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WO2019049927A1 - 安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物 - Google Patents

安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物 Download PDF

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Publication number
WO2019049927A1
WO2019049927A1 PCT/JP2018/033017 JP2018033017W WO2019049927A1 WO 2019049927 A1 WO2019049927 A1 WO 2019049927A1 JP 2018033017 W JP2018033017 W JP 2018033017W WO 2019049927 A1 WO2019049927 A1 WO 2019049927A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
enzyme
protein
weight
protein deamidation
stability
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/033017
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
平圭 小原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amano Enzyme Inc
Original Assignee
Amano Enzyme Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amano Enzyme Inc filed Critical Amano Enzyme Inc
Priority to JP2019540993A priority Critical patent/JP7315461B2/ja
Priority to CN201880057099.5A priority patent/CN111051507B/zh
Priority to US16/645,393 priority patent/US11685914B2/en
Priority to EP18853419.2A priority patent/EP3680330A4/en
Publication of WO2019049927A1 publication Critical patent/WO2019049927A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01044—Protein-glutamine glutaminase (3.5.1.44)

Definitions

  • the present invention relates to stabilized protein deamidation enzyme dry compositions.
  • the protein deamidation enzyme is an enzyme assigned EC 3.5.1.44 as an EC number, and hydrolyzes the amido group of glutamine and asparagine in the protein to convert it to glutamic acid and aspartic acid to release ammonia.
  • Protein deamidation enzymes improve protein functionality (solubility, emulsifying properties, foam properties, gelling properties, etc.), improve wheat gluten dough extensibility, reduce wheat allergen induced property, protein from agricultural products It is applicable to various applications such as improvement of extraction efficiency and improvement of calcium solubility in protein solution, and is an enzyme with high industrial applicability.
  • Protein deamidation enzymes are ubiquitous in nature. The best known ones are the protein-derived glutaminases from microorganisms described in Patent Documents 1 and 2.
  • Non-Patent Document 1 reports the presence of an enzyme that deamidates glutamine residues in proteins from germinating wheat, green bean and pumpkin seeds.
  • Non-Patent Document 2 reports the presence of a peptide glutaminase, which is an enzyme that deamidates glutamine residues in a peptide, in the cells of bacteria (Bacillus circulans).
  • Non-Patent Document 2 describes that the pH stability of the protein deamidation enzyme solution is pH 5 to 9.
  • transglutaminase is mentioned as an enzyme which acts on an amide group as an enzyme known since protein deamidation enzyme from old times.
  • Transglutaminase is an acyl transferase to which EC 2.3.2.13 is assigned as an EC number, and protein deamidation enzyme is known as an enzyme completely different from transglutaminase in terms of structure and properties.
  • Storage stability becomes important when using an enzyme as an industrial enzyme agent.
  • modification of the property of the enzyme itself by mutation, addition of a stabilizer and the like can be mentioned.
  • Patent Document 3 describes the design of a mutant protein deamidation enzyme that introduces a specific mutation into a protein deamidation enzyme to improve stability.
  • an object of the present invention is to provide a technique for improving the stability of a protein deamidation enzyme composition by devising the composition of the enzyme composition.
  • the present inventor examined a stabilizer that improves the stability to protein deamidation enzyme in the enzyme composition, and as a stability improvement to protein amide enzyme uniqueness, the protein deamidation enzyme is used as a dry composition and magnesium chloride It has been found that it is effective to formulate or to prepare a protein deamidation enzyme as a dry composition and to have a pH of less than 5 at the time of dissolution.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • the present invention includes the following inventions.
  • Item 1 A stabilized protein deamidation enzyme dry composition comprising a protein deamidation enzyme and magnesium chloride.
  • Item 2. Item 11. The stabilized protein deamidation enzyme dry composition according to Item 1, wherein the content of the magnesium chloride is 1.0 to 10.0% by weight.
  • Item 3. Item 11. The stabilized protein deamidation enzyme dry composition according to Item 1, wherein the content of the magnesium chloride is 1.0 to 6.0% by weight.
  • Item 4. Item 11. The stabilized protein deamidation enzyme dry composition according to Item 1, wherein the content of the magnesium chloride is 0.01 to 2.0 mg / u.
  • a method for improving the stability of a protein deamidation enzyme comprising: A method for improving stability, in which magnesium chloride is coexistent with the protein deamidation enzyme in a dry enzyme composition.
  • Item 6. The stabilized protein deamidation enzyme dry composition which has a pH of 2 or more and less than 5 when dissolved in water so as to be 1 w / v%.
  • Item 7. What is claimed is: 1.
  • a method for improving the stability of a protein deamidation enzyme comprising: A method for improving stability, comprising adjusting the pH of the dry enzyme composition to be 2 or more and less than 5 when dissolved in water so as to be 1 w / v%.
  • Item 8. A method for producing a stabilized protein deamidation enzyme dry composition, comprising the steps of: preparing an enzyme solution containing a protein deamidation enzyme having a pH of 2 or more and less than 5; and drying the enzyme solution.
  • the present invention provides a stabilized stabilized protein deamidation enzyme dry composition comprising a protein deamidation enzyme and magnesium chloride, and a stabilized pH of 2 to 5 when dissolved in water at a predetermined concentration.
  • the stabilized protein deamidation enzyme dry composition having a pH of 2 or more and less than 5 when dissolved in water at a predetermined concentration may or may not contain magnesium chloride.
  • the protein deamidation enzyme in the present invention is also referred to as protein glutaminase, and is an enzyme that acts on an amide group of a side chain of a protein to hydrolyze it into a side chain carboxyl group and ammonia.
  • the optimum temperature is, for example, around 60 ° C.
  • the optimum pH is, for example, around pH 6.
  • amino acid residues having an amide group of a side chain on which a protein deamidation enzyme acts include, but are not limited to, asparagine residues and glutamine residues.
  • proteins that are substrates of protein deamidation enzymes include proteins having a molecular weight of 5,000 or more, preferably 10,000 to 2,000,000, but also include polypeptides (including dipeptides) having a molecular weight of less than 5,000.
  • proteins which is a substrate of protein deamidation enzyme it may be a form of a single protein consisting only of amino acid residues, or a form of a complex protein complexed with a sugar, a lipid, etc. Good.
  • the protein amide enzyme in the present invention does not have transglutaminase activity even if it acts on the amide group of the side chain of the protein.
  • Transglutaminase activity is an activity that catalyzes isopeptide formation between glutamine residue and lysine residue of protein as found in transglutaminase.
  • the protein deamidation enzyme in the present invention also has no protease activity.
  • Protease activity is the activity of hydrolyzing the peptide bonds of proteins, as found in various prostheses.
  • the organism from which the protein deamidation enzyme of the present invention is derived is capable of producing an enzyme having an activity of acting on the amide group of the side chain in the protein and cleaving the peptide bond and crosslinking the protein. It is not particularly limited.
  • organisms from which protein deamidation enzymes are derived include, for example, bacteria classified as Cytophagales (Cytophagales), Actinomycetes, and Flavobacteriatacea, and more specifically, Microorganisms belonging to the genus Bacterial (Chryseobacterium), Flavobacterium (Flavobacterium), Empedobacter (Empedobacter), Sphingobacterium (Sphingobacterium), Aureobacterium (Aureobacterium) and Myroides (Myroides) are listed.
  • bacteria classified as Cytophagales (Cytophagales), Actinomycetes, and Flavobacteriatacea and more specifically, Microorganisms belonging to the genus Bacterial (Chryseobacterium), Flavobacterium (Flavobacterium), Empedobacter (Empedobacter), Sphingobacterium (Sphingobacterium), Aureobacterium (Aureobacterium) and Myroides (Myroides) are listed.
  • a microorganism belonging to the genus Chryseobacterium (Chryseobacterium), more preferably a bacterium belonging to the genus Chryseobacterium (Chryseobacterium) No. 9670 (FERM). BP-7351).
  • the amino acid sequence of the protein deamidation enzyme in the present invention is not particularly limited as long as it acts on the amide group of the side chain in the protein and has an activity of cleaving the peptide bond and deamidation without crosslinking the protein.
  • a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (1-135 is a prepro sequence, and 136 to 320 is a mature sequence), represented by SEQ ID NO: 2 In the amino acid sequence (mature sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added
  • the amino acid sequence of the protein deamidation enzyme is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 70% or more, more preferably 90% or more. It may be an amino acid sequence having an identity of 95% or more.
  • identity means an optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably, the algorithm is one of the sequences for optimal alignment or It means the ratio (%) of identical amino acid residues to total overlapping amino acid residues in which the introduction of gaps in both can be considered.
  • the molecular weight of the protein deamidation enzyme (molecular weight by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) is, for example, about 18,000 to 22,000, preferably about 20,000.
  • the optimum pH of the protein deamidation enzyme is, for example, about 5 to 7, preferably about 5.5 to 6.5, and more preferably about 6.
  • the optimum pH is as follows: after preheating 100 ⁇ l of substrate solution (containing 10 mmol / l Z-Gln-Gly) [40 mmol / l Britton-Robinson buffer (pH 3 to 12)] at each pH for 5 minutes at 37 ° C.
  • the optimum temperature for the protein deamidation enzyme is, for example, 50 to 70 ° C., preferably 55 to 65 ° C., more preferably around 60 ° C.
  • the optimum temperature is 10 ⁇ l of an enzyme solution containing 1.21 ⁇ g of protein deamidation enzyme in 100 ⁇ l of a substrate solution (containing 10 mmol / l of Z-Gln-Gly) [176 mmol / l phosphate buffer (pH 6.5)]. Is obtained by reacting at each temperature for 60 minutes and measuring the enzyme activity.
  • the pH stability of the protein deamidation enzyme is, for example, 5-9.
  • the pH stability is determined by treating 22 ⁇ l [40 mmol / l Britton-Robinson buffer (pH 3 to 12)] containing 0.75 ⁇ g of protein deamidation enzyme at 30 ° C. for 18 hours, and then measuring the remaining enzyme activity You get it by doing.
