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WO2018110616A1 - 新規宿主細胞及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法 - Google Patents

新規宿主細胞及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法 Download PDF

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WO2018110616A1
WO2018110616A1 PCT/JP2017/044806 JP2017044806W WO2018110616A1 WO 2018110616 A1 WO2018110616 A1 WO 2018110616A1 JP 2017044806 W JP2017044806 W JP 2017044806W WO 2018110616 A1 WO2018110616 A1 WO 2018110616A1
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WO
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base sequence
gene
seq
yeast
host cell
Prior art date
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PCT/JP2017/044806
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English (en)
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輝之 西
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Kaneka Corp
Original Assignee
Kaneka Corp
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Publication date
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a novel host cell in which methanol assimilation is reduced by inactivating a specific gene, a novel host cell with improved productivity of the target protein, a vector for inactivating the gene, the novel host
  • the present invention relates to a method for producing a target protein using cells.
  • Hosts for producing the target protein by genetic recombination methods include animals such as chickens, animal cells such as CHO, insects such as silkworms, insect cells such as sf9, and microorganisms such as yeast, Escherichia coli, and actinomycetes. It is used.
  • yeast can be cultured on an inexpensive medium at a large scale and at a high density, so that the target protein can be produced at low cost, and secretion into the culture medium can be achieved using a signal peptide or the like.
  • Komagataella pastoris a kind of yeast, is a methanol-utilizing (Mut + ) yeast that has an excellent protein expression ability and can use an inexpensive carbon source that is advantageous for industrial production.
  • Non-Patent Document 1 reports a method for producing heterologous proteins such as green fluorescent protein, human serum albumin, hepatitis B virus surface antigen, human insulin, and single-chain antibody using Komagataela pastoris. ing.
  • heterologous proteins such as green fluorescent protein, human serum albumin, hepatitis B virus surface antigen, human insulin, and single-chain antibody using Komagataela pastoris.
  • When producing heterologous proteins in yeast in order to improve productivity, addition of signal sequences, use of strong promoters, codon modification, co-expression of chaperone genes, co-expression of transcription factor genes, proteases derived from host yeast
  • Patent Document 1 reports an improvement in productivity by expressing a transcription factor that activates a methanol-inducible promoter using Komagataela
  • Non-Patent Documents 2 to 4 describe methods for producing a target protein using a strain with reduced methanol utilization (Mut S ) by disruption of the AOX1 gene.
  • An object of the present invention is to provide a new means for reducing methanol assimilation and improving the productivity of a target protein.
  • the present inventors have identified a novel protein by comprehensive analysis of the base sequence of the chromosomal DNA of Komagataella yeast. And it discovered that the utilization of methanol of a host cell fell by inactivating the gene which codes this novel protein. In addition, it has also been found that the productivity of the target protein is improved, and further, it has been found that the productivity of the target protein is further improved by highly expressing a transcription factor that activates the methanol-inducible promoter, and the present invention is completed. It came to.
  • the host cell according to (6) which is a yeast, bacteria, fungus, insect cell, animal cell, or plant cell.
  • the host cell according to (8), wherein the methanol-assimilating yeast is Komagataela yeast or Ogataea yeast.
  • a method for producing a target protein comprising a step of culturing the cell according to any one of (3) to (9) and a step of recovering the target protein from the culture solution.
  • (11) The method according to (10), wherein the target protein is a heterologous protein.
  • the present invention provides an efficient production method of the target protein.
  • the present invention provides a host cell in which any of the following genes (a) to (d) is inactivated: (A) a gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 34, (B) a gene comprising a nucleic acid base sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 34; (C) a gene comprising a base sequence having 85% or more sequence identity to the base sequence shown in SEQ ID NO: 34, (D) a gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33;
  • nucleic acids hybridize under stringent conditions have the following meanings.
  • an SSC solution double concentration
  • nucleic acid Y can be obtained as nucleic acid bound on the filter.
  • nucleic acid Y can be referred to as “a nucleic acid that hybridizes with the nucleic acid X under stringent conditions”.
  • nucleic acid X and nucleic acid Y “hybridize with each other under stringent conditions”. Since the nucleic acid having high sequence identity can be expected to hybridize as the concentration of the SSC solution is lowered, the nucleic acid Y is preferably washed with a 1-fold concentration of SSC solution at 65 ° C, more preferably 0.5-fold at 65 ° C.
  • nucleic acid Y is preferably washed with an SSC solution at a double concentration at 70 ° C., more preferably at a double concentration at 75 ° C.
  • the reference nucleic acid X may be a colony or plaque-derived nucleic acid X.
  • sequence identity of base sequences and amino acid sequences can be determined using methods well known to those skilled in the art, sequence analysis software, and the like.
  • sequence analysis software for example, the BLAST algorithm blastn program and blastp program, and the FASTA algorithm fasta program may be mentioned.
  • sequence identity of a certain base sequence to be evaluated with the base sequence X is to align (align) the base sequence X and the base sequence to be evaluated, and introduce a gap as necessary. This is a value expressed in% as the frequency of occurrence of the same base at the same site in the base sequence including the gap when the base coincidence between the two is maximized.
  • sequence identity of an amino acid sequence X of an amino acid sequence to be evaluated is alignment (alignment) of the amino acid sequence X and the amino acid sequence to be evaluated, and a gap is introduced as necessary. This is a value expressed in% as the frequency of occurrence of the same amino acid at the same site in the amino acid sequence including the gap when the amino acid coincidence between the two is maximized.
  • sequence identity between the base sequence of the gene and the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, and 97% or more Is particularly preferable, and 98% or more, or 99% or more is most preferable.
  • nucleic acid can also be referred to as “polynucleotide” and refers to DNA or RNA, typically DNA.
  • the term “gene” includes not only DNA but also mRNA and cDNA of nucleic acids possessed by a host cell, but typically it can be DNA, particularly genomic DNA.
  • the “gene” does not ask whether the functional region is different, and may include, for example, only exons or exons and introns.
  • the “base sequence” and the “base sequence having 85% or more sequence identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 34” in the above (c) are each a base sequence formed by connecting a plurality of exons (for example, a cDNA base) Sequence (), the gene (a), the gene (b), and the gene (c) are each inserted and / or added with one or more intron base sequences in the base sequence. It may be DNA or RNA containing the determined base sequence.
  • DNA and RNA may be double-stranded or single-stranded.
  • DNA, RNA, polynucleotide or nucleic acid having a predetermined base sequence a gene, DNA, RNA, polynucleotide or nucleic acid having a base sequence complementary to the predetermined base sequence is also included unless otherwise specified.
  • the base symbol “T” shown in the sequence listing is read as “U”.
  • the “base sequence encoding an amino acid sequence” refers to a base sequence designed based on a codon table for a polypeptide comprising an amino acid sequence, and the base sequence is generated by transcription and translation. Bring.
  • polypeptide refers to a peptide in which two or more amino acids are bonded to each other, and includes proteins and short chains called peptides and oligopeptides.
  • activation refers to a state in which the function of a gene is lost or a state in which the function is decreased, and the expression level of mRNA that is a transcription product of the gene or polypeptide that is a translation product It also includes a state in which the level is decreased and a state that does not function normally as mRNA or protein.
  • the mRNA expression level can be quantified using a real-time PCR method, RNA-Seq method, Northern hybridization or hybridization method using a DNA array, and the polypeptide expression level recognizes the polypeptide. It can be quantified using a staining compound having binding properties with an antibody or polypeptide. In addition to the quantitative methods listed above, conventional methods used by those skilled in the art may be used.
  • DNA mutation treatment using drugs or ultraviolet rays, partial specific mutagenesis using PCR, RNAi, protease, homologous recombination, and the like can be used.
  • the base sequence modification (deletion, substitution, addition, insertion) in the ORF of the gene and / or the start or stop of transcription of the promoter region, enhancer region, terminator region, etc. are controlled. This is done by modifying the base sequence in the region (deletion, substitution, addition, insertion).
  • part which performs the said deletion, substitution, addition, and insertion, and the base sequence inserted in deletion, substitution, addition, and insertion are not specifically limited as long as the normal function of the said gene can be deleted.
  • the gene to be inactivated may be a gene on the host cell chromosome or a gene outside the host cell chromosome. Of these, it is preferable to inactivate genes on the chromosome.
  • base sequence modification can be carried out using gene insertion or site-directed mutagenesis using homologous recombination. For example, replacement of a gene upstream promoter with a less active promoter, modification to a codon not suitable for the host cell, etc., and upstream sequences of genes to be deleted, selectable marker gene sequences and genes to be deleted Examples thereof include introduction of a vector in which a downstream sequence is linked.
  • the “upstream sequence of the gene to be deleted” refers to, for example, a base sequence located upstream from the gene to be deleted in the chromosomal genomic DNA of the host cell.
  • downstream sequence refers to, for example, a base sequence located downstream of the gene to be deleted in the chromosomal genomic DNA of the host cell.
  • the degree of expression reduction due to inactivation in the present invention is not particularly limited as long as the productivity of the target protein is improved, but it is 5% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50%. As mentioned above, it is preferable that it is reducing 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more. Even if the expression level does not decrease, as described above, it is well known to those skilled in the art that the gene product can be inactivated as long as the normal function of the gene product can be lost. This degree is only one of the criteria for determining inactivation.
  • host cell refers to a cell into which a vector is introduced and transformed, and is referred to as “host” or “transformant”.
  • host cells before and after transformation may be simply referred to as “cells”.
  • the cell used as the host is not particularly limited as long as the vector can be introduced into the cell.
  • the gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 is the base sequence of the four chromosomal DNAs of Komagataela pastoris (ATCC76273 strain: ACCESSION No. FR839628 to FR839631 (J. Biotechnol. 154 (4), 312-320 ( 2011), and GS115 strain: ACCESSION No. FN392319 to FN392322 (Nat. Biotechnol. 27 (6), 561-566 (2009))).
  • the inventors have searched for a polypeptide that causes a decrease in methanol assimilation by inactivation, and a polynucleotide containing a base sequence encoding the amino acid sequence, and as a result, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 (ACCESSION No. CCA41122), and a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 34 encoding the polypeptide.
  • the present inventors have derived from the above base sequence. That the gene vector to inactivate introduced into a host, reduction in methylotrophic and productivity of the target protein was confirmed that the improvement.
  • the increase in the amount of protein produced from the host cell is, for example, 1.01, 1.02, 1.03, 1.04, 1.05, 1.1 times the amount of protein produced in the parent cell or wild type strain.
  • the amount of secreted protein produced from cells is easily determined by methods known to those skilled in the art, such as the Bladford method, Lowry method, and BCA method, using cell culture supernatants. can do.
  • the secretory production amount of a specific protein from a cell can be easily determined by ELISA or the like using a cell culture supernatant or the like.
  • parent cell or wild type strain refers to a host that has not been subjected to a treatment that changes the expression of a gene comprising the nucleotide sequence shown in any of (a) to (d) above. Means cell or strain. Accordingly, the “parent cell” or “wild-type strain” described in the present specification includes host cells or strains modified except for the base sequences shown in any of the above (a) to (d).
  • a gene encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 refers to a polymorph consisting of an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 This refers to a gene consisting of a base sequence designed with reference to a codon table based on a peptide, and includes, for example, the gene shown in SEQ ID NO: 34. Then, by inactivating the gene, it is possible to achieve a reduction in methanol utilization and an improvement in the production amount of the target protein.
  • the sequence identity is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, particularly preferably 97% or more, most preferably 98% or more, or 99% or more. preferable.
  • the host cell of the present invention comprises a nucleotide sequence having a homologous region with any of the genes (a) to (d), and a nucleotide sequence having a homologous region with the promoter of any of the genes (a) to (d). And / or is preferably obtained by transforming a vector containing at least one of the nucleotide sequences having a homologous region with the terminator of any of the genes (a) to (d).
  • a base sequence having a homologous region with any of the genes (a) to (d) a base sequence having a homologous region with the promoter of any of the genes (a) to (d)
  • the parent cell is transformed with a vector containing at least one of the base sequences having a homologous region with the terminator of any of the genes a) to (d), whereby the above-mentioned (a) on the chromosome of the host cell Any of the genes (1) to (d) can be inactivated.
  • the vector a vector in which all the base sequences having the respective homologous regions are incorporated may be used, or a vector in which each of the base sequences having the respective homologous regions is incorporated may be used.
  • the “vector in which all the base sequences having the respective homologous regions are incorporated” is used as one of the genes (a) to (d) and the homologous region.
  • a base sequence having a homologous region with the promoter of any of the genes (a) to (d), and a homologous region with the terminator of any of the genes (a) to (d) A vector containing the entire base sequence can be used.
  • the “vector in which each of the base sequences having each homologous region is incorporated one by one” is used as the homologous region of any of the genes (a) to (d) above.
  • the terminator of any of these genes and a third vector containing a base sequence having a homologous region can be used in combination.
  • the first to third vectors may be introduced simultaneously or sequentially when the host cell is transformed.
  • the vector of the present invention can be a circular vector, a linear vector, a plasmid, an artificial chromosome or the like.
  • a vector is an artificially constructed nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule constituting the vector of the present invention is usually DNA, preferably double-stranded DNA, which may be circular or linear.
  • the vector of the present invention usually has a predetermined base sequence (a base sequence of any of the above (a) to (d), a promoter and a homologous region of any of the genes of (a) to (d) above).
  • a nucleotide sequence having a homologous region with the terminator of any of the genes (a) to (d) above, or a plurality of these nucleotide sequences are linked (through other nucleotide sequences of an appropriate length).
  • Clontech's In-Fusion cloning system In order to use cloning sites containing one or more restriction enzyme recognition sites, Clontech's In-Fusion cloning system, New England's Gibson Assembly system, etc. Overlapping region, base sequence of endogenous gene, base sequence encoding polypeptide consisting of amino acid sequence of target protein, selectable marker gene (auxotrophic complementary gene It can include nucleotide sequences such as a drug resistance gene, etc.).
  • linear vectors include auxotrophic complementary genes such as URA3 gene, LEU2 gene, ADE1 gene, HIS4 gene, ARG4 gene, G418 resistance gene, Zeocin (TM) resistance gene, hygromycin resistance gene, Clone NAT resistance
  • auxotrophic complementary genes such as URA3 gene, LEU2 gene, ADE1 gene, HIS4 gene, ARG4 gene, G418 resistance gene, Zeocin (TM) resistance gene, hygromycin resistance gene, Clone NAT resistance
  • examples thereof include a PCR product having a nucleotide sequence of a drug resistance gene such as a gene, a blasticidin S resistance gene, or a linear vector obtained by cleaving a circular vector or plasmid with an appropriate restriction enzyme.
