WO2018124929A1 - Способ снятия микрочастиц и микроследов с объекта растительного и животного происхождения - Google Patents
Способ снятия микрочастиц и микроследов с объекта растительного и животного происхождения Download PDFInfo
- Publication number
- WO2018124929A1 WO2018124929A1 PCT/RU2017/000391 RU2017000391W WO2018124929A1 WO 2018124929 A1 WO2018124929 A1 WO 2018124929A1 RU 2017000391 W RU2017000391 W RU 2017000391W WO 2018124929 A1 WO2018124929 A1 WO 2018124929A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- micro
- microparticles
- traces
- plant
- animal origin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
Definitions
- the invention relates to the study or analysis of materials, namely, to obtain samples for research, in particular microparticles and micro-traces from a carrier object of plant and animal origin, and can be used in palynology, biology, ecology, medicine for spore-pollen analysis , forensic, merchandising and environmental expertise.
- a method for detecting the presence of submicron particles in a sample taken from the environment.
- the method includes sampling from the environment, purification and concentration of submicron particles in the sample based on particle size.
- the purified and concentrated particles are detected using a device that includes an electrospray assembly having a capillary, a differential mobility analyzer that receives an output signal from the capillary, and a particle condensation device for counting the number of particles that pass through the differential mobility analyzer.
- this method is designed to capture particles smaller than 1 micron in size from air, which is much smaller than the size of organic dust particles, including pollen grains, whose size range is 10-100 microns.
- the method employs a device - an electrospray assembly.
- the pollen of higher plants is characterized by the presence of an electric charge, but one flower contains a different number of pollen grains, charged both positively and negatively.
- the charge of pollen is extremely small and is in the range of 10 "16 - 0 " 17 C.
- This method is also not applicable for the collection of microparticles from deep pores, cracks in the surface of a macro object.
- the average size of bacteria is 0.5-5 microns, which is much smaller than the size of pollen grains. Therefore, this method is not applicable for macroobjects of plant and animal origin, because it does not allow to separate large “garbage” - pollen grains and spores - from bacterial cells in full. In addition, pollen grains and spores in excrement should not be normal, because this indicates a violation of peristalsis and too rapid evacuation of food masses from the intestine.
- the closest in technical essence to the proposed method is a method of removing microparticles and micro-traces from objects-carriers by the vacuum method (for example, a vacuum cleaner, special nozzles, filters); removal of microparticles by ultrasound in inert environments; exemption microparticles using ultrasonic cavitation in the environment of Freon-1 13.
- the methods are used in medicine, forensic science, merchandising, palynomorphological and other studies (Gladkova AN, Grichuk V.P., Zaklinskaya E.D. et al. Pollen test, 1950 ; GOST 31769-2012 Medical method for determining the frequency of occurrence of pollen grains; Karevskaya I.A.
- a method of sampling microparticles, i.e. pollen grains and spores from liquid substances, for example, honey are based on the addition of distilled water to the sample and centrifugation in two stages. The precipitate is stained with a 0.1% alcohol solution of fuchsin. Then the drug is fixed in glycerol-gelatin and the morphology of pollen grains is determined.
- This method is operational and provides identification of a large number of species of pollen grains and spores from liquid media, but is not applicable for removing microobjects from the surface and roughnesses of a carrier object.
- the technical problem to which the claimed invention is directed is the insufficient quality of samples containing macro- and micro-objects, i.e. purity of samples in which there are many impurities of other microparticles, in addition to pollen grains and spores, the destruction of micro-objects to unidentifiable residues in the process of removal, separation and preparation (alkaline hydrolysis) for registration.
- the technical result of the claimed invention is to improve the quality of samples 5 at the preparatory stages and to obtain the most complete set of microparticles and microseeds due to the choice of solvents and flushing modes, which allows to accelerate routine work when removing microparticles and microseeds of plant and animal origin from the carrier object, to increase the efficiency of the results identification analysis in general.
- the specified technical result is achieved due to the fact that in the method of removing microparticles and micro-traces from an object of plant and animal origin from the surface of the carrier object, the material is washed off physically-mechanically at a temperature of 20-25 ° C in a solution of monobasic carboxylic acid with the addition of surface active
- the method can carry out additional washing of the material from deep 20 layers of the surface of the carrier object under ultrasonic treatment at a temperature of 35-45 ° C in a solution of monobasic carboxylic acid with the addition of a surfactant with further sedimentation, after which alkaline hydrolysis of the precipitate is carried out using a mixture of ammonia alcohol and alkali, followed by washing, drying and 25 staining of microparticles and micro-traces.
- the achievement of the indicated technical result is ensured by using the non-destructive principle of removing microparticles and micro-traces of plant and animal origin from the carrier object.
- the material is washed off at room temperature (20-25 ° C) in a solution of monobasic carboxylic acid with the addition of a surfactant and subsequent sedimentation. Then, mild alkaline hydrolysis (a mixture of ammonia and alkali) is carried out during boiling, followed by washing, drying and staining of microparticles and micro-traces.
- the proposed method is affordable, ergonomic and environmentally friendly.
- FIG. 1-2 show:
- FIG. 1 is an algorithm for implementing the method with the main flush
- FIG. 2 is an algorithm for implementing the method with an additional flush. The method is implemented as follows.
- the first stage involves removing microparticles and micro-traces from the surface of the carrier object by the physicomechanical method on the orbital rocking chair (shaker) at a temperature of 20-25 ° C with a solution of monobasic carboxylic (acetic) acid with the addition of a surfactant, e.g. Polysorbate 20 (liquid soap, TWEEN_20). Sedimentation of aqueous solutions is carried out with the addition of sodium chloride at a temperature of 20-25 ° C in a laboratory centrifuge.
- a surfactant e.g. Polysorbate 20
- the second stage involves the removal of microparticles and micro-traces from the surface of the carrier object physically-mechanically in an ultrasonic bath at a temperature of 35-45 ° C with a solution of monobasic carboxylic (acetic) acid with the addition of Polysorbate 20 (liquid soap, TWEEN_20) .