  • As temperature stability of a protein deamidation enzyme 50 degrees C or less is mentioned. The said temperature stability measures the enzyme activity which remains after leaving 43 microliters [50 mmol / l phosphate buffer solution (pH 7.0)] containing 1.76 micrograms protein deamidation enzyme for 10 minutes at each temperature. You get it by doing.
  • the content of the protein deamidation enzyme in the protein deamidation enzyme dry composition (100% by weight) is not particularly limited, it is, for example, 0.1% by weight or more, preferably 0.2% by weight or more, more preferably 0.3. % By weight, more preferably 0.5% by weight, and for example, 20% by weight or less, preferably 10% by weight or less, more preferably 5.0% by weight or less, still more preferably 2.5% by weight or less It can be mentioned.
  • the protein deamidating enzyme dry composition of the present invention can include magnesium chloride. Magnesium chloride is used as a stabilizer for protein deamidation enzymes. By using magnesium chloride as a stabilizing agent, the protein deamidation enzyme dry composition of the present invention can be provided with excellent stability.
  • the content of magnesium chloride is not particularly limited, it is, for example, 1.0 to 10.0% by weight as a ratio to the total weight (100% by weight) of the protein deamidation enzyme dry composition from the viewpoint of obtaining the effect of improving stability preferably. Can be mentioned. From the viewpoint of obtaining the effect of improving the stability more preferably, the lower limit of the range of the ratio to the total weight of the protein deamidation enzyme dry composition described above is preferably 1.5% by weight or more, more preferably 2.0% by weight or more And more preferably 2.5% by weight or more, more preferably 3.0% by weight or more, still more preferably 3.5% by weight or more, particularly preferably 4.0% by weight or more.
  • the content of magnesium chloride is 1.0 to 9.0% by weight, 1.0 to 7.0% by weight, 1.0 to 6.5% by weight, 1.5 to 10.0 Wt%, 1.5 to 9.0 wt%, 1.5 to 7.0 wt%, 1.5 to 6.5 wt%, 2.0 to 10.0 wt%, 2.0 to 9.0 Wt%, 2.0-7.0 wt%, 2.0-6.5 wt%, 3.0-10.0 wt%, 3.0-9.0 wt%, 3.0-7.0 Wt%, 3.0-6.5 wt%, 3.5-10.0 wt%, 3.5-9.0 wt%, 3.5-7.0 wt%, 3.5-6.5 %
  • 4.0 to 9.0 wt%, 4.0 to 7.0 wt%, 4.0 to 6.5 wt% can be
  • the upper limit of the range of the ratio to the total weight of the protein deamidating enzyme dry composition described above is Preferably it is 5.5 weight% or less, More preferably, it is 5.0 weight% or less, More preferably, it is 4.5 weight% or less, More preferably, it is 4.0 weight% or less.
  • the specific content of magnesium chloride in the case of considering the powder characteristics of the protein deamidation enzyme dry composition in addition to the stability improving effect is 1.0 to 5.5 weight, 1.0 to 5. 0% by weight, 1.0 to 4.5% by weight, 1.0 to 4.0% by weight can be mentioned.
  • the content of magnesium chloride is, for example, 0.01 to 2.0 mg / u as the amount per activity of the protein deamidation enzyme from the viewpoint of preferably obtaining the effect of improving the stability.
  • the lower limit of the range of the amount per activity of the above-mentioned protein deamidation enzyme is 0.02 mg / u or more, preferably 0.03 mg / u or more, more preferably 0.04 mg / u or more, more preferably 0.05 mg / u or more, more preferably 0.06 mg / u or more, still more preferably 0.07 mg / u or more, particularly preferably 0.08 mg / u or more
  • a more preferable upper limit of the range of the amount per activity of the protein deamidation enzyme 1.0 mg / u or less, preferably 0.50 mg / u or less, more preferably 0.20 mg / u or less, still more preferably 0 .18 mg / u or less,
  • the specific range of the content of magnesium chloride is 0.01 to 1.0 mg / u, 0.01 to 0.50 mg / u, 0.01 to 0.20 mg / u, 0.01 to 0.18 mg / U, 0.01 to 0.14 mg / u, 0.01 to 0.13 mg / u, 0.02 to 2.0 mg / u, 0.02 to 1.0 mg / u, 0.02 to 0.50 mg / U, 0.02 to 0.20 mg / u, 0.02 to 0.18 mg / u, 0.02 to 0.14 mg / u, 0.02 to 0.13 mg / u, 0.03 to 2.0 mg / U, 0.03 to 1.0 mg / u, 0.03 to 0.50 mg / u, 0.03 to 0.20 mg / u, 0.03 to 0.18 mg / u, 0.03 to 0.14 mg / U, 0.03 to 0.13 mg / u, 0.04 to 2.0 mg / u, 0.04 to 1.0 mg / u, 0.04 to 2.0 mg /
  • the amount per protein deamidating enzyme activity is, for example, 0.02 to 0.12 mg / u can be mentioned.
  • the protein deamidating enzyme dry composition As a preferable upper limit of the range of the amount per protein deamidating enzyme activity described above, 0.12 mg / u or less, preferably 0.11 mg / u or less, more preferably 0.10 mg / u or less, further preferably 0.09 mg / u or less, more preferably 0.08 mg / u or less.
  • the specific oil content of magnesium chloride in consideration of the powder characteristics of the protein deamidating enzyme dry composition in addition to the stability improving effect is 0.02 to 0.11 mg / u, 0.02 to 0. And 10 mg / u, 0.02 to 0.09 mg / u, and 0.02 to 0.08 mg / u.
  • the protein deamidation enzyme dry composition of the present invention may further contain calcium chloride.
  • Calcium chloride can be used as a powder property improver and / or as a stabilizing aid.
  • the protein deamidation enzyme dry composition of the present invention can be provided with better powder properties (eg, inhibition of caking and / or deliquescence).
  • the content of calcium chloride is not particularly limited, but it is, for example, 1.0% by weight or more as a ratio to the total weight of the protein deamidation enzyme dry composition from the viewpoint of preferably improving the powder characteristics of the protein deamidation enzyme dry composition.
  • the content is preferably 2.0% by weight or more, more preferably 2.5% by weight or more, and for example, 10.0% by weight or less, preferably 8.0% by weight or less, more preferably 6.5% by weight or less
  • it is 6.0 weight% or less, More preferably, 5.5 weight% or less is mentioned.
  • the range of the content of calcium chloride is 1.0 to 10.0% by weight, 1.0 to 8.0% by weight, 1.0 to 6.5% by weight, and 1.0 to 6.0.
  • Wt% 1.0 to 5.5 wt%, 2.0 to 10.0 wt%, 2.0 to 8.0 wt%, 2.0 to 6.5 wt%, 2.0 to 6.0 Wt%, 2.0 to 5.5 wt%, 2.5 to 10.0 wt%, 2.5 to 8.0 wt%, 2.5 to 6.5 wt%, 2.5 to 6.0 % By weight, 2.5 to 5.5% by weight.
  • the amount relative to 100 parts by weight of total of magnesium chloride and calcium chloride is, for example, 15 parts by weight or more, preferably 30 parts by weight or more, more preferably 35 parts by weight or more can be mentioned, for example, 95 parts by weight or less, preferably 90 parts by weight or less, more preferably 85 parts by weight or less, still more preferably 70 parts by weight or less, more preferably 65 parts by weight or less.
  • the specific range of the amount based on 100 parts by weight of total of magnesium chloride and calcium chloride is 15 to 95 parts by weight, 15 to 90 parts by weight, 15 to 85 parts by weight, 15 to 70 parts by weight, 15 to 65 parts by weight 30 to 95 parts by weight, 30 to 90 parts by weight, 30 to 85 parts by weight, 30 to 70 parts by weight, 30 to 65 parts by weight, 35 to 95 parts by weight, 35 to 90 parts by weight, 35 to 85 parts by weight, 35 There are 70 to 70 parts by weight and 35 to 65 parts by weight.
  • the protein deamidation enzyme dry composition of the present invention may contain other components in addition to the components described above.
  • Other ingredients include, for example, dextrin, resistant digestible dextrin, starch, potato starch, corn starch, sucrose, sugar excipients such as mannitol, sorbitol, lactose, trehalose and the like; salts such as sodium chloride and calcium chloride; Antiseptics such as benzoate esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, etc .; antioxidants; various proteins such as milk proteins, soy proteins, wheat proteins (except for protein deamidating enzymes); peptides; amino acids; lactic acid bacteria; The above salts may be excluded); oils and fats; various extracts (meat extract, yeast extract etc.); nucleic acid etc.
  • the protein deamidation enzyme dry composition of the present invention is a stabilized protein deamidation enzyme dry composition containing a protein deamidation enzyme and magnesium chloride
  • the concentration of the protein deamidation dry composition is 1 w / v%.
  • the pH when dissolved in water is not particularly limited, and, for example, 2 or more can be mentioned, 8 or less can be mentioned, and a specific range is 2 to 8 is mentioned.
  • the pH when dissolved in water is preferably 4 or more, and preferably 8 or less. As a specific range, 4 to 8 can be mentioned.
  • the protein deamidation enzyme dry composition of the present invention is a stabilized protein deamidation enzyme dry composition having a pH of 2 or more and less than 5 when dissolved in water at a predetermined concentration
  • the protein deamidation dry composition may be
  • the pH when dissolved in water to a concentration of 1 w / v% (pH at 25 ° C., the same applies below) is at least 2 from the viewpoint of obtaining the effect of improving the stability of the protein deamidation enzyme dry composition It is less than 5.
  • the upper limit of the pH range is preferably 4 or less, more preferably 3 or less.
  • 2 to 4 (2 or more and 4 or less) and 2 to 3 can be mentioned.
  • the protein deamidation enzyme composition in the liquid state is stable at pH 5 to 9, but the protein deamidation enzyme composition of the present invention has a pH of 2 or more and less than 5 when it is in a dry state and dissolved in water.