  • plasmids examples include YEp vector, YRp vector, YCp vector, pPICHOLI (http://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/p_picholi_shuttle_vector.html), pHIP (Journal of General Microbioiogy (1992), 138, 2405-2416. Hro Chromosomal targeting of replicating plasmids in the yeast Hansenula pH polymorpha), pHRP (see the references cited above for pHIP), pHARS (Molecular general Genetics MGG February 1986, Volume 302, Issue-308, pp Transformation of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha by autonomous replication and integration vectors), E.
  • artificial chromosomes generally refer to artificial chromosome vectors containing centromeric DNA sequences, telomeric DNA sequences, autonomously replicating sequences (ARS), and yeasts include yeast artificial chromosomes (YAC vectors), Saccharomyces cerevisiae, Developed in Schizosaccharomyces pombe. In Komagataela pastoris, an artificial chromosome can be constructed by using the centromere DNA sequence described in WO 2016/088884.
  • the vector of the present invention typically contains a promoter of any of the genes (a) to (d), a promoter of any of the genes (a) to (d), and genomic DNA of a host cell, and Of the region containing the terminator of any of the genes (a) to (d), a part of the base sequence is the first base sequence, and a part of the region located downstream of the first base sequence is When the base sequence is the second base sequence, a linear chain containing a base sequence containing a first homologous region homologous to the first base sequence on the upstream side and a second homologous region homologous to the second base sequence on the downstream side Examples of such vectors are illustrated.
  • the base sequence encoding the polypeptide consisting of the base sequence of the endogenous gene, the amino acid sequence of the target protein, as mentioned above, and selection It is preferable that one or more base sequences such as a marker gene base sequence exist.
  • the first base sequence is preferably the base sequence of at least a part of the promoter of any of the genes (a) to (d) in the genomic DNA of the host cell.
  • Komagataella pastoris Can be the 1st to 97th nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31.
  • the second base sequence is preferably the base sequence of at least a part of the terminator of any of the genes (a) to (d) in the genomic DNA of the host cell.
  • the host cell is Komagataela pastoris
  • transformation refers to introduction of the vector into a cell.
  • a method for introducing a vector into a host cell that is, a transformation method
  • a known method can be appropriately used.
  • an electroporation method, a lithium acetate method, a spheroplast method and the like can be mentioned.
  • a transformation method of Komagataela pastoris an electroporation method described in High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithiumacetate and dithiothreitol (Biotechniques. 2004 Jan; 36 (1): 152-4.) Is common.
  • a selection marker gene such as an auxotrophic complementary gene or a drug resistance gene.
  • the selection marker is not particularly limited, but in the case of Komagataela yeast, uracil, leucine, adenine, histidine, arginine, respectively, in the case of auxotrophic complementary genes such as URA3 gene, LEU2 gene, ADE1 gene, HIS4 gene, ARG4 gene, etc.
  • Transformants can be selected by restoration of the prototrophic phenotype in the auxotrophic strains.
  • G418 resistance gene, Zeocin (trademark) resistance gene, hygromycin resistance gene, Clone NAT resistance gene, blasticidin S resistance gene and other drug resistance genes are G418, Zeocin (trademark), hygromycin, Clone, respectively.
  • a transformant can be selected by resistance on a medium containing NAT and blasticidin S.
  • an auxotrophic selection marker used when producing a yeast host cannot be used if the selection marker is not destroyed in the host. In this case, the selection marker may be destroyed in the host, and methods known to those skilled in the art can be used.
  • a vector when incorporated into a chromosome, it is preferably produced as DNA containing a plurality of homologous regions of the chromosome as in this example.
  • the method of integrating the vector onto the chromosome may be non-specific integration without using the homologous region, integration using one homologous region, or double crossover type using two homologous regions. May be incorporated.
  • transformation may be performed using a vector arranged so that the homologous region is located at both ends of the selection marker gene sequence. I can do it.
  • a base sequence including a complementary region to the promoter of the gene to be deleted upstream of the selectable marker gene, and a base sequence including a complementary region to the terminator of the gene to be deleted downstream can be incorporated using a linked vector.
  • the number of vector copies per chromosome is not particularly limited. Further, the position where the vector is integrated on the chromosome is not particularly limited as long as the gene of the present invention is inactivated. In addition, about the integration position of the transformant in which two or more copies of the vector are integrated, a plurality may be integrated at the same position, or one copy may be integrated at different positions.
  • the “base sequence having a homologous region” of the present invention may be any base sequence having at least a part of the target base sequence and having 50% or more sequence identity, more preferably 70. % Or more, more preferably 80% or more, particularly preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, more particularly preferably 95% or more, and most preferably 100% of the nucleotide sequence.
  • the length of the base sequence having the homologous region is not particularly limited since homologous recombination can be performed as long as it is a base sequence of 20 bp or more having the homologous region with the target base sequence.
  • 0.1% or more of the length of the target base sequence is preferable, 0.5% or more, 1% or more, 1.5% or more, 2% or more, 2.5% or more, 3% or more, 3.5 % Or more, 4% or more, 4.5% or more, 5% or more, 5.5% or more, 6% or more, 6.5% or more, 7% or more, 7.5% or more, 8% or more, 8.5 % Or more, 9% or more, 9.5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 40% or more, 45% or more, 50% or more, 55 % Or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more , Preferably 100%.
  • the “promoter of any of the genes (a) to (d)” of the present invention is present upstream of any of the genes (a) to (d) on the chromosome, and the expression level of the gene product is expressed as follows.
  • the base sequence to be adjusted specifically refers to at least a part of the base sequence up to 5000 bp upstream from the start codon of any of the genes (a) to (d).
  • terminal of any of the genes (a) to (d)” of the present invention is present downstream of any of the genes (a) to (d) on the chromosome, and the expression level of the gene product is
  • the base sequence to be adjusted specifically refers to at least a part of the base sequence up to 5000 bp downstream from the stop codon of any of the genes (a) to (d).
  • the host cell of the present invention comprises a nucleotide sequence having a homologous region with any of the genes (a) to (d), and a nucleotide sequence having a homologous region with the promoter of any of the genes (a) to (d). And / or at least one base sequence having a homologous region with the terminator of the gene of any one of (a) to (d) above, and from the amino acid sequence of the target protein upstream or downstream of the base sequence It is preferably obtained by transforming a parent cell with a vector containing a base sequence encoding the polypeptide.
  • the “target protein” is a protein produced by a cell into which the vector of the present invention has been introduced, and may be a host endogenous protein or a heterologous protein.
  • the target protein include enzymes derived from microorganisms, proteins produced by animals and plants that are multicellular organisms, and the like.
  • Examples include phytase, protein A, protein G, protein L, amylase, glucosidase, cellulase, lipase, protease, glutaminase, peptidase, nuclease, oxidase, lactase, xylanase, trypsin, pectinase, isomerase, fibroin, and fluorescent protein.
  • phytase protein A, protein G, protein L, amylase, glucosidase, cellulase, lipase, protease, glutaminase, peptidase, nuclease, oxidase, lactase, xylanase, trypsin, pectinase, isomerase, fibroin, and fluorescent protein.
  • human and / or animal therapeutic proteins are preferred.
  • human and / or animal therapeutic proteins include hepatitis B virus surface antigen, hirudin, antibody, human antibody, partial antibody, human partial antibody, serum albumin, human serum albumin, epidermal growth factor, human epithelial growth Factor, insulin, growth hormone, erythropoietin, interferon, blood coagulation factor VIII, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), thrombopoietin, IL-1, IL-6, Examples include tissue plasminogen activator (TPA), urokinase, leptin, and stem cell growth factor (SCF).
  • TPA tissue plasminogen activator
  • SCF stem cell growth factor
  • antibody refers to a heterotetrameric protein composed of disulfide bonds between two polypeptide chains, an L chain and an H chain, and has the ability to bind to a specific antigen. There is no particular limitation.
  • partial antibody refers to a Fab type antibody, a (Fab) type 2 antibody, a scFv type antibody, a diabody type antibody, or a derivative thereof, and has the ability to bind to a specific antigen.
  • Fab type antibody refers to a heteromeric protein in which the L chain and Fd chain of the antibody are linked by SS bonds, or a heteromeric protein in which the L chain and Fd chain of the antibody are associated with each other without containing SS bonds. If it has the capability to couple
  • amino acids constituting the target protein may be natural, non-natural, or modified.
  • amino acid sequence of the protein may be artificially modified or may be designed by de-novo.
  • the host cell of the present invention comprises a nucleotide sequence having a homologous region with any of the genes (a) to (d), and a nucleotide sequence having a homologous region with the promoter of any of the genes (a) to (d). And / or a vector containing at least one of the nucleotide sequences having a homologous region with the terminator of any of the genes (a) to (d), and a polypeptide comprising the amino acid sequence of the target protein It is preferably obtained by transforming a parent cell with a vector containing a base sequence.
  • a host cell with improved productivity of the target protein can be obtained.
  • the vector containing the base sequence encoding the target protein is separated from the vector to be inactivated and the vector containing the base sequence encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence of the target protein.
  • the host cell of the present invention is characterized in that methanol assimilation is lower than that of the parent cell.
  • methanol assimilation means that a host cell digests methanol as a carbon source. For example, whether or not methanol assimilation is reduced is determined by culturing in a medium using methanol as a carbon source. Or, for example, by measuring the amount of residual methanol or dissolved oxygen in the culture and comparing it with an unmodified strain such as a parent cell or a wild type strain.
  • the present invention provides a host cell obtained by further transformation with a vector comprising any one of the following base sequences (e) to (h): (E) a base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30, (F) a base sequence encoding an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, and / or added in the amino acid sequence shown in (e) above, (G) a base sequence encoding an amino acid sequence having 85% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in (e) above, or (h) complementary to a base sequence encoding the amino acid sequence shown in (e) above
  • the present invention relates to a nucleotide sequence of a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid having a basic nucleotide sequence.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 is the amino acid sequence of the polypeptide PpMPP1, which is a transcription factor that activates the methanol-inducible promoter found by the present inventors (ACCESSIONACCESSNo. CCA39317, International Publication No. 2012 / 102171).
  • the “base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30” is, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, but is not particularly limited as long as it encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30.
  • the present inventors further added a vector containing the nucleotide sequences (e) to (h) to a host cell in which any of the genes (a) to (d) is inactivated. It has been confirmed that the productivity of the target protein is further improved by transforming and highly expressing the polypeptide PpMPP1 represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30.
  • the term “one or more” relating to amino acid substitution, deletion, insertion and / or addition means, for example, in the amino acid sequence described in (f), in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30, 280, 1 to 250, 1 to 200, 1 to 190, 1 to 160, 1 to 130, 1 to 100, 1 to 75, 1 to 50, 1 to 25, 1 to 20, 1-15, 1-10, 1-7, 1-5, 1-4, 1-3, or 1 or 2
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 is 1-5, 1-10, 1-25, 1-50, 1-75, 1-100, 1 to Examples thereof include partial amino acid sequences consisting of 125, 1 to 150, 1 to 175, 1 to 200, 1 to 225, 1 to 250, 1 to 275, or 1 to 300 amino acids.
  • Sequence identity of 85% or more in (g) is more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, Most preferably, the sequence identity is 99% or more.
  • expression refers to transcription and translation of a base sequence that results in the production of a polypeptide. Moreover, the expression may be in a substantially constant state or may depend on external stimuli or growth conditions.
  • the promoter that drives expression is not particularly limited as long as it is a promoter that drives expression of a base sequence encoding a polypeptide.
  • “high expression” means that the amount of polypeptide in the host cell or the amount of mRNA in the host cell is increased compared to the normal amount. Measurement using an antibody recognizing a peptide, or measurement using, for example, RT-PCR, Northern hybridization, hybridization using a DNA array, etc. This can be confirmed by comparison.
  • the biological species of the host cell is not particularly limited, and examples thereof include yeast, bacteria, fungi, insect cells, animal cells, and plant cells.
  • yeast is preferable, methanol-utilizing yeast, fission yeast, and budding yeast are more preferable. More preferred is a methanol-assimilating yeast.
  • methanol-assimilating yeast is defined as yeast that can be cultivated using methanol as the only carbon source, but it was originally methanol-assimilating yeast, but it was assimilated by human modification or mutation. Yeast that has lost its performance is also included in the methanol-assimilating yeast in the present invention.
  • Examples of the methanol-assimilating yeast include yeasts belonging to the genus Pichia, the genus Ogataea, the genus Candida, the genus Torulopsis, the genus Komagataella, and the like.
  • Pichia ⁇ methanolica in the genus Ogataea, Ogataea angusta, Ogataea polymorpha, Ogataea polypolymorpha, minuta uta ), Candida genus Candida boidinii, and Komagataella genus Komagataella pastoris, Komagataella phaffii, and the like are preferable examples.
  • Komagataela yeast or Ogataea yeast are particularly preferable.
  • Komagataella pastoris As yeast of the genus Komagataella, Komagataella pastoris and Komagataella phaffii are preferable. Both Komagataela pastoris and Komagataela faffy have aliases for Pichia pastoris.
  • strains that can be used as hosts include Komagataela pastoris ATCC76273 (Y-11430, CBS7435), Komagataela pastoris X-33, and the like. These strains can be obtained from American Type Culture Collection, Thermo Fisher Scientific Co., etc.
  • Ogataea genus yeast As the Ogataea genus yeast, Ogataea angusta, Ogataea polymorpha, and Ogataea parapolymorpha are preferable. These three are closely related species, all of which are also known as Hansenula polymorpha or Pichia angusta.
  • strains that can be used include strains such as Ogata Air Angsta NCYC495 (ATCC14754), Ogata Air Polymorph 8V (ATCC34438), Ogata Air Parapolymorph DL-1 (ATCC26012), and the like. These strains can be obtained from the American Type Culture Collection.
  • derivatives derived from these strains of the genus Komagataela and Ogataae can also be used.
  • Komagataela pastoris GS115 strain available from Thermo Fisher Scientific
  • leucine if histidine is required.
  • Examples of the required strain include BY4329 derived from NCYC495, BY5242 derived from 8V, BY5243 derived from DL-1 (these can be sold from National BioResource Project), and the like.
  • derivatives derived from these strains can also be used.
  • the present invention relates to a method for producing a target protein, comprising the step of culturing the cells described above and the step of recovering the target protein from a culture solution.
  • culture medium means cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells in addition to the culture supernatant. Therefore, as a method for producing the target protein using the transformed yeast of the present invention, the above-described cells are cultured and accumulated in the cells, or secreted and accumulated in the culture supernatant. Preferably, a method of secreting and accumulating in the culture supernatant is mentioned.
  • the cell culture conditions are not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the cells.
  • any medium containing a nutrient source that can be assimilated by cells can be used.
