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WO2018207888A1 - ラメルテオンの製造法 - Google Patents

ラメルテオンの製造法 Download PDF

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WO2018207888A1
WO2018207888A1 PCT/JP2018/018199 JP2018018199W WO2018207888A1 WO 2018207888 A1 WO2018207888 A1 WO 2018207888A1 JP 2018018199 W JP2018018199 W JP 2018018199W WO 2018207888 A1 WO2018207888 A1 WO 2018207888A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ramelteon
transaminase
represented
producing
optically active
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/018199
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
西山　章
紀幸 伊藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kaneka Corp
Original Assignee
Kaneka Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kaneka Corp filed Critical Kaneka Corp
Priority to JP2019517702A priority Critical patent/JPWO2018207888A1/ja
Publication of WO2018207888A1 publication Critical patent/WO2018207888A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/77—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D307/78—Benzo [b] furans; Hydrogenated benzo [b] furans
    • C07D307/79—Benzo [b] furans; Hydrogenated benzo [b] furans with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D307/80—Radicals substituted by oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/77—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D307/78—Benzo [b] furans; Hydrogenated benzo [b] furans
    • C07D307/79—Benzo [b] furans; Hydrogenated benzo [b] furans with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D307/81—Radicals substituted by nitrogen atoms not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/04—Oxygen as only ring hetero atoms containing a five-membered hetero ring, e.g. griseofulvin, vitamin C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/343—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide condensed with a carbocyclic ring, e.g. coumaran, bufuralol, befunolol, clobenfurol, amiodarone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B53/00—Asymmetric syntheses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B61/00—Other general methods

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ramelteon.
  • the following methods are known as a production method of ramelteon used as a sleep inducing agent.
  • Tetrahedron Asymmetry, 2006, 17, 184-190.
  • the prior arts (1) and (2) are not suitable for implementation on an industrial scale because they use an expensive transition metal catalyst and perform high-pressure hydrogenation that requires special equipment.
  • the prior arts (3) and (4) are optical resolution methods, unnecessary enantiomers accounting for half of the substrate weight must be discarded, and these are also not efficient methods.
  • the problem to be solved by the present invention with respect to the above prior art is to provide a simple and efficient production method of ramelteon.
  • the asymmetric reduction is represented by the following formula (5): Wherein R is an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have a substituent, an alkenyl group having 2 to 20 carbon atoms which may have a substituent, and a carbon number which may have a substituent. Represents an aralkyl group having 7 to 20 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms which may have a substituent, a carboxyl group, or a 1H-tetrazole group, * represents an asymmetric carbon atom, and A ⁇ represents a counter anion.
  • the optically active pyrrolidine salt derivative represented by the following formula (6) The method for producing ramelteon according to [1], wherein the Hantzsh ester represented by the formula is used as a reducing agent.
  • R is a diphenylmethyl group, (trimethylsilyloxy) diphenylmethyl group, or (hydroxy) diphenylmethyl group, the absolute configuration is R-form, and A ⁇ is The method for producing ramelteon according to [2], which is trichloroacetate or trifluoroacetate.
  • optically active aldehyde (2) is represented by the following formula (3): The method for producing ramelteon according to any one of [1] to [5], which is converted to an optically active amine represented by the following formula and then propionylated.
  • the enal (1) is represented by the following formula (7);
  • ramelteon can be easily and efficiently produced.
  • an ⁇ , ⁇ -unsaturated nitrile represented by the following formula (7) that is, (E)-(1,6,7,8-tetrahydro-2H-indeno [5,4- b] furan-8-ylidene) acetonitile can be used.
  • the compound (7) can be synthesized with a carbanion prepared from diethyl cyanomethylphosphonate and sodium hydride, 1,2,6,7-tetrahydro-8H-indeno [ It can be easily produced by reacting 5,4-b] furan-8-one.
  • enal which is an intermediate product of the present invention, that is, (E) -2- [1,2,6,7-tetrahydro-8H-indeno [5,4-b] furan-8-ylidene] acetaldehyde is It is represented by Formula (1).
  • the compound (1) is a novel compound not described in any literature.
  • optically active aldehyde which is an intermediate product of the present invention, ie, (S)-(1,6,7,8-tetrahydro-2H-indeno [5,4-b] furan-8-yl) acetaldehyde is It is represented by Formula (2).
  • an optically active amine which is an intermediate product of the present invention, that is, (S) -2- (1,6,7,8-tetrahydro-2H-indeno [5,4-b] furan-8-yl) ethanolamine is Is represented by the following formula (3).
  • ramelteon which is the product of the present invention, that is, (S) -N- [2- (1,6,7,8-tetrahydro-2H-indeno [5,4-b] furan-8-yl) ethyl] Propionamide is represented by the following formula (4).
  • the preferred embodiment of the present invention is represented as follows in the figure. Further, in the present application, “manufacturing the optically active aldehyde represented by the formula (2) and subsequently converting it into the ramelteon represented by the formula (4)” includes the step 3 from the optically active aldehyde (2). And a method for producing ramelteon (4) from optically active aldehyde (2) via steps 4 to 5 are included.
  • the enal represented by the formula (1) is produced by reacting the ⁇ , ⁇ -unsaturated nitrile represented by the formula (7) with a hydride reducing agent.
  • Examples of the hydride reducing agent include lithium aluminum hydride, diisobutylaluminum hydride, sodium bis (2-methoxyethoxy) aluminum hydride, lithium tri (tert-butoxy) aluminum hydride, borane, lithium borohydride, hydrogenation.
  • Examples thereof include sodium borohydride, potassium borohydride, sodium cyanoborohydride, sodium triacetoxyborohydride, lithium triethylborohydride, catecholborane and the like, preferably diisobutylaluminum hydride.
  • the upper limit of the amount of the hydride reducing agent used is preferably 10 times the molar amount relative to the compound (7), more preferably 5 times the molar amount. As a minimum, it is 0.5 time mole amount with respect to the said compound (7), More preferably, it is 1 time mole amount.
  • the reaction solvent in this step is not particularly limited as long as it does not affect the reaction.
  • tetrahydrofuran, methyltetrahydrofuran, diethyl ether, 1,4-dioxane, methyl tert-butyl ether, ethylene glycol dimethyl ether Ether solvents such as 4-methyltetrahydropyran; aliphatic hydrocarbon solvents such as pentane, hexane, heptane and methylcyclohexane; aromatic hydrocarbon solvents such as benzene, toluene, xylene, ethylbenzene and mesitylene; N, N Amino acids such as dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N, N-diethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, N-ethyl-2-pyrrolidone, N-methyl- ⁇ -caprolactam, hexamethylphosphoramide, etc.
  • phosphonic acid triamide system such as hexamethylphosphoric acid triamide solvents such as; system solvent; urea and dimethyl propylene urea-based solvent. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the mixing ratio is not particularly limited.
  • it is an aromatic hydrocarbon solvent, more preferably tetrahydrofuran, 4-methyltetrahydropyran, or toluene.
  • the upper limit of the amount of the solvent used is preferably 100 times the weight of the compound (7), more preferably 50 times the weight, and particularly preferably 20 times the weight.
  • the lower limit is preferably 0.1 times the weight of the compound (7), more preferably 0.5 times the weight, and particularly preferably 1 times the weight. In such a range, the cost is not excessive and post-processing is simple.
  • the reaction temperature in this reaction is not particularly limited and may be set as appropriate.
  • the upper limit is preferably 120 ° C, more preferably 80 ° C, and particularly preferably 40 ° C. ° C.
  • the lower limit is preferably ⁇ 100 ° C., more preferably ⁇ 80 ° C., and particularly preferably ⁇ 70 ° C.
  • the reaction time in this reaction is not particularly limited and may be appropriately set.
  • the upper limit is preferably 100 hours, more preferably 50 hours, and particularly preferably 25 hours.
  • the lower limit is preferably 0.1 hour, more preferably 0.5 hour, and particularly preferably 1 hour.
  • a general process for obtaining a product from the reaction solution may be performed.
  • a general extraction solvent such as ethyl acetate, diethyl ether, methylene chloride, toluene, hexane, or the like.
  • the reaction solvent and the extraction solvent are distilled off from the obtained extract by an operation such as heating under reduced pressure, vacuum drying, or the use of a desiccant such as anhydrous magnesium sulfate, the desired product is obtained.
  • the target product thus obtained has a sufficient purity that can be used in the subsequent steps.
  • the target product is obtained by a general purification method such as crystallization, fractional distillation, or column chromatography. Further, the purity may be further increased.
  • the optically active aldehyde represented by the formula (2) is produced by asymmetric reduction of the enal represented by the formula (1).
  • the enal (1) may be produced according to the method described in the step 1, or even produced by other methods is included in the scope of the present invention.
  • Examples of the method for asymmetric reduction include a method using a reducing agent in the presence of an asymmetric organic catalyst, and a method using enone reductase.
  • Examples of the asymmetric organic catalyst include (2S, 5S) -2-tert-Butyl-3-methyl-5-benzoyl-4-oxomidazolidinium trichloroacetate, (R) -2- (tert-Butyl) -3-methyl- 4-oxoimidolidium trichloroacetate, (2S, 5S) -5-Benzyl-3-methyl-2- (5-methyl-2-furyl) -2-imidazolidinium trichloroacetate, (5S) -2,2,3-Trimethyl phenylmethyl-4-oxoimidazolidinium trichloroacetate, (2S, 5S) -2-tert-Butyl- -Methyl-5-benzyl-4-oxomidazolidinium trifluoroacetate, (R) -2- (tert-Butyl) -3-methyl-4-oxomimidazolidinium trifluoroacetate, (2S, 5S) -3 Mac
  • An optically active pyrrolidine salt derivative represented by formula (5) is preferable, and an optically active pyrrolidine salt derivative represented by formula (5) is preferable.
  • R has an optionally substituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, an optionally substituted alkenyl group having 2 to 20 carbon atoms, and a substituent.
  • An alkyl group, a carboxyl group, or a 1H-tetrazole group having 1 to 20 (more preferably 1 to 10 carbon atoms) is preferable.
  • substituents examples include an aromatic hydrocarbon group having 6 to 10 carbon atoms such as a phenyl group; an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms such as a methoxy group and an ethoxy group; a hydroxy group; a trimethylsilyloxy group and a triethylsilyloxy group A 5- to 7-membered heterocyclic group such as a pyrrolidinyl group or a piperidinyl group; and the like, and these substituents may be combined with one or more.
  • aromatic hydrocarbon group having 6 to 10 carbon atoms such as a phenyl group
  • alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms such as a methoxy group and an ethoxy group
  • a hydroxy group such as a trimethylsilyloxy group and a triethylsilyloxy group
  • a 5- to 7-membered heterocyclic group such as a pyrrolidinyl group or a piperidinyl group
  • R is preferably methyl, ethyl, isopropyl, methoxymethyl, (1-pyrrolidinyl) methyl, vinyl, benzyl, phenyl, diphenylmethyl, (trimethylsilyloxy) diphenylmethyl, (hydroxy) A diphenylmethyl group, a carboxyl group, or a 1H-tetrazole group, more preferably a diphenylmethyl group, a (trimethylsilyloxy) diphenylmethyl group, or a (hydroxy) diphenylmethyl group, and still more preferably a diphenylmethyl group.
  • * represents an asymmetric carbon atom
  • the absolute configuration may be either S-form or R-form, and preferably the absolute configuration is R-form.
  • a ⁇ represents a counter anion.
  • the counter anion is not particularly limited, but is preferably chloride ion, bromide ion, sulfate ion, phosphate ion, mesylate, tosylate, triflate, trichloroacetate, trifluoroacetate, acetate, or benzoate, and more preferably Is trichloroacetate or trifluoroacetate.
  • supported by the polymer may be sufficient, for example, the cation exchange resin etc. in which a counter anion is a sulfonate are mentioned.
  • optically active pyrrolidine salt derivative includes optically active pyrrolidine in the reaction system, hydrogen chloride, hydrogen bromide, sulfuric acid, phosphoric acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trichloroacetic acid, You may prepare by mixing acids, such as a trifluoroacetic acid, an acetic acid, and a benzoic acid.
  • the acid is preferably trifluoroacetic acid or trichloroacetic acid, and more preferably trifluoroacetic acid.
  • the upper limit of the amount of the acid used is 10 times the weight of the optically active pyrrolidine, more preferably 5 times the weight, and particularly preferably 3 times the weight.
  • the lower limit is preferably 0.001 times weight, more preferably 0.01 times weight, and particularly preferably 0.1 times weight with respect to the compound (1).
  • the upper limit of the amount of the asymmetric organic catalyst used is preferably 10 times the weight of the compound (1), more preferably 5 times the weight, and particularly preferably 1 times the weight.
  • the lower limit is preferably 0.001 times weight, more preferably 0.01 times weight, and particularly preferably 0.1 times weight with respect to the compound (1). In such a range, the cost is not excessive and post-processing is simple.
  • Examples of the reducing agent include hydrogen gas, formic acid, sodium formate, triethylammonium formate, 1,4-dihydropyridine derivatives and the like, with 1,4-dihydropyridine derivatives being preferred.
  • the 1,4-dihydropyridine derivative is more preferably the following formula (6);
  • Hantzsh ester represented by: Diethyl 1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-3,5-pyridine dicarboxylicboxylate.
  • the upper limit of the amount of the reducing agent used is preferably 100 times the weight of the compound (1), more preferably 50 times the weight, and particularly preferably 10 times the weight.
  • the lower limit is preferably 0.1 times the weight of the compound (1), more preferably 0.5 times the weight, and particularly preferably 1 times the weight. In such a range, the cost is not excessive and post-processing is simple.
  • the solvent in this step is not particularly limited as long as it does not affect the reaction. Specifically, for example, water; methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, tert-butanol, ethylene glycol, etc.
  • Alcohol solvents such as tetrahydrofuran, methyltetrahydrofuran, diethyl ether, 1,4-dioxane, methyl tert-butyl ether, ethylene glycol dimethyl ether, 4-methyltetrahydropyran and the like; nitrile solvents such as acetonitrile and propionitrile; Ester solvents such as ethyl acetate, n-propyl acetate, isopropyl acetate; aliphatic hydrocarbon solvents such as pentane, hexane, heptane, methylcyclohexane; benzene, toluene, xylene, ethylbenzene Aromatic hydrocarbon solvents such as Zen and mesitylene; halogen solvents such as methylene chloride and 1,2-dichloroethane; sulfoxide solvents such as dimethyl sulfoxide; N, N-dimethylformamide,
  • the mixing ratio is not particularly limited.
  • the upper limit of the amount of the solvent used is preferably 100 times the weight of the compound (1), more preferably 50 times the weight, and particularly preferably 20 times the weight.
  • the lower limit is preferably 0.1 times the weight of the compound (1), more preferably 0.5 times the weight, and particularly preferably 1 times the weight. In such a range, the cost is not excessive and post-processing is simple.
  • the reaction temperature in this reaction is not particularly limited and may be set as appropriate.
  • the upper limit is preferably 150 ° C., more preferably 100 ° C., and particularly preferably 50 ° C.
  • the lower limit is preferably ⁇ 80 ° C., more preferably ⁇ 30 ° C., and particularly preferably 0 ° C.
  • the reaction time in this reaction is not particularly limited and may be appropriately set.
  • the upper limit is preferably 100 hours, more preferably 50 hours, and particularly preferably 25 hours.
  • the lower limit is preferably 0.1 hour, more preferably 0.5 hour, and particularly preferably 1 hour.
  • the mixing order of compound (1), asymmetric organic catalyst, reducing agent and solvent in this step is not particularly limited.
  • a general process for obtaining a product from the reaction solution may be performed.
  • a general process for obtaining a product from the reaction solution may be performed.
  • a general extraction solvent such as ethyl acetate, diethyl ether, methylene chloride, toluene, hexane, or the like. Good.
  • the reaction solvent and the extraction solvent are distilled off from the resulting extract by an operation such as heating under reduced pressure, the desired product is obtained.
  • the target product thus obtained has a sufficient purity that can be used in the subsequent steps.