  • the stability of the protein deamidation enzyme can be improved as compared to the case where the pH is 5 to 9 when dissolved in water.
  • the protein deamidation enzyme dry composition of the present invention which has a pH of 2 or more and less than 5 when dissolved in water, can obtain the effect of improving the stability of the protein deamidation enzyme without containing the above-mentioned magnesium chloride. it can.
  • the form of the protein deamidation enzyme dry composition of the present invention is not particularly limited as long as it is in a dry state, and examples thereof include powder, granules, and the like, with preference given to powder.
  • the protein deamidation enzyme dry composition of the present invention may be in the form of a spray-dried product, a lyophilizate, a vacuum-dried product or the like, preferably a spray-dried product or a lyophilizate.
  • the protein deamidation enzyme drying composition includes a step of preparing a protein deamidation enzyme, a step of preparing an enzyme solution containing a protein deamidation enzyme, and a step of drying the enzyme solution.
  • a protein deamidation enzyme can be appropriately produced by a person skilled in the art from known organisms described in the above-mentioned “1-1.
  • Protein deamidation enzyme by a known culture method.
  • culture methods such as a solid culture method and a liquid culture method may be mentioned, and preferably a liquid culture method is used.
  • the medium is not particularly limited as long as the used microorganism can grow.
  • any medium can be used as long as it is a medium in which a microorganism that produces a protein deamidation enzyme can grow and that can produce a protein deamidation enzyme.
  • carbon sources such as glucose, sucrose, glycerin, dextrin, molasses and organic acids, and further ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium phosphate, ammonium acetate or peptone, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolysate, meat
  • a nitrogen source such as an extract
  • an inorganic salt such as potassium salt, magnesium salt, sodium salt, phosphate, manganese salt, iron salt, zinc salt and the like.
  • the pH of the medium is adjusted to, for example, about 3 to 9, preferably about 5.0 to 8.0, and the culture temperature is usually about 10 to 50 ° C., preferably about 20 to 37 ° C., for 12 hours to 20 days Culturing is preferably carried out under aerobic conditions for about 1 to 7 days.
  • a culture method for example, a shake culture method or an aerobic submerged culture method using a jar fermenter can be used.
  • the protein deamidation enzyme can be isolated from the resulting culture solution by a conventional means to obtain the protein deamidation enzyme of the present invention.
  • a commercially available protein deamidation enzyme for example, Protein-glutaminase “Amano” 500 provided by Amano Enzyme Co., Ltd.
  • a commercially available protein deamidation enzyme for example, Protein-glutaminase “Amano” 500 provided by Amano Enzyme Co., Ltd.
  • Mano Protein-glutaminase “Amano” 500 provided by Amano Enzyme Co., Ltd.
  • the protein deamidating enzyme is magnesium chloride and, if necessary, calcium chloride And an enzyme solution containing a component selected from the group consisting of the other components described above.
  • magnesium chloride is, for example, 1.0 to 10.0% by weight based on the total weight of the material (in terms of dry weight) or, for example, 0 as an amount per activity of protein deamidation enzyme .01 to 2.0 mg / u can be included. More specifically, it can be contained in the amount described in the above-mentioned "1-2.
  • the pH of the enzyme solution is not particularly limited, and may be, for example, 2 or more, and 8 or less. Furthermore, from the viewpoint of more effectively achieving the stability improvement effect of magnesium chloride as compared to the case where magnesium chloride is not contained, the pH of the enzyme solution is preferably adjusted to 4 or more, and is preferably adjusted to 8 or less. More specifically, the pH described in “1-5. PH when dissolved in water” is mentioned.
  • calcium chloride is included, calcium chloride is, for example, 1.0% by weight or more, 10.0% by weight or less, or 100% by weight in total of magnesium chloride and calcium chloride as a ratio to the total dry weight of the material. It can be contained in an amount of 15 parts by weight or more and 85 parts by weight or less with respect to parts. More specifically, it can be contained in the amount described in the above-mentioned "1-2. Calcium chloride".
  • the pH of the enzyme solution is 2 or more and 5 or more in the case of producing a stabilized protein deamidating enzyme dry composition having a pH of 2 or more and less than 5 when dissolved in water at a predetermined concentration. From the viewpoint of obtaining the stability improving effect preferably in the protein deamidation enzyme dry composition, it can be adjusted to less than 2, preferably to 2 to 4, and more preferably to 2 to 3.
  • Step of drying enzyme solution In the step of drying the enzyme solution, the enzyme solution obtained in the above step is dried. Examples of the drying method include lyophilization, vacuum drying, spray drying and the like. This gives a protein deamidating enzyme dry composition.
  • the protein deamidation enzyme dry composition of the present invention can directly deamidate an amide group in a protein by acting on various proteins.
  • the resulting deamidated protein results in a decrease in pI, an increase in hydration power and an increase in electrostatic repulsion as the negative charge increases.
  • changes in the conformation of proteins lead to an increase in surface hydrophobicity.
  • the protein deamidation enzyme dry composition of the present invention can be widely used in the food field.
  • applications that improve the solubility, dispersibility, emulsifiability, etc. of vegetable protein in a weakly acidic environment which is the pH range of ordinary foods (eg, acidic beverages such as coffee and whitener, juice, dressing, Mayonnaise, production of cream); Solubility of plant poorly soluble protein, increase of dispersibility (for example, production of tempura flour using wheat gluten), application for modification of dough in baking and confectionery (for example, , Crackers, biscuits, cookies, pizza or pie crusts); removal or reduction of allergens in food allergens (eg, food manufacture for wheat allergy patients); protein mineral sensitivity Reduce soluble salts, increase soluble mineral content in fluids containing proteins and minerals, and absorb minerals into the human body Applications (eg, high mineral (eg, calcium) content beverages, applications to manufacture mineral (eg, calcium) absorption enhancers); applications that reduce bitterness, applications that improve the rate of protein degradation of prote
  • the invention also provides a method of improving the stability of a protein deamidation enzyme in a dry enzyme composition comprising a protein deamidation enzyme.
  • the method of improving stability according to the present invention is characterized in that magnesium chloride is made to coexist with a protein deamidation enzyme in a dry enzyme composition.
  • the pH of the dry enzyme composition containing protein deamidation enzyme is adjusted to 2 or more and less than 5 when dissolved in water so as to be 1 w / v%. (Specifically, it can be carried out by adjusting the pH of the enzyme solution to 2 or more and less than 5 as described in the step of preparing the enzyme solution in the method for producing a protein deamidation enzyme dry composition described above. ) Is characterized.
  • the stability can be measured, for example, by the residual activity after storage under predetermined conditions, as described in the examples below.
  • the stability of the stabilized protein deamidation enzyme drying composition is not particularly limited as long as it is improved stability as compared to the case where the method for improving stability is not carried out, but for example, the remaining activity after storage for 1 month at 40.degree. % Or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 75% or more, and still more preferably 80% or more.
  • the case where the method for improving the stability is not carried out means a protein deamidating enzyme dry composition which does not allow magnesium chloride to be present in the embodiment characterized by coexistence of magnesium chloride with the protein deamidating enzyme.
  • the pH of the dry enzyme composition is adjusted to 5 or more in an embodiment characterized in that the pH is adjusted to 2 or more and less than 5 when dissolved in water so as to be 1 w / v%. It refers to a protein deamidation enzyme dry composition prepared as above.
  • the types and contents of the components used, pH when dissolved in water, methods for producing a dried enzyme composition, forms and the like can be referred to the above-mentioned "1. It is as having described in the column of "the dry composition.”
  • Protein deamidation enzyme preparation “Protein-glutaminase“ Amano ”500” (derived from Chryseobacterium) was used as a protein deamidation enzyme.
  • "Protein-glutaminase” Amano "500” is an enzyme preparation which contains dextrin in addition to a protein deamidation enzyme and which is adjusted to have an activity of 500 u / g.
  • the protein deamidation enzyme may be obtained by the following method. Chryseobacterium sp. No. 9670 (Chryseobacterium sp. No.
  • 9670 is shake-cultured in LB Base medium (Gibco) according to the method described in Patent Document 2 at 25 ° C. for 2 to 7 days, and then Obtain the centrifugation supernatant. After completion of the culture, the culture solution is centrifuged (12000 rpm, 4 ° C., 20 minutes) to obtain a supernatant as a crude enzyme solution, followed by ultrafiltration (UF) concentration (SEP-0013), salting out, phenyl sepharose, sephacryl S Treat with -100 to purify the enzyme.
  • UF ultrafiltration
  • protein deamidation enzyme activity in a composition containing protein deamidation enzyme was measured as follows.
  • the substrate Z-Gln-Gly represents N-benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine. 1. 0.2 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 1.
  • an enzyme solution not containing magnesium chloride (without addition) and an enzyme solution in which magnesium chloride is replaced with cysteine or calcium chloride are similarly shown in Table 1 (protein deamidation enzyme and protein containing dextrin) Deamidation enzyme preparation, and weight ratio to protein deamidation enzyme preparation, dextrin and protein deamidation enzyme preparation containing cysteine or calcium chloride, and weight per protein deamidation enzyme activity) .
  • These enzyme solutions were adjusted to pH 6.0 (25 ° C.) using 1 M hydrochloric acid and 1 M sodium hydroxide.
  • the enzyme solution (after pH adjustment) was powdered with a spray dryer (EYELA SPRAY DRYER SD-1000) to obtain a protein deamidation enzyme dry composition as a spray-dried product.
  • a spray dryer EYELA SPRAY DRYER SD-1000
  • Example 2 Verification of Stabilizing Effect by Magnesium Chloride-2
  • Preparation of a protein deamidating enzyme dry composition A protein deamidating enzyme dry composition as a spray-dried product in the same manner as in Test Example 1 except that the weight ratio of magnesium chloride was 2.5% by weight.
  • Example 2 was prepared and subjected to the following stability evaluation test.
