WO2018135593A1 - 細胞の製造方法および細胞を製造するためのキット - Google Patents
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- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
Definitions
- the present invention relates to a method for producing cells and a kit for producing cells.
- cells are cultured on the surface of a cell culture substrate such as a glass substrate.
- a substance for example, a proteolytic enzyme such as trypsin or a chemical
- enzyme treatment and chemical treatment are not only complicated, but also point out disadvantages such as increased possibility of contamination and that the cells themselves may be denatured and their original functions may be impaired. Yes.
- UCST upper critical solution temperature
- LCST lower critical solution temperature
- Elastic modulus B / elastic modulus A The water repellent layer at the contact portion between the water repellent layer and the phosphate buffered saline measured by bringing the water repellent layer into contact with the phosphate buffered saline. Ratio of the elastic modulus B of the water-repellent layer at the contact portion of the water-repellent layer with the solvent, measured by bringing the water-repellent layer and the solvent into contact with each other.
- the base material body is composed of a substrate or a granular carrier, and the culturing step arranges the cell culture base material on a bottom surface of a container in which a liquid medium is accommodated, and cells on the water-repellent layer
- the production method according to (1) which is a step of culturing.
- the base material body constitutes at least part of the bottom of the container, and the culturing step is a step of culturing cells on the water-repellent layer disposed in the container in which a liquid medium is accommodated.
- the material of the water repellent layer is a resin selected from the group consisting of a fluororesin, an acrylic resin, and a silicone resin.
- the fluororesin is a polymer having units derived from fluoroalkyl methacrylate or fluoroalkyl acrylate.
- the acrylic resin is a polymer having a unit derived from alkyl methacrylate or alkyl acrylate.
- the fluorine-containing solvent is a fluorine-containing solvent selected from the group consisting of fluorine-containing alkanes, fluorine-containing olefins, fluorine-containing alkyl ethers, fluorine-containing alkylamines, and fluorine-containing aromatic compounds, (10) or (11) The manufacturing method as described. (13) The production method according to any one of (1) to (8), wherein the solvent is a solvent that is phase-separated from the liquid medium used for culturing in the culturing step and has a specific gravity lower than that of the liquid medium. .
- Elastic modulus B / elastic modulus A elasticity of the water repellent layer at a contact portion between the water repellent layer and phosphate buffered saline measured by bringing the water repellent layer and phosphate buffered saline into contact with each other.
- recover the cell cultured on the cell-culture base material more simply can be provided.
- the kit used with the said manufacturing method can be provided.
- FIG. 1 It is a figure for demonstrating the culture
- the water repellent layer is a layer in which the mobility of the polymer chain is limited in water, and the water contact angle on the surface of the water repellent layer defined here is 30 degrees or more.
- the material of the water repellent layer in the present invention comprises a water repellent or hydrophobic resin. Further, the material of the water repellent layer is substantially water-insoluble.
- acrylic resin refers to a resin comprising a polymer having units derived from a monomer having a methacryloyl group or an acryloyl group.
- Typical acrylic resins are alkyl methacrylate homopolymers and copolymers.
- the acrylic resin having a fluorine atom is included in the category of the fluororesin.
- the “substrate body” is a separate body from the culture container, and may be disposed in the culture container and in contact with the liquid medium, or the culture container itself in contact with the liquid medium. It may have a portion (usually a portion constituting the inner bottom surface of the culture vessel and its periphery).
- the “water-repellent layer disposed on the base body” is a surface layer made of a water-repellent or hydrophobic material formed on the surface of the base body that contacts the liquid medium.
- the cell culture substrate (that is, the substrate main body having a water-repellent layer) in the present invention is usually composed of a planar body such as a sheet or a film or culture containers of various shapes.
- the present invention is not limited to this, and it may be a granular cell culture substrate having a water repellent layer formed on the surface thereof.
- culturing using a base body that is a separate body from the culturing vessel will be described, and then the other embodiments described above will be described.
- the solvent defined by the elastic modulus B / elastic modulus A is also referred to as “specific solvent” unless otherwise specified.
- 1st Embodiment of the manufacturing method (cell culture method) of this invention has the following culture
- the procedure of this embodiment will be described with reference to the drawings.
- the culturing step is a step of culturing cells on a water-repellent layer in a cell culture substrate by disposing a cell culture substrate on the bottom of a container in which a liquid medium is accommodated. More specifically, as shown in FIG. 1, a cell culture substrate 16 having a substrate 12 and a water repellent layer 14 is disposed on the bottom surface of the container 10 in which the liquid medium L is accommodated. 14 is a step of culturing the cell C on 14.
- substrate 12 corresponds to a base-material main body.
- the cell culture substrate has a substrate and a water-repellent layer disposed on the substrate, and cells are cultured on the water-repellent layer.
- substrate is not restrict
- the surface of the glass substrate and the metal substrate is usually hydrophilic.
- the surface of the resin substrate is both hydrophilic and water repellent (which also means hydrophobicity).
- the resin of the resin substrate only needs to have a solubility in a specific solvent of less than 1 mg / g as compared with the material of the water repellent layer.
- a glass substrate is preferable from the viewpoint of handleability.
- the thickness of the substrate is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 20 mm, more preferably 0.1 to 10 mm.
- the material which comprises a water repellent layer is not restrict
- the acrylic resin is preferably a polymer having units derived from alkyl methacrylate or alkyl acrylate, and the alkyl group preferably has 1 to 10 carbon atoms.
- Specific examples include homopolymers and copolymers of alkyl methacrylate and alkyl acrylate. In particular, homopolymers and copolymers of methyl methacrylate are preferred.
- the fluororesin is a resin containing fluorine atoms.
- the fluororesin include polymers having units derived from fluoroalkyl methacrylate or fluoroalkyl acrylate.
- the number of carbon atoms of the fluoroalkyl group is preferably 3 or more, and more preferably 5 or more.
- the upper limit of the carbon number of the fluoroalkyl group is not particularly limited, but 10 is preferable.
- As the fluoroalkyl group a fluoroalkyl group having a perfluoroalkyl portion and an alkylene portion (a portion having no fluorine atom) is preferable.
- the perfluoroalkyl moiety preferably has 1 to 6 carbon atoms, and the alkylene moiety preferably has 2 to 4 carbon atoms.
- the water repellent layer is preferably fixed on the substrate.
- the fixed form include a form in which the water repellent layer is chemically fixed. More specifically, the chemically fixed form includes a form in which the material (for example, resin) constituting the water-repellent layer and the substrate are bonded through a covalent bond. Such a form can be formed by a graft polymerization method described later. Further, the water repellent layer may be bonded to the substrate through a non-covalent bond. Non-covalent bonds include electrostatic interactions and ⁇ - ⁇ interactions.
- the water repellent layer may have a three-dimensional crosslinked structure.
- the water repellent layer has such a structure, elution of components constituting the water repellent layer into a solvent other than water added in the recovery step described later is suppressed.
- the formation method in particular of a water repellent layer is not restrict
- a method for forming a water-repellent layer by bringing a composition for forming a water-repellent layer containing a material (for example, resin) constituting the water-repellent layer into contact with a substrate and performing a curing treatment as necessary.
- a polymerization initiator is introduced onto the surface of the substrate, a polymerization reaction is started from the polymerization initiator, and a polymer chain is synthesized on the substrate, so-called Graft polymerization is preferred.
- the graft polymerization method known procedures can be referred to.
- a polymerization initiator is fixed on the surface of the substrate via a covalent bond.
- the type of the functional group used for fixing the polymerization initiator is not particularly limited, and examples thereof include a method of fixing the polymerization initiator via an amino group on the substrate surface.
- the substrate on which the polymerization initiator is fixed and the monomer are brought into contact with each other to initiate a polymerization reaction, whereby a polymer chain extending from the substrate is synthesized. That is, the obtained water-repellent layer includes a polymer chain having one end bonded to the substrate through a chemical bond.
- graft polymerization method there is also a grafting method in which a polymer chain having a site that forms a chemical bond with a substrate at a terminal or a part of a side chain is reacted with a functional group of the substrate to directly fix the polymer chain to the substrate. It is done.
- a method for bonding substrates through non-covalent bonds a method of coating a block polymer containing a polymer unit having a strong interaction with the substrate can be mentioned.
- the thickness of the water repellent layer is not particularly limited, but is preferably 5 nm or more and more preferably 20 nm or more from the viewpoint of cell detachability.
- the upper limit is not particularly limited, but 100 ⁇ m is preferable.
- the water repellent layer is preferably disposed on the entire surface of at least one main surface of the substrate. If necessary, other layers may be disposed between the substrate and the water repellent layer. For example, a primer layer or the like for increasing the adhesion between the two may be disposed.
- the liquid medium can be appropriately selected from commonly used cell culture media according to the cells to be cultured, the purpose, and the like.
- Examples of the normal cell culture medium include Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), MEM- ⁇ , RPMI 1640, and the like.
- DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
- MEM- ⁇ MEM- ⁇
- RPMI 1640 RPMI 1640
- the concentration of these additives may be a concentration that is usually used.
- serum can be 5 to 10% by volume of the medium amount.
- the liquid medium often contains water. In general, a liquid medium is obtained by dissolving nutrients in water.
- cells The type of cells cultured on the water repellent layer is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose and the like. Examples of cells include mammalian cells including humans, and specific examples include somatic cells, progenitor cells thereof, and mixed cells thereof.
- cells include endothelial cells, mesenchymal stem cells, adipose-derived stem cells, umbilical cord blood-derived stem cells, dental pulp stem cells, cardiomyocytes, heart wall cells, hepatocytes, fibroblasts, osteoblasts, vascular endothelial cells, liver
- examples include progenitor cells, mesenchymal cells, islet cells, chondrocytes, epithelial cells, and the like, and at least one cell selected from the group consisting of these is preferable.
- a cell is an adherent cell.
- the adherent cell is a non-floating cell, and is a cell that exhibits adhesion dependency on the surface of the culture vessel during cell proliferation.
- the type of the container is not particularly limited as long as it can accommodate a liquid medium inside and can place a cell culture substrate on the bottom surface.
- the container has at least a bottom surface portion and at least a wall portion extending from the periphery of the bottom surface portion.
- the procedure of the culturing step is not particularly limited as long as cells are cultured on the water-repellent layer.
- a cell culture substrate is placed at a predetermined position in the container.
- a predetermined type of cells is seeded in a container so as to have a predetermined number, and a liquid medium is further added to the container to perform culture. Note that the liquid medium may be added to the container first, and then the cells may be seeded.
- the culture temperature is usually about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
- the culture is performed, for example, in an atmosphere of CO 2 -containing air, and the CO 2 concentration is, for example, 2 to 5%.
- the culture time is, for example, 1 to 10 days.
- the gas to be supplied can be appropriately selected depending on the purpose, and examples thereof include oxygen, nitrogen, nitric oxide, nitrogen dioxide, carbon monoxide, carbon dioxide, hydrogen, and hydrogen sulfide.
- the collecting step is a step of bringing the water-repellent layer and the specific solvent into contact with each other, peeling the cells from the water-repellent layer, and collecting them.
- the collecting step is a step of bringing the water-repellent layer and the specific solvent into contact with each other, peeling the cells from the water-repellent layer, and collecting them.
- the polymer chain P before the water repellent layer 14 comes into contact with the specific solvent used in the recovery step, the polymer chain P is in a contracted state, and the mobility of the polymer chain P is small.
- the liquid medium usually contains water
- the polymer chain in the water-repellent layer tends to be in a contracted state.
- the elastic modulus A of the water-repellent layer measured by bringing the water-repellent layer into contact with water is determined by the polymer chain P in the water-repellent layer as shown in FIG. Represents the elastic modulus in a contracted state.
- the elastic modulus A is an elastic modulus in a state where the mobility of the polymer chain in the water repellent layer is low.
- the compatibility between the polymer chain P in the water repellent layer 14 and the specific solvent is as shown in FIG. Since the compatibility with water is higher, the polymer chain P interacts with the specific solvent, the water repellent layer swells, and the polymer chain P spreads. That is, when the water repellent layer 14 comes into contact with the specific solvent, the mobility of the polymer chain P increases. When the mobility of the polymer chain P is increased in this way, as a result, the cells C on the water repellent layer 14 are separated from the water repellent layer 14.
- the cells that have been on the water repellent layer can be detached.
- the specific solvent is taken into the water-repellent layer and the polymer chain P spreads, and the water-repellent layer
- the elastic modulus of the film changes before and after contact with the specific solvent.
- the elastic modulus B of the water-repellent layer measured by bringing the water-repellent layer and the specific solvent into contact with each other is the polymer chain P in the water-repellent layer as shown in FIG.
- the elastic modulus B is an elastic modulus in a state where the mobility of the polymer chain in the water repellent layer is high.
- the elastic modulus B is lower than the elastic modulus A because the polymer chain is in a spread state. That is, the ratio of the elastic modulus B to the elastic modulus A (elastic modulus B / elastic modulus A) substantially represents a change in mobility before and after the water-repellent layer contacts the specific solvent. Therefore, the ratio (elastic modulus B / elastic modulus A) being equal to or less than a predetermined value means that the mobility of the polymer chain in the water repellent layer is constant due to the contact between the water repellent layer and the specific solvent.
- the combination of the water repellent layer and the specific solvent as described above include a mode in which the water repellent layer includes a fluororesin and a fluorine-containing solvent is used as the specific solvent.
- cells can be easily detached from the cell culture substrate simply by bringing the specific solvent into contact with the water repellent layer. That is, it is not necessary to prepare special equipment such as temperature control equipment as in the prior art, and cells can be easily detached and collected.
- the water repellent layer including a polymer chain having one end fixed on the substrate has been described.
- any water repellent layer exhibiting the above ratio (elastic modulus B / elastic modulus A) may be used.
- the configuration is not particularly limited.
- the above-described water repellent layer having a three-dimensional crosslinked structure may be used.
- an atomic force microscope is used to measure the elastic modulus A and the elastic modulus B.
- the types of devices are as follows. Equipment: Cypher-S manufactured by Oxford Instruments Cantilever holder: Droplet cantilever holder Probe: B1_FMR (manufactured by nanotools, hemispherical tip tip curvature 40 nm)
- the optical lever sensitivity and the spring constant are calibrated using the sapphire substrate measurement and the Sader method.
- the specific solvent used in the recovery step is dropped on the sapphire substrate, and the optical lever sensitivity under each measurement condition is calculated from the force curve measurement on the surface of the sapphire substrate onto which the solvent is dropped.
- the spring constant is calculated by separating the probe from the sample surface by about 1 mm, fixing the calculated optical lever sensitivity, and fitting the thermal noise spectrum (probe vibration spectrum due to thermal fluctuation) by the sadder method.
- phosphate buffered saline is dropped on the water-repellent layer of the cell culture substrate to be measured to form a droplet (convex meniscus) for 30 minutes at room temperature.
- the phosphate buffered saline and the water repellent layer are brought into contact with each other.
- phosphate buffered saline on the water repellent layer is volatilized and decreases, phosphate buffered saline is appropriately dropped.
- the sample surface shape of the portion in contact with the droplets of the water repellent layer is obtained using the above apparatus. After that, determine the indent position avoiding dust and perform force curve measurement.
- indentation is performed at a maximum pushing force of 200 nN and a pushing speed of 1 Hz.
- the elastic modulus A is calculated by fitting the indentation curve with a Hertz model using the analysis software (AR ver13) attached to Cypher-S.
- the probe tip shape is a hemisphere, and the tip curvature is 40 nm.
- the fitting region is appropriately adjusted within a range in which a force is detected and a straight line is maintained after starting to deviate from the baseline.
- the indentation depth is very deep with respect to the thickness of the water repellent layer (specifically, when the elastic modulus is in the kPa range)
- the inclination increases abruptly as the indentation depth increases, and the elastic modulus of the base is increased. As shown.
- the elastic force is calculated by setting the maximum pushing force small and eliminating the influence of the base.
- the phosphate buffered saline used includes KCl (200 mg / L), NaCl (8000 mg / L), KH 2 PO 4 (200 mg / L), and Na 2 HPO 4 (anhyd.) (1150 mg / L).
- Examples of the phosphate buffered saline include D-PBS (-) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a commercial product.
- the elasticity modulus B can be measured by changing the solvent used from a phosphate buffered saline to a specific solvent.
