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WO2019098461A1 - 해양 진균 Penicillium sp. SF-5859 유래 커뷰라린 유형의 대사체를 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

해양 진균 Penicillium sp. SF-5859 유래 커뷰라린 유형의 대사체를 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2019098461A1
WO2019098461A1 PCT/KR2018/002498 KR2018002498W WO2019098461A1 WO 2019098461 A1 WO2019098461 A1 WO 2019098461A1 KR 2018002498 W KR2018002498 W KR 2018002498W WO 2019098461 A1 WO2019098461 A1 WO 2019098461A1
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WO
WIPO (PCT)
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formula
preventing
curvularin
inflammatory diseases
inflammatory
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/KR2018/002498
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
임정한
김일찬
한세종
윤의중
오현철
김윤철
손재학
트란밍하
고원민
이승준
손재영
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Institute of Ocean Science and Technology KIOST
Original Assignee
Korea Institute of Ocean Science and Technology KIOST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Institute of Ocean Science and Technology KIOST filed Critical Korea Institute of Ocean Science and Technology KIOST
Priority to US16/759,281 priority Critical patent/US20210177796A1/en
Publication of WO2019098461A1 publication Critical patent/WO2019098461A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
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    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/324—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the immune system

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease and a food for preventing or ameliorating an inflammatory disease, which comprises a metabolite of cevaporin type as an active ingredient. More particularly, the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising Penicillium sp. A pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease and a food for preventing or ameliorating an inflammatory disease, wherein the composition contains a metabolite of a cobualarin type derived from SF-5859 as an active ingredient.
  • Inflammation is an important part of the body's immune response, a useful defense against injury or damage, and is designed to inhibit the deleterious effects of injury (Zhang, G. et al., 2001. J. Clin. Invest, 107, 13-19 ).
  • excessive acute or chronic inflammation can cause serious disorders such as arthritis, asthma, colitis, Parkinson's disease, Alzheimer's disease or sepsis (K. Lucas et al., 2013, Mol. Neurobiol. 48, 190-204).
  • the control of inflammation is essential.
  • LPS lipopolysaccharides
  • iNOS inducible nitric oxide synthase
  • NO nitric oxide
  • COX-2 cyclooxygenase-2
  • PGE 2 cyclooxygenase-2
  • Nitric oxide (NO) is an inflammatory molecule produced by iNOS. Excessive increase of iNOS activity or production of nitric oxide is a pathogenesis of various inflammatory diseases (McCartney-Francis et al., J. Exp. Med.
  • NF- ⁇ B is composed of heterodimeric proteins of the transcription factors p50 and p65.
  • the heterodimeric domain interacts with the inhibitory protein I ⁇ B ⁇ , which inactivates NF- ⁇ B and retains the complex in the cytoplasm.
  • the activity of the LPS-induced NF- ⁇ B system results in degradation of I ⁇ B ⁇ and migration of NF- ⁇ B into the nucleus.
  • NF- ⁇ B translocation into the nucleus further induces iNOS and COX-2 protein expression and mRNA expression of TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ .
  • MAPK mitogen-activated protein kinase cascades in LPS-induced macrophages and microglial cells play an essential role in inflammatory responses.
  • MAPK signaling pathways There are three MAPK signaling pathways: c-Jun N-terminal phosphorylase (JNK), extracellular signal regulatory phosphorylase (ERK) and P38 (MY Peroval et al., 2013, PLoS ONE 8, e51243).
  • marine microorganisms including bacteria, cyanobacteria, microalgae and fungi are important sources of new pharmacologically active secondary metabolites (Bugni and Ireland et al., Nat. Prod. Rep. 21: 143163, 2004) Marine fungi are a rich and promising source of novel antiviral, anti-inflammatory, antibacterial and anticancer materials (Bhadury et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33: 325337, 2006). Thus, over the years, marine-derived fungal studies have initiated new secondary metabolites and their pharmacological activity.
  • the inventors of the present invention found that the marine fungus Penicillium sp . SF-5859 to confirm the anti-inflammatory effect of these compounds on inflammatory responses induced by LPS in RAW 264.7 macrophages, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases, which contains, as an active ingredient, a metabolite of curvularin type selected from the group consisting of the following Formulas 1 to 4 .
  • R 1 and R 2 in Formula 1 are independently H, OCH 3, or OAc, and R 1 and R 2 in Formula 2 are each independently H, OH, or OCH 3 .
  • the present invention also provides a method of preventing or treating an inflammatory disease, comprising administering a pharmaceutically effective amount of a metabolite of any of the chervalin types selected from the group consisting of Formulas 1 to 4 above.
  • the present invention also provides the use of any of the metabolites of the keravirin type selected from the group consisting of Formulas 1 to 4 for the prevention or treatment of inflammatory diseases.
  • the present invention also provides the use of any of the chervalin-type metabolites selected from the group consisting of Formulas 1 to 4 for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of inflammatory diseases.
  • the present invention also provides a food for preventing or ameliorating an inflammatory disease, comprising as an active ingredient a metabolite of chervalin type selected from the group consisting of the above-mentioned formulas (1) to (4).
  • Figure 1 shows the effect of IL-1 ⁇ , IL-6, IL-1 ⁇ and IL-6 on the expression levels of iNOS and COX-2 protein in RAW264.7 macrophages TNF-a ⁇ / RTI > on mRNA expression levels. Representative data or mean values of three independent experiments were displayed (* p ⁇ 0.05 compared to the LPS treated group).
  • Figure 2 shows the effect of (3) on the LPS-induced RAW264.7 macrophages on NF-kB activation (nuclear-p50 and p65), (b) on the I ⁇ B ⁇ phosphorylation and degradation, c) is a graph showing the effect of NF- ⁇ B on DNA binding activity.
  • Each data represents representative data or mean values of three independent experiments (* p ⁇ 0.05 compared to the LPS treated group).
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of (a) p38 on (b), JNK, and (c) on the phosphorylation of ERK in RAW264.7 macrophages induced by LPS. Representative data for three independent experiments were displayed.
  • the marine-derived fungus Penicillium sp From the SF-5859 (Accession No .: KCTC 13354BP), the compounds of Formulas 1 to 4, which are metabolites of the curvularin type, were isolated and their structure confirmed. Also, the metabolism of the above-mentioned cowhallin type compounds (compounds of Formulas 1 to 4) inhibits NO and PGE 2 production in RAW 264.7 macrophages, the compound of Formula 3 inhibits iNOS and COX-2 expression, 1 ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ by inhibiting the expression of mRNA.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease, which contains, as an active ingredient, a metabolite of curvularin type selected from the group consisting of the following Formulas (1) to (4)
  • R 1 and R 2 in Formula 1 are independently H, OCH 3, or OAc, and R 1 and R 2 in Formula 2 are each independently H, OH, or OCH 3 .
  • the present invention relates to a method of preventing or treating an inflammatory disease, comprising administering a pharmaceutically effective amount of a metabolite of any of the chervalin types selected from the group consisting of Formulas 1 to 4 above.
  • the present invention relates to the use of a metabolite of any of the chervulrin types selected from the group consisting of Formulas 1 to 4 for the prevention or treatment of inflammatory diseases.
  • the present invention relates to the use of any of the metabolites of the keravirin type selected from the group consisting of Formulas 1 to 4 for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of inflammatory diseases.
  • the metabolite of the above formula (1) is selected from the group consisting of curvularin (Elzner, S . ; et al., Inhibitors of inducible NO synthase expression: total synthesis of (S) -curvularin and its ring homologues. ChemMedChem 2008, 939.).
  • the metabolite of Formula 1 may be any one selected from the group consisting of the following Formulas 1a to 1e.
  • R 1 OCH 3
  • R 2 OCH 3
  • the metabolite of formula (2) may be any one selected from the group consisting of the following formulas (2a) to (2d).
  • the metabolite of the above formula (3) is (10E, 15S) -10,11-dehydrocurvularin (Greve, H. et al., Apralactone A and a new stereochemical class of curvularins from the marine fungus Curvularia sp. (10Z, 15S) -10,11-dehydrocurvularin (Lai, S . ; et al. , Novel curvularin-type metabolites of a hybrid strain ME 0005 derived from Penicillium citreo-viride B. IFO 6200 and 4692. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 2241-2244).