  • the target product is obtained by a general purification method such as crystallization, fractional distillation, or column chromatography. Further, the purity may be further increased.
  • An optically active aldehyde represented by the above formula (2) is produced by acting an enone reductase having the ability to stereoselectively reduce the carbon-carbon double bond of the enal represented by the above formula (1). To do.
  • Any enone reductase may be used as long as it has the ability to stereoselectively reduce the carbon-carbon double bond at the enone site of enal (1) to produce optically active aldehyde (2). .
  • Enon reductase may be not only the enzyme itself, but also the microbial cell itself of the microorganism that produces the enzyme, the culture solution of the microbial cell, or the processed microbial cell product as long as it has the desired reducing activity. Moreover, the transformant into which DNA which codes the enzyme which has the reduction activity derived from the said microorganisms was introduce
  • transduced is also included.
  • the microorganism-treated product of the microorganism is not particularly limited, and examples thereof include dry cells, surfactant-treated products, lysed enzyme-treated products, immobilized cells, or cell-free extracts obtained by disrupting cells. it can. Furthermore, an enzyme that catalyzes the asymmetric reduction reaction may be purified from the culture and used.
  • microorganisms may be used alone or in combination of two or more.
  • these microorganisms may be immobilized and used by a known method.
  • the old yellow which is usually recognized as an enone reductase Examples include an enzyme (Old Yellow Enzyme), such as an oxidoreductase classified as EC 1.6.99 according to the enzyme classification method of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. As oxidoreductases classified into EC1.6.99, EC1.65.99.1: NADPH dehydrogenase, EC1.65.99.2: NAD (P) H dehydrogenase (quinone), EC1.69.99.
  • NADH dehydrogenase oxidoreductase classified into NADH dehydrogenase, EC1.65.99.5: NADH dehydrogenase (quinone), or EC1.65.99.6: NADPH dehydrogenase (quinone), preferably EC1.6 .99.1: NADPH dehydrogenase.
  • the EC 1.6.99.1 NADPH dehydrogenase include the genus Candida, the genus Kluyveromyces, the genus Saccharomyces, the genus Schizosaccharomyces, and the like. And those derived from bacteria such as Bacillus genus, Escherichia genus, Pseudomonas genus, Yersinia genus, Zymomonas genus, and preferably Saccharomyces saccharomyces (Saccharomyces saccharomyces).
  • Genus, Kluyveromyces genus, Bacillus genus, Esh examples include those derived from microorganisms such as Escherichia genus, Pseudomonas genus, Yersinia genus, Zymomonas genus, and the most preferred examples are Saccharomyces cerevisiae cerevisiae and Saccharomyces cerevisiae cerevisiae. Seth lactis (Kluyveromyces lactis), Bacillus subtilis (Escherichia coli), Pseudomonas putida (Pseudomonas putida), Yersinia bermobies i. is) is included.
  • Examples of the enone reductase include OYE2, OYE3 (derived from Saccharomyces cerevisae, described in International Publication No. 2006/129628), and KYE (derived from Kluyveromyces lactis C. certis). , 349, 1521 (2007)), YqjM (derived from Bacillus subtilis, described in J. Biol. Chem., 278, 19891 (2003)), NemA (Escherichi coli) Origin: Biol.Pharm.Bul.20, 110 (1997)), XeaA, XenE, etc.
  • YersER derived from Yersinia bercoviaeri, described in Adv. Synth. Catal., 349, 1521.
  • NCR-R derived from Zymomonas mobilis, described in Biotechnol. Bioeng., 98, 22 (2007)
  • OYE2 derived from Zymomonas mobilis, described in Biotechnol. Bioeng., 98, 22 (2007)
  • OYE2 derived from Zymomonas mobilis, described in Biotechnol. Bioeng., 98, 22 (2007)
  • NemA derived from Zymomonas mobilis, described in Biotechnol. Bioeng., 98, 22 (2007)
  • NemA derived from Zymomonas mobilis
  • YERSER derived from Zymomonas mobilis
  • NCR-R derived from Zymomonas mobilis, described in Biotechnol. Bioeng., 98, 22 (2007)
  • Microorganisms that produce enzymes can usually be obtained from stocks that are readily available or purchased. For example, it can be obtained from the following culture collections. ⁇ National Biotechnology Headquarters, Biotechnology Headquarters, National Institute of Technology and Evaluation (NBRC) (2-5-8 Kazusa Kamashika, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818) ⁇ RIKEN BioResource Center Microbial Materials Development Office (JCM) (2-1, Hirosawa, Wako, Saitama 351-0198) German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) (Marschuder Weg 1b, D-38124 Brunswick, Germany)
  • the enone reductase (for example, OYE2) used in the present invention has its known amino acid sequence (for example, J. Biol. Chem. 268, 6097-6106 (for example) as long as it has the desired reductase activity. 1993) (one amino acid sequence of OYE2) (for example, 40, preferably 20, more preferably 15, more preferably 10, more preferably 5, 4, 3, Or a polypeptide having 2 or less amino acids) substituted, inserted, deleted and / or added.
  • the homology is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, more preferably 98% or more, or It may have 99% or more amino acid sequence.
  • a tag sequence such as a histidine tag or an HA tag can be added.
  • it can be a fusion protein with another protein.
  • a peptide fragment may be sufficient.
  • the optically active aldehyde (2) can be more efficiently produced by using a transformant containing DNA encoding enone reductase.
  • genetic manipulations such as DNA isolation, vector preparation, and transformation described in this specification are described in Molecular Cloning 4th Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012), Current Protocols in. It can be carried out by a method described in a document such as Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley-Interscience).
  • the vector used for the above transformant is not particularly limited as long as it can express the gene encoding the reductase used in the present invention in a suitable host organism.
  • examples of such vectors include plasmid vectors, phage vectors, cosmid vectors, and shuttle vectors that can exchange genes with other host strains can also be used.
  • Such vectors for example in the case of E. coli, usually contain regulatory elements such as lacUV5 promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, pL promoter, etc., and are operable with the DNA of the present invention. It can be suitably used as an expression vector comprising an expression unit linked to the.
  • pSTV28 manufactured by Takara Bio Inc.
  • pUCNT International Publication No. 94/03613
  • the “regulatory factor” refers to a base sequence having a functional promoter and any related transcription element (eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.).
  • operably linked means that various regulatory elements such as promoters and enhancers that regulate gene expression and the gene are linked in a state where they can operate in the host cell.
  • regulatory elements such as promoters and enhancers that regulate gene expression and the gene are linked in a state where they can operate in the host cell.
  • type and kind of the control factor can vary depending on the host.
  • the host organism used for expressing each enzyme is not particularly limited as long as it is transformed by an enzyme expression vector containing DNA encoding each enzyme and can express the enzyme into which the DNA has been introduced. .
  • bacteria are preferable from the introduction and expression efficiency, and Escherichia coli (Escherichia coli) is particularly preferable.
  • a vector containing a DNA encoding a reductase used in the present invention can be introduced into a host microorganism by a known method.
  • Escherichia coli as the host microorganism, the vector is introduced into the host cell by using a commercially available Escherichia coli HB101 (hereinafter, E. coli HB101) competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.). can do.
  • Examples of transformants containing DNA encoding an enzyme that reduces the carbon-carbon double bond at the enone site of enal (1) include the vector pTSSYE2 and E. coli.
  • E. coli obtained by transforming HB101.
  • E. coli HB101 pTSYE2
  • E. coli obtained in the same manner. coli HB101 pTSYE3
  • E. coli. coli HB101 pNKYE
  • E. coli. coli HB101 pNYqjM
  • E. coli. coli HB101 pNYersER
  • E. coli. and E. coli HB101 pNNCR-R.
  • a transformant containing both a DNA encoding an enzyme having a target reducing activity and a DNA encoding a polypeptide having a coenzyme regeneration ability can be produced.
  • a transformant containing both a DNA encoding an enzyme that reduces the carbon-carbon double bond at the enone site of enal (1) and a DNA encoding a polypeptide having a coenzyme regeneration ability is Both the DNA encoding the enzyme that reduces the carbon-carbon double bond at the enone site of (1) and the DNA encoding the polypeptide having the coenzyme regeneration ability are incorporated into the same vector, and this is incorporated into the host cell.
  • these two types of DNAs can be incorporated into two different vectors of different incompatibility groups, and the two types of vectors can be introduced into the same host cell.
  • an enzyme that reduces the carbon-carbon double bond at the enone site of enal (1) is used.
  • the encoding DNA and the DNA encoding the polypeptide having the ability to regenerate coenzyme may be introduced into different host cells, and these host cells may be cultured in the same culture solution or using different culture solutions.
  • NAD + oxidized nicotinamide / adenine dinucleotide
  • NADP + oxidized nicotinamide / adenine dinucleotide phosphate
  • NADH reduced nicotinamide / adenine dinucleotide
  • an oxidoreductase having the ability to convert to NADPH is preferable.
  • enzymes include hydrogenase, formate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and glucose dehydrogenase.
  • formate dehydrogenase and glucose dehydrogenase are used.
  • Examples of the formate dehydrogenase include Candida, Kloeckera, Pichia, Lipomyces, Pseudomonas, Moraxella, and Hyphomicrobium.
  • Examples include enzymes derived from microorganisms such as the genus Hyphomicrobium, the genus Paracoccus, the genus Thiobacillus, and the genus Ansylobacter, and the enzyme obtained from Thiobacillus sp. Can be mentioned.
  • glucose dehydrogenase examples include enzymes derived from microorganisms such as the genus Bacillus, the genus Lactobacillus, and the genus Pediococcus, and in particular, Bacillus megaterium, Lactobacillus plan Examples thereof include enzymes obtained from Talam (Lactobacillus plantarum), Lactobacillus pentosus (Lactobacillus pentosus), and Pediococcus parvulus.
  • microorganisms such as the genus Bacillus, the genus Lactobacillus, and the genus Pediococcus, and in particular, Bacillus megaterium, Lactobacillus plan
  • examples thereof include enzymes obtained from Talam (Lactobacillus plantarum), Lactobacillus pentosus (Lactobacillus pentosus), and Pediococcus parvulus.
  • Examples of the enzyme include the genus Cryptococcus (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-262767), the genus Gluconobacter (J. Bacteriol., 184, 672-678, (2002)), and Saccharomyces (Saccharomyces).
  • Glucose dehydrogenase and cryptococcus from the genus Methodhods Enzymol., 89, 159-163, (1982)
  • Lactobacillus genus Lactobacillus genus
  • Pediococcus genus International Publication No. 2009/041415
  • Glucose-6-li from the genera, Aspergillus, Pseudomonas Dehydrogenase are known (Arch. Biochem. Biophys., 228,113-119 (1984)).
  • an appropriate solvent and substrate enal (1) the above microorganism, a culture thereof, or a processed product thereof, etc. are mixed and stirred and shaken under pH adjustment. Or leave it alone.
  • the reaction solution contains an enzyme that reduces NAD + and / or NADP + to each reduced form and a substrate for the reduction. It is preferable to carry out the reaction.
  • glucose dehydrogenase as the enzyme that reduces to the reduced form
  • glucose coexists as the substrate for reduction
  • formate dehydrogenase as the enzyme that reduces to the reduced form
  • formic acid as the substrate for reduction
  • the reaction can be promoted by adding a coenzyme such as NADH or NADPH that is required for a reduction reaction by a biological method.
  • a coenzyme such as NADH or NADPH that is required for a reduction reaction by a biological method.
  • these are usually added directly to the reaction solution.
  • a surfactant such as Triton (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.), Span (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.), Tween (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.)
  • an organic solvent may coexist in the reaction system. If an organic solvent insoluble in water such as ethyl acetate, butyl acetate, isopropyl ether, toluene, hexane or the like is added to the reaction solution, inhibition of the reaction by the substrate and / or the alcohol that is the product of the reduction reaction can be avoided.
  • the solubility of the substrate can be increased by adding a water-soluble organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, tetrahydrofuran, or dimethyl sulfoxide.
  • reaction solvent an aqueous medium such as water or a buffer solution is usually used.
  • buffer include potassium phosphate buffer and tris (hydroxymethyl) aminomethane-hydrochloric acid buffer.
  • a culture solution containing the microorganisms is usually used for the reaction as it is. You may concentrate and use a culture solution. In addition, when the components in the culture solution adversely affect the reaction, it is preferable to use microbial cells or processed microbial cells obtained by treating the culture solution by centrifugation or the like.
  • Enal (1) as a substrate may be added all at once at the beginning of the reaction, or may be added in divided portions as the reaction proceeds.
  • the temperature during the reaction is preferably 60 ° C as an upper limit, more preferably 40 ° C.
  • the lower limit is preferably 10 ° C, more preferably 20 ° C.
  • the pH during the reaction is preferably 10 as an upper limit, more preferably 9.
  • the lower limit is preferably 2.5, and more preferably 5.
  • the amount of the enzyme source in the reaction solution may be appropriately determined according to the ability to reduce these substrates, and the upper limit is preferably 50% (W / V), more preferably 10% (W / V). is there.
  • the lower limit is preferably 0.01% (W / V), more preferably 0.1% (W / V).
  • the substrate concentration in the reaction solution is preferably 50% (W / V) as the upper limit, more preferably 30% (W / V).
  • the lower limit is preferably 0.01% (W / V), more preferably 0.1% (W / V).
  • the reaction is usually performed with shaking or stirring with aeration.
  • the reaction time is appropriately determined depending on the substrate concentration, the amount of microorganisms, and other reaction conditions.
  • the upper limit of the reaction time is preferably 336 hours, and more preferably 168 hours.
  • the lower limit is preferably 0.1 hour, more preferably 1 hour.
  • an energy source such as glucose, ethanol or isopropanol
  • the upper limit of the addition amount is preferably 50% (W / V), more preferably 30% (W / V).
  • the lower limit is preferably 0.1 (W / V), more preferably 0.5% (W / V).
  • the method for taking out the optically active aldehyde (2) produced by the reduction reaction is not particularly limited, but ethyl acetate, toluene, t-butyl methyl ether, hexane, n-butanol,
  • a high-purity optically active aldehyde (2) can be easily obtained by extraction with a solvent such as dichloromethane, followed by dehydration and purification by distillation or silica gel column chromatography.
  • optically active aldehyde (2) thus obtained is included in the scope of the present invention even if it is derived into ramelteon (4) by any conversion method.
  • each process is demonstrated in detail.
  • ramelteon represented by the formula (4) is produced by condensing and reducing the optically active aldehyde represented by the formula (2) with propionic acid amide.
  • ramelteon represented by the formula (4) is produced by condensing and reducing the optically active aldehyde represented by the formula (2) with propionic acid amide.
  • a metal catalyst for example, Adv. Synth. Catal 2013, 355, 717-733.
  • propionamide, [Rh (COD) Cl] 2 as a metal catalyst
  • Xantphos 4,5-Bis (diphenylphosphino) -9,9-dimethylxanthene
  • the target product thus obtained has a sufficient purity, but for the purpose of further increasing the purity, the purity can be further increased by a general purification method such as crystallization, fractional distillation, column chromatography and the like. Also good.
  • the optically active amine represented by the formula (3) is produced from the optically active aldehyde represented by the formula (2).
  • the optically active aldehyde (2) may be produced according to the method described in Step 2, or it may be produced by other methods, and is included in the scope of the present invention.
  • Specific conversion methods include, for example, a method using ammonia and a hydride reducing agent, a hydrogenation method in the presence of ammonia and a metal catalyst, a method using formic acid in the presence of a metal catalyst, and a transamination in the presence of an enzyme (transaminase). The method of doing is mentioned.
  • the desired product is obtained by adding aqueous ammonia and ammonium acetate in an ethanol solvent and reducing with sodium cyanoborohydride.
  • the method for hydrogenation in the presence of ammonia and a metal catalyst may be performed according to the method described in Japanese Patent No. 4059978, for example. That is, the desired product can be obtained by adding ammonia gas and hydrogen gas in the presence of a transition metal catalyst such as homogeneous nickel, rhodium, palladium, iridium or the like. Or, Catalysts 2015, 5, 2258-2270. In other words, the target product can also be obtained by adding ammonia gas and hydrogen gas in the presence of a ruthenium catalyst supported on alumina.