  • the additive-free protein deamidation enzyme dry composition (Comparative Example 1) obtained in Test Example 1
  • the protein deamidation enzyme dry composition Example 1 in which the weight ratio is 6.5% by weight Were also subjected to the following stability evaluation test.
  • Example 2 No added protein deamidation enzyme dry composition (Comparative Example 1) and protein deamidation enzyme dry composition (Examples 2 and 1) in which the weight proportions are 2.5% by weight and 6.5% by weight, respectively.
  • Table 2 shows the results of the stability evaluation for. As shown in Table 2, in any of the examples, the stabilizing effect of the protein deamidation enzyme dry composition was confirmed. Thus, it was confirmed that magnesium chloride exerts an excellent stabilizing effect on the protein deamidation enzyme dry composition.
  • An enzyme solution was obtained by dissolving so as to be the weight of the protein deamidation enzyme preparation per protein deamidation enzyme activity.
  • the enzyme solution was adjusted to pH 6 (25 ° C.) using 1 M hydrochloric acid and 1 M sodium hydroxide.
  • the enzyme solution (after pH adjustment) was powdered with a spray dryer (EYELA SPRAY DRYER SD-1000) to obtain a protein deamidation enzyme dry composition as a spray-dried product.
  • a spray dryer EYELA SPRAY DRYER SD-1000
  • the enzyme solution (after pH adjustment) was powdered with a spray dryer (EYELA SPRAY DRYER SD-1000) to obtain a protein deamidation enzyme dry composition as a spray-dried product.
  • the resulting protein deamidating enzyme dry composition (obtained from each of the enzyme solutions of pH 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8) is redissolved in water so as to be 1 w / v% again.
  • the pH after re-dissolution 25.degree. C. was 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8, respectively.
  • the protein deamidating enzyme dry composition containing neither magnesium chloride nor calcium chloride
  • the protein deamidating enzyme dry composition having a pH of 2 to 4 in the enzyme solution has a pH of the enzyme solution.
  • High stability was confirmed as compared with the protein deamidating enzyme dry composition (comparative examples 4 to 7) in which is 5 to 8.
  • the protein deamidating enzyme dry composition having a pH of 2 to 3 in the enzyme solution was remarkably high in stability.
  • the protein deamidating enzyme dry composition (Examples 9 to 15) containing magnesium chloride and calcium chloride
  • the protein deamidating enzyme dry composition containing no additive was compared in any case with the pH of the same enzyme solution.
  • the stability was improved compared to the products (Examples 6 to 8 and Comparative Examples 4 to 7).
  • the degree of improvement in stability as compared to the non-added protein deamidating enzyme dry composition was particularly remarkable when the pH was 4 to 8.

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Abstract

乾燥酵素組成物の組成上の工夫により蛋白質脱アミド酵素組成物の安定性を向上させる技術を提供する。乾燥酵素組成物において、蛋白質脱アミド酵素ともに、塩化マグネシウムを共存させること、又は、１ｗ／ｖ％の濃度で水に溶解させた時のｐＨが２以上５未満となるように調整することによって、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の安定性を向上させることができる。

Description

安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物
　本発明は、安定化された蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物に関する。
　蛋白質脱アミド酵素はＥＣ番号としてEC 3.5.1.44が割り当てられている酵素であり、蛋白質中のグルタミン、アスパラギンのアミド基を加水分解し、グルタミン酸、アスパラギン酸に変換しアンモニアを遊離する。蛋白質脱アミド酵素は、蛋白質の機能性（溶解性、乳化特性、泡末特性、ゲル化特性など）の向上、小麦グルテンのドウの伸展性の向上、小麦アレルゲン誘発性の低下、農産物からの蛋白質抽出効率の向上、蛋白質溶液中でのカルシウム溶解性の向上など様々な用途に適用可能であり、産業上の利用性の高い酵素である。
　蛋白質脱アミド酵素は自然界に広く存在する。最も良く知られたものとしては、特許文献１、２に記載された微生物由来のプロテイングルタミナーゼが挙げられる。非特許文献１では、発芽中の小麦、インゲン豆、カボチャの種子から、蛋白質中のグルタミン残基を脱アミドする酵素の存在が報告されている。また、非特許文献２では、細菌（Bacillus circulans）の菌体内に、ペプチド中のグルタミン残基を脱アミド化する酵素であるペプチドグルタミナーゼの存在が報告されている。さらに、非特許文献２では、蛋白質脱アミド酵素溶液のｐＨ安定性がｐＨ５から９までであることが記載されている。
　なお、アミド基に作用する酵素として蛋白質脱アミド酵素よりも古くから知られている酵素として、トランスグルタミナーゼが挙げられる。トランスグルタミナーゼは、ＥＣ番号としてEC 2.3.2.13が割り当てられているアシル転移酵素であり、蛋白質脱アミド酵素は、構造および特性等の点でトランスグルタミナーゼとは全く異なる酵素として知られている。
　酵素を産業用酵素剤として利用する場合には保存安定性が重要となる。十分な保存安定性を維持するための手段としては、変異による酵素自身の性質の改質、及び安定化剤の添加などが挙げられる。
　例えば特許文献３には、安定性改良のため蛋白質脱アミド酵素に特定の変異を導入する、変異型蛋白質脱アミド酵素の設計について記載されている。
特開２０００－５０８８７号公報 特開２００１－２１８５９０号公報 国際公開第２０１０／０２９６８５号
Vaintraub, I.A., Kotova, L.V. & Shaha, R. (1996) Protein deamidases from germinating seeds. Physiol. Plantarum. 96, 662-666. Kikuchi, M., Hayashida, H., Nakano, E. & Sakaguchi K. (1971) Peptidoglutaminase. Enzymes for selective deamidation of γ-amido of peptide-bound glutamine. Biochemistry 10, 1222-1229.
　蛋白質脱アミド酵素については、特許文献３のように酵素自身に変異を導入することにより安定性を改良することが知られている。しかしながら、酵素組成物の組成上の工夫により蛋白質脱アミド酵素の安定性を改良する方法は知られていない。
　そこで、本発明の目的は、酵素組成物の組成上の工夫により蛋白質脱アミド酵素組成物の安定性を向上させる技術を提供することにある。
　本発明者は、酵素組成物において蛋白質脱アミド酵素に対して安定性を向上させる安定剤について検討したところ、蛋白質アミド酵素独自の安定性向上に、蛋白質脱アミド酵素を乾燥組成物とし且つ塩化マグネシウムを配合すること、又は、蛋白質脱アミド酵素を乾燥組成物とし且つ溶解時のｐＨが５未満となるように調製することが有効であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
　本発明は以下の発明を含む。
項１．　蛋白質脱アミド酵素と、塩化マグネシウムとを含む、安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
項２．　前記塩化マグネシウムの含有量が１．０～１０．０重量％である、項１に記載の安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
項３．　前記塩化マグネシウムの含有量が１．０～６．０重量％である、項１に記載の安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
項４．　前記塩化マグネシウムの含有量が０．０１～２．０ｍｇ／ｕである、項１に記載の安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
項５．　蛋白質脱アミド酵素を含む乾燥酵素組成物において、前記蛋白質脱アミド酵素の安定性を向上させる安定性向上方法であって、
　乾燥酵素組成物において、前記蛋白質脱アミド酵素ともに、塩化マグネシウムを共存させる、安定性向上方法。
項６．　１ｗ／ｖ％となるように水に溶解させた場合のｐＨが２以上５未満である、安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
項７．　蛋白質脱アミド酵素を含む乾燥酵素組成物において、前記蛋白質脱アミド酵素の安定性を向上させる安定性向上方法であって、
　乾燥酵素組成物を１ｗ／ｖ％となるように水に溶解させた場合のｐＨが２以上５未満となるように調整する、安定性向上方法。