  • Metabolites of the cervical type are macrocyclic lactones produced by various fungi of the genera Curvularia, Penicillium and Alternaria , and have been reported to have various biological activities.
  • the above-mentioned metabolite of the cowhallin type is a marine fungus Penicillium sp. SF-5859 (Accession No .: KCTC 13354BP).
  • the inflammatory diseases are selected from the group consisting of arthritis, rhinitis, hepatitis, keratitis, gastritis, enteritis, nephritis, bronchitis, pleurisy, peritonitis, spondylitis, pancreatitis, inflammatory pain, urethritis, cystitis, burn inflammation, dermatitis, Neuroinflammation, and neuroinflammation, but the present invention is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases may be characterized by having any one or more of the following characteristics.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating the inflammatory disease may be characterized in that it has a property of inhibiting the production of nitric oxide (NO) and prostaglandin E 2 (PGE 2 ).
  • NO nitric oxide
  • PGE 2 prostaglandin E 2
  • NO is a small molecule that is an intracellular mediator produced in various immune cells and plays a pivotal role in the physiological and pathological state of inflammatory symptoms.
  • PGE 2 can regulate the immune and inflammatory responses.
  • the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases is characterized by having the characteristics of inhibiting expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) can do.
  • iNOS inducible nitric oxide synthase
  • COX-2 cyclooxygenase-2
  • the compound of formula 3 was found to dose-dependently reduce excessive protein expression of iNOS and COX-2 in cells induced by LPS (Fig. 1 (a)).
  • iNOS and COX-2 are proinflammatory mediators, iNOS is an inflammatory molecule that produces NO, and COX-2 produces PGE 2 . Excessive activity increase of iNOS and COX-2 may be a cause of various inflammatory diseases.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating the inflammatory disease may be characterized as having the IL-1 ⁇ , IL-6 and TNF- ⁇ expression suppressing properties.
  • the compound of Chemical Formula 3 significantly inhibited mRNA expression of IL-1 ⁇ , IL-6 and TNF- ⁇ in LPS-induced cells in a dose-dependent manner (FIG. 1 ) To Fig. 1 (d)).
  • This result implies that the compound of formula 3 weakens the expression of proinflammatory cytokines at the transcriptional level.
  • the overproduction of proinflammatory cytokines such as TNF-a, IL, etc. contribute to the onset of inflammatory diseases.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases is characterized by having inhibition of phosphorylation and degradation of I ⁇ B- ⁇ (inhibitor kappa B- ⁇ ) and inhibition of activation of NF- ⁇ B (nuclear factor kappa B) can do.
  • the most active metabolite chain (10E, 15S) -10,11-dehydrocurvularin weakens the phosphorylation of I ⁇ B- ⁇ and degrades I ⁇ B- ⁇ in a concentration- (Fig. 2 (b)).
  • induction of proinflammatory mediators and cytokines can be inhibited by down-regulation of the NF- ⁇ B signaling pathway.
  • NF- ⁇ B is an important transcription factor associated with inflammatory diseases and is known to regulate inflammatory genes and the expression of proinflammatory mediators such as iNOS and COX-2.
  • NF- ⁇ B consists of inactivated subunits of p50 and p65 bound to I ⁇ B- ⁇ .
  • the NF- ⁇ B signaling pathway can be activated by LPS or other stimuli, leading to the degradation and nuclear transfer of NF- ⁇ B as I ⁇ B- ⁇ phosphorylates.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating the inflammatory disease may be characterized in that it is not mediated through the MAPK signal transduction pathway.
  • the anti-inflammatory effect of the compound of formula (III) is not mediated through the MAPK signaling pathway.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • Examples of carriers, excipients and diluents that can be contained in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , Methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of powders, pills, granules, capsules, suspensions, solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, Suppositories, and suppositories.
  • a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used.
  • Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, sucrose), lactose, gelatin, and the like.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Propyleneglycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As a suppository base witepsol, macrogol, tween 60, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) depending on the intended method, and the dose may be determined depending on the health condition of the patient, , Sex, diet, excretion rate, degree of disease, type of drug, administration time, route of administration, and administration period, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the metabolite of the present invention can be administered at a daily dose of 0.001 to 1000 mg / kg, preferably 0.01 to 100 mg / kg.
  • the administration may be carried out once a day or divided into several times.
  • the dose is not intended to limit the scope of the invention in any way.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological response modifiers for the prevention or treatment of inflammatory diseases.
  • the present invention relates to a food for preventing or ameliorating an inflammatory disease containing, as an active ingredient, a metabolite of curvularin type selected from the group consisting of the above-mentioned Formulas (1) to (4).
  • the food for preventing or improving inflammatory diseases includes all forms of nutritional supplement, health food, and food additives.
  • Foods of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • the metabolism of the chevralin type of the present invention can be prepared in the form of tea, juice and drink and then consumed, granulated, encapsulated and powdered.
  • the food may be selected from the group consisting of beverages (including alcoholic beverages), fruit and its processed foods (e.g., canned fruits, bottled, jam, marmalade, etc.), fish, meat and processed foods such as ham, sausage, And noodles (eg, udon, buckwheat noodles, ramen noodles, spaghetti, macaroni, etc.), juice, various drinks, cookies, sugar, dairy products such as butter, cheese, edible vegetable oil, margarine, vegetable protein, Food, and various seasonings (for example, soybean paste, soy sauce, sauce, etc.) by adding the metabolite of the chevralin type according to the present invention.
  • beverages including alcoholic beverages
  • fruit and its processed foods e.g., canned fruits, bottled, jam, marmalade, etc.
  • fish meat and processed foods
  • meat and processed foods such as ham, sausage, And noodles (eg, udon, buckwheat noodles, ramen noodles, spaghetti, macaroni, etc.)
  • juice various drinks
  • inflammation refers to a defense mechanism of biological tissues against a certain stimulus, and is a mechanism of biological defense to recover injury by various harmful stimuli to restore original state. Irritation of the inflammation, infection, or chemical and physical stimulation, and the process of inflammation can be divided into two types of acute and chronic inflammation. Acute inflammation is a short-term reaction within a few days. Plasma components and blood cells are involved in dephosphorylation by displaying a microcirculatory system. Chronic inflammation has a long duration, and tissue proliferation is seen.
  • nitric oxide refers to a substance that increases the production amount of nitric oxide synthase upon inducing an intracellular inflammatory reaction.
  • NO nervous system nitric oxide synthase
  • the synthesized nitric oxide increases the production of cGMP in brain cells, and thereby functions to store externally-recognized information for a long time.
  • NO is a free radical known to be involved in physiological and pathological processes.
  • NO is synthesized by oxidation of L-arginine by nitric oxide synthase (Atkan, et al., 75: 639-653, 2004).
  • COX-2 is an enzyme involved in the production of prostaglandin, a protein related to an inflammatory reaction.
  • An increase in intracellular COX-2 expression level may be an indicator of progress of the inflammatory reaction.
  • prostaglandin E 2 is an inflammatory mediator produced at the site of inflammation by COX-2, which is called prostaglandin endoparboxyl synthase.
  • PGE2 has been implicated in chronic inflammatory diseases including many cardiovascular diseases, arthritis, inflammatory bowel disease and chronic gastric ulcer (St-Onge, M. et al., Biochim. Biophys. Acta. 1771: 1235-1245, 2007; Turini, ME et al, Annu.Rev.Med 53 : 35-57, 2002; Rocca, B. et al, Int.Immunopharmacol 2: doi 603-630, 2002; Singh, VP et al, Pharmacology 72 : 77-84, 2004).
  • MAPK is a key signaling system that regulates cell growth and differentiation by transferring this signal from the cell membrane to the nucleus in order to activate a receptor located in the cell membrane.
  • HRESIMS data were obtained using an ESI Q-TOF MS / MS system (AB SCIEX Triple, SCIEX, Framingham, Mass., USA). Flash column chromatography was performed on silica gel (Kieselgel 60, 70-230 mesh and 230-400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, USA) and YMC octadecyl-functionalized silica gel (C 18 , YMC CO., Kyoto, Japan) .