- sedimentation is carried out.
- Alkaline hydrolysis of precipitates containing non-destroyed microobjects is carried out in an inert vessel in a boiling water bath with equal amounts of ammonia (NhUOH) and alkali (NaOH) added, followed by washing and drying of the precipitate by centrifugation.
- NhUOH ammonia
- NaOH alkali
- the resulting precipitates with microobjects are stained with an alcohol solution of fuchsin and the preparation is fixed in a glycerin-containing medium for the microscopy procedure using light microscopy.
- a precipitate is a component of a solution containing microparticles and micro-traces from a carrier object of biological origin.
- the carrier object is placed in a container with a tight lid of inert material. All dishes are also used from inert material.
- Example 1 A cardboard box from a pharmacy - Alder cones (fruits), 50g.
- a fat-free glass slide was placed on a heating table and a circle of wax was applied.
- One drop of the suspension with microobjects was placed in the center and covered with a coverslip.
- the finished product was microscopic using a professional biological light microscope.
- Flushing B After flushing A was obtained, 100 ml of a 10% solution of monobasic carboxylic (acetic) acid was added to NsN ° 1-3 samples in containers with alder cones and 0.5 ml of Polysorbate 20 (TWEEN_20, liquid soap) was added. Two volumes of a solution of a monobasic carboxylic (acetic) acid, i.e. per 50 g was added 100 ml of solution. The containers were tightly closed and placed on an ultrasonic bath for 10 min with maximum power, then they settled for 10 min and the supernatant was poured into centrifuge tubes (hereinafter - tubes) without alder fruit.
- TWEEN_20 Polysorbate 20
- Fat-free glass slide was placed on a heating table and
- micromycetes Registration and analysis of microobjects - the total number of pollen grains and the number of pollen grains of certain genera / species, micromycetes - was carried out using light microscopy with an increase of 40-1000-fold.
- the palinoindication of pollen grains and spores of higher plants was carried out according to qualitative zoological attributes in accordance with descriptions in atlases, scientific literature, specialized interactive databases with descriptions and illustrations of microobjects. Three replicates were taken into account (NsNsl-3 sample), two glasses from each sample and at least 150 pollen grains (total number).
- a + flush is (not) identifiable
- Example 2 Plum seasonal, ordinary (sample weight 1 kg).
- each sample is 90-100 g.
- 0.5 ml of Polysorbate 20 (TWEEN_20, liquid soap) and 100 ml of a 20% solution of monobasic carboxylic (acetic) acid are added to each sample.
- TWEEN_20 liquid soap
- monobasic carboxylic (acetic) acid For better removal of microobjects by mechanical friction and separation from the carrier object, 5 g of sodium chloride was added.
- One volume of a solution of a monobasic carboxylic (acetic) acid, i.e. per 100 g was added 100 ml of solution.
- a container with a tightly closed lid was placed on an orbital rocking chair (shaker) at a temperature of 20-25 ° C for 30 min with a frequency of 1000 rpm.
- the solution was left to stand for 10 min and the supernatant was poured into centrifugal
- L5 tubes (hereinafter - tubes) without plum fruit.
- the saline tubes were centrifuged, i.e. carried out sedimentation for 25 min at a rotor speed of 3000 rpm./min in a laboratory centrifuge. After centrifugation, the tubes were carefully removed and the supernatant was drained.
- a fat-free glass slide was placed on a heating table and a circle of wax was applied. In the center was placed one drop of a suspension with microobjects, covered with a coverslip. The finished product was microscopic using a professional biological light microscope.
- the arithmetic mean value of the results of parallel determinations (sample N ° N ° 1-3) was taken as the final test result.
- sample N ° N ° 1-3 the same sample (Plum, seasonal, ordinary) obtained by the same method, in the same laboratory, by the same laboratory assistant, using the same the same measuring instruments and equipment received the maximum permissible relative discrepancy of less than 15% of the arithmetic mean value (table 3).
- the present invention is an affordable, ergonomic and environmentally friendly way to remove microparticles to obtain "clean" high-quality samples with a set of microparticles.
- the method allows to obtain the most complete set of microparticles and micro-traces of plant and animal origin, including pollen grains and spores of higher plants, palynomorphs, mycelium, bacteria, protozoa, phytoliths, fragments of plant and animal origin to characterize the properties of the carrier object.
- the method also allows to obtain a differentiated set of microparticles and micro-traces of plant and animal origin, taking into account the growth time of the carrier object, because deep or fixed microparticles settled in the place of growth of the carrier object are removed with an additional or hot wash; main or cold flush - later micro-traces associated with the packaging and movement of the carrier object.
- Using the proposed method speeds up routine work - the average time of work is 2.5 hours per 1 sample, and also increases the effectiveness of the results of identification analysis - the number of hard or unidentifiable micro-objects ranges from 1-8%.
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
Изобретение относится к исследованию или анализу материалов, а именно к получению образцов для исследования, в частности микрочастиц и микроследов с объекта-носителя растительного и животного происхождения, и может использоваться в палинологии, биологии, экологии, медицина для спорово- пыльцевого анализа, криминалистической, товароведческой и экологической экспертиз. В способе снятия микрочастиц и микроследов с объекта растительного и животного происхождения с поверхности объекта-носителя осуществляют смыв материала физико-механическим способом при температуре 20-25 °С в растворе одноосновной карбоновой кислоты с добавлением поверхностно-активного вещества с последующей седиментацией. Затем проводят щелочной гидролиз осадка с использованием смеси нашатырного спирта и щёлочи с последующим отмыванием, осушением и окрашиванием микрочастиц и микроследов. Техническим результатом заявляемого изобретения является улучшение качества проб на подготовительных этапах и получение максимально полного набора микрочастиц и микроследов за счёт выбора растворителей и режимов смыва, что позволяет ускорить рутинные работы при изъятии микрочастиц и микроследов растительного и животного происхождения с объекта-носителя, повысить эффективность результатов идентификационного анализа в целом.