項８．　ｐＨ２以上５未満である蛋白質脱アミド酵素を含む酵素液を用意する工程と、前記酵素液を乾燥させる工程とを含む、安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の製造方法。
　本発明によれば、乾燥酵素組成物の組成上の工夫により蛋白質脱アミド酵素組成物の安定性を向上させる技術が提供される。
［１．蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物］
　本発明は、蛋白質脱アミド酵素と塩化マグネシウムとを含む、安定化された蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物と、所定濃度で水に溶解させた場合のｐＨが２以上５未満である、安定化された蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物と、を提供する。なお、所定濃度で水に溶解させた場合のｐＨが２以上５未満である安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物においては、塩化マグネシウムを含んでもよいし、含まなくてもよい。
［１－１．蛋白質脱アミド酵素］
　本発明における蛋白質脱アミド酵素は、プロテイングルタミナーゼとも称され、蛋白質の側鎖のアミド基に作用して、側鎖カルボキシル基とアンモニアとに加水分解する酵素である。至適温度は例えば６０℃付近、至適ｐＨは例えばｐＨ６付近である。蛋白質脱アミド酵素が作用する側鎖のアミド基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン残基及びグルタミン残基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、蛋白質脱アミド酵素の基質である蛋白質には、分子量５０００以上、好ましくは１０，０００～２，０００，０００の蛋白質が挙げられるが、分子量が５０００未満のポリペプチド（ジペプチドを含む）も含む。さらに、蛋白質脱アミド酵素の基質である蛋白質の形態としては、アミノ酸残基のみで構成される蛋白質単体の形態であってもよいし、糖、脂質等と複合した複合蛋白質の形態であってもよい。
　なお、本発明における蛋白質アミド酵素は、蛋白質の側鎖のアミド基に作用するものであっても、トランスグルタミナーゼ活性は有さない。トランスグルタミナーゼ活性は、トランスグルタミナーゼに見られるように、蛋白質のグルタミン残基とリジン残基の間でのイソペプチド形成を触媒する活性である。また、本発明における蛋白質脱アミド酵素は、プロテアーゼ活性も有さない。プロテアーゼ活性は、種々のプロテーゼに見られるように、蛋白質のペプチド結合を加水分解する活性である。
　本発明における蛋白質脱アミド酵素の由来となる生物は、蛋白質中の側鎖のアミド基に作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする活性を有する酵素を産生可能である限り特に限定されない。蛋白質脱アミド酵素の由来となる生物としては、例えば、シトファガレス（Cytophagales）、アクチノマイセテス（Actinomycetes）、及びフラボバクテリアチェ（Flavobacteriaceae）に分類される細菌が挙げられ、より具体的には、クリセオバクテリウム（Chryseobacterium）属、フラボバクテリウム（Flavobacteium）属、エンペドバクター（Empedobacter）属、スフインゴバクチリウム（Sphingobacterium）属、アウレオバクテリウム（Aureobacterium）属及びミロイデス（Myroides）属に属する微生物が挙げられ、好ましくはクリセオバクテリウム（Chryseobacterium）属に属する微生物が挙げられ、より好ましくはクリセオバクテリウム（Chryseobacterium）属に属する新菌クリセオバクテリウム・エスピー（Chryseobacterium sp.）No. 9670（ＦＥＲＭ  ＢＰ－７３５１）が挙げられる。
　本発明における蛋白質脱アミド酵素のアミノ酸配列は、蛋白質中の側鎖のアミド基に作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする活性を有する限り特に限定されない。安定性向上効果をより好ましく得る観点から、好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列（1-135はプレプロ配列、136～320は成熟体配列）を有するタンパク質、配列番号２で表されるアミノ酸配列（配列番号１で表されるアミノ酸配列の成熟体配列）及び、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、蛋白質中の側鎖のアミド基に作用し、ペプチド結合の切断及び蛋白質の架橋を伴わず脱アミドする活性を有するタンパク質が挙げられ、より好ましくは、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、当該活性を有する限り、蛋白質脱アミド酵素のアミノ酸配列は、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってよい。なお、同一性とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する、同一アミノ酸残基の割合（％）を意味する。
　蛋白質脱アミド酵素の分子量（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量）としては、例えば１８,０００～２２，０００、好ましくは２０，０００程度が挙げられる。蛋白質脱アミド酵素の至適ｐＨとしては、例えば５～７、好ましくは５．５～６．５、より好ましくは６程度が挙げられる。当該至適ｐＨは、基質溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌのＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む）１００μｌ［４０ｍｍｏｌ／ｌブリットン－ロビンソン緩衝液（ｐＨ３～１２）］を各ｐＨで３７℃で５分間予熱後、０．３２μｇの蛋白質脱アミド酵素を含む酵素液１０μｌを加え、３７℃で６０分間反応し、酵素活性を測定することによって得る。蛋白質脱アミド酵素の至適温度としては、例えば５０～７０℃、好ましくは５５～６５℃、より好ましくは６０℃付近が挙げられる。当該至適温度は、基質溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌのＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む）１００μｌ［１７６ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）］に１．２１μｇの蛋白質脱アミド酵素を含む酵素溶液１０μｌを添加して、各温度で６０分間反応し、酵素活性を測定することによって得る。蛋白質脱アミド酵素のｐＨ安定性としては、例えば５～９が挙げられる。当該ｐＨ安定性は、０．７５μｇの蛋白質脱アミド酵素を含む酵素溶液２２μｌ［４０ｍｍｏｌ／ｌブリットン－ロビンソン緩衝液（ｐＨ３～１２）］を３０℃で１８時間処理し、その後残存する酵素活性を測定することによって得る。蛋白質脱アミド酵素の温度安定性としては、５０℃以下が挙げられる。当該温度安定性は、１．７６μｇの蛋白質脱アミド酵素を含む酵素溶液４３μｌ［５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）］を１０分間、各温度で放置した後、残存する酵素活性を測定することによって得る。
　蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物（１００重量％）中の蛋白質脱アミド酵素の含有量は特に限定されないが、例えば０．１重量％以上、好ましくは０．２重量％以上、より好ましくは０．３重量％以上、さらに好ましくは０．５重量％以上が挙げられ、例えば２０重量％以下、好ましくは１０重量％以下、より好ましくは５．０重量％以下、更に好ましくは２．５重量％以下が挙げられる。
［１－２．塩化マグネシウム］
　本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物には塩化マグネシウムを含むことができる。塩化マグネシウムは、蛋白質脱アミド酵素の安定化剤として用いられる。塩化マグネシウムを安定化剤として用いることにより、本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物は優れた安定性を備えることができる。
　塩化マグネシウムの含有量は特に限定されないが、安定性向上効果を好ましく得る観点から、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物全体の重量（１００重量％）に対する割合として、例えば１．０～１０．０重量％が挙げられる。安定性向上効果をより好ましく得る観点から、上述の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物全体の重量に対する割合の範囲の下限としては、好ましくは１．５重量％以上、より好ましくは２．０重量％以上、更に好ましくは２．５重量％以上、一層好ましくは３．０重量％以上、より一層好ましくは３．５重量％以上、特に好ましくは４．０重量％以上が挙げられ、当該割合の範囲の上限としては、好ましくは９．０重量％以下、より好ましくは７．０重量％以下、更に好ましくは６．５重量％以下が挙げられる。具体的な塩化マグネシウムの含有量の範囲としては、１．０～９．０重量％、１．０～７．０重量％、１．０～６．５重量％、１．５～１０．０重量％、１．５～９．０重量％、１．５～７．０重量％、１．５～６．５重量％、２．０～１０．０重量％、２．０～９．０重量％、２．０～７．０重量％、２．０～６．５重量％、３．０～１０．０重量％、３．０～９．０重量％、３．０～７．０重量％、３．０～６．５重量％、３．５～１０．０重量％、３．５～９．０重量％、３．５～７．０重量％、３．５～６．５重量％、４．０～１０．０重量％。４．０～９．０重量％、４．０～７．０重量％、４．０～６．５重量％が挙げられる。
　さらに、安定性向上効果に加え、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の粉末特性（例えば固結及び／又は潮解に対する抑制性）を良好に得る観点から、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物全体の重量に対する割合として、例えば１．０～６．０重量％が挙げられる。蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の粉末特性（例えば固結及び／又は潮解に対する抑制性）をより良好に得る観点から、上述の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物全体の重量に対する割合の範囲の上限としては、好ましくは５．５重量％以下、より好ましくは５．０重量％以下、さらに好ましくは４．５重量％以下、一層好ましくは４．０重量％以下が挙げられる。安定性向上効果に加えて蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の粉末特性を考慮した場合の具体的な塩化マグネシウムの含有量の範囲としては、１．０～５．５重量、１．０～５．０重量％、１．０～４．５重量％、１．０～４．０重量％が挙げられる。
　さらに、塩化マグネシウムの含有量は、安定性向上効果を好ましく得る観点から、蛋白質脱アミド酵素の活性当たりの量として、例えば０．０１～２．０ｍｇ／ｕが挙げられる。安定性向上効果をより好ましく得る観点から、上述の蛋白質脱アミド酵素の活性当たりの量の範囲のより好ましい下限としては、０．０２ｍｇ／ｕ以上、好ましくは０．０３ｍｇ／ｕ以上、より好ましくは０．０４ｍｇ／ｕ以上、更に好ましくは０．０５ｍｇ／ｕ以上、一層好ましくは０．０６ｍｇ／ｕ以上、より一層好ましくは０．０７ｍｇ／ｕ以上、特に好ましくは０．０８ｍｇ／ｕ以上が挙げられ、当該蛋白質脱アミド酵素の活性当たりの量の範囲のより好ましい上限としては、１．０ｍｇ／ｕ以下、好ましくは０．５０ｍｇ／ｕ以下、より好ましくは０．２０ｍｇ／ｕ以下、更に好ましくは０．１８ｍｇ／ｕ以下、一層好ましくは０．１４ｍｇ／ｕ以下、特に好ましくは０．１３ｍｇ／ｕ以下が挙げられる。具体的な塩化マグネシウムの含有量の範囲としては、０．０１～１．０ｍｇ／ｕ、０．０１～０．５０ｍｇ／ｕ、０．０１～０．２０ｍｇ／ｕ、０．０１～０．１８ｍｇ／ｕ、０．０１～０．１４ｍｇ／ｕ、０．０１～０．１３ｍｇ／ｕ、０．０２～２．０ｍｇ／ｕ、０．０２～１．０ｍｇ／ｕ、０．０２～０．５０ｍｇ／ｕ、０．０２～０．２０ｍｇ／ｕ、０．０２～０．１８ｍｇ／ｕ、０．０２～０．１４ｍｇ／ｕ、０．０２～０．１３ｍｇ／ｕ、０．０３～２．０ｍｇ／ｕ、０．０３～１．０ｍｇ／ｕ、０．０３～０．５０ｍｇ／ｕ、０．０３～０．２０ｍｇ／ｕ、０．０３～０．１８ｍｇ／ｕ、０．０３～０．１４ｍｇ／ｕ、０．０３～０．１３ｍｇ／ｕ、０．０４～２．０ｍｇ／ｕ、０．０４～１．０ｍｇ／ｕ、０．０４～０．５０ｍｇ／ｕ、０．０４～０．２０ｍｇ／ｕ、０．０４～０．１８ｍｇ／ｕ、０．０４～０．１４ｍｇ／ｕ、０．０４～０．１３ｍｇ／ｕ、０．０５～２．０ｍｇ／ｕ、０．０５～１．０ｍｇ／ｕ、０．０５～０．５０ｍｇ／ｕ、０．０５～０．２０ｍｇ／ｕ、０．０５～０．１８ｍｇ／ｕ、０．０５～０．１４ｍｇ／ｕ、０．０５～０．１３ｍｇ／ｕ、０．０６～２．０ｍｇ／ｕ、０．０６～１．０ｍｇ／ｕ、０．０６～０．５０ｍｇ／ｕ、０．０６～０．２０ｍｇ／ｕ、０．０６～０．１８ｍｇ／ｕ、０．０６～０．１４ｍｇ／ｕ、０．０６～０．１３ｍｇ／ｕ、０．０７～２．０ｍｇ／ｕ、０．０７～０．２０ｍｇ／ｕ、０．０７～１．０ｍｇ／ｕ、０．０７～０．５０ｍｇ／ｕ、０．０７～０．１８ｍｇ／ｕ、０．０７～０．１４ｍｇ／ｕ、０．０７～０．１３ｍｇ／ｕ、０．０８～２．０ｍｇ／ｕ、０．０８～１．０ｍｇ／ｕ、０．０８～０．５０ｍｇ／ｕ、０．０８～０．２０ｍｇ／ｕ、０．０８～０．１８ｍｇ／ｕ、０．０８～０．１４ｍｇ／ｕ、０．０８～０．１３ｍｇ／ｕが挙げられる。
