、MCDNA（minicircle DNA）などが挙げられる。
  siRNAは、RNA干渉（RNAi：RNA interference）利用して目的の遺伝子の発現を抑制し得るものであればよく、例えば、目的遺伝子としては、癌（腫瘍）遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、細胞周期関連遺伝子、増殖シグナル遺伝子等が好ましく挙げられる。また、siRNAの塩基長は、通常、30塩基未満（例えば19～21塩基）であればよく、限定はされない。
　siRNA等の核酸分子はポリアニオンとなるため、前記ブロックコポリマーのポリカチオン部分の側鎖と、静電的相互作用により結合（会合）することができる。
５．核酸送達デバイス用キット
　本発明の核酸送達デバイス用キットは、本発明のポリマー化合物を含むことを特徴とするものである。当該キットは、例えば各種標的細胞に対してRNAiを利用した遺伝子治療、mRNAを利用したタンパク質治療に好ましく用いることができる。
　本発明のキットにおいて、ポリマーの保存状態は、限定はされず、その安定性（保存性）及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状等の状態を選択できる。
　本発明のキットは、前記ポリマー化合物以外に他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、例えば、細胞内に導入する核酸、溶解用又は希釈用等の各種バッファー、溶解用バッファー、各種タンパク質、及び使用説明書（使用マニュアル）等を挙げることができ、使用目的と使用するポリマーの種類に応じて、適宜選択することができる。
　本発明のキットは、標的細胞内に導入する所望の核酸（例えばmRNA又はsiRNA）をコア部分としたポリイオンコンプレックス（PIC）を調製するために使用され、調製したPICは、標的細胞への核酸送達デバイスとして有効に用いることができる。
６．核酸送達デバイス
　本発明においては、上述したポリイオンコンプレックスを含む核酸送達デバイスが提供される。本発明の送達デバイスは、標的細胞内へ安定したまま送達することが困難であった核酸を、酵素による分解に対して耐性を向上させ安定化状態にすることができる。
　本発明の送達デバイスは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ等の各種動物に適用することができ、限定はされない。被験動物への投与方法は、通常、点滴静注などの非経口用法が採用され、投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、被験動物の種類及び状態に合わせて適宜設定することができる。
　本発明の送達デバイスは、各種疾患の原因となる細胞に所望の核酸を導入する治療（遺伝子治療）に用いることができる。よって本発明は、前記ポリプレックスを含む各種疾患の治療用の医薬組成物、当該医薬組成物を有効成分として含む各種疾患用の遺伝子治療剤、及び、前述したPICを用いる各種疾患の治療方法（特に遺伝子治療方法）を提供することもできる。
 投与の方法及び条件は前記と同様である。また、各種疾患としては、例えば、癌（例えば、肺癌、膵臓癌、脳腫瘍、肝癌、乳癌、大腸癌、神経芽細胞腫 及び膀胱癌等）、循環器疾患、運動器疾患、及び中枢系疾患等が挙げられ、特に限定されるものではない。
　上記医薬組成物については、薬剤製造上一般に用いられる賦形剤、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。また、医薬組成物の形態は、通常、静脈内注射剤（点滴を含む）が採用され、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
  実施例
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
  各種ポリマーの合成
  製造例１：ポリエチレングリコール-block-ポリ(L-リジン)の合成
合成スキーム：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　アミノ基を末端に有するポリエチレングリコールを真空乾燥により脱水し、重合モノマーであるε-トリフルオロ酢酸-L-リジン-N-カルボン酸無水物(Lys(TFA)-NCA)をN, N-ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、35°Cで1晩重合反応を行った。反応後にジエチルエーテルを用いた再沈殿法により精製を行い、真空乾燥により粉末状のポリマーが得られた。次に、ポリマーをメタノールに溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて室温で1晩反応させた。反応後に水に対する透析を行い精製を行い、凍結乾燥により粉末状のポリマーが得られた。得られたポリマー（以下、PEG-PLLともいう）は以下の構造式で表すことのできるポリマーであり、n=272、m=83であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
製造例２：ポリエチレングリコール-block-ポリ(グリシジルブチルアミン)の合成
合成スキーム：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　ヒドロキシル基を末端に有するポリエチレングリコールをトルエンに溶解し、180°Cで1時間加熱することによりポリエチレングリコールを脱水した。重合モノマーである1, 2-エポキシ-5-ヘキセンおよび触媒であるトリイソブチルアルミニウムを加えて、室温で1晩重合反応を行った。反応後にジエチルエーテルを用いた再沈殿法により精製を行い、真空乾燥により粉末状のポリマーが得られた。次に、ポリマーをテトラヒドロフランに溶解し、ボランを加えて66°Cで1晩還流した。粉末状のヒドロキシルアミン-O-スルホン酸を加えて室温で1晩反応させた。反応後に水に対する透析を行い精製を行い、凍結乾燥により粉末状のポリマーが得られた。得られたポリマー（以下、PEG-PGBAともいう）は以下の構造式で表すことのできるポリマーであり、n=272、m=93であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
製造例３：ポリエチレングリコール-block-ポリ(グリシジルメチルアミン)の合成
合成スキーム：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　ヒドロキシル基を末端に有するポリエチレングリコールをトルエンに溶解し、180°Cで1時間加熱することによりポリエチレングリコールを脱水した。重合モノマーであるエピクロロヒドリンおよび触媒であるトリイソブチルアルミニウムを加えて、室温で1晩重合反応を行った。反応後にジエチルエーテルを用いた再沈殿法により精製を行い、真空乾燥により粉末状のポリマーが得られた。次に、ポリマーをDMFに溶解し、アジ化ナトリウムを加えて180°Cで1晩反応させた。反応後にジエチルエーテルを用いた再沈殿法により精製を行い、真空乾燥により粉末状のポリマーが得られた。さらに、ポリマーをDMFに溶解し、トリフェニルフォスフィンを加えて室温で1晩反応させた。反応後に水を加えて1晩反応させて、反応後に水に対する透析を行い精製を行い、凍結乾燥により粉末状のポリマーが得られた。得られたポリマー（以下、PEG-PGMAともいう）は以下の構造式で表すことのできるポリマーであり、n=272、m=81であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
製造例４：ポリエチレングリコール-block-ポリ(グリシジルグリシン)の合成
合成スキーム：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　ヒドロキシル基を末端に有するポリエチレングリコールをトルエンに溶解し、180°Cで1時間加熱することによりポリエチレングリコールを脱水した。重合モノマーであるエピクロロヒドリンおよび触媒であるトリイソブチルアルミニウムを加えて、室温で1晩重合反応を行った。反応後にジエチルエーテルを用いた再沈殿法により精製を行い、真空乾燥により粉末状のポリマーが得られた。次に、水酸化ナトリウム水溶液を加えて1晩反応させて、反応後に水に対する透析を行い精製を行い、凍結乾燥により粉末状のポリマーが得られた。さらに、ポリマーをDMFに溶解し、N-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]-L-グリシンおよびジメチルアミノピリジン、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドを加えて1晩反応させた。反応後にジエチルエーテルを用いた再沈殿法により精製を行い、真空乾燥により粉末状のポリマーが得られた。次に、ポリマーをDMFに溶解し、ピペリジンを加えて1晩反応させた。反応後に水に対する透析を行い精製を行い、凍結乾燥により粉末状のポリマーが得られた。得られたポリマー（以下、PEG-PGGlyともいう）は以下の構造式で表すことのできるポリマーであり、n=272、m=81であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
製造例５：ポリエチレングリコール-block-ポリ(グリシジルロイシン)の合成
合成スキーム：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　ヒドロキシル基を末端に有するポリエチレングリコールをトルエンに溶解し、180°Cで1時間加熱することによりポリエチレングリコールを脱水した。重合モノマーであるエピクロロヒドリンおよび触媒であるトリイソブチルアルミニウムを加えて、室温で1晩重合反応を行った。反応後にジエチルエーテルを用いた再沈殿法により精製を行い、真空乾燥により粉末状のポリマーが得られた。次に、水酸化ナトリウム水溶液を加えて1晩反応させて、反応後に水に対する透析を行い精製を行い、凍結乾燥により粉末状のポリマーが得られた。さらに、ポリマーをDMFに溶解し、N-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]-L-ロイシンおよびジメチルアミノピリジン、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドを加えて1晩反応させた。反応後にジエチルエーテルを用いた再沈殿法により精製を行い、真空乾燥により粉末状のポリマーが得られた。次に、ポリマーをDMFに溶解し、ピペリジンを加えて1晩反応させた。反応後に水に対する透析を行い精製を行い、凍結乾燥により粉末状のポリマーが得られた。得られたポリマー（以下、PEG-PGLeuともいう）は以下の構造式で表すことのできるポリマーであり、n=272、m=81であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
製造例６：ポリエチレングリコール-block-ポリ(グリシジルトリプトファン)の合成