  • a transition metal catalyst such as homogeneous nickel, rhodium, palladium, iridium or the like.
  • Catalysts 2015, 5, 2258-2270 Catalysts 2015, 5, 2258-2270.
  • the target product can also be obtained by adding ammonia gas and hydrogen gas in the presence of a ruthenium catalyst supported on alumina.
  • the method using formic acid in the presence of the metal catalyst may be according to the method described in International Publication No. 2016/096905. That is, the desired product can be obtained by using ammonium formate in the presence of a palladium catalyst.
  • transaminase a method for transamination in the presence of an enzyme (transaminase) will be described. That is, the transaminase having the ability to generate the optically active amine represented by the formula (3) is allowed to act on the optically active aldehyde represented by the formula (2) in the presence of an amino group donor. An optically active amine represented by the formula (3) is produced.
  • transaminase Any transaminase may be used as long as it has an ability to produce an optically active amine (3) in the presence of an amino group donor from the optically active aldehyde (2).
  • the transaminase may be not only the enzyme itself, but also the microbial cell itself, the culture solution of the microbial cell, or the processed microbial cell product as long as it has the desired transamination activity.
  • transduced is also included.
  • the microorganism-treated product of the microorganism is not particularly limited, and examples thereof include dry cells, surfactant-treated products, lysed enzyme-treated products, immobilized cells, or cell-free extracts obtained by disrupting cells. it can. Furthermore, an enzyme that catalyzes the asymmetric reduction reaction may be purified from the culture and used. These may be used alone or in combination of two or more.
  • these microorganisms may be immobilized and used by a known method.
  • the immobilization method generally include a carrier binding method, a crosslinking method, and a comprehensive method, and any of them may be used.
  • the transaminase may be reacted in water, and may be reacted in an organic solvent, that is, the organic solvent may be present in the reaction system or may be reacted using only the organic solvent.
  • the organic solvent may be present in the reaction system or may be reacted using only the organic solvent.
  • solvents such as glycerol, ethylene glycol, methanol, ethanol, 1-propanol, and 2-propanol
  • sulfoxide solvents such as dimethyl sulfoxide
  • amide systems such as N, N-dimethylformamide Solvents
  • aliphatic hydrocarbon solvents such as n-hexane and n-heptane
  • ester solvents such as ethyl acetate, isopropyl acetate and butyl acetate
  • aromatic hydrocarbon solvents such as benzene, toluene and xylene
  • acetone, 2- Ketone solvents such as butanone and methyl isobutyl ketone
  • Preferred solvents include dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, ethyl acetate, isopropyl acetate, butyl acetate, toluene, xylene, diethyl ether, dinormal propyl ether, diisopropyl ether, dinormal butyl ether, methyl isopropyl ether, methyl tert -Butyl ether and ethyl-tert-butyl ether are mentioned, and more preferred solvent is methyl-tert-butyl ether.
  • the transaminase having the ability to produce an optically active amine (3) from the optically active aldehyde (2) in the presence of an amino group donor is, for example, EC 2.6 according to the enzyme classification method of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. .1. An enzyme group classified as X is mentioned.
  • the transaminase is generally called ⁇ -transaminase.
  • the ⁇ -transaminase refers to one having an activity to generate amines other than ⁇ -amino acids.
  • ⁇ -transaminase examples include the genera Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Vibrio, Alcaligenes, and Mesorhizobium. Examples include those derived from bacteria such as the genus Chromobacterium, the genus Caurobacter, and the genus Rhodobacter.
  • Arthrobacter sp. Bacillus megaterium, Pseudomonas sp., Vibrio fluvialis, Arthrobacter re-bacter ⁇ Dentricificans (Alcaligenes denitrificans), Pseudomonas fluorescens (Pseudomonas fluorescens), Pseudomonas corrugata (Pseudomonas corrugata), Mesozobium sp.
  • Violaceum Chromobacterium violaceum
  • Caulobacter-Kuresentasu Caulobacter crescentus
  • Rhodobacter Sufaeroidesu Rhodobacter sphaeroides
  • Arthrobacter sp. KNK168 Arthrobacter sp. KNK168
  • Bacillus megaterium Pseudomonas sp. KNK425 (Pseudomonas sp. KNK425)
  • Pseudomonas sp. ⁇ Furubiarisu JS17 (Vibrio fluvialis JS17)
  • Arthrobacter citreus Arthrobacter citreus
  • Alkaligenes denitrificans Y2k-2 Alkaligenes denitrificans Y2k-2 (Alcaligenes denitrificans Y2k-2)
  • Pseudomonas P eu 8 KNu fluor 8 as fluorescens KNK08-18 Pseudomonas Korugata 10F6 (Pseudomonas corrugata 10F6)
  • Mesorhizobium sp LUK Mesorhizobium sp LUK
  • megaterium SC6394 Bacillus megaterium SC6394
  • Caulobacter crescentus CB15 Calobacter crecentus CB15
  • Rhodobacter sphaeroides DSM 158 Rhobacter sphaeroides DSM 158
  • microorganisms can usually be obtained from stocks that are easy to obtain or purchase. For example, it can be obtained from the following culture collections. ⁇ National Biotechnology Headquarters, Biotechnology Headquarters, National Institute of Technology and Evaluation (NBRC) (2-5-8 Kazusa Kamashika, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818) ⁇ RIKEN BioResource Center Microbial Materials Development Office (JCM) (2-1, Hirosawa, Wako, Saitama 351-0198) German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) (Marschuder Weg 1b, D-38124 Brunswick, Germany)
  • the transaminase used in the present invention has one or more (for example, 40, preferably 20, more preferably) in the known amino acid sequence as long as it has the desired transamination activity.
  • a polypeptide in which 15 amino acids, more preferably 10, more preferably 5, 4, 3, or 2 amino acids) are substituted, inserted, deleted and / or added may be used.
  • the amino acid sequence is 85% or more homologous to a known amino acid sequence, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, or 99%. You may have the above amino acid sequence.
  • the optically active amine (3) when a transformant containing DNA encoding transaminase is used, the optically active amine (3) can be produced more efficiently.
  • genetic manipulations such as DNA isolation, vector preparation, and transformation described in this specification are described in Molecular Cloning 4th Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012), Current Protocols in. It can be carried out by a method described in a document such as Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley-Interscience).
  • the vector used for the transformant is not particularly limited as long as it can express the gene encoding the transaminase used in the present invention in an appropriate host organism.
  • examples of such vectors include plasmid vectors, phage vectors, cosmid vectors, and shuttle vectors that can exchange genes with other host strains can also be used.
  • such a vector usually contains regulatory elements such as lacUV5 promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, pL promoter, etc., and operates with the DNA of the present invention. It can be suitably used as an expression vector comprising expression units that are ligated together.
  • pSTV28 manufactured by Takara Bio Inc.
  • pUCNT International Publication No. 94/03613
  • the “regulatory factor” refers to a base sequence having a functional promoter and any related transcription element (eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.).
  • operably linked means that various regulatory elements such as promoters and enhancers that regulate gene expression and the gene are linked in a state where they can operate in the host cell.
  • regulatory elements such as promoters and enhancers that regulate gene expression and the gene are linked in a state where they can operate in the host cell.
  • type and kind of the control factor can vary depending on the host.
  • the host organism used for expressing each enzyme is not particularly limited as long as it is transformed by an enzyme expression vector containing DNA encoding each enzyme and can express the enzyme into which the DNA has been introduced. .
  • bacteria are preferable from the introduction and expression efficiency, and Escherichia coli (Escherichia coli) is particularly preferable.
  • a vector containing a DNA encoding a reductase used in the present invention can be introduced into a host microorganism by a known method.
  • Escherichia coli as the host microorganism, the vector is introduced into the host cell by using a commercially available Escherichia coli HB101 (hereinafter, E. coli HB101) competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.). can do.
  • an amination reaction using transaminase is generally a reversible reaction, the reaction generally stops at an equilibrium point.
  • the reaction using the polypeptide of the present invention can be improved.
  • alanine as an amino group donor, pyruvate by-product is conjugated with lactate dehydrogenase and glucose dehydrogenase for coenzyme regeneration.
  • a method of converting to lactic acid and eliminating the reaction equilibrium is effective.
  • a method using alanine as an amino group donor and removing by-product pyruvate with pyruvate decarboxylase International Publication No.
  • the optically active compound of the present invention can be more efficiently obtained by using a transformant that produces the plurality of enzymes in the same host cell.
  • the transformant can be obtained by incorporating DNAs encoding a plurality of necessary enzyme genes into the same vector and introducing them into the same host cell, and by combining these two types of DNA with a plurality of vectors having different incompatibility groups. And can be obtained by introduction into the same host cell.
  • Any amino group donor can be used as long as it generates the optically active amine represented by the formula (3) in the presence of an enzyme source.
  • Specific examples include ⁇ -phenethylamine, 2-butylamine, 2-pentylamine, 2-heptylamine, 3-heptylamine, n-ethylamine, n-propylamine, n-butylamine, n-amylamine, isopropylamine, isobutylamine.
  • ⁇ -amino acids eg, glycine, alanine, etc.
  • 3-amino-1-phenylbutane benzylamine, ⁇ -phenethylamine, cyclohexylamine, and optically active forms thereof.
  • ⁇ -phenethylamine, isopropylamine, or ⁇ -amino acid eg, alanine
  • ⁇ -phenethylamine or ⁇ -amino acid is more preferable.
  • Examples of preferred combinations of ⁇ -transaminase and amino group donors include the following. 1) When the amino group donor is isopropylamine, preferably Arthrobacter sp., Pseudomonas sp., Vibrio fluviaris, or Pseudomonas fluorescens (Pseudomona) fluorescens), and more preferably, Arthrobacter sp.
  • amino group donor is ⁇ -phenethylamine
  • Arthrobacter sp. Pseudomonas sp., Vibrio flubialis, or Pseudomonas fluorescens (Pseudomonas fluorescens) Pseudomonas fluorescens, more preferably Arthrobacter sp., Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens, and more preferably p. Pseudomonas fluorescens. .).
  • the amino group donor is an ⁇ -amino acid (especially alanine)
  • it is preferably Arthrobacter sp., Pseudomonas sp., Vibrio fluviaris, or Pseudomonas. -Fluorescence (Pseudomonas fluorescens), More preferably, Arthrobacter sp. (Arthrobacter sp.) Or Pseudomonas sp. MV37 (Pseudomonas sp. MV37).
  • reaction solvent an aqueous medium such as water or a buffer solution is usually used.
  • buffer include potassium phosphate buffer and tris (hydroxymethyl) aminomethane-hydrochloric acid buffer.
  • a culture solution containing the cells of the above microorganisms may be used for the reaction as it is, or the culture solution may be concentrated.
  • the components in the culture solution adversely affect the reaction, it is preferable to use microbial cells or processed microbial cells obtained by treating the culture solution by centrifugation or the like.
  • optically active aldehyde (2) as a substrate may be added all at once at the beginning of the reaction, or may be added in divided portions as the reaction proceeds.
  • the temperature during the reaction is preferably 60 ° C as an upper limit, more preferably 40 ° C.
  • the lower limit is preferably 10 ° C, more preferably 20 ° C.
  • the pH during the reaction is preferably 10 as an upper limit, more preferably 9.
  • the lower limit is preferably 2.5, and more preferably 5.
  • the amount of the enzyme source in the reaction solution may be appropriately determined according to the ability to reduce these substrates, and the upper limit is preferably 50% (W / V), more preferably 10% (W / V). is there.
  • the lower limit is preferably 0.01% (W / V), more preferably 0.1% (W / V).
  • the substrate concentration in the reaction solution is preferably 50% (W / V) as the upper limit, more preferably 30% (W / V).
  • the lower limit is preferably 0.01% (W / V), more preferably 0.1% (W / V).
  • the reaction is usually performed with shaking or stirring with aeration.
  • the reaction time is appropriately determined depending on the substrate concentration, the amount of microorganisms, and other reaction conditions.
  • the upper limit of the reaction time is preferably 336 hours, and more preferably 168 hours.
  • the lower limit is preferably 0.1 hour, more preferably 1 hour.
  • an energy source such as glucose, ethanol or isopropanol
  • the upper limit of the addition amount is preferably 50% (W / V), more preferably 30% (W / V).
  • the lower limit is preferably 0.1 (W / V), more preferably 0.5% (W / V).
  • a surfactant such as Triton (manufactured by Nacalai Tesque), Span (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.), Tween (manufactured by Nacalai Tesque) to the reaction solution.
  • an organic solvent insoluble in water insoluble organic solvent such as ethyl acetate, butyl acetate, isopropyl ether, toluene, hexane). Solvent may be added to the reaction solution.
  • an organic solvent soluble in water such as methanol, ethanol, acetone, tetrahydrofuran, dimethyl sulfoxide can be added.
  • the optically active amine is generated by the above reaction.
  • the produced optically active amine can be isolated from the reaction mixture by a known method such as extraction, distillation, recrystallization, or column separation.
  • ethers such as diethyl ether and diisopropyl ether
  • esters such as ethyl acetate and butyl acetate
  • hydrocarbons such as hexane, octane and benzene
  • halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, etc.
  • the produced optically active amino compound and unreacted amino group donor can be extracted with a common organic solvent in the same manner, for example, by adjusting the pH to basic.
  • the produced optically active amino compound and the unreacted amino group donor can be separated by, for example, distillation.
  • the target product thus obtained has a sufficient purity that can be used in the subsequent steps.
  • crystallization, fractional distillation, solution washing, column chromatography, etc. are generally used.
  • the purity may be further increased by a simple purification method.
  • crystallization is performed by forming a salt with an acid such as mandelic acid or camphorsulfonic acid.
  • an acid such as mandelic acid or camphorsulfonic acid.
  • a ramelteon represented by the formula (4) is produced by further propionylating the optically active amine represented by the formula (3) produced by the method described in the step 4.
  • a propionylating agent such as propionyl chloride, propionyl bromide, or propionic anhydride may be used in the presence of a base.
  • Examples of the base include lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, cesium hydroxide, lithium carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate, cesium carbonate, lithium hydrogen carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate and the like; lithium Methoxide, lithium ethoxide, lithium isopropoxide, lithium tert-butoxide, sodium methoxide, sodium ethoxide, sodium isopropoxide, sodium tert-butoxide, potassium methoxide, potassium ethoxide, potassium isopropoxide, potassium tert -Alkoxides such as butoxide; metal hydrides such as sodium hydride, potassium hydride, calcium hydride; trimethylamine, triethylamine, tributylamine, diisopropylethyl Amine, N- methylpyrrolidine, N- methylmorpholine, 1,8-diazabicyclo [5,4,0] undec-7-ene, pyridine, quinoline, include
  • the mixing ratio is not particularly limited.
  • Sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, potassium carbonate, triethylamine, or tributylamine is preferable, and sodium hydroxide, potassium carbonate, or triethylamine is more preferable.
  • the upper limit of the amount of the base used is preferably 100 times the weight of the compound (3), more preferably 50 times the weight, and particularly preferably 10 times the weight.
  • the lower limit is preferably 0.1 times the weight of the compound (3), more preferably 0.5 times the weight, and particularly preferably 1 times the weight. In such a range, the cost is not excessive and post-processing is simple.
  • the upper limit of the amount of the propionylating agent used is preferably 50 times the weight of the compound (3), more preferably 10 times the weight, and particularly preferably 5 times the weight.
  • the lower limit is preferably 0.5 times the weight of the compound (3), more preferably 0.8 times the weight, and particularly preferably 1 times the weight. In such a range, the cost is not excessive and post-processing is simple.
  • the solvent in this step is not particularly limited as long as it does not affect the reaction.