- the elastic modulus B of the water-repellent layer is measured using a fluorine-containing solvent instead of the phosphate buffered saline.
- the ratio (elastic modulus B / elastic modulus A) is 0.2 or less, preferably 0.01 or less, more preferably 0.002 or less, and more preferably 0.001 in terms of better cell detachability. The following is more preferable.
- the lower limit is not particularly limited, but is preferably 0.000001 and more preferably 0.00001 in terms of the affinity between the material constituting the water-repellent layer and the specific solvent.
- the value of the elastic modulus A is not particularly limited, but is preferably 1.0 ⁇ 10 6 to 1.0 ⁇ 10 10 Pa, more preferably 1.0 ⁇ 10 7 to 5.0 in terms of more excellent cell detachability. ⁇ 10 9 Pa is more preferable.
- the value of the elastic modulus B is not particularly limited, but is preferably 2.0 ⁇ 10 6 Pa or less, and more preferably 1.0 ⁇ 10 5 Pa or less in terms of more excellent cell detachability.
- the lower limit is not particularly limited, but 1.0 ⁇ 10 2 Pa is preferable.
- the specific solvent As a suitable combination of the water repellent layer and the specific solvent satisfying the relationship of the above ratio (elastic modulus B / elastic modulus A), fluororesin, acrylic resin, and silicone Examples include a combination of a water repellent layer containing a resin selected from the group consisting of resins and a specific solvent selected from the group consisting of a fluorine-containing solvent, a hydrocarbon solvent, and a silicone solvent. A combination of the water repellent layer and the fluorine-containing solvent is more preferable.
- an optimal solvent is appropriately selected according to the material type of the water repellent layer so as to satisfy the above ratio (elastic modulus B / elastic modulus A).
- a hydrophobic solvent or a hydrophilic solvent may be used, and a hydrophobic solvent is preferable from the viewpoint of easily satisfying the above ratio (elastic modulus B / elastic modulus A).
- the hydrophobic solvent is easy to phase separate from the liquid medium.
- a fluorine-containing solvent, a hydrocarbon solvent, and a silicone solvent are more preferable, and a fluorine-containing solvent is further more preferable.
- the said fluorine-containing solvent, hydrocarbon solvent, and silicone solvent correspond to a hydrophobic solvent.
- the said hydrophobic solvent is a solvent with small affinity with water, and means the solvent whose solubility with respect to water in 25 degreeC is 50 g / L or less.
- the said hydrophilic solvent is a solvent with a large affinity with water, and means the solvent whose solubility with respect to water in 25 degreeC exceeds 50 g / L.
- the specific solvent is preferably a solvent that is phase-separated from water. Moreover, only 1 type may be used for a specific solvent, and it may use 2 or more types together.
- the specific gravity of the specific solvent is not particularly limited, and may be a solvent having a specific gravity of more than 1.0 or a solvent having a specific gravity of less than 1.0.
- the solvent having a specific gravity of more than 1.0 include fluorine-containing solvents, and examples of the solvent having a specific gravity of less than 1.0 include hydrocarbon solvents and silicone solvents.
- the specific gravity of the liquid medium is approximately 1.0.
- an optimal contact method with the water repellent layer is appropriately selected depending on the specific gravity of the specific solvent.
- the fluorine-containing solvent is a solvent containing a fluorine atom, and examples thereof include fluorine-containing alkanes, fluorine-containing olefins, fluorine-containing alkyl ethers, fluorine-containing alkylamines, and fluorine-containing aromatic compounds.
- the fluorine-containing solvent may be a fluorine-containing solvent containing a chlorine atom or a bromine atom.
- the fluorine content which is the total content of fluorine atoms in the fluorine-containing solvent, is preferably 15% by mass or more, and more preferably 30% by mass or more.
- the upper limit is preferably 85% by mass, and more preferably 80% by mass.
- the solubility of the fluorinated solvent in water at 25 ° C. is preferably 50 g / L or less, more preferably 10 g / L or less, and even more preferably 5 g / L or less from the viewpoint of phase separation from the liquid medium.
- the lower limit of solubility in water is 0 g / L.
- the viscosity of the fluorinated solvent is not particularly limited, but is preferably 0.4 mPa ⁇ s or more, more preferably 0.44 mPa ⁇ s or more at 25 ° C.
- the upper limit is preferably 2000 mPa ⁇ s, and more preferably 50 mPa ⁇ s.
- the density of the fluorine-containing solvent is not particularly limited, but is preferably more than 1.0 g / mL, more preferably 1.1 g / mL or more at 25 ° C., and preferably sufficiently heavier than the cells. 2 g / mL is more preferable.
- the upper limit is preferably 3.0 g / mL, and more preferably 2.1 g / mL.
- the surface tension of the fluorine-containing solvent is not particularly limited, but is preferably 9 mN / m or more, more preferably 12 mN / m or more at 25 ° C.
- the upper limit is preferably 80 mN / m, and more preferably 100 mN / m.
- the fluorinated alkane may be linear, branched or cyclic.
- the fluorine-containing alkane preferably has 5 to 20 carbon atoms, more preferably 6 to 10 carbon atoms.
- Fluorine-containing alkanes are perfluoroalkanes in which all of the alkane hydrogen atoms have been replaced with fluorine atoms, hydrofluoroalkanes in which some of the hydrogen atoms have been replaced with fluorine atoms, and some or all of the hydrogen atoms have been converted into fluorine and chlorine atoms. Examples include substituted chlorofluoroalkanes.
- fluorine-containing alkane examples include perfluorohexane, perfluoroheptane, perfluorooctane, perfluorononane, perfluorodecane, perfluoromethylcyclohexane, perfluoro (1,3-dimethylcyclohexane), perfluorodecalin, dichloropentafluoropropane, 1,1, 1,2,2,3,3,4,4,5,5,6,6-tridecafluorooctane, 1,1,1,2,2,3,3,4,4,5,5,6 , 6-Tridecafluorohexane, 1,1,1,2,2,3,3,4,4-nonafluorohexane, 1,1,1,2,2,3,4,5,5,5- Decafluoropentane, 1,1,2,2,3,3,4-heptafluorocyclopentane, 3M FC-87, FC-84, FC-77, Perfluo Kerosene, and the like.
- the fluorine-containing olefin may be linear, branched or cyclic, but is preferably linear or branched.
- the carbon number of the fluorinated olefin is preferably 5 to 20, more preferably 6 to 10.
- the number of unsaturated bonds contained in the fluorinated olefin is preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 5.
- Fluorinated olefins are perfluoroolefins in which all of the hydrogen atoms of the olefin have been replaced with fluorine atoms, hydrofluoroolefins in which some of the hydrogen atoms have been replaced with fluorine atoms, and some or all of the hydrogen atoms have been converted into fluorine and chlorine atoms.
- Examples thereof include substituted chlorofluoroolefins.
- the fluorinated olefin include perfluorocyclopentene, perfluorocyclohexene, perfluorocycloheptene, perfluorocyclooctene, perfluorocyclononene, perfluorocyclodecene, 1-chloro-3,3,3-trifluoropropene, 1-chloro- 2,3,3-trifluoropropene, 1,1,1,2,2,3,5,5,6,6,7,7,7-tridecafluoro-4-methoxy-3-heptene It is done.
- the fluorine-containing alkyl ether at least one of the two alkyl groups bonded to the oxygen atom may be substituted with one or more fluorine atoms.
- the alkyl group part which may be substituted with a fluorine atom constituting the fluorinated alkyl ether may be linear, branched or cyclic, but is preferably linear or branched.
- the number of carbon atoms in the alkyl group moiety contained in the fluorinated alkyl ether is preferably from 5 to 20, and more preferably from 6 to 10.
- the alkyl group moieties that may be substituted with fluorine atoms contained in the fluorine-containing alkyl ether may be the same or different.
- Fluorinated alkyl ethers are perfluoroalkyl ethers in which all of the hydrogen atoms of the alkyl ether are replaced with fluorine atoms, hydrofluoroalkyl ethers in which some of the hydrogen atoms are replaced with fluorine atoms, and some or all of the hydrogen atoms are fluorine atoms And chlorofluoroalkyl ether substituted with a chlorine atom.
- fluorine-containing alkyl ether examples include 1,1,2,2-tetrafluoroethyl-2,2,2-trifluoroethyl ether, 1-methoxy-1,1,2,2,3,3,3 -Heptafluoropropane, 1-ethoxy-1,1,2,2,3,3,4,4,4-nonafluorobutane, 3-methoxy-1,1,1,2,2,3,4,4 , 5,5,6,6,6-tridecafluorohexane, 1-methoxy-1,1,2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,6-tridecafluorohexane , Methyl nonafluoroisobutyl ether, ethyl nonafluorobutyl ether, ethyl nonafluoroisobutyl ether 1, 1, 1, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 5-decafluoro-3-methoxy-4- (trifluoro Methyl) pentane, SOLVEY Made in GALDEN HT55, G
- the fluorine-containing alkylamine may be any of primary amine, secondary amine and tertiary amine, and tertiary amine is particularly preferable.
- tertiary amine is particularly preferable.
- the alkyl group part that may be substituted with a fluorine atom constituting the fluorinated alkylamine may be linear, branched or cyclic, but is preferably linear or branched.
- the number of carbon atoms in one alkyl group moiety contained in the fluorine-containing alkylamine is preferably 3 to 50, more preferably 9 to 30.
- Fluorine-containing alkylamines include perfluoroalkylamines in which all of the hydrogen atoms of the alkylamine are substituted with fluorine atoms, hydrofluoroalkylamines in which some of the hydrogen atoms are substituted with fluorine atoms, and some or all of the hydrogen atoms are Examples thereof include chlorofluoroalkylamine substituted with a fluorine atom and a chlorine atom.
- fluorine-containing alkylamine examples include perfluorotripropylamine, perfluorotributylamine, perfluorotripentylamine, perfluorotrihexylamine, perfluorotriheptylamine, perfluorotrioctylamine, perfluorotrinonylamine, and perfluorotridecylamine. Can be mentioned.
- the fluorine-containing aromatic compound is a compound in which at least one fluorine atom is substituted on the aromatic compound.
- the number of carbon atoms in the fluorinated aromatic compound is preferably 5 to 30, and more preferably 6 to 10.
- Fluorine-containing aromatic compounds include compounds in which all of the hydrogen atoms in the aromatic compound are replaced with fluorine atoms, compounds in which some of the hydrogen atoms are replaced with fluorine atoms, and some or all of the hydrogen atoms are fluorine atoms. And a compound substituted with a chlorine atom.
- fluorine-containing aromatic compound examples include monofluorobenzene, difluorobenzene, trifluorobenzene, tetrafluorobenzene, pentafluorobenzene, hexafluorobenzene and the like.
- the hydrocarbon solvent is a solvent composed of carbon atoms and hydrogen atoms.
- aromatic hydrocarbon solvents such as toluene and xylene, pentane, hexane, octane, decane, 2,2,4-trimethylpentane, 2,2 Aliphatic hydrocarbon solvents such as 1,3-trimethylhexane.
- silicone solvent examples include straight silicone oils such as dimethyl silicone oil, methylphenyl silicone oil and methyl hydrogen silicone oil, and cyclic polysiloxanes such as cyclic dimethyl silicone.
- the kind of the hydrophilic solvent described above is not particularly limited, and examples thereof include ether solvents such as propylene glycol 1-monomethyl ether and ester solvents such as ethyl lactate.
- the method for bringing the water-repellent layer into contact with the specific solvent is not particularly limited.
- a method of adding the specific solvent S into the container 10 in which the liquid medium L is stored can be mentioned.
- the specific solvent S is added into the container 10 until the cell culture substrate 16 is immersed in the specific solvent S.
- the mobility of the water-repellent layer 14 in contact with the specific solvent S is increased, and the cells C cultured on the water-repellent layer 14 are detached from the water-repellent layer 14 and the cells can be easily collected.
- a solvent having a specific gravity higher than that of the liquid medium L is selected.
- the specific solvent S is preferably a specific solvent having a specific gravity of more than 1.0.
- the specific solvent S moves to a lower layer side than the liquid medium L.
- the specific gravity is more preferably 1.2 or more.
- the upper limit of specific gravity is not particularly limited, but 2.1 is preferable. With this method, the cells can be detached simply by dropping the specific solvent S into a container containing the liquid medium L, which can be said to be a very simple method.
- the specific solvent S is added to the container 10 as shown in FIG.
- the specific gravity of the specific solvent S is not particularly limited, but it is preferable to use a specific solvent having a specific gravity of less than 1.0 from the viewpoint of easy subsequent cell recovery.
- a specific solvent having a specific gravity of less than 1.0 is used, if water is further added to the specific solvent S shown in FIG. 6, the specific solvent S is located in the upper phase and the water W is located in the lower phase as shown in FIG. A phase separation structure is obtained.
- the specific gravity is more preferably 0.95 or less.
- the lower limit of specific gravity is not particularly limited, but is preferably 0.6.
- the form of the collected cells is not particularly limited, and may be a cell sheet (cells gathered in a sheet shape) or individual cells separated into pieces.
- Second Embodiment >> 2nd Embodiment of the manufacturing method of the cell of this invention has the following 2nd culture
- Second culture step a step of culturing cells on the water-repellent layer in a container containing a liquid medium and having a water-repellent layer disposed on the bottom surface.
- Recovery step a water-repellent layer and a specific solvent
- the substrate having a water-repellent layer separate from the culture vessel is used in the second embodiment, whereas the cell is detached from the water-repellent layer and collected.
- the same procedure e.g., cell culture procedure, recovery step
- the culture vessel itself is a substrate and the water-repellent layer is directly disposed on the bottom surface of the vessel.
- a water repellent layer-equipped container having a container and a water repellent layer disposed on the bottom surface of the container is used. That is, at least a part of the bottom of the container corresponds to the base body. More specifically, as shown in FIG. 8, a water repellent layer 14 is disposed on the bottom surface of the container 10, and a liquid medium L is accommodated in the container 10.
- the configuration of the water repellent layer is the same as that of the first embodiment.
- the method for forming the water repellent layer on the bottom surface of the container is not particularly limited, and examples thereof include the method described in the first embodiment.
- a chain is synthesized.
- a primer layer or the like for increasing the adhesion between the two may be disposed.
- the ratio (elastic modulus B / elastic modulus A) can be measured by the method described above using a container with a water repellent layer.
- 3rd Embodiment of the manufacturing method of the cell of this invention has the following 3rd culture
- Third culturing step a step of collecting cells in a vessel in which a liquid medium is accommodated and a granular cell culture substrate having a granular carrier and a water-repellent layer disposed on the granular carrier is disposed.
- the carrier supporting the water repellent layer The shape is granular.
- the cell culture substrate is a granular cell culture substrate having a granular carrier and a water-repellent layer disposed on the granular carrier.
- a granular cell culture substrate having a water repellent layer can be suitably applied to microcarrier culture having both sides of adhesion culture and suspension culture.
- the granular carrier is a granular member on which a water repellent layer is disposed.
- the shape of the granular carrier include a spherical shape, an ellipsoidal shape, a cubic shape, and a rectangular parallelepiped shape.
- the average particle size of the granular carrier is preferably 100 to 1000 ⁇ m, more preferably 200 to 500 ⁇ m, from the viewpoint of application to microcarrier culture. This average particle diameter is 50% volume average particle diameter (D50).
- Specific examples of the material constituting the granular carrier include resin, glass, metal, metal oxide (however, other than glass), metal nitride, and the like.
- Specific examples of the granular carrier include glass beads, resin particles, silica beads and the like.
- the form of the water repellent layer disposed on the granular carrier is as described in the first embodiment, and satisfies a predetermined ratio (elastic modulus B / elastic modulus A).
- the method for forming the water repellent layer on the granular carrier is as described in the first embodiment.
- the water-repellent layer may be disposed on at least a part of the granular carrier, and is preferably disposed on the entire surface.
- the present invention also relates to a kit for producing cells.
- the kit is a kit for culturing cells and recovering the cultured cells, which includes a substrate, a cell culture substrate having a water-repellent layer disposed on the substrate, and a specific solvent. This kit is used in the first embodiment described above.
- kits having a water-repellent layer-equipped container having a water-repellent layer disposed on the bottom surface of the container and a specific solvent This kit is used in the second embodiment described above.