　さらに、安定性向上効果に加え、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の粉末特性（例えば固結及び／又は潮解に対する抑制性）を良好に得る観点から、蛋白質脱アミド酵素の活性当たりの量として、例えば０．０２～０．１２ｍｇ／ｕが挙げられる。蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の粉末特性（例えば固結及び／又は潮解に対する抑制性）をより良好に得る観点から、上述の蛋白質脱アミド酵素の活性当たりの量の範囲のより好ましい上限としては、０．１２ｍｇ／ｕ以下、好ましくは０．１１ｍｇ／ｕ以下、より好ましくは０．１０ｍｇ／ｕ以下、さらに好ましくは０．０９ｍｇ／ｕ以下、一層好ましくは０．０８ｍｇ／ｕ以下が挙げられる。安定性向上効果に加えて蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の粉末特性を考慮した場合の具体的な塩化マグネシウムの含油量の範囲としては、０．０２～０．１１ｍｇ／ｕ、０．０２～０．１０ｍｇ／ｕ、０．０２～０．０９ｍｇ／ｕ、０．０２～０．０８ｍｇ／ｕが挙げられる。
［１－３．塩化カルシウム］
　本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物には、塩化カルシウムがさらに含まれていてもよい。塩化カルシウムは、粉末特性向上剤及び／又は安定化助剤として用いることができる。塩化カルシウムを塩化マグネシウムと併用することによって、本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物は、より優れた粉末特性（例えば固結及び／又は潮解に対する抑制性）を備えることができる。
　塩化カルシウムの含有量は特に限定されないが、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の粉末特性を好ましく向上させる観点から、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物全体の重量に対する割合として、例えば１．０重量％以上、好ましくは２．０重量％以上、より好ましくは２．５重量％以上が挙げられ、例えば１０．０重量％以下、好ましくは８．０重量％以下、より好ましくは６．５重量％以下、さらに好ましくは６．０重量％以下、一層好ましくは５．５重量％以下が挙げられる。具体的な塩化カルシウムの含有量の範囲としては、１．０～１０．０重量％、１．０～８．０重量％、１．０～６．５重量％、１．０～６．０重量％、１．０～５．５重量％、２．０～１０．０重量％、２．０～８．０重量％、２．０～６．５重量％、２．０～６．０重量％、２．０～５．５重量％、２．５～１０．０重量％、２．５～８．０重量％、２．５～６．５重量％、２．５～６．０重量％、２．５～５．５重量％が挙げられる。
　また、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の粉末特性を好ましく向上させる観点から、塩化マグネシウムと塩化カルシウムとの総量１００重量部に対する量として、例えば１５重量部以上、好ましくは３０重量部以上、より好ましくは３５重量部以上が挙げられ、例えば９５重量部以下、好ましくは９０重量部以下、より好ましくは８５重量部以下、更に好ましくは７０重量部以下、一層好ましくは６５重量部以下が挙げられる。塩化マグネシウムと塩化カルシウムとの総量１００重量部に対する量の具体的な範囲としては、１５～９５重量部、１５～９０重量部、１５～８５重量部、１５～７０重量部、１５～６５重量部、３０～９５重量部、３０～９０重量部、３０～８５重量部、３０～７０重量部、３０～６５重量部、３５～９５重量部、３５～９０重量部、３５～８５重量部、３５～７０重量部、３５～６５重量部が挙げられる。
［１－４．その他の成分］
　本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物には、上述の成分以外に、他の成分を含んでもよい。他の成分としては、例えば、デキストリン、難消化性デキストリン、デンプン、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、トレハロースなどの糖賦形剤；塩化ナトリウムや塩化カルシウムなどの塩類；パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール等の防腐剤；抗酸化剤；乳タンパク質、大豆タンパク質、小麦タンパク質などの各種タンパク質（蛋白質脱アミド酵素を除く）；ペプチド；アミノ酸；乳酸菌；ビタミン；ミネラル（上記塩類を除く）；油脂；各種エキス（肉エキス、酵母エキスなど）；核酸等を含んでいてもよい。
［１－５．水に溶解させた場合のｐＨ］
　本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物が、蛋白質脱アミド酵素と塩化マグネシウムとを含む安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物である場合、蛋白質脱アミド乾燥組成物を１ｗ／ｖ％の濃度となるように水に溶解させた場合のｐＨ（２５℃におけるｐＨ。以下において同様。）としては特に限定されず、たとえば、２以上が挙げられ、８以下が挙げられ、具体的な範囲として、２～８が挙げられる。さらに、塩化マグネシウムを含まない場合に比べた塩化マグネシウムによる安定性向上効果をより有効に得る観点では、水に溶解させた場合のｐＨは４以上であることが好ましく、８以下であることが好ましく、具体的な範囲として、４～８が挙げられる。
　本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物が、所定濃度で水に溶解させた場合のｐＨが２以上５未満である安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物である場合、蛋白質脱アミド乾燥組成物を１ｗ／ｖ％の濃度となるように水に溶解させた場合のｐＨ（２５℃におけるｐＨ。以下において同様。）としては、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物において安定性向上効果を得る観点から２以上５未満である。安定性向上効果をより好ましく得る観点から、当該ｐＨの範囲の上限は好ましくは４以下、より好ましくは３以下が挙げられる。具体的なｐＨの範囲としては、２～４（２以上４以下）、２～３が挙げられる。液体状態の蛋白質脱アミド酵素組成物ではｐＨ５～９で安定であるが、本発明の蛋白質脱アミド酵素組成物では、乾燥状態とし且つ水に溶解させた場合のｐＨを２以上５未満とすることで、水に溶解させた場合のｐＨを５～９とした場合に比べて蛋白質脱アミド酵素の安定性を向上させることができる。水に溶解させた場合のｐＨが２以上５未満となる本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物は、上述の塩化マグネシウムを含んでいなくとも蛋白質脱アミド酵素の安定性向上効果を得ることができる。
［１－６．形態］
　本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の形態としては、乾燥状態である限り特に限定されず、例えば、粉末状、顆粒状等が挙げられ、好ましくは粉末状が挙げられる。また、本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物は、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物等の態様のものが挙げられ、好ましくは、噴霧乾燥物及び凍結乾燥物が挙げられる。
［１－７．製造方法］
　蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物は、蛋白質脱アミド酵素を準備する工程、蛋白質脱アミド酵素を含む酵素液を調製する工程、及び、当該酵素液を乾燥させる工程を含む。
［１－７－１．蛋白質脱アミド酵素を準備する工程］
　蛋白質脱アミド酵素を準備する工程において、蛋白質脱アミド酵素は、上述の「１－１．蛋白質脱アミド酵素」に記載した由来生物から公知の培養方法で当業者によって適宜製造することができる。培養方法としては、固体培養法及び液体培養法などの培養法が挙げられるが、好ましくは液体培養法が利用される。
　培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、特に限定されない。使用できる培地としては、蛋白質脱アミド酵素を生産する微生物が生育可能且つ蛋白質脱アミド酵素を生産可能な培地であれば、如何なるものでも良い。例えば、グルコース、シュクロース、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、或いは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。
　培地のｐＨは例えば約３～９、好ましくは約５．０～８．０程度に調製し、培養温度は通常約１０～５０℃、好ましくは約２０～３７℃程度で、１２時間～２０日間、好ましくは１～７日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
　得られた培養液から蛋白質脱アミド酵素を通常の手段で単離し、本発明の蛋白質脱アミド酵素を得ことができる。例えば培養液から、蛋白質脱アミド酵素を単離精製するには、遠心分離、ＵＦ濃縮、塩析、イオン交換樹脂等の各種クロマトグラフィーを組み合わせ、常法により処理して、精製した蛋白質脱アミド酵素を得ることができる。
　また、市販の蛋白質脱アミド酵素（例えば、天野エンザイム株式会社が提供するＰｒｏｔｅｉｎ－ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ“Ａｍａｎｏ”５００等）を出発原料に用いてもよい。
［１－７－２．酵素液を調製する工程］
　酵素液を調製する工程においては、蛋白質脱アミド酵素と塩化マグネシウムとを含む安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の製造の場合は、蛋白質脱アミド酵素が、塩化マグネシウム、及び必要に応じ、塩化カルシウム及び上述の他の成分からなる群から選択される成分を含む酵素液として調製される。酵素液の調製においては、例えば、塩化マグネシウムを、材料の総重量（乾燥重量換算）に対して例えば１．０～１０．０重量％、又は、蛋白質脱アミド酵素の活性当たりの量として例えば０．０１～２．０ｍｇ／ｕ含ませることができる。より具体的には、上述の「１－２．塩化マグネシウム」に記載の量で含ませることができる。またこの場合、酵素液のｐＨは特に限定されず、たとえば２以上が挙げられ、８以下が挙げられる。さらに、塩化マグネシウムを含まない場合に比べた塩化マグネシウムによる安定性向上効果をより有効に得る観点では、酵素液のｐＨは４以上に調整することが好ましく、８以下に調整することが好ましい。より具体的には、上述の「１－５．水に溶解させた場合のｐＨ」に記載のｐＨが挙げられる。また、塩化カルシウムを含ませる場合は、塩化カルシウムを、材料の乾燥重量の総量に対する割合として例えば１．０重量％以上、１０．０重量％以下、又は、塩化マグネシウムと塩化カルシウムとの総量１００重量部に対する量が１５重量部以上、８５重量部以下となる量で含ませるこができる。より具体的には、上述の「１－２．塩化カルシウム」に記載の量で含ませることができる。