  • the YMC semiprep-C 18 column (20 ⁇ 150 mm; 4 ⁇ m particle size; 80 ⁇ pore size, 5 mL / min, YMC CO., Kyoto, Japan) and Shodex Ohpak SB 802.5 80 ⁇ pore size, 0.6 mL / min, Showa Denko KK, Tokyo, Japan) was used.
  • TLC was performed on Kieselgel 60 F254 (Merck, Kenilworth, NJ, USA) or reversed-phase (RP) -18 F254s (Merck, Kenilworth, NJ, USA) plates. Spots were visualized after heating by spraying in 10% aqueous H2SO4 solution. All compounds were detected by UV absorption at 210 and 254 nm.
  • RPMI 1640, fetal bovine serum (FBS) and other tissue culture reagents were purchased from Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA). All other chemicals were obtained from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, Mo., USA).
  • P65 sc-8008, Santa Cruz (R)
  • the primary antibody COX-2: sc-1745; iNOS: sc-650; I ⁇ B- ⁇ : sc-371; p-I ⁇ B- Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA
  • p-ERK # 9101; p-JNK: # 9251; JNK: # 9252S; p-p38: # 9211; p38: , USA
  • secondary antibody mouse: ap124p; goat: ap106p; rabbit: ap132p, Millipore, Billerica MA, USA.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit for PGE2 was purchased from R and D Systems, Inc. (Minneapolis, MN, USA).
  • Example 2 Marine fungi Penicillium sp. Culture and identification of SF-5859
  • Fungus strain SF-5859 was identified based on rRNA sequencing.
  • GenBank results of the 28S rRNA gene were 99.48% and 98.69%, respectively, for Penicillium chrysogenum (FJ890400), P. steckii (HM469415), P. paxilli (FJ890408) and P. citrinum (JN938950) , 98.69% and 98.43%, respectively.
  • the fungal strain SF-5859 derived from the ocean is Penicillium sp. , But specific species were not clearly identified.
  • Example 3 Penicillium sp. Extraction and isolation of curvularin type metabolites from SF-5859
  • SF-5859 was cultivated in a 10 g Fernbach-style flask in a medium containing 400 mL of PDB containing 100 g of semi-solid semi-solid vermiculite and 3% (w / v) NaCl.
  • the flasks were individually inoculated with 2 mL seed culture of fungal strains, incubated at 25 DEG C for 14 days, and then extracted with EtOAc (4 L per flask).
  • the extract solution was filtered through filter paper and evaporated to dryness to give crude extract SF5859 (2.2 g).
  • Reverse phase the crude extract (reversed phase; RP) C 18 was fractionated by flash column chromatography (5X30cm), 20, 40, 60, 80 and 100% of H 2 O (each 500mL) (v / v) stepwise gradient of MeOH To obtain six fractions continuously from SF5859-1 to SF5859-6.
  • the SF5859-3 fraction was applied to a chromatographic column packed with silica gel (2 X 30 cm). The column was then eluted with a gradient of CH 2 Cl 2 in EtOAc (8/1 v / v, 200 mL) and (4/1 v / v, 150 mL) to yield the compound of formula 3 (30.0 mg) SF5859-31 to SF5859-38. This was collected based on TLC analysis.
  • N, N-diisopropylethylamine (50 ⁇ L) is added to a solution of curvularin (Formula 1a, 15 mg) in 1 mL MeOH, and TMSCHN 2 (110 ⁇ L, 2.2 M in n-hexane) is added.
  • Curvularin Forma 1a, 15 mg
  • TMSCHN 2 110 ⁇ L, 2.2 M in n-hexane
  • Curvularin (Formula 1a, 10 mg) was dissolved in 600 ⁇ L of acetone and acetic anhydride (600 ⁇ L) was added. A catalytic amount of N, N-dimethylpyridin-4-amine was added to initiate the reaction. The reaction mixture was stirred at room temperature for 3 hours. The resulting solution was dried in vacuo and then partitioned between EtOAc and H 2 O before the organic phase was evaporated.
  • the compound of formula 4 is the first report of naturally occurring (10Z, 15S) -10,11-dehyrocurvularin and the previously reported (10Z, 15S *) - 10,11- dehyrocurvularin was an enantiomer of the compound of formula will be.
  • RAW264.7 macrophages with 10% heat-inactivated FBS, penicillin G (100 units / mL), streptomycin (100mg / mL) and 5 ⁇ 10 5 cells in RPMI1640 medium was added L- glutamine (2mM) / mL, and cultured at 37 ° C in a humidified atmosphere of 5% CO 2 .
  • Cells (1 ⁇ 105 cells / well in 96-well plates) were incubated with 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) For 3 hours, and the formazan formed was dissolved in acidic 2-propanol.
  • Optical density was measured at 540 nm with a microplate reader (BioRad, Hercules, Calif., USA). The optical density of formazan formed in the control (untreated) cells was considered to represent 100% viability.
  • nitrite a stable end product of NO oxidation as an indicator of NO production in RAW264.7 macrophages. The concentration of nitrite in conditioned media was determined based on the Griess reaction.
  • RAW 264.7 macrophages were pretreated for 3 hours in media containing the non-toxic concentrations of each compound (Formulas 1-4) (Table 1) and then treated with LPS (1 ⁇ g / mL) for 24 hours.
  • LPS LPS
  • the production of NO and PGE 2 was increased, and the effect of all compounds on the production levels of NO and PGE 2 was assessed by Griess reaction and PGE2 kit, respectively.
  • the compounds of formulas 1 to 4 inhibited the production of NO and PGE 2 by LPS dose-dependently, and their IC 50 values are shown in Table 2. Based on a comparison of the IC 50 values for the compounds of formulas 1 to 4, it was confirmed that the curvularin-type metabolites exhibit structure-dependent anti-inflammatory properties.
  • Example 7 Penicillium sp . Effects of SF-5859-derived curvularin type metabolites on the expression of proinflammatory enzymes and proinflammatory cytokines
  • the compound of formula 3 was identified as the metabolite with the best anti-inflammatory activity (Table 1).
  • the present inventors have found that the inhibitory effect on the production of NO and PGE 2 of the compound of formula (III) is inhibited by pro-inflammatory enzymes known to catalyze the production of NO and PGEs in cells stimulated with LPS (INOS or COX-2, respectively).
  • pro-inflammatory enzymes known to catalyze the production of NO and PGEs in cells stimulated with LPS (INOS or COX-2, respectively).
  • RAW264.7 macrophages were pretreated with the indicated concentrations of the compound of formula 3 for 3 hours and stimulated with LPS for 24 hours.
  • the presence of the compound of formula 3 dose-dependently reduced excessive protein expression of iNOS and COX-2 (Fig. 1 (a)).
  • cytokines such as TNF- ⁇ , IL, and the like.
  • the overproduction of this cytokine contributes to the onset of inflammatory diseases. Therefore, the present inventors further evaluated the effect of the compound of formula (3) on mRNA expression of proinflammatory cytokines in LPS-induced cells. Cells were pretreated with the indicated concentrations for 3 hours and then subjected to LPS stimulation (1 ⁇ g / mL) for 6 hours. MRNA expression of proinflammatory cytokines was determined by RT-qPCR. As shown in Fig. 1 (b) to Fig.
  • the compound of Chemical Formula 3 significantly inhibited mRNA expression of IL-1 ?, IL-6 and TNF-a in a dose-dependent manner. This result implies that the compound of formula 3 weakens the expression of proinflammatory cytokines at the transcriptional level.
  • Example 8 Effect on I ⁇ B- ⁇ phosphorylation and NF- ⁇ B activity
  • Nuclear factor- ⁇ B is an important transcription factor associated with inflammation-related diseases and is known to regulate inflammatory genes and the expression of proinflammatory mediators such as iNOS and COX-2.
  • NF- ⁇ B consists of inactivated subunits of p50 and p65 bound to the NF- ⁇ B inhibitory protein (I ⁇ B- ⁇ ).
  • the NF- ⁇ B signaling pathway can be activated by LPS or other stimuli, leading to the degradation and nuclear transfer of NF- ⁇ B as I ⁇ B- ⁇ phosphorylates.
  • the test of nuclear extract and the degree of binding of NF- ⁇ B were measured using an NF- ⁇ B ELISA kit (Active Motif).
  • the pretreatment of the compound of formula 3 inhibited the transfer of p50 and p65 to the nucleus in a dose-dependent manner (Fig. 2 (a)).
  • the phosphorylation level of I ⁇ B- ⁇ was increased, but the compound of formula III weakened the phosphorylation of I ⁇ B- ⁇ .
  • the compound of formula (3) prevented the degradation of I ⁇ B- ⁇ in a concentration-dependent manner (FIG. 2 (b)).
  • the compound of formula (III) can inhibit the induction of proinflammatory mediators and cytokines through down-regulation of the NF-kB signaling pathway.
  • the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway is known to be involved in the expression of proinflammatory cytokines in macrophages. Therefore, the effect of the compound of formula (3) on LPS induced phosphorylation of MAPK was investigated.
  • the phosphorylation of p38, c-Jun N-terminal phosphorylase (JNK) and extracellular signal regulated phosphorylation enzyme (ERK) occurs in the cells treated with LPS for 30 minutes. According to the data of this example, (Fig. 3 (a) to Fig. 3 (c)). Consequently, the anti-inflammatory effect of the compound of formula (III) does not seem to be mediated through the MAPK signaling pathway, and further research is needed to reveal specific targets involved in the anti-inflammatory activity of compounds of formula (III).
  • the marine fungus Penicillium sp the marine fungus Penicillium sp .
  • Pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of inflammatory diseases containing a metabolite of the curvularin type derived from SF-5859 (KCTC 13354BP) are useful for the prophylaxis and treatment of proinflammatory cytokines and mediators in RAW 264.7 macrophages And thus can be usefully used for prevention or treatment of inflammatory diseases.

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Abstract

본 발명은 커뷰라린 유형의 대사체를 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 염증질환 예방 또는 개선용 식품에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 해양 진균 Penicillium sp. SF-5859 유래 커뷰라린 유형의 대사체를 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 염증질환 예방 또는 개선용 식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 해양 진균 Penicillium sp. SF-5859(KCTC 13354BP)로부터 유래된 커뷰라린(curvularin) 유형의 대사체를 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 전 염증성 사이토카인 및 매개체 생성을 억제하므로, 염증질환의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

해양 진균 Penicillium sp. SF-5859 유래 커뷰라린 유형의 대사체를 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 커뷰라린 유형의 대사체를 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 염증질환 예방 또는 개선용 식품에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 해양 진균 Penicillium sp. SF-5859 유래 커뷰라린 유형의 대사체를 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 염증질환 예방 또는 개선용 식품에 관한 것이다.
염증은 신체 면역 반응의 중요한 부분으로, 상해 또는 손상에 대한 유용한 방어 반응이며, 상해의 해로운 영향을 억제하도록 계획된다(Zhang, G et al., 2001. J. Clin. Invest, 107, 13-19). 하지만, 과도한 급성 또는 만성 염증은 관절염, 천식, 대장염, 파키슨병, 알츠하이머병 또는 패혈증과 같은 심각한 장애를 일으킬 수 있다(K. Lucas et al., 2013, Mol. Neurobiol. 48, 190-204). 이러한 질병의 치료에 있어서, 염증의 제어는 필수적이다.
지질다당류(lipopolysaccharides; LPS)로 알려진 그람음성균의 외막은 강력한 전염증 내독소이다. LPS 자극은 대식세포 및 미세아교세포에서, 유도성 산화질소 효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS)-유래 산화질소(NO) 및 시클로옥시게나아제(cyclooxygenase-2; COX-2)-유래 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2; PGE2)를 포함하는 전염증성 매개체의 생성을 유도할 수 있다. 산화질소(NO)는 iNOS에 의해 생성되는 염증성 분자로, 과도한 iNOS의 활성 증가 또는 산화질소의 생성은 다양한 염증성 질환의 병인이다(McCartney-Francis et al., J. Exp. Med. 178, 749754, 1993; Szabo et al., New Horiz. 3, 232, 1995). COX-2 효소에 의해 합성되는 PGE2는 발열과 통증 같은 염증 증상의 중요한 매개체이므로(Samuelsson et al., Pharmacol. Rev. 59:207224, 2007; Simmons et al., Pharmacol. Rev. 56:387437, 2004), 이들 염증성 매개체의 생산 억제는 다양한 염증질환의 치료에 유용하다. 따라서, 염증성 사이토카인 및 매개물질의 억제는 염증 관련 만성 질병 예방에 대한 치료 표적일 수 있다.
또한, LPS에 의해 활성화된 대식세포는 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터류킨-1β(IL-1β) 및 인터류킨-6(IL-6)를 포함하는 전염증 사이토카인을 유도하며(T. Kawai et al., 2010, Nat. Immunol. 11, 373-384), 이는 NF-κB에 의해 조절된다. NF-κB는 전사인자 p50 및 p65의 이종이량체(heterodimeric) 단백질로 구성된다. 이종이량체 도메인은 저해단백질 IκBα와 상호작용하고, 이는 NF-κB를 불활성시키며, 세포질 내에서 복합체를 유지한다. LPS에 의해 유도되는 NF-κB 시스템의 활성은 IκBα의 분해 및 핵으로 NF-κB의 이동을 초래한다. 핵으로 NF-κB의 이동은 iNOS와 COX-2 단백질 발현 및 TNF-α와 IL-1β의 mRNA 발현을 더욱 유도한다.
LPS로 유도된 대식세포 및 미세아교세포에서 활성화된 미토겐 활성 단백질 인산화효소(mitogen-activated protein kinase; MAPK) 캐스케이드는 염증반응에 필수적인 역할을 하는 것으로 나타났다. 3가지 MAPK 신호전달 경로가 있으며, c-Jun N-말단 인산화효소(JNK), 세포외 신호조절 인산화효소(ERK) 및 P38이다(M.Y. Peroval et al., 2013, PLoS ONE 8, e51243).
한편, 박테리아, 시아노박테리아, 미세조류 및 곰팡이를 포함한 해양 미생물은 새로운 약리학적 활성 이차대사산물의 중요한 원천이며(Bugni and Ireland et al., Nat. Prod. Rep. 21:143163, 2004), 특히 해양균류는 신규한 항바이러스, 항염증, 항균 및 항암제 물질의 풍부하고 유망한 근원이다(Bhadury et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33:325337, 2006). 따라서, 다년간, 해양 유래 균류 연구는 새로운 2차 대사체 및 그들의 약리적 활성을 개시해왔다.
이에, 본 발명자들은 해양 진균 Penicillium sp. SF-5859로부터 커뷰라린 유형의 대사체들을 분리하여, RAW 264.7 대식세포에서 LPS에 의해 유도되는 염증반응에 대한 상기 화합물들의 항염증성 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 커뷰라린 유형의 대사체를 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 염증질환 예방 또는 개선용 식품을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 커뷰라린(curvularin) 유형의 대사체를 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
화학식 1
Figure PCTKR2018002498-appb-I000001
화학식 2
Figure PCTKR2018002498-appb-I000002
화학식 3
Figure PCTKR2018002498-appb-I000003
화학식 4
Figure PCTKR2018002498-appb-I000004
여기서, 상기 화학식 1의 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, OCH3 또는 OAc이고, 화학식 2의 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, OH 또는 OCH3이다.
본 발명은 또한, 약학적으로 유효한 양의 상기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 커뷰라린 유형의 대사체를 투여하는 단계를 포함하는 염증질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 염증질환 예방 또는 치료를 위한 상기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 커뷰라린 유형의 대사체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 염증질환 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 커뷰라린 유형의 대사체의 사용을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 커뷰라린 유형의 대사체를 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 개선용 식품을 제공한다.
도 1은 RAW264.7 대식세포에서 화학식 3의 화합물의 (a)는 iNOS와 COX-2 단백질 발현 수준에 대한 효과, (b)는 IL-1β, (c)는 IL-6, (d)는 TNF-α의 mRNA 발현 수준에 대한 효과를 나타낸 그래프이다. 3번의 독립적인 실험의 대표 데이터 또는 평균값을 표시하였다(*p < 0.05 는 LPS 처리된 군과 비교).
도 2는 LPS로 유도된 RAW264.7 대식세포에서 화학식 3의 화합물의 (a)는 NF-κB 활성화(핵-p50 및 p65)에 대한 효과, (b)는 IκBα 인산화 및 분해에 대한 효과, (c)는 NF-κB의 DNA 결합 활성에 대한 효과를 나타낸 그래프이다. 각 데이터는 3번의 독립적인 실험의 대표 데이터 또는 평균값을 나타낸다(*p < 0.05 는 LPS 처리된 군과 비교).
도 3은 LPS로 유도된 RAW264.7 대식세포에서 화학식 3의 화합물의 (a)는 p38, (b)는 JNK, (c)는 ERK의 인산화에 대한 효과를 나타낸 그래프이다. 3번의 독립적인 실험의 대표 데이터를 표시하였다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 해양 유래 진균 Penicillium sp. SF-5859(기탁번호: KCTC 13354BP)로부터 커뷰라린(curvularin) 유형의 대사체인 화학식 1 내지 4의 화합물을 분리하고 그 구조를 확인하였다. 또한, 상기 커뷰라린 유형의 대사체(화학식 1 내지 4의 화합물)가 RAW264.7 대식세포에서 NO 및 PGE2 생성을 억제하고, 화학식 3의 화합물이 iNOS 및 COX-2 발현을 억제하며, IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현을 억제시킴으로써, 염증질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 하기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 커뷰라린(curvularin) 유형의 대사체를 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
화학식 1
Figure PCTKR2018002498-appb-I000005
화학식 2
Figure PCTKR2018002498-appb-I000006
화학식 3
Figure PCTKR2018002498-appb-I000007
화학식 4
Figure PCTKR2018002498-appb-I000008
여기서, 상기 화학식 1의 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, OCH3 또는 OAc이고, 화학식 2의 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, OH 또는 OCH3이다.
본 발명은 다른 관점에서, 약학적으로 유효한 양의 상기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 커뷰라린 유형의 대사체를 투여하는 단계를 포함하는 염증질환 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 염증질환 예방 또는 치료를 위한 상기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 커뷰라린 유형의 대사체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 염증질환 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 커뷰라린 유형의 대사체의 사용에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 대사체는 curvularin(Elzner, S.; et al., Inhibitors of inducible NO synthase expression: total synthesis of (S)-curvularin and its ring homologues. ChemMedChem 2008, 3, 924-939.)으로 정의된다. 상기 화학식 1의 대사체는 하기 화학식 1a 내지 1e로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
화학식 1a 내지 1e
Figure PCTKR2018002498-appb-I000009
여기서, 화학식 1a는 R1=H, R2=H이고, 1b는 R1=OCH3, R2=H이고, 1c는 R1=OCH3, R2=OCH3이며, 1d는 R1=OAc, R2=H, 1e는 R1=OAc, R2=OAc이다.
상기 화학식 2의 대사체는 하기 화학식 2a 내지 2d로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
화학식 2a 내지 2d
Figure PCTKR2018002498-appb-I000010
여기서 화학식 2a는 R1=OH, R2=H로서, (11R,15S)-11-hydroxycurvularin이며, 2b는 R1=H, R2=OH로서 (11S,15S)-11-hydroxycurvularin이다(Greve, H.; et al., Apralactone A and a new stereochemical class of curvularins from the marine fungus Curvularia sp.. Eur. J. Org. Chem. 2008, 2008, 5085-5092.). 화학식 2c는 R1=OCH3, R2=H로서, (11R,15S)-11-methoxycurvularin이며, 2d는 R1=H, R2=OCH3로서, (11S,15S)-11-methoxycurvularin이다(Liang, Q.; et al., First total syntheses and spectral data corrections of 11-α-methoxycurvularin and 11-β-methoxycurvularin. J. Org. Chem. 2007, 72, 9846-9849.).
또한, 상기 화학식 3의 대사체는 (10E,15S)-10,11-dehydrocurvularin(Greve, H.; et al., Apralactone A and a new stereochemical class of curvularins from the marine fungus Curvularia sp.. Eur. J. Org. Chem. 2008, 2008, 5085-5092.), 상기 화학식 4의 대사체는 (10Z,15S)-10,11-dehydrocurvularin(Lai, S.; et al., Novel curvularin-type metabolites of a hybrid strain ME 0005 derived from Penicillium citreo-viride B. IFO 6200 and 4692. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 2241-2244.)으로 정의된다.
커뷰라린 유형의 대사체들은 Curvularia, Penicillium 및 Alternaria 속의 여러 가지 진균에 의해 생성되는 macrocyclic lactones이며, 다양한 생물학적 활성을 갖는다고 보고되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 커뷰라린 유형의 대사체는 해양 진균 Penicillium sp. SF-5859(기탁번호: KCTC 13354BP)에서 분리된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 염증질환은 관절염, 비염, 간염, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 화상 염증, 피부염, 치주염, 치은염 및 퇴행성 신경염증으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 염증질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 하기 특성 중 어느 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
1) 산화질소(NO) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성 억제;
2) 유도성 산화질소 효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현 억제;
3) IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현 억제;
4) IκB-α(inhibitor kappa B-α)의 인산화 및 분해 억제; 및
5) NF-κB(nuclear factor kappa B)의 활성화 억제.
본 발명에 있어서, 상기 염증질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 산화질소(NO) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성 억제 특성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 화학식 1 내지 4의 화합물이 NO 및 PGE2의 과잉 생성을 억제하는 것을 확인하였다(표 1). NO는 다양한 면역 세포에서 생성되는 세포 내 매개체인 작은 분자이며, 염증 증상의 생리학적 및 병리학적 상태에 중추적인 역할을 한다. 또한, PGE2는 면역 반응과 염증 반응을 조절할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 염증질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 유도성 산화질소 효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현 억제 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 화학식 3의 화합물이 LPS로 유도된 세포에서 iNOS 및 COX-2의 과도한 단백질 발현을 용량-의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다(도 1(a)). iNOS 및 COX-2는 전 염증성 매개체로서, iNOS는 NO를 생성하는 염증성 분자이며, COX-2는 PGE2를 생성한다. iNOS 및 COX-2의 과도한 활성 증가는 다양한 염증질환의 병인일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 염증질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현 억제 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, LPS로 유도된 세포에서 화학식 3의 화합물이 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현을 용량-의존적으로 현저하게 억제하는 것을 확인하였다(도 1(b) 내지 도 1(d)). 이러한 결과는 화학식 3의 화합물이 전사 수준(transcriptional level)에서 전 염증성 사이토카인의 유전자 발현을 약화시킨다는 것을 의미한다. TNF-α, IL 등과 같은 전 염증성 사이토카인의 과잉 생성은 염증질환의 발병에 기여한다.
본 발명에 있어서, 상기 염증질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 IκB-α(inhibitor kappa B-α)의 인산화 및 분해 억제 및 NF-κB(nuclear factor kappa B)의 활성화 억제 특성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 가장 활성이 있는 대사체인 (10E,15S)-10,11-dehydrocurvularin(화학식 3의 화합물)이 IκB-α의 인산화를 약화시키고, 농도-의존적으로 IκB-α의 분해를 막는 것을 확인하였다(도 2(b)). 또한, NF-κB 신호 전달 경로의 하향 조절을 통해 전 염증성 매개체 및 사이토카인의 유도를 억제할 수 있는 것을 확인하였다.
많은 세포 신호 전달 경로와 전사 인자가 면역 세포에서 전 염증성 유전자 및 효소의 발현에 관련이 있다고 보고되어 왔다. NF-κB는 염증 관련 질환과 관련된 중요한 전사 인자이며, 염증성 유전자와 iNOS 및 COX-2와 같은 전 염증성 매개체의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 정상 세포에서 NF-κB는 IκB-α에 결합된 p50과 p65의 불활성화된 서브유닛으로 구성된다. NF-κB 신호 전달 경로는 LPS 또는 다른 자극에 의해 활성화될 수 있으며, IκB-α가 인산화되면서 NF-κB의 분해 및 핵으로의 전이를 유도한다.