Description
СПОСОБ СНЯТИЯ МИКРОЧАСТИЦ И МИКРОСЛЕДОВ С ОБЪЕКТА
РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Изобретение относится к исследованию или анализу материалов, а именно к получению образцов для исследования, в частности микрочастиц и микроследов с объекта-носителя растительного и животного происхождения, и может использоваться в палинологии, биологии, экологии, медицина для спорово- пыльцевого анализа, криминалистической, товароведческой и экологической экспертиз.
Из патента US 7250138 известен способ для обнаружения присутствия субмикронных частиц в образце, взятом из окружающей среды. Способ включает в себя отбор пробы из окружающей среды, очистка и концентрирование субмикронных частиц в образце на основании размера частиц. Очищенные и концентрированные частицы детектируют с помощью устройства, которое включает в себя узел электрораспыления, имеющий капилляр, анализатор дифференциальной подвижности, который принимает выходной сигнал из капилляра, и устройство конденсации частиц для подсчета числа частиц, которые проходят через анализатор дифференциальной подвижности.
Однако данный способ предназначен для улавливания частиц размером менее 1 мкм из воздуха, что много меньше размера органических пылевых частиц, в том числе и пыльцевых зерен, диапазон размеров которых равен 10- 100 мкм. В способе применено устройство - узел электрораспыления. Пыльца высших растений характеризуется наличием электрического заряда, но в одном цветке содержится разное количество пыльцевых зёрен, заряженных как положительно, так и отрицательно. Величина заряда пыльцы крайне мала и находится в пределах 10"16- 0"17 Кл. Данный способ также не применим для сбора микрочастиц из глубоких пор, трещин поверхности макрообъекта.
Известен также способ измельчения, экстракции и обнаружения аналитов в твёрдых биологических образцах из международной заявки WO 2005063962. Данное изобретение относится к способам, реагентам, наборам, приборам и автоматизированным системам для измельчения, извлечения и обнаружения аналитов наркотиков, пестицидов, гербицидов и стероидов в твёрдых
биологических образцах, происходящих, например, от человека, домашних животных, растений, амфибий, насекомых и рептилий.
Однако данный способ отличается высокими экономическими затратами на электричество, воду и утилизацию токсичных отходов, где, например, в качестве растворителя использована соляная кислота. При экстракции и обнаружении аналитов используют автоматизированные хроматографические системы, дорогостоящие иностранные наборы КИТ (KitLab) и аналитические стандарты высокой чистоты. Кроме того, применение измельчения на этапе подготовки препаратов приводит к полному разрушению микрообъектов, в том числе, пыльцевых зерен и спор без возможности их регистрации и идентификации по морфометрическим признакам.
Известно также техническое решение из патента RU 2273853 «Способ бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки». Данное изобретение относится к области медицины - колопроктологии, гастроэнтерологии, клинической микробиологии. Способ включает отбор пробы, которую разводят дистиллированной водой, усредненные суспензии субстрата отстаивают, добавляют 95,5° этиловый спирт, центрифугируют в два этапа, из осадка делают монослойный мазок, который высушивают при комнатной температуре, фиксируют 95,5° этиловым спиртом, затем окрашивают мазок по Граму и определяют морфологию микроорганизмов. Изобретение обеспечивает быструю идентификацию большого числа видов микробных популяций при одновременном определении соотношений грам положительных и грамотрицательных форм.
Однако средний размер бактерий составляет 0,5-5 мкм, что много меньше размера пыльцевых зерен. Поэтому данный метод не применим для макрообъектов растительного и животного происхождения, т.к. не позволяет отделить крупный «мусор» - пыльцевые зерна и споры - от бактериальных клеток в полном объеме. Кроме того, в норме пыльцевых зерен и спор в экскрементах не должно быть, т.к. это свидетельствует о нарушении перистальтики и слишком быстрой эвакуации пищевых масс из кишечника.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ изъятия микрочастиц и микроследов с объектов-носителей вакуумным методом (например, пылесос, специальные насадки-фильтры); изъятие микрочастиц с помощью ультразвука в инертных средах; изъятие
микрочастиц с помощью ультразвуковой кавитации в среде фреона-1 13. Способы применяются в медицине, криминалистике, товароведение, палиноморфологических и других исследованиях (Гладкова А.Н., Гричук В. П., Заклинская Е.Д. и др. Пыльцевой анализ, 1950; ГОСТ 31769-2012 Мед. Метод определения частоты встречаемости пыльцевых зерен; Каревская И.А. Споровово-пыльцевой анализ при палеогеографических и геоморфологических исследованиях, 1999; Додонкин Ю.В., Жебелева И.А., Криштафович В. И. Таможенная экспертиза товаров, 2004; ГОСТ 28887-90. Пыльца цветочная (обножка). Технические условия; ГОСТ Р 51074-2003. Продукты пищевые; и др.).
Способ отбора пробы микрочастиц, т.е. пыльцевых зёрен и спор из жидких субстанций, например, мёда (ГОСТ 28887-90, ГОСТ 31769-2012) основан на добавление к пробе дистиллированной воды и центрифугирование в два этапа. Осадок окрашивают 0,1 %-ным спиртовым раствором фуксина. Затем препарат фиксируют в глицерин-желатине и по морфологии пыльцевых зерен проводят определение. Данный способ оперативен и обеспечивает идентификацию большого числа видов пыльцевых зёрен и спор из жидких сред, но не применим для снятия микрообъектов с поверхности и неровностей объекта-носителя. Вакуумный метод и ультразвуковая кавитация как способы изъятия микрообъектов, наряду с широким применением и проверкой временем, также имеют ряд существенных ограничений. Во-первых, проблематично по медицинским аспектам (имеются ограничения) - шумовое загрязнение и дополнительное запыление, соблюдение жестких требований по санитарным нормативам, в том числе по фреону. Во-вторых, экономические затраты на ресурсы (электричество) и время проведения рутинных работ, а также утилизацию токсичных отходов, оказывающих значительное влияние на экологию рабочего места. В-третьих, данный способ не обеспечивает достаточный набор (или диапазон) микрочастиц, т.к. многие из них разрушаются или теряются при извлечении, измельчение и прочих процедурах. В-четвертых, при реализации данного способа трудно, а иногда невозможно изъять микрочастицы с объекта- носителя растительного и животного происхождения для последующей регистрации/идентификации.