　酵素液を調製する工程においては、所定濃度で水に溶解させた場合のｐＨが２以上５未満である安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の製造の場合は、酵素液のｐＨは２以上５未満に調整することができ、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物において安定性向上効果を好ましく得る観点から、好ましくは２～４、より好ましくは２～３に調整することができる。
［１－７－３．酵素液を乾燥させる工程］
　酵素液を乾燥させる工程では、上述の工程で得られた酵素液を乾燥させる。乾燥の手法としては、例えば凍結乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥等が挙げられる。これによって、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物が得られる。
［１－８．用途］
　本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物は、各種蛋白質に作用させることにより、蛋白質中のアミド基を直接脱アミドすることができる。その結果生じた脱アミド化蛋白質は、負電荷の増加に伴い、ｐＩの低下、水和力の上昇、静電反発力の上昇がもたらされる。更に蛋白質の高次構造の変化により、表面疎水性の上昇がもたらされる。これらの効果により、可溶性・分散性の向上、起泡性・泡沫安定性の向上、乳化性・乳化安定性の向上など、蛋白質の機能性の改善がもたらされる。
　従って、本発明の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物は、食品分野において広く用いることができる。具体的には、通常の食品のｐＨ範囲である弱酸性条件環境において植物性蛋白質の可溶性、分散性、乳化性などを向上させる用途（例えば、コーヒー・ホワイトナー、ジュースなどの酸性飲料、ドレッシング、マヨネーズ、クリームの製造用途）；植物性難溶解性蛋白質の可溶性、分散性の増大化（例えば、小麦グルテンを用いた天ぷら粉等の製造用途）；製パン・製菓におけるドウの改質用途（例えば、クラッカー、ビスケット、クッキー、ピザや或いはパイのクラストの製造用途）；食品中のアレルギー性蛋白質におけるアレルゲンの除去又は低減化用途（例えば、小麦アレルギー患者用の食品の製造用途）；蛋白質のミネラル感受性を低下させ、蛋白質及びミネラルを含む液体中の可溶性ミネラル含量を高め、ミネラルの人体への吸収性を高める用途（例えば、高ミネラル（例えばカルシウム）含有飲料、ミネラル（例えばカルシウム）の吸収促進剤の製造用途）；苦みを低下させる用途、プロテアーゼの蛋白質分解率を向上させる用途、及び／又はグルタミン酸含有量を増強させる用途（例えば、アミノ酸系調味料（動物性蛋白質の加水分解物（HAP）、植物性蛋白質の加水分解物（HVP））、味噌・醤油の製造用途）等が挙げられる。
［２．安定性向上方法］
　本発明は、蛋白質脱アミド酵素を含む乾燥酵素組成物において、蛋白質脱アミド酵素の安定性を向上させる方法も提供する。具体的には、本発明の安定性向上方法は、乾燥酵素組成物において、蛋白質脱アミド酵素とともに、塩化マグネシウムを共存させることを特徴とする。又は、本発明の安定性向上方法は、蛋白質脱アミド酵素を含む乾燥酵素組成物を１ｗ／ｖ％となるように水に溶解させた場合のｐＨが２以上５未満となるように調整すること（具体的には、上述の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の製造方法における酵素液を調製する工程で記載したように、酵素液のｐＨを２以上５未満に調整することによって行うことができる。）を特徴とする。
　なお、安定性は、後述の実施例に記載のように、例えば所定条件での保存後の残存活性等で測定することができる。安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の安定性は、安定性向上方法を実施しない場合と比べて向上した安定性であれば特に限定されないが、例えば４０℃で１ヶ月保存後の残存活性が６０％以上であることが挙げられ、好ましくは６５％以上、よりに好ましくは７０％以上、更に好ましくは７５％以上、より一層好ましくは８０％以上である。なお、上述において、安定性向上方法を実施しない場合とは、蛋白質脱アミド酵素とともに塩化マグネシウムを共存させることを特徴とする態様にあっては塩化マグネシウムを共存させない蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物をいい、乾燥酵素組成物を１ｗ／ｖ％となるように水に溶解させた場合のｐＨが２以上５未満となるように調整することを特徴とする態様にあっては当該ｐＨが５以上となるように調整された蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物をいう。
　本発明の安定性向上方法において、使用される成分の種類や含有量、水に溶解させた場合のｐＨ、乾燥酵素組成物の製造方法及び形態等については、上述の「１．蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物」の欄に記載の通りである。
　以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［蛋白質脱アミド酵素の準備］
　以下の試験例において、蛋白質脱アミド酵素としては、天野エンザイム株式会社製蛋白質脱アミド酵素製剤「Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ“Ａｍａｎｏ”５００」(クリセオバクテリウム属由来)、５００ｕ／ｇを用いた。「Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ“Ａｍａｎｏ”５００」は、蛋白質脱アミド酵素以外にデキストリンを含み、活性が５００ｕ／ｇとなるように調整された酵素製剤である。なお、蛋白質脱アミド酵素は、以下の方法で取得してもよい。クリセオバクテリウム・エスピー No.9670（Chryseobacterium sp. No.9670）を、特許文献２に記載の方法に準じ、LB Base培地(Gibco社製)で２５℃、２～７日間振盪培養し、その後遠心上清を得る。培養終了後、培養液を遠心分離（12000rpm、４℃、20分間）し、上清を粗酵素液として得、限外ろ過（ＵＦ）濃縮（SEP-0013）、塩析、フェニールセファロース、セファクリルＳ－１００により処理し酵素を精製する。
［蛋白質脱アミド酵素を含む組成物における蛋白質脱アミド酵素活性の測定法］
　以下の試験例において、蛋白質脱アミド酵素を含む組成物における蛋白質脱アミド酵素活性は以下のように測定した。なお、以下において、基質であるＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙは、Ｎ－ベンジルオキシカルボニル-L-グルタミニルグリシンを表す。
１．３０ｍＭ　Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１．０ｍｌへ０．００２％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を用いて適当に希釈した試料溶液０．１ｍｌを添加し、３７℃にて１０分間インキュベートした後、０．４Ｍトリクロロ酢酸１．０ｍｌ添加し、反応を停止した。
２．テストキットアンモニア（ｗａｋｏ純薬）にて遊離アンモニア量を定量した。
　具体的には、反応液０．２ｍｌを精製水０．８ｍｌと混合した後に、発色試液Ａ（０．４３Ｍフェノール、０．５Ｍペンタシアノニトリル鉄（III）酸ナトリウム二水塩溶液）１．０ｍｌを加えて混合し、更に発色試液Ｂ（０．８９Ｍ水酸化カリウム水溶液）０．５ｍｌを加えて混合し、そこへ発色試液Ｃ（炭酸カリウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液）１．０ｍｌを加えて混合した後に、３７℃にて２０分間インキュベートした。その後、波長６３０ｎｍによる吸光度（Ａ１）を測定した。
３．ブランクとして試料溶液０．１ｍｌへ０．４Ｍトリクロロ酢酸１．０ｍｌ添加した後に、３０ｍＭ　Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１．０ｍｌを混合した溶液も同様の発色操作を行い、吸光度（Ａ２）を測定した。
４．１分間に１μｍｏｌのアンモニアを生成する酵素量を１ｕとし、蛋白質脱アミド酵素活性（ＰＧ活性）を次式より算出した。
　　　　PG活性（u/g）= F x （A1-A2） x (1/17.03) x (2.1/0.1) x (1/10) x N
　　　　　　F：アンモニア検量線の作成により算出される定数
　　　　　　17.03：アンモニア分子量
　　　　　　2.1：反応液総量
　　　　　　0.1：試料添加量
　　　　　　10：反応時間（分）
　　　　　　N：希釈倍数
［試験例１：塩化マグネシウムによる安定性向上効果の検証－１］
（１）蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の調製
　「Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ“Ａｍａｎｏ”５００」（天野エンザイム株式会社製）（５００ｕ／ｇ）を水に溶解し、塩化マグネシウムを、表１に示す配合（蛋白質脱アミド酵素、デキストリン、塩化マグネシウムを含む蛋白質脱アミド酵素製剤の総重量（乾燥重量換算）に対する重量割合、及び蛋白質脱アミド酵素活性当たりの蛋白質脱アミド酵素製剤の重量）となるように溶解させ、酵素液を得た。また、比較例として、塩化マグネシウムを含まない（無添加）酵素液、及び塩化マグネシウムをシステイン又は塩化カルシウムに置き換えた酵素液も同様に、表１に示す配合（タンパク質脱アミド酵素及びデキストリンを含む蛋白質脱アミド酵素製剤、並びに、蛋白質脱アミド酵素、デキストリン及びシステイン又は塩化カルシウムを含む蛋白質脱アミド酵素製剤の総重量（乾燥重量換算）に対する重量割合、及び蛋白質脱アミド酵素活性当たりの重量）で調製した。これらの酵素液は、１Ｍ塩酸及び１Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．０（２５℃）に調整した。
　酵素液（ｐＨ調整後）をスプレードライヤー（EYELA SPRAY DRYER SD-1000）にて粉末化し、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物を噴霧乾燥品として得た。
（２）安定性評価
　得られた噴霧乾燥品をそれぞれGXフィルム袋（凸版印刷株式会社）に入れ、ヒートシールで密封した後、－２０℃及び６０℃それぞれの温度条件にて２日保存した。保存後の蛋白質脱アミド酵素活性を測定し、残存活性（％）を、－２０℃の蛋白質脱アミド酵素活性に対する６０℃の蛋白質脱アミド酵素活性として百分率で導出した。
　結果を表１に示す。塩化マグネシウムを含む場合（実施例１）は、塩化マグネシウムを含まない場合（比較例１）、塩化マグネシウムの代わりにシステインを含む場合（比較例２）、及び塩化マグネシウムの代わりに塩化カルシウムを含む場合（比較例３）に比べて、安定性が向上した。このように、塩化マグネシウムが蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物に対して優れた安定化効果を奏することを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［試験例２：塩化マグネシウムによる安定性向上効果の検証－２］
（１）蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の調製
　塩化マグネシウムの重量割合を２．５重量％としたことを除いて、試験例１と同様に同様に、噴霧乾燥品として蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物（実施例２）を調製し、以下の安定評価試験に供した。また、試験例１で得られた、無添加の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物（比較例１）及び当該重量割合が６．５重量％である蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物（実施例１）についても、以下の安定性評価試験に供した。
（２）安定性評価
　得られた噴霧乾燥品をそれぞれGXフィルム袋（凸版印刷株式会社）に入れ、ヒートシールで密封した後、－２０℃及び４０℃それぞれの温度条件にて１ヶ月保存した。保存後の蛋白質脱アミド酵素活性を測定し、残存活性（％）を、－２０℃の蛋白質脱アミド酵素活性に対する４０℃の蛋白質脱アミド酵素活性として百分率で導出した。
