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WO2019000152A1 - 一种表达rhbdd1基因的cho细胞及其应用 - Google Patents

一种表达rhbdd1基因的cho细胞及其应用 Download PDF

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WO2019000152A1
WO2019000152A1 PCT/CN2017/089932 CN2017089932W WO2019000152A1 WO 2019000152 A1 WO2019000152 A1 WO 2019000152A1 CN 2017089932 W CN2017089932 W CN 2017089932W WO 2019000152 A1 WO2019000152 A1 WO 2019000152A1
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rhbdd1
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cells
cho
pcag
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French (fr)
Inventor
毛吉炎
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Shenzhen Biocan Technologies Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen Biocan Technologies Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host

Definitions

  • the present invention belongs to the field of recombinant cell technology, and relates to a CHO cell expressing an RHBDD1 gene and an application thereof.
  • RHBDD1 is the 18th member of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamily and is a thymus-derived CD4+
  • RHBDD1/RHBDD1L A surface molecule on CD25+ Treg cells with a ligand of RHBDD1L. Studies have shown that RHBDD1/RHBDD1L has many important biological activities, including cell proliferation, differentiation and survival. Since RHBDD 1 is mainly expressed on resting Treg cells, anti-RHBDD 1 antibody (DTA-1) can eliminate the immunosuppressive effects of Tre g cells.
  • DTA-1 anti-RHBDD 1 antibody
  • the HBDD1/RHBDD1L system is involved in the regulation of Treg cells and has a good clinical transformation prospect.
  • the lack of cells expressing the RHBDD1 gene in the prior art has hindered the progress of related research.
  • the object of the present invention is to provide a CHO cell expressing the RHBDD1 gene, which is achieved by the following technical solutions:
  • a CHO cell expressing the RHBDD1 gene, the recombinant CHO cell with high expression of RHBDD1 is CH
  • the 0 cell is a host cell
  • the exogenous expression vector for transfecting the host cell is an expression vector comprising the full-length gene of RHBDD1.
  • the nucleotide sequence of the full-length RHBDD1 gene is shown in SEQ ID No: 1.
  • the expression vector comprising the full-length gene of RHBDD1 is pCAG(m)-IRESblast, and the expression vector is through EcoR
  • the present invention constructs the eukaryotic expression vector pCAG(m)-IRESblast of human RHBDD1, which is confirmed by clone sequencing to be identical to the human RHBDD1 sequence in the NCBI database; transfected CHO cells by liposome method, blasticidal A cell line capable of stably growing and surviving was obtained by restriction enzyme screening, and a recombinant CHO/RHBDD1 cell line stably and highly expressing RHBDD1 was selected by quantitative PCR detection; a recombinant CHO/RHBDD1 cell line containing the full length of RHBDD1 gene constructed by the present invention was constructed. It can stably express RHBDD1 and has a complete molecular structure.
  • CHO cells as host cells have many advantages, including relatively low expression of the cells themselves, and exogenous recombinant genes have higher amplification and expression ability, and RHBDD1 expressed by recombinant CHO/RHBDD1 cells.
  • the relative expression level was significantly higher than that of CHO, and R HBDD1 occupied the dominant expression level compared with other expression products.
  • FIG. 1 is a schematic representation of the results of detection of RHBDD1 expression levels by fluorescent quantitative PCR after screening of CHO cells by blasticidin.
  • the present invention is based on the construction of the eukaryotic expression vector pCAG(m)-IRESblast-RHBDD1 of the full-length RHBDD1 gene, and transfects CHO cells to obtain a stable CHO/RHBDD1 cell line stably expressing RHBDD1.
  • the explanation of the embodiments of the invention is not to be construed as limiting.
  • the pCAG(m)-IRESblast-based vector was used, and the EcoR I and Spel cleavage sites were specifically selected as the multiple cloning site for the foreign gene.
  • Amplification was carried out by using the PrimeSTAR enzyme of Dalian Bao Biotech Co., Ltd., and the PCR reaction system was: upstream primer 4 ⁇ , downstream primer 4 L, 2 ⁇ Premix PrimeSTAR 25 L, cDNA: 1 ⁇ , plus ddH20 to 50 L; 98 ° C for 2 min, After 30 cycles (denaturation at 98 °C for 10 s, annealing at 60 °C for 10 s, extension at 72 °C for 1 min), and finally extension at 72 °C for 5 min, a large number of target fragments were obtained, and the product was expanded using a commercial PCR purification kit. The product is purified.
  • DNA/plasmid 2 g, lOxFastDigest Buffer 2 L, supplement ddH20 to 2 ( ⁇ L; reaction at 37 ° C for 30 min, and the product was purified by commercial PCR product purification kit.
  • the DNA ligase Buffer ⁇ obtained the recombinant pCAG(m)-IRESblast-RHBDD1 expression vector.
  • CHO cells were seeded in 6-well plates at 10 6 cells per well, 18
  • CHO cells and CHO/RHBDD1 cells were seeded separately into 6-well plates. Cell density reached 80 ⁇ 3 ⁇ 4-90 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ , total RNA was extracted from each group using RNeasy Mini Kit, using PrimeScrip RT reagent
  • Kit reverse transcribes mRNA into cDNA and stores at -20 °C.
  • RHBDD1 As a template, GAPDH was used as an internal reference, and the relative expression of RHBDD1 was detected by real-time fluorescent quantitative PCR.
  • the reaction conditions were set: 95. C 30s, 1 cycle, 58. C 30s 40 cycles, 95. C 5s, 60 ° C lmin, 95. C 15s , the results are shown in Figure 1. It can be seen that the expression level of RHBDD1 gene of CHO/RHBDD1 cells is 140 times higher than that of C HO cells, indicating that the cDNA sequence of RHBDD1 gene provided by the present invention is successfully inserted into the pCAG(m)-IRESblast vector, and can specifically and efficiently promote the RHBDD1 gene. High expression.
  • the present invention constructs the eukaryotic expression vector pCAG(m)-IRESblast of human RHBDD1, which is confirmed by cloning and sequencing to be identical to the human RHBDD1 sequence in the NCBI database; transfected CHO cells by liposome method, and killed by rice blast fungus A cell line capable of stably growing and surviving was obtained by restriction enzyme screening, and a recombinant CHO/RHBDD1 cell line stably and highly expressing RHBDD1 was selected by quantitative PCR detection; a recombinant CHO/RHBDD1 cell line containing the full length of RHBDD1 gene constructed by the present invention was constructed. It can stably express RHBDD1 and has a complete molecular structure.
  • CHO cells as host cells have many advantages, including a relatively low level of protein expression in the cell itself, and a higher amplification and expression ability of the foreign recombinant gene, and RHBDD1 expressed by the recombinant CHO/RHBDD1 cells.
  • the relative expression level was significantly higher than that of CHO, and R HBDD1 occupied the dominant expression level compared with other expression products.