Техническая проблема, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в недостаточном качестве проб, содержащих макро- и микрообъекты, т.е. чистота проб, в которых много примесей иных микрочастиц,
кроме пыльцевых зёрен и спор, разрушение микрообъектов до неидентифицируемых остатков в процессе изъятия, разделения и подготовке (щелочной гидролиз) к регистрации.
Техническим результатом заявляемого изобретения является улучшение 5 качества проб на подготовительных этапах и получение максимально полного набора микрочастиц и микроследов за счёт выбора растворителей и режимов смыва, что позволяет ускорить рутинные работы при изъятии микрочастиц и микроследов растительного и животного происхождения с объекта-носителя, повысить эффективность результатов идентификационного анализа в целом.
ю Указанный технический результат достигается за счёт того, что в способе снятия микрочастиц и микроследов с объекта растительного и животного происхождения с поверхности объекта-носителя осуществляют смыв материала физико-механическим способом при температуре 20-25 °С в растворе одноосновной карбоновой кислоты с добавлением поверхностно-активного
15 вещества с последующей седиментацией, после чего проводят щелочной гидролиз осадка с использованием смеси нашатырного спирта и щёлочи с последующим отмыванием, осушением и окрашиванием микрочастиц и микроследов.
В способе могут проводить дополнительный смыв материала с глубоких 20 слоев поверхности объекта-носителя при ультразвуковом воздействии при температуре 35-45 °С в растворе одноосновной карбоновой кислоты с добавлением поверхностно-активного вещества с дальнейшей седиментацией, после чего проводят щелочной гидролиз осадка с использованием смеси нашатырного спирта и щёлочи с последующим отмыванием, осушением и 25 окрашиванием микрочастиц и микроследов.
Достижение указанного технического результата обеспечивается благодаря использованию неразрушающего принципа снятия с объекта-носителя микрочастиц и микроследов растительного и животного происхождения. В способе осуществляют смыв материала при комнатной температуре (20-25 °С) в растворе зо одноосновной карбоновой кислоты с добавлением поверхностно-активного вещества и последующей седиментацией. После чего проводят мягкий щелочной гидролиз (смесь нашатырного спирта и щёлочи) при кипячении с последующим отмыванием, осушением и окрашиванием микрочастиц и микроследов.
Предлагаемый способ является доступным, эргономичным и экологически безопасным.
Реализация изобретения проиллюстрирована с помощью блок-схем на фиг. 1-2, на которых показаны:
5 Фиг. 1 - алгоритм реализации способа основным смывом;
Фиг. 2 - алгоритм реализации способа с дополнительным смывом. Способ реализуют следующим образом.
Первый этап (смыв А или основной) предусматривает снятие микрочастиц и микроследов с поверхности объекта-носителя физико-механическим способом на ю орбитальной качалке (шейкере) при температуре 20-25 °С раствором одноосновной карбоновой (уксусной) кислотой с добавлением поверхностно- активного вещества, например, Полисорбата 20 (жидкое мыло, TWEEN_20). Седиментацию водных растворов проводят с добавлением хлорида натрия при температуре 20-25 °С на лабораторной центрифуге.
15 Второй этап (смыв Б или дополнительный) предусматривает снятие микрочастиц и микроследов с поверхности объекта-носителя физико- механическим способом в ультразвуковой ванне при температуре 35-45 °С раствором одноосновной карбоновой (уксусной) кислотой с добавлением Полисорбата 20 (жидкое мыло, TWEEN_20). Далее проводят седиментацию
20 водных растворов на лабораторной центрифуге при комнатной температуре.
Щелочной гидролиз получаемых осадков, содержащих неразрушенные микрообъекты, проводят в инертной посуде на кипящей водяной бане с добавлением в равных объемах нашатырного спирта (NhUOH) и щелочи (NaOH), и с последующим отмыванием и осушением осадка путем центрифугирования.
25 Далее полученные осадки с микрообъектами окрашивают спиртовым раствором фуксина и фиксируют препарат в глицерин-содержащую среду для процедуры микроскопирования с использованием световой микроскопии.
В зависимости от типа поверхности макрообъекта возможен дополнительный (самостоятельный) смыв микрообъектов с глубоких слоев зо поверхности объекта-носителя. Принято условное деление: тип 1 - неровная, шероховатая, опушенная, жесткая, грубая, шершавая, восковое /парафиновое покрытие; тип 2 - ровная, гладкая, шелковистая (таблица 1 ).
В таблице 1 использованы следующие сокращения: Ш - шейкер, УЗВ - ультразвуковая ванна, БВ - водяная баня, ЦФ1 - центрифуга, ЦФ2 - микроцентрифуга-вортекс, ОН - объект-носитель.
Понимается, что осадок - это компонент раствора, содержащий микрочастицы и микроследы с объекта-носителя биологического происхождения.
Таблица 1. Схема изъятия микрочастиц и микроследов с объекта-носителя биологического происхождения
N2 Наимено При- Вре- Част Темпера Тип 1 Тип 2
Ns вание бор мя, ота, -турный (поверхность (поверхность этапа ин. об/м режим, неровная, ровная, ин °С шероховатая, гладкая) опушенная,
восковое
/парафиновое
покрытие)
1. Смыв А Ш 30 1000 20-25 ОН + 20 % ОН + 20 % уксус уксус + ПАВ + ПАВ + хлорид натрия
2. ЦФ1 15 3000 20-25 раствор+ раствор хлорид натрия
3. Смыв Б ш 10 1000 20-25 ОН + 10% уксус
+ ПАВ
4. УЗВ 10 мах 35-45 + хлорид
5. ЦФ1 15 3000 20-25 натрия
об.