  • the nutrient source include sugars such as glucose, sucrose and maltose, organic acids such as lactic acid, acetic acid, citric acid and propionic acid, alcohols such as methanol, ethanol and glycerol, hydrocarbons such as paraffin, soybean oil, Oils such as rapeseed oil, or carbon sources such as mixtures thereof, ammonium sources such as ammonium sulfate, ammonium phosphate, urea, yeast extract, meat extract, peptone, corn steep liquor, and other inorganic salts, vitamins, etc.
  • a normal medium in which nutrient sources are appropriately mixed and blended can be used.
  • the culture can be either batch culture or continuous culture.
  • the carbon source may be one of glucose, glycerol and methanol, or two or more thereof. Moreover, these carbon sources may exist from the beginning of the culture, or may be added during the culture.
  • the target protein By culturing the transformant obtained by introducing the vector of the present invention into cells, the target protein can be accumulated in the host or the culture solution and recovered.
  • known purification methods can be used in appropriate combination. For example, first, the transformed yeast is cultured in an appropriate medium, and the cells are removed from the culture supernatant by centrifugation of the culture solution or filtration. The obtained culture supernatant is salted out (ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation, etc.), solvent precipitation (protein fraction precipitation with acetone or ethanol, etc.), dialysis, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography. The target protein is recovered from the culture supernatant by using techniques such as chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, and ultrafiltration alone or in combination.
  • Cells can be cultured under normal conditions.
  • the cells are aerobically cultured for 10 hours to 10 days at a pH of 2.5 to 10.0 and a temperature range of 10 ° C to 48 ° C. Can be done.
  • the recovered target protein can be used as it is, but it can also be used after being modified with a pharmacological change such as PEGylation or a modification that adds a function such as an enzyme or an isotope. Various formulation treatments may also be used.
  • a base sequence encoding a signal sequence may be introduced at the 5 ′ end of the target protein gene.
  • the base sequence encoding the signal sequence is not particularly limited as long as it is a base sequence encoding a signal sequence that can be secreted and expressed by yeast, but Saccharomyces cerevisiae Mating Factor ⁇ (MF ⁇ ), Ogata Air Angsta acid phosphatase (PHO1), The base sequence encoding the acid phosphatase of P.
  • PHO1 Saccharomyces cerevisiae invertase
  • SUC2 Saccharomyces cerevisiae PLB1
  • BSA bovine serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • immunoglobulin signal sequences Etc immunoglobulin signal sequences Etc.
  • the “target protein” for improving the productivity may be an endogenous protein of the host or a heterologous protein.
  • endogenous protein refers to a protein produced during culture by a host cell that has not been genetically modified.
  • heterologous protein refers to a protein that is not normally expressed by a host cell that has not been genetically modified, or that is not sufficiently expressed even if expressed.
  • the promoter for expressing the target protein is not particularly limited as long as a promoter that can be expressed in the selected carbon source is appropriately used.
  • examples of the promoter for expressing the polypeptide include, but are not limited to, AOX1 promoter, AOX2 promoter, CAT promoter, DHAS promoter, FDH promoter, FMD promoter, GAP promoter, and MOX promoter.
  • examples of the promoter for expressing the polypeptide include, but are not limited to, GAP promoter, TEF promoter, LEU2 promoter, URA3 promoter, ADE promoter, ADH1 promoter, and PGK1 promoter.
  • the “promoter” refers to a base sequence region located upstream of the above-mentioned predetermined base sequence.
  • various transcription regulatory factors involved in the promotion or suppression of transcription bind to or act on the region.
  • the above-mentioned predetermined base sequence as a template is read to synthesize (transcribe) complementary RNA.
  • the plasmid used for yeast transformation was amplified by introducing the constructed vector into E. coli DH5 ⁇ competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.) and culturing the resulting transformant. It was prepared by. Preparation of the plasmid from the plasmid-bearing strain was performed using FastGene Plasmid Mini Kit (manufactured by Nippon Genetics).
  • AOX1 promoter SEQ ID NO: 1
  • AOX1 terminator SEQ ID NO: 2
  • HIS4 sequence SEQ ID NO: 3
  • GAP promoter SEQ ID NO: 4
  • nucleotide sequence encoding the polypeptide PpMPP1 used in the construction of the vector SEQ ID NO: 5
  • CCA38473 terminator SEQ ID NO: 6
  • AOX1 promoter is primer 1 (SEQ ID NO: 7) and primer 2 (SEQ ID NO: 8), AOX1 terminator is primer 3 (SEQ ID NO: 9) and primer 4 (SEQ ID NO: 10), HIS4 sequence is primer 5 (SEQ ID NO: 11) and primer 6 (SEQ ID NO: 12), GAP promoter is primer 7 (SEQ ID NO: 13) and primer 8 (SEQ ID NO: 14), base sequence encoding polypeptide PpMPP1 is primer 9 (SEQ ID NO: 15) and primer 10 (SEQ ID NO: 16)
  • the CCA38473 terminator was prepared by PCR using primer 11 (SEQ ID NO: 17) and primer 12 (SEQ ID NO: 18).
  • the promoter-controlled Zeocin TM resistance gene (SEQ ID NO: 19) used in the construction of the vector was prepared by PCR using synthetic DNA as a template.
  • the promoter-controlled G418 resistance gene (SEQ ID NO: 20) used in the construction of the vector was prepared by PCR using synthetic DNA as a template.
  • the anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody gene (SEQ ID NO: 21) to which the Mating Factor ⁇ prepro signal sequence was used was used in the construction of the vector, and public sequence information (J Mol Biol. 1998 Jul 3; 280 (1): 117-27 .) was prepared by PCR using a synthetic DNA as a template.
  • Chromosomal DNA was prepared from Komagataela pastoris ATCC76273 strain using Kaneka® Simple DNA Extraction Kit “version-2” (manufactured by Kaneka) under the conditions described therein.
  • ⁇ Production Example 2 Construction of an anti- ⁇ -galactosidase single chain antibody expression vector> A gene fragment having the multiple cloning site of HindIII-BamHI-BglII-XbaI-EcoRI (SEQ ID NO: 22) was fully synthesized and inserted between the HindIII-EcoRI sites of pUC19 (Takara Bio, Code No. 3219). PUC-1 was constructed.
  • nucleic acid fragment having a BamHI recognition sequence added to both sides of the AOX1 promoter (SEQ ID NO: 1) was prepared by PCR using primers 1 (SEQ ID NO: 7) and 2 (SEQ ID NO: 8), and after pam-1 treatment with pUC-1 PUC-Paox was constructed by inserting into BamHI site.
  • nucleic acid fragment having an XbaI recognition sequence added to both sides of the AOX1 terminator was prepared by PCR using primers 3 (SEQ ID NO: 9) and 4 (SEQ ID NO: 10).
  • PUC-PaoxTaox was constructed by inserting it into Paox's XbaI site.
  • a nucleic acid fragment having EcoRI recognition sequences added to both sides of the HIS4 sequence was prepared by PCR using primers 5 (SEQ ID NO: 11) and 6 (SEQ ID NO: 12).
  • PUC-PaoxTaoxHIS4 was constructed by inserting into the EcoRI site of PaoxTaox.
  • a nucleic acid fragment added with a BglII recognition sequence on both sides of the anti- ⁇ -galactosidase single chain antibody gene (SEQ ID NO: 21) to which the Mating Factor ⁇ prepro signal sequence was added, was added to primers 13 (SEQ ID NO: 23) and 14 (SEQ ID NO: 23). 24) and was inserted into the BglII site of pUC-PaoxTaoxHIS4 after BglII treatment to construct pUC-PaoxscFvTaoxHIS4.
  • This pUC-PaoxscFvTaoxHIS4 is designed so that an anti- ⁇ -galactosidase single chain antibody is expressed under the control of the AOX1 promoter.
  • PCR using primers 15 (SEQ ID NO: 26) and 16 (SEQ ID NO: 27) was performed by using a nucleic acid fragment added with EcoRI recognition sequence on both sides of a promoter-controlled Zeocin TM resistance gene (SEQ ID NO: 19). And was inserted into the EcoRI site of pUC-Pgap after EcoRI treatment to construct pUC-PgapZeo.
  • a nucleic acid fragment added with an XbaI recognition sequence on both sides of the CCA38473 terminator was prepared by PCR using primers 11 (SEQ ID NO: 17) and 12 (SEQ ID NO: 18).
  • PUC-PgapT38473Zeo was constructed by inserting it into the XbaI site of PgapZeo.
  • a base sequence (SEQ ID NO: 5) encoding the polypeptide PpMPP1 was prepared by PCR using primer 9 (SEQ ID NO: 15) and primer 10 (SEQ ID NO: 16).
  • Each nucleic acid fragment has a GAP promoter sequence as an overlap region upstream of the base sequence encoding the polypeptide PpMPP1, and a CCA38473 terminator sequence as an overlap region added downstream.
  • pUC-PgapT38473Zeo was treated with SpeI
  • a nucleic acid fragment was prepared by PCR using the GAP promoter Re primer (primer 17 (SEQ ID NO: 28)) and the CCA38473 terminator Fw primer (primer 18 (SEQ ID NO: 29)). It was mixed with a nucleic acid fragment of the base sequence encoding the prepared polypeptide PpMPP1 and joined using a New England Biolabs Gibson Assembly system to construct pUC-PgapPpMPP1T38473Zeo.
  • This vector is designed so that the polypeptide PpMPP1 represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 30 is expressed under the control of the GAP promoter.
  • ⁇ Production Example 4 Construction of a vector for inactivating a gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 34> A gene fragment in which a homologous region for transformation was added to both sides of a promoter-controlled G418 resistance gene (SEQ ID NO: 20) was obtained by PCR using primer 19 (SEQ ID NO: 31) and primer 20 (SEQ ID NO: 32). Prepared.
  • This vector is a promoter of the gene located upstream of the gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34, which encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 (ACCESSION No. CCA41122) in the chromosome of Komagataela pastoris ATCC76273 strain
  • a base sequence having 100% sequence identity with the base sequence of 97 bases, and a base sequence having 100% sequence identity with the 98 base sequence of the terminator of the gene located downstream of the gene As a homologous region, it is a vector added to both sides of a G418 resistance gene controlled by a promoter, and designed to inactivate the gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34 when transformed into a host cell. ing.
  • ⁇ Production Example 5 Construction of a vector for inactivating AOX1 gene, FLD1 gene, DAS1 gene, and DAS2 gene> Using a primer fragment (SEQ ID NO: 35) and primer 22 (SEQ ID NO: 36), a gene fragment with a homologous region for transformation added to both sides of the promoter-controlled Zeocin TM resistance gene (SEQ ID NO: 19) Prepared by PCR.
  • This vector is added to both sides of a promoter-controlled Zeocin TM resistance gene with the reading frame of the gene (SEQ ID NO: 37) encoding AOX1 (ACCESSION No. CCA40305) of Komagataela pastoris ATCC76273 strain as a homologous region.
  • a gene fragment in which a homologous region for transformation was added to both sides of a Zeocin TM resistance gene (SEQ ID NO: 19) controlled by a promoter was used using primer 23 (SEQ ID NO: 38) and primer 24 (SEQ ID NO: 39). Prepared by PCR.
  • This vector is resistant to Zeocin (trademark) controlled by a promoter using the 94-base sequence upstream and 94-base sequence downstream of FLD1 (ACCESSION No. CCA39112) of Komagataela pastoris ATCC76273 strain as homologous regions
  • This vector is added to both sides of the gene and is designed so that the gene encoding FLD1 is inactivated by transformation into a host cell.
  • a gene fragment in which a homologous region for transformation is added to both sides of a promoter-controlled Zeocin TM resistance gene (SEQ ID NO: 19) is used with primer 25 (SEQ ID NO: 41) and primer 26 (SEQ ID NO: 42).
  • primer 25 SEQ ID NO: 41
  • primer 26 SEQ ID NO: 42
  • This vector is resistant to Zeocin (trademark) controlled by a promoter with the 80-base sequence upstream and 78-base sequence downstream of the gene encoding DAS1 (ACCESSION No.) CCA39320) of Komagataela pastoris ATCC76273 strain as homologous regions
  • This vector is added to both sides of the gene and is designed so that the gene encoding DAS1 is inactivated by transformation into a host cell.
  • a gene fragment in which a homologous region for transformation was added on both sides of a promoter-controlled G418 resistance gene was obtained by PCR using primer 27 (SEQ ID NO: 44) and primer 28 (SEQ ID NO: 45). Prepared.
  • This vector is composed of 80 bases upstream and 77 bases downstream of the gene (SEQ ID NO: 46) encoding DAS2 (ACCESSION No. CCA39318) of Komagataela pastoris ATCC76273 strain, and both sides of the G418 resistance gene controlled by the promoter. This vector is designed to inactivate the gene encoding DAS2 upon transformation into a host cell.
  • YPD medium 1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 2% glucose
  • histidine-requiring strain derived from Komagataela pastoris ATCC76273 The preculture was obtained by shaking culture overnight. Inoculate 500 ⁇ l of the obtained preculture into 50 ml of YPD medium, shake culture until OD600 reaches 1 to 1.5, collect cells (3000 ⁇ g, 10 min, 20 ° C.), and then add 250 ⁇ l of 1M DTT (final concentration) Resuspended in 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 containing 25 mM).
  • This suspension was incubated at 30 ° C. for 15 minutes, then collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.), and ice-cooled 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) .5) washed. The washing solution was collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ⁇ L of STM buffer, and then collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 ⁇ l of ice-cold STM buffer, which was used as a competent cell solution.
  • STM buffer 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) .5
  • Escherichia coli was transformed with the anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody expression vector pUC-PaoxscFvTaoxHIS4 constructed in Production Example 2, and the resulting transformant was treated with 5 ml of ampicillin-containing 2YT medium (1.6% tryptone bacto (Becton Dickinson) ), 1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 0.5% sodium chloride, 0.01% ampicillin sodium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)), and FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics) Was used to obtain pUC-PaoxscFvTaoxHIS4. This plasmid was linearized by SacI treatment using the SacI recognition sequence in the AOX1 promoter.
  • the cells were collected (3000 ⁇ g, 5 minutes, 20 ° C.), suspended in 1 ml of YNB medium (0.67% yeast nitro base Without Amino Acid (Becton Dickinson)), and then collected again ( 3000 ⁇ g, 5 minutes, 20 ° C.).
  • the cells were resuspended in an appropriate amount of YNB medium and then applied to a YNB selective agar plate (0.67% yeast nitro base Without Amino Acid (Becton Dickinson), 1.5% agarose, 2% glucose), 30 °C, 3 A strain that grows in stationary culture for 1 day was selected, and an anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast was obtained.