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Abstract

一种表达RHBDD1基因的CHO细胞，利用真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast构建全长RHBDD1基因真核表达载体pCAG(m)-IRESblast-RHBDD1，进而以其转染CHO细胞，利用杀稻瘟菌素筛选得到高表达全长RHBDD1的基因的工程细胞系 CHO/RHBDD1，并证实该细胞系可大幅提高全长 RHBDD1的表达。

Description

发明名称：一种表达 RHBDD1基因的 CHO细胞及其应用 技术领域
[0001] 本发明属于重组细胞技术领域， 涉及一种表达 RHBDD1基因的 CHO细胞及其应 用。
背景技术
[0002] RHBDD1是肿瘤坏死因子受体 （TNFR) 超家族中的第 18个成员， 是胸腺来源 的 CD4+
CD25+Treg细胞上的一个表面分子， 其配体为 RHBDD1L。 研究表明， RHBDD1/ RHBDD1L具有许多重要的生物学活性， 包括细胞的增殖、 分化和存活等。 因为 RHBDD 1主要表达在静息性的 Treg细胞上， 故抗 RHBDD 1抗体 (DTA- 1 )可消除 Tre g细胞的免疫抑制作用。
技术问题
[0003] HBDD1/RHBDD1L系统参与 Treg细胞发挥免疫调节的作用， 具有较好的临床转 化前景， 但现有技术中缺乏表达 RHBDD1基因的细胞， 对相关研究的进展造成 了一定的阻碍。
问题的解决方案
技术解决方案
[0004] 本发明的目的在于提供一种表达 RHBDD1基因的 CHO细胞， 通过以下技术方案 来实现：
[0005] 一种表达 RHBDD1基因的 CHO细胞， RHBDD1高表达的重组 CHO细胞是以 CH
0细胞为宿主细胞， 转染宿主细胞的外源性表达载体的是包含 RHBDD1全长基因 的表达载体。
[0006] 所述的 RHBDD1全长基因的核苷酸序列如 SEQ ID No: 1所示。
[0007] 所述的包含 RHBDD1全长基因的表达载体是 pCAG(m)-IRESblast， 该表达载体 是通过 EcoR
I与 Spel酶切位点将 RHBDD 1全长基因克隆入真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast。 发明的有益效果
有益效果
[0008] 本发明构建了人 RHBDDl的真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast， 经过克隆测序 证实序列同 NCBI数据库中的人 RHBDDl序列一致； 经过脂质体法转染 CHO细胞 ， 杀稻瘟菌素抗性筛选获得能够稳定生长、 存活的细胞株， 经过定量 PCR检测， 筛选出稳定、 高表达 RHBDDl的重组 CHO/RHBDD1细胞株； 本发明构建的包含 RHBDDl基因全长的重组 CHO/RHBDD1细胞株能够稳定表达 RHBDDl， 具有完 整的分子结构。
[0009] 作为宿主细胞的 CHO细胞具有许多优势， 包括细胞本身蛋白表达量相对较低， 而对外源的重组基因则具有较高的扩增和表达能力， 重组后的 CHO/RHBDD1细 胞表达的 RHBDDl的相对表达量较 CHO空载明显升高， 相对于其他表达产物， R HBDD1占据优势表达量。
[0010] 通过定量 PCR检测技术， 证明 RHBDDl表达量相比 CHO明显升高， 且其在细胞 膜上的表达较 CHO细胞表达量明显提高。
对附图的简要说明
附图说明
[0011] 图 1为杀稻瘟菌素筛选 CHO细胞后荧光定量 PCR检测 RHBDDl表达水平结果示 意图。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0012] 本发明在构建 RHBDDl全长基因的真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast-RHBDDl 的基础上， 转染 CHO细胞， 获得稳定、 高表达 RHBDDl的重组 CHO/RHBDD1细 胞株， 下面是对本发明实施例的解释而不是限定。
[0013] 本实施例以 pCAG(m)-IRESblast为基础载体， 具体选择 EcoR I与 Spel酶切位点作 为连接外源基因的多克隆位点。
[0014] 实施例一 RHBDDl基因的克隆
[0015] 以 A375细胞的 cDNA为模板， 采用 Premier Primer 6.0软件设计相应的特异性弓 | 物， 并在两端分别加入 EcoRI和 Spel酶切位点： RHBDD1-F: 5'- GGAATTCATGCAACGGAGATCAAGAG -3'； RHBDD1-R: 5'- GACTAGTTCACTGGCTATCGAATCTGTG -3，。
[0016] 采用大连宝生物公司 PrimeSTAR酶进行扩增， PCR反应体系为： 上游引物 4μί 、 下游引物 4 L、 2xPremix PrimeSTAR 25 L、 cDNA: 1μΙ^、 补加 ddH20至 50 L ； 98°C2min， 再经过 30个循环作用 (98°C变性 10 s， 60°C退火 10s， 72°C延伸 1 min), 最后 72°C延伸 5min， 得到大量目的片段， 对产物采用商品化 PCR纯化试 剂盒将扩增产物纯化。
[0017] 实施例二重组表达载体构建
[0018] 利用 EcoR I、 Spe I双酶切真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast和 RHBDD1基因纯 化产物： 酶切体系为： EcoRIl L、 Spel
1.5 L、 DNA/质粒： 2 g、 lOxFastDigest Buffer 2 L、 补加 ddH20至 2(^L; 37°C 反应 30 min, 对酶切产物采用商品化 PCR产物纯化试剂盒纯化。
[0019] 将线性化载体与酶切后的 RHBDD1扩增片段 4°C条件下， T4 DNA连接酶作用下 过夜连接， 反应体系为： 酶切后的线性 pCAG(m)-IRESblast
2μί、 酶切后的 RHBDD1片段 5μί、 T4DNA连接酶 1μί、 10xT4
DNA连接酶 Buffer Ιμί, 获得重组 pCAG(m)-IRESblast-RHBDDl表达载体。
[0020] 将 5 重组 pCAG(m)-IRESblast-RHBDDl质粒加入 5( L ToplO感受态细胞中， 冰浴 30 min， 42°C热激 60s， 冰浴 2 min， 加入 50 无抗性 LB液体培养基， 37°C 振摇 lh， 取全部菌液， 涂布至含有氨苄霉素抗性 （终浓度 100 g/mL) LB固体 培养基中， 37°C过夜培养， 挑取单克隆在含有氨苄霉素抗性 （终浓度 100 g/mL ) LB液体培养基中扩大培养， 并送上海生工进行测序， 验证序列碱基， 确保测 序结果与基因库 （GenBank) 中的一致。
[0021] 实施例三重组载体转导 CHO细胞
[0022] 接种 CHO细胞于 6孔板中， 每孔 106个细胞， 18
h后细胞密度约为 60<¾。 取 pCAG(m)-IRESblast-RHBDDl质粒 1
g， 应用 Lipofectamine3000转导至 CHO细胞中， 继续培养 24 h后， 加入杀稻瘟 菌素至终浓度为 5 g/mL， 筛选细胞。 [0023] 实施例四荧光定量 PCR检测 RHBDDl基因表达量
[0024] 分别接种 CHO细胞和 CHO/RHBDD1细胞至 6孔板。 细胞密度达到 80<¾-90<¾吋， 用 RNeasy Mini Kit提取各组细胞的总 RNA， 利用 PrimeScrip RT reagent
Kit将 mRNA逆转录为 cDNA， -20°C保存。
[0025] 取各组细胞的 cDNA 1
为模板， 以 GAPDH为内参， 实吋荧光定量 PCR检测 RHBDDl相对表达量， 设 置反应条件： 95。C 30s， 1循环， 58。C 30s 40循环， 95。C 5s， 60°C lmin, 95。C 15s ， 结果如图 1所示。 可以看到， CHO/RHBDD1细胞的 RHBDDl基因表达水平较 C HO细胞高 140倍， 说明本发明提供的 RHBDDl基因 cDNA序列成功插入至 pCAG( m)-IRESblast载体中， 能特异、 高效地促进 RHBDDl基因高表达。
工业实用性
[0026] 本发明构建了人 RHBDDl的真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast， 经过克隆测序 证实序列同 NCBI数据库中的人 RHBDDl序列一致； 经过脂质体法转染 CHO细胞 ， 杀稻瘟菌素抗性筛选获得能够稳定生长、 存活的细胞株， 经过定量 PCR检测， 筛选出稳定、 高表达 RHBDDl的重组 CHO/RHBDD1细胞株； 本发明构建的包含 RHBDDl基因全长的重组 CHO/RHBDD1细胞株能够稳定表达 RHBDDl， 具有完 整的分子结构。
[0027] 作为宿主细胞的 CHO细胞具有许多优势， 包括细胞本身蛋白表达量相对较低， 而对外源的重组基因则具有较高的扩增和表达能力， 重组后的 CHO/RHBDD1细 胞表达的 RHBDDl的相对表达量较 CHO空载明显升高， 相对于其他表达产物， R HBDD1占据优势表达量。
[0028] 通过定量 PCR检测技术， 证明 RHBDDl表达量相比 CHO明显升高， 且其在细胞 膜上的表达较 CHO细胞表达量明显提高。
[0029]

Claims

权利要求书 [权利要求 1] 一种表达 RHBDD1基因的 CHO细胞， 其特征在于： RHBDD1高表达 的重组 CHO细胞是以 CHO细胞为宿主细胞， 转染宿主细胞的外源性 表达载体的是包含 RHBDD1全长基因的表达载体。 [权利要求 2] 根据权利要求 1所述的一种表达 RHBDD1基因的 CHO细胞， 其特征 在于： 所述的 RHBDD1全长基因的核苷酸序列如 SEQ ID No: 1所示。 [权利要求 3] 根据权利要求 1所述的一种表达 RHBDD1基因的 CHO细胞， 其特征 在于： 所述的包含 RHBDD 1全长基因的表达载体是 pCAG(m)-IRESbla st, 该表达载体是通过 EcoR I和 Spe I酶切位点将 RHBDD 1全长基因克 隆入真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast。 [权利要求 4] 根据权利要求 1至 3任一权利要求所述的一种 RHBDD1高表达的重组 C HO细胞的构建方法， 其特征在于： 包括以下步骤：
(1) RHBDD1基因的克隆
以 A375细胞的 cDNA为模板， 采用 Premier Primer 6.0软件设计相应的 特异性引物， 并在两端分别加入 EcoR I和 Spe I酶切位点： RHBDD1-F ： 5， - GGAATTCATGCAACGGAGATCAAGAG -3'；
RHBDD 1-R: 5， - GACTAGTTCACTGGCTATCGAATCTGTG -3 '。 采用大连宝生物公司 PrimeSTAR酶进行扩增， PCR反应体系为： 上游 引物 4 L、 下游引物 4 L、 2xPremix PrimeSTAR 25μ^ cDNA: Ιμί 、 补加 ddH20至 50μί; 98°C 2 min, 再经过 30个循环作用 (98°C变性 10 s， 60°C退火 10 s， 72°C延伸 l min)， 最后 72°C延伸 5 min， 得到大量目 的片段， 对产物采用商品化 PCR纯化试剂盒将扩增产物纯化。
(2) 重组表达载体构建
利用 EcoR I、 Spe
I双酶切真核表达载体 pCAG(m)-IRESblast和 RHBDD 1基因纯化产物： 酶切体系为： EcoR I l L、 Spe l
1.5 L、 DNA/质粒： 2 g、 lOxFastDigest Buffer 2μ^ 补加 ddH20至 20 μί; 37°C反应 30 min， 对酶切产物采用商品化 PCR产物纯化试剂盒纯 化。
将线性化载体与酶切后的 RHBDD1扩增片段 4°C条件下， T4 DNA连 接酶作用下过夜连接， 反应体系为： 酶切后的线性 pCAG(m)-IRESbla st 2 L、 酶切后的 RHBDD1片段 5μί、 T4 DNA连接酶 1 μί、 10xT4 DNA连接酶 Buffer Ιμί, 获得重组 pCAG(m)-IRESblast-RHBDDl表达 载体。
将 5 重组 pCAG(m)-IRESblast-RHBDDl质粒加入 5( L ToplO感受态 细胞中， 冰浴 30 min， 42°C热激 60 s， 冰浴 2 min， 加入 50
无抗性 LB液体培养基， 37°C振摇 l h， 取全部菌液， 涂布至含有氨 苄霉素抗性 （终浓度 100 g/mL) LB固体培养基中， 37°C过夜培养， 挑取单克隆在含有氨苄霉素抗性 （终浓度 100 g/mL) LB液体培养基 中扩大培养， 并送上海生工进行测序， 验证序列碱基， 确保测序结果 与基因库 （GenBank) 中的一致。
(3) 重组载体转导 CHO细胞
接种 CHO细胞于 6孔板中， 每孔 10 6个细胞， 18 h后细胞密度约为 60% 。 取 pCAG(m)-IRESblast-RHBDDl质粒 1 g， 应用 Lipofectamine 3000 转导至 CHO细胞中， 继续培养 24 h后， 加入杀稻瘟菌素至终浓度为 5 筛选细胞。
(4) 荧光定量 PCR检测 RHBDD1基因表达量
分别接种 CHO细胞和 CHO/RHBDD1细胞至 6孔板。 细胞密度达到 80% -90%吋， 用 RNeasy Mini Kit提取各组细胞的总 RNA， 利用 PrimeScrip RT reagent Kit将 mRNA逆转录为 cDNA， -20。C保存。
取各组细胞的 cDNA 1
为模板， 以 GAPDH为内参， 实吋荧光定量 PCR检测 RHBDD1相对 表达量， 设置反应条件： 95。C 30s， 1循环， 58。C 30s 40循环， 95°C 5s ， 60°C lmin, 95°C 15s， 结果如图 1所示。 可以看到， CHO/RHBDD1 细胞的 RHBDD 1基因表达水平较 CHO细胞高 140倍。
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