6. Щелочно ЦФ1 10 5000 20-25 раствор —
7. й БВ 10 95-99 Осадок + Осадок + гидролиз нашатырный нашатырный спирт спирт
8. ЦФ1 10 5000 20-25 + щелочь + щелочь
9. Отмыван ЦФ1 10 3000 20-25 Осадок + вода Осадок + вода
10. ие ЦФ1 10 3000 20-25 Осадок + вода Осадок + осадка вода
1 1 . Окрашив ЦФ2 1 1000 20-25 Осадок + Осадок + ание глицерин + глицерин + краситель краситель
Примечание:
Для снятия микрочастиц Объект-носитель помещается в контейнер с плотной крышкой из инертного материала. Вся посуда используется также из инертного материала.
На этапе «Смыв А» на один объем объекта-носителя равный 1 см3 добавляют 1 см3 20%-ого раствора одноосновной карбоновой (уксусной) кислотой, т.е. на объект-носитель со средним объемом 50 см3, например, корнеплод, ягода и др. добавляют 50 мл раствора.
На этапе «Смыв Б» на один объём объекта-носителя равный 1 см3 добавляют 2 см3 10%-ого раствора одноосновной карбоновой (уксусной) кислотой.
Примеры использования данного способа.
Пример 1. Картонная коробка из аптеки - Ольха шишки (плоды), 50г.
Подготовка к испытанию.
Смыв А. Из упаковки брали навеску плодов ольхи массой 50 г и помещали в контейнер с плотной крышкой. Затем добавляли 0,5 мл Полисорбата 20 (TWEEN_20, жидкое мыло), заливали 50 мл 20%-ым раствором одноосновной карбоновой (уксусной) кислотой и помещали на орбитальную качалку (шейкер) при температуре 20-25 °С на 30 мин. с частотой 1000 об/мин. На один объём объекта-носителя добавляли один объём раствора одноосновной карбоновой (уксусной) кислоты, т.е. на 50 г добавляли 50 мл раствора. Раствор отстаивали 10 мин и надосадочную жидкость сливали в центрифужные пробирки (далее - пробирки) без плодов ольхи. К раствору в пробирки добавляли 5 г хлорида натрия и центрифугировали, т.е. осуществляли седиментацию, в течение 15 мин при частоте вращения ротора 3000 об. /мин. на лабораторной центрифуге. После центрифугирования пробирки осторожно извлекали и сливали надосадочную жидкость.
К осадку в пробирке добавляли 10 мл смеси: в равных объёмах 10%-ого нашатырного спирта (NH4OH) и 10%-й щёлочи (NaOH) и в течение 10 мин на
водяной бане при 95-99 °С проводили щелочной гидролиз получаемых осадков, содержащих неразрушенные микрообъекты. Далее пробирки центрифугировали, т.е. осуществляли седиментацию, в течение 10 мин при частоте вращения ротора 5000 об./мин на лабораторной центрифуге, сливали надосадочную жидкость (щёлочь) и отмывали водой, добавляя в пробирку по 10 мл дистиллированной воды, перемешивая стеклянной палочкой, и проводили центрифугирование в течение 10 мин при частоте вращения ротора 5000 об./мин. Повторяли процедуру отмывки осадка водой. Затем сливали надосадочную жидкость (супернатант) и к осадку добавляли 1 мл дистиллированной воды, перемешивали на микроцентрифуге-вортекс 10 с и переносили в пробирку эппендорф объемом 2 мл. Суспензию центрифугировали на микроцентрифуге-вортекс в течение 0 мин при ускорении 1000 д. Из-под надосадочной жидкости брали аккуратно автоматизированным дозатором 0,03 мл осадочной суспензии, переносили в пробирку эппендорф объемом 0,5 мл, добавляли 2-3 капли 0,1 %-ного спиртового раствора фуксина, т.е. 10 мг основного фуксина на 60 мл 96% спирта, для окрашивания и встряхивали на вортексе.
Обезжиренное предметное стекло помещали на нагревательный столик и наносили круг из воска. В центр помещали одну каплю суспензии с микрообъектами и накрывали покровным стеклом. Готовый препарат микроскопировали с использованием профессионального биологического светового микроскопа.
Смыв Б. После получения смыва А к навескам NsN°1-3 - в контейнеры с шишками ольхи, доливали 100 мл 10%-ого раствора одноосновной карбоновой (уксусной) кислоты и добавляли 0,5 мл Полисорбата 20 (TWEEN_20, жидкое мыло). На один объём объекта-носителя добавляли два объема раствора одноосновной карбоновой (уксусной) кислоты, т.е. на 50 г добавляли 100 мл раствора. Контейнеры плотно закрывали и помещали на ультразвуковую ванну на 10 мин с максимальной мощностью, затем отстаивали 10 мин и надосадочную жидкость сливали в центрифужные пробирки (далее - пробирки) без плодов ольхи. К раствору в пробирки добавляли 5 г хлорида натрия и центрифугировали, осуществляя седиментацию, в течение 15 мин при частоте вращения ротора 3000 об./мин на лабораторной центрифуге. После центрифугирования пробирки осторожно извлекали и сливали надосадочную жидкость.
К осадку в пробирке добавляли 10 мл смеси - в равных объемах 10%-ого нашатырного спирта (NH4OH) и 10%-й щелочи (NaOH) и в течение 10 мин на водяной бане при 95-99 °С проводили щелочной гидролиз получаемых осадков, содержащих неразрушенные микрообъекты. Далее пробирки центрифугировали,
5 осуществляя седиментация, в течение 10 мин при частоте вращения ротора 5000 об./мин на лабораторной центрифуге. Сливали надосадочную жидкость (щелочь) и отмывали водой, добавляя в пробирку по 10 мл дистиллированной воды, перемешивая стеклянной палочкой, и проводили центрифугирование в течение 10 мин при частоте вращения ротора 5000 об./мин. Повторяли процедуру ю отмывки осадка водой. Затем сливали надосадочную жидкость (супернатант) и к осадку добавляли 1 мл дистиллированной воды, перемешивали на микроцентрифуге-вортекс 10 с и переносили в пробирку эппендорф объемом 2 мл. Суспензию центрифугировали на микроцентрифуге-вортекс в течение 10 мин при ускорении 1000 д. Из-под надосадочной жидкости брали автоматизированным
15 дозатором 0,03 мл осадочной суспензии, переносили в пробирку эппендорф объёмом 0,5 мл, добавляли 2-3 капли 0,1 %-ного спиртового раствора фуксина: 10 мг основного фуксина на 60 мл 96% спирта для окрашивания и встряхивали на микроцентрифуге-вортекс.