본 발명에 있어서, 상기 염증질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 MAPK 신호 전달 경로를 통해 매개되지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 화학식 3의 화합물의 항염증 효과는 MAPK 신호 전달 경로를 통해 매개되지 않는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈,수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 이에 제한되는 것은 아니나, 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수용액제, 현탁액, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 60, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 건강상태, 체중, 연령, 성별, 식이, 배설율, 질병의 정도, 약물형태, 투여시간, 투여경로 및 투여기간에 따라 그 범위가 다양하지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 대사체는 1일 0.001~1000mg/kg으로, 바람직하게는 0.01~100mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 염증질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 커뷰라린(curvularin) 유형의 대사체를 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 개선용 식품에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 염증질환 예방 또는 개선용 식품은 영양 보조제(nutritional supplement), 건강 식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 커뷰라린 유형의 대사체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 상기 식품은 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명에 따른 커뷰라린 유형의 대사체를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "염증"이란, 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 각종 유해한 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어 기전이다. 염증의 자극에는, 감염 혹은 화학적, 물리적 자극이 있으며, 염증의 과정은 급성과 만성 염증의 2가지로 나눌 수 있다. 급성염증은 수일 이내의 단기적인 반응이며, 혈장성분이나 혈구 등이 미소순환계를 게재하여 이물 제거에 관련한다. 만성염증은 지속시간이 길며, 조직의 증식 등이 보여진다.
본원에서 "산화질소(NO)"는 세포 내 염증반응 유발시 산화질소 합성효소에 의해 생성량이 증가하는 물질로, 염증반응의 지표가 되는 분자이다. 신경계에서 산화질소는 신경세포에 존재하는 신경계 산화질소 합성효소(NOS)에 의하여 합성된다. 상기 합성된 산화질소는 뇌세포에서 cGMP의 생성을 증가시키고, 이로 인하여 외부로부터 인지한 정보를 오랫동안 저장하는 기능을 수행한다. NO는 자유 라디칼로 생리학적, 병리학적 과정에 관련된 것으로 알려져 있다. NO는 산화질소 합성효소에 의해 엘-아르기닌(L-Arginine) 산화에 의해 합성된다(Atkan, et al., 75: 639-653, 2004).
본원에서 "COX-2"는 염증반응과 관련된 단백질인 프로스타글라딘을 생성하는데 관여하는 효소로, 세포내 COX-2 발현 수준의 증가는 염증반응이 진행되고 있음을 나타내는 지표가 될 수 있다.
본원에서 "프로스타글란딘 E2(PGE2)"는 프로스타글란딘 엔도페록시드 합성효소라고 불리는 COX-2에 의해 염증 부위에서 생성되는 염증 매개체이다. PGE2는 많은 심장혈관 질환, 관절염, 염증성 장 질환 및 만성 위궤양을 포함하는 만성 염증성 질환과 관련되어 있다(St-Onge, M. et al., Biochim.Biophys.Acta. 1771:1235-1245, 2007; Turini, M.E. et al., Annu.Rev.Med. 53:35-57, 2002; Rocca, B. et al., Int.Immunopharmacol. 2: 603-630, 2002; Singh, V.P. et al., Pharmacology 72:77-84, 2004).
본원에서 "MAPK"는 성장인자 등이 세포막에 위치한 수용체를 활성화하려면 이 신호를 세포막으로부터 핵으로 전달함으로써 세포의 성장과 분화를 조절하는 주요 신호전달계이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 일반적인 실험 절차
선광성(optical rotation)은 Jasco P-2000 digital polarimeter(Jasco, Easton, PA, USA)을 사용하였다. NMR 스펙트럼(1D 및 2D)은 JEOL JNM ECP-400 spectrometer(400 MHz for 1H, 100 MHz for 13C, JEOL Ltd., Akishima, Japan)를 사용하였고, 화학적 이동(chemical shifts)은 상응하는 residual solvents signals에 대하여 표시되었다(δH 2.05/δC 29.8 for acetone-d 6, δH 7.26/δC 77.2 for CDCl3 및 δH 3.30/δC 49.0 for CD3OD).
HMQC 및 HMBC 실험은 각각 1JCH=140Hz와 nJCH=8Hz로 최적화되었다. HRESIMS 데이터는 ESI Q-TOF MS/MS 시스템(AB SCIEX Triple, SCIEX, Framingham, MA, USA)을 이용하여 얻었다. Flash column chromatography는 실리카 겔(Kieselgel 60, 70-230 mesh and 230-400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, USA)과 YMC octadecyl-functionalized silica gel(C18, YMC CO., Kyoto, Japan) 상에서 수행하였다. HPLC(YoungLin, Anyang, Korea) separations에는 YMC semiprep-C18 column(20 X 150mm; 4 μm particle size; 80 Å pore size, 5 mL/min, YMC CO., Kyoto, Japan) 및 Shodex Ohpak SB 802.5(8 X 300mm; 6μm particle size; 80 Å pore size, 0.6mL/min, Showa Denko K.K., Tokyo, Japan)가 사용되었다. TLC는 Kieselgel 60 F254(Merck, Kenilworth, NJ, USA) 또는 reversed-phase(RP)-18 F254s(Merck, Kenilworth, NJ, USA) 판에서 수행되었다. 스팟은 가열 후 10% aqueous H2SO4 solution에서 뿌려져 시각화되었다. 모든 화합물들은 210 및 254nm UV absorption에 의해 탐지되었다.
RPMI1640, fetal bovine serum (FBS) 및 다른 조직배양 시약은 Gibco BRL Co.(Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. 다른 모든 화학 물질들은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)을 통해 얻었다. 1차 항체(COX-2: sc-1745; iNOS: sc-650; IκB-α: sc-371; p-IκB-α: sc-8404; p50: sc-7178; p65: sc-8008, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, p-ERK: #9101; ERK: #9102; p-JNK: #9251; JNK: #9252S; p-p38: #9211; p38: 9212S, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 및 2차 항체(mouse: ap124p; goat: ap106p; rabbit: ap132p, Millipore, Billerica MA, USA). PGE2를 위한 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 키트는 R and D Systems, Inc.(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다.
실시예 2: 해양 진균 Penicillium sp. SF-5859의 배양 및 확인
로스해(76 06.25635 S 169 12.6752 E)에서 수집한 정체불명의 해면동물로부터 Penicillium sp. SF-5859(기탁번호: KCTC 13354BP)를 분리하였다. 해면동물의 표면을 멸균하고, 시료 1g을 막자 사발로 분쇄한 후, 멸균된 바닷물(10mL)과 혼합하였다. 시료의 일부(0.1mL)를 부산 지역에서 채취한 멸균 해수를 함유한 potato dextrose agar (PDA) 배지에서 확산 판 방법을 사용하여 가공하였다. 플레이트를 25℃에서 14일동안 배양하였다. 분리 균을 몇 차례 계대 배양한 후, 순수 배양균을 선별하여 -70℃에서 보존하였다.
진균 균주 SF-5859는 rRNA 서열 분석에 기초하여 동정하였다. SF-5859(GenBank 수탁번호 KF745792) 28S rRNA 유전자로 검색한 GenBank 결과는 Penicillium chrysogenum (FJ890400), P. steckii (HM469415), P. paxilli (FJ890408) 및 P. citrinum (JN938950) 각각 99.48%, 98.69%, 98.69% 및 98.43%의 서열 동일성을 나타냈다. 따라서, 해양에서 유래된 진균 균주 SF-5859는 Penicillium sp.로 특정되었으나, 특정 종은 명확하게 확인되지 않았다.
실시예 3: Penicillium sp. SF-5859로부터 curvularin 유형의 대사체의 추출 및 분리
진균 균주 Penicillium sp. SF-5859는 10g의 Fernbach-style 플라스크에 100g의 semi-solid semi-solid vermiculite와 3%(w/v) NaCl을 함유한 400mL PDB가 들어있는 배지에서 배양되었다. 플라스크는 진균 균주의 2mL 종군 배양물을 개별적으로 접종하고, 25℃에서 14일동안 항온 처리한 다음, EtOAc(한 플라스크 당 4L)로 추출하였다. 추출 용액을 여과지를 통해 여과시키고 증발 건조시켜 조 추출물(crude extract) SF5859(2.2g)을 수득하였다. 조 추출물을 역상(reversed phase; RP) C18 플래시 컬럼 크로마토그래피(5X30cm)로 분획시키고, H2O(각각 500mL) 중의 20, 40, 60, 80 및 100%(v/v) MeOH의 단계적 구배로 용출시켜 SF5859-1에서 SF5859-6까지 6개의 분획을 연속적으로 얻었다. SF5859-3 분획을 실리카겔(2X30cm)이 충진된 크로마토그래피 컬럼에 적용시켰다. 이어서, 컬럼을 EtOAc(8/1 v/v, 200mL) 및 (4/1 v/v, 150mL) 중의 CH2Cl2의 구배로 용출시켜 화학식 3의 화합물(30.0mg) 및 7개의 다른 분획, SF5859-31에서 SF5859-38까지 얻었다. 이는 TLC 분석에 기초하여 모아졌다.
4번째 분획인 SF5859-34를 물(0.1% HCOOH) 중 MeOH(60% to 80% in 20min)의 구배로 용출시키는 semi-preparative reverse-phase HPLC에 의해 추가로 정제하여서 화학식 4의 화합물(1.5mg, t R = 13.5min)을 얻었다.
마찬가지로, 6번째 분획인 SF5859-36을 semi-preparative RP HPLC column(50-80% MeOH in H2O(0.1% HCOOH) over 30 min)에 적용시켜 2개의 하위 분획 SF5859-361 및 SF5859-362를 얻고, Shodex Ohpak SB 802.5 HPLC column(30-75% MeOH in H2O over 50 min)을 수행하여 하위 분획 SF5859-362로부터 화학식 2c의 화합물(3.5mg, t R = 46 min)을 분리하였다.
7번째 분획 SF5859-37은 semi-preparative RP HPLC column(30-60% MeOH in H2O (0.1% HCOOH) in 30 min)을 이용하여 화학식 2b의 화합물(1.5mg, t R = 28 min) 및 2개의 다른 하위 분획으로 분리되었다. 상기 하위 분획물 중 SF5859-373을 semi-preparative RP HPLC column (40-65% MeOH in H2O (0.1% HCOOH) in 25 min)으로 추가 분리하여 화학식 2a의 화합물(2.5mg, t R = 20.5 min)를 얻었다.
8번째 분획 SF5859-38은 MeOH in H2O(1/3 v/v)으로 용출하는 C18 크로마토그래피 컬럼(1.5X20cm)에 의해 먼저 분리되고, 분획 SF5859-4는 CH2Cl2 in EtOAc(7/1 v/v)로 용리하면서 실리카 겔 컬럼(3X30cm)에서 크로마토그래피 하였다. 이것으로부터 4개의 다른 분획물과 함께 주요 대사 산물인 화학식 1a의 화합물(450.0mg)을 얻었다.
5번째 분획 SF5859-45를 semi-preparative RP HPLC column 60-75% MeOH in H2O (0.1% HCOOH) over 15 min)에서 최종 정제하여 화학식 2d의 화합물(2mg, t R = 13 min)을 수득 하였다.
1mL MeOH의 curvularin(화학식 1a, 15mg) 용액에 N,N-diisopropylethylamine (50μL)을 추가하고, TMSCHN2 (110μL, 2.2M in n-hexane)을 추가한다. 반응 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 진공에서 농축시키고, 유기 상을 증발시키기 전에 EtOAc 및 H2O로 추출하였다. 그 후, 잔류물질을 18분에 걸쳐 70% 내지 86%의 메탄올 in water(0.1 % HCOOH)의 구배로 용출시키는 semi-preparative RP HPLC에 적용시켜 메틸화 생성물 화학식 1b(4mg, t R = 14 min) 및 화학식 1c(6mg, t R = 16 min)의 화합물을 얻었다.
Curvularin(화학식 1a, 10mg)을 600μL acetone에 용해시킨 후, acetic anhydride(600μL)을 첨가하였다. 촉매량의 N,N-dimethylpyridin-4-amine을 첨가하여 반응이 개시되었다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 진공에서 건조시킨 후, 유기 상을 증발시키기 전에 전에 EtOAc 및 H2O로 분할하였다. 그 후, 잔류물질을 19분에 걸쳐 62% 내지 80%의 methanol in water(0.1% HCOOH)의 구배로 용출시키는 semi-preparative RP HPLC에 적용시켜 아세틸화된 생성물 화학식 1d(2mg, t R = 14 min) 및 1e(3.5mg, t R = 16 min)의 화합물을 얻었다.
실시예 4: Penicillium sp. SF-5859 유래 curvularin 유형의 대사체의 구조 결정
4-1: 화학식 1b 및 1c 화합물
5-O-methylcurvularin(1b): white amorphous powder; 1H-NMR(CD3OD, 400MHz) 및 13C-NMR data(CD3OD, 100MHz); HRESIMS m/z 309.1667 [M + H]+ (calcd. for C17H21D2O5 due to deuterium exchange, 309.1671).
5,7-Di-O-methylcurvularin(1c): white amorphous powder; 1H-NMR (CD3OD, 400MHz) 및 13C-NMR data(CD3OD, 100MHz); HRESIMS m/z 321.1706 [M + H]+(calcd. for C18H25O5, 321.1702).
4-2: 화학식 1d 및 1e 화합물
5-O-acetylcurvularin(1d): white amorphous powder; 1H-NMR (acetone-d 6, 400MHz); HRESIMS m/z 357.1336 [M + Na]+ (calcd. for C18H22NaO6, 357.1314).
5,7-Di-O-acetylcurvularin(1e): white amorphous powder;1H-NMR (acetone-d 6, 400MHz); HRESIMS m/z 399.1441 [M + Na]+ (calcd. for C20H24NaO7, 399.1420).
4-3: 화학식 4 화합물
화학식 4의 화합물은 음의 비선광도([α]20 D = -19.9 (c = 0.15, EtOH)를 갖는 반면, 화학식 4의 화합물과 동일한 평면 구조를 갖는 (10Z,15S*)-10,11-dehyrocurvularin은 양의 비선광도([α]22 D = +7.3 (c 0.78, EtOH); Lai, S et al., Novel curvularin-type metabolites of a hybrid strain ME 0005 derived from Penicillium citreo-viride B. IFO 6200 and 4692. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 2241-2244.)를 갖는 Penicillium sp.에서 유래된 혼합 균주로부터 분리되었다는 것은 주목할 만하다. C-15에서의 비선광도의 부호와 절대적 구성 사이의 관계를 고려할 때, 화학식 4의 화합물은 자연적으로 발생한 (10Z,15S)-10,11-dehyrocurvularin의 첫번째 보고이며, 이전에 보고된 (10Z,15S*)-10,11-dehyrocurvularin은 화학식 4의 화합물의 거울상 이성질체였을 것이다.
실시예 5: 세포 배양 및 생존력 분석
본 실시예에서는 화학식 1 내지 4의 화합물의 세포독성을 MTT 분석법을 이용하여 RAW264.7 대식세포에서 확인하였다.
RAW264.7 대식세포를 10% 열-불활성화된 FBS, 페니실린 G(100 units/mL), 스트렙토마이신(100mg/mL) 및 L-글루타민(2mM)이 첨가된 RPMI1640 배지에서 5×105cells/mL의 농도로 유지하고, 5% CO2의 습기 내 37℃에서 배양하였다. 세포 생존력의 결정을 위해, 세포(1X105cells/well in 96-well plates)는 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)와 함께 최종 농도 0.5mg/mL의 농도로 3시간 동안 배양하고, 형성된 formazan을 acidic 2-propanol에 용해시켰다. 광학밀도는 마이크로플레이트 판독기(BioRad, Hercules, CA, USA)로 540nm에서 측정하였다. 대조군(처리되지 않은) 세포에서 형성된 formazan의 광학밀도는 100% 생존력을 나타내는 것으로 간주되었다.
실시예 6: Penicillium sp. SF-5859 유래 curvularin 유형의 대사체가 아질산염 및 PGE2 생성 억제에 미치는 영향
RAW264.7 대식세포에서 NO 생성의 지표로서 NO 산화의 안정한 최종 생성물 인 아질산염(nitrite)의 생성이 평가되었다. Conditioned media에서 아질산염의 농도는 그리스 반응(Griess reaction)에 기초하여 결정되었다.
본 실시예에서는 RAW264.7 대식세포를 각 화합물(화학식 1 내지 4)의 무독성 농도(표 1)가 함유된 배지에서 3시간 동안 전처리 한 다음 LPS(1μg/mL)를 24시간 동안 처리하였다. LPS에 의한 RAW264.7 대식세포의 자극에 따라, NO 및 PGE2의 생성이 증가하였고, NO 및 PGE2의 생성 수준에 대한 모든 화합물의 영향이 각각 Griess 반응 및 PGE2 키트에 의해 평가되었다.
결과적으로, 화학식 1 내지 4의 화합물은 LPS에 의한 NO 및 PGE2의 생성을 용량-의존적으로 저해하였고, 이들의 IC50 값을 표 2에 나타내었다. 화학식 1 내지 4의 화합물에 대한 IC50 값의 비교에 기초하여, 커뷰라린 유형의 대사체(curvularin-type metabolites)들이 구조-의존적인 항염증 특성을 나타내는 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2018002498-appb-T000001
실시예 7: Penicillium sp. SF-5859 유래 curvularin 유형의 대사체가 전 염증 효소 및 전 염증성 사이토카인 발현에 미치는 영향
본 발명의 curvularin 유형의 대사체 중에서 IC50 값에 근거하여 화학식 3의 화합물이 가장 우수한 항염증 활성을 갖는 대사체로 확인되었다(표 1).
따라서, 본 발명자들은 화학식 3의 화합물이 갖는 NO와 PGE2 생성에 대한 억제 효과가 LPS로 자극된 세포에서 NO 및 PGE들의 생성에 촉매 작용 하는 것으로 알려진 전 염증 효소(pro-inflammatory enzymes, 예를 들면 각각 iNOS 또는 COX-2)의 단백질 발현과 상관 관계가 있는지를 더 실험하였다. RAW264.7 대식세포를 3시간 동안 화학식 3의 화합물의 지시된 농도로 전처리 후, 24시간 동안 LPS로 자극하였다. 화학식 3의 화합물의 존재는 iNOS 및 COX-2의 과도한 단백질 발현을 용량-의존적으로 감소시켰다(도 1(a)).
또한, LPS에 의한 자극 시, 대식세포는 TNF-α, IL 등과 같은 전 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 생성을 유발할 수 있다. 이 사이토카인의 과잉 생성은 염증질환의 발병에 기여한다. 따라서, 본 발명자들은, LPS로 유도된 세포에서 화학식 3의 화합물의 전 염증성 사이토카인의 mRNA 발현에 대한 효과를 추가로 평가하였다. 세포를 지시된 농도로 3시간 동안 전처리 한 다음, 6시간 동안 LPS 자극(1μg/mL)을 가했다. 전 염증성 사이토카인의 mRNA 발현은 RT-qPCR에 의해 결정되었다. 도 1(b) 내지 도 1(d)에서 설명되는 바와 같이, 화학식 3의 화합물은 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 mRNA 발현을 용량-의존적으로 현저하게 억제하였다. 이러한 결과는 화학식 3의 화합물이 전사 수준(transcriptional level)에서 전 염증성 사이토카인의 유전자 발현을 약화시킨다는 것을 의미한다.
실시예 8: IκB-α 인산화 및 NF-κB 활성에 대한 효과
많은 세포 신호 전달 경로와 전사 인자가 면역 세포에서 전 염증성 유전자 및 효소의 발현에 관련이 있다고 보고되어 왔다. 핵 인자-κB(Nuclear factor-κB; NF-κB)는 염증 관련 질환과 관련된 중요한 전사 인자이며, 염증성 유전자와 iNOS 및 COX-2와 같은 전 염증성 매개체의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 정상 세포에서 NF-κB는 NF-κB 억제 단백질(IκB-α)에 결합된 p50과 p65의 불활성화된 서브유닛으로 구성된다. NF-κB 신호 전달 경로는 LPS 또는 다른 자극에 의해 활성화될 수 있으며, IκB-α가 인산화되면서 NF-κB의 분해 및 핵으로의 전이를 유도한다.
본 실시예에서는 핵 추출물의 테스트 및 NF-κB의 결합 정도를 NF-κB ELISA kit(Active Motif)를 사용하여 측정하였다. 본 실시예의 데이터에 의하면, 화학식 3의 화합물의 전처리는 용량-의존적으로 p50 및 p65의 핵으로의 전이를 억제했다(도 2(a)). 나아가, 세포에 LPS를 단독으로 처리했을 때, IκB-α의 인산화 수준은 증가했지만, 화학식 3의 화합물은 IκB-α의 인산화를 약화시켰다. 또한, 화학식 3의 화합물은 농도-의존적으로 IκB-α의 분해를 막았다(도 2(b)). 이와 마찬가지로, 화학식 3의 화합물로 동시-처리된 세포의 핵 추출물에서 NF-κB의 LPS로 유도된 DNA 결합 활성이 감소하였다(도 2(c)). 종합하면, 화학식 3의 화합물은 NF-κB 신호 전달 경로의 하향 조절을 통해 전 염증성 매개체 및 사이토카인의 유도를 억제할 수 있다.
실시예 9: MAPK 경로에 대한 효과
Mitogen-activated protein kinase(MAPK) 경로는 대식세포에서 전 염증성 사이토카인의 발현에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, MAPK의 LPS로 유발된 인산화에 대한 화학식 3의 화합물의 효과를 조사하였다. 세포에 30분간 LPS를 처리하면 p38, c-Jun N-말단 인산화효소(JNK) 및 세포 외 신호조절 인산화효소(ERK)의 인산화가 일어나지만, 본 실시예의 데이터에 의하면 화학식 3의 화합물은 이들의 인산화를 억제하지 못한다(도 3(a) 내지 도 3(c)). 결과적으로, 화학식 3의 화합물의 항염증 효과는 MAPK 신호 전달 경로를 통해 매개되는 것으로 보이지 않으며, 화학식 3의 화합물의 항염증 활성에 관여하는 특정 표적을 밝히기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다.
수탁번호
기탁기관명: 한국생명공학연구원
수탁번호: KCTC13354BP
수탁일자: 20170915
본 발명에 따르면 해양 진균 Penicillium sp. SF-5859(KCTC 13354BP)로부터 유래된 커뷰라린(curvularin) 유형의 대사체를 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 염증반응과 관련하여 RAW264.7 대식세포에서 전 염증성 사이토카인 및 매개체 생성을 억제하므로, 염증질환의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Figure PCTKR2018002498-appb-I000011

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 커뷰라린(curvularin) 유형의 대사체를 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    화학식 1
    Figure PCTKR2018002498-appb-I000012
    화학식 2
    Figure PCTKR2018002498-appb-I000013
    화학식 3
    Figure PCTKR2018002498-appb-I000014
    화학식 4
    Figure PCTKR2018002498-appb-I000015
    여기서, 상기 화학식 1의 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, OCH3 또는 OAc이고, 화학식 2의 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, OH 또는 OCH3임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 커뷰라린 유형의 대사체는 해양 진균 Penicillium sp. SF-5859(KCTC 13354BP)에서 분리된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 염증질환은 관절염, 비염, 간염, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 화상 염증, 피부염, 치주염, 치은염 및 퇴행성 신경염증으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 하기 특성 중 어느 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    1) 산화질소(NO) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성 억제;
    2) 유도성 산화질소 효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현 억제;
    3) IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현 억제;
    4) IκB-α(inhibitor kappa B-α)의 인산화 및 분해 억제; 및
    5) NF-κB(nuclear factor kappa B)의 활성화 억제.
  5. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 하기 화학식 1 내지 4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 커뷰라린(curvularin) 유형의 대사체를 유효성분으로 함유하는 염증질환 예방 또는 개선용 식품:
    화학식 1
    Figure PCTKR2018002498-appb-I000016
    화학식 2
    Figure PCTKR2018002498-appb-I000017
    화학식 3
    Figure PCTKR2018002498-appb-I000018
    화학식 4
    Figure PCTKR2018002498-appb-I000019
    여기서, 상기 화학식 1의 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, OCH3 또는 OAc이고, 화학식 2의 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, OH 또는 OCH3임.
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