- a kit having a culture vessel, a granular cell culture substrate having a water-repellent layer, and a specific solvent can also be mentioned. This kit is used in the third embodiment described above.
- the mixed solution in the sample tube was stirred at room temperature (about 25 ° C.) for 1 hour. Thereafter, the slide glass was taken out from the sample tube, washed with methanol and THF, and then dried in a nitrogen stream to obtain a slide glass (A) on which the polymerization initiator was fixed.
- the reagent prepared above was used.
- the following preparations and reactions were all performed under nitrogen.
- a slide glass (A) and a stirring bar were placed in a 100 mL sample tube, and AIBN (0.023 g), deoxygenated toluene (10.5 mL), mXHF (38.5 mL), and C6FMA (19.9 mL) were added thereto. .
- a solution obtained by dissolving copper (II) bromide (0.0016 g) and TPMA (0.0020 g) in DMF (0.4 mL) was dropped into the sample tube.
- the liquid mixture in the sample tube was stirred in an oil bath at 80 ° C. for 16 hours.
- the slide glass was taken out from the sample tube, washed with methanol and Asahi Clin AK-225 (trade name, manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.), and then dried with a nitrogen stream to obtain a cell culture substrate 1.
- the water repellent layer in the cell culture substrate 1 contained poly (2- (perfluorohexyl) ethyl methacrylate) (hereinafter also referred to as “PC6FMA”).
- PC6FMA poly (2- (perfluorohexyl) ethyl methacrylate
- MMA Methyl methacrylate
- DMF Deoxygenated dimethylformamide
- AIBN 2,2′-azobisisobutyronitrile
- TPMA tris (2-pyridylmethyl) amine
- II copper
- the reagent prepared above was used. The following preparations and reactions were all performed under nitrogen.
- a slide glass (A) and a stirring bar were placed in a 100 mL sample tube, and AIBN (0.033 g) and MMA (70 mL) were added thereto.
- a slide glass (A) and a stirring bar were placed in a 100 mL sample tube, and AIBN (0.023 g), EHMA (33 mL), and deoxygenated toluene (35 mL) were added thereto. Furthermore, a solution obtained by dissolving copper (II) bromide (0.0022 g) and TPMA (0.0029 g) in DMF (0.4 mL) was dropped into the sample tube. Next, the liquid mixture in the sample tube was stirred in an oil bath at 60 ° C. for 4 hours. Thereafter, the slide glass was taken out from the sample tube, washed with methanol and toluene, and then dried with a nitrogen stream to obtain a cell culture substrate 3.
- the water repellent layer in the cell culture substrate 3 contained poly (2-ethylhexyl methacrylate) (hereinafter also referred to as “PEHMA”).
- Example 1 A cell culture substrate 1 cut into a 2 cm square was placed in an IWAKI dish (60 mm / non-treated dish model number 1010-060), and the cell culture substrate 1 was irradiated with UV for 15 minutes and sterilized. Next, the cells (TIG3) were seeded at 200,000 cells / Dish, and 4 mL of a liquid medium (Gibco MEM) was added to the dish. Next, the obtained dish was placed in an incubator at 37 ° C. for 24 hours, and then the dish was taken out from the incubator.
- IWAKI dish 60 mm / non-treated dish model number 1010-060
- a dish was placed on a microscope, and 4 mL of a fluorinated solvent (specific solvent 1) was dropped into the dish, and changes in the adhesion behavior of cells on the cell culture substrate 1 were observed over time.
- a fluorinated solvent specifically solvent 1
- the adherent cells change into a spherical shape or are washed away and disappear from the cell culture substrate 1. Therefore, by visual inspection, the adherent cells change to a spherical shape after 20 minutes, or the case where the adherent cells disappear from the cell culture substrate 1 after being washed away is defined as “ ⁇ ” (good), and the adherent cells change to a spherical shape after 5 minutes.
- the case where it disappeared from the cell culture substrate 1 after being flowed was designated as “ ⁇ ” (excellent), and the case where there was no change after 20 minutes was designated as “x” (defective).
- TIG3 Human fetal lung-derived fibroblasts
- JCRB cell bank Cat. No. JCRB0506
- hMSC Mesenchymal stem cells, PT-2501, Lonza Japan
- Example 1 when the same operation as in Example 1 was performed using a container instead of the substrate, the same result as in Example 1 was obtained. That is, even when a container with a water repellent layer was used, a desired effect was obtained.
- Example 3 and Example 6 After performing the same operation as the cell culture substrate 2 using glass beads (particle size 500 ⁇ m) instead of the substrate, the same as in Example 3 and Example 6 using the obtained glass beads. As a result of the operation, the same results as in Example 3 and Example 6 were obtained. That is, a desired effect was obtained even when a granular cell culture substrate was used.
- Container 12 Substrate 14 Water repellent layer 16 Cell culture substrate
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Abstract
より簡便に細胞培養基材上で培養された細胞を回収し得る、細胞の製造方法を提供する。 基材本体と基材本体上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材の撥水層上で細胞の培養を行う培養工程と、撥水層と溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する回収工程とを有し、前記溶媒が、下記弾性率Ｂ／弾性率Ａが０．２以下となる溶媒であることを特徴とする細胞の製造方法。 弾性率Ｂ／弾性率Ａ：撥水層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される撥水層とリン酸緩衝生理食塩水との接触部分での撥水層の弾性率Ａに対する、撥水層と溶媒とを接触させて測定される撥水層の溶媒との接触部分での撥水層の弾性率Ｂの比。
Description
本発明は、細胞の製造方法、および細胞を製造するためのキットに関する。
従来、細胞の培養は、ガラス基材などの細胞培養基材の表面上にて行われていた。細胞培養基材上で培養した細胞を回収するためには、細胞を細胞培養基材表面から剥離する必要がある。この目的のために、細胞と細胞培養基材との間の結合を破壊する作用を有する物質（例えば、トリプシンのようなタンパク質分解酵素や化学薬品）が用いられる。しかしながら、酵素処理や化学薬品処理は煩雑であるだけでなく、不純物混入の可能性が高くなること、および、細胞自体が変性し本来の機能が損なわれる場合があること等の欠点が指摘されている。
これらの欠点を解消するために、酵素処理や化学薬品処理を行うことなく、水に対する上限臨界溶解温度（以後、ＵＣＳＴと略すことがある）または下限臨界溶解温度（以後、ＬＣＳＴと略すことがある）が０～８０℃である温度応答性ポリマーで基材を被覆してなる細胞培養基材を用い、温度変化によって細胞を剥離する技術が提案されている（特許文献１）。
一方、特許文献１に記載の細胞培養基材を用いる方法においては、温度変化を実現するための温調設備が必要となり、簡便性という点では必ずしも満足できるものではなかった。
本発明は、上記実情を鑑みて、より簡便に細胞培養基材上で培養された細胞を回収し得る、細胞の製造方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、上記製造方法にて使用されるキットを提供することも課題とする。
また、本発明は、上記製造方法にて使用されるキットを提供することも課題とする。
上記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
（１） 基材本体と前記基材本体上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材の前記撥水層上で細胞の培養を行う培養工程と、前記撥水層と溶媒とを接触させて、前記撥水層上から前記細胞を剥離して回収する回収工程とを有し、前記溶媒が、下記弾性率Ｂ／弾性率Ａが０．２以下となる溶媒であることを特徴とする細胞の製造方法。
弾性率Ｂ／弾性率Ａ：前記撥水層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される前記撥水層と前記リン酸緩衝生理食塩水との接触部分での前記撥水層の弾性率Ａに対する、前記撥水層と溶媒とを接触させて測定される前記撥水層の前記溶媒との接触部分での前記撥水層の弾性率Ｂの比。
（１） 基材本体と前記基材本体上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材の前記撥水層上で細胞の培養を行う培養工程と、前記撥水層と溶媒とを接触させて、前記撥水層上から前記細胞を剥離して回収する回収工程とを有し、前記溶媒が、下記弾性率Ｂ／弾性率Ａが０．２以下となる溶媒であることを特徴とする細胞の製造方法。
弾性率Ｂ／弾性率Ａ：前記撥水層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される前記撥水層と前記リン酸緩衝生理食塩水との接触部分での前記撥水層の弾性率Ａに対する、前記撥水層と溶媒とを接触させて測定される前記撥水層の前記溶媒との接触部分での前記撥水層の弾性率Ｂの比。
（２） 前記基材本体が、基板または粒状担体で構成され、前記培養工程が、液体培地が収容された容器の底面上に前記細胞培養基材を配置して、前記撥水層上で細胞の培養を行う工程である、（１）に記載の製造方法。
（３） 前記基材本体が、容器の底部の少なくとも一部を構成し、前記培養工程が、液体培地が収容された前記容器内に配置される前記撥水層上で細胞の培養を行う工程である、（１）に記載の製造方法。
（４） 前記細胞培養基材が、粒状担体および粒状担体上に配置された撥水層を有する粒状の細胞培養基材である、（１）に記載の製造方法。
（３） 前記基材本体が、容器の底部の少なくとも一部を構成し、前記培養工程が、液体培地が収容された前記容器内に配置される前記撥水層上で細胞の培養を行う工程である、（１）に記載の製造方法。
（４） 前記細胞培養基材が、粒状担体および粒状担体上に配置された撥水層を有する粒状の細胞培養基材である、（１）に記載の製造方法。
（５） 前記撥水層の材料が、撥水性ないし疎水性の樹脂である、（１）～（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６） 前記撥水層の材料が、フッ素樹脂、アクリル樹脂、およびシリコーン樹脂からなる群から選択される樹脂である、（１）～（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７） 前記フッ素樹脂が、フルオロアルキルメタクリレートまたはフルオロアルキルアクリレートに由来する単位を有する重合体である、（６）に記載の製造方法。
（８） 前記アクリル樹脂が、アルキルメタクリレートまたはアルキルアクリレートに由来する単位を有する重合体である、（６）に記載の製造方法。
（６） 前記撥水層の材料が、フッ素樹脂、アクリル樹脂、およびシリコーン樹脂からなる群から選択される樹脂である、（１）～（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７） 前記フッ素樹脂が、フルオロアルキルメタクリレートまたはフルオロアルキルアクリレートに由来する単位を有する重合体である、（６）に記載の製造方法。
（８） 前記アクリル樹脂が、アルキルメタクリレートまたはアルキルアクリレートに由来する単位を有する重合体である、（６）に記載の製造方法。
（９） 前記溶媒が、前記培養工程における培養に使用された液体培地と相分離しかつ該液体培地よりも高比重の溶媒である、（１）～（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１０） 前記溶媒が含フッ素溶媒である、（９）に記載の製造方法。
（１１） 前記含フッ素溶媒が、フッ素含有量が１５質量％以上であって、かつ、水に対する溶解度（２５℃）が５０ｇ／リットル以下の含フッ素溶媒である、（１０）に記載の製造方法。
（１２） 前記含フッ素溶媒が、含フッ素アルカン、含フッ素オレフィン、含フッ素アルキルエーテル、含フッ素アルキルアミン、および含フッ素芳香族化合物からなる群から選ばれた含フッ素溶媒である、（１０）または（１１）に記載の製造方法。
（１３） 前記溶媒が、前記培養工程における培養に使用された液体培地と相分離しかつ該液体培地よりも低比重の溶媒である、（１）～（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１０） 前記溶媒が含フッ素溶媒である、（９）に記載の製造方法。
（１１） 前記含フッ素溶媒が、フッ素含有量が１５質量％以上であって、かつ、水に対する溶解度（２５℃）が５０ｇ／リットル以下の含フッ素溶媒である、（１０）に記載の製造方法。
（１２） 前記含フッ素溶媒が、含フッ素アルカン、含フッ素オレフィン、含フッ素アルキルエーテル、含フッ素アルキルアミン、および含フッ素芳香族化合物からなる群から選ばれた含フッ素溶媒である、（１０）または（１１）に記載の製造方法。
（１３） 前記溶媒が、前記培養工程における培養に使用された液体培地と相分離しかつ該液体培地よりも低比重の溶媒である、（１）～（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１４） 撥水性表面を有する細胞培養基材の該撥水性表面上で培養された細胞を、該撥水性表面と細胞との接触面に下記弾性率Ｂ／弾性率Ａが０．２以下となる溶媒を接触させることにより、該撥水性表面から剥離して回収することを特徴とする培養細胞の回収方法。
弾性率Ｂ／弾性率Ａ：前記撥水性表面を有する層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される前記撥水性表面を有する層と前記リン酸緩衝生理食塩水との接触部分での前記撥水性表面を有する層の弾性率Ａに対する、前記撥水性表面を有する層と溶媒とを接触させて測定される前記撥水性表面を有する層の前記溶媒との接触部分での前記撥水性表面を有する層の弾性率Ｂの比。
（１５） 基板および前記基板上に配置された撥水層を有する細胞培養基材または粒状担体および粒状担体上に配置された撥水層を有する粒状の細胞培養基材と、下記弾性率Ｂ／弾性率Ａが０．２以下となる溶媒とを有する、細胞の培養と該培養された細胞を回収するためのキット。
弾性率Ｂ／弾性率Ａ：前記撥水層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される前記撥水層とリン酸緩衝生理食塩水との接触部分での前記撥水層の弾性率Ａに対する、前記撥水層と溶媒とを接触させて測定される前記撥水層の前記溶媒との接触部分での前記撥水層の弾性率Ｂの比。
弾性率Ｂ／弾性率Ａ：前記撥水性表面を有する層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される前記撥水性表面を有する層と前記リン酸緩衝生理食塩水との接触部分での前記撥水性表面を有する層の弾性率Ａに対する、前記撥水性表面を有する層と溶媒とを接触させて測定される前記撥水性表面を有する層の前記溶媒との接触部分での前記撥水性表面を有する層の弾性率Ｂの比。
（１５） 基板および前記基板上に配置された撥水層を有する細胞培養基材または粒状担体および粒状担体上に配置された撥水層を有する粒状の細胞培養基材と、下記弾性率Ｂ／弾性率Ａが０．２以下となる溶媒とを有する、細胞の培養と該培養された細胞を回収するためのキット。
弾性率Ｂ／弾性率Ａ：前記撥水層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される前記撥水層とリン酸緩衝生理食塩水との接触部分での前記撥水層の弾性率Ａに対する、前記撥水層と溶媒とを接触させて測定される前記撥水層の前記溶媒との接触部分での前記撥水層の弾性率Ｂの比。
本発明によれば、より簡便に細胞培養基材上で培養された細胞を回収し得る、細胞の製造方法を提供することができる。
また、本発明によれば、上記製造方法にて使用されるキットを提供することができる。
また、本発明によれば、上記製造方法にて使用されるキットを提供することができる。
以下、本発明を実施するための形態について図面を参照して説明するが、本発明は、以下の実施形態に制限されることはなく、本発明の範囲を逸脱することなく、以下の実施形態に種々の変形および置換を加えることができる。
本発明において、撥水層とは、水中ではポリマー鎖の運動性が制限された層のことであり、ここで定義する撥水層表面の水接触角は３０度以上である。本発明における撥水層の材料は、撥水性ないし疎水性の樹脂からなる。また、撥水層の材料は実質的に水不溶性である。
また、本発明において、「アクリル樹脂」とは、メタクリロイル基またはアクリロイル基を有する単量体に由来する単位を有する重合体からなる樹脂をいう。代表的なアクリル樹脂は、アルキルメタクリレートの単独重合体や共重合体である。なお、本発明において、フッ素原子を有するアクリル樹脂は、フッ素樹脂の範疇に含める。
本発明において、撥水層とは、水中ではポリマー鎖の運動性が制限された層のことであり、ここで定義する撥水層表面の水接触角は３０度以上である。本発明における撥水層の材料は、撥水性ないし疎水性の樹脂からなる。また、撥水層の材料は実質的に水不溶性である。
また、本発明において、「アクリル樹脂」とは、メタクリロイル基またはアクリロイル基を有する単量体に由来する単位を有する重合体からなる樹脂をいう。代表的なアクリル樹脂は、アルキルメタクリレートの単独重合体や共重合体である。なお、本発明において、フッ素原子を有するアクリル樹脂は、フッ素樹脂の範疇に含める。
本発明において、「基材本体」とは、培養容器とは別体であって、培養容器内に配置されかつ液体培地と接するものであってもよく、培養容器そのものであって液体培地に接する部分（通常は、培養容器の内側底面を構成する部分やその周辺）を有するものであってもよい。
「基材本体上に配置された撥水層」とは、基材本体の液体培地に接する面に形成された、撥水性ないし疎水性の材料から構成された表面層である。
本発明における細胞培養基材（すなわち、撥水層を有する基材本体）は、通常、シートやフィルムなどの面状体や各種形状の培養容器からなる。しかし、これに限定されるものではなく、その表面に撥水層が形成された粒状の細胞培養基材であってもよい。
以下、本発明の第１実施形態として、培養容器とは別体である基材本体を使用した培養について説明し、その後に上記他の実施態様について説明する。
なお、弾性率Ｂ／弾性率Ａによって定義された溶媒を、特に言及しない限り、「特定溶媒」ともいう。
「基材本体上に配置された撥水層」とは、基材本体の液体培地に接する面に形成された、撥水性ないし疎水性の材料から構成された表面層である。
本発明における細胞培養基材（すなわち、撥水層を有する基材本体）は、通常、シートやフィルムなどの面状体や各種形状の培養容器からなる。しかし、これに限定されるものではなく、その表面に撥水層が形成された粒状の細胞培養基材であってもよい。
以下、本発明の第１実施形態として、培養容器とは別体である基材本体を使用した培養について説明し、その後に上記他の実施態様について説明する。
なお、弾性率Ｂ／弾性率Ａによって定義された溶媒を、特に言及しない限り、「特定溶媒」ともいう。
＜＜第１実施形態＞＞
本発明の細胞の製造方法（細胞の培養方法）の第１実施形態は、以下の培養工程および回収工程を有する。
培養工程：液体培地が収容された培養容器の底面上に、基板と基板上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材を配置して、撥水層上で細胞の培養を行う工程
回収工程：撥水層と、特定溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程
以下、本実施形態の手順について、図面を参照しながら、説明する。
本発明の細胞の製造方法（細胞の培養方法）の第１実施形態は、以下の培養工程および回収工程を有する。
培養工程：液体培地が収容された培養容器の底面上に、基板と基板上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材を配置して、撥水層上で細胞の培養を行う工程
回収工程：撥水層と、特定溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程
以下、本実施形態の手順について、図面を参照しながら、説明する。
＜培養工程＞
培養工程は、液体培地が収容された容器の底面上に細胞培養基材を配置して、細胞培養基材中の撥水層上で細胞の培養を行う工程である。より具体的には、図１に示すように、液体培地Ｌが収容された容器１０の底面上に、基板１２と撥水層１４とを有する細胞培養基材１６を配置して、撥水層１４上で細胞Ｃを培養する工程である。本実施形態では、基板１２が、基材本体に該当する。
以下では、まず、本工程で使用される部材および材料について詳述し、その後、工程の手順について詳述する。
培養工程は、液体培地が収容された容器の底面上に細胞培養基材を配置して、細胞培養基材中の撥水層上で細胞の培養を行う工程である。より具体的には、図１に示すように、液体培地Ｌが収容された容器１０の底面上に、基板１２と撥水層１４とを有する細胞培養基材１６を配置して、撥水層１４上で細胞Ｃを培養する工程である。本実施形態では、基板１２が、基材本体に該当する。
以下では、まず、本工程で使用される部材および材料について詳述し、その後、工程の手順について詳述する。
（細胞培養基材）
細胞培養基材は、基板と、基板上に配置された撥水層とを有し、撥水層上にて細胞の培養が行われる。
基板の種類は特に制限されず、ガラス基板、樹脂基板、金属基板などが挙げられる。ガラス基板および金属基板の表面は通常親水性である。樹脂基板は、樹脂の種類により、その表面は親水性にも撥水性（疎水性も意味する）にもなる。また、本発明においては、樹脂基板の樹脂は、撥水層の材料に比較して、特定溶媒に対する溶解度が１ｍｇ/ｇ未満であればよい。基板としては、取り扱い性の点から、ガラス基板が好ましい。
基板の厚みは特に制限されないが、０．０１～２０ｍｍが好ましく、より好ましくは０．１～１０ｍｍである。
細胞培養基材は、基板と、基板上に配置された撥水層とを有し、撥水層上にて細胞の培養が行われる。
基板の種類は特に制限されず、ガラス基板、樹脂基板、金属基板などが挙げられる。ガラス基板および金属基板の表面は通常親水性である。樹脂基板は、樹脂の種類により、その表面は親水性にも撥水性（疎水性も意味する）にもなる。また、本発明においては、樹脂基板の樹脂は、撥水層の材料に比較して、特定溶媒に対する溶解度が１ｍｇ/ｇ未満であればよい。基板としては、取り扱い性の点から、ガラス基板が好ましい。
基板の厚みは特に制限されないが、０．０１～２０ｍｍが好ましく、より好ましくは０．１～１０ｍｍである。
撥水層を構成する材料は特に制限されないが、水接触角が３０度以上の、公知の樹脂が挙げられる。より具体的には、アクリル樹脂、ウレタン樹脂、エポキシ樹脂、オレフィン樹脂、スチレン樹脂、フッ素樹脂、シリコーン樹脂などが挙げられる。なかでも、細胞の剥離性がより優れる点で、撥水性ないし疎水性の樹脂が好ましい。撥水性ないし疎水性樹脂としては、フッ素樹脂、アクリル樹脂およびシリコーン樹脂が好ましく、アクリル樹脂およびフッ素樹脂がより好ましい。
上記アクリル樹脂としては、アルキルメタクリレートまたはアルキルアクリレート由来の単位を有する重合体が好ましく、アルキル基の炭素数は１～１０が好ましい。具体的には、アルキルメタクリレートやアルキルアクリレートの単独重合体や共重合体が挙げられる。特に、メチルメタクリレートの単独重合体や共重合体が好ましい。
上記アクリル樹脂としては、アルキルメタクリレートまたはアルキルアクリレート由来の単位を有する重合体が好ましく、アルキル基の炭素数は１～１０が好ましい。具体的には、アルキルメタクリレートやアルキルアクリレートの単独重合体や共重合体が挙げられる。特に、メチルメタクリレートの単独重合体や共重合体が好ましい。
また、フッ素樹脂とは、フッ素原子が含まれる樹脂である。
フッ素樹脂としては、フルオロアルキルメタクリレートまたはフルオロアルキルアクリレート由来の単位を有する重合体が挙げられる。フルオロアルキル基の炭素数は、３以上が好ましく、５以上がより好ましい。フルオロアルキル基の炭素数の上限は特に制限されないが、１０が好ましい。
フルオロアルキル基としては、パーフルオロアルキル部分とアルキレン部分（フッ素原子を有しない部分）とを有するフルオロアルキル基が好ましい。パーフルオロアルキル部分の炭素数は１～６が好ましく、アルキレン部分の炭素数は２～４が好ましい。
フッ素樹脂としては、フルオロアルキルメタクリレートまたはフルオロアルキルアクリレート由来の単位を有する重合体が挙げられる。フルオロアルキル基の炭素数は、３以上が好ましく、５以上がより好ましい。フルオロアルキル基の炭素数の上限は特に制限されないが、１０が好ましい。
フルオロアルキル基としては、パーフルオロアルキル部分とアルキレン部分（フッ素原子を有しない部分）とを有するフルオロアルキル基が好ましい。パーフルオロアルキル部分の炭素数は１～６が好ましく、アルキレン部分の炭素数は２～４が好ましい。
撥水層は、基板上に固定されていることが好ましい。固定の形態としては、例えば、撥水層が化学的に固定されている形態が挙げられる。この化学的に固定される形態としては、より具体的には、撥水層を構成する材料（例えば、樹脂）と基板とが共有結合を介して結合している形態が挙げられる。このような形態は、後述するグラフト重合法によって形成できる。
また、撥水層は非共有結合を介して基板と結合していてもよい。非共有結合としては、静電相互作用、π－π相互作用などが挙げられる。
また、撥水層は非共有結合を介して基板と結合していてもよい。非共有結合としては、静電相互作用、π－π相互作用などが挙げられる。
撥水層は、３次元架橋構造を有していてもよい。撥水層がこのような構造を有する場合は、後述する回収工程において添加される水以外の溶媒への撥水層を構成する成分の溶出が抑制される。
撥水層の形成方法は特に制限されず、公知の方法が挙げられる。例えば、撥水層を構成する材料（例えば、樹脂）を含む撥水層形成用組成物を基板上に接触させ、必要に応じて硬化処理を施して、撥水層を形成する方法が挙げられる。
また、撥水層をより強固に基板に固定できる点から、基板の表面上に重合開始剤を導入し、その重合開始剤から重合反応を開始して、基板上でポリマー鎖を合成する、いわゆるグラフト重合法が好ましい。
グラフト重合法としては、公知の手順を参照できる。例えば、まず、基板の表面上に共有結合を介して重合開始剤を固定する。重合開始剤を固定する際に用いる官能基の種類は特に制限されないが、例えば、基板表面のアミノ基を介して重合開始剤を固定化する方法などが挙げられる。次に、重合開始剤が固定された基板とモノマーとを接触させて、重合反応を開始することにより、基板上からのびるポリマー鎖が合成される。つまり、得られる撥水層には、一端が基板と化学結合を介して結合しているポリマー鎖が含まれる。
グラフト重合法以外にも、末端または側鎖の一部に基板と化学結合を形成する部位を有するポリマー鎖を基板の官能基と反応させることでポリマー鎖を直接基板に固定化するグラフト方法も挙げられる。
また、非共有結合を介した基板の結合方法としては、基板と相互作用の強いポリマーユニットを含むブロックポリマーをコーティングする方法が挙げられる。
また、撥水層をより強固に基板に固定できる点から、基板の表面上に重合開始剤を導入し、その重合開始剤から重合反応を開始して、基板上でポリマー鎖を合成する、いわゆるグラフト重合法が好ましい。
グラフト重合法としては、公知の手順を参照できる。例えば、まず、基板の表面上に共有結合を介して重合開始剤を固定する。重合開始剤を固定する際に用いる官能基の種類は特に制限されないが、例えば、基板表面のアミノ基を介して重合開始剤を固定化する方法などが挙げられる。次に、重合開始剤が固定された基板とモノマーとを接触させて、重合反応を開始することにより、基板上からのびるポリマー鎖が合成される。つまり、得られる撥水層には、一端が基板と化学結合を介して結合しているポリマー鎖が含まれる。
グラフト重合法以外にも、末端または側鎖の一部に基板と化学結合を形成する部位を有するポリマー鎖を基板の官能基と反応させることでポリマー鎖を直接基板に固定化するグラフト方法も挙げられる。
また、非共有結合を介した基板の結合方法としては、基板と相互作用の強いポリマーユニットを含むブロックポリマーをコーティングする方法が挙げられる。
撥水層の厚みは特に制限されないが、細胞の剥離性の点から、５ｎｍ以上が好ましく、２０ｎｍ以上がより好ましい。上限は特に制限されないが、１００μｍが好ましい。
撥水層は、基板の少なくとも一方の主面上全面の配置されるのが好ましい。
なお、必要に応じて、基板と撥水層との間には他の層が配置されていてもよい。例えば、両者の密着性を高めるためのプライマー層などが配置されていてもよい。
なお、必要に応じて、基板と撥水層との間には他の層が配置されていてもよい。例えば、両者の密着性を高めるためのプライマー層などが配置されていてもよい。
（液体培地）
液体培地は、通常用いられる細胞培養培地から、培養する細胞、目的等に応じて適宜選択できる。通常の細胞培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ－α、ＲＰＭＩ１６４０などが挙げられる。
また、これらの液体培地に対しては、必要に応じて、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。これらの添加剤の濃度は通常用いられる濃度であればよく、例えば、血清は培地量の５～１０容量％とすることができる。
なお、液体培地には、水が含まれる場合が多い。一般的に、液体培地は、栄養分を水に溶解させて得られる。
液体培地は、通常用いられる細胞培養培地から、培養する細胞、目的等に応じて適宜選択できる。通常の細胞培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ－α、ＲＰＭＩ１６４０などが挙げられる。
また、これらの液体培地に対しては、必要に応じて、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。これらの添加剤の濃度は通常用いられる濃度であればよく、例えば、血清は培地量の５～１０容量％とすることができる。
なお、液体培地には、水が含まれる場合が多い。一般的に、液体培地は、栄養分を水に溶解させて得られる。
（細胞）
撥水層上で培養される細胞の種類は特に制限されず、目的等に応じて適宜選択できる。細胞としては、例えば、ヒトを含む哺乳動物の細胞が挙げられ、具体的には、体細胞、その前駆細胞、それらの混合細胞などが挙げられる。細胞の具体例としては、内皮細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、臍帯血由来幹細胞、歯髄幹細胞、心筋細胞、心臓壁細胞、肝細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、肝前駆細胞、間葉系細胞、膵島細胞、軟骨細胞、上皮細胞などが挙げられ、これらからなる群から選択される少なくとも１種の細胞が好ましい。
なお、細胞は、付着性細胞であることが好ましい。ここで付着性細胞とは、非浮遊性の細胞であり、細胞増殖に際して培養器面に対する接着依存性を示す細胞である。
撥水層上で培養される細胞の種類は特に制限されず、目的等に応じて適宜選択できる。細胞としては、例えば、ヒトを含む哺乳動物の細胞が挙げられ、具体的には、体細胞、その前駆細胞、それらの混合細胞などが挙げられる。細胞の具体例としては、内皮細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、臍帯血由来幹細胞、歯髄幹細胞、心筋細胞、心臓壁細胞、肝細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、血管内皮細胞、肝前駆細胞、間葉系細胞、膵島細胞、軟骨細胞、上皮細胞などが挙げられ、これらからなる群から選択される少なくとも１種の細胞が好ましい。
なお、細胞は、付着性細胞であることが好ましい。ここで付着性細胞とは、非浮遊性の細胞であり、細胞増殖に際して培養器面に対する接着依存性を示す細胞である。
（容器）
容器は、その内部に液体培地を収容でき、かつ、その底面上に細胞培養基材が載置できるものであれば、その種類は特に制限されない。通常、容器は、少なくとも底面部と、底面部の周囲からのびる壁部とを少なくとも有する。
容器は、その内部に液体培地を収容でき、かつ、その底面上に細胞培養基材が載置できるものであれば、その種類は特に制限されない。通常、容器は、少なくとも底面部と、底面部の周囲からのびる壁部とを少なくとも有する。
（手順）
培養工程の手順は、撥水層上で細胞が培養されれば特に制限されないが、代表例としては、まず、容器内の所定の位置に細胞培養基材を配置する。次に、所定の種類の細胞を所定数となるように容器内に播種し、さらに液体培地を容器内に加え、培養を行う。なお、液体培地を先に容器内に加えて、その後、細胞を播種してもよい。
培養工程の手順は、撥水層上で細胞が培養されれば特に制限されないが、代表例としては、まず、容器内の所定の位置に細胞培養基材を配置する。次に、所定の種類の細胞を所定数となるように容器内に播種し、さらに液体培地を容器内に加え、培養を行う。なお、液体培地を先に容器内に加えて、その後、細胞を播種してもよい。
細胞の培養条件は、細胞の種類、目的などに応じて適宜最適な条件を選択できる。例えば、培養温度は、通常、約３０～４０℃程度の場合が多く、約３７℃が好ましい。培養は、例えば、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われ、ＣＯ２濃度は、例えば２～５％である。培養時間は、例えば、１～１０日間である。
なお、気体を供給しながら、細胞培養を行ってもよい。供給される気体は、目的等に応じて適宜選択でき、例えば、酸素、窒素、一酸化窒素、二酸化窒素、一酸化炭素、二酸化炭素、水素、硫化水素などが挙げられる。
なお、気体を供給しながら、細胞培養を行ってもよい。供給される気体は、目的等に応じて適宜選択でき、例えば、酸素、窒素、一酸化窒素、二酸化窒素、一酸化炭素、二酸化炭素、水素、硫化水素などが挙げられる。
＜回収工程＞
回収工程は、撥水層と、特定溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程である。
撥水層と、特定溶媒とを接触させることにより、撥水層の運動性が向上し、結果として撥水層表面上から細胞が剥離され、細胞を容易に回収できる。
以下、基板に一端が共有結合により結合した高分子鎖（グラフト鎖）を含む撥水層の場合を一例として、撥水層上から細胞が剥離する機構について説明する。
図２（Ａ）に示すように、撥水層１４が回収工程で使用される特定溶媒と接触する前は、高分子鎖Ｐは縮まった状態であり、高分子鎖Ｐの運動性は小さい。特に、通常、液体培地は水を含むため、撥水層が液体培地と接触している場合、撥水層中の高分子鎖は縮まった状態となりやすい。後段で詳述するように、撥水層と水とを接触させて測定される撥水層の弾性率Ａは、上記図２（Ａ）のように、撥水層中の高分子鎖Ｐが縮まった状態での弾性率を表す。言い換えると、弾性率Ａは、撥水層中の高分子鎖の運動性が低い状態での弾性率である。
次に、撥水層１４と特定溶媒とを接触させると、図２（Ｂ）に示すように、撥水層１４中の高分子鎖Ｐと特定溶媒との相溶性が、高分子鎖Ｐと水との相溶性よりも高いため、高分子鎖Ｐと特定溶媒とが相互作用して、撥水層が膨潤し、高分子鎖Ｐは広がった状態となる。つまり、撥水層１４が特定溶媒と接触すると、高分子鎖Ｐの運動性が高まる。このように高分子鎖Ｐの運動性が高まると、結果として、撥水層１４上にあった細胞Ｃが撥水層１４上から離れる。言い換えると、撥水層上にあった細胞を剥離させることができる。
なお、上記図２（Ｂ）に示すように、高分子鎖Ｐが特定溶媒と相互作用した場合、撥水層中に特定溶媒が取り込まれ、高分子鎖Ｐが広がった状態となり、撥水層の弾性率が特定溶媒と接触前後で変化する。後段で詳述するように、撥水層と特定溶媒とを接触させて測定される撥水層の弾性率Ｂは、上記図２（Ｂ）のように、撥水層中の高分子鎖Ｐが広がった状態での弾性率を表す。言い換えると、弾性率Ｂは、撥水層中の高分子鎖の運動性が高い状態での弾性率である。通常、弾性率Ｂは、高分子鎖が広がった状態であるため、弾性率Ａよりも低くなる。
つまり、弾性率Ａに対する弾性率Ｂの比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）は、実質的に、撥水層が特定溶媒と接触する前後の運動性の変化を表している。そのため、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が所定値以下であるということは、撥水層と特定溶媒とが接触することにより、撥水層中の高分子鎖の運動性がある一定以上高まることを意図する。このような高分子鎖の運動性がある一定以上高まると、撥水層上にある細胞が撥水層上から離れやすい。従って、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が所定値以下であるような撥水層と特定溶媒との組み合わせであれば、回収工程において、撥水層上から細胞を剥離できる。
回収工程は、撥水層と、特定溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程である。
撥水層と、特定溶媒とを接触させることにより、撥水層の運動性が向上し、結果として撥水層表面上から細胞が剥離され、細胞を容易に回収できる。
以下、基板に一端が共有結合により結合した高分子鎖（グラフト鎖）を含む撥水層の場合を一例として、撥水層上から細胞が剥離する機構について説明する。
図２（Ａ）に示すように、撥水層１４が回収工程で使用される特定溶媒と接触する前は、高分子鎖Ｐは縮まった状態であり、高分子鎖Ｐの運動性は小さい。特に、通常、液体培地は水を含むため、撥水層が液体培地と接触している場合、撥水層中の高分子鎖は縮まった状態となりやすい。後段で詳述するように、撥水層と水とを接触させて測定される撥水層の弾性率Ａは、上記図２（Ａ）のように、撥水層中の高分子鎖Ｐが縮まった状態での弾性率を表す。言い換えると、弾性率Ａは、撥水層中の高分子鎖の運動性が低い状態での弾性率である。
次に、撥水層１４と特定溶媒とを接触させると、図２（Ｂ）に示すように、撥水層１４中の高分子鎖Ｐと特定溶媒との相溶性が、高分子鎖Ｐと水との相溶性よりも高いため、高分子鎖Ｐと特定溶媒とが相互作用して、撥水層が膨潤し、高分子鎖Ｐは広がった状態となる。つまり、撥水層１４が特定溶媒と接触すると、高分子鎖Ｐの運動性が高まる。このように高分子鎖Ｐの運動性が高まると、結果として、撥水層１４上にあった細胞Ｃが撥水層１４上から離れる。言い換えると、撥水層上にあった細胞を剥離させることができる。
なお、上記図２（Ｂ）に示すように、高分子鎖Ｐが特定溶媒と相互作用した場合、撥水層中に特定溶媒が取り込まれ、高分子鎖Ｐが広がった状態となり、撥水層の弾性率が特定溶媒と接触前後で変化する。後段で詳述するように、撥水層と特定溶媒とを接触させて測定される撥水層の弾性率Ｂは、上記図２（Ｂ）のように、撥水層中の高分子鎖Ｐが広がった状態での弾性率を表す。言い換えると、弾性率Ｂは、撥水層中の高分子鎖の運動性が高い状態での弾性率である。通常、弾性率Ｂは、高分子鎖が広がった状態であるため、弾性率Ａよりも低くなる。
つまり、弾性率Ａに対する弾性率Ｂの比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）は、実質的に、撥水層が特定溶媒と接触する前後の運動性の変化を表している。そのため、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が所定値以下であるということは、撥水層と特定溶媒とが接触することにより、撥水層中の高分子鎖の運動性がある一定以上高まることを意図する。このような高分子鎖の運動性がある一定以上高まると、撥水層上にある細胞が撥水層上から離れやすい。従って、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が所定値以下であるような撥水層と特定溶媒との組み合わせであれば、回収工程において、撥水層上から細胞を剥離できる。
従って、本実施形態においては、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を満たすような、特定溶媒を選択することにより、撥水層上から簡便に細胞を剥離・回収できる。
なお、上記のような、撥水層と特定溶媒との組み合わせとしては、例えば、撥水層にフッ素樹脂が含まれ、特定溶媒として含フッ素溶媒を用いる態様が挙げられる。
なお、上記のような、撥水層と特定溶媒との組み合わせとしては、例えば、撥水層にフッ素樹脂が含まれ、特定溶媒として含フッ素溶媒を用いる態様が挙げられる。
上述したように、本実施形態によれば、単に特定溶媒と撥水層とを接触させることにより、細胞培養基材から細胞を容易に剥離できる。つまり、従来技術のような温調設備のような特殊な設備を用意する必要がなく、簡便に、細胞を剥離・回収できる。
なお、上記図２においては、一方の末端が基板上に固定された高分子鎖を含む撥水層について説明したが、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を示す撥水層であればその構成は特に制限されない。例えば、上述した、３次元架橋構造を有する撥水層であってもよい。
なお、上記図２においては、一方の末端が基板上に固定された高分子鎖を含む撥水層について説明したが、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を示す撥水層であればその構成は特に制限されない。例えば、上述した、３次元架橋構造を有する撥水層であってもよい。
以下、弾性率Ａおよび弾性率Ｂの測定方法について詳述する。
まず、弾性率Ａおよび弾性率Ｂの測定には、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いる。装置の種類は以下の通りである。
装置：Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製 Ｃｙｐｈｅｒ－Ｓ
カンチレバーホルダー：液滴カンチレバーホルダー
プローブ：ｎａｎｏｔｏｏｌｓ社製Ｂ１＿ＦＭＲ（ＨＤＣ製半球状チップ 先端曲率４０ｎｍ）
まず、弾性率Ａおよび弾性率Ｂの測定には、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いる。装置の種類は以下の通りである。
装置：Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製 Ｃｙｐｈｅｒ－Ｓ
カンチレバーホルダー：液滴カンチレバーホルダー
プローブ：ｎａｎｏｔｏｏｌｓ社製Ｂ１＿ＦＭＲ（ＨＤＣ製半球状チップ 先端曲率４０ｎｍ）
弾性率Ａおよび弾性率Ｂを測定する際に、まず、サファイア基板測定とＳａｄｅｒ法を用いて、光てこ感度およびバネ定数を校正する。サファイア基板上に回収工程で用いられる特定溶媒を滴下して、溶媒を滴下したサファイア基板表面のフォースカーブ測定より、各測定条件での光てこ感度を算出する。また、試料表面よりプローブを１ｍｍ程度離し、算出した光てこ感度を固定してサーマルノイズスペクトル（熱揺らぎによるプローブの振動スペクトル）をｓａｄｅｒ法によりフィッティングすることで、バネ定数を算出する。
次に、測定対象である細胞培養基材の撥水層上にリン酸緩衝生理食塩水を滴下して、液滴（凸状のメニスカス）が形成されるようにして、室温下にて３０分間にわたってリン酸緩衝生理食塩水と撥水層とを接触させる。なお、撥水層上のリン酸緩衝生理食塩水が揮発して目減りする場合は、適宜、リン酸緩衝生理食塩水を滴下する。
次に、上記装置を用いて、撥水層の液滴と接触している部分の試料表面形状を取得する。その後、ゴミ等を避けてインデント位置を決め、フォースカーブ測定を実施する。測定は、最大押込み力２００ｎＮ、押込み速度：１Ｈｚでインデンテーションを実施する。Ｃｙｐｈｅｒ－Ｓ付属の解析ソフト（ＡＲ ｖｅｒ１３）により、押込み曲線をヘルツモデルでフィッティングして弾性率Ａを算出する。
なお、プローブチップ形状は半球、先端曲率は４０ｎｍを用いる。フィッティング領域は力を検出してベースラインから逸脱し始めてからほぼ直線を保つ範囲内で適宜調整する。撥水層の厚みに対して押込み深さが非常に深い場合（具体的には、弾性率がｋＰａ台の場合）は、押込み深さが深くなると急激に傾きが増大し、下地の弾性率を示すようになる。この場合は、最大押込み力を小さく設定し、下地の影響を排除して弾性率を算出する。
また、使用されるリン酸緩衝生理食塩水には、ＫＣｌ（２００ｍｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（８０００ｍｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（２００ｍｇ／Ｌ）、および、Ｎａ２ＨＰＯ４（ａｎｈｙｄ.）（１１５０ｍｇ／Ｌ）が含まれる。
上記リン酸緩衝生理食塩水としては、Ｄ－ＰＢＳ（－）（和光純薬工業社製）が市販品として挙げられる。
次に、測定対象である細胞培養基材の撥水層上にリン酸緩衝生理食塩水を滴下して、液滴（凸状のメニスカス）が形成されるようにして、室温下にて３０分間にわたってリン酸緩衝生理食塩水と撥水層とを接触させる。なお、撥水層上のリン酸緩衝生理食塩水が揮発して目減りする場合は、適宜、リン酸緩衝生理食塩水を滴下する。
次に、上記装置を用いて、撥水層の液滴と接触している部分の試料表面形状を取得する。その後、ゴミ等を避けてインデント位置を決め、フォースカーブ測定を実施する。測定は、最大押込み力２００ｎＮ、押込み速度：１Ｈｚでインデンテーションを実施する。Ｃｙｐｈｅｒ－Ｓ付属の解析ソフト（ＡＲ ｖｅｒ１３）により、押込み曲線をヘルツモデルでフィッティングして弾性率Ａを算出する。
なお、プローブチップ形状は半球、先端曲率は４０ｎｍを用いる。フィッティング領域は力を検出してベースラインから逸脱し始めてからほぼ直線を保つ範囲内で適宜調整する。撥水層の厚みに対して押込み深さが非常に深い場合（具体的には、弾性率がｋＰａ台の場合）は、押込み深さが深くなると急激に傾きが増大し、下地の弾性率を示すようになる。この場合は、最大押込み力を小さく設定し、下地の影響を排除して弾性率を算出する。
また、使用されるリン酸緩衝生理食塩水には、ＫＣｌ（２００ｍｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（８０００ｍｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（２００ｍｇ／Ｌ）、および、Ｎａ２ＨＰＯ４（ａｎｈｙｄ.）（１１５０ｍｇ／Ｌ）が含まれる。
上記リン酸緩衝生理食塩水としては、Ｄ－ＰＢＳ（－）（和光純薬工業社製）が市販品として挙げられる。
なお、上記では弾性率Ａの測定方法について述べたが、使用される溶媒をリン酸緩衝生理食塩水から特定溶媒に変更することにより、弾性率Ｂを測定できる。例えば、特定溶媒として含フッ素溶媒を用いる場合は、上記リン酸緩衝生理食塩水の代わりに含フッ素溶媒を用いて、撥水層の弾性率Ｂを測定する。
なお、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）は、０．２以下であり、細胞の剥離性がより優れる点で、０．０１以下が好ましく、０．００２以下がより好ましく、０．００１以下がさらに好ましい。
なお、下限値は特に制限されないが、撥水層を構成する材料と特定溶媒との親和性の点で、０．０００００１が好ましく、０．００００１がより好ましい。
なお、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）は、０．２以下であり、細胞の剥離性がより優れる点で、０．０１以下が好ましく、０．００２以下がより好ましく、０．００１以下がさらに好ましい。
なお、下限値は特に制限されないが、撥水層を構成する材料と特定溶媒との親和性の点で、０．０００００１が好ましく、０．００００１がより好ましい。
上記弾性率Ａの値としては特に制限されないが、細胞の剥離性がより優れる点で、１．０×１０６～１．０×１０１０Ｐａが好ましく、１．０×１０７～５．０×１０９Ｐａがより好ましい。
上記弾性率Ｂの値としては特に制限されないが、細胞の剥離性がより優れる点で、２．０×１０６Ｐａ以下が好ましく、１．０×１０５Ｐａ以下がより好ましい。下限は特に制限されないが、１．０×１０２Ｐａが好ましい。
上記弾性率Ｂの値としては特に制限されないが、細胞の剥離性がより優れる点で、２．０×１０６Ｐａ以下が好ましく、１．０×１０５Ｐａ以下がより好ましい。下限は特に制限されないが、１．０×１０２Ｐａが好ましい。
特定溶媒の種類は後段で詳述するが、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）の関係を満たす撥水層と特定溶媒との好適な組み合わせとしては、フッ素樹脂、アクリル樹脂、および、シリコーン樹脂からなる群から選択される樹脂を含む撥水層と、含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、および、シリコーン溶媒からなる群から選択される特定溶媒との組み合わせが挙げられ、フッ素樹脂またはアクリル樹脂を含む撥水層と含フッ素溶媒との組み合わせがより好ましい。
以下では、回収工程で使用される材料について詳述し、その後、工程の手順について詳述する。
（特定溶媒）
特定溶媒としては、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を満たすように、撥水層の材料の種類に応じて適宜最適な溶媒が選択される。
水以外の溶媒としては、疎水性溶媒および親水性溶媒のいずれでもよく、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を満たしやすい点から、疎水性溶媒が好ましい。なお、疎水性溶媒は液体培地と相分離しやすい。
なかでも、特定溶媒としては、含フッ素溶媒、炭化水素溶媒およびシリコーン溶媒がより好ましく、含フッ素溶媒がさらに好ましい。なお、上記含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、およびシリコーン溶媒は、疎水性溶媒に該当することが好ましい。
なお、上記疎水性溶媒とは、水との親和性が小さな溶媒であり、２５℃における水に対する溶解度が５０ｇ／Ｌ以下の溶媒を意味する。また、上記親水性溶媒とは、水との親和性が大きな溶媒であり、２５℃における水に対する溶解度が５０ｇ／Ｌ超の溶媒を意味する。
特定溶媒は、水と相分離する溶媒であることが好ましい。
また、特定溶媒は、１種のみを用いてもよいし、２種以上を合わせて用いてもよい。
特定溶媒としては、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を満たすように、撥水層の材料の種類に応じて適宜最適な溶媒が選択される。
水以外の溶媒としては、疎水性溶媒および親水性溶媒のいずれでもよく、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を満たしやすい点から、疎水性溶媒が好ましい。なお、疎水性溶媒は液体培地と相分離しやすい。
なかでも、特定溶媒としては、含フッ素溶媒、炭化水素溶媒およびシリコーン溶媒がより好ましく、含フッ素溶媒がさらに好ましい。なお、上記含フッ素溶媒、炭化水素溶媒、およびシリコーン溶媒は、疎水性溶媒に該当することが好ましい。
なお、上記疎水性溶媒とは、水との親和性が小さな溶媒であり、２５℃における水に対する溶解度が５０ｇ／Ｌ以下の溶媒を意味する。また、上記親水性溶媒とは、水との親和性が大きな溶媒であり、２５℃における水に対する溶解度が５０ｇ／Ｌ超の溶媒を意味する。
特定溶媒は、水と相分離する溶媒であることが好ましい。
また、特定溶媒は、１種のみを用いてもよいし、２種以上を合わせて用いてもよい。
上記特定溶媒の比重は特に制限されないが、比重１．０超の溶媒であってもよいし、比重１．０未満の溶媒であってもよい。比重１．０超の溶媒としては含フッ素溶媒が挙げられ、比重１．０未満の溶媒としては、炭化水素溶媒やシリコーン溶媒が挙げられる。液体培地の比重はほぼ１．０であることより、例えば、液体培地よりも高比重の特定溶媒の場合、液体培地と層分離させた場合は、特定溶媒が下層、液体培地が上層に層分離する。
後段で詳述するように、特定溶媒の比重によって、適宜最適な撥水層との接触方法が選択される。
後段で詳述するように、特定溶媒の比重によって、適宜最適な撥水層との接触方法が選択される。
含フッ素溶媒は、フッ素原子を含む溶媒であり、例えば、含フッ素アルカン、含フッ素オレフィン、含フッ素アルキルエーテル、含フッ素アルキルアミン、含フッ素芳香族化合物などが挙げられる。含フッ素溶媒は、塩素原子や臭素原子を含む含フッ素溶媒であってもよい。
液体培地との相分離の点から、含フッ素溶媒中のフッ素原子の総含有率であるフッ素含量は、１５質量％以上が好ましく、３０質量％以上がより好ましい。上限は、８５質量％が好ましく、８０質量％がより好ましい。
液体培地との相分離の点から、含フッ素溶媒中のフッ素原子の総含有率であるフッ素含量は、１５質量％以上が好ましく、３０質量％以上がより好ましい。上限は、８５質量％が好ましく、８０質量％がより好ましい。
含フッ素溶媒の２５℃における水に対する溶解度は、液体培地との相分離の点から、５０ｇ／Ｌ以下が好ましく、１０ｇ／Ｌ以下がより好ましく、５ｇ／Ｌ以下がさらに好ましい。水に対する溶解度の下限値は、０ｇ／Ｌである。
含フッ素溶媒の粘度は特に制限するものではないが、２５℃において、０．４ｍＰａ・ｓ以上が好ましく、０．４４ｍＰａ・ｓ以上がより好ましい。上限値は、２０００ｍＰａ・ｓが好ましく、５０ｍＰａ・ｓがより好ましい。
含フッ素溶媒の密度は特に制限するものではないが、２５℃において、１．０ｇ／ｍＬ超が好ましく、１．１ｇ／ｍＬ以上がより好ましく、細胞より十分に重いことが好ましいことから、１．２ｇ／ｍＬがさらに好ましい。上限値は、３．０ｇ／ｍＬが好ましく、２．１ｇ／ｍＬがより好ましい。
含フッ素溶媒の表面張力は特に制限するものではないが、２５℃において、９ｍＮ／ｍ以上が好ましく、１２ｍＮ／ｍ以上がより好ましい。上限値は、８０ｍＮ／ｍが好ましく、１００ｍＮ／ｍがより好ましい。
含フッ素アルカンは、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよい。含フッ素アルカンの炭素数は、５～２０が好ましく、６～１０がより好ましい。含フッ素アルカンはアルカンの水素原子のすべてがフッ素原子に置換されたペルフルオロアルカン、水素原子の一部がフッ素原子に置換されたハイドロフルオロアルカン、水素原子の一部またはすべてがフッ素原子と塩素原子に置換されたクロロフルオロアルカンなどが挙げられる。
含フッ素アルカンの具体例としては、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロノナン、ペルフルオロデカン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロ（１，３－ジメチルシクロヘキサン）、ペルフルオロデカリン、ジクロロペンタフルオロプロパン、１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６－トリデカフルオロオクタン、１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６－トリデカフルオロヘキサン、１，１，１，２，２，３，３，４，４－ノナフルオロヘキサン、１，１，１，２，２，３，４，５，５，５－デカフルオロペンタン、１，１，２，２，３，３，４－ヘプタフルオロシクロペンタン、３Ｍ社製のＦＣ－８７、ＦＣ－８４、ＦＣ－７７、ペルフルオロケロセンなどが挙げられる。
含フッ素アルカンの具体例としては、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロノナン、ペルフルオロデカン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロ（１，３－ジメチルシクロヘキサン）、ペルフルオロデカリン、ジクロロペンタフルオロプロパン、１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６－トリデカフルオロオクタン、１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６－トリデカフルオロヘキサン、１，１，１，２，２，３，３，４，４－ノナフルオロヘキサン、１，１，１，２，２，３，４，５，５，５－デカフルオロペンタン、１，１，２，２，３，３，４－ヘプタフルオロシクロペンタン、３Ｍ社製のＦＣ－８７、ＦＣ－８４、ＦＣ－７７、ペルフルオロケロセンなどが挙げられる。
含フッ素オレフィンは、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよいが、直鎖状または分岐鎖状が好ましい。含フッ素オレフィンの炭素数は、５～２０が好ましく、６～１０がより好ましい。含フッ素オレフィンに含まれる不飽和結合数は、１～１０が好ましく、１～５がより好ましい。含フッ素オレフィンはオレフィンの水素原子のすべてがフッ素原子に置換されたペルフルオロオレフィン、水素原子の一部がフッ素原子に置換されたハイドロフルオロオレフィン、水素原子の一部またはすべてがフッ素原子と塩素原子に置換されたクロロフルオロオレフィンなどが挙げられる。
含フッ素オレフィンの具体例としては、ペルフルオロシクロペンテン、ペルフルオロシクロヘキセン、ペルフルオロシクロヘプテン、ペルフルオロシクロオクテン、ペルフルオロシクロノネン、ペルフルオロシクロデセン、１－クロロ－３，３，３－トリフルオロプロペン、１－クロロ－２，３，３－トリフルオロプロペン、１，１，１，２，２，３，５，５，６，６，７，７，７－トリデカフルオロ－４－メトキシ－３－ヘプテンなどが挙げられる。
含フッ素オレフィンの具体例としては、ペルフルオロシクロペンテン、ペルフルオロシクロヘキセン、ペルフルオロシクロヘプテン、ペルフルオロシクロオクテン、ペルフルオロシクロノネン、ペルフルオロシクロデセン、１－クロロ－３，３，３－トリフルオロプロペン、１－クロロ－２，３，３－トリフルオロプロペン、１，１，１，２，２，３，５，５，６，６，７，７，７－トリデカフルオロ－４－メトキシ－３－ヘプテンなどが挙げられる。
含フッ素アルキルエーテルは、酸素原子に結合する２つのアルキル基のうち少なくとも一方にフッ素原子が１以上置換していればよい。含フッ素アルキルエーテルを構成するフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよいが、直鎖状または分岐鎖状が好ましい。含フッ素アルキルエーテルに含まれるアルキル基部分の炭素数は、５～２０が好ましく、６～１０がより好ましい。含フッ素アルキルエーテルに含まれるフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は同一であっても、異なっていてもよい。含フッ素アルキルエーテルはアルキルエーテルの水素原子のすべてがフッ素原子に置換されたペルフルオロアルキルエーテル、水素原子の一部がフッ素原子に置換されたハイドロフルオロアルキルエーテル、水素原子の一部またはすべてがフッ素原子と塩素原子に置換されたクロロフルオロアルキルエーテルなどが挙げられる。
含フッ素アルキルエーテルの具体例としては、１，１，２，２－テトラフルオロエチル－２，２，２－トリフルオロエチルエーテル、１－メトキシ－１，１，２，２，３，３，３－ヘプタフルオロプロパン、１－エトキシ－１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロブタン、３－メトキシ－１，１，１，２，２，３，４，４，５，５，６，６，６－トリデカフルオロヘキサン、１－メトキシ－１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６，６－トリデカフルオロヘキサン、メチルノナフルオロイソブチルエーテル、エチルノナフルオロブチルエーテル、エチルノナフルオロイソブチルエーテル、１、１、１、２、２、３、４、５、５、５－デカフルオロ－３－メトキシ－４－（トリフルオロメチル）ペンタン、ＳＯＬＶＥＹ社製のＧＡＬＤＥＮ ＨＴ５５、ＧＡＬＤＥＮ ＨＴ７０、ＧＡＬＤＥＮ ＨＴ９０、ＧＡＬＤＥＮ ＺＴ１５０、ＧＡＬＤＥＮ ＨＴ１７０、ＧＡＬＤＥＮ ＺＴ１８０、ＧＡＬＤＥＮ ＨＴ２００、ＦＯＭＢＬＩＮＥ Ｙなどが挙げられる。
含フッ素アルキルエーテルの具体例としては、１，１，２，２－テトラフルオロエチル－２，２，２－トリフルオロエチルエーテル、１－メトキシ－１，１，２，２，３，３，３－ヘプタフルオロプロパン、１－エトキシ－１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロブタン、３－メトキシ－１，１，１，２，２，３，４，４，５，５，６，６，６－トリデカフルオロヘキサン、１－メトキシ－１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６，６－トリデカフルオロヘキサン、メチルノナフルオロイソブチルエーテル、エチルノナフルオロブチルエーテル、エチルノナフルオロイソブチルエーテル、１、１、１、２、２、３、４、５、５、５－デカフルオロ－３－メトキシ－４－（トリフルオロメチル）ペンタン、ＳＯＬＶＥＹ社製のＧＡＬＤＥＮ ＨＴ５５、ＧＡＬＤＥＮ ＨＴ７０、ＧＡＬＤＥＮ ＨＴ９０、ＧＡＬＤＥＮ ＺＴ１５０、ＧＡＬＤＥＮ ＨＴ１７０、ＧＡＬＤＥＮ ＺＴ１８０、ＧＡＬＤＥＮ ＨＴ２００、ＦＯＭＢＬＩＮＥ Ｙなどが挙げられる。
含フッ素アルキルアミンは、一級アミン、二級アミンおよび三級アミンのいずれでもよく、なかでも三級アミンが好ましい。含フッ素アルキルアミンは、窒素原子に結合するアルキル基のうちの少なくとも１つにフッ素原子が１以上置換していればよい。含フッ素アルキルアミンを構成するフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分は、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよいが、直鎖状または分岐鎖状が好ましい。含フッ素アルキルアミンに含まれる１つのアルキル基部分の炭素数は、３～５０が好ましく、９～３０がより好ましい。含フッ素アルキルアミンに含まれるフッ素原子で置換されていてもよいアルキル基部分が２以上ある場合、それらは同一であっても、異なっていてもよい。含フッ素アルキルアミンとしては、アルキルアミンの水素原子のすべてがフッ素原子に置換されたペルフルオロアルキルアミン、水素原子の一部がフッ素原子に置換されたハイドロフルオロアルキルアミン、水素原子の一部またはすべてがフッ素原子と塩素原子に置換されたクロロフルオロアルキルアミンなどが挙げられる。
含フッ素アルキルアミンの具体例としては、ペルフルオロトリプロピルアミン、ペルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロトリペンチルアミン、ペルフルオロトリヘキシルアミン、ペルフルオロトリヘプチルアミン、ペルフルオロトリオクチルアミン、ペルフルオロトリノニルアミン、ペルフルオロトリデシルアミンなどが挙げられる。
含フッ素アルキルアミンの具体例としては、ペルフルオロトリプロピルアミン、ペルフルオロトリブチルアミン、ペルフルオロトリペンチルアミン、ペルフルオロトリヘキシルアミン、ペルフルオロトリヘプチルアミン、ペルフルオロトリオクチルアミン、ペルフルオロトリノニルアミン、ペルフルオロトリデシルアミンなどが挙げられる。
含フッ素芳香族化合物は、芳香族化合物に少なくとも１以上のフッ素原子が置換している化合物である。含フッ素芳香族化合物の炭素数は、５～３０が好ましく、６～１０がより好ましい。含フッ素芳香族化合物としては、芳香族化合物中の水素原子のすべてがフッ素原子に置換された化合物、水素原子の一部がフッ素原子に置換された化合物、水素原子の一部またはすべてがフッ素原子と塩素原子に置換された化合物などが挙げられる。
含フッ素芳香族化合物の具体例としては、モノフルオロベンゼン、ジフルオロベンゼン、トリフルオロベンゼン、テトラフルオロベンゼン、ペンタフルオロベンゼン、ヘキサフルオロベンゼンなどが挙げられる。
含フッ素芳香族化合物の具体例としては、モノフルオロベンゼン、ジフルオロベンゼン、トリフルオロベンゼン、テトラフルオロベンゼン、ペンタフルオロベンゼン、ヘキサフルオロベンゼンなどが挙げられる。
炭化水素溶媒は、炭素原子と水素原子とからなる溶媒であり、例えば、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素溶媒、ペンタン、ヘキサン、オクタン、デカン、２，２，４－トリメチルペンタン、２，２，３－トリメチルヘキサンなどの脂肪族炭化水素溶媒が挙げられる。
シリコーン溶媒としては、例えば、ジメチルシリコーンオイル、メチルフェニルシリコーンオイル、メチルハイドロジェンシリコーンオイルなどのストレートシリコーンオイル、環状ジメチルシリコーンなどの環状ポリシロキサンなどが挙げられる。
なお、上述した親水性溶媒の種類は特に制限されないが、例えば、プロピレングリコール１－モノメチルエーテルなどのエーテル溶媒や乳酸エチルなどのエステル溶媒が挙げられる。
（手順）
撥水層と特定溶媒とを接触させる方法は特に制限されないが、例えば、図３に示すように、液体培地Ｌが収容された容器１０内に特定溶媒Ｓを添加する方法が挙げられる。この方法においては、図４に示すように、特定溶媒Ｓ中に細胞培養基材１６が浸漬するようになるまで、特定溶媒Ｓを容器１０内に添加する。上述したように、特定溶媒Ｓと接触した撥水層１４の運動性が上昇し、撥水層１４上で培養された細胞Ｃが撥水層１４上から剥離し、細胞を容易に回収できる。
なお、この方法で使用される特定溶媒Ｓとしては、液体培地Ｌよりも比重の大きい溶媒が選択される。より具体的には、特定溶媒Ｓとしては、比重が１．０超である特定溶媒が好ましい。このような特定溶媒Ｓが液体培地Ｌに加えられると、特定溶媒Ｓが液体培地Ｌよりも下層側に移動する。なお、上記比重は、１．２以上がより好ましい。比重の上限値は特に制限されないが、２．１が好ましい。
この方法であれば、単に液体培地Ｌを含む容器中に特定溶媒Ｓを滴下するのみで、細胞を剥離することができ、非常に簡便な方法といえる。
撥水層と特定溶媒とを接触させる方法は特に制限されないが、例えば、図３に示すように、液体培地Ｌが収容された容器１０内に特定溶媒Ｓを添加する方法が挙げられる。この方法においては、図４に示すように、特定溶媒Ｓ中に細胞培養基材１６が浸漬するようになるまで、特定溶媒Ｓを容器１０内に添加する。上述したように、特定溶媒Ｓと接触した撥水層１４の運動性が上昇し、撥水層１４上で培養された細胞Ｃが撥水層１４上から剥離し、細胞を容易に回収できる。
なお、この方法で使用される特定溶媒Ｓとしては、液体培地Ｌよりも比重の大きい溶媒が選択される。より具体的には、特定溶媒Ｓとしては、比重が１．０超である特定溶媒が好ましい。このような特定溶媒Ｓが液体培地Ｌに加えられると、特定溶媒Ｓが液体培地Ｌよりも下層側に移動する。なお、上記比重は、１．２以上がより好ましい。比重の上限値は特に制限されないが、２．１が好ましい。
この方法であれば、単に液体培地Ｌを含む容器中に特定溶媒Ｓを滴下するのみで、細胞を剥離することができ、非常に簡便な方法といえる。
また、上記方法以外にも、図５に示すように、容器１０内の液体培地Ｌを一旦除去した後、図６に示すように、容器１０内に特定溶媒Ｓを添加して、特定溶媒Ｓ中に細胞培養基材１６を浸漬させて、特定溶媒Ｓと撥水層１４とを接触させる方法も挙げられる。
この方法においては、特定溶媒Ｓの比重は特に制限されないが、その後の細胞の回収が容易な点で、比重が１．０未満である特定溶媒を用いることが好ましい。比重が１．０未満である特定溶媒を用いる場合、図６に示す特定溶媒Ｓ中にさらに水を添加すると、図７に示すように、特定溶媒Ｓが上相に水Ｗが下相に位置する相分離構造が得られる。このような相分離構造が形成されると、通常、細胞は水相に移動する。よって、この場合、遠心分離操作などによって細胞を含む水相を容易に回収することができ、細胞の回収効率性に優れる。なお、上記比重は、０．９５以下がより好ましい。比重の下限値は特に制限されないが、０．６が好ましい。
この方法においては、特定溶媒Ｓの比重は特に制限されないが、その後の細胞の回収が容易な点で、比重が１．０未満である特定溶媒を用いることが好ましい。比重が１．０未満である特定溶媒を用いる場合、図６に示す特定溶媒Ｓ中にさらに水を添加すると、図７に示すように、特定溶媒Ｓが上相に水Ｗが下相に位置する相分離構造が得られる。このような相分離構造が形成されると、通常、細胞は水相に移動する。よって、この場合、遠心分離操作などによって細胞を含む水相を容易に回収することができ、細胞の回収効率性に優れる。なお、上記比重は、０．９５以下がより好ましい。比重の下限値は特に制限されないが、０．６が好ましい。
なお、回収された細胞の形態は特に制限されず、細胞シート（細胞がシート状に集合したもの）であっても、個々の細胞がバラバラに分離したものであってもよい。
＜＜第２実施形態＞＞
本発明の細胞の製造方法の第２実施形態は、以下の第２の培養工程および回収工程を有する。
第２の培養工程：液体培地が収容され、かつ、底面上に撥水層が配置された容器内において、撥水層上で細胞の培養を行う工程
回収工程：撥水層と、特定溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程
第１実施形態では、培養容器とは別体の撥水層を有する基板が用いられていたのに対して、第２実施形態では、培養容器自体が基板であり、撥水層が容器の底面上に直接配置されている点以外は、同一の手順を実施するため、同一の手順（例えば、細胞の培養手順、回収工程の構成など）について説明を省略し、以下では、主に、第１実施形態との差異点について詳述する。
本発明の細胞の製造方法の第２実施形態は、以下の第２の培養工程および回収工程を有する。
第２の培養工程：液体培地が収容され、かつ、底面上に撥水層が配置された容器内において、撥水層上で細胞の培養を行う工程
回収工程：撥水層と、特定溶媒とを接触させて、撥水層上から細胞を剥離して回収する工程
第１実施形態では、培養容器とは別体の撥水層を有する基板が用いられていたのに対して、第２実施形態では、培養容器自体が基板であり、撥水層が容器の底面上に直接配置されている点以外は、同一の手順を実施するため、同一の手順（例えば、細胞の培養手順、回収工程の構成など）について説明を省略し、以下では、主に、第１実施形態との差異点について詳述する。
上述したように、本実施形態においては、容器と、容器の底面上に配置された撥水層とを有する撥水層付き容器が用いられる。つまり、容器の底部の少なくとも一部が、基材本体に該当する。より具体的には、図８に示すように、容器１０の底面上に撥水層１４が配置されており、容器１０内には液体培地Ｌが収容されている。
撥水層の構成は、第１実施形態と同様の構成である。
容器底面上に撥水層を形成する方法は特に制限されず、上述した第１実施形態で述べた方法が挙げられる。例えば、容器の底面上に共有結合を介して重合開始剤を固定し、重合開始剤が固定された容器とモノマーとを接触させて、重合反応を開始することにより、容器の底面上から延びるポリマー鎖が合成される。
撥水層の構成は、第１実施形態と同様の構成である。
容器底面上に撥水層を形成する方法は特に制限されず、上述した第１実施形態で述べた方法が挙げられる。例えば、容器の底面上に共有結合を介して重合開始剤を固定し、重合開始剤が固定された容器とモノマーとを接触させて、重合反応を開始することにより、容器の底面上から延びるポリマー鎖が合成される。
なお、必要に応じて、容器と撥水層との間には他の層が配置されていてもよい。例えば、両者の密着性を高めるためのプライマー層などが配置されていてもよい。
また、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）は、撥水層付き容器を用いて、上述した方法により測定できる。
また、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）は、撥水層付き容器を用いて、上述した方法により測定できる。
＜＜第３実施形態＞＞
本発明の細胞の製造方法の第３実施形態は、以下の第３の培養工程および回収工程を有する。
第３の培養工程：液体培地が収容され、かつ、粒状担体および粒状担体上に配置された撥水層を有する粒状の細胞培養基材が配置された容器内において細胞の培養を行う工程
回収工程：撥水層を有する粒状担体と、特定溶媒とを接触させて、該粒状担体の撥水層表面から細胞を剥離して回収する工程
上記第３実施形態において、撥水層を担持する担体の形状は、粒状である。つまり、細胞培養基材は、粒状担体と、粒状担体上に配置された撥水層とを有する粒状細胞培養基材である。撥水層を有する粒状の細胞培養基材は、接着培養と浮遊培養の両方の側面を持つマイクロキャリア培養に好適に適用できる。
本発明の細胞の製造方法の第３実施形態は、以下の第３の培養工程および回収工程を有する。
第３の培養工程：液体培地が収容され、かつ、粒状担体および粒状担体上に配置された撥水層を有する粒状の細胞培養基材が配置された容器内において細胞の培養を行う工程
回収工程：撥水層を有する粒状担体と、特定溶媒とを接触させて、該粒状担体の撥水層表面から細胞を剥離して回収する工程
上記第３実施形態において、撥水層を担持する担体の形状は、粒状である。つまり、細胞培養基材は、粒状担体と、粒状担体上に配置された撥水層とを有する粒状細胞培養基材である。撥水層を有する粒状の細胞培養基材は、接着培養と浮遊培養の両方の側面を持つマイクロキャリア培養に好適に適用できる。
粒状担体は、その表面上に撥水層が配置される、粒状の部材である。
粒状担体の形状の具体例としては、球状、楕円体状、立方体状、直方体状が挙げられる。
粒状担体の平均粒径は、マイクロキャリア培養への適用の点から、１００～１０００μｍが好ましく、２００～５００μｍがより好ましい。なお、この平均粒径は、５０％体積平均粒径（Ｄ５０）である。
粒状担体を構成する材料の具体例としては、樹脂、ガラス、金属、金属酸化物（ただし、ガラス以外）、金属窒化物などが挙げられる。
粒状担体の具体例としては、ガラスビーズ、樹脂粒子、シリカビーズなどが挙げられる。
粒状担体の形状の具体例としては、球状、楕円体状、立方体状、直方体状が挙げられる。
粒状担体の平均粒径は、マイクロキャリア培養への適用の点から、１００～１０００μｍが好ましく、２００～５００μｍがより好ましい。なお、この平均粒径は、５０％体積平均粒径（Ｄ５０）である。
粒状担体を構成する材料の具体例としては、樹脂、ガラス、金属、金属酸化物（ただし、ガラス以外）、金属窒化物などが挙げられる。
粒状担体の具体例としては、ガラスビーズ、樹脂粒子、シリカビーズなどが挙げられる。
粒状担体上に配置される撥水層の形態は、第１実施形態で述べた通りであり、所定の比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を満たす。
また、粒状担体上への撥水層の形成方法は、第１実施形態で述べた通りである。
なお、撥水層は、粒状担体上の少なくとも一部に配置されていればよく、全面に配置されているのが好ましい。
また、粒状担体上への撥水層の形成方法は、第１実施形態で述べた通りである。
なお、撥水層は、粒状担体上の少なくとも一部に配置されていればよく、全面に配置されているのが好ましい。
＜＜キット＞＞
本発明は、細胞を製造するためのキットにも関する。
キットは、基板および基板上に配置された撥水層を有する細胞培養基材と、特定溶媒とを有する、細胞の培養と該培養された細胞を回収するためのキットである。本キットは、上述した第１実施形態にて使用される。
本発明は、細胞を製造するためのキットにも関する。
キットは、基板および基板上に配置された撥水層を有する細胞培養基材と、特定溶媒とを有する、細胞の培養と該培養された細胞を回収するためのキットである。本キットは、上述した第１実施形態にて使用される。
また、キットの他の形態としては、容器の底面上に配置された撥水層を有する撥水層付き容器と、特定溶媒とを有するキットも挙げられる。本キットは、上述した第２実施形態にて使用される。
さらに、キットの他の形態としては、培養容器と、撥水層を有する粒状細胞培養基材と、特定溶媒とを有するキットも挙げられる。本キットは、上述した第３実施形態にて使用される。
さらに、キットの他の形態としては、培養容器と、撥水層を有する粒状細胞培養基材と、特定溶媒とを有するキットも挙げられる。本キットは、上述した第３実施形態にて使用される。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
＜細胞培養基材の作製＞
アミノシランコートスライドガラス（品番：Ｓ８１１１、松浪硝子工業社製）を１００ｍＬサンプル管に入れ、そこへ脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、関東化学社製）７０ｍＬ、重合開始基を有する２－ブロモイソブチリルブロミド（東京化成工業社製）１．８２ｍＬ、トリエチルアミン（関東化学社製）３．１５ｍＬを加え、重合開始基をスライドグラス表面に固定化する処理を行った。ミックスローターを用いて、サンプル管内の混合液を室温（約２５℃）で１時間撹拌した。その後、サンプル管内からスライドガラスを取り出し、メタノール、ＴＨＦを用いてスライドガラスを洗浄した後、窒素気流にて乾燥を行い、重合開始剤が固定されたスライドガラス（Ａ）を得た。
アミノシランコートスライドガラス（品番：Ｓ８１１１、松浪硝子工業社製）を１００ｍＬサンプル管に入れ、そこへ脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、関東化学社製）７０ｍＬ、重合開始基を有する２－ブロモイソブチリルブロミド（東京化成工業社製）１．８２ｍＬ、トリエチルアミン（関東化学社製）３．１５ｍＬを加え、重合開始基をスライドグラス表面に固定化する処理を行った。ミックスローターを用いて、サンプル管内の混合液を室温（約２５℃）で１時間撹拌した。その後、サンプル管内からスライドガラスを取り出し、メタノール、ＴＨＦを用いてスライドガラスを洗浄した後、窒素気流にて乾燥を行い、重合開始剤が固定されたスライドガラス（Ａ）を得た。
（細胞培養基材１の作製）
活性アルミナを用いてメタクリル酸２－（パーフルオロヘキシル）エチル（Ｃ６ＦＭＡ、旭硝子社製）の精製を行った後、乾燥窒素を用いて得られた精製物のバブリングを２０分間行った。１，３－ビス（トリフルオロメチル）ベンゼン（ｍＸＨＦ、東京化成工業社製）に対しても、乾燥窒素を用いたバブリングを２０分間行った。脱酸素ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、脱酸素トルエン、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、トリス（２－ピリジルメチル）アミン（ＴＰＭＡ）、臭化銅（ＩＩ）は購入したものをそのまま用いた。
以下の調製および反応では、上記で用意した試薬を使用した。また、以下の調製および反応はすべて窒素下で行った。
１００ｍＬサンプル管にスライドガラス（Ａ）と撹拌子とを入れ、そこへＡＩＢＮ（０．０２３ｇ）、脱酸素トルエン（１０．５ｍＬ）、ｍＸＨＦ（３８．５ｍＬ）、Ｃ６ＦＭＡ（１９．９ｍＬ）を加えた。さらに、臭化銅（ＩＩ）（０．００１６ｇ）およびＴＰＭＡ（０．００２０ｇ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解させて得られた溶液を、サンプル管内に滴下した。次に、オイルバス中にて、８０℃で１６時間にわたってサンプル管内の混合液を撹拌した。その後、サンプル管内からスライドガラスを取り出し、メタノール、アサヒクリンＡＫ―２２５（商品名、旭硝子社製）でスライドガラスを洗浄した後、窒素気流で乾燥を行い、細胞培養基材１を得た。
なお、細胞培養基材１中の撥水層には、ポリ（メタクリル酸２－（パーフルオロヘキシル）エチル）（以下、「ＰＣ６ＦＭＡ」ともいう。）が含まれていた。
なお、上記「アサヒクリンＡＫ－２２５」は、後述の特定溶媒３と同じ溶媒である。
活性アルミナを用いてメタクリル酸２－（パーフルオロヘキシル）エチル（Ｃ６ＦＭＡ、旭硝子社製）の精製を行った後、乾燥窒素を用いて得られた精製物のバブリングを２０分間行った。１，３－ビス（トリフルオロメチル）ベンゼン（ｍＸＨＦ、東京化成工業社製）に対しても、乾燥窒素を用いたバブリングを２０分間行った。脱酸素ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、脱酸素トルエン、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、トリス（２－ピリジルメチル）アミン（ＴＰＭＡ）、臭化銅（ＩＩ）は購入したものをそのまま用いた。
以下の調製および反応では、上記で用意した試薬を使用した。また、以下の調製および反応はすべて窒素下で行った。
１００ｍＬサンプル管にスライドガラス（Ａ）と撹拌子とを入れ、そこへＡＩＢＮ（０．０２３ｇ）、脱酸素トルエン（１０．５ｍＬ）、ｍＸＨＦ（３８．５ｍＬ）、Ｃ６ＦＭＡ（１９．９ｍＬ）を加えた。さらに、臭化銅（ＩＩ）（０．００１６ｇ）およびＴＰＭＡ（０．００２０ｇ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解させて得られた溶液を、サンプル管内に滴下した。次に、オイルバス中にて、８０℃で１６時間にわたってサンプル管内の混合液を撹拌した。その後、サンプル管内からスライドガラスを取り出し、メタノール、アサヒクリンＡＫ―２２５（商品名、旭硝子社製）でスライドガラスを洗浄した後、窒素気流で乾燥を行い、細胞培養基材１を得た。
なお、細胞培養基材１中の撥水層には、ポリ（メタクリル酸２－（パーフルオロヘキシル）エチル）（以下、「ＰＣ６ＦＭＡ」ともいう。）が含まれていた。
なお、上記「アサヒクリンＡＫ－２２５」は、後述の特定溶媒３と同じ溶媒である。
（細胞培養基材２の作製）
メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）を活性アルミナにより、精製した。脱酸素ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、トリス（２－ピリジルメチル）アミン（ＴＰＭＡ）、臭化銅（ＩＩ）は購入したものをそのまま用いた。
以下の調製および反応では、上記で用意した試薬を使用した。また、以下の調製および反応はすべて窒素下で行った。
１００ｍＬサンプル管にスライドガラス（Ａ）と撹拌子とを入れ、そこへＡＩＢＮ（０．０３３ｇ）、ＭＭＡ（７０ｍＬ）を加えた。さらに、臭化銅（ＩＩ）（０．００１６ｇ）およびＴＰＭＡ（０．００２９ｇ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解させて得られた溶液を、サンプル管内に滴下した。次に、オイルバス中にて、６０℃で４時間にわたってサンプル管内の混合液を撹拌した。その後、サンプル管内からスライドガラスを取り出し、メタノール、トルエンでスライドガラスを洗浄した後、窒素気流で乾燥を行い、細胞培養基材２を得た。
なお、細胞培養基材２中の撥水層には、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）が含まれていた。
メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）を活性アルミナにより、精製した。脱酸素ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、トリス（２－ピリジルメチル）アミン（ＴＰＭＡ）、臭化銅（ＩＩ）は購入したものをそのまま用いた。
以下の調製および反応では、上記で用意した試薬を使用した。また、以下の調製および反応はすべて窒素下で行った。
１００ｍＬサンプル管にスライドガラス（Ａ）と撹拌子とを入れ、そこへＡＩＢＮ（０．０３３ｇ）、ＭＭＡ（７０ｍＬ）を加えた。さらに、臭化銅（ＩＩ）（０．００１６ｇ）およびＴＰＭＡ（０．００２９ｇ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解させて得られた溶液を、サンプル管内に滴下した。次に、オイルバス中にて、６０℃で４時間にわたってサンプル管内の混合液を撹拌した。その後、サンプル管内からスライドガラスを取り出し、メタノール、トルエンでスライドガラスを洗浄した後、窒素気流で乾燥を行い、細胞培養基材２を得た。
なお、細胞培養基材２中の撥水層には、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）が含まれていた。
（細胞培養基材３の作製）
２－エチルヘキシルメタクリレート（ＥＨＭＡ）を活性アルミナにより、精製した。脱酸素ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、脱酸素トルエン、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、トリス（２－ピリジルメチル）アミン（ＴＰＭＡ）、臭化銅（ＩＩ）は購入したものをそのまま用いた。
以下の調製および反応では、上記で用意した試薬を使用した。また、以下の調製および反応はすべて窒素下で行った。
１００ｍＬサンプル管にスライドガラス（Ａ）と撹拌子とを入れ、そこへＡＩＢＮ（０．０２３ｇ）、ＥＨＭＡ（３３ｍＬ）、脱酸素トルエン（３５ｍＬ）を加えた。さらに、臭化銅（ＩＩ）（０．００２２ｇ）およびＴＰＭＡ（０．００２９ｇ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解させて得られた溶液を、サンプル管内に滴下した。次に、オイルバス中にて、６０℃で４時間にわたってサンプル管内の混合液を撹拌した。その後、サンプル管内からスライドガラスを取り出し、メタノール、トルエンでスライドガラスを洗浄した後、窒素気流で乾燥を行い、細胞培養基材３を得た。
なお、細胞培養基材３中の撥水層には、ポリ（２－エチルヘキシルメタクリレート）（以下、「ＰＥＨＭＡ」ともいう。）が含まれていた。
２－エチルヘキシルメタクリレート（ＥＨＭＡ）を活性アルミナにより、精製した。脱酸素ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、脱酸素トルエン、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、トリス（２－ピリジルメチル）アミン（ＴＰＭＡ）、臭化銅（ＩＩ）は購入したものをそのまま用いた。
以下の調製および反応では、上記で用意した試薬を使用した。また、以下の調製および反応はすべて窒素下で行った。
１００ｍＬサンプル管にスライドガラス（Ａ）と撹拌子とを入れ、そこへＡＩＢＮ（０．０２３ｇ）、ＥＨＭＡ（３３ｍＬ）、脱酸素トルエン（３５ｍＬ）を加えた。さらに、臭化銅（ＩＩ）（０．００２２ｇ）およびＴＰＭＡ（０．００２９ｇ）をＤＭＦ（０．４ｍＬ）に溶解させて得られた溶液を、サンプル管内に滴下した。次に、オイルバス中にて、６０℃で４時間にわたってサンプル管内の混合液を撹拌した。その後、サンプル管内からスライドガラスを取り出し、メタノール、トルエンでスライドガラスを洗浄した後、窒素気流で乾燥を行い、細胞培養基材３を得た。
なお、細胞培養基材３中の撥水層には、ポリ（２－エチルヘキシルメタクリレート）（以下、「ＰＥＨＭＡ」ともいう。）が含まれていた。
＜実施例１＞
ＩＷＡＫＩ製のディッシュ（６０ｍｍ／ｎｏｎ―ｔｒｅａｔｅｄ ｄｉｓｈ 型番１０１０－０６０）に、２ｃｍ角にカットした細胞培養基材１を入れて、細胞培養基材１にＵＶを１５分間照射して、滅菌した。
次に、細胞（ＴＩＧ３）を２０万細胞／Ｄｉｓｈとなるよう播種し、ディッシュに液体培地（Ｇｉｂｃｏ社製 ＭＥＭ）を４ｍＬ添加した。次に、得られたディッシュをインキュベータ内にて、３７℃で２４時間置き、その後、インキュベータよりディッシュを取り出した。顕微鏡にディッシュを設置し、含フッ素溶媒（特定溶媒１）４ｍＬをディッシュ内に滴下し、細胞培養基材１上の細胞の接着挙動の経時変化を観察した。
細胞培養基材１上の接着細胞が剥離すると、接着細胞が球状に変化するか、または、流されて細胞培養基材１上から無くなる。そこで、目視により、２０分後に、接着細胞が球状に変化する、または、流されて細胞培養基材１上から無くなる場合を「○」（良好）とし、５分後に接着細胞が球状に変化する、または、流されて細胞培養基材１上から無くなる場合を「◎」（優秀）、２０分後に変化がないものを「×」（不良）とした。
ＩＷＡＫＩ製のディッシュ（６０ｍｍ／ｎｏｎ―ｔｒｅａｔｅｄ ｄｉｓｈ 型番１０１０－０６０）に、２ｃｍ角にカットした細胞培養基材１を入れて、細胞培養基材１にＵＶを１５分間照射して、滅菌した。
次に、細胞（ＴＩＧ３）を２０万細胞／Ｄｉｓｈとなるよう播種し、ディッシュに液体培地（Ｇｉｂｃｏ社製 ＭＥＭ）を４ｍＬ添加した。次に、得られたディッシュをインキュベータ内にて、３７℃で２４時間置き、その後、インキュベータよりディッシュを取り出した。顕微鏡にディッシュを設置し、含フッ素溶媒（特定溶媒１）４ｍＬをディッシュ内に滴下し、細胞培養基材１上の細胞の接着挙動の経時変化を観察した。
細胞培養基材１上の接着細胞が剥離すると、接着細胞が球状に変化するか、または、流されて細胞培養基材１上から無くなる。そこで、目視により、２０分後に、接着細胞が球状に変化する、または、流されて細胞培養基材１上から無くなる場合を「○」（良好）とし、５分後に接着細胞が球状に変化する、または、流されて細胞培養基材１上から無くなる場合を「◎」（優秀）、２０分後に変化がないものを「×」（不良）とした。
＜実施例２～７、比較例１～６＞
使用される細胞培養基材の種類、特定溶媒の種類、および、細胞の種類を表１および２のように変更し、細胞種がｈＭＳＣの場合は培地をＭＳＣＧＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔＴＭ（型番ＰＴ－３００１）に変更した以外は、実施例１と同様の手順に従って、細胞の培養を行い、上記と同様の剥離性の評価を実施した。ただし、特定溶媒４においては比重が液体培地より小さいため溶媒添加後に培地相を除去し溶媒と基板を接触させた。
結果を以下の表１および２にまとめて示す。
なお、表１および２中の特定溶媒の種類は以下の通りである。また、以下の使用した特定溶媒は、いずれも、２５℃における水に対する溶解度が５０ｇ／Ｌ以下であった。
特定溶媒１：１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６－トリデカフルオロオクタン
特定溶媒２：１，１，１，２，２，３，４，５，５，５－デカフルオロ－３－メトキシ－４－（トリフルオロメチル）ペンタン
特定溶媒３：ジクロロペンタフルオロプロパン（３，３－ジクロロ－１，１，１，２，２－ペンタフルオロプロパンおよび１，３－ジクロロ－１，１，２，２，３－ペンタフルオロプロパンの２種の溶媒の混合液に該当）
特定溶媒４：ヘキサン
特定溶媒５：パーフルオロポリエーテル（Chemours社 Krytox GPL100）
使用される細胞培養基材の種類、特定溶媒の種類、および、細胞の種類を表１および２のように変更し、細胞種がｈＭＳＣの場合は培地をＭＳＣＧＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔＴＭ（型番ＰＴ－３００１）に変更した以外は、実施例１と同様の手順に従って、細胞の培養を行い、上記と同様の剥離性の評価を実施した。ただし、特定溶媒４においては比重が液体培地より小さいため溶媒添加後に培地相を除去し溶媒と基板を接触させた。
結果を以下の表１および２にまとめて示す。
なお、表１および２中の特定溶媒の種類は以下の通りである。また、以下の使用した特定溶媒は、いずれも、２５℃における水に対する溶解度が５０ｇ／Ｌ以下であった。
特定溶媒１：１，１，１，２，２，３，３，４，４，５，５，６，６－トリデカフルオロオクタン
特定溶媒２：１，１，１，２，２，３，４，５，５，５－デカフルオロ－３－メトキシ－４－（トリフルオロメチル）ペンタン
特定溶媒３：ジクロロペンタフルオロプロパン（３，３－ジクロロ－１，１，１，２，２－ペンタフルオロプロパンおよび１，３－ジクロロ－１，１，２，２，３－ペンタフルオロプロパンの２種の溶媒の混合液に該当）
特定溶媒４：ヘキサン
特定溶媒５：パーフルオロポリエーテル（Chemours社 Krytox GPL100）
使用した細胞を以下に示す。
ＴＩＧ３：ヒト胎児肺由来線維芽細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク、Cat.No. JCRB0506
ｈＭＳＣ：間葉系幹細胞、ＰＴ－２５０１、ロンザジャパン社
ＴＩＧ３：ヒト胎児肺由来線維芽細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク、Cat.No. JCRB0506
ｈＭＳＣ：間葉系幹細胞、ＰＴ－２５０１、ロンザジャパン社
なお、比較例２および５においては、細胞培養基材４としてＩＷＡＫＩ製のディッシュを用いた。上記ＩＷＡＫＩ製のディッシュには、撥水層が含まれていなかった。
また、各実施例および比較例にて得られた細胞培養基材を用いて、上述した方法により比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を算出した。
また、各実施例および比較例にて得られた細胞培養基材を用いて、上述した方法により比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を算出した。
表１および２より、所定の比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）を満たす場合、細胞培養基材から細胞を容易に剥離でき、細胞を容易に製造できることが確認された。
また、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が０．００２以下の場合、細胞の剥離性がより優れることが確認された。
また、上記比（弾性率Ｂ／弾性率Ａ）が０．００２以下の場合、細胞の剥離性がより優れることが確認された。
なお、基板の代わりに、容器を用いて、実施例１と同様の操作を行ったところ、実施例１と同様の結果が得られた。つまり、撥水層付き容器を用いた場合でも、所望の効果が得られた。
また、基板の代わりに、ガラスビーズ（粒径５００μｍ）を用いて、細胞培養基材２と同様の操作を行った後、得られたガラスビーズを用いて実施例３および実施例６と同様の操作を行ったところ、実施例３および実施例６と同様の結果が得られた。つまり、粒状の細胞培養基材を用いた場合でも、所望の効果が得られた。
なお、２０１７年１月２０日に出願された日本特許出願２０１７－８６４６号および２０１７年１２月２６日に出願された日本特許出願２０１７－２４８９１８号の明細書、特許請求の範囲、図面、及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
なお、２０１７年１月２０日に出願された日本特許出願２０１７－８６４６号および２０１７年１２月２６日に出願された日本特許出願２０１７－２４８９１８号の明細書、特許請求の範囲、図面、及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
１０ 容器
１２ 基板
１４ 撥水層
１６ 細胞培養基材
１２ 基板
１４ 撥水層
１６ 細胞培養基材
Claims (15)
- 基材本体と前記基材本体上に配置された撥水層とを有する細胞培養基材の前記撥水層上で細胞の培養を行う培養工程と、
前記撥水層と溶媒とを接触させて、前記撥水層上から前記細胞を剥離して回収する回収工程とを有し、
前記溶媒が、下記弾性率Ｂ／弾性率Ａが０．２以下となる溶媒であることを特徴とする細胞の製造方法。
弾性率Ｂ／弾性率Ａ：前記撥水層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される前記撥水層と前記リン酸緩衝生理食塩水との接触部分での前記撥水層の弾性率Ａに対する、前記撥水層と溶媒とを接触させて測定される前記撥水層の前記溶媒との接触部分での前記撥水層の弾性率Ｂの比。 - 前記基材本体が、基板または粒状担体で構成され、
前記培養工程が、液体培地が収容された容器の底面上に前記細胞培養基材を配置して、前記撥水層上で細胞の培養を行う工程である、請求項１に記載の製造方法。 - 前記基材本体が、容器の底部の少なくとも一部を構成し、
前記培養工程が、液体培地が収容された前記容器内に配置される前記撥水層上で細胞の培養を行う工程である、請求項１に記載の製造方法。 - 前記細胞培養基材が、粒状担体および粒状担体上に配置された撥水層を有する粒状の細胞培養基材である、請求項１に記載の製造方法。
- 前記撥水層の材料が、撥水性ないし疎水性の樹脂である、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記撥水層の材料が、フッ素樹脂、アクリル樹脂、およびシリコーン樹脂からなる群から選択される樹脂である、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記フッ素樹脂が、フルオロアルキルメタクリレートまたはフルオロアルキルアクリレートに由来する単位を有する重合体である、請求項６に記載の製造方法。
- 前記アクリル樹脂が、アルキルメタクリレートまたはアルキルアクリレートに由来する単位を有する重合体である、請求項６に記載の製造方法。
- 前記溶媒が、前記培養工程における培養に使用された液体培地と相分離しかつ該液体培地よりも高比重の溶媒である、請求項１～８のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記溶媒が含フッ素溶媒である、請求項９に記載の製造方法。
- 前記含フッ素溶媒が、フッ素含有量が１５質量％以上であって、かつ、水に対する溶解度（２５℃）が５０ｇ／リットル以下の含フッ素溶媒である、請求項１０に記載の製造方法。
- 前記含フッ素溶媒が、含フッ素アルカン、含フッ素オレフィン、含フッ素アルキルエーテル、含フッ素アルキルアミン、および含フッ素芳香族化合物からなる群から選ばれた含フッ素溶媒である、請求項１０または１１に記載の製造方法。
- 前記溶媒が、前記培養工程における培養に使用された液体培地と相分離しかつ該液体培地よりも低比重の溶媒である、請求項１～８のいずれか１項に記載の製造方法。
- 撥水性表面を有する細胞培養基材の該撥水性表面上で培養された細胞を、該撥水性表面と細胞との接触面に下記弾性率Ｂ／弾性率Ａが０．２以下となる溶媒を接触させることにより、該撥水性表面から剥離して回収することを特徴とする培養細胞の回収方法。
弾性率Ｂ／弾性率Ａ：前記撥水性表面を有する層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される前記撥水性表面を有する層と前記リン酸緩衝生理食塩水との接触部分での前記撥水性表面を有する層の弾性率Ａに対する、前記撥水性表面を有する層と溶媒とを接触させて測定される前記撥水性表面を有する層の前記溶媒との接触部分での前記撥水性表面を有する層の弾性率Ｂの比。 - 基板および前記基板上に配置された撥水層を有する細胞培養基材または粒状担体および粒状担体上に配置された撥水層を有する粒状の細胞培養基材と、下記弾性率Ｂ／弾性率Ａが０．２以下となる溶媒とを有する、細胞の培養と該培養された細胞を回収するためのキット。
弾性率Ｂ／弾性率Ａ：前記撥水層とリン酸緩衝生理食塩水とを接触させて測定される前記撥水層とリン酸緩衝生理食塩水との接触部分での前記撥水層の弾性率Ａに対する、前記撥水層と溶媒とを接触させて測定される前記撥水層の前記溶媒との接触部分での前記撥水層の弾性率Ｂの比。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017-008646 | 2017-01-20 | ||
| JP2017008646 | 2017-01-20 | ||
| JP2017248918A JP2020043766A (ja) | 2017-01-20 | 2017-12-26 | 細胞の製造方法、キット |
| JP2017-248918 | 2017-12-26 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2018135593A1 true WO2018135593A1 (ja) | 2018-07-26 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2018/001441 Ceased WO2018135593A1 (ja) | 2017-01-20 | 2018-01-18 | 細胞の製造方法および細胞を製造するためのキット |
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| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2018135593A1 (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015133532A1 (ja) * | 2014-03-04 | 2015-09-11 | ダイキン工業株式会社 | 高分子基材、その用途及びその製造方法 |
| WO2015163043A1 (ja) * | 2014-04-22 | 2015-10-29 | 株式会社日本触媒 | フッ素含有ポリマーを表面に含む細胞培養用基材 |
| WO2016121994A1 (ja) * | 2015-01-29 | 2016-08-04 | ダイキン工業株式会社 | 細胞培養器材 |
| JP2016171778A (ja) * | 2015-03-17 | 2016-09-29 | 株式会社日本触媒 | 細胞培養用基材 |
-
2018
- 2018-01-18 WO PCT/JP2018/001441 patent/WO2018135593A1/ja not_active Ceased
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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