Обезжиренное предметное стекло помещали на нагревательный столик и
20 наносили круг из воска. В центр помещали одну каплю суспензии с микрообъектами и накрывали покровным стеклом. Готовый препарат микроскопировали с использованием профессионального биологического светового микроскопа.
Проведение испытания.
25 Регистрацию и анализ микрообъектов - общее число пыльцевых зерен и число пыльцевых зерен отдельных родов/видов, микромицетов - проводили с использованием световой микроскопии при увеличении 40-1000-крат. Палиноиндикацию пыльцевых зерен и спор высших растений (возможна индикация микромицетов, фитолитов и др.) проводили по качественным зо признакам в соответствии с описаниями в атласах, научной литературы, специализированных интерактивных баз данных с описанием и иллюстрациями микрообъектов. Учитывали три повторности (навеска NsNsl -З) по два стекла с каждой навески и не менее 150 пыльцевых зерен (общее число).
Обработка результатов испытаний
Число пыльцевых зёрен определяемого рода/вида растения X, %, рассчитывали по формуле: Х=а/Ь * 100%, где а - число учтённых пыльцевых зерен определяемого рода/вида в препарате, шт.; b - общее число учтённых пыльцевых зерен в препарате, шт.; 100 - коэффициент пересчета на массовую долю (%) пыльцевых зёрен определяемого рода/вида. За окончательный результат испытания принимали среднеарифметическое значение результатов параллельных определений (навеска N->N°1 -3).
В итоге между тремя результатами испытаний (навеска NsN2l-3) одной и той же пробы (Ольха шишки (плоды), 50г, картонная коробка из аптеки), полученными по одной методике, в одной и той же лаборатории, одним и тем же лаборантом, с использованием одного и того же средства измерений и оборудования, получили предельно допустимое относительное расхождение менее 20 % среднеарифметического значения (таблица 2). Таблица 2. Результаты испытаний пробы - Ольха шишки (плоды) в картонной коробке (каждая навеска весом 50 г).
Название ПЗ, навеска навеска навеска сред
NsNs % род/вид NS1 N22 N&3 нее
Смыв А
1 Alnus sp. (ольха) 1 1 1 98 99 103 32,4
Chenopodiaceae
2 (маревые) 21 39 43 34 10,8
Larix sp.
3 (лиственница) 3 0 14 6 1 ,8
Helianthus sp.
4 (подсолненчик) 60 93 42 65 20,5
Artemisia sp.
5 (полынь) 36 2 14 17 5,5
Смыв Б 0,0
1 Alnus sp. (ольха) 33 77 86 65 20,6 трудно
Смыв А+ (не)идентифицируе
Смыв Б мые 28 31 22 27 8,5
Общее число
учтенных 100, пыльцевых зерен 292 340 320 317 0
КоэфКорр
(навеска N°N°1 -3) 0,76 0,84 0,70
древесной 54,7 кустарниковой 0,0 травяной 36,8
Пример 2. Слива сезонная, обыкновенная (вес образца 1 кг).
Подготовка к испытанию.
Смыв А. Брали три навески в каждой по три плода сливы и помещали в
5 контейнер с плотной крышкой. Вес сливы зависит от сорта и размера урожая, но в среднем вес равен 30 г, т.е. каждая навеска 90-100 г. В каждую навеску добавляли 0,5 мл Полисорбата 20 (TWEEN_20, жидкое мыло) и 100 мл 20%-ого раствора одноосновной карбоновой (уксусной) кислоты. Для лучшего снятия микрообъектов механическим трением и отделения от объекта-носителя добавляли 5 г хлорида ю натрия. На один объём объекта-носителя добавляли один объём раствора одноосновной карбоновой (уксусной) кислоты, т.е. на 100 г добавляли 100 мл раствора. Контейнер с плотно закрытой крышкой помещали на орбитальную качалку (шейкер) при температуре 20-25 °С на 30 мин с частотой 1000 об/мин. Раствор отстаивали 10 мин и надосадочную жидкость сливали в центрифужные
L5 пробирки (далее - пробирки) без плодов сливы.
Пробирки с солевым раствором центрифугировали, т.е. осуществляли седиментацию, в течение 25 мин при частоте вращения ротора 3000 об./мин на лабораторной центрифуге. После центрифугирования пробирки осторожно извлекали и сливали надосадочную жидкость.
!0 К осадку в пробирке добавляли 10 мл смеси - в равных объемах 10%-ого нашатырного спирта (NhUOH) и 10%-й щелочи (NaOH) - и в течение 10 мин на водяной бане при 95-99 °С проводили щелочной гидролиз получаемых осадков, содержащих неразрушенные микрообъекты. Далее пробирки центрифугировали, осуществляя седиментацию, в течение 10 мин при частоте вращения ротора
!5 5000 об./мин на лабораторной центрифуге, сливали надосадочную жидкость (щелочь) и отмывали водой, добавляя в пробирку по 10 мл дистиллированной
воды, перемешивая стеклянной палочкой, и проводили центрифугирование в течение 10 мин при частоте вращения ротора 5000 об. /мин. Повторяли процедуру отмывки осадка водой. Затем сливали надосадочную жидкость (супернатант) и к осадку добавляли 1 мл дистиллированной воды, перемешивали на микроцентрифуге-вортекс 10 с и переносили в пробирку эппендорф объемом 2 мл. Суспензию центрифугировали на микроцентрифуге-вортекс в течение 10 мин при ускорении 1000 д. Из-под надосадочной жидкости брали аккуратно автоматизированным дозатором 0,03 мл осадочной суспензии, переносили в пробирку эппендорф объемом 0,5 мл, добавляли 2-3 капли 0,1 %-ного спиртового раствора фуксина, т.е. 10 мг основного фуксина на 60 мл 96% спирта для окрашивания, и встряхивали на микроцентрифуге-вортекс.