　無添加の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物（比較例１）及び当該重量割合がそれぞれ２．５重量％及び６．５重量％である蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物（実施例２及び実施例１）についての安定性評価の結果を表２に示す。表２に示されるように、いずれの実施例の場合も、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の安定化効果が確認された。このように、塩化マグネシウムが蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物に対して優れた安定化効果を奏することを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［試験例３：塩化マグネシウムと塩化カルシウムの併用による粉体特性向上効果の検証］
（１）蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の調製
　「Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ“Ａｍａｎｏ”５００」（天野エンザイム株式会社製）（５００ｕ／ｇ）を水に溶解し、塩化マグネシウム、又は塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを、表３に示す配合（蛋白質脱アミド酵素、デキストリン、及び塩化マグネシウムを含む、又はさらに塩化カルシウムを含む蛋白質脱アミド酵素製剤を含む蛋白質脱アミド酵素製剤の総重量（乾燥重量換算）に対する重量割合、及び蛋白質脱アミド酵素活性当たりの蛋白質脱アミド酵素製剤の重量）となるように溶解させ、酵素液を得た。酵素液は、１Ｍ塩酸及び１Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６（２５℃）に調整した。
　酵素液（ｐＨ調整後）をスプレードライヤー（EYELA SPRAY DRYER SD-1000）にて粉末化し、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物を噴霧乾燥品として得た。
（２）安定性評価
　得られた噴霧乾燥品をそれぞれGXフィルム袋（凸版印刷株式会社）に入れ、ヒートシールで密封した後、－２０℃及び４０℃それぞれの温度条件にて１ヶ月保存した。保存後の蛋白質脱アミド酵素活性を測定し、残存活性（％）を、－２０℃の蛋白質脱アミド酵素活性に対する４０℃の蛋白質脱アミド酵素活性として百分率で導出した。
（３）粉末特性評価
　得られた噴霧乾燥品をそれぞれGXフィルム袋（凸版印刷株式会社）に入れ、ヒートシールで密封した後、４０℃の温度条件にて１ヶ月保存した後、粉末の外観を目視で観察し、以下の基準に基づいて粉末特性を評価した。
　　　○：固結及び潮解が観察されなかった。
　　　△：軽度の固結又は潮解が観察された。
　　　×：重度の固結又は潮解が観察された。
　結果を表３に示す。塩化マグネシウム単独の場合（実施例１）では、無添加の場合（比較例１）では観察されなかった軽度の固結が観察されたものの、酵素乾燥組成物として許容可能な程度であった。塩化マグネシウム単独の場合（実施例１）と塩化マグネシウムに塩化カルシウムを併用した場合（実施例３～５）を比較すると、安定性は低下傾向にあるものの優れた安定性レベルは維持されており、それに加え、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の固結が抑制されて粉末特性が向上することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［試験例４：溶液時のｐＨが乾燥組成物の安定性に与える影響の検証］
（１）蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の調製
　「Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ“Ａｍａｎｏ”５００」（天野エンザイム株式会社製）（５００ｕ／ｇ）を水に溶解し、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを、表４に示す配合（蛋白質脱アミド酵素、デキストリン、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを含む蛋白質脱アミド酵素製剤の総重量（乾燥重量換算）に対する重量割合、及び蛋白質脱アミド酵素活性当たりの蛋白質脱アミド酵素製剤の重量）となるように溶解させ、酵素液を得た。なお、表４で「無添加」と記載された例では、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを含まない酵素液を得た。これらの酵素液は、１Ｍ塩酸及び／又は１Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ（２５℃）を２、３、４、５、６、７及び８に調整した。
　酵素液（ｐＨ調整後）をスプレードライヤー（EYELA SPRAY DRYER SD-1000）にて粉末化し、蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物を噴霧乾燥品として得た。
　なお、得られた蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物（ｐＨ２、３、４、５、６、７及び８それぞれの酵素液から得られたもの）を再び１ｗ／ｖ％となるように水に再溶解させると、再溶解後のｐＨ（２５℃）は、それぞれ、２、３、４、５、６、７及び８であった。
（２）安定性評価
　得られた噴霧乾燥品をそれぞれGXフィルム袋（凸版印刷株式会社）に入れ、ヒートシールで密封した後、－２０℃及び４０℃それぞれの温度条件にて１ヶ月保存した。保存後の蛋白質脱アミド酵素活性を測定し、残存活性（％）を、－２０℃の蛋白質脱アミド酵素活性に対する４０℃の蛋白質脱アミド酵素活性として百分率で導出した。
　結果を表４に示す。塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを含まない蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物においては、酵素液時のｐＨが２～４である蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物（実施例６～８）は、酵素液時のｐＨが５～８である蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物（比較例４～７）に比べて高い安定性が確認された。特に、酵素液時のｐＨが２～３である蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物（実施例６～７）は安定性が顕著に高いことが確認された。一方、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを含有する蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物（実施例９～１５）においては、同じ酵素液時のｐＨで比較するといずれの場合も、無添加の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物（実施例６～８及び比較例４～７）に比べて安定性が向上した。無添加の蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物に比べた場合の安定性の向上の程度は、特にｐＨ４～８である場合に顕著であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［試験例５：液状品の場合］
（１）蛋白質脱アミド酵素液状組成物の調製
　「Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ“Ａｍａｎｏ”５００」（天野エンザイム株式会社製）（５００ｕ／ｇ）をＢｒｉｘが２５％となるように水に溶解し、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを、表５に示す量（蛋白質脱アミド酵素、デキストリン、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムの総重量（乾燥重量換算）に対する量、及び、乾燥製剤とした場合の蛋白質脱アミド酵素活性当たりの重量）となるように溶解させ、酵素液を得た。なお、表６で「無添加」と記載された例では、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを含まない酵素液を得た。酵素液は、１Ｍ塩酸及び／又は１Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ（２５℃）を６及び７に調整することで、蛋白質脱アミド酵素液状組成物を得た。
（２）安定性評価
　得られた液状品をポリプロピレンチューブに入れ、蓋をした後、４０℃にて１ヶ月保存した。保存後の保存後の蛋白質脱アミド酵素活性を測定し、残存活性（％）を、保存前のの蛋白質脱アミド酵素活性に対する保存後の蛋白質脱アミド酵素活性として百分率で導出した。
　結果を表５に示す。液状組成物では、無添加の液状組成物（比較例８～９）及び塩化マグネシウム及び炭酸カルシウムを含む液状組成物（比較例１０～１１）のいずれにおいても、ｐＨが低いと安定性が低くなった。一方、上述の表４で示したとおり、粉末組成物では酵素液時のｐＨが小さいほど反対に安定性が高い。すなわち、液状組成物と粉末組成物とで、ｐＨが安定性に対して与える影響が全く異なることを確認した。
　さらに、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを含む液状組成物（比較例１０～１１）では、同じｐＨで比較するといずれの場合も無添加の液状組成物（比較例８～９）に比べて安定性が低下した。一方、上述の表１～表４に示したとおり、粉末組成物では、無添加に比べて塩化マグネシウム又は塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを含む場合の方が反対に安定性が高い。すなわち、液状組成物と乾燥組成物とで、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムが安定性に対して与える影響が全く異なることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明の好ましい実施形態は上記の通りであるが、本発明はそれらのみに限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な実施形態が他になされる。

Claims (8)

  1. 　蛋白質脱アミド酵素と塩化マグネシウムとを含む、安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
  2. 　前記塩化マグネシウムの含有量が１．０～１０．０重量％である、請求項１に記載の安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
  3. 　前記塩化マグネシウムの含有量が１．０～６．０重量％である、請求項１に記載の安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
  4. 　前記塩化マグネシウムの含有量が０．０１～２．０ｍｇ／ｕである、請求項１に記載の安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
  5. 　蛋白質脱アミド酵素を含む乾燥酵素組成物において、前記蛋白質脱アミド酵素の安定性を向上させる安定性向上方法であって、
    　乾燥酵素組成物において、前記蛋白質脱アミド酵素ともに、塩化マグネシウムを共存させる、安定性向上方法。
  6. 　１ｗ／ｖ％となるように水に溶解させた場合のｐＨが２以上５未満である、安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物。
  7. 　蛋白質脱アミド酵素を含む乾燥酵素組成物において、前記蛋白質脱アミド酵素の安定性を向上させる安定性向上方法であって、
    　乾燥酵素組成物を１ｗ／ｖ％となるように水に溶解させた場合のｐＨが２以上５未満となるように調整する、安定性向上方法。
  8. 　ｐＨ２以上５未満である蛋白質脱アミド酵素を含む酵素液を用意する工程と、前記酵素液を乾燥させる工程とを含む、安定化蛋白質脱アミド酵素乾燥組成物の製造方法。
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