合成スキーム：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　ヒドロキシル基を末端に有するポリエチレングリコールをトルエンに溶解し、180°Cで1時間加熱することによりポリエチレングリコールを脱水した。重合モノマーであるエピクロロヒドリンおよび触媒であるトリイソブチルアルミニウムを加えて、室温で1晩重合反応を行った。反応後にジエチルエーテルを用いた再沈殿法により精製を行い、真空乾燥により粉末状のポリマーが得られた。次に、水酸化ナトリウム水溶液を加えて1晩反応させて、反応後に水に対する透析を行い精製を行い、凍結乾燥により粉末状のポリマーが得られた。さらに、ポリマーをDMFに溶解し、N-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]-L-トリプトファンおよびジメチルアミノピリジン、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドを加えて1晩反応させた。反応後にジエチルエーテルを用いた再沈殿法により精製を行い、真空乾燥により粉末状のポリマーが得られた。次に、ポリマーをDMFに溶解し、ピペリジンを加えて1晩反応させた。反応後に水に対する透析を行い精製を行い、凍結乾燥により粉末状のポリマーが得られた。得られたポリマー（以下、PEG-PGTryともいう）は以下の構造式で表すことのできるポリマーであり、n=272、m=81であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
製造例７：ポリエチレングリコール-block-ポリ(グリシジルチロシン)の合成
合成スキーム：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　ヒドロキシル基を末端に有するポリエチレングリコールをトルエンに溶解し、180°Cで1時間加熱することによりポリエチレングリコールを脱水した。重合モノマーであるエピクロロヒドリンおよび触媒であるトリイソブチルアルミニウムを加えて、室温で1晩重合反応を行った。反応後にジエチルエーテルを用いた再沈殿法により精製を行い、真空乾燥により粉末状のポリマーが得られた。次に、水酸化ナトリウム水溶液を加えて1晩反応させて、反応後に水に対する透析を行い精製を行い、凍結乾燥により粉末状のポリマーが得られた。さらに、ポリマーをDMFに溶解し、N-[(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)カルボニル]-L-チロシンおよびジメチルアミノピリジン、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドを加えて1晩反応させた。反応後にジエチルエーテルを用いた再沈殿法により精製を行い、真空乾燥により粉末状のポリマーが得られた。次に、ポリマーをDMFに溶解し、ピペリジンを加えて1晩反応させた。反応後に水に対する透析を行い精製を行い、凍結乾燥により粉末状のポリマーが得られた。得られたポリマー（以下、PEG-PGTyrともいう）は以下の構造式で表すことのできるポリマーであり、n=272、m=81であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGLeuを用いた血清中での酵素耐性試験
　この実施例では、PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGLeuからなる高分子ミセルの分解酵素に対する安定性を、ウシ胎児血清(FBS)により評価する。
<材料および方法>
　PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGLeuおよびルシフェラーゼmRNAとのミセルは、PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGLeu溶液とmRNA溶液をN/P比が3となるように混合することによって調製した。なお、ここで言うN/P比とは、次式によって定義される量であり、以後断りの無い限り、N/P比とはこの量の事を指す。
　N/P比=(溶液中のポリマーのアミノ基の総数)/(溶液中の核酸のリン酸基の総数)
　FBSを10 mM HEPES buffer (pH 7.3)で50%となるよう希釈し、そこにミセル溶液添加したのち、37°Cで15分静置した。その後、RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて溶液よりmRNAを抽出した。抽出したmRNAをコンプリメンタリーDNA (cDNA)に逆転写した後、qRT-PCRにより残存しているcDNAを定量評価した。FBS存在下で37°C静置を行わなかった場合のmRNA量を100%として、相対値を示した。
<結果>
　図1に示すように、PEG-PGBAからなるミセルは、PEG-PLLからなるミセルよりも高い酵素耐性を示した。このことは、PEG-PGBAの柔軟なポリグリシジル鎖により酵素耐性が向上されたことを示すものである。一方、PEG-PGMAからなるミセルは、PEG-PGBAからなるミセルと同程度の酵素耐性を示したことから、側鎖メチレン基数は酵素耐性に影響を与えないことが確認された。さらに、PEG-PGLeuからなるミセルは、PEG-PGBAからなるミセルよりも高い酵素耐性を示した。このことは、PEG-PGLeuの疎水的なイソブチル基により酵素耐性が向上されたことを示すものである。
PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMAを用いた培養細胞への遺伝子導入
　この実施例では、PEG-PLL、PEG-PGBA、またはPEG-PGMAからなる高分子ミセルの培養細胞への遺伝子導入能を、ルシフェラーゼmRNAにより評価する。
<材料および方法>
　PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMAおよびルシフェラーゼmRNAとのミセルは、PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA溶液とmRNA溶液をN/P比が3となるように混合することによって調製した。
　細胞の準備として、HuH-7細胞を96wellプレートに1.0×104 cells/well播き、10%FBS入りDMEMに交換し(200 μL/well)、調製した各ミセル溶液を培地中に滴下することによって、トランスフェクションを行った。mRNA量として200 ng/well投与した。そのまま24時間インキュベートした後、培地中の発光強度を測定した。
<結果>
　図2に示すように、PEG-PGBAからなるミセルがPEG-PLLからなるミセルよりも高い遺伝子発現を示した。このことは、PEG-PGBAの柔軟なポリグリシジル鎖により酵素耐性が向上し、mRNAが細胞内へ送達されたことを示すものである。一方、PEG-PGMAからなるミセルはPEG-PGBAからなるミセルと同程度の遺伝子発現効率を示したことから、側鎖メチレン基数は遺伝子発現効率に影響を与えないことが確認された。
PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGGly、PEG-PGLeu、PEG-PGTry、PEG-PGTyrを用いたヘパリン中でのポリアニオン耐性試験
　この実施例では、PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGGly、PEG-PGLeu、PEG-PGTry、PEG-PGTyrからなる高分子ミセルのポリアニオンに対する安定性を、ヘパリンにより評価する。
<材料および方法>
　PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGGly、PEG-PGLeu、PEG-PGTry、PEG-PGTyrおよび蛍光標識ルシフェラーゼmRNAとのミセルは、PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、PEG-PGGly、PEG-PGLeu、PEG-PGTry、PEG-PGTyr溶液とmRNA溶液をN/P比が3となるように混合することによって調製した。
　ヘパリンを10 mM HEPES buffer (pH 7.3)で希釈し、ミセル溶液と種々のS/P比で混合し、室温で6時間静置した。なお、ここで言うS/P比とは、次式によって定義される量である。
S/P比=(溶液中のヘパリンのアニオンの総数)/(溶液中の核酸のリン酸基の総数)
　ミセル溶液を10 mM HEPES buffer (pH 7.3)で希釈し、蛍光相関分光法により蛍光標識mRNAの拡散係数を測定した。
<結果>
　図3に示すように、PEG-PGBAからなるミセルは、PEG-PLLからなるミセルよりも高いポリアニオン耐性を示した。このことは、PEG-PGBAの柔軟なポリグリシジル鎖によりポリアニオン耐性が向上されたことを示すものである。一方、PEG-PGMAからなるミセルはPEG-PGBAからなるミセルと同様の拡散係数を示したことから、側鎖メチレン基数はポリアニオン耐性に影響を与えないことが確認された。
　また、図4に示すように、PEG-PGLeuからなるミセルは、PEG-PGGlyからなるミセルよりも高いポリアニオン耐性を示した。このことは、PEG-PGLeuの疎水的なイソブチル基によりポリアニオン耐性が向上されたことを示すものである。また、PEG-PGTryからなるミセルがPEG-PGGlyからなるミセルよりも高いポリアニオン耐性を示した。このことは、PEG-PGTry のmRNA中のプリン塩基との相互作用によりポリアニオン耐性が向上されたことを示すものである。さらに、PEG-PGTyrからなるミセルは、PEG-PGGlyからなるミセルよりも高いポリアニオン耐性を示した。このことは、PEG-PGTry のmRNA中のピリミジン塩基との相互作用によりポリアニオン耐性が向上されたことを示すものである。
PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMAを用いた生体内における安定性試験
　この実施例では、PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA、からなる高分子ミセルの生体内における安定性を、マウス血中における滞留性により評価する。
<材料および方法>
　PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMAおよびルシフェラーゼmRNAとのミセルは、PEG-PLL、PEG-PGBA、PEG-PGMA溶液とmRNA溶液をN/P比が3となるように混合することによって調製した。
　Balb/Cマウスの尾静脈より、40 μgのmRNAを含むミセル溶液を200 μL投与した。2.5、5、10分後に尾静脈より2 μLの血液を採血した。採血した血液から、RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いてmRNAを抽出し、抽出したmRNAをcDNAに逆転写した後、qRT-PCRによりcDNAを定量評価した。
<結果>
　図5に示すように、PEG-PGBAからなるミセルは、PEG-PLLからなるミセルよりも優れた血中滞留性を示した。このことは、PEG-PGBAの柔軟なポリグリシジル鎖により酵素耐性およびポリアニオン耐性が向上され、生体における安定性が向上されたことを示すものである。一方、PEG-PGMAからなるミセルは、PEG-PGBAからなるミセルと同様の血中滞留性を示したことから、側鎖メチレン基数は血中滞留性に影響を与えないことが確認された。
PEG-PLLおよびPEG-PGLeuを用いた加水分解試験
　この実施例では、PEG-PLLおよびPEG-PGLeuの生理塩条件における加水分解の時間依存性を、フルオレスカミン法によるポリマー内の１級アミンの定量により評価した。
<材料および方法>
　PEG-PLLおよびPEG-PGLeuをPBS (pH 7.4)に溶解し、37°Cで1、3、6、24時間静置した。その後、限外濾過により加水分解により脱離したL-ロイシンを除去し、凍結乾燥により粉末状のポリマーを得た。
　ポリマーをPBSに溶解し、PBSに溶解したフルオレスカミンを加えて、蛍光強度を測定した。N-ブチルアミンをもとに蛍光強度を１級アミン数に変換し、ポリマー内の１級アミン数とした。
<結果>
　図6に示すように、PEG-PLLにおいては１級アミン数の変化は見られなかったが、PEG-PGLeuにおいては１級アミン数が減少した。このことは、PEG-PGLeuが生理条件においてエステル結合の開裂により安全なポリエチレングリコール-block-ポリグリセロール（以下、PEG-PGlycerolともいう）とL-ロイシンに加水分解されたことを示すものである。
PEG-PLL、PEG-PGLeuを用いた培養細胞に対する毒性試験
　この実施例では、PEG-PLLおよびPEG-PGLeuの培養細胞に対する毒性を、ポリマー添加後の細胞生存率により評価した。
<材料および方法>
　PEG-PLL、PEG-PGLeuを10 mM HEPES buffer (pH 7.3)に溶解し、ポリマー溶液の希釈系列を作成した。
　細胞の準備として、HEK293細胞を96wellプレートに1.0×104 cells/well播き、10%FBS入りDMEMに交換し(200 μL/well)、各ポリマー溶液を培地中に滴下した。そのまま24時間インキュベートした後、10%FBS入りDMEMに交換し、Cell counting kit-8 (CCK-8) 法により細胞生存数を測定した。ポリマー溶液の代わりに10 mM HEPES bufferを添加したものを100%とし、細胞生存率を算出した。
<結果>
　図７に示すように、PEG-PLLにおいては高濃度のポリマー溶液の添加により細胞生存率の減少が確認されたが、PEG-PGLeuにおいては高濃度のポリマー溶液の添加によっても細胞生存率の減少は確認されなかった。このことは、PEG-PGLeuが培地中で安全なPEG-PGlycerolとL-ロイシンに加水分解されて、ポリマー中の正電荷の電荷密度の減少により細胞毒性が減少したことを示すものである。
PEG-PGBA, PEG-PLLを用いたmRNAミセルの熱力学的安定性の評価
　この実施例では、PEG-PGBA, PEG-PLLからなる高分子ミセルの熱力学的安定性を、等温滴定熱測定(ITC)により評価する。
実験方法
　mRNA溶液(11 μM, 10 mM HEPES buffer (pH 7.3))にPEG-PGBAまたはPEG-PLL溶液(110 μM, 10 mM HEPES buffer (pH 7.3))を滴下し、PIC形成に伴う反応熱をiTC200 (GE Healthcare)により測定した。また、得られた測定データをORIGIN7ソフトにより解析することにより、結合比、エンタルピー、エントロピー、結合定数を算出した。
結果
　図8および表1に示すように、PEG-PGBAからなるミセルは、PEG-PLLからなるミセルよりも低いエンタルピー変化および高いエントロピー変化を示した。このことは、柔軟なPGBA鎖によりmRNAとの接触面積が増加し表面エネルギーが減少したこと、およびmRNAとのイオン対形成が促進し自由水の放出が促進されたことを示すものである。その結果、PEG-PGBAとmRNAとの結合定数が増大した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
PEG-PGTrp, PEG-PGTyrを用いたmRNAとの相互作用の評価
　この実施例では、PEG-PGTrp, PEG-PGTyrからなる高分子ミセル中のポリマーとmRNAとの相互作用を、蛍光強度を測定することにより評価した。
実験方法
　PEG-PGTrp, PEG-PGTyrおよびルシフェラーゼmRNAとのミセルは、PEG-PGTrp, PEG-PGTyr溶液とmRNA溶液をN/P比が3となるように混合することによって調製した。また、　PEG-PGTrp, PEG-PGTyrおよびHomo-poly(L-aspartate) (Homo-PAsp, PAsp鎖の重合度は80)とのミセルは、PEG-PGTrp, PEG-PGTyr溶液とHomo-PAsp溶液をN/P比が3となるように混合することによって調製した。ここで、Homo-PAspは、PEG-PLLと同様にn-ブチルアミンを開始剤とするNCA重合法により合成した。
　ポリマーおよび調製したミセル溶液の蛍光強度(Ex/Em = 280/350 nm)をNanodrop (Thermo Fisher Scientific, USA)により測定した。得られた蛍光強度はポリマーの蛍光強度を1として規格化した。
結果
　図9および図10に示すように、mRNAのポリマーへの添加により蛍光強度が減少した。このことは、ポリマー中のトリプトファンおよびチロシンが他のポリマーまたはmRNA中の塩基とπ-π相互作用していることを示すものである。また、塩基を持たないHomo-PAspの添加により蛍光強度が増加した。このことは、ポリマー中のトリプトファンおよびチロシンがmRNA中の塩基とπ-π相互作用していることを示すものである。
PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyを用いた血清中での酵素耐性試験
　この実施例では、PEG-PGTrp, PEG-PGTyrからなる高分子ミセルの分解酵素に対する安定性を、ウシ胎児血清(FBS)により評価する。
実験方法
　PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyおよびルシフェラーゼmRNAとのミセルは、PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGly溶液とmRNA溶液をN/P比が3となるように混合することによって調製した。
　FBSを10 mM HEPES buffer (pH 7.3)で50%となるよう希釈し、そこにミセル溶液添加したのち、37°Cで15分静置した。その後、RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて溶液よりmRNAを抽出した。抽出したmRNAをコンプリメンタリーDNA (cDNA)に逆転写した後、qRT-PCRにより残存しているcDNAを定量評価した。FBS存在下で37°C静置を行わなかった場合のmRNA量を100%として、相対値を示した。
結果
　図11に示すように、PEG-PGLeuからなるミセルは、PEG-PGGlyからなるミセルよりも優れた安定性を示した。このことは、PEG-PGLeuの疎水的なイソブチル基により酵素耐性が向上されたことを示すものである。また、PEG-PGTrpおよびPEG-PGTyrからなるミセルは、PEG-PGGlyからなるミセルよりも優れた安定性を示した。このことは、トリプトファンおよびチロシンとmRNA中の塩基とのπ-π相互作用により酵素耐性が向上されたことを示すものである。
PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyを用いた培養細胞への遺伝子導入
　この実施例では、PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyからなる高分子ミセルの培養細胞への遺伝子導入能をルシフェラーゼmRNAにより評価する。
実験方法
　PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyおよびルシフェラーゼmRNAとのミセルは、PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGly溶液とmRNA溶液をN/P比が3となるように混合することによって調製した。
　細胞の準備として、HuH-7細胞を96wellプレートに1.0×104 cells/well播き、10%FBS入りDMEMに交換し(200 μL/well)、調製した各ミセル溶液を培地中に滴下することによって、トランスフェクションを行った。mRNA量として200 ng/well投与した。そのまま24時間インキュベートした後、培地中の発光強度を測定した。
結果
　図12に示すように、PEG-PGLeuからなるミセルは、PEG-PGGlyからなるミセルよりも優れた遺伝子発現効率を示した。このことは、PEG-PGLeuの疎水的なイソブチル基により酵素耐性およびポリアニオン耐性が向上され、培養条件における安定性が向上されたことを示すものである。また、PEG-PGTrpおよびPEG-PGTyrからなるミセルは、PEG-PGGlyからなるミセルよりも優れた安定性を示した。このことは、トリプトファンおよびチロシンとmRNA中の塩基とのπ-π相互作用により酵素耐性およびポリアニオン耐性が向上され、培養条件における安定性が向上されたことを示すものである。
PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyを用いた生体内における安定性試験
　この実施例では、PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyからなる高分子ミセルの生体内における安定性を、マウス血中における滞留性により評価する。
実験方法
　PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyおよびルシフェラーゼmRNAとのミセルは、PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGly溶液とmRNA溶液をN/P比が3となるように混合することによって調製した。
　Balb/Cマウスの尾静脈より、40 μgのmRNAを含むミセル溶液を200 μL投与した。2.5、5、10分後に尾静脈より2 μLの血液を採血した。採血した血液から、RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いてmRNAを抽出し、抽出したmRNAをcDNAに逆転写した後、qRT-PCRによりcDNAを定量評価した。
結果
　図13に示すように、PEG-PGLeuからなるミセルは、PEG-PGGlyからなるミセルよりも優れた血中滞留性を示した。このことは、PEG-PGLeuの疎水的なイソブチル基により酵素耐性およびポリアニオン耐性が向上され、生体における安定性が向上されたことを示すものであるまた、PEG-PGTrpおよびPEG-PGTyrからなるミセルは、PEG-PGGlyからなるミセルよりも優れた血中滞留性を示した。このことは、トリプトファンおよびチロシンとmRNA中の塩基とのπ-π相互作用により酵素耐性およびポリアニオン耐性が向上され、生体における安定性が向上されたことを示すものである。
PEG-PGBA, PEG-PLLを用いた生体内への遺伝子導入
　この実施例では、PEG-PGBA, PEG-PLLからなる高分子ミセルの生体内への遺伝子導入効率を、マウス肺におけるルシフェラーゼ発現効率により評価する。
実験方法
　PEG-PGBA, PEG-PLLおよびルシフェラーゼmRNAとのミセルは、PEG-PGBA, PEG-PLL溶液とmRNA溶液をN/P比が3となるように混合することによって調製した。
　Balb/Cマウスの気管より、67 μgのmRNAを含むミセル溶液を200 μL投与した。24時間後に肺を摘出した。摘出した肺に細胞溶解液(1x passive lysis buffer, Promega, USA)を添加し、マルチビーズショッカー(安井器械株式会社)による破砕後に溶液中の発光強度を測定した。
結果
　図14に示すように、PEG-PGBAおよびPEG-PLLからなるミセルは、mRNA単体の投与群よりも優れた遺伝子発現効率を示した。このことは、mRNAの高分子ミセルへの内包により酵素耐性およびポリアニオン耐性が向上され、生体における遺伝子導入効率が向上されたことを示すものである。さらに、PEG-PGBAからなるミセルは、PEG-PLLからなるミセルよりも優れた遺伝子発現効率を示した。このことは、PEG-PGBAのポリエーテル骨格により酵素耐性およびポリアニオン耐性が向上され、生体における遺伝子導入効率が向上されたことを示すものである。
PEG-PGTrp, PEG-PGGlyを用いた生体内への遺伝子導入
　この実施例では、PEG-PGTrp, PEG-PGGlyからなる高分子ミセルの生体内への遺伝子導入効率を、マウス肺におけるルシフェラーゼ発現効率により評価する。
実験方法
　PEG-PGTrp, PEG-PGGlyおよびルシフェラーゼmRNAとのミセルは、PEG-PGTrp, PEG-PGGly溶液とmRNA溶液をN/P比が3となるように混合することによって調製した。
　Balb/Cマウスの気管より、67 μgのmRNAを含むミセル溶液を200 μL投与した。24時間後に肺を摘出した。摘出した肺に細胞溶解液(1x passive lysis buffer, Promega, USA)を添加し、マルチビーズショッカー(安井器械株式会社)による破砕後に溶液中の発光強度を測定した。
結果
　図15に示すように、PEG-PGTrpからなるミセルは、PEG-PGGlyからなるミセルよりも優れた遺伝子発現効率を示した。このことは、PEG-PGTrpのトリプトファンとmRNA中の塩基とのπ-π相互作用により酵素耐性およびポリアニオン耐性が向上され、生体における遺伝子導入効率が向上されたことを示すものである。
PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyを用いた加水分解試験
　この実施例では、PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyの生理塩条件における加水分解の時間依存性を、フルオレスカミン法によるポリマー内の１級アミンの定量により評価した。
実験方法
　PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyをPBS (pH 7.4)に溶解し、37°Cで1、3、6、24時間静置した。その後、限外濾過により加水分解により脱離したL-ロイシンを除去し、凍結乾燥により粉末状のポリマーを得た。
　ポリマーをPBSに溶解し、PBSに溶解したフルオレスカミンを加えて、蛍光強度を測定した。N-ブチルアミンをもとに蛍光強度を１級アミン数に変換し、ポリマー内の１級アミン数とした。
結果
　図16に示すように、PEG-PLLにおいては１級アミン数の変化は見られなかったが、PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyにおいては１級アミン数が減少した。このことは、上記ポリマーは生理条件においてエステル結合の開裂により安全なポリエチレングリコール-block-ポリグリセロールとアミノ酸単体に加水分解されたことを示すものである。
PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyを用いた培養細胞に対する毒性試験
　この実施例では、PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyの培養細胞に対する毒性を、ポリマー添加後の細胞生存率により評価した。
実験方法
　PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyを10 mM HEPES buffer (pH 7.3)に溶解し、ポリマー溶液の希釈系列を作成した。
　細胞の準備として、HEK293細胞を96wellプレートに1.0×104 cells/well播き、10%FBS含有DMEMに交換し(200 μL/well)、各ポリマー溶液を培地中に滴下した。そのまま24時間インキュベートした後、10%FBS含有DMEMに交換し、Cell counting kit-8 (CCK-8) 法により細胞生存数を測定した。ポリマー溶液の代わりに10 mM HEPES bufferを添加したものを100%とし、細胞生存率を算出した。
結果
　図17に示すように、PEG-PLLにおいては高濃度のポリマー溶液の添加により細胞生存率の減少が確認されたが、PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyにおいては高濃度のポリマー溶液の添加によっても細胞生存率の減少は確認されなかった。このことは、PEG-PGLeu, PEG-PGTrp, PEG-PGTyr, PEG-PGGlyは培地中で安全なPEG-PGlycerolとアミノ酸単体に加水分解されて、ポリマー中の正電荷の電荷密度の減少により細胞毒性が減少したことを示すものである。
 

Claims (18)

  1.  以下の(a)のホモポリマー及び(b)のブロック共重合体から選ばれる、ポリマー化合物。
    （ａ）１級アミンを含む側鎖を有するポリグリシジル鎖からなるホモポリマー
    （ｂ）１級アミンを含む側鎖を有するポリグリシジル鎖とポリエチレングリコール鎖とのブロック共重合体
  2.   ホモポリマーが、次式Ｉ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１は、メチレン基又はエステル結合を介した１級アミンを表し、Ｒ５ａ及びＲ５ｂは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、又は－ＯＣＯＣＨ（ＮＨ２）Ｒ３（Ｒ３は水素原子、又は
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （Ｒ４は置換基を有していてもよい炭素数１～２０の炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複素環式官能基を表し、ｊは１～５の整数を表す。）で示される基を表し、ｍは2～5,000の整数を表す。）
    で示されるものである、請求項１に記載のポリマー化合物。
  3.   メチレン基又はエステル結合を介した１級アミンが、次式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （Ｒ３は水素原子、又は
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （Ｒ４は置換基を有していてもよい炭素数１～２０の炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複素環式官能基を表し、ｊは１～５の整数を表す。）で示される基を表すか、又はＲ３及びＲ４は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸のタンパク質における側鎖構造を表し、Ｒ６は、水素原子、又は１若しくは複数の任意のアミノ酸を表し、ｋは１～５の整数を表す。）
    で示されるものである、請求項２に記載のポリマー化合物。
  4.   ブロック共重合体が、次式II：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     〔式中、Ｒ１は、メチレン基又はエステル結合を介した１級アミンを表し、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、それぞれ独立して、水素原子、又は
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （Ｒ２０は－Ｏ－ＣＨ３で示される基、又はリガンド分子を表し、Ｌ２は連結基を表し、ｎは5～20,000の整数を表す。）で示される基を表し、
    Ｌ１ａ及びＬ１ｂは、それぞれ独立して連結基を表し、
    ｍは2～5,000の整数を表す。〕
    で示されるものである、請求項１に記載のポリマー化合物。
  5. メチレン基又はエステル結合を介した１級アミンが、次式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （Ｒ３は水素原子、又は
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （Ｒ４は置換基を有していてもよい炭素数１～２０の炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複素環式官能基を表し、ｊは１～５の整数を表す。）
    で示される基を表すか、又はＲ３及びＲ４は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸のタンパク質における側鎖構造を表し、Ｒ６は、水素原子、又は１若しくは複数の任意のアミノ酸を表し、ｋは１～５の整数を表す。）
    で示されるものである、請求項４に記載のポリマー化合物。
  6. Ｒ１が－ＣＨ２ＮＨ２又は－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２で示されるものである、請求項２～５のいずれか１項に記載の化合物。
  7. Ｒ１が
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     （Ｒ３は水素原子、又は
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     （Ｒ４はプロピル基、置換基を有していてもよいインドリル基、又は置換基を有していてもよいフェニル基を表す。）で示される基を表す。）で示されるものである、請求項２～５のいずれか１項に記載の化合物。
  8. Ｌ１ａ及び／又はＬ１ｂが、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－で示されるものである、請求項４～７のいずれか１項に記載の化合物。
  9. Ｒ２が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     （ｎは5～20,000の整数を表す。）
    で示されるものである、請求項４～８のいずれか１項に記載の化合物。
  10.   請求項１～７のいずれか１項に記載のポリマー化合物及び核酸を含む、ポリイオンコンプレックス。
  11.   核酸がRNA又はDNAである請求項１０に記載のポリイオンコンプレックス。
  12.   RNAがsiRNA、mRNA、アンチセンスRNA、RNAアプタマー、self-replicating RNA、miRNA（micro RNA）、又はlncRNA (long non cording RNA)である請求項１１に記載のポリイオンコンプレックス。
  13.   DNAがアンチセンスDNA、DNAアプタマー、pDNA（plasmid DNA）、又はMCDNA（minicircle DNA）である請求項１１に記載のポリイオンコンプレックス。
  14.   請求項１～９のいずれか１項に記載のポリマー化合物を含む、標的細胞又は組織への核酸送達デバイス作製用キット。
  15.   請求項１０～１３のいずれか１項に記載のポリイオンコンプレックスを含む、標的細胞又は組織への核酸送達デバイス。
  16. １級アミンを含む側鎖を有するポリグリシジル鎖とポリエチレングリコール鎖とのブロック共重合体の製造方法であって、ポリエチレングリコールを脱水した後にエポキシ開環重合を行って、ポリエチレングリコールと、側鎖を有するポリグリシジル鎖とのブロック共重合体を得、当該ポリグリシジル鎖の側鎖に１級アミンを導入することを特徴とする、前記方法。
  17.   脱水がトルエンを用いて行われるものである、請求項１６に記載の方法。
  18.   エポキシ開環重合が、1,2-エポキシ-5-ヘキセン又はエピクロロヒドリンを用いて行われるものである、請求項１６又は１７に記載の方法。
     
     
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