Обезжиренное предметное стекло помещали на нагревательный столик и наносили круг из воска. В центр помещали одну каплю суспензии с микрообъектами, накрывали покровным стеклом. Готовый препарат микроскопировали с использованием профессионального биологического светового микроскопа.
Проведение испытания.
Регистрацию и анализ микрообъектов - общее число пыльцевых зерен и число пыльцевых зерен отдельных родов/видов - проводили с использованием световой микроскопии при увеличении 40-1000-крат. Палиноиндикацию пыльцевых зерен и спор высших растений (возможна индикация микромицетов, фитолитов и др.) проводили по качественным признакам в соответствии с описаниями в атласах, научной литературы, специализированных интерактивных баз данных с описанием и иллюстрациями микрообъектов. Учитывают три повторности (навеска N°Ne1 -3), по два стекла с каждой навески, не менее 150 пыльцевых зерен (общее число).
Обработка результатов испытаний.
Число пыльцевых зерен, определяемого рода/вида растения X, %, рассчитывали по формуле: Х=а/Ь * 100%, где а - число учтенных пыльцевых зерен определяемого рода/вида в препарате, шт.; b - общее число учтенных пыльцевых зерен в препарате, шт.; 100 - коэффициент пересчета на массовую долю (%) пыльцевых зерен определяемого рода/вида. За окончательный результат испытания принимали среднеарифметическое значение результатов параллельных определений (навеска N°N°1 -3).
В итоге между тремя результатами испытаний (навеска N°N°1 -3) одной и той же пробы (Слива сезонная, обыкновенная) полученными по одной методике, в одной и той же лаборатории, одним и тем же лаборантом, с использованием одного и того же средства измерений и оборудования, получили предельно допустимое относительное расхождение менее 15 % среднеарифметического значения (таблица 3).
Таблица 3. Результаты испытаний пробы - Слива сезонная, обыкновенная (каждая навеска весом 100 г)
Название ПЗ, навеска навеска навеска
NSN2 среднее %
род/вид N21 Ns2 Ns3
Смыв А
Quercus sp.
1 (дуб) 35 43 55 44 28,7
Betula sp.
2 (береза) 18 41 48 36 23, 1
Fraxinus sp.
3 (ясень) 16 19 0 12 7,5
Pinus sp.
4 (сосна) 27 30 1 1 23 14,7
Apiaceae
5 (зонтичные) 5 1 10 5 3,4
Poaceae
6 (мятликовые) 33 17 22 24 15,5
Solanaceae
7 (пасленовые) 0 9 17 9 5,6 трудно
(не)идентифиц
8 ируемые 2 3 2 2 1 ,5
Общее число
учтенных
пыльцевых
зерен 136 163 165 155 100,0
КоэфКорр
(навеска
N2N21-3) 0,74 0,79 0,54
древесной 73,9 кустарниковой - 0,0 травяной 24,6
Специалисту в данной области техники очевидно, что заявляемые диапазоны значений температур и времени не являются альтернативами, а представляют собой конкретный режим, который может изменяться в указанных пределах в зависимости от исходного объекта, используемого оборудования и других внешних факторов.
Приведённые примеры являются частными случаями и не исчерпывают всех возможных реализаций заявляемого изобретения.
Предлагаемое изобретение является доступным, эргономичным и экологически безопасным способом изъятия микрочастиц для получения «чистых» качественных проб с набором микрочастиц. Способ позволяет получить максимально полный набор микрочастиц и микроследов растительного и животного происхождения, в том числе пыльцевых зерен и спор высших растений, палиноморфов, мицелия, бактерий, простейших, фитолитов, обломков растительного и животного происхождения для характеристики свойств объекта- носителя. Способ также позволяет получить дифференцированный набор микрочастиц и микроследов растительного и животного происхождения с учетом времени роста объекта-носителя, т.к. дополнительным или горячим смывом снимают глубоко зафиксированные микрочастицы, осевшие в месте произрастания объекта-носителя; основным или холодным смывом - более поздние микроследы, связанные с упаковкой и перемещением объекта-носителя. Использование заявляемого способа ускоряет рутинные работы - время проведения работ в среднем 2,5 ч на 1 пробу, а также увеличивает эффективность результатов идентификационного анализа - количество трудно или неидентифицируемых микрообъектов колеблется в пределах 1-8%.
Claims
1 . Способ снятия микрочастиц и микроследов с объекта растительного и животного происхождения, характеризующийся тем, что с поверхности объекта-носителя осуществляют смыв материала физико-механическим способом при температуре 20-25 °С в растворе одноосновной карбоновой кислоты с добавлением поверхностно-активного вещества с последующей седиментацией, после чего проводят щелочной гидролиз осадка с использованием смеси нашатырного спирта и щёлочи с последующим отмыванием, осушением и окрашиванием микрочастиц и микроследов.