  • Ether solvents such as ethylene glycol dimethyl ether and 4-methyltetrahydropyran
  • nitrile solvents such as acetonitrile and propionitrile
  • ester solvents such as ethyl acetate, n-propyl acetate and isopropyl acetate
  • Aliphatic hydrocarbon solvents such as cyclohexane
  • Aromatic hydrocarbon solvents such as benzene, toluene, xylene, ethylbenzene, and mesitylene
  • Ketone solvents such as acetone, methyl ethyl ketone, and
  • the mixing ratio is not particularly limited.
  • water ether solvents such as tetrahydrofuran, methyltetrahydrofuran, diethyl ether, 1,4-dioxane, methyl tert-butyl ether, ethylene glycol dimethyl ether, 4-methyltetrahydropyran; ketone solvents such as acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone
  • a nitrile solvent such as acetonitrile or propionitrile, more preferably water, tetrahydrofuran, acetone, or acetonitrile, and particularly preferably tetrahydrofuran or acetonitrile.
  • the upper limit of the amount of the solvent used is preferably 100 times the weight of the compound (3), more preferably 50 times the weight, and particularly preferably 20 times the weight.
  • the lower limit is preferably 0.1 times the weight of the compound (3), more preferably 0.5 times the weight, and particularly preferably 1 times the weight. In such a range, the cost is not excessive and post-processing is simple.
  • the reaction temperature in this reaction is not particularly limited and may be set as appropriate.
  • the upper limit is preferably 150 ° C., more preferably 100 ° C., and particularly preferably 50 ° C.
  • the lower limit is preferably ⁇ 80 ° C., more preferably ⁇ 30 ° C., and particularly preferably 0 ° C.
  • the reaction time in this reaction is not particularly limited and may be appropriately set.
  • the upper limit is preferably 100 hours, more preferably 50 hours, and particularly preferably 25 hours.
  • the lower limit is preferably 0.1 hour, more preferably 0.5 hour, and particularly preferably 1 hour.
  • the mixing order of the compound (3), propionylating agent, base and solvent in this step is not particularly limited.
  • a general process for obtaining a product from the reaction solution may be performed.
  • the reaction solution after completion of the reaction is added to water or an aqueous acid solution such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and an extraction operation is performed using a general extraction solvent such as ethyl acetate, diethyl ether, methylene chloride, toluene, hexane or the like.
  • a general extraction solvent such as ethyl acetate, diethyl ether, methylene chloride, toluene, hexane or the like.
  • the target product precipitated by adding water to the reaction solution is filtered off and washed with water, tetrahydrofuran, acetone, acetonitrile, ethyl acetate, methylene chloride, toluene, heptane, or the like.
  • the target product, ramelteon (4), obtained in this way has sufficient purity, but for the purpose of further increasing the purity, a general purification method such as crystallization, fractional distillation, column chromatography or the like is used. Further, the purity may be further increased.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • TCA trichloroacetic acid
  • THF Tetrahydrofuran 4-MTHP: 4-methyltetrahydropyran DMA: dimethylacetamide
  • Example 27 Preparation of lyophilized cells of E. coli expressing ⁇ -transaminase
  • enzyme A Arthrobacter sp. KNK168 (Patent No. 5410089, SEQ ID NO: 25)
  • Enzyme B Pseudomonas sp. KNK425 (Pseudomonas sp. KNK425)
  • Enzyme C Pseudomonas fluorescens KNK08-18 (Pseudomonas fluorescens) (Patent No.
  • Enzyme D Pseudomonas sp. MV37 (Pseudomonas sp. MV37) (Patent No. 5878871, SEQ ID NO: 2)
  • Enzyme E Vibrio flu Alice JS17 (Vibrio flavialis JS17) (sequence described in Appl. Microbiol. Biotechnol. 61.463-471 (2003)), NdeI recognition site and multi-site of pUCNT (International Publication No. 94/03613) downstream of lac promoter
  • the recombinant vector was obtained by inserting between the cloning sites.
  • E. coli E. coli using the recombinant vector.
  • coli HB101 (Takara Bio Inc.) was transformed to obtain recombinant E. coli.
  • the obtained recombinant Escherichia coli was cultured in 2 ⁇ YT medium (tripton 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%, pH 7.0) containing 200 ⁇ g / ml ampicillin, and the cells were collected. did.
  • the obtained cells were frozen in methanol in which dry ice was dissolved, and then dried overnight with a freeze dryer (Tokyo Rika Kikai Co., Ltd., FDS-1000) to obtain freeze-dried cells.
  • Example 29 Production of (S) -2- (1,6,7,8-tetrahydro-2H-indeno [5,4-b] furan-8-yl) ethanolamine using ⁇ -transaminase (reaction in water 3 enzyme method) L-lactic acid dehydrogenase PALDH derived from Pediococcus acidilactici JCM8797 and glucose dehydrogenase derived from Bacillus megaterium IAM1030 described in Example 13 of International Publication No. 2007/139055 Recombinant E.
  • ⁇ -transaminase reaction in water 3 enzyme method
  • L-lactic acid dehydrogenase PALDH derived from Pediococcus acidilactici JCM8797
  • glucose dehydrogenase derived from Bacillus megaterium IAM1030 described in Example 13 of International Publication No. 2007/139055 Recombinant E.
  • GDH coli co-expressing the enzyme GDH was cultured in 2 ⁇ YT medium (tryptone 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%, pH 7.0) containing 200 ⁇ g / ml ampicillin, Bacteria were collected by centrifugation. The obtained cells were frozen in methanol in which dry ice was dissolved, and then dried overnight with a freeze dryer (Tokyo Rika Kikai, FDS-1000) to obtain PAL / GDH freeze-dried cells.
  • 2 ⁇ YT medium tryptone 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%, pH 7.0
  • Bacteria were collected by centrifugation.
  • the obtained cells were frozen in methanol in which dry ice was dissolved, and then dried overnight with a freeze dryer (Tokyo Rika Kikai, FDS-1000) to obtain PAL / GDH freeze-dried cells.
  • Example 31 Production of (S) -2- (1,6,7,8-tetrahydro-2H-indeno [5,4-b] furan-8-yl) ethanamine using an enzyme flow reactor Diaion HP2MG After washing twice 7.5 g (manufactured by Mitsubishi Chemical) with 7.5 mL of 0.1 M KPB (potassium phosphate buffer) (pH 7.5), 250 mg of TPM freeze-dried cells and 20 mg of PLP (pyridoxal phosphate) 10 mL of 0.1 M KPB (pH 7.5) in which was dissolved was added and stirred at room temperature for 2 hours. After removing water with a pipette, nitrogen was blown to dry until moisture disappeared to prepare an enzyme-immobilized resin. When the protein content in the removed water was measured, 38% of the added protein was adsorbed on the resin. The immobilization resin was packed in a glass tube of ⁇ 5 mm ⁇ 50 mm to produce an immobilization resin column.
  • KPB potassium phosphate
  • solution A 100 mM (S)-(1,6,7,8-tetrahydro-2H-indeno [5,4-b] furan-8-yl) acetaldehyde, MTBE solution
  • solution B was saturated with water
  • YSP-101 syringe pump
  • liquid A and liquid B are fed at 0.025 mL / min, mixed in a T-shaped mixing section, and fixed at 30 ° C.
  • the solution was passed through a fluorinated resin column.
  • the eluted reaction solution was analyzed by gas chromatography under the same conditions as in Example 26, and (S) -2- (1,6,7,8-tetrahydro-2H-indeno [5,4-b] furan-8 was obtained.
  • the conversion rate was calculated from the ratio of -yl) ethanolamine and (S)-(1,6,7,8-tetrahydro-2H-indeno [5,4-b] furan-8-yl) acetaldehyde.
  • the results are shown in Table 7 and FIG.
  • the conversion activity into the target compound was stably maintained from 40 minutes to 180 minutes after the start of liquid feeding.

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Abstract

本発明は、睡眠導入剤ラメルテオンの簡便、且つ効率的な製造法を提供する。　本発明によれば、入手容易なエナール（Ｅ）－２－［１，２，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅを不斉還元することにより光学活性アルデヒド（Ｓ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅを製造する工程を実施することにより、短工程でラメルテオンを製造することができる。

Description

ラメルテオンの製造法
　本発明は、ラメルテオンの製造法に関する。
　睡眠導入剤として使用されているラメルテオンの製造法としては、以下のような方法が知られている。
　１）１，２，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｏｎｅをリン酸エステル誘導体を用いて（Ｅ）－２－［１，２，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅに変換し、ニトリル官能基を還元してアミン化合物とした後、オレフィンを不斉水素化して、得られた光学活性体の化合物を還元反応し、次いでアシル化させることによりラメルテオンに誘導する方法（特許文献１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　２）１，２，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｏｎｅをリン酸エステル誘導体を用いて（Ｅ）－２－［１，２，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５,４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅに変換し、ニトリル官能基を水和してアミド官能基とした後、オレフィンを異性化させ、これを不斉水素化してラメルテオンに誘導する方法（非特許文献１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　３）ラセミ２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅを光学活性なカルボン酸誘導体を用いて造塩し、前記光学活性なカルボン酸塩を光学分割する方法（特許文献２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　４）ラセミ２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ)ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄを光学活性なアミン誘導体を用いて造塩し、前記光学活性なアミン誘導体塩を光学分割する方法（特許文献３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
特許第４３５８９１７号公報 中国特許出願公開第１０４５２９９５９号明細書 中国特許出願公開第１０１６５４４４５号明細書
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，２００６，１７，１８４－１９０．
　しかしながら従来技術（１）と（２）では、高価な遷移金属触媒を用いて、更に特殊設備が必要な高圧水素化を行っているため、工業的規模での実施には不適である。また、従来技術（３）と（４）は光学分割法であるため、基質重量の半分を占める不要なエナンチオマーは廃棄しなければならず、これらもまた効率的な方法とは言い難い。
　上記の従来技術に対して本発明が解決しようとする課題は、ラメルテオンの簡便、且つ効率のよい製造法を提供することにある。
　本発明者らは鋭意検討の結果、入手容易な出発原料から簡便、且つ効率よく、更に高圧水素化などの特殊設備を必要としないラメルテオンの製造法を見出し、本発明を完成するに至った。
[１]　下記式（１）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
で表されるエナールを不斉還元することにより、下記式（２）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
で表される光学活性アルデヒドを製造し、続いてこれを下記式（４）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
で表されるラメルテオンに変換することを特徴とするラメルテオンの製造法。
[２]　前記不斉還元が、下記式（５）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（式中、Ｒは置換基を有しても良い炭素数１～２０のアルキル基、置換基を有しても良い炭素数２～２０のアルケニル基、置換基を有しても良い炭素数７～２０のアラルキル基、置換基を有しても良い炭素数６～２０のアリール基、カルボキシル基、又は１Ｈ－テトラゾール基を表す。＊は不斉炭素原子を表す。Ａ-はカウンター陰イオンを表す。）で表される光学活性ピロリジン塩誘導体を不斉有機触媒に用いて、下記式（６）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
で表わされるＨａｎｔｚｓｈエステルを還元剤に用いて行うことを特徴とする、［１］に記載のラメルテオンの製造法。
[３]　前記光学活性ピロリジン塩誘導体（５）において、Ｒがジフェニルメチル基、（トリメチルシリルオキシ）ジフェニルメチル基、又は（ヒドロキシ）ジフェニルメチル基であり、絶対立体配置がＲ体であり、Ａ-がトリクロロアセテート、又はトリフルオロアセテートである、［２］に記載のラメルテオンの製造法。
[４]　前記不斉還元がエノンリダクターゼを用いて行うことを特徴とする、［１］に記載のラメルテオンの製造法。
[５]　前記エノンリダクターゼがＯＹＥ２、ＮｅｍＡ、ＹｅｒｓＥＲ、ＮＣＲ－Ｒである、［４］に記載のラメルテオンの製造法。
[６]　前記光学活性アルデヒド（２）を、下記式（３）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
で表される光学活性アミンに変換した後、これをプロピオニル化することを特徴とする、［１］～［５］のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
[７]　前記光学活性アミン（３）に変換する方法が、アミノ基供与体の存在下、トランスアミナーゼを用いて行うことを特徴とする、［６］に記載のラメルテオンの製造法。
[８]　前記アミノ基供与体がイソプロピルアミンであり、前記トランスアミナーゼがω－トランスアミナーゼである、［７］に記載のラメルテオンの製造法。
[９]　前記アミノ基供与体がα－フェネチルアミンであり、前記トランスアミナーゼがω－トランスアミナーゼである、［７］に記載のラメルテオンの製造法。
[１０]　前記アミノ基供与体がα－アミノ酸であり、前記トランスアミナーゼがω－トランスアミナーゼである、［７］に記載のラメルテオンの製造法。
[１１]　前記トランスアミナーゼを有機溶媒中で反応させる、［７］～［１０］のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
[１２]　樹脂に固定化された前記トランスアミナーゼを有機溶媒中で反応させる、［７］～［１１］のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
[１３]　前記エナール（１）が、下記式（７）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
で表されるα，β－不飽和ニトリルとヒドリド還元剤を反応させて製造したものである、［１］～［１２］のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
[１４]　下記式（１）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
で表されるエナール（（Ｅ）－２－［１，２，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）。
　本発明によれば、ラメルテオンを簡便、且つ効率よく製造することができる。
酵素フローリアクターを用いた（Ｓ）－２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅ製造での変換率の経時安定性を示すグラフである。
　以下、本発明に係るラメルテオンの製造方法について、詳細に述べる。
　まずは、本発明の製造法に使用する原料、中間生成物、及び目的生成物について説明する。
　本発明の出発原料としては、例えば下記式（７）で表されるα，β－不飽和ニトリル、即ち（Ｅ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌｉｄｅｎｅ）ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅを使用することができる。ここで、化合物（７）は例えば、特許第４０８１１６１号公報に記載の方法に従って、シアノメチルホスホン酸ジエチルと水素化ナトリウムから調製したカルボアニオンと、１，２，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｏｎｅを反応させることなどにより簡便に製造できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　また、本発明の中間生成物であるエナール、即ち（Ｅ）－２－［１，２，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅは、下記式（１）で表される。ここで、前記化合物（１）は文献未記載の新規化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　また、本発明の中間生成物である光学活性アルデヒド、即ち（Ｓ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅは、下記式（２）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　また、本発明の中間生成物である光学活性アミン、即ち（Ｓ）－２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅは、下記式（３）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　また、本発明の生成物であるラメルテオン、即ち（Ｓ）－Ｎ－［２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ)ｅｔｈｙｌ］ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅは、下記式（４）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　本発明の好ましい態様を図で表すと以下のとおりである。また本願では、「式（２）で表される光学活性アルデヒドを製造し、続いてこれを式（４）で表されるラメルテオンに変換すること」には、光学活性アルデヒド（２）から工程３を経てラメルテオン（４）を製造する方法、及び光学活性アルデヒド（２）から工程４～５を経てラメルテオン（４）を製造する方法の両方が含まれることとする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　以下に各工程を順を追って説明する。
　（工程１）
　本工程で、前記式（７）で表されるα，β－不飽和ニトリルにヒドリド還元剤を反応させることにより、前記式（１）で表されるエナールを製造する。
　前記ヒドリド還元剤としては例えば、水素化リチウムアルミニウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、水素化ビス（２－メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム、水素化リチウムトリ（ｔｅｒｔ－ブトキシ）アルミニウム、ボラン、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリエチルホウ素リチウム、カテコールボラン等が挙げられ、好ましくは水素化ジイソブチルアルミニウムである。
　前記ヒドリド還元剤の使用量として、上限として好ましくは前記化合物（７）に対して１０倍モル量であり、更に好ましくは５倍モル量である。下限としては、前記化合物（７）に対して０．５倍モル量であり、更に好ましくは１倍モル量である。
　本工程の反応溶媒としては、反応に影響を与えない限りにおいては特に制限はなく、具体的には例えば、テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４－ジオキサン、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン等のエーテル系溶媒；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、メシチレン等の芳香族炭化水素系溶媒；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ－エチル－２－ピロリドン、Ｎ－メチル－ε－カプロラクタム、ヘキサメチルホスホルアミド等のアミド系溶媒；ジメチルプロピレンウレア等のウレア系溶媒；ヘキサメチルホスホン酸トリアミド等のホスホン酸トリアミド系溶媒等を用いることができる。これらは単独で用いても良く、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その混合比は特に制限されない。好ましくはまたは芳香族炭化水素系溶媒であり、更に好ましくはテトラヒドロフラン、４－メチルテトラヒドロピラン、またはトルエンである。
　前記溶媒の使用量は、上限としては、前記化合物（７）に対して好ましくは１００倍重量であり、更に好ましくは５０倍重量であり、特に好ましくは２０倍重量である。下限としては、前記化合物（７）に対して好ましくは０．１倍重量であり、更に好ましくは０．５倍重量であり、特に好ましくは１倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
　本反応における反応温度には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、副生成物の生成を少なくするため、上限として好ましくは１２０℃であり、更に好ましくは８０℃であり、特に好ましくは４０℃である。下限としては好ましくは－１００℃であり、更に好ましくは－８０℃であり、特に好ましくは－７０℃である。
　本反応における反応時間には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、上限としては好ましくは１００時間であり、更に好ましくは５０時間であり、特に好ましくは２５時間である。下限として好ましくは０．１時間であり、更に好ましくは０．５時間であり、特に好ましくは１時間である。
　本工程の混合順序について特に制限はないが、化合物（７）と溶媒を含む溶液に対し、ヒドリド還元剤を添加するのが好ましい。
　反応後の処理としては、反応液から生成物を取得するための一般的な処理を行えばよい。例えば、反応終了後の反応液を水、又は塩酸、硫酸等の酸水溶液に加え、一般的な抽出溶媒、例えば酢酸エチル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、トルエン、ヘキサン等を用いて抽出操作を行うとよい。得られた抽出液から、減圧加熱、真空乾燥等の操作や、無水硫酸マグネシウム等の乾燥剤の使用により、反応溶媒及び抽出溶媒を留去すると目的物が得られる。このようにして得られた目的物は、後続工程に使用できる十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。
　（工程２）
　本工程で、前記式（１）で表されるエナールを不斉還元することにより、前記式（２）で表される光学活性アルデヒドを製造する。ここで、前記エナール（１）は工程１に記載の方法に従って製造してもよく、又はそれ以外の方法で製造したものであっても本発明の範囲に含まれる。
　前記不斉還元する方法としては、不斉有機触媒存在下に還元剤を用いる方法、若しくはエノンリダクターゼを用いる方法が挙げられる。
　まずは不斉有機触媒存在下に還元剤を用いる方法について説明する。
　前記不斉有機触媒としては例えば、（２Ｓ，５Ｓ）－２－ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｙｌ－３－ｍｅｔｈｙｌ－５－ｂｅｎｚｙｌ－４－ｏｘｏｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、（Ｒ）－２－（ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｙｌ）－３－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｏｘｏｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、（２Ｓ，５Ｓ）－５－Ｂｅｎｚｙｌ－３－ｍｅｔｈｙｌ－２－（５－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｆｕｒｙｌ）－２－ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、（５Ｓ）－２，２，３－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－５－ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ－４－ｏｘｏｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、（２Ｓ，５Ｓ）－２－ｔｅｒｔ-Ｂｕｔｙｌ－３－ｍｅｔｈｙｌ－５－ｂｅｎｚｙｌ－４－ｏｘｏｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、（Ｒ）－２－（ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｙｌ）－３－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｏｘｏｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、（２Ｓ，５Ｓ）－５－Ｂｅｎｚｙｌ－３－ｍｅｔｈｙｌ－２－（５－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｆｕｒｙｌ）－２－ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ、（５Ｓ）－２，２，３－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－５－ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ－４－ｏｘｏｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｕｍ　ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ等のマクミラン型触媒、
及び下記式（５）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
で表される光学活性ピロリジン塩誘導体等が挙げられ、好ましくは、式（５）で表わされる光学活性ピロリジン塩誘導体である。
　ここで、式（５）中、Ｒは置換基を有しても良い炭素数１～２０のアルキル基、置換基を有しても良い炭素数２～２０のアルケニル基、置換基を有しても良い炭素数７～２０のアラルキル基、置換基を有しても良い炭素数６～２０のアリール基、カルボキシル基、又は１Ｈ－テトラゾール基を表し、置換基を有しても良い炭素数１～２０（より好ましくは炭素数１～１０）のアルキル基、カルボキシル基、又は１Ｈ－テトラゾール基が好ましい。前記置換基としては、フェニル基等の炭素数６～１０の芳香族炭化水素基；メトキシ基、エトキシ基等の炭素数１～６のアルコキシ基；ヒドロキシ基；トリメチルシリルオキシ基、トリエチルシリルオキシ基等のトリアルキルシリルオキシ基；ピロリジニル基、ピペリジニル基等の五～七員複素環基；等が例示され、これらの置換基は１又は２以上を組み合わせてもよい。
　Ｒとして好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基、メトキシメチル基、（１－ピロリジニル）メチル基、ビニル基、ベンジル基、フェニル基、ジフェニルメチル基、（トリメチルシリルオキシ）ジフェニルメチル基、（ヒドロキシ）ジフェニルメチル基、カルボキシル基、又は１Ｈ－テトラゾール基であり、より好ましくはジフェニルメチル基、（トリメチルシリルオキシ）ジフェニルメチル基、又は（ヒドロキシ）ジフェニルメチル基であり、よりさらに好ましくはジフェニルメチル基である。
　式（５）中、＊は不斉炭素原子を表し、絶対立体配置はＳ体またはＲ体のいずれでもよく、好ましくは絶対立体配置がＲ体である。
　式（５）中、Ａ-はカウンター陰イオンを表す。前記カウンター陰イオンとして特に制限はないが、好ましくは塩化物イオン、臭化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、メシレート、トシレート、トリフレート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、アセテート、又はベンゾエートであり、更に好ましくはトリクロロアセテート、又はトリフルオロアセテートである。また、ポリマーに担持されたカウンター陰イオンでもよく、具体的には例えば、カウンター陰イオンがスルホネートである陽イオン交換樹脂などが挙げられる。
　また、前記光学活性ピロリジン塩誘導体は、反応系中で光学活性ピロリジンと、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリフロオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、安息香酸等の酸を混合することにより調製してもよい。酸として好ましくは、トリフルオロ酢酸、又はトリクロロ酢酸であり、より好ましくはトリフルオロ酢酸である。
　前記酸の使用量としては、上限としては前記光学活性ピロリジンの１０倍重量であり、更に好ましくは５倍重量であり、特に好ましくは３倍重量である。下限としては、前記化合物（１）に対して好ましくは０．００１倍重量であり、更に好ましくは０．０１倍重量であり、特に好ましくは０．１倍重量である。
　前記不斉有機触媒の使用量としては、上限としては、前記化合物（１）に対して好ましくは１０倍重量であり、更に好ましくは５倍重量であり、特に好ましくは１倍重量である。下限としては、前記化合物（１）に対して好ましくは０．００１倍重量であり、更に好ましくは０．０１倍重量であり、特に好ましくは０．１倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
　前記還元剤としては、水素ガス、蟻酸、蟻酸ナトリウム、蟻酸トリエチルアンモニウム、１，４－ジヒドロピリジン誘導体等が挙げられるが、好ましくは１，４－ジヒドロピリジン誘導体である。前記１，４－ジヒドロピリジン誘導体として更に好ましくは、下記式（６）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
で表わされるＨａｎｔｚｓｈエステル、即ち、Ｄｉｅｔｈｙｌ　１，４－Ｄｉｈｙｄｒｏ－２，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－３，５－ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅである。
　前記還元剤の使用量としては、上限としては、前記化合物（１）に対して好ましくは１００倍重量であり、更に好ましくは５０倍重量であり、特に好ましくは１０倍重量である。下限としては、前記化合物（１）に対して好ましくは０．１倍重量であり、更に好ましくは０．５倍重量であり、特に好ましくは１倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
　本工程の溶媒としては、反応に影響を与えない限りにおいては特に制限はなく、具体的には例えば、水；メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、エチレングリコール等のアルコール系溶媒；テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４－ジオキサン、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン等のエーテル系溶媒；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒；酢酸エチル、酢酸ｎ－プロピル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、メシチレン等の芳香族炭化水素系溶媒；塩化メチレン、１，２－ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ－エチル－２－ピロリドン、Ｎ－メチル－ε－カプロラクタム、ヘキサメチルホスホルアミド等のアミド系溶媒；ジメチルプロピレンウレア等のウレア系溶媒；ヘキサメチルホスホン酸トリアミド等のホスホン酸トリアミド系溶媒等を用いることができる。これらは単独で用いても良く、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その混合比は特に制限されない。好ましくはエーテル系溶媒；エステル系溶媒；芳香族炭化水素系溶媒；ニトリル系溶媒であり、更に好ましくはテトラヒドロフラン、４－メチルテトラヒドロピラン、酢酸エチル、トルエン、又はアセトニトリルであり、特に好ましくはテトラヒドロフラン、トルエン、又はアセトニトリルである。
　前記溶媒の使用量は、上限としては、前記化合物（１）に対して好ましくは１００倍重量であり、更に好ましくは５０倍重量であり、特に好ましくは２０倍重量である。下限としては、前記化合物（１）に対して好ましくは０．１倍重量であり、更に好ましくは０．５倍重量であり、特に好ましくは１倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
　本反応における反応温度には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、副生成物の生成を少なくするため、上限としては好ましくは１５０℃であり、更に好ましくは１００℃であり、特に好ましくは５０℃である。下限としては好ましくは－８０℃であり、更に好ましくは－３０℃であり、特に好ましくは０℃である。
　本反応における反応時間には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、上限としては好ましくは１００時間であり、更に好ましくは５０時間であり、特に好ましくは２５時間である。下限として好ましくは０．１時間であり、更に好ましくは０．５時間であり、特に好ましくは１時間である。
　本工程の化合物（１）、不斉有機触媒、還元剤、溶媒の混合順序については、特に制限はない。
　反応後の処理としては、反応液から生成物を取得するための一般的な処理を行えばよい。例えば、反応終了後の反応液を水、又は塩酸、硫酸等の酸水溶液に加え、一般的な抽出溶媒、例えば酢酸エチル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、トルエン、ヘキサン等を用いて抽出操作を行うとよい。得られた抽出液から減圧加熱等の操作により、反応溶媒及び抽出溶媒を留去すると目的物が得られる。このようにして得られた目的物は、後続工程に使用できる十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。
　続いて、エノンリダクターゼを用いる方法について説明する。
　前記式（１）で表されるエナールの炭素－炭素間二重結合を立体選択的に還元する能力を有するエノンリダクターゼを作用させることで、前記式（２）で表される光学活性アルデヒドを製造する。
　エノンリダクターゼは、エナール（１）のエノン部位の炭素－炭素間二重結合を立体選択的に還元して、光学活性アルデヒド（２）を生成する能力を有するものであればいずれを用いても良い。
　エノンリダクターゼは、目的とする還元活性を有する限りにおいては、酵素そのものだけでなく、当該酵素を生成する微生物の菌体そのもの、微生物の培養液、又は菌体処理物であってもよい。また、当該微生物由来の還元活性を有する酵素をコードするＤＮＡが導入された形質転換体も含むものとする。
　上記微生物の菌体処理物としては特に限定されず、例えば、乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体又は菌体を破砕した無細胞抽出液などを挙げることができる。更には、培養物より不斉還元反応を触媒する酵素を精製し、これを使用してもよい。
　これらは、単独で用いても、２種以上組み合わせて用いても良い。また、これら微生物は周知の方法で固定化して用いてもよい。
　エナール（１）のエノン部位の炭素－炭素間二重結合を立体選択的に還元して光学活性アルデヒド（２）を生成する能力を有するエノンリダクターゼとしては、通常エノンリダクターゼと認識されている旧黄色酵素（Ｏｌｄ　Ｙｅｌｌｏｗ　Ｅｎｚｙｍｅ）を含み、そのようなものとしては、国際生化学・分子生物学連合の酵素分類法によりＥＣ１．６．９９に分類される酸化還元酵素が挙げられる。ＥＣ１．６．９９に分類される酸化還元酵素としては、ＥＣ１．６．９９．１：ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．６．９９．２：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ（キノン）、ＥＣ１．６．９９．３：ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．６．９９．５：ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（キノン）、またはＥＣ１．６．９９．６：ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ（キノン）に分類される酸化還元酵素が挙げられ、好ましくは、ＥＣ１．６．９９．１：ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼである。
　上記ＥＣ１．６．９９．１：ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼとしては、具体的には、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、又はシゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母由来のもの、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等の細菌由来のものが挙げられ、好ましくはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等の微生物に由来するものが挙げられ、最も好ましい例にはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）、バシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）、エルシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ）が含まれる。
　エノンリダクターゼとしては、例えば、ＯＹＥ２、ＯＹＥ３（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）由来。国際公開第２００６／１２９６２８号に記載）、ＫＹＥ（クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）由来。Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．，３４９，１５２１（２００７）に記載）、ＹｑｊＭ（バシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，１９８９１（２００３）に記載）、ＮｅｍＡ（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ　ｃｏｌｉ）由来。Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０，１１０（１９９７）に記載）、ＸｅａＡ、ＸｅｎＥなど（シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）由来。Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７４，６７０３（２００８）に記載）、ＹｅｒｓＥＲ（エルシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）由来。Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．，３４９，１５２１（２００７）に記載）、ＮＣＲ－Ｒ（ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　ｍｏｂｉｌｉｓ）由来。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９８，２２（２００７）に記載）などが含まれ、好ましくは、ＯＹＥ２、ＮｅｍＡ、ＹｅｒｓＥＲ、又はＮＣＲ－Ｒであり、より好ましくはＮｅｍＡ、ＹｅｒｓＥＲ、又はＮＣＲ－Ｒであり、更に好ましくはＮｅｍＡである。
　酵素を生成する微生物は、通常、入手または購入が容易な保存株から得ることができる。例えば、以下のカルチャーコレクションより入手可能である。
・独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部　生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（〒２９２－０８１８　 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）
・独立行政法人理化学研究所　バイオリソースセンター 微生物材料開発室（ＪＣＭ）（〒３５１－０１９８　埼玉県和光市広沢２－１）
・Ｇｅｒｍａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（Ｍａｒｓｃｈｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　１ｂ，Ｄ－３８１２４　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
　また、本発明に利用するエノンリダクターゼ（例えば、ＯＹＥ２）は、目的の還元酵素活性を有している限りにおいては、その公知のアミノ酸配列（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，６０９７－６１０６（１９９３）に記載のＯＹＥ２のアミノ酸配列）において１若しくは複数個（例えば、４０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下）のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたポリペプチドであってもよい。あるいは、そのアミノ酸配列が公知の配列と比較した際に、相同性８５％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、または９９％以上のアミノ酸配列を有していても良い。また、目的の還元酵素活性を有する限り、本発明に利用する還元酵素のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合してもよい。例えばヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また目的の還元酵素活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
　本発明においては、エノンリダクターゼをコードするＤＮＡを含む形質転換体を使用すると、より効率的に光学活性アルデヒド（２）を製造することができる。なお、本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　４ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等の成書に記載されている方法により実施できる。
　上記の形質転換体に用いるベクターとしては、適当な宿主生物内で本発明に利用する還元酵素をコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
　このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第９４／０３６１３号）などが挙げられる。
　なお、「制御因子」とは、機能的プロモーター、及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
　また、「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。なお、制御因子のタイプ及び種類が宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
　各酵素を発現させるために用いる宿主生物は、各酵素をコードするＤＮＡを含む酵素発現ベクターにより形質転換され、ＤＮＡを導入した酵素を発現することができる生物であれば、特に制限するものではない。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ））が特に好ましい。
　本発明に利用する還元酵素をコードするＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入することができる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（以下、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１）コンピテントセル（タカラバイオ社製））を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入することができる。
　エナール（１）のエノン部位の炭素－炭素間二重結合を還元する酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体の例としては、ベクターｐＴＳＹＥ２でＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１を形質転換して得られる、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＴＳＹＥ２）、同様の方法で得られる、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＴＳＹＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＫＹＥ）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＹｑｊＭ）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＮｅｍＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＸｅｎＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＸｅｎＥ）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＹｅｒｓＥＲ）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＮＣＲ－Ｒ）などが挙げられる。
　また、本発明においては、目的とする還元活性を有する酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を用いることにより、より効率的に本発明の光学活性化合物を製造することができる。例えば、エナール（１）のエノン部位の炭素－炭素間二重結合を還元する酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、エナール（１）のエノン部位の炭素－炭素間二重結合を還元する酵素をコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。また、酵素を細胞外へ放出する宿主細胞を用いる場合や、宿主細胞の破砕液などを反応に用いる場合には、エナール（１）のエノン部位の炭素－炭素間二重結合を還元する酵素をコードするＤＮＡと補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをそれぞれ別の宿主細胞へ導入し、これら宿主細胞を同一培養液内または異なる培養液を使って培養してもよい。
　補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、ＮＡＤ+（酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド）もしくはＮＡＤＰ+（酸化型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸）をＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチド）、もしくはＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチドリン酸）に変換する能力を有している酸化還元酵素が好ましい。
　このような酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、グルコース－６－リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素などが挙げられる。好適には、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素が使用される。
　ギ酸脱水素酵素としては、例えば、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クロイッケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、ハイホマイクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アンシロバクター（Ａｎｃｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、などの微生物に由来する酵素が挙げられ、特にチオバシラス・エスピー（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）から得られる酵素が挙げられる。
　グルコース脱水素酵素としては、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属などの微生物に由来する酵素が挙げられ、特にバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバシラス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ペディオコッカス・パーブラス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒｖｕｌｕｓ）から得られる酵素が挙げられる。
　前記酵素としては、例えば、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（特開２００６－２６２７６７号公報）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４，６７２－６７８，（２００２））、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８９，１５９－１６３，（１９８２））、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属（国際公開第２００９／０４１４１５号）由来のグルコース脱水素酵素やクリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来のグルコース－６－リン酸脱水素酵素が知られている（Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２２８，１１３－１１９（１９８４））。
　次に、エノンリダクターゼを用いたエナール（１）の還元反応について説明する。
　エノンリダクターゼを用いた還元反応の際には、適当な溶媒と基質のエナール（１）、上記微生物、その培養物、またはその処理物等の酵素源を混合し、ｐＨ調整下に攪拌、振とうまたは静置する。
　エノンリダクターゼを用いたエナール（１）の還元反応を促進させるために、前記反応液に、ＮＡＤ+及び／またはＮＡＤＰ+をそれぞれの還元型へ還元する酵素と、該還元のための基質を共存させて反応を行うのが好ましい。例えば、還元型へ還元する酵素としてグルコース脱水素酵素、還元のための基質としてグルコースをそれぞれ共存させるか、または、還元型へ還元する酵素としてギ酸脱水素酵素、還元のための基質としてギ酸をそれぞれ共存させるのがよい。
　一般に、生物学的方法による還元反応に必要とされているＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素を添加することにより、反応を促進させることができる。この場合、通常は、反応液に直接これらを添加する。
　更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも、還元反応をより促進することに効果的である。
　また、反応系に有機溶剤を共存させてもよい。酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサン等の水に不溶な有機溶媒を反応液に添加すれば、基質及び／又は還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避できる。また、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加すれば、基質の溶解度を高めることができる。
　反応溶媒としては、通常、水や緩衝液等の水性媒体を用いる。緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液やトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン－塩酸緩衝液が挙げられる。
　酵素源は、通常、上記微生物の菌体を含んだ培養液をそのまま反応に使用する。培養液を濃縮して用いてもよい。また、培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、培養液を遠心分離等により処理して得られる菌体または菌体処理物を使用するとよい。
　基質であるエナール（１）は、反応の初期に一括添加してもよく、反応の進行にあわせて逐次分割して添加してもよい。
　反応時の温度は、上限として好ましくは６０℃であり、更に好ましくは４０℃である。下限としては好ましくは１０℃であり、更に好ましくは２０℃である。
　反応時のｐＨは、上限として好ましくは１０であり、更に好ましくは９である。下限として好ましくは２．５であり、更に好ましくは５である。
　反応液中の酵素源の量は、これらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよく、上限として好ましくは５０％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは１０％（Ｗ／Ｖ）である。下限として好ましくは０．０１％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは０．１％（Ｗ／Ｖ）である。
　反応液中の基質濃度は、上限として好ましくは５０％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは３０％（Ｗ／Ｖ）である。下限として好ましくは０．０１％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは０．１％（Ｗ／Ｖ）である。
　反応は、通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。
　反応時間は、基質濃度、微生物の量及びその他の反応条件により適宜決定される。反応時間の上限として好ましくは３３６時間であり、更に好ましくは１６８時間である。下限として好ましくは０．１時間であり、更に好ましくは１時間である。
　還元反応を促進させるために、反応液にグルコース、エタノール、イソプロパノールなどのエネルギー源を加えるのが好ましい。添加量の上限として好ましくは５０％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは３０％（Ｗ／Ｖ）である。下限として好ましくは０．１（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは０．５％（Ｗ／Ｖ）である。
　還元反応により生成した光学活性アルデヒド（２）を取り出す方法は特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後に、酢酸エチル、トルエン、ｔ－ブチルメチルエーテル、ヘキサン、ｎ－ブタノール、ジクロロメタン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製することにより、高純度の光学活性アルデヒド（２）を容易に得ることができる。
　このようにして得られた光学活性アルデヒド（２）は、いかなる変換方法を用いてラメルテオン（４）に誘導しても本発明の範囲に含まれる。好ましくは、光学活性アルデヒド（２）をプロピオン酸アミドと縮合して還元する方法（工程３）、若しくは光学活性アルデヒド（２）を光学活性アミン（３）に変換した後（工程４）、プロピロオニル化する方法（工程５）である。以下に、各工程について詳細に説明する。
　（工程３）
　本工程では、前記式（２）で表される光学活性アルデヒドをプロピオン酸アミドと縮合して還元することにより、前記式（４）で表されるラメルテオンを製造する。具体的には例えば、Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ　２０１３，３５５，７１７－７３３．に記載の方法に従って、ジグライム溶液中、プロピオンアミド、金属触媒として［Ｒｈ（ＣＯＤ）Ｃｌ］2、配位子としてＸａｎｔｐｈｏｓ（４，５－Ｂｉｓ（ｄｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｏ）－９，９－ｄｉｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｅｎｅ）を共存させ、水素ガスを加えることによって目的物が得られる。
　このようにして得られた目的物は十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。
　（工程４）
　本工程で、前記式（２）で表される光学活性アルデヒドから、前記式（３）で表される光学活性アミンを製造する。ここで、前記光学活性アルデヒド（２）は工程２に記載の方法に従って製造してもよく、又はそれ以外の方法で製造したものであっても本発明の範囲に含まれる。
　具体的な変換方法としては例えば、アンモニアとヒドリド還元剤を用いる方法、アンモニアと金属触媒存在下に水素化する方法、金属触媒存在下に蟻酸を用いる方法、酵素（トランスアミナーゼ）存在下にトランスアミノ化する方法が挙げられる。
　前記アンモニアとヒドリド還元剤を用いる方法については例えば、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，７５，５４７０－５４７７．に記載の方法に従えばよい。即ち、エタノール溶媒中にアンモニア水と酢酸アンモニウムを加えて、シアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元することにより目的物が得られる。
　また、前記アンモニアと金属触媒存在下に水素化する方法については例えば、特許第４０５９９７８号公報に記載の方法に従えばよい。即ち、均一系のニッケル、ロジウム、パラジウム、イリジウム等の遷移金属触媒存在下に、アンモニアガスと水素ガスを加えることにより目的物が得られる。若しくは、Ｃａｔａｌｙｓｔｓ　２０１５，５，２２５８－２２７０．に記載の方法に従ってもよく、即ち、アルミナに担持されたルテニウム触媒存在下に、アンモニアガスと水素ガスを加えることによっても目的物が得られる。
　また、前記金属触媒存在下に蟻酸を用いる方法については例えば、国際公開第２０１６／０９６９０５号に記載の方法に従えばよい。即ち、パラジウム触媒存在下に蟻酸アンモニウムを用いることにより目的物が得られる。
　更に、酵素（トランスアミナーゼ）存在下でトランスアミノ化する方法について説明する。即ち、前記式（２）で表される光学活性アルデヒドに、アミノ基供与体の存在下、前記式（３）で表される光学活性アミンを生成する能力を有するトランスアミナーゼを作用させることで、前記式（３）で表される光学活性アミンを製造する。
　トランスアミナーゼは、光学活性アルデヒド（２）から、アミノ基供与体の存在下、光学活性アミン（３）を生成する能力を有するものであればいずれを用いても良い。また、トランスアミナーゼは、目的とするトランスアミノ化活性を有する限りにおいては、酵素そのものだけでなく、当該酵素を生成する微生物の菌体そのもの、微生物の培養液、または菌体処理物であってもよい。また、当該微生物由来の還元活性を有する酵素をコードするＤＮＡが導入された形質転換体も含むものとする。
　上記微生物の菌体処理物としては特に限定されず、例えば、乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体または菌体を破砕した無細胞抽出液などをあげることができる。更には、培養物より不斉還元反応を触媒する酵素を精製し、これを使用してもよい。これらは、単独で用いても、２種以上組み合わせて用いても良い。
　また、これら微生物は周知の方法で固定化して用いてもよい。固定化方法としては、一般に、担体結合法、架橋法、包括法が挙げられるが、いずれを用いても良い。
　また、前記トランスアミナーゼを、水中で反応させてもよく、有機溶媒中で反応、すなわち反応系に有機溶媒を共存、あるいは、有機溶媒のみを用いて反応させてもかまわない。有機溶媒のみを使用する場合には、若干の水を添加することで反応性が改善することが期待される。溶媒を使用する場合の溶剤としては、グリセロール、エチレングリコール、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール等のアルコール系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒；ｎ－ヘキサン、ｎ－ヘプタン等の脂肪族炭化水素系溶媒；酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒；アセトン、２－ブタノン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒；ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル、エチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２－ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒；等が挙げられる。好ましい溶媒としては、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、ジノルマルプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジノルマルブチルエーテル、メチルイソプロピルエーテル、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル、エチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルが挙げられ、さらに好ましい溶媒としては、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルが挙げられる。
　光学活性アルデヒド（２）から、アミノ基供与体の存在下、光学活性アミン（３）を生成する能力を有するトランスアミナーゼとしては、例えば、国際生化学・分子生物学連合の酵素分類法によりＥＣ２．６．１．Ｘに分類される酵素群が挙げられる。
　本発明の特に好ましい実施形態において、トランスアミナーゼは、一般にω－トランスアミナーゼと呼ばれるものが好ましい。ω－トランスアミナーゼとはαアミノ酸以外のアミンを生成する活性を持つものを示す。
　上記ω－トランスアミナーゼとしては、具体的には、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、等の細菌由来のものが挙げられる。
　好ましくは、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｉｔｒｅｕｓ）、アルカリゲネス・デネトリフィカンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・コルガータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｏｒｒｕｇａｔａ）、メソリゾビウム・エスピー（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｓｐ．）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、ロドバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）が挙げられる。
　最も好ましい例には、アースロバクター・エスピーＫＮＫ１６８（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．ＫＮＫ１６８）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス・エスピーＫＮＫ４２５（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＫＮＫ４２５）、シュードモナス・エスピーＭＶ３７（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＭＶ３７）、ビブリオ・フルビアリスＪＳ１７（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｌｕｖｉａｌｉｓ　ＪＳ１７）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｉｔｒｅｕｓ）、アルカリゲネス・デネトリフィカンスＹ２ｋ－２（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　Ｙ２ｋ－２）、シュードモナス・フルオレッセンスＫＮＫ０８－１８（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　ＫＮＫ０８－１８）、シュードモナス・コルガータ１０Ｆ６（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｏｒｒｕｇａｔａ　１０Ｆ６）、メソリゾビウム・エスピーＬＵＫ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｓｐ．ＬＵＫ）、クロモバクテリウム・ビオラセウムＤＳＭ　３０１９１（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ　ＤＳＭ　３０１９１）、バシラス・メガテリウムＳＣ６３９４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　ＳＣ６３９４）、カウロバクター・クレセンタスＣＢ１５（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ　ＣＢ１５）、ロドバクター・スファエロイデスＤＳＭ　１５８（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ　ＤＳＭ　１５８）などが挙げられる。
　これらのω－トランスアミナーゼは、例えば、Ｉｗａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（２００３）２５，１８４３－１８４６，Ｓｈｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９７）５５，３４８－３５８，Ｓｈｉｎ　ａｎｄ　Ｋｉｍ，Ｂｏｏｋ　ｏｆ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，２１７ｔｈ　ＡＣＳ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ａｎａｈｅｉｍ，Ｃａｌｉｆ．，Ｍａｒｃｈ　２１－２５，（１９９９）１８０，Ｓｈｉｎ　ａｎｄ　Ｋｉｍ，Ｂｉｏｓｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００１）６５，１７８２－１７８８　ａｎｄ　Ｓｈｉｎ　ａｎｄ　Ｋｉｍ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９９８）６０，５３４－５４０，Ｍ．Ｓｈａｈｅｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１２）９４，１１６３－１１７１，Ｓａｍ　ｅｔ　ａｌ．，ＡＣＳ　ｃａｔａｌ．（２０１２）２，９９３－１００１，Ｒｕｄａｔ　ｅｔ　ａｌ．，ＡＭＢ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（２０１２）２：１１，Ｐａｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，（２０１１）１０８，１４７９－１４９３，国際公開第２０１２／１２４６３９号，国際公開第２０１２／０４３６５３号，国際公開第２０１２／０４３６２２号，国際公開第２０１２／００７５４８号，国際公開第２０１１／０２６５５６号等に記載されている。
　これら微生物は、通常、入手または購入が容易な保存株から得ることができる。例えば、以下のカルチャーコレクションより入手可能である。
・独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部　生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）
・独立行政法人理化学研究所　バイオリソースセンター　微生物材料開発室（ＪＣＭ）（〒３５１－０１９８　埼玉県和光市広沢２－１）
・Ｇｅｒｍａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（Ｍａｒｓｃｈｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　１ｂ，Ｄ－３８１２４　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
　また、本発明に利用するトランスアミナーゼは、目的のトランスアミノ化活性を有している限りにおいては、その公知のアミノ酸配列において１、若しくは複数個（例えば、４０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下）のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたポリペプチドであってもよい。あるいは、そのアミノ酸配列が公知のアミノ酸配列に対して相同性８５％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、または９９％以上のアミノ酸配列を有していても良い。また、トランスアミノ化活性を有する限り、本発明に利用する還元酵素のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合してもよい。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、目的の還元酵素活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
　本発明においては、トランスアミナーゼをコードするＤＮＡを含む形質転換体を使用すると、より効率的に光学活性アミン（３）を製造することができる。なお、本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　４ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等の成書に記載されている方法により実施できる。
　上記の形質転換体に用いるベクターとしては、適当な宿主生物内で本発明に利用するトランスアミナーゼをコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
　このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第９４／０３６１３号）などが挙げられる。
　なお、「制御因子」とは、機能的プロモーター、及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
　また、「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。なお、制御因子のタイプ及び種類が宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
　各酵素を発現させるために用いる宿主生物は、各酵素をコードするＤＮＡを含む酵素発現ベクターにより形質転換され、ＤＮＡを導入した酵素を発現することができる生物であれば、特に制限するものではない。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ））が特に好ましい。
　本発明に利用する還元酵素をコードするＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入することができる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（以下、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１）コンピテントセル（タカラバイオ社製））を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入することができる。
　トランスアミナーゼを用いたアミノ化反応は一般的に可逆反応であるため、一般的に平衡点で見かけ上反応が停止する。これらの反応平衡を解消する公知の方法を組み合わせることで、本発明のポリペプチドを用いた反応を改善することができる。例えば、国際公開第２００７／１３９０５５号に記載のように、アミノ基供与体としてアラニンを用いて、副生成するピルビン酸を乳酸脱水素酵素と補酵素再生用のグルコース脱水素酵素を共役させることで乳酸へ変換し、反応平衡を解消する方法が有効である。同様に、アミノ基供与体としてアラニンを用いて、副生成するピルビン酸を、ピルビン酸デカルボキシラーゼで除く方法（国際公開第２００７／０９３３７２号）、アラニン脱水素酵素を用いる方法（ＵＳ２００９／０１１７６２７Ａ１公報）、過酸化水素で除く方法（ＵＳ２００８／０２１３８４５Ａ１公報）、アセト酪酸合成酵素を用いる方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１１），３０３０－３０３３（２００８））、イソプロピルアミンを用いて生成するアセトンを除去する方法なども有効である。
　上記の反応平衡を解消するために複数の酵素を共役させる場合には、それら複数の酵素を同一宿主細胞内で生産する形質転換体を用いることにより、より効率的に本発明の光学活性化合物を製造することができる。当該形質転換体は必要な複数の酵素遺伝子コードするＤＮＡを同一ベクターに組み込み、これを同一の宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる複数のベクターに組み込み、同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。
　アミノ基供与体としては、酵素源の存在下で前記式（３）で表される光学活性アミンを生成するものであればいかなるものでも使用できる。具体例としては、α－フェネチルアミン、２－ブチルアミン、２－ペンチルアミン、２－ヘプチルアミン、３－ヘプチルアミン、ｎ－エチルアミン、ｎ－プロピルアミン、ｎ－ブチルアミン、ｎ－アミルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミン、α－アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン等）、３－アミノ－１－フェニルブタン、ベンジルアミン、β－フェネチルアミン、シクロヘキシルアミンおよびそれらの光学活性体が挙げられる。なかでも、α－フェネチルアミン、イソプロピルアミン、又はα－アミノ酸（例えば、アラニン等）が好ましく、α－フェネチルアミン又はα－アミノ酸がより好ましい。
　ω－トランスアミナーゼとアミノ基供与体の好ましい組み合わせとしては、以下のものが例示される。
１）アミノ基供与体がイソプロピルアミンのときは、好ましくはアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、またはシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）であり、より好ましくはアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）である。
２）アミノ基供与体がα－フェネチルアミンのときは、好ましくはアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、またはシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）であり、より好ましくはアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）、またはシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）であり、更に好ましくはシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）である。
３）アミノ基供与体がα－アミノ酸（特にアラニン）のときは、好ましくはアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、またはシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）であり、より好ましくはアースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．）、またはシュードモナス・エスピーＭＶ３７（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＭＶ３７）である。
　次に、トランスアミナーゼを用いた光学活性アルデヒド（２）のトランスアミノ化反応について説明する。
　酵素源を用いたトランスアミノ化反応の際には、適当な溶媒と基質の光学活性アルデヒド（２）、上記微生物、その培養物、またはその処理物等を混合し、ｐＨ調整下に攪拌、振とうまたは静置する。
　反応溶媒としては、通常、水や緩衝液等の水性媒体を用いる。緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液やトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン－塩酸緩衝液が挙げられる。
　トランスアミナーゼは、上記微生物の菌体を含んだ培養液をそのまま反応に使用してもよいし、培養液を濃縮して用いてもよい。また、培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、培養液を遠心分離等により処理して得られる菌体または菌体処理物を使用するとよい。
　基質である光学活性アルデヒド（２）は、反応の初期に一括添加してもよく、反応の進行にあわせて逐次分割して添加してもよい。
　反応時の温度は、上限として好ましくは６０℃であり、更に好ましくは４０℃である。下限としては好ましくは１０℃であり、更に好ましくは２０℃である。
　反応時のｐＨは、上限として好ましくは１０であり、更に好ましくは９である。下限として好ましくは２．５であり、更に好ましくは５である。
　反応液中の酵素源の量は、これらの基質を還元する能力に応じ適宜決定すればよく、上限として好ましくは５０％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは１０％（Ｗ／Ｖ）である。下限として好ましくは０．０１％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは０．１％（Ｗ／Ｖ）である。
　反応液中の基質濃度は、上限として好ましくは５０％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは３０％（Ｗ／Ｖ）である。下限として好ましくは０．０１％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは０．１％（Ｗ／Ｖ）である。
　反応は、通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。
　反応時間は、基質濃度、微生物の量及びその他の反応条件により適宜決定される。反応時間の上限として好ましくは３３６時間であり、更に好ましくは１６８時間である。下限として好ましくは０．１時間であり、更に好ましくは１時間である。
　還元反応を促進させるために、反応液にグルコース、エタノール、イソプロパノールなどのエネルギー源を加えるのが好ましい。添加量の上限として好ましくは５０％（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは３０％（Ｗ／Ｖ）である。下限として好ましくは０．１（Ｗ／Ｖ）であり、更に好ましくは０．５％（Ｗ／Ｖ）である。
　更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも効果的である。
　更に、基質及び／又は還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避する目的で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒（不水溶性有機溶媒）を反応液に添加してもよい。
　更に、基質の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒（水溶性有機溶媒）を添加することもできる。
　上記の反応により、光学活性アミンが生成する。生成した光学活性アミンは、反応混合液から抽出、蒸留、再結晶、カラム分離など公知の方法によって単離することができる。
　例えば、ｐＨを酸性に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類；ヘキサン、オクタン、ベンゼン等の炭化水素類；塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等一般的な溶媒により、生成した光学活性アミノ化合物を水相に残したまま、未反応の基質およびアミノ基転移反応により生じたアミノ基供与体に対応するケトン化合物を選択的に除くことができる。
　生成した光学活性アミノ化合物および未反応のアミノ基供与体は、例えば、ｐＨを塩基性に調節し、同様に一般的な有機溶媒で抽出することができる。
　生成した光学活性アミノ化合物と未反応のアミノ基供与体は、例えば、蒸留により分離することができる。
　このようにして得られた目的物は、後続工程に使用できる十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、転溶洗浄、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。好ましくは、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、シュウ酸、蟻酸、酢酸、安息香酸、ｐ－ニトロ安息香酸、トリフルオロ酢酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、カンファースルホン酸等の酸と塩を形成させて晶析する方法である。具体的には例えば、国際公開第２００６／０３０７３９号に記載された方法、即ち、前記光学活性アミン（３）の塩酸塩をｎ－ブタノールから晶析する方法である。
　（工程５）
　本工程で、工程４に記載の方法で製造された前記式（３）で表される光学活性アミンを、更にプロピオニル化することにより、前記式（４）で表されるラメルテオンを製造する。
　前記プロピオニル化する方法としては、塩基存在下に塩化プロピオニル、臭化プロピオニル、又は無水プロピオン酸等のプロピオニル化剤を用いればよい。
　前記塩基としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどの無機塩基；リチウムメトキシド、リチウムエトキシド、リチウムイソプロポキシド、リチウムｔｅｒｔ－ブトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウムイソプロポキシド、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、カリウムイソプロポキシド、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド等のアルコキシド；水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化カルシウム等の金属水素化物；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルピロリジン、Ｎ－メチルモルホリン、１，８－ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデク－７－エン、ピリジン、キノリン、イミダゾール等のアミンが挙げられる。これらは単独で用いても良く、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その混合比は特に制限されない。好ましくは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、又はトリブチルアミンであり、更に好ましくは、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、又はトリエチルアミンである。
　前記塩基の使用量としては、上限としては、前記化合物（３）に対して好ましくは１００倍重量であり、更に好ましくは５０倍重量であり、特に好ましくは１０倍重量である。下限としては、前記化合物（３）に対して好ましくは０．１倍重量であり、更に好ましくは０．５倍重量であり、特に好ましくは１倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
　前記プロピオニル化剤の使用量としては、上限としては、前記化合物（３）に対して好ましくは５０倍重量であり、更に好ましくは１０倍重量であり、特に好ましくは５倍重量である。下限としては、前記化合物（３）に対して好ましくは０．５倍重量であり、更に好ましくは０．８倍重量であり、特に好ましくは１倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
　本工程の溶媒としては、反応に影響を与えない限りにおいては特に制限はなく、具体的には例えば、水；テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４－ジオキサン、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、エチレングリコールジメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン等のエーテル系溶媒；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒；酢酸エチル、酢酸ｎ－プロピル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサン等の脂肪族炭化水素系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、メシチレン等の芳香族炭化水素系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒；塩化メチレン、１，２－ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、Ｎ－エチル－２－ピロリドン、Ｎ－メチル－ε－カプロラクタム、ヘキサメチルホスホルアミド等のアミド系溶媒；ジメチルプロピレンウレア等のウレア系溶媒；ヘキサメチルホスホン酸トリアミド等のホスホン酸トリアミド系溶媒等を用いることができる。これらは単独で用いても良く、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その混合比は特に制限されない。好ましくは水；テトラヒドロフラン、メチルテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４－ジオキサン、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、４－メチルテトラヒドロピラン等のエーテル系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒であり、更に好ましくは水、テトラヒドロフラン、アセトン、又はアセトニトリルであり、特に好ましくはテトラヒドロフラン、又はアセトニトリルである。
　前記溶媒の使用量は、上限としては、前記化合物（３）に対して好ましくは１００倍重量であり、更に好ましくは５０倍重量であり、特に好ましくは２０倍重量である。下限としては、前記化合物（３）に対して好ましくは０．１倍重量であり、更に好ましくは０．５倍重量であり、特に好ましくは１倍重量である。このような範囲であれば、コストも掛かりすぎず、後処理も簡便である。
　本反応における反応温度には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、副生成物の生成を少なくするため、上限としては好ましくは１５０℃であり、更に好ましくは１００℃であり、特に好ましくは５０℃である。下限としては好ましくは－８０℃であり、更に好ましくは－３０℃であり、特に好ましくは０℃である。
　本反応における反応時間には特に制限はなく、適宜設定すればよいが、上限としては好ましくは１００時間であり、更に好ましくは５０時間であり、特に好ましくは２５時間である。下限として好ましくは０．１時間であり、更に好ましくは０．５時間であり、特に好ましくは１時間である。
　本工程の化合物（３）、プロピオニル化剤、塩基、溶媒の混合順序については、特に制限はない。
　反応後の処理としては、反応液から生成物を取得するための一般的な処理を行えばよい。例えば、反応終了後の反応液を水、又は塩酸、硫酸等の酸水溶液に加え、一般的な抽出溶媒、例えば酢酸エチル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、トルエン、ヘキサン等を用いて抽出操作を行う。得られた抽出液から減圧加熱等の操作により、反応溶媒及び抽出溶媒を留去すると目的物（４）が得られる。好ましくは、反応液に水を加えることで析出する目的物を濾別し、水、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、塩化メチレン、トルエン、ヘプタン等で洗浄するとよい。このようにして得られた目的物であるラメルテオン（４）は十分な純度を有しているが、純度を更に高める目的で、晶析、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等の一般的な精製手法により、更に純度を高めてもよい。
　本願は、２０１７年５月１０日に出願された日本国特許出願第２０１７－０９４２０１号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１７年５月１０日に出願された日本国特許出願第２０１７－０９４２０１号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下に、実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例は本発明を何ら限定するものではない。
　（実施例１）　（Ｅ）－２－［１，２，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅの製造
　（Ｅ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌｉｄｅｎｅ）ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（純度：９７．６重量％、２５２．５ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）、トルエン（１０ｍＬ）からなる溶液を－７０℃に冷却し、ここに水素化ジイソブチルアルミニウム／トルエン溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ、２．５ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）を１５分で滴下した。２５℃まで自然に昇温させながら１６時間攪拌した後、酢酸エチル（５ｍＬ）を添加した（反応収率：７５％）。水（３０ｍＬ）、トルエン（２０ｍＬ）、濃塩酸（５ｍＬ）を加えて抽出した。水層を更にトルエン（２０ｍＬ）で２回抽出し、有機層を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、濾液から減圧下に溶媒を留去し、残査にヘキサン（１０ｍＬ）を加えて晶析した。結晶を減圧濾別し、ヘキサン（１０ｍＬ）で洗浄後、真空乾燥することにより標題化合物を赤色固体として得た（６８．７ｍｇ、純度：９３．８重量％、単離収率：２６％）。
1Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１０．０５（１Ｈ，ｄ）、７．１３（１Ｈ，ｄ）、６．９０（１Ｈ，ｄ）、６．３３（１Ｈ，ｄ）、４．６７（２Ｈ，ｄｄ）、３．４１（２Ｈ，ｄｄ）、３．３３（２Ｈ，ｍ）、３．１０（２Ｈ，ｍ）
　（実施例２）　（Ｓ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅの製造
　（Ｅ）－２－［１，２，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（４００ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、Ｄｉｅｔｈｙｌ　１，４－Ｄｉｈｙｄｒｏ－２，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－３，５－ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（６０８ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）、（Ｒ）－２－（ジフェニルメチル）ピロリジン（４７．５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（３ｍＬ）、トリフルオロ酢酸（２２．８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）からなる溶液を２０℃、１６時間攪拌した（反応収率：８０％）。反応液を減圧濃縮後、得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、標題化合物を淡黄色油状物として得た（２６０．０ｍｇ、純度：９３．３％、単離収率：６０％、光学純度：８５．２％ｅｅ）。
1Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ９．８５（１Ｈ，ｓ）、６．９８（１Ｈ，ｄ）、６．６４（１Ｈ，ｄ）、４．６０－４．５２（２Ｈ，ｍ）、３．７０（１Ｈ，ｍ）、３．１５－３．０９（２Ｈ，ｍ）、２．９０－２．８１（３Ｈ，ｍ）、２．８１－２．６１（１Ｈ，ｍ）、２．５０－２．４０（１Ｈ，ｍ）、１．７６－１．７０（１Ｈ，ｍ）
　（光学純度分析条件）
　カラム：ダイセルキラルセルＯＤ－Ｈ　４．６×２５０ｍｍ
　溶離液：エタノール／ヘキサン＝２／９８（ｖ／ｖ）
　カラム温度：３０℃
　流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ．
　検出器：ＵＶ２１０ｎｍ
　保持時間：Ｓ体＝１４．１分、Ｒ体＝１７．６分
　（実施例３～２０）　（Ｓ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅの製造
　（Ｅ）－２－［１，２，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（２００ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、Ｄｉｅｔｈｙｌ　１，４－Ｄｉｈｙｄｒｏ－２，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－３，５－ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（３０４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）に溶媒、不斉有機触媒、酸を加えて、種々条件を変えて実施した結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＣＡ：トリクロロ酢酸
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
４－ＭＴＨＰ：４－メチルテトラヒドロピラン
ＤＭＡ：ジメチルアセトアミド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　（実施例２１～２４）　（Ｓ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅの製造
　（Ｅ）－２－［１，２，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（０．０５ｍｍｏｌ）、Ｄ－グルコース（０．１５ｍｍｏｌ）、ＮＡＤ+（０．０５μｍｏｌ）、ＮＡＤＰ+（０．０５μｍｏｌ）、を下記に示すエノンリダクターゼとグルコース脱水素酵素の存在下でリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬ中で、３０℃で一晩攪拌した。その結果を以下に示す。なお、（Ｓ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅへの変換率は、反応液２００μＬを酢酸エチル１ｍＬで抽出した後、下記条件のガスクロマトグラフィーで確認した。光学純度は下記条件にて分析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　（変換率分析条件）
　カラム：ＲＥＳＴＥＫ社、Ｒｔｘ（登録商標）－３５　Ａｍｉｎｅ　３０ミリ×０．２５ｍｍ　ＩＤ
　溶離液：エタノール／ヘキサン＝２／９８（ｖ／ｖ）
　カラム温度：２２０℃
　インジェクター温度：２００℃
　ディテクター温度：２００℃
　キャリアガス：Ｈｅ（１５０ｋＰａ）
　検出：ＦＩＤ
　（光学純度分析条件）
　カラム：ダイセルキラルセルＯＤ－Ｈ　４．６×２５０ｍｍ
　溶離液：エタノール／ヘキサン＝２／９８（ｖ／ｖ）
　カラム温度：３０℃
　流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ．
　検出器：ＵＶ２１０ｎｍ
　（実施例２５）　（Ｓ）－２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅの製造
　（Ｓ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（純度：９４．２重量％、３６０ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）、酢酸アンモニウム（２．５９ｇ、３３．６ｍｍｏｌ）、エタノール（３０ｍＬ）、２５重量％アンモニア水（１０ｍＬ）からなる溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム３１７ｍｇ（５．０ｍｍｏｌ）を２５℃で加え、７０℃に昇温して６時間攪拌した。室温まで冷却後、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液（１．３４４ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）を加え、減圧下にエタノールを留去した。得られた残査に４－メチルテトラヒドロピラン（１５ｍＬ×２回）を加えて抽出し、有機層を合わせて飽和食塩水１０ｍＬで２回洗浄、減圧濃縮することにより黄色油状物（８１０．０ｍｇ）を得た（純度：１２．３重量％、収率：２９％）。
　続いて、転溶洗浄操作により精製を行った。前記黄色油状物（８１０．０ｍｇ）に酢酸エチル（１０ｍＬ）と水（５ｍＬ）を加え、濃塩酸でｐＨ＝０．１に調整した。有機層を分離後、水層に３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝１２に調整し、酢酸エチル（１０ｍＬ）で２回抽出した。有機層を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮することにより、標題化合物を無色油状物として得た（純度：９３．３重量％、転溶洗浄回収率：９７％）。
　1Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ６．８７（１Ｈ，ｄ）、６．５３（１Ｈ，ｄ）、４．５１－４．４２（２Ｈ，ｍ）、３．１６－３．０３（３Ｈ，ｍ）、２．８０－２．６７（４Ｈ，ｍ）、２．１５（１Ｈ，ｍ）、１．９３－１．８７（３Ｈ，ｍ）、１，７０（１Ｈ，ｍ）、１．５０（１Ｈ，ｍ）
　（実施例２６）　（Ｓ）－２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅの製造
　（Ｓ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（０．０５ｍｍｏｌ）、α－ｐｈｅｎｅｔｙｌａｍｉｎｅ（０．０７５ｍｍｏｌ）、ピリドキサルリン酸（０．５μｍｏｌ）、をω－トランスアミナーゼの存在下、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬ中で、３０℃で一晩攪拌した。反応終了後、反応液２００μＬを３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝１２に調整し、酢酸エチル１ｍＬで抽出した後、下記条件のガスクロマトグラフィーで分析したところ、（Ｓ）－２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ)ｅｔｈａｎａｍｉｎｅが生成していた。
　（変換率分析条件）
　カラム：ＲＥＳＴＥＫ社、Ｒｔｘ（登録商標）－３５　Ａｍｉｎｅ　３０ミリ×０．２５ｍｍ　ＩＤ
　カラム温度：２２０℃
　インジェクター温度：２００℃
　ディテクター温度：２００℃
　キャリアガス：Ｈｅ（１５０ｋＰａ）
　検出：ＦＩＤ
　（実施例２７）　ω－トランスアミナーゼ発現大腸菌の凍結乾燥菌体調製
　以下のω－トランスアミナーゼ遺伝子、酵素Ａ：アースロバクター・エスピーＫＮＫ１６８（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．ＫＮＫ１６８）（特許第５４１００８９号公報、配列番号２５）、酵素Ｂ：シュードモナス・エスピーＫＮＫ４２５（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＫＮＫ４２５）（特許第５４１００８９号公報、配列番号２）、酵素Ｃ：シュードモナス・フルオレッセンスＫＮＫ０８－１８（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）（特許第５４１００８９号公報、配列番号５）、酵素Ｄ：シュードモナス・エスピーＭＶ３７（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＭＶ３７）（特許第５８７８８７１号公報、配列番号２）、酵素Ｅ：ビブリオ・フルビアリスＪＳ１７（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｌｕｖｉａｌｉｓ　ＪＳ１７）（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６１．４６３－４７１（２００３）に記載の配列）、をｐＵＣＮＴ（国際公開第９４／０３６１３号）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とマルチクローニングサイトの間に挿入し、組換えベクターを得た。組換えベクターを用いて大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（タカラバイオ株式会社製）を形質転換し、組換え大腸菌を得た。得られた組換え大腸菌を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ　０．５％、ｐＨ７．０）で培養し、菌体を回収した。得られた菌体をドライアイスを溶解したメタノール中で凍結させた後、凍結乾燥機（東京理化器械、ＦＤＳ－１０００）で終夜乾燥させ、凍結乾燥菌体を取得した。
　（実施例２８）　ω－トランスアミナーゼを用いた（Ｓ）－２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅの製造（水中反応、１酵素法）
　（Ｓ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（０．０５ｍｍｏｌ）、アミノ基供与体（（Ｓ）－α－ｐｈｅｎｅｔｙｌａｍｉｎｅ（０．０７５ｍｍｏｌ）（以下、Ｓ－ＰＥＡ）、あるいは、（Ｒ）－α－ｐｈｅｎｅｔｙｌａｍｉｎｅ（０．０７５ｍｍｏｌ）（以下、Ｒ－ＰＥＡ）、あるいは、イソプロピルアミン（０．３７５ｍｍｏｌ）（以下、ＩＳＰＡ））、ピリドキサルリン酸（０．５μｍｏｌ）、とω－トランスアミナーゼの凍結乾燥菌体（酵素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのいずれか）５ｍｇを加えたリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）０．５ｍＬ中で、３０℃で一晩攪拌して反応した。反応終了後、反応液２００μＬを３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝１２に調整し、酢酸エチル１ｍＬで抽出した後、実施例２６と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析した結果を表４に示す。その結果、全ての酵素で（Ｓ）－２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅが生成していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　（実施例２９）　ω－トランスアミナーゼを用いた（Ｓ）－２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅの製造（水中反応、３酵素法）
　国際公開第２００７／１３９０５５号の実施例１３に記載のペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）ＪＣＭ８７９７株由来のＬ－乳酸脱水素酵素ＰＡＬＤＨとバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３０由来グルコース脱水素酵素ＧＤＨを共発現する組換え大腸菌を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ　０．５％、ｐＨ７．０）で培養し、遠心分離により集菌した。得られた菌体をドライアイスを溶解したメタノール中で凍結させた後、凍結乾燥機（東京理化器械、ＦＤＳ－１０００）で終夜乾燥させ、ＰＡＬ・ＧＤＨ凍結乾燥菌体を取得した。
　（Ｓ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（５０μｍｏｌ）、アミノ基供与体（Ｌ－アラニン（５６１μｍｏｌ）、あるいは、Ｄ－アラニン（５６１μｍｏｌ））、ピリドキサルリン酸（０．５μｍｏｌ）、Ｄ－グルコース（３３３μｍｏｌ）、ＮＡＤ+（１．３μｍｏｌ）と、ω－トランスアミナーゼ凍結乾燥菌体（酵素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのいずれか）５ｍｇ、ＰＡＬ・ＧＤＨ凍結乾燥菌体２．５ｍｇを加えたリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬ中で、３０℃で４時間攪拌した。
　反応終了後、反応液２００μＬに３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝１２に調整し、酢酸エチル１ｍＬで抽出した後、実施例２６と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析した結果を表５に示す。その結果、全ての酵素で（Ｓ）－２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅが生成していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　（実施例３０）　ω－トランスアミナーゼを用いた（Ｓ）－２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅの製造（溶媒中反応）
　（Ｓ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ（０．０５ｍｍｏｌ）、アミノ基供与体（（Ｓ）－α－ｐｈｅｎｅｔｙｌａｍｉｎｅ（０．０７５ｍｍｏｌ）（Ｓ－ＰＥＡ））を、ｐＨ７．５に調整した０．５Ｍピリドキサルリン酸水溶液０．５μＬとω－トランスアミナーゼ凍結乾燥菌体（酵素Ｄ）５ｍｇを加えた水飽和ＭＴＢＥ０．５ｍＬ中で、３０℃で３時間攪拌して反応した。反応終了後、反応液を実施例２６と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析した結果を表６に示す。その結果、（Ｓ）－２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅが生成していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
　（実施例３１）　酵素フローリアクターを用いた（Ｓ）－２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅの製造
　ダイヤイオンＨＰ２ＭＧ（三菱ケミカル社製）７．５ｇを７．５ｍＬの０．１ＭＫＰＢ（リン酸カリウム緩衝液）（ｐＨ７．５）で２回洗浄した後に、ＴＰＭの凍結乾燥菌体２５０ｍｇとＰＬＰ（ピリドキサルリン酸）２０ｍｇを溶解させた１０ｍＬの０．１ＭＫＰＢ（ｐＨ７．５）を加えて、室温で２時間攪拌した。ピペットで水分を除去した後に、窒素を吹きかけて湿気がなくなるまで乾燥させ、酵素固定化樹脂を調製した。除去した水分中のタンパク含量を測定したところ、添加したタンパクの３８％が樹脂に吸着していた。
　当該固定化樹脂をΦ５ｍｍ×５０ｍｍのガラス管に詰めて固定化樹脂カラムを作製した。
　Ａ液として、１００ｍＭの（Ｓ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅのＭＴＢＥ溶液、Ｂ液として、水飽和させたＭＴＢＥ溶液を用いて調製した１００ｍＭ（Ｓ）－α－ｐｈｅｎｅｔｙｌａｍｉｎｅ溶液を調製した。シリンジポンプ（ＹＳＰ－１０１、ＹＭＣ社製）を用いて、Ａ液、Ｂ液、それぞれを０．０２５ｍＬ／ｍｉｎで送液し、Ｔ字型の混合部で混合させ、３０℃に保温された固定化樹脂カラムに通液した。溶出された反応液を実施例２６と同じ条件のガスクロマトグラフィーで分析し、（Ｓ）－２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅと（Ｓ）－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅの比から変換率を算出した。その結果を表７及び図１に示す。送液開始４０分から１８０分にかけて安定して目的化合物への変換活性が持続した。
　なお、酵素フローリアクターを用いたラメルテオン製造の実用化の際には、カラム長の延長や、通液回数の増加、流速の低減等の方法により変換率をより高くして使用することも可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
　（実施例３２）　ラメルテオン（（Ｓ）－Ｎ－［２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈｙｌ］ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ）の製造
　（Ｓ）－２－（１，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌ）ｅｔｈａｎａｍｉｎｅ（純度：９３．３重量％、６０．０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（５ｍＬ）、トリエチルアミン（５６ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、塩化プロピオニル（３１ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）からなる溶液を２５℃、１時間攪拌した。水（５ｍＬ）を加えて均一溶液とした後、減圧下にアセトニトリルを留去した。残査に酢酸エチル（１５ｍＬ）を加えて抽出し、有機層を更に水（５ｍＬ）で２回洗浄、減圧濃縮することにより白色固体を得た（７５．９ｍｇ、純度：８９．３重量％、反応収率：９５％、光学純度：８３．５％ｅｅ）。
　前記白色固体（６０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）に酢酸エチル（１ｍＬ）を加えて溶解し、ヘキサン（５ｍＬ）を加えて晶析を行った。５℃に冷却して３０分攪拌後、結晶を減圧濾別し、ヘキサン（５ｍＬ）で洗浄、真空乾燥することにより標題化合物を白色結晶として得た（３８．１ｍｇ、純度：９７．３重量％、晶析回収率：９７％、光学純度：９７．９％ｅｅ）。
　1Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ６．９５（１Ｈ，ｄ）、６．６１（１Ｈ，ｄ）、５．４（１Ｈ，ｂｒｓ）、４．５９（１Ｈ，ｄｄ）、４．５５（１Ｈ，ｄｄ）、３．３６（２Ｈ，ｍ）、３．２４－３．１０（３Ｈ，ｍ）、２．８９（１Ｈ，ｄｄ）、２．７７（１Ｈ，ｄｄ）、２．２０（１Ｈ，ｍ）、２．１７（２Ｈ，ｑ）、２．０３（１Ｈ，ｍ）、１．８５（１Ｈ，ｍ）、１．８２（１Ｈ，ｍ）、１．１４（３Ｈ，ｔ）
　（光学純度分析条件）
　カラム：ダイセルキラルセルＯＤ－Ｈ　４．６×２５０ｍｍ
　溶離液：エタノール／ヘキサン＝１／９（ｖ／ｖ）
　カラム温度：３０℃
　流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ．
　検出器：ＵＶ２１０ｎｍ
　保持時間：Ｓ体＝１２．３分、Ｒ体＝１６．０分

Claims (14)

  1. 　下記式（１）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    で表されるエナールを不斉還元することにより、下記式（２）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    で表される光学活性アルデヒドを製造し、続いてこれを下記式（４）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    で表されるラメルテオンに変換することを特徴とするラメルテオンの製造法。
  2. 　前記不斉還元が、下記式（５）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    （式中、Ｒは置換基を有しても良い炭素数１～２０のアルキル基、置換基を有しても良い炭素数２～２０のアルケニル基、置換基を有しても良い炭素数７～２０のアラルキル基、置換基を有しても良い炭素数６～２０のアリール基、カルボキシル基、又は１Ｈ－テトラゾール基を表す。＊は不斉炭素原子を表す。Ａ-はカウンター陰イオンを表す。）で表される光学活性ピロリジン塩誘導体を不斉有機触媒に用いて、下記式（６）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    で表わされるＨａｎｔｚｓｈエステルを還元剤に用いて行うことを特徴とする、請求項１に記載のラメルテオンの製造法。
  3. 　前記光学活性ピロリジン塩誘導体（５）において、Ｒがジフェニルメチル基、（トリメチルシリルオキシ）ジフェニルメチル基、又は（ヒドロキシ）ジフェニルメチル基であり、絶対立体配置がＲ体であり、Ａ-がトリクロロアセテート、又はトリフルオロアセテートである、請求項２に記載のラメルテオンの製造法。
  4. 　前記不斉還元がエノンリダクターゼを用いて行うことを特徴とする、請求項１に記載のラメルテオンの製造法。
  5. 　前記エノンリダクターゼがＯＹＥ２、ＮｅｍＡ、ＹｅｒｓＥＲ、ＮＣＲ－Ｒである、請求項４に記載のラメルテオンの製造法。
  6. 　前記光学活性アルデヒド（２）を、下記式（３）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    で表される光学活性アミンに変換した後、これをプロピオニル化することを特徴とする、請求項１～５のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
  7. 　前記光学活性アミン（３）に変換する方法が、アミノ基供与体の存在下、トランスアミナーゼを用いて行うことを特徴とする、請求項６に記載のラメルテオンの製造法。
  8. 　前記アミノ基供与体がイソプロピルアミンであり、前記トランスアミナーゼがω－トランスアミナーゼである、請求項７に記載のラメルテオンの製造法。
  9. 　前記アミノ基供与体がα－フェネチルアミンであり、前記トランスアミナーゼがω－トランスアミナーゼである、請求項７に記載のラメルテオンの製造法。
  10. 　前記アミノ基供与体がα－アミノ酸であり、前記トランスアミナーゼがω－トランスアミナーゼである、請求項７に記載のラメルテオンの製造法。
  11. 　前記トランスアミナーゼを有機溶媒中で反応させる、請求項７～１０のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
  12. 　樹脂に固定化された前記トランスアミナーゼを有機溶媒中で反応させる、請求項７～１１のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
  13. 　前記エナール（１）が、下記式（７）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    で表されるα，β－不飽和ニトリルとヒドリド還元剤を反応させて製造したものである、請求項１～１２のいずれかに記載のラメルテオンの製造法。
  14. 　下記式（１）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    で表されるエナール（（Ｅ）－２－［１，２，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８Ｈ－ｉｎｄｅｎｏ［５，４－ｂ］ｆｕｒａｎ－８－ｙｌｉｄｅｎｅ］ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）。
     
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