  • Example 1 Acquisition of transformed yeast> Using the gene inactivation vector consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 34 constructed in Production Example 4, a yeast expressing an anti- ⁇ -galactosidase single chain antibody was transformed as follows.
  • Anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast obtained in Comparative Example 1 is inoculated into 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% ⁇ glucose).
  • the preculture was obtained by shaking culture at 30 ° C. overnight. Inoculate 500 ⁇ l of the obtained preculture into 50 ml of YPD medium, shake culture until OD600 reaches 1 to 1.5, collect cells (3000 ⁇ g, 10 min, 20 ° C.), and then add 250 ⁇ l of 1M DTT (final concentration) Resuspended in 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 containing 25 mM).
  • This suspension was incubated at 30 ° C. for 15 minutes, then collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.), and ice-cooled 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) .5) washed. The washing solution was collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ⁇ L of STM buffer, and then collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 ⁇ l of ice-cold STM buffer, which was used as a competent cell solution.
  • STM buffer 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) .5
  • YPDG418 selection agar plate 1% yeast extract (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% glucose, 1.5% agarose, 0.05% G418 disulfate ( An anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody in which the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 is inactivated by selecting a strain that grows by stationary culture at 30 ° C. for 3 days. Expression yeast was obtained.
  • YPD medium 1% yeast extract bacto (manufactured by Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) And 2% glucose
  • This suspension was incubated at 30 ° C. for 15 minutes, then collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.), and ice-cooled 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) .5) washed. The washing solution was collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ⁇ L of STM buffer, and then collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 ⁇ l of ice-cold STM buffer, which was used as a competent cell solution.
  • STM buffer 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) .5
  • Escherichia coli was transformed with the polypeptide PpMPP1 expression vector pUC-PgapPpMPP1T38473Zeo constructed in Production Example 3, and the obtained transformant was treated with 5 ml of ampicillin-containing 2YT medium (1.6% tryptone bacto (Becton Dickinson), 1% Cultivate in yeast extract bacto (Becton Dickinson), 0.5% sodium chloride, 0.01% ampicillin sodium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)), and from the cells, FastGene Plasmid Mini Kit (Nihon Genetics) To obtain pUC-PgapPpMPP1T38473Zeo. This plasmid was linearized by NruI treatment using the NruI recognition sequence in the CCA38473 terminator.
  • YPDG418Zeocin (trademark) selection agar plate (1% yeast extract (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nippon Pharmaceutical), 2% glucose, 1.5% agarose, 0.05% G418 Apply to sulfate (Nacalai Tesque), 0.01% Zeocin (trademark) (manufactured by Thermo Fisher Scientific)), select the strain that grows in static culture at 30 ° C for 3 days, and polypeptide PpMPP1 An anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast in which the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 was inactivated was obtained.
  • Anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast obtained in Comparative Example 1 is inoculated into 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% ⁇ glucose).
  • the preculture was obtained by shaking culture at 30 ° C. overnight. Inoculate 500 ⁇ l of the obtained preculture into 50 ml of YPD medium, shake culture until OD600 reaches 1 to 1.5, collect cells (3000 ⁇ g, 10 min, 20 ° C.), and then add 250 ⁇ l of 1M DTT (final concentration) Resuspended in 10 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 containing 25 mM).
  • This suspension was incubated at 30 ° C. for 15 minutes, then collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.), and ice-cooled 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) .5) washed. The washing solution was collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ⁇ L of STM buffer, and then collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 ⁇ l of ice-cold STM buffer, which was used as a competent cell solution.
  • STM buffer 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) .5
  • YPDZeocin (trademark) selection agar plate (1% yeast extract (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nippon Pharmaceutical), 2% glucose, 1.5% agarose, 0.01% Zeocin ( Trademark) (manufactured by Thermo Fisher Scientific)), select a strain that grows in static culture at 30 ° C for 3 days, and an anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast in which the AOX1 gene is inactivated Anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast in which the FLD1 gene was inactivated and anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast in which the DAS1 gene was inactivated were obtained.
  • the DAS2 gene inactivation vector constructed in Production Example 5 was used to transform an anti- ⁇ -galactosidase single chain antibody-expressing yeast in which the DAS1 gene was inactivated as follows.
  • DAS1 gene-inactivated anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast in 3 ml of YPD medium (1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% ⁇ glucose) Inoculated and cultured overnight at 30 ° C. with shaking to obtain a preculture.
  • YPD medium 1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% ⁇ glucose
  • This suspension was incubated at 30 ° C. for 15 minutes, then collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 20 ° C.), and ice-cooled 50 ml of STM buffer (270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) .5) washed. The washing solution was collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), washed again with 25 ⁇ L of STM buffer, and then collected (3000 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.). Finally, it was suspended in 250 ⁇ l of ice-cold STM buffer, which was used as a competent cell solution.
  • STM buffer 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM magnesium chloride, pH 7) .5
  • YPDG418 Zeocin TM selection agar plate 1% (yeast extract (BectonBDickinson), 2% ⁇ polypeptone (Nihon Pharmaceutical), 2% ⁇ glucose, 1.5% agarose, 0.05% G418 Apply to disulfate (manufactured by Nacalai Tesque), 0.01% Zeocin (trademark) (manufactured by Thermo Fisher Scientific)), select a strain that grows in static culture at 30 ° C for 3 days, An anti- ⁇ -galactosidase single chain antibody-expressing yeast in which the DAS2 gene was inactivated was obtained.
  • Example 2 Culture of transformed yeast> Anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast obtained by inactivating the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 obtained in Example 1, and the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 2ml BMMY medium (1% yeast extract bacto (Becton Dickinson), 2% polypeptone (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.34% yeast nitrogen base Without Amino Inoculate Acid and Ammonium Sulfate (Becton Dickinson), 1% Ammonium Sulfate, 0.4mg / l Biotin, 100mM potassium phosphate (pH6.0), 2% Methanol, and shake this at 30 °C, 170rpm for 72 hours After culture, the culture supernatant was recovered by centrifugation (12000 rpm, 5 minutes, 4 ° C.). The bacterial cell concentration was measured at OD600.
  • ⁇ Comparative Example 3 Culture of transformed yeast> Anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast obtained in Comparative Example 1, anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast obtained by Comparative Example 2 with inactivated AOX1 gene, FLD1 gene inactivated Anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast, anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast in which the DAS1 gene and DAS2 gene are inactivated are cultured by the same method as in Example 2 and then centrifuged (12000 rpm, 5 minutes) , 4 ° C.). The bacterial cell concentration was measured at OD600.
  • Example 3 Measurement of production amount of anti- ⁇ -galactosidase single chain antibody by ELISA method> The production amount of the anti- ⁇ -galactosidase single chain antibody in the culture supernatant obtained in Example 2 was carried out by the sandwich ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method as described below.
  • Immobilization buffer (8g / L sodium chloride, 0.2g / L potassium chloride, 1.15g / L ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ sodium monohydrogen phosphate (anhydrous), on ELISA plate (Nunc immunoplate maxi soap (manufactured by Thermo Fisher Scientific)) 50 ⁇ l of ⁇ -galactosidase (5 mg / mL Roche) diluted with 0.2 g / L potassium dihydrogen phosphate (anhydrous, 1 mM magnesium chloride) 2500 times was added and incubated at 4 ° C. overnight.
  • ⁇ Comparative Example 4 Measurement of production amount of anti- ⁇ -galactosidase single chain antibody by ELISA method> The production amount of anti- ⁇ -galactosidase single chain antibody in the culture supernatant obtained in Comparative Example 3 was measured in the same manner as in Example 3. Table 1 shows the amount of anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody produced by this method and the concentration of each cell (OD600). ⁇ Result>
  • the anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast (2) in which the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 obtained in Example 1 was inactivated is clearly a comparative example.
  • methanol assimilation was lower than that of the anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast obtained in 1 (1), and the antibody production was high.
  • the anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast (2) in which the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 obtained in Example 1 was inactivated was constructed with the intention of reducing methanol utilization.
  • the anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast (6) expressing the polypeptide PpMPP1 obtained in Example 1 and inactivating the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 is Comparative Example 1. Methanol assimilation decreased from the obtained anti- ⁇ -galactosidase single-chain antibody-expressing yeast (1), and high antibody production was shown. In addition, an anti- ⁇ -galactosidase single chain antibody-expressing yeast (6) expressing the polypeptide PpMPP1 obtained in Example 1 and inactivating the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 was used in Example 1.
  • the antibody production amount was higher. This suggests that the expression of the polypeptide PpMPP1 and the gene inactivation consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 further enhance the effect in both methanol utilization reduction and antibody production.

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Abstract

本発明は、宿主細胞のメタノール資化を低下させ、且つ目的タンパク質の生産性を向上させる新たな手段を提供することを解決すべき課題とする。　本発明によれば、本発明に記載の遺伝子を不活性化することによりメタノール資化が低下した宿主細胞及び目的タンパク質の生産性が向上した宿主細胞及び該遺伝子を不活性化するためのベクターが提供され、上記課題を解決する。さらに、該宿主細胞を宿主として用いる目的タンパク質の製造方法が提供される。

Description

新規宿主細胞及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法
　本発明は、特定の遺伝子を不活性化することによりメタノール資化が低下した新規宿主細胞、目的タンパク質の生産性が向上した新規宿主細胞、該遺伝子を不活性化するためのベクター、該新規宿主細胞を用いた目的タンパク質の製造方法に関する。
　医療及び診断用途に活用するための抗体、酵素、及びサイトカイン等の産業上有用なバイオマテリアルの生産には、遺伝子組換え法が広く用いられている。遺伝子組換え法によって目的タンパク質を生産するための宿主としては、ニワトリ等の動物、CHO等の動物細胞、カイコ等の昆虫、sf9等の昆虫細胞、並びに酵母、大腸菌、及び放線菌等の微生物が用いられている。宿主生物の中でも酵母は、安価な培地で大規模かつ高密度での培養が可能であるため、目的タンパク質を低コストで生産することができること、シグナルペプチド等を利用すれば培養液中への分泌発現も可能なため目的タンパク質の精製過程も容易となること、及び真核生物であるため糖鎖付加等の翻訳後修飾も可能であることから非常に有益であり、様々な研究が行われている。酵母において種々の目的タンパク質に対応できる革新的な生産技術を開発することができれば、生産性の劇的向上によるコスト競争力の強化に加え、幅広い産業展開が期待できる。
　酵母の一種であるコマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）はタンパク質発現能力に優れ、工業生産上有利である安価な炭素源を活用できるメタノール資化性（Mut+）酵母である。例えば、非特許文献1には、コマガタエラ・パストリスを用いて、緑色蛍光タンパク質、ヒト血清アルブミン、B型肝炎ウイルス表面抗原、ヒトインシュリン、及び一本鎖抗体等の異種タンパク質を生産する方法が報告されている。酵母において異種タンパク質を生産する場合、その生産性の向上のために、シグナル配列の付加、強力なプロモーターの利用、コドン改変、シャペロン遺伝子の共発現、転写因子遺伝子の共発現、宿主酵母由来のプロテアーゼ遺伝子の不活性化、及び培養条件の検討等様々な試みがなされている。例えば、特許文献１には、コマガタエラ・パストリスを用いて、メタノール誘導性プロモーターを活性化させる転写因子を発現させることによる生産性向上が報告されている。
　ところで、大規模且つ高密度培養系において、炭素源としてメタノールを用いて目的タンパク質の生産を行うには様々な問題が生じる。その問題とは、メタノール貯蔵タンクの大型化による安全性のリスク、メタノールの酸化で生じる過酸化水素による細胞のストレスや細胞死、メタノールの燃焼による熱の発生、高密度培養を維持するための酸素の大量供給、などである。これらの問題を解決するため、例えば非特許文献２～４には、AOX1遺伝子の破壊によるメタノール資化低下（MutS）株を用いた目的タンパク質の生産方法が記載されている。
国際公開第2012／102171号
FEMS Microbiology Reviews 24 (2000) 45-66. Enzyme and Microbial Technology 21 (1997) 277-283. Microbial Cell Factories (2012) 11:22. Biotechnology and Bioprocess Engineering (2015) 20: 315-323.
　しかしながら、非特許文献２～４に記載されているメタノール資化低下（MutS）株を用いて目的タンパク質を生産する場合、培養時間の長期化、炭素源の枯渇、プロテアーゼによる目的タンパク質の分解、といった新たな問題が生じる。
　本発明は、メタノール資化を低下させ、且つ目的タンパク質の生産性を向上させる新たな手段を提供することを課題とする。
　本発明者らは、コマガタエラ属酵母の染色体DNAの塩基配列の網羅的解析により、新規タンパク質を同定した。そして、該新規タンパク質をコードする遺伝子を不活性化することで、宿主細胞のメタノール資化が低下することを見出した。また、目的タンパク質の生産性が向上することも見出し、更にはメタノール誘導性プロモーターを活性化させる転写因子を高発現させることで目的タンパク質の生産性がより向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
（１）以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子が不活性化された宿主細胞：
（ａ）配列番号34に示す塩基配列を含む遺伝子、
（ｂ）配列番号34に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
（ｃ）配列番号34に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
（ｄ）配列番号33に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
（２）前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列を含有するベクターで形質転換して得られる（１）に記載の宿主細胞。
（３）前記ベクターが、目的タンパク質をコードする塩基配列を含有する、（２）に記載の宿主細胞。
（４）さらに、目的タンパク質をコードする塩基配列を含有するベクターを含む、（２）に記載の宿主細胞。
（５）親細胞に比してメタノール資化が低下した（１）～（４）のいずれかに記載の宿主細胞。
（６）以下の（ｅ）～（ｈ）のいずれかの塩基配列を含むベクターで形質転換することにより得られる（１）～（５）のいずれか１項に記載の宿主細胞：
（ｅ）配列番号30に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｆ）前記（ｅ）に示すアミノ酸配列において、1もしくは複数個アミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｇ）前記（ｅ）に示すアミノ酸配列と85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は
（ｈ）前記（ｅ）に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列。
（７）酵母、細菌、真菌、昆虫細胞、動物細胞、又は植物細胞である、（６）に記載の宿主細胞。
（８）酵母が、メタノール資化性酵母、分裂酵母、又は出芽酵母である、（７）に記載の宿主細胞。
（９）メタノール資化性酵母がコマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母である、（８）に記載の宿主細胞。
（１０）（３）～（９）のいずれかに記載の細胞を培養する工程、及び培養液から目的タンパク質を回収する工程を含む、目的タンパク質の製造方法。
（１１）目的タンパク質が異種タンパク質である、（１０）に記載の方法。
（１２）培養工程において、グルコース、グリセロール、及びメタノールからなる群から選択される一以上の炭素源を含む培養液を用いる、（１０）又は（１１）に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-243198号の開示内容を包含する。
　本発明により、宿主細胞のメタノール資化を低下させることができる。さらに、本発明により目的タンパク質の効率的な生産方法が提供される。
　以下、本発明を、好ましい実施形態を用いて詳細に説明する。
一態様において、本発明は、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子が不活性化された宿主細胞：
（ａ）配列番号34に示す塩基配列を含む遺伝子、
（ｂ）配列番号34に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
（ｃ）配列番号34に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
（ｄ）配列番号33に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子、に関する。
　本発明において、2つの核酸がストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、例えば以下の意味である。例えば、核酸Xを固定化したフィルターを用いて、0.7～1.0MのNaCl存在下、65℃で配列同一性が85％以上の核酸Yとハイブリダイゼーションを行った後、2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、65℃の条件下でフィルターを洗浄することにより、核酸Yがフィルター上に結合した核酸として取得できる場合に、核酸Yを「核酸Xとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸」と言うことができる。或いは核酸Xと核酸Yとが「ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズする」ということができる。SSC溶液の濃度を下げるほど、高い配列同一性を有する核酸がハイブリダイズすることが期待できることから、核酸Yは好ましくは65℃で1倍濃度のSSC溶液で洗浄、より好ましくは65℃で0.5倍濃度のSSC溶液で洗浄、より好ましくは65℃で0.2倍濃度のSSC溶液で洗浄、更に好ましくは65℃で0.1倍濃度のSSC溶液で前記フィルターを洗浄することによりフィルター上に結合した核酸として取得できる核酸である。また、温度を上げるほど高い配列同一性を有する核酸がハイブリダイズすることが期待できることから、核酸Yは好ましくは70℃で2倍濃度のSSC溶液で洗浄、より好ましくは75℃で2倍濃度のSSC溶液で洗浄、より好ましくは80℃で2倍濃度のSSC溶液で洗浄、更に好ましくは85℃で2倍濃度のSSC溶液で前記フィルターを洗浄することによりフィルター上に結合した核酸として取得できる核酸である。基準となる核酸Xは、コロニー又はプラーク由来の核酸Xであってよい。
　本発明において塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、BLASTアルゴリズムのblastnプログラムやblastpプログラム、FASTAアルゴリズムのfastaプログラムが挙げられる。本発明において、ある評価対象塩基配列の、塩基配列Xとの「配列同一性」とは、塩基配列Xと評価対象塩基配列とを整列（アラインメント）させ、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだ塩基配列において同一部位に同一の塩基が出現する頻度を％で表示した値である。本発明において、ある評価対象アミノ酸配列の、アミノ酸配列Xとの「配列同一性」とは、アミノ酸配列Xと評価対象アミノ酸配列とを整列（アラインメント）させ、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだアミノ酸配列において同一部位に同一のアミノ酸が出現する頻度を％で表示した値である。
　前記遺伝子の塩基配列と配列番号34に示す塩基配列との配列同一性は、８５％以上であり、９０%以上が好ましく、９５%以上がより好ましく、９６%以上がさらにより好ましく、９７%以上が特に好ましく、９８%以上、又は９９%以上が最も好ましい。
　本発明において「核酸」とは、「ポリヌクレオチド」と呼ぶこともでき、DNA又はRNAを指し、典型的にはDNAを指す。
　本明細書において「遺伝子」とは、宿主細胞が有する核酸のうちDNAのみならずそのmRNA及びcDNAも包含するが、典型的にはDNAであることができ、特にゲノムDNAであることができる。「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば、エキソンのみ含むのであってもよいし、エキソン及びイントロンを含むものであってもよい。
　前記（ａ）における「配列番号34に示す塩基配列」、前記（ｂ）における「配列番号34に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列」、前記（ｃ）における「配列番号34に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列」が、それぞれ、複数のエキソンが接続されて形成された塩基配列（例えばcDNA塩基配列）である場合には、前記（ａ）の遺伝子、前記（ｂ）の遺伝子、前記（ｃ）の遺伝子は、それぞれ、前記塩基配列に１以上のイントロンの塩基配列が更に挿入及び／又は付加された塩基配列を含むDNA又はRNAであってもよい。
　本明細書においてDNA及びRNAは2本鎖であっても1本鎖であってもよい。所定の塩基配列を有する遺伝子、DNA、RNA、ポリヌクレオチド又は核酸といった場合、特に言及しない限り、前記所定の塩基配列と相補的な塩基配列を有する遺伝子、DNA、RNA、ポリヌクレオチド又は核酸も包含される。さらに、遺伝子、ポリヌクレオチド又は核酸がRNAである場合、配列表に示される塩基記号「T」は「U」と読み替えられるものとする。
　本発明において「アミノ酸配列をコードする塩基配列」とは、アミノ酸配列からなるポリペプチドに対してコドン表に基づいて設計された塩基配列を指し、該塩基配列は、転写及び翻訳によってポリペプチドの生成をもたらす。
　本発明において、「ポリペプチド」とは、2個以上のアミノ酸がペプチド結合したものを指し、タンパク質の他、ペプチドやオリゴペプチドと呼ばれる鎖長の短いものが含まれる。
　本発明において「不活性化」とは、遺伝子の機能が失われている状態、または機能が減少している状態を指し、当該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるポリペプチドの発現量が低下している状態やｍＲＮＡやタンパク質として正常に機能しない状態も包含する。なお、ｍＲＮＡの発現量はリアルタイムＰＣＲ法、RNA-Seq法、ノーザンハイブリダイゼーション又はＤＮＡアレイを利用したハイブリダイゼーション法等を用いて定量することができ、ポリペプチドの発現量は、ポリペプチドを認識する抗体やポリペプチドと結合性を有する染色化合物等を用いて定量することができる。また、上記に挙げた定量方法以外にも、当業者で用いられている従来法であってもよい。
　遺伝子を不活性化させる手段としては、薬剤や紫外線を用いたＤＮＡ変異処理、ＰＣＲを用いた部分特異的変異導入、ＲＮＡｉ、プロテアーゼ、相同組み換え等を利用することができる。遺伝子を不活性化させる場合は、当該遺伝子のＯＲＦ内の塩基配列の改変（欠失、置換、付加、挿入）、及び／又はプロモーター領域、エンハンサー領域、ターミネーター領域などの転写開始または停止を制御する領域内の塩基配列の改変（欠失、置換、付加、挿入）により行う。なお、前記欠失、置換、付加、挿入を行う部位や、欠失、置換、付加、挿入される塩基配列は、当該遺伝子の正常な機能が欠損し得る限り、特に限定されない。不活性化させる遺伝子は、宿主細胞の染色体上の遺伝子であってもよく、宿主細胞の染色体外の遺伝子であってもよい。このうち、染色体上の遺伝子を不活性化させることが好ましい。
　本発明における「塩基配列の改変」とは、相同組換えを利用した遺伝子の挿入や部位特異的変異導入の手法を使用して実施することができる。例えば、遺伝子上流プロモーターのより活性の低いプロモーターへの置換や、宿主細胞に適していないコドンへの改変等、また、欠失させたい遺伝子の上流配列、選択マーカー遺伝子配列及び欠失させたい遺伝子の下流配列を連結させたベクターの導入などが挙げられる。ここで、「欠失させたい遺伝子の上流配列」とは、例えば、宿主細胞の染色体ゲノムＤＮＡにおいて、欠失させたい遺伝子よりも上流側に位置する塩基配列を指し、「欠失させたい遺伝子の下流配列」とは、例えば、宿主細胞の染色体ゲノムＤＮＡにおいて、欠失させたい遺伝子よりも下流側に位置する塩基配列を指す。
　本発明における不活性化による発現量低下の度合は、目的タンパク質の生産性が向上すれば特に限定されないが、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上低下していることが好ましい。なお、発現量が低下していなくとも、上述のとおり、遺伝子産物の正常な機能が欠損し得る限り、不活性化することができることは、当業者であれば周知であるから、発現量の低下の度合は、あくまで不活性化の判断基準の１つにすぎない。
　本明細書において、「宿主細胞」とは、ベクターが導入され形質転換される細胞をいい、「宿主」又は「形質転換体」と呼ばれる。本明細書では形質転換前及び後の宿主細胞を単に「細胞」と呼ぶ場合がある。宿主として用いる細胞はベクターを導入することの出来る細胞であれば特に限定されない。
　「配列番号34に示す塩基配列を含む遺伝子」は、コマガタエラ・パストリスの4本の染色体DNAの塩基配列(ATCC76273株：ACCESSION No. FR839628～FR839631（J. Biotechnol. 154 (4), 312-320 (2011)、及びGS115株：ACCESSION No. FN392319～FN392322（Nat. Biotechnol. 27 (6), 561-566 (2009))）の網羅的解析により見出された。具体的には、本発明者は、不活性化によってメタノール資化の低下を引き起こすポリペプチド、及びそのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを探索した。その結果、ATCC76273株において配列番号33で示されるアミノ酸配列（ACCESSION No. CCA41122）で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号34で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドを見出した。後述する実施例において、本発明者らは上記の塩基配列からなる遺伝子を不活性化させるベクターを宿主に導入し、メタノール資化の低下及び目的タンパク質の生産性が向上することを確認している。
　本明細書において、宿主細胞からのタンパク質の生産量の増加は、親細胞又は野生型株におけるタンパク質の生産量に対して、例えば1.01倍、1.02倍、1.03倍、1.04倍、1.05倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、又は5倍以上、また100倍、90倍、80倍、70倍、60倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、又は5倍以下であればよい。タンパク質を分泌生産する場合、細胞からの全タンパク質の分泌生産量は、細胞の培養上清等を用いて、当業者に公知の方法、例えばBladford法、Lowry法、及びBCA法等により容易に決定することができる。細胞からの特定のタンパク質の分泌生産量は、細胞の培養上清等を用いて、ELISA法等により容易に決定することができる。
　本明細書において、「親細胞」、又は「野生型株」とは、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかに示す塩基配列を含む遺伝子の発現を変化させるような処理を施していない宿主細胞又は株を意味する。したがって、本明細書に記載の「親細胞」、又は「野生型株」には、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかに示す塩基配列以外を改変した宿主細胞又は株も含まれる。
　配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子を不活性化する例として、後述する実施例のように配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子の上流に位置するプロモーターの97ｂｐと１００％の配列同一性を有する塩基配列（例えば、配列番号31の1～97番目の塩基配列）及び、配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子の下流に位置するターミネーターの相補配列98ｂｐと１００％の配列同一性を有する塩基配列（例えば、配列番号32の1～98番目の塩基配列）をそれぞれプライマー19及び20の内部配列として用いてPCR産物を調製し、該PCR産物をベクターとしてコマガタエラ属酵母に形質転換する方法が挙げられる。
　「配列番号33に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子」とは、配列番号33に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づきコドン表を参照して設計される塩基配列からなる遺伝子のことを指し、例えば、配列番号34に示す遺伝子が挙げられる。そして、当該遺伝子を不活性化させることで、メタノール資化の低下及び目的タンパク質の生産量の向上を達成することができる。前記配列同一性は、８５％以上であり、９０%以上が好ましく、９５%以上がより好ましく、９６%以上がさらにより好ましく、９７%以上が特に好ましく、９８%以上、又は９９%以上が最も好ましい。
　本発明の宿主細胞は、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターを形質転換することにより得られることが好ましい。
　本発明では、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターで親細胞を形質転換することで、宿主細胞の染色体上における前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子を不活性化させることができる。また、ベクターは、各々の相同領域を有する塩基配列をすべて組み込んだベクターを用いても良いし、各々の相同領域を有する塩基配列を、それぞれ１つずつ組み込んだベクターを用いても良い。
　本発明の１以上の実施形態では、前記「各々の相同領域を有する塩基配列をすべて組み込んだベクター」として、１つのベクター中に、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列の全てを含むベクターを用いることができる。
　本発明の他の１以上の実施形態では、前記「各々の相同領域を有する塩基配列を、それぞれ１つずつ組み込んだベクター」として、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子と相同領域を有する塩基配列を含む第１のベクターと、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列を含む第２のベクターと、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列を含む第３のベクターとを、組み合わせて用いることができる。この場合、宿主細胞の形質転換時に、第１～第３のベクターを、同時に導入してもよいし、逐次的に導入してもよい。
　本発明のベクターは環状ベクター、直鎖状ベクター、プラスミド、人工染色体等であることができる。
　本発明においてベクターとは人為的に構築された核酸分子である。本発明のベクターを構成する核酸分子は、通常DNA、好ましくは二本鎖DNAであり、環状であっても、直鎖状であってもよい。本発明のベクターは、通常は、所定の塩基配列（上述した前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基配列、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列、或いは、これらの塩基配列のうち複数が連結（適当な長さの他の塩基配列を介して連結する場合を含む）した塩基配列）に加えて、１つ以上の制限酵素認識部位を含むクローニングサイト、Clontech社のIn-FusionクローニングシステムやNew England Biolabs社のGibson Assemblyシステム等を利用するためのオーバーラップ領域、内在性遺伝子の塩基配列、目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、選択マーカー遺伝子（栄養要求性相補遺伝子、薬剤耐性遺伝子など）の塩基配列等を含むことができる。直鎖状ベクターの例としては、URA3遺伝子、LEU2遺伝子、ADE1遺伝子、HIS4遺伝子、ARG4遺伝子等の栄養要求性相補遺伝子やG418耐性遺伝子、Zeocin(商標)耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、Clone NAT耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子の塩基配列を有するＰＣＲ産物、または環状ベクターやプラスミドを適当な制限酵素によって切断し、直鎖状としたものなどが挙げられる。プラスミドの例としては、YEpベクター、YRpベクター、YCpベクター、pPICHOLI（http://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/p_picholi_shuttle_vector.html）、pHIP（Journal of General Microbioiogy (1992), 138, 2405-2416. Chromosomal targeting of replicating plasmids in the yeast Hansenula polymorpha）、pHRP（pHIPについて挙げた前記文献参照）、pHARS（Molecular and General Genetics MGG February 1986, Volume 202, Issue 2, pp 302-308, Transformation of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha by autonomous replication and integration vectors）、大腸菌由来プラスミドベクター（pUC18、pUC19、pBR322、pBluescript、pQE）、枯草菌由来プラスミドベクター（pHY300PLK、pMTLBS72）等を使用することができる。人工染色体の例としては、一般に、セントロメアＤＮＡ配列、テロメアＤＮＡ配列、自律複製配列（ARS）を含む人工染色体ベクターを指し、酵母であれば酵母人工染色体（YACベクター）などが挙げられ、Saccharomyces cerevisiaeやSchizosaccharomyces pombeなどにおいて開発されている。コマガタエラ・パストリスにおいては国際公開第2016／088824号に記載されているセントロメアＤＮＡ配列を用いることによって人工染色体を構築することができる。
　本発明のベクターは、典型的には、宿主細胞のゲノムＤＮＡにおける、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のプロモーター、及び、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のターミネーターを含む領域のうち、一部分の塩基配列を第１塩基配列とし、前記領域のうち、第１塩基配列よりも下流側に位置する一部分の塩基配列を第２塩基配列としたとき、第１塩基配列と相同な第１相同領域を上流側に含み、第２塩基配列と相同な第２相同領域を下流側に含む塩基配列を含む直鎖状ベクターが例示できる。この直鎖状ベクターでは第１相同領域と第２相同領域との間に、上記で挙げたような、内在性遺伝子の塩基配列、目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、選択マーカー遺伝子の塩基配列等の１以上の塩基配列が存在していることが好ましい。第１塩基配列は、好ましくは、宿主細胞のゲノムＤＮＡにおける前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のプロモーターの少なくとも一部分の塩基配列であり、例えば、宿主細胞がコマガタエラ・パストリスである場合には配列番号３１の１～９７番目の塩基配列であることができる。第２塩基配列は、好ましくは、宿主細胞のゲノムＤＮＡにおける前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のターミネーターの少なくとも一部分の塩基配列であり、例えば、宿主細胞がコマガタエラ・パストリスである場合には配列番号３２の１～９８番目の塩基配列であることができる。
　本発明において「形質転換」とは、上記ベクターを細胞に導入することを指す。ベクターを宿主細胞へ導入する方法、すなわち形質転換法は公知の方法を適宜用いることができ、例えば宿主として酵母細胞を用いる場合、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法等が挙げられるが特にこれらに限定されるものではない。例えば、コマガタエラ・パストリスの形質転換法としては、High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithiumacetate and dithiothreitol（Biotechniques. 2004 Jan;36(1):152-4.）に記載されているエレクトロポレーション法が一般的である。
　本発明において、ベクターをコマガタエラ属酵母に形質転換する場合、栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子を用いることが好ましい。選択マーカーは特に限定されないが、コマガタエラ属酵母であれば、URA3遺伝子、LEU2遺伝子、ADE1遺伝子、HIS4遺伝子、ARG4遺伝子などの栄養要求性相補遺伝子であれば、それぞれウラシル、ロイシン、アデニン、ヒスチジン、アルギニンの栄養要求性株において原栄養株表現型の回復により形質転換体を選択することができる。また、G418耐性遺伝子、Zeocin(商標)耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、Clone NAT耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子であれば、それぞれG418、Zeocin(商標)、ハイグロマイシン、Clone NAT、ブラストサイジンSを含む培地上における耐性により形質転換体を選択することができる。なお、酵母宿主を作製するときに用いる栄養要求性選択マーカーは、宿主において該選択マーカーが破壊されていない場合は、用いることができない。この場合、宿主において該選択マーカーを破壊すればよく、方法は当業者には公知の方法を用いることができる。
　本発明において、ベクターを染色体に組み込む場合、本実施例のように染色体の相同領域を複数含むＤＮＡとして作製することが好ましい。染色体上へのベクターの組み込みの方法は、相同領域を利用しない非特異的な組み込みでもよいし、１箇所の相同領域を利用した組み込みでもよいし、２箇所の相同領域を利用したダブルクロスオーバー型の組み込みでもよい。
　本発明において、相同領域を利用した組み込みの場合、例えば本実施例のように、選択マーカー遺伝子配列の両末端に相同領域が位置するように配置されたベクターを利用して形質転換を行うことが出来る。例えば、遺伝子欠失させたい場合、選択マーカー遺伝子の上流に欠失させたい遺伝子のプロモーターとの相補領域を含む塩基配列、下流には欠失させたい遺伝子のターミネーターとの相補領域を含む塩基配列を連結させたベクターを利用して組み込むことが出来る。
　本発明において、染色体あたりのベクターのコピー数は特に限定されない。また、染色体上にベクターが組み込まれている位置は、本発明の遺伝子が不活性化されている限り、特に限定されない。なお、２コピー以上のベクターが組み込まれている形質転換体の組み込み位置については、同じ位置に複数が組み込まれている状態でもよいし、異なる位置に１コピーずつ組み込まれている状態でもよい。
　本発明の「相同領域を有する塩基配列」とは、目的とする塩基配列の少なくとも一部の塩基配列を有し、５０％以上の配列同一性を有する塩基配列であればよく、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは８５％以上、よりさらに好ましくは９０％以上、より特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する塩基配列である。また、該相同領域を有する塩基配列の長さは、目的とする塩基配列と相同領域を有する２０ｂｐ以上の塩基配列であれば、相同組み換えすることができるため特に限定されないが、具体的には、目的とする塩基配列の長さの０．１％以上が好ましく、０．５％以上、１％以上、１．５％以上、２％以上、２．５％以上、３％以上、３．５％以上、４％以上、４．５％以上、５％以上、５．５％以上、６％以上、６．５％以上、７％以上、７．５％以上、８％以上、８．５％以上、９％以上、９．５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、１００％が好ましい。
　本発明の「（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のプロモーター」とは、染色体上で（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子の上流に存在し、該遺伝子産物の発現量を調整する塩基配列であり、具体的には、（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子の開始コドンより上流の５０００ｂｐまでの塩基配列の少なくとも一部分を指す。
　本発明の「（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のターミネーター」とは、染色体上で（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子の下流に存在し、該遺伝子産物の発現量を調整する塩基配列であり、具体的には、（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子の終始コドンより下流の５０００ｂｐまでの塩基配列の少なくとも一部分を指す。
　本発明の宿主細胞は、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターで親細胞を形質転換することにより得られることが好ましい。
　前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列の上流又は下流に目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列が配置されたベクターを形質転換することで、目的タンパク質の生産性が向上した宿主細胞を得ることができる。さらに、各々の相同領域を有する塩基配列を含有したベクターに、該塩基配列の上流及び／又は下流に目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を配置することで、形質転換の操作性を向上させることができる。
　本発明において「目的タンパク質」とは、本発明のベクターが導入された細胞が生産するタンパク質であって、宿主の内在性タンパク質であってもよいし、異種タンパク質であってもよい。目的タンパク質の例として、微生物由来の酵素類、多細胞生物である動物や植物が産生するタンパク質等が挙げられる。例えば、フィターゼ、プロテインA、プロテインG、プロテインL、アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、グルタミナーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、ラクターゼ、キシラナーゼ、トリプシン、ペクチナーゼ、イソメラーゼ、フィブロイン、及び蛍光タンパク質等が挙げられるが、これらに限定はされない。特に、ヒト及び／又は動物治療用タンパク質が好ましい。　ヒト及び／又は動物治療用タンパク質として、具体的には、B型肝炎ウイルス表面抗原、ヒルジン、抗体、ヒト抗体、部分抗体、ヒト部分抗体、血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、上皮成長因子、ヒト上皮成長因子、インシュリン、成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン、血液凝固第VIII因子、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、トロンボポエチン、IL-1、IL-6、組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）、ウロキナーゼ、レプチン、及び幹細胞成長因子（SCF）等が挙げられる。
　ここで「抗体」とは、L鎖とH鎖の各2本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合して構成されるヘテロテトラマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。
　ここで「部分抗体」とは、Fab型抗体、（Fab）2型抗体、scFv型抗体、diabody型抗体や、これらの誘導体等のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。Fab型抗体とは、抗体のL鎖とFd鎖がS-S結合で結合したヘテロマータンパク質、又は抗体のL鎖とFd鎖がS-S結合を含まず会合したヘテロマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。
　上記目的タンパク質を構成するアミノ酸は天然のものでもよいし、非天然のものでもよいし、修飾を受けていてもよい。また、タンパク質のアミノ酸配列は、人為的な改変が施されていてもよいし、de-novoで設計されたものでもよい。
　本発明の宿主細胞は、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとで親細胞を形質転換することにより得られることが好ましい。
　前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとで細胞を形質転換することで、目的タンパク質の生産性が向上した宿主細胞を得ることができる。さらに、不活性化するベクターと、目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを別にすることで、該目的タンパク質をコードする塩基配列を含有するベクターを前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子の位置以外に１コピー以上導入して発現量を増大させること、目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列が１コピー以上存在するプラスミドや人工染色体を導入して発現量を増大させること、また、育種改良において前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子の不活性化に用いた栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子の破壊時に目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列も同時に破壊させてしまうことを防ぐため、効率よく目的タンパク質の生産性を向上させることができる。
　本発明の宿主細胞は親細胞と比してメタノール資化が低下していることを特徴とする。
　本発明において「メタノール資化」とは、宿主細胞がメタノールを炭素源として消化することを意味し、例えばメタノール資化が低下しているかどうかは、メタノールを炭素源とした培地で培養し細胞数を測定し、あるいは、例えば、培養液中の残存メタノール量や溶存酸素量を測定し、親細胞又は野生型株のような非改変株と比較することによって確認することができる。
　一態様において、本発明は、以下の（ｅ）～（ｈ）のいずれかの塩基配列を含むベクターで更に形質転換することにより得られる宿主細胞：
（ｅ）配列番号30に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｆ）前記（ｅ）に示すアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｇ）前記（ｅ）に示すアミノ酸配列と85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は
（ｈ）前記（ｅ）に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列、に関する。
　「配列番号30に示すアミノ酸配列」は、本発明者によって見出されたメタノール誘導性プロモーターを活性化させる転写因子であるポリペプチドPpMPP1のアミノ酸配列である（ACCESSION No. CCA39317、国際公開第2012／102171号）。「配列番号30に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列」は、例えば配列番号5に示される塩基配列であるが、配列番号30に示すアミノ酸配列をコードしていれば特に限定されない。後述する実施例において、本発明者らは前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子が不活性化された宿主細胞に、前記（ｅ）～（ｈ）の塩基配列を含むベクターで更に形質転換し、配列番号30で示されるアミノ酸配列で示されるポリペプチドPpMPP1を高発現させることにより、目的タンパク質の生産性が更に向上することを確認している。
　本発明において、アミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加に関する「1もしくは複数個」とは、例えば、（ｆ）に記載のアミノ酸配列では、配列番号30で示されるアミノ酸配列において、1～280個、1～250個、1～200個、1～190個、1～160個、1～130個、1～100個、1～75個、1～50個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～7個、1～5個、1～4個、1～3個、又は1もしくは2個をいう。（ｆ）に記載のアミノ酸配列の例として、配列番号30で示されるアミノ酸配列の連続する、1～5、1～10、1～25、1～50、1～75、1～100、1～125、1～150、1～175、1～200、1～225、1～250、1～275、又は1～300アミノ酸からなる部分アミノ酸配列が挙げられる。
　（ｇ）における「85％以上の配列同一性」は、より好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、より好ましくは９６%以上、より好ましくは９７%以上、より好ましくは９８%以上、最も好ましくは９９%以上の配列同一性である。
　本発明において、「発現」とは、ポリペプチドの生成をもたらす塩基配列の転写及び翻訳を指す。また、その発現は外部刺激や生育条件等に依存せずにほぼ一定の状態でもよいし、依存してもよい。発現を駆動するプロモーターは、ポリペプチドをコードする塩基配列の発現を駆動するプロモーターであれば特に限定されない。
　本発明において、「高発現」とは、宿主細胞内のポリペプチドの量、もしくは、宿主細胞内のmRNAの量が、通常の量に比較して増加していることを意味し、例えば、ポリペプチドを認識する抗体を利用して測定し、あるいは、例えば、RT-PCR法やノーザンハイブリダイゼーション、DNAアレイを使用するハイブリダイゼーション等によって測定し、親細胞又は野生型株のような非改変株と比較することによって確認することができる。
　宿主細胞の生物種は特に限定されないが、酵母、細菌、真菌、昆虫細胞、動物細胞、及び植物細胞等が挙げられ、酵母が好ましく、メタノール資化性酵母、分裂酵母、出芽酵母がより好ましく、メタノール資化性酵母がさらに好ましい。一般に、メタノール資化性酵母は、唯一の炭素源としてメタノールを利用して培養可能な酵母と定義されるが、本来メタノール資化性酵母であったが、人為的な改変あるいは変異によりメタノール資化性能を喪失した酵母も、本発明におけるメタノール資化性酵母に包含される。
　メタノール資化性酵母としては、ピキア（Pichia）属、オガタエア（Ogataea）属、キャンディダ（Candida）属、トルロプシス（Torulopsis）属、コマガタエラ（Komagataella）属等に属する酵母が挙げられる。ピキア（Pichia）属ではピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、オガタエア（Ogataea）属ではオガタエア・アングスタ（Ogataea angusta）、オガタエア・ポリモルファ（Ogataea polymorpha）、オガタエア・パラポリモルファ（Ogataea parapolymorpha）、オガタエア・ミヌータ(Ogataea minuta)、キャンディダ（Candida）属ではキャンディダ・ボイディニ（Candida boidinii）、コマガタエラ（Komagataella）属ではコマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、コマガタエラ・ファフィ（Komagataella phaffii）等が好ましい例として挙げられる。
　上記のメタノール資化性酵母のなかでも、コマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母が特に好ましい。
　コマガタエラ（Komagataella）属酵母としては、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、コマガタエラ・ファフィ（Komagataella phaffii）が好ましい。コマガタエラ・パストリス及びコマガタエラ・ファフィはどちらもピキア・パストリス（Pichia pastoris）の別名を有する。
　具体的に宿主として使用できる菌株として、コマガタエラ・パストリスATCC76273（Y-11430、CBS7435）、コマガタエラ・パストリスX-33等の株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションやサーモフィッシャーサイエンティフィック社等から入手することができる。
　オガタエア（Ogataea）属酵母としては、オガタエア・アングスタ（Ogataea angusta）、オガタエア・ポリモルファ（Ogataea polymorpha）、オガタエア・パラポリモルファ（Ogataea parapolymorpha）が好ましい。これら3つは近縁種であり、いずれも、別名ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、又は別名ピキア・アングスタ（Pichia angusta）でも表される。
　具体的に使用できる菌株として、オガタエア・アングスタNCYC495（ATCC14754）、オガタエア・ポリモルファ8V（ATCC34438）、オガタエア・パラポリモルファDL-1（ATCC26012）等の菌株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション等から入手することができる。
　また、本発明においては、これらコマガタエラ属酵母やオガタエア属酵母の菌株からの誘導株も使用でき、例えばヒスチジン要求性であればコマガタエラ・パストリスGS115株（サーモフィッシャーサイエンティフィック社より入手可能）、ロイシン要求性株であれば、NCYC495由来のBY4329、8V由来のBY5242、DL-1由来のBY5243（これらはNational BioResource Projectから分譲可能）等が挙げられる。本発明においては、これらの菌株からの誘導株等も使用できる。
　一態様において、本発明は、上記に記載の細胞を培養する工程、培養液から目的タンパク質を回収する工程を含む、目的タンパク質の製造方法に関する。
　ここで、「培養液」とは、培養上清のほか、培養細胞、培養菌体、又は細胞もしくは菌体の破砕物を意味する。よって、本発明の形質転換酵母を用いて目的タンパク質を製造する方法としては、上記に記載の細胞を培養し、その菌体中に蓄積させる方法、又は培養上清中に分泌して蓄積させる方法が挙げられ、好ましくは培養上清中に分泌して蓄積させる方法が挙げられる。
　細胞の培養条件は特に限定されず、細胞に応じて適宜選択すればよい。該培養においては、細胞が資化しうる栄養源を含む培地であれば何でも使用できる。該栄養源としては、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油類、又はこれらの混合物等の炭素源、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源、更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源を適宜混合・配合した通常の培地を用いることができる。また、培養はバッチ培養や連続培養のいずれでも可能である。
　本発明の好ましい態様として、酵母にコマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母を用いた場合、上記炭素源は、グルコース、グリセロール、メタノールの1種でもよく、又は2種以上であってもよい。また、これらの炭素源は培養初期から存在していてもよいし、培養途中に添加してもよい。
　本発明のベクターを細胞に導入することによって得られた形質転換体を培養することで宿主中又は培養液中に目的タンパク質を蓄積させ、回収することができる。目的タンパク質の回収方法については、公知の精製法を適当に組み合わせて用いることができる。例えば、まず、当該形質転換酵母を適当な培地で培養し、培養液の遠心分離、あるいは、濾過処理により培養上清から菌体を除く。得られた培養上清を、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿等）、溶媒沈殿（アセトン又はエタノール等による蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、又は組み合わせて用いることにより、該培養上清から目的タンパク質を回収する。
　細胞の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、酵母の場合、pH2．5～10．0、温度範囲10℃～48℃の範囲で、好気的に10時間～10日間培養することにより行うことができる。
　回収された目的タンパク質は、そのまま使用することもできるが、その後PEG化等の薬理学的な変化をもたらす修飾、酵素やアイソトープ等の機能を付加する修飾を加えて使用することもできる。また、各種の製剤化処理を使用してもよい。
　分泌性でない目的タンパク質を菌体外に分泌生産させる場合には、該目的タンパク質遺伝子の5'末端にシグナル配列をコードする塩基配列を導入すればよい。シグナル配列をコードする塩基配列は、酵母が分泌発現できるシグナル配列をコードする塩基配列であれば特に限定されないが、サッカロマイセス・セレビシエのMating Factor α（MFα）やオガタエア・アングスタの酸性ホスファターゼ（PHO1）、コマガタエラ・パストリスの酸性ホスファターゼ（PHO1）、サッカロマイセス・セレビシエのインベルターゼ（SUC2）、サッカロマイセス・セレビシエのPLB1、牛血清アルブミン（BSA）、ヒト血清アルブミン（HSA）、及び免疫グロブリンのシグナル配列をコードする塩基配列等が挙げられる。
　本明細書において、生産性を向上させる「目的タンパク質」は、宿主の内在性タンパク質であってもよいし、異種タンパク質であってもよい。本明細書において、「内在性タンパク質」とは、遺伝子改変を行っていない宿主細胞が培養の間に産生するタンパク質をいう。これに対し、本明細書において「異種タンパク質」とは、遺伝子改変を行っていない宿主細胞が通常発現しないか、あるいは発現してもその発現量が十分でないタンパク質をいう。
　目的タンパク質を発現させるプロモーターは、選択した炭素源にて発現が起こりうるプロモーターを適切に使用すればよく、特に限定されない。
　炭素源がメタノールの場合、ポリペプチドを発現させるプロモーターは、AOX1プロモーター、AOX2プロモーター、CATプロモーター、DHASプロモーター、FDHプロモーター、FMDプロモーター、GAPプロモーター、MOXプロモーター等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。
　炭素源がグルコースやグリセロールの場合、ポリペプチドを発現させるプロモーターは、GAPプロモーター、TEFプロモーター、LEU2プロモーター、URA3プロモーター、ADEプロモーター、ADH1プロモーター、PGK1プロモーター等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。
　ここで、「プロモーター」とは、上記の所定の塩基配列の上流に位置する塩基配列領域をいい、RNAポリメラーゼのほか、転写の促進や抑制に関わる様々な転写調節因子が該領域に結合又は作用することによって鋳型である上記の所定の塩基配列を読み取って相補的なRNAを合成（転写）する。
　以下、製造例、比較例、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
＜製造例１：ベクターの調製に用いた各種遺伝子の調製＞
　以下の実施例において用いた組換えDNA技術に関する詳細な操作方法等は、次の成書に記載されている：Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、Current Protocolsin Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。
　また、以下の実施例において、酵母の形質転換に用いるプラスミドは、構築したベクターを大腸菌E.coli DH5αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製した。プラスミド保持株からのプラスミドの調製は、FastGene Plasmid Mini Kit（日本ジェネティクス社製）を用いて行った。
　ベクターの構築において利用したAOX1プロモーター（配列番号1）、AOX1ターミネーター（配列番号2）、HIS4配列（配列番号3）、GAPプロモーター（配列番号4）、ポリペプチドPpMPP1をコードする塩基配列（配列番号5）、CCA38473ターミネーター（配列番号6）はコマガタエラ・パストリスATCC76273株の染色体DNA（塩基配列はEMBL (The European Molecular Biology Laboratory) ACCESSION No. FR839628～FR839631に記載)混合物をテンプレートにしてPCRで調製した。AOX1プロモーターはプライマー1（配列番号7）及びプライマー2（配列番号8）、AOX1ターミネーターはプライマー3（配列番号9）及びプライマー4（配列番号10）、HIS4配列はプライマー5（配列番号11）及びプライマー6（配列番号12）、GAPプロモーターはプライマー7（配列番号13）及びプライマー8（配列番号14）、ポリペプチドPpMPP1をコードする塩基配列はプライマー9（配列番号15）及びプライマー10（配列番号16）、CCA38473ターミネーターはプライマー11（配列番号17）及びプライマー12（配列番号18）、を用いてPCRで調製した。
　ベクターの構築において利用した、プロモーターで制御されたZeocin(商標)耐性遺伝子（配列番号19）は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターの構築において利用した、プロモーターで制御されたG418耐性遺伝子（配列番号20）は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターの構築において利用した、Mating Factorαプレプロシグナル配列が付与された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体遺伝子（配列番号21）は公開配列情報（J Mol Biol. 1998 Jul 3;280(1):117-27.）に基づいて合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。
　PCRにはPrime STAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）等を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。染色体DNAの調製は、コマガタエラ・パストリスATCC76273株からカネカ 簡易DNA抽出キット version 2（カネカ社製）等を用いて、これに記載の条件で実施した。
＜製造例２：抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現ベクターの構築＞
　HindIII-BamHI-BglII-XbaI-EcoRIのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片（配列番号22）を全合成し、これをpUC19（タカラバイオ社製、Code No． 3219）のHindIII-EcoRIサイト間に挿入して、pUC-1を構築した。
　また、AOX1プロモーター（配列番号1）の両側にBamHI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー1（配列番号7）及び2（配列番号8）を用いたPCRにより調製し、BamHI処理後にpUC-1のBamHIサイトに挿入して、pUC-Paoxを構築した。
　次に、AOX1ターミネーター（配列番号2）の両側にXbaI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー3（配列番号9）及び4（配列番号10）を用いたPCRにより調製し、XbaI処理後にpUC-PaoxのXbaIサイトに挿入して、pUC-PaoxTaoxを構築した。
　次に、HIS4配列（配列番号3）の両側にEcoRI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー5（配列番号11）及び6（配列番号12）を用いたPCRにより調製し、EcoRI処理後にpUC-PaoxTaoxのEcoRIサイトに挿入して、pUC-PaoxTaoxHIS4を構築した。
　次に、Mating　Factorαプレプロシグナル配列が付与された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体遺伝子（配列番号21）の両側にBglII認識配列を付加した核酸断片を、プライマー13（配列番号23）及び14（配列番号24）を用いたPCRにより調製し、BglII処理後にpUC-PaoxTaoxHIS4のBglIIサイトに挿入して、pUC-PaoxscFvTaoxHIS4を構築した。このpUC-PaoxscFvTaoxHIS4は、抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体がAOX1プロモーター制御下で発現するように設計されている。
＜製造例３：ポリペプチドPpMPP1発現ベクターの構築＞
　HindIII-BamHI-SpeI-XbaI-EcoRIのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片（配列番号25）を全合成し、これをpUC19（タカラバイオ社製、Code　No．　3219）のHindIII-EcoRIサイト間に挿入して、pUC-2を構築した。
また、GAPプロモーター（配列番号4）の両側にBamHI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー7（配列番号13）及び8（配列番号14）を用いたPCRにより調製し、BamHI処理後にpUC-2のBamHIサイトに挿入して、pUC-Pgapを構築した。
　次に、プロモーターで制御されたZeocin(商標)耐性遺伝子（配列番号19）の両側にEcoRI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー15（配列番号26）及び16（配列番号27）を用いたPCRにより調製し、EcoRI処理後にpUC-PgapのEcoRIサイトに挿入して、pUC-PgapZeoを構築した。
　次に、CCA38473ターミネーター（配列番号6）の両側にXbaI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー11（配列番号17）及び12（配列番号18）を用いたPCRにより調製し、XbaI処理後にpUC-PgapZeoのXbaIサイトに挿入して、pUC-PgapT38473Zeoを構築した。
　次に、ポリペプチドPpMPP1をコードする塩基配列（配列番号5）を、プライマー9（配列番号15）及びプライマー10（配列番号16）を用いたPCRにより調製した。この各核酸断片はポリペプチドPpMPP1をコードする塩基配列の上流にオーバーラップ領域としてGAPプロモーター配列、下流にオーバーラップ領域としてCCA38473ターミネーター配列が付加されている。
　pUC-PgapT38473ZeoをSpeI処理後にGAPプロモーターのReプライマー（プライマー17（配列番号28））及びCCA38473ターミネーターのFwプライマー（プライマー18（配列番号29））を用いたPCRにより核酸断片を調製し、上記PCRにより調製されたポリペプチドPpMPP1をコードする塩基配列の核酸断片と混合し、New England Biolabs社のGibson Assembly システムを用いて繋ぎ合わせて、pUC-PgapPpMPP1T38473Zeoを構築した。このベクターは、配列番号30に示すアミノ酸配列で示されるポリペプチドPpMPP1がGAPプロモーター制御下で発現するように設計されている。
＜製造例４：配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクターの構築＞
 プロモーターで制御されたG418耐性遺伝子（配列番号20）の両側に形質転換のための相同領域を付加した遺伝子断片を、プライマー19（配列番号31）及びプライマー20（配列番号32）を用いたPCRにより調製した。
　本ベクターは、コマガタエラ・パストリスATCC76273株の染色体における、配列番号33で示されるアミノ酸配列（ACCESSION No. CCA41122）をコードする、配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子の上流に位置する前記遺伝子のプロモーターの97塩基の塩基配列と１００％の配列同一性を有する塩基配列、及び、前記遺伝子の下流に位置する前記遺伝子のターミネーターの98塩基の塩基配列と１００％の配列同一性を有する塩基配列が、相同領域として、プロモーターで制御されたG418耐性遺伝子の両側に付加されたベクターであり、宿主細胞に形質転換することで配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化されるように設計されている。
＜製造例５：AOX1遺伝子、FLD1遺伝子、DAS1遺伝子、DAS2遺伝子の不活性化用ベクターの構築＞
　プロモーターで制御されたZeocin(商標)耐性遺伝子（配列番号19）の両側に形質転換のための相同領域を付加した遺伝子断片を、プライマー21（配列番号35）及びプライマー22（配列番号36）を用いたPCRにより調製した。
　本ベクターはコマガタエラ・パストリスATCC76273株のAOX1（ACCESSION No. CCA40305）をコードする遺伝子（配列番号37）の読み枠内を相同領域として、プロモーターで制御されたZeocin(商標)耐性遺伝子の両側に付加されたベクターであり、宿主細胞に形質転換することでAOX1をコードする遺伝子が不活性化されるように設計されている。
　プロモーターで制御されたZeocin(商標)耐性遺伝子（配列番号19）の両側に形質転換のための相同領域を付加した遺伝子断片を、プライマー23（配列番号38）及びプライマー24（配列番号39）を用いたPCRにより調製した。
　本ベクターはコマガタエラ・パストリスATCC76273株のFLD1（ACCESSION No. CCA39112）をコードする遺伝子（配列番号40）の上流94塩基配列及び下流94塩基配列を相同領域として、プロモーターで制御されたZeocin(商標)耐性遺伝子の両側に付加されたベクターであり、宿主細胞に形質転換することでFLD1をコードする遺伝子が不活性化されるように設計されている。
　プロモーターで制御されたZeocin(商標)耐性遺伝子（配列番号19）の両側に形質転換のための相同領域を付加した遺伝子断片を、プライマー25（配列番号41）及びプライマー26（配列番号42）を用いたPCRにより調製した。
　本ベクターはコマガタエラ・パストリスATCC76273株のDAS1（ACCESSION No. CCA39320）をコードする遺伝子（配列番号43）の上流80塩基配列及び下流78塩基配列を相同領域として、プロモーターで制御されたZeocin(商標)耐性遺伝子の両側に付加されたベクターであり、宿主細胞に形質転換することでDAS1をコードする遺伝子が不活性化されるように設計されている。
　プロモーターで制御されたG418耐性遺伝子（配列番号20）の両側に形質転換のための相同領域を付加した遺伝子断片を、プライマー27（配列番号44）及びプライマー28（配列番号45）を用いたPCRにより調製した。
　本ベクターはコマガタエラ・パストリスATCC76273株のDAS2（ACCESSION No. CCA39318）をコードする遺伝子（配列番号46）の上流80塩基配列及び下流77塩基配列を相同領域として、プロモーターで制御されたG418耐性遺伝子の両側に付加されたベクターであり、宿主細胞に形質転換することでDAS2をコードする遺伝子が不活性化されるように設計されている。
＜比較例１：形質転換酵母の取得＞
　製造例２で構築した抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現ベクターpUC-PaoxscFvTaoxHIS4を用いて、以下のようにコマガタエラ・パストリスを形質転換した。
　コマガタエラ・パストリスATCC76273株由来ヒスチジン要求性株を3mlのYPD培地（1% yeast extract bacto（Becton Dickinson社製）、2% polypeptone（日本製薬社製）、2% glucose）に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1～1.5になるまで振盪培養後、集菌（3000×g、10分、20℃）し、250μlの1M DTT（終濃度25mM）を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。
　この懸濁液を30℃で15分インキュベート後、集菌（3000×g、10分、20℃）し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー（270mMスクロース、10mM Tris-HCl、1mM塩化マグネシウム、pH7.5）で洗浄した。洗浄液を集菌（3000×g、10分、4℃）し、25 mlのSTMバッファーで再度洗浄したのち、集菌（3000×g、10分、4℃）した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
　製造例２で構築した抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現ベクターpUC-PaoxscFvTaoxHIS4を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を5mlのアンピシリン含有2YT培地（1.6% tryptone bacto（Becton Dickinson社製）、1% yeast extract bacto（Becton Dickinson社製）、0.5% 塩化ナトリウム、0.01%アンピシリンナトリウム（和光純薬工業社製））で培養し、得られた菌体からFastGene Plasmid Mini Kit（日本ジェネティクス社製）を用いて、pUC-PaoxscFvTaoxHIS4を取得した。本プラスミドをAOX1プロモーター内のSacI認識配列を利用して、SacI処理により直鎖状にした。
　このコンピテントセル溶液60μlと直鎖状のpUC-PaoxscFvTaoxHIS4溶液1μlを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極、電極間隔2mm（ビーエム機器社製））に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌（3000×g、5分、20℃）し、1mlのYNB培地（0.67% yeast nitrogen base Without Amino Acid（Becton Dickinson社製））に懸濁後、再度集菌（3000×g、5分、20℃）した。菌体を適当量のYNB培地で再懸濁後、YNB選択寒天プレート（0.67% yeast nitrogen base Without Amino Acid（Becton Dickinson社製）、1.5%アガロース、2% glucose）に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を取得した。
＜実施例１：形質転換酵母の取得＞
　製造例４で構築した配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクターを用いて、以下のように抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を形質転換した。
　比較例１で取得した抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を3mlのYPD培地（1% yeast extract bacto（Becton Dickinson社製）、2% polypeptone（日本製薬社製）、2% glucose）に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1～1.5になるまで振盪培養後、集菌（3000×g、10分、20℃）し、250μlの1M DTT（終濃度25mM）を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。
　この懸濁液を30℃で15分インキュベート後、集菌（3000×g、10分、20℃）し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー（270mMスクロース、10mM Tris-HCl、1mM塩化マグネシウム、pH7.5）で洗浄した。洗浄液を集菌（3000×g、10分、4℃）し、25 mlのSTMバッファーで再度洗浄したのち、集菌（3000×g、10分、4℃）した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
　このコンピテントセル溶液60μlと製造例４で構築した配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクター3μlを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極、電極間隔2mm（ビーエム機器社製））に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌（3000×g、5分、20℃）し、上清950μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、YPDG418選択寒天プレート（1% yeast extract（Becton Dickinson社製）、2% polypeptone（日本製薬社製）、2% glucose、1.5%アガロース、0.05% G418二硫酸塩（ナカライテスク社製））に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を取得した。
　続いて、製造例３で構築したポリペプチドPpMPP1発現ベクターpUC-PgapPpMPP1T38473Zeoを用いて、以下のように配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を形質転換した。
　配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を3mlのYPD培地（1% yeast extract bacto（Becton Dickinson社製）、2% polypeptone（日本製薬社製）、2% glucose）に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1～1.5になるまで振盪培養後、集菌（3000×g、10分、20℃）し、250μlの1M DTT（終濃度25mM）を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。
　この懸濁液を30℃で15分インキュベート後、集菌（3000×g、10分、20℃）し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー（270mMスクロース、10mM Tris-HCl、1mM塩化マグネシウム、pH7.5）で洗浄した。洗浄液を集菌（3000×g、10分、4℃）し、25 mlのSTMバッファーで再度洗浄したのち、集菌（3000×g、10分、4℃）した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
　製造例３で構築したポリペプチドPpMPP1発現ベクターpUC-PgapPpMPP1T38473Zeoを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を5mlのアンピシリン含有2YT培地（1.6% tryptone bacto（Becton Dickinson社製）、1% yeast extract bacto（Becton Dickinson社製）、0.5% 塩化ナトリウム、0.01%アンピシリンナトリウム（和光純薬工業社製））で培養し、得られた菌体からFastGene Plasmid Mini Kit（日本ジェネティクス社製）を用いて、pUC-PgapPpMPP1T38473Zeoを取得した。本プラスミドをCCA38473ターミネーター内のNruI認識配列を利用して、NruI処理により直鎖状にした。
　このコンピテントセル溶液60μlと直鎖状のpUC-PgapPpMPP1T38473Zeo溶液1μlを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極、電極間隔2mm（ビーエム機器社製））に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌（3000×g、5分、20℃）し、上清950μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、YPDG418Zeocin（商標）選択寒天プレート（1% yeast extract（Becton Dickinson社製）、2% polypeptone（日本製薬社製）、2% glucose、1.5%アガロース、0.05% G418二硫酸塩（ナカライテスク社製）、0.01%Zeocin（商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製））に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、ポリペプチドPpMPP1を発現し且つ配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を取得した。
＜比較例2：形質転換酵母の取得＞
　製造例５で構築したAOX1遺伝子、FLD1遺伝子、DAS1遺伝子の不活性化用ベクターを用いて、以下のように抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を形質転換した。
　比較例１で取得した抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を3mlのYPD培地（1% yeast extract bacto（Becton Dickinson社製）、2% polypeptone（日本製薬社製）、2% glucose）に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1～1.5になるまで振盪培養後、集菌（3000×g、10分、20℃）し、250μlの1M DTT（終濃度25mM）を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。
　この懸濁液を30℃で15分インキュベート後、集菌（3000×g、10分、20℃）し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー（270mMスクロース、10mM Tris-HCl、1mM塩化マグネシウム、pH7.5）で洗浄した。洗浄液を集菌（3000×g、10分、4℃）し、25 mlのSTMバッファーで再度洗浄したのち、集菌（3000×g、10分、4℃）した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
　このコンピテントセル溶液60μlと製造例５で構築したAOX1遺伝子、FLD1遺伝子、DAS1遺伝子の不活性化用ベクター3μlを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極、電極間隔2mm（ビーエム機器社製））に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌（3000×g、5分、20℃）し、上清950μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、YPDZeocin（商標）選択寒天プレート（1% yeast extract（Becton Dickinson社製）、2% polypeptone（日本製薬社製）、2% glucose、1.5%アガロース、0.01%Zeocin（商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製））に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、AOX1遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母、FLD1遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母、DAS1遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を取得した。
　続いて、製造例５で構築したDAS2遺伝子の不活性化用ベクターを用いて、以下のようにDAS1遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を形質転換した。
　DAS1遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を3mlのYPD培地（1% yeast extract bacto（Becton Dickinson社製）、2% polypeptone（日本製薬社製）、2% glucose）に接種し、30℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液500μlを50mlのYPD培地に接種し、OD600が1～1.5になるまで振盪培養後、集菌（3000×g、10分、20℃）し、250μlの1M DTT（終濃度25mM）を含む10mlの50mMリン酸カリウムバッファー, pH7.5に再懸濁した。
　この懸濁液を30℃で15分インキュベート後、集菌（3000×g、10分、20℃）し、予め氷冷した50mlのSTMバッファー（270mMスクロース、10mM Tris-HCl、1mM塩化マグネシウム、pH7.5）で洗浄した。洗浄液を集菌（3000×g、10分、4℃）し、25 mlのSTMバッファーで再度洗浄したのち、集菌（3000×g、10分、4℃）した。最終的に、250μlの氷冷STMバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
　このコンピテントセル溶液60μlと製造例５で構築したDAS2遺伝子の不活性化用ベクター3μlを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極、電極間隔2mm（ビーエム機器社製））に移し入れ、7.5kV/cm、25μF、200Ωに供した後、菌体を1mlのYPD培地で懸濁し、30℃で1時間静置した。1時間静置後、集菌（3000×g、5分、20℃）し、上清950μlを廃棄した。残った溶液で再懸濁後、YPDG418 Zeocin（商標）選択寒天プレート（1% yeast extract（Becton Dickinson社製）、2% polypeptone（日本製薬社製）、2% glucose、1.5%アガロース、0.05% G418二硫酸塩（ナカライテスク社製）、0.01%Zeocin（商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製））に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、DAS1遺伝子及びDAS2遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を取得した。
＜実施例２：形質転換酵母の培養＞
　実施例１で得られた配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母、ポリペプチドPpMPP1を発現し且つ配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を2mlのBMMY培地（1% yeast extract bacto（Becton Dickinson社製）、2% polypeptone（日本製薬社製）、0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate（Becton Dickinson社製）、1% Ammonium Sulfate、0.4mg/l Biotin、100mM リン酸カリウム（pH6.0）、2% Methanol）に接種し、これを30℃、170rpm、72時間振盪培養後、遠心分離（12000rpm、5分、4℃）により培養上清を回収した。菌体濃度はOD600にて測定した。
＜比較例３：形質転換酵母の培養＞
　比較例１で得られた抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母、比較例2で得られたAOX1遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母、FLD1遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母、DAS1遺伝子及びDAS2遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母を上記実施例２と同様の方法で培養後、遠心分離（12000rpm、5分、4℃）により培養上清を回収した。菌体濃度はOD600にて測定した。
＜実施例３：ELISA法による抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体の生産量の測定＞
　実施例２で得られた培養上清への抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体生産量は、サンドイッチELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）法により以下に示す方法で行った。
　ELISA用プレート（Nuncイムノプレートマキシソープ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製））に固定化バッファー（8g/L 塩化ナトリウム、0.2g/L 塩化カリウム、1.15g/L リン酸一水素ナトリウム（無水）、0.2g/L リン酸二水素カリウム（無水）、1mM 塩化マグネシウム）にて2500倍希釈したβガラクトシダーゼ（5mg/mL ロシュ社製）を各ウェル50μlずつ添加し、終夜4℃でインキュベートした。インキュベート後、ウェル中の溶液を除去し、イムノブロック（大日本住友製薬社製）200μlでブロッキングし、室温で1時間静置した。PBSTバッファー（8g/L 塩化ナトリウム、0.2g/L 塩化カリウム、1.15g/L リン酸一水素ナトリウム（無水）、0.2g/L リン酸二水素カリウム（無水）、0.1% Tween20）で3回洗浄後、系列希釈した標準抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体と希釈した培養上清を各ウェル50μlずつ添加し、室温で1時間反応した。PBSTバッファーで3回洗浄後、PBSTバッファーにて8000倍希釈した二次抗体溶液（二次抗体：Anti-His-tag  mAb-HRP-DirecT（MBL社製））を各ウェル50μlずつ添加し、室温で1時間反応させた。PBSTバッファーで3回洗浄後、50μlのTMB-1 Component Microwell Peroxidase Substrate SureBlue（KPL社製）を添加し、室温で20分静置した。50μlのTMB Stop Solution（KPL社製）を添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（Spectra Max Paradigm；モレキュラーデバイス社製）で450nmの吸光度を測定した。培養上清中の抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体の定量は、標準抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体の検量線を用いて行った。この方法により得られた抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体生産量と各々の菌体濃度（OD600）を表1に示した。
＜比較例４：ELISA法による抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体の生産量の測定＞
　比較例３で得られた培養上清への抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体生産量について、実施例３と同様の方法で測定した。この方法により得られた抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体生産量と各々の菌体濃度（OD600）を表1に示した。
＜結果＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表1に示されるように、実施例１で得られた配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母（2）は、明らかに、比較例１で得られた抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母（1）よりメタノール資化が低下し、且つ高い抗体生産量を示した。また、実施例１で得られた配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母（2）は、メタノール資化の低下を意図して構築した比較例2で得られたAOX1遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母（3）、FLD1遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母（4）、DAS1遺伝子及びDAS2遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母（5）と比較してメタノール資化が同程度に低いのに対し、明らかに高い抗体生産量を示している。これは配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化により、メタノールの炭素源が効率的に目的タンパク質に使われていることを示している。
　また、実施例１で得られたポリペプチドPpMPP1を発現し且つ配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母（6）は、比較例１で得られた抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母（1）よりメタノール資化が低下し、且つ高い抗体生産量を示した。加えて、実施例１で得られたポリペプチドPpMPP1を発現し且つ配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母（6）は、実施例１で得られた配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化された抗βガラクトシダーゼ一本鎖抗体発現酵母（2）と比較して、更に高い抗体生産量を示した。これは、ポリペプチドPpMPP1の発現と配列番号34に示す塩基配列からなる遺伝子不活性化が、メタノール資化低下と抗体生産量の両方においてその効果を更に高めることを示唆している。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (12)

  1. 以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子が不活性化された宿主細胞：
    （ａ）配列番号34に示す塩基配列を含む遺伝子、
    （ｂ）配列番号34に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列を含む遺伝子、
    （ｃ）配列番号34に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む遺伝子、
    （ｄ）配列番号33に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子。
  2. 前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列を含有するベクターで形質転換して得られる請求項１に記載の宿主細胞。
  3. 前記ベクターが、目的タンパク質をコードする塩基配列を含有する、請求項２に記載の宿主細胞。
  4. さらに、目的タンパク質をコードする塩基配列を含有するベクターを含む、請求項２に記載の宿主細胞。
  5. 親細胞に比してメタノール資化が低下した請求項１～４のいずれかに記載の宿主細胞。
  6. 以下の（ｅ）～（ｈ）のいずれかの塩基配列を含むベクターで形質転換することにより得られる請求項１～５のいずれか１項に記載の宿主細胞：
    （ｅ）配列番号30に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
    （ｆ）前記（ｅ）に示すアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列、
    （ｇ）前記（ｅ）に示すアミノ酸配列と85％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、又は
    （ｈ）前記（ｅ）に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列。
  7. 酵母、細菌、真菌、昆虫細胞、動物細胞、又は植物細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
  8. 酵母が、メタノール資化性酵母、分裂酵母、又は出芽酵母である、請求項７に記載の宿主細胞。
  9. メタノール資化性酵母がコマガタエラ属酵母又はオガタエア属酵母である、請求項８に記載の宿主細胞。
  10. 請求項３～９のいずれかに記載の細胞を培養する工程、及び培養液から目的タンパク質を回収する工程を含む、目的タンパク質の製造方法。
  11. 目的タンパク質が異種タンパク質である、請求項１０に記載の方法。
  12. 培養工程において、グルコース、グリセロール、及びメタノールからなる群から選択される一以上の炭素源を含む培養液を用いる、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
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