2. Способ по п.1 , характеризующийся тем, что проводят дополнительный смыв материала с глубоких слоев поверхности объекта-носителя при ультразвуковом воздействии при температуре 35-45 °С в растворе одноосновной карбоновой кислоты с добавлением поверхностно-активного вещества с дальнейшей седиментацией, после чего проводят щелочной гидролиз осадка с использованием смеси нашатырного спирта и щёлочи с последующим отмыванием, осушением и окрашиванием микрочастиц и микроследов.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016152567 | 2016-12-30 | ||
| RU2016152567A RU2651171C1 (ru) | 2016-12-30 | 2016-12-30 | Способ сбора микрочастиц и микроследов с объекта растительного и животного происхождения |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2018124929A1 true WO2018124929A1 (ru) | 2018-07-05 |
Family
ID=61976836
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2017/000391 Ceased WO2018124929A1 (ru) | 2016-12-30 | 2017-06-08 | Способ снятия микрочастиц и микроследов с объекта растительного и животного происхождения |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2651171C1 (ru) |
| WO (1) | WO2018124929A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112284861A (zh) * | 2020-10-21 | 2021-01-29 | 上海市农业科学院 | 用于真姬菇担孢子显微观察的固定液、制备方法、固定方法及应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030199100A1 (en) * | 2000-09-15 | 2003-10-23 | Wick Charles Harold | Method and system for detecting and recording submicron sized particles |
| RU2229109C2 (ru) * | 2002-05-06 | 2004-05-20 | Военно-морской инженерный институт | Способ отбора и обработки проб для определения загрязненности поверхностей металлической ртутью и ее соединениями |
| RU2239837C2 (ru) * | 2002-08-15 | 2004-11-10 | Государственное учреждение системы высшего и послевузовского профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" | Способ оценки степени тяжести атопического дерматита |
| RU2402781C1 (ru) * | 2009-06-23 | 2010-10-27 | Государственное научное учреждение "Прикаспийский зональный НИВИ" Россельхозакадемии | Способ предпосевной обработки проб, снятых с объектов внешней среды, на выделение микобактерий |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1735737A1 (ru) * | 1989-08-31 | 1992-05-23 | Научно-Исследовательский Институт Общей И Коммунальной Гигиены Им.А.Н.Сысина | Способ подготовки эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта к исследованию |
| RU2370540C2 (ru) * | 2007-08-06 | 2009-10-20 | Автономная некоммерческая организация "Центр инноваций и наукоемких технологий" | Способ определения биотоксичности питьевой минеральной воды |
-
2016
- 2016-12-30 RU RU2016152567A patent/RU2651171C1/ru not_active IP Right Cessation
-
2017
- 2017-06-08 WO PCT/RU2017/000391 patent/WO2018124929A1/ru not_active Ceased
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030199100A1 (en) * | 2000-09-15 | 2003-10-23 | Wick Charles Harold | Method and system for detecting and recording submicron sized particles |
| RU2229109C2 (ru) * | 2002-05-06 | 2004-05-20 | Военно-морской инженерный институт | Способ отбора и обработки проб для определения загрязненности поверхностей металлической ртутью и ее соединениями |
| RU2239837C2 (ru) * | 2002-08-15 | 2004-11-10 | Государственное учреждение системы высшего и послевузовского профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет" | Способ оценки степени тяжести атопического дерматита |
| RU2402781C1 (ru) * | 2009-06-23 | 2010-10-27 | Государственное научное учреждение "Прикаспийский зональный НИВИ" Россельхозакадемии | Способ предпосевной обработки проб, снятых с объектов внешней среды, на выделение микобактерий |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112284861A (zh) * | 2020-10-21 | 2021-01-29 | 上海市农业科学院 | 用于真姬菇担孢子显微观察的固定液、制备方法、固定方法及应用 |
| CN112284861B (zh) * | 2020-10-21 | 2023-02-17 | 上海市农业科学院 | 用于真姬菇担孢子显微观察的固定液、制备方法、固定方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2651171C1 (ru) | 2018-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106238110B (zh) | 使用过滤和样品转移装置离析、积聚、表征和/或确定微生物的方法 | |
| RU2541775C2 (ru) | Способ идентификации микроорганизмов из тестируемого образца гемокультуры | |
| RU2519650C2 (ru) | Способы разделения, характеристики и(или) идентификации микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии | |
| JP6026581B2 (ja) | ラマン分光法を使用した微生物の分離、キャラクタリゼーションおよび／または同定方法 | |
| RU2533252C2 (ru) | Способы разделения и характеристики микроорганизмов с помощью идентификатора | |
| CN103813845B (zh) | 从培养物离析微生物的方法和试剂盒 | |
| CN104483409B (zh) | 一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法 | |
| WO2018124929A1 (ru) | Способ снятия микрочастиц и микроследов с объекта растительного и животного происхождения | |
| CN101413872B (zh) | 一种微生物活菌数快速检测方法 | |
| Merid et al. | Validation of bleach-treated smears for the diagnosis of pulmonary tuberculosis | |
| CA1114271A (en) | Assay of gram-negative bacteria | |
| US20180282823A1 (en) | Molecular identification method for single dinoflagellate cyst | |
| JP4911423B2 (ja) | 微生物の計測方法 | |
| Leadbeater | Preparation of pelagic protists for electron microscopy | |
| Ponomaryov et al. | Assessment of the chemical composition of shungite of the Zazhoginsky field for its use in biotechnology | |
| CN113604522A (zh) | 产胞外多糖的青霉菌d306菌株及其在制备胆汁酸结合剂中的应用 | |
| Ortega et al. | Detection of parasites in foods | |
| CN113322284B (zh) | 一种降低秸秆中重金属生物有效性的方法及其应用 | |
| CN102329894A (zh) | 凡纳滨对虾诺达病毒现场快速检测试剂盒及检测方法 | |
| CN112683990A (zh) | Maldi-tof ms微生物鉴定样本生物安全前处理方法 | |
| CN103235118B (zh) | 一种快速分离纯化及富集派琴虫的方法 | |
| CN120098939A (zh) | 一株可裂解多重耐药肺炎克雷伯菌的噬菌体及应用 | |
| WO2021083907A1 (fr) | Dispositif contenant des billes de verre fonctionnalisees avec du polyethyleneimine, et leur utilisation pour capter les micro-organismes | |
| Culley et al. | Viral community structure | |
| JP2005151957A (ja) | 卵、マヨネーズからのｐｃｒ検査、コロイド金抗体法検査、生存確認検査対応の検体試料調製方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 17889288 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 17889288 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |