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WO2018100866A1 - 植物による有用タンパク質の生産方法 - Google Patents

植物による有用タンパク質の生産方法 Download PDF

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WO2018100866A1
WO2018100866A1 PCT/JP2017/035383 JP2017035383W WO2018100866A1 WO 2018100866 A1 WO2018100866 A1 WO 2018100866A1 JP 2017035383 W JP2017035383 W JP 2017035383W WO 2018100866 A1 WO2018100866 A1 WO 2018100866A1
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WO
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plant
culture
protein
useful
medium
Prior art date
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Application number
PCT/JP2017/035383
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English (en)
French (fr)
Inventor
一朗 小原
博志 大川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kirin Co Ltd
Original Assignee
Kirin Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to US16/464,765 priority patent/US20190352659A1/en
Priority to JP2018553684A priority patent/JP7165056B2/ja
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
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    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
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    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a substance by a plant. That is, the present invention relates to a method for stably and efficiently producing useful proteins by continuously culturing plants in a liquid immersion state.
  • useful substances such as useful proteins have been separated and purified from biological materials such as microorganisms, mass culture of microorganisms using large fermenters, mass culture of animal cells, and gene recombination technologies. Production is done.
  • biological materials such as microorganisms, mass culture of microorganisms using large fermenters, mass culture of animal cells, and gene recombination technologies. Production is done.
  • these technologies still require a large amount of capital investment and still have problems such as high running costs and risk of contamination with animal-derived pathogens, E. coli-derived toxins, and the like.
  • JP 2008-525454 A proposes a system in which plant cells genetically modified to produce antibodies are grown by suspension culture to produce antibodies.
  • plants produce and accumulate useful substances specifically in differentiated tissues and organs.
  • the inventors of the present invention have recently discovered that by cultivating a plant body in a liquid immersion state, the useful protein production amount per unit container space can be efficiently increased. Furthermore, at this time, it has been found that the ratio of the target protein amount to the total protein amount in the grown plant body is unexpectedly increased by performing a series of processes under liquid immersion culture conditions. As described above, the production of useful proteins has been achieved more efficiently by continuously culturing a series of processes under liquid immersion culture conditions. This eliminates the need for replanting as in greenhouse cultivation and the transfer of pots for seedlings, simplifying the entire work and improving work efficiency. Furthermore, time production efficiency could be improved by increasing the growth rate of the plant body by liquid immersion culture.
  • an object of the present invention is to provide a method for stably and efficiently producing a target protein, which is a useful substance, using a plant under liquid culture conditions.
  • a method for producing a useful protein by a plant comprising culturing at least a part of a plant capable of producing useful protein in a container while being immersed in a liquid medium, and growing the plant.
  • ⁇ 2> The method according to ⁇ 1>, wherein the plant is a plant modified so as to be able to produce useful proteins.
  • ⁇ 3> The method according to ⁇ 1> or ⁇ 2> above, wherein the plant body is a stable genetically modified plant.
  • ⁇ 4> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the useful protein to be produced is a medical protein or an industrial protein.
  • ⁇ 5> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4> above, wherein the protein is expressed using a constitutive expression promoter.
  • ⁇ 6> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, further comprising a step of extracting or separating useful proteins from the grown plant body.
  • ⁇ 8> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the plant body is cultured and grown in a sterilized container.
  • ⁇ 9> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8> above, wherein the container is a bag-type culture tank.
  • ⁇ 10> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9> above, wherein the plant is mass-cultured using a plurality of containers to mass-produce useful proteins.
  • a target useful protein can be efficiently produced using a plant. That is, according to the present invention, it is possible to increase the production efficiency of the target protein by combining the viewpoints of required resources, labor, time, and the like as compared with greenhouse cultivation, solid medium culture, or the like.
  • the useful protein production amount per unit container space can be increased by culturing the plant body in the liquid immersion state.
  • the production cost can be reduced.
  • the ratio of the target protein content per total protein amount in the plant can be greatly increased by carrying out a series of processes under liquid immersion culture conditions. As a result, according to the present invention, reduction in extraction cost can be expected, and useful protein can be produced more efficiently. Therefore, it can be said that the method according to the present invention is a useful protein production method in actual production of the target protein.
  • the produced useful protein can often be separated and purified relatively easily.
  • a plant part that has been used for food it is possible to directly ingest the plant itself or a part thereof in which the useful protein is produced and accumulated without separation and purification. According to the present invention, these points can be easily realized.
  • Example 1 The experimental result performed in Example 1 is shown. Specifically, the comparison of the growth amount of the plant body by the difference in a culture method is shown.
  • the experimental result performed in Example 2 is shown. Specifically, the comparison of the growth amount of the plant body (potato) by the difference in liquid medium amount is shown.
  • the experimental result performed in Example 2 is shown. Specifically, the GUS production amount per bag type culture tank is shown.
  • the experimental result performed in Example 3 is shown. Specifically, the GUS activity (leaf) of the gas phase part and the liquid phase part of the bag-type culture tank is shown.
  • the experimental result performed in Example 3 is shown. Specifically, GUS activity (stem) of the gas phase part and the liquid phase part of the bag-type culture tank is shown.
  • the experimental result performed in Example 4 is shown.
  • a gene encoding a useful protein is introduced as a target gene, the useful protein is obtained by its expression, and the expression of a specific gene is controlled by the expression of the target gene. Increasing the production of useful proteins is included.
  • the plant used in the present invention is a plant capable of producing useful proteins. Therefore, plants that can be used in the present invention have been introduced with plants that have been genetically modified by genetic recombination techniques or the like so that useful proteins can be produced, and virus vectors that have been modified to produce useful proteins. Plants that have been modified to produce useful proteins, such as plants, natural plants that have the ability to produce useful proteins, and have been bred to retain such properties It may be a variety.
  • the plant is a plant modified so as to be able to produce useful proteins, and in a particularly preferred embodiment, it is a stable genetically modified plant.
  • the plant species that can be used in the present invention are not particularly limited as long as it can produce useful proteins.
  • the plant species is a plant that can be transformed by the Agrobacterium method, the Partlegan method, or the like, and a plant that stably expresses the target gene.
  • Examples include dicotyledonous plants and monocotyledonous plants.
  • examples of dicotyledonous plants include solanaceous plants (potatoes, tobacco, benthamiana tobacco, tomatoes, etc.), cruciferous plants (arugula, komatsuna, mizuna, mustard, shiroizuna, etc.), asteraceae plants.
  • the plant used for transformation is not necessarily a wild type, and a genetically modified plant can also be used.
  • a genetically modified plant can also be used.
  • a recombinant plant expressing a human glycosyltransferase can also be used for transformation.
  • the plant species used is any selected from the group consisting of potato, lettuce, tobacco, tomato, rice, barley, wheat, soybean, and corn, more preferably potato. , Lettuce, tobacco, and rice.
  • plant means an organ, part, or part of a plant, such as leaves, stems, roots (including adventitious roots), buds (including adventitious buds), petals, cotyledons, hypocotyls. , Cocoons, embryos (including somatic embryos), seeds, berries, rhizomes, tuberous roots, tubers, bulbs and the like, and parts thereof.
  • the “plant” is used in a sense that does not include a modified site (for example, a hairy root in hairy root culture) that branches and extends even when separated from the plant. .
  • the “plant” can typically be a plant that excludes hairy roots (or excludes only hairy roots).
  • plant means a dedifferentiated cell, cell mass (callus), differentiated plant organ, tissue, part and / or site.
  • At least a part of the plant body is cultured while being immersed in a liquid medium.
  • the “liquid medium” is a liquid that contains nutrients such as a carbon source and a nitrogen source that are essential for the growth of the plant, and has an osmotic pressure and a pH adjusted appropriately. It can be a liquid basal medium known in tissue culture technology or a modified medium thereof, or a medium in which some components are omitted. Examples of such known media include White's media (described in Plant Cell Engineering Introduction (Academic Publishing Center) p20-p36), Heller's media (Heller R, Bot. Biol. Veg.
  • SH medium Schoenk and Hildebrandt medium
  • MS medium Murashige and Skoog medium
  • LS medium Linsmaier and Skoog medium
  • B5 medium introduction to plant cell engineering (conference publication center) p20-p36
  • MB medium and WP medium (woody plant: wood Basic medium).
  • the amount of the liquid medium used may be an amount that can maintain the state in which at least a part of the plant body is immersed throughout the culture period, and can be adjusted as appropriate according to the size of the container, as described in the following examples. Furthermore, since the state immersed in the liquid is more advantageous for the production of useful proteins, the larger one is preferable. For example, it is preferable to use the liquid medium in such an amount that 50% or more, more preferably 75% or more of the whole plant is immersed throughout the culture period.
  • the plant body to be used is a plant body genetically modified so that useful proteins can be produced
  • the plant body is preferably obtained by introducing a target gene.
  • a target gene is introduced into a plant as an expressible nucleic acid construct containing the target gene.
  • the target gene means a gene to be introduced into a plant or a part thereof.
  • the target gene is not particularly limited as long as it can change the genetic traits of the plant as a result of being introduced into the plant, and may be a gene derived from an organism other than the plant to be introduced, It may be an artificially produced gene.
  • the artificially prepared gene may be, for example, a chimeric gene obtained by connecting two or more types of genes, or a mutant gene obtained by mutating a gene possessed by any organism.
  • a mutated gene for example, a part of the base sequence of DNA constituting the gene may be deleted or may be replaced. Moreover, what inserted the partial base sequence in the middle of this base sequence may be used.
  • the target gene is also preferably incorporated into the vector together with a marker gene and optionally a reporter gene.
  • the marker gene include drug resistance genes such as kanamycin resistance gene (nptII), hygromycin resistance gene (hptI), and bleomycin resistance gene.
  • the reporter gene for confirming the expression position in the plant include luciferase gene, GUS ( ⁇ -glucuronidase) gene, GFP (green fluorescent protein), RFP (red fluorescent protein) and the like. Therefore, the expressible nucleic acid construct of the present invention can contain a target gene together with a promoter, a marker gene, a reporter gene, and the like.
  • Examples of methods for introducing an expressible nucleic acid construct containing a target gene into plant cells include the Agrobacterium method, the particle gun method, the whisker method, and the floral dip method.
  • Agrobacterium method plants are inoculated with Agrobacterium containing an expressible nucleic acid construct containing a target gene.
  • the preparation method of Agrobacterium used for inoculation is as follows.
  • Agrobacterium containing an expressible nucleic acid construct containing a target gene can be produced using any conventionally known technique.
  • a target gene recombination intermediate vector in which a target gene is incorporated in a plasmid capable of homologous recombination with the T-DNA region of Ti plasmid of Agrobacterium is prepared, and the target gene recombination intermediate vector is introduced into Agrobacterium.
  • a target gene binary vector in which a target gene or the like is incorporated into a binary vector widely used in the Agrobacterium method may be introduced into Agrobacterium.
  • binary vectors include pBI vectors (for example, pRiceFOX), pPZP vectors (Plant Molecular Biology 25 (6): 989-94. (1994)), pCAMBIA vectors (vector backbone: pPZP vector), pSMA system A vector (Plant ⁇ ⁇ Cell Reports 19: 448-453. (2000)) can be mentioned, but is not limited thereto.
  • pBI vectors for example, pRiceFOX
  • pPZP vectors Plant Molecular Biology 25 (6): 989-94. (1994)
  • pCAMBIA vectors vector backbone: pPZP vector
  • pSMA system A vector Plant ⁇ ⁇ Cell Reports 19: 448-453. (2000)
  • examples of the plant modified so as to be able to produce useful proteins include a stable genetically modified plant, a plant into which a viral vector is introduced, and the like.
  • it is a genetically modified plant, that is, a stable genetically modified plant.
  • the stable genetically modified plant means a stable transformant, and the plant obtained by the gene introduction method of the genetically modified plant described above is subcultured to a certain algebra, A plant in which the introduced gene is stably retained throughout the plant body by repeating the selection using the marker or the like as an index.
  • the target gene in the present invention is a gene from which a protein as a useful substance can be obtained by its expression, and examples of such useful proteins include medical proteins and industrial proteins.
  • VLP virus-like particles
  • a VLP component protein may be a single protein or may include one or more proteins.
  • the virus include influenza virus, human immunodeficiency virus (HIV), human hepatitis C virus (HCV), human hepatitis B virus (HBV) and the like.
  • HCV human immunodeficiency virus
  • HCV human hepatitis C virus
  • HBV human hepatitis B virus
  • HA hemagglutinin
  • Industrial proteins are proteins used in food, feed, cosmetics, fibers, detergents, chemicals, etc., and examples include peptides, enzymes, and functional proteins. Specific examples include protease, lipase, cellulase, amylase, albumin, peptidase, luciferase, lactamase, collagen, gelatin, lactoferrin, transferrin, jellyfish green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS) and the like.
  • protease lipase, cellulase, amylase, albumin, peptidase, luciferase, lactamase, collagen, gelatin, lactoferrin, transferrin, jellyfish green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS) and the like.
  • GFP jellyfish green fluorescent protein
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • At least a part of a plant body immersed in a liquid medium is cultured while being immersed, and is grown as a plant body. That is, in the present invention, when cultivating the immersed plant body, the contact with the medium is not repeated intermittently, and the plant is continuously immersed in the medium.
  • a dark place or a bright place can be selected as appropriate. Although it does not restrict
  • the light intensity can be evaluated by measuring a photosynthetic effective photon flux density (PPFD) or the like.
  • PPFD is represented by the unit time of light in the visible region 400 to 700 nm effective for photosynthesis and the number of photons per unit area, and the unit is ⁇ mol ⁇ m ⁇ 2 ⁇ s ⁇ 1 .
  • PPFD is usually carried out at 2000 ⁇ mol ⁇ m ⁇ 2 ⁇ s ⁇ 1 or less, preferably at 1500 ⁇ mol ⁇ m ⁇ 2 ⁇ s ⁇ 1 or less, more preferably at 1000 ⁇ mol ⁇ m ⁇ 2 ⁇ s ⁇ 1 or less.
  • PPFD can be measured using an optical quantum meter or the like.
  • the growth time of the plant is usually 30 to 90 days, but varies depending on the plant species, the amount of the plant to be introduced, the amount of liquid medium, other environmental conditions, etc. It is possible to adjust as appropriate in consideration of the above.
  • the present invention can further include a step of extracting or separating the target useful protein from the obtained plant body from the grown plant body or liquid medium. That is, it is preferable to obtain a fraction containing the target protein from the grown plant body or liquid medium, and to separate and purify the target protein by an appropriate method.
  • the nucleic acid construct containing the target gene encoding the target protein may include, for example, a tag sequence for purification and a signal sequence for secretion outside the plant cell.
  • Extracts used for protein extraction are known buffer solutions such as Glycine buffer, Citrate buffer, Acetate buffer, Succinate buffer, Malate buffer, MES buffer, PIPES buffer, MOPS buffer, phosphorus Acid buffer solution, TES buffer solution, Hepes buffer solution, Tricine buffer solution, Tris buffer solution, Bicine buffer solution, Glycylyglycine buffer solution, TAPS buffer solution, borate buffer solution and the like can be used.
  • buffer solutions such as Glycine buffer, Citrate buffer, Acetate buffer, Succinate buffer, Malate buffer, MES buffer, PIPES buffer, MOPS buffer, phosphorus Acid buffer solution, TES buffer solution, Hepes buffer solution, Tricine buffer solution, Tris buffer solution, Bicine buffer solution, Glycylyglycine buffer solution, TAPS buffer solution, borate buffer solution and the like can be used.
  • protease inhibitors such as benzamide, PMSF, AEBSF, antipain, chymostatin, leupeptin, pepstatin A, phs
  • purification can be performed by a known method.
  • Examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic interaction chromatography, immobilized metal affinity chromatography, reverse phase chromatography, and hydroxyapatite chromatography. May be.
  • the obtained plant body can be used after being processed into a dry powder.
  • the method of the present invention is preferably a container for liquid immersion culture (or a culture tank).
  • liquid immersion culture containers are materials that can be sterilized by steam, gamma rays, etc., such as polystyrene, polycarbonate, polyethylene terephthalate, etc., and various types of culture tanks such as bag-type and box-type can be used. However, it is not limited to these.
  • a large culture tank exceeding 100 to several hundreds of liters may be used, but instead, a small culture tank of less than 20 L is used and necessary. Depending on the situation, it is preferable to prepare and implement many of them.
  • a bag-type culture tank (culture bag) configured to be able to stand on its own by being expanded from a folded state is preferable.
  • a culture tank include a bag-type culture tank as described below. That is, the method of the present invention is preferably performed in such a bag-type culture tank.
  • a single lower port 3 and two upper ports 4 are attached to the side surface of the culture bag 1. These ports 3 and 4 are for introducing gas into the culture bag 1 or exhausting gas from the culture bag 1.
  • the ports 3 and 4 are provided by bonding a molded product made of polypropylene resin to the culture bag 1.
  • the ports 3 and 4 are formed in a shape that can connect tubes, for example.
  • the region from the upper end of the upper port 4 to the upper end of the culture bag 1 functions as a sealing portion for sealing the culture bag 1 after the culture medium or plant material is accommodated in the culture bag 1.
  • FIG. 13 shows an example of the use of the culture bag 1 in the plant production process, which is an example of mass production equipment.
  • FIG. 12 shows an example of a single culture bag 1 in its use state.
  • a storage shelf 11 is installed in a predetermined culture chamber 10.
  • the culture room 10 is classified as a culture space capable of managing various physical parameters constituting a plant culture environment such as temperature, humidity, and lighting.
  • each culture bag 1 contains a culture medium 12 and plant material 13 sterilized by filter filtration or the like, and the opening at the upper end of each culture bag 1 has a sealing method such as heat sealing. Used aseptically sealed. A gas phase portion 14 is secured above the culture medium 12. A liquid medium having an appropriate composition is appropriately selected and used for the medium 12 according to the type of the plant material 13 and the production process thereof. An aeration tube 15 and a filter 16 are connected to the lower port 3 of the culture bag 1, an aeration tube 17 and a filter 18 are connected to one upper port 4, and a filter 19 is connected to the other upper port 4. Connected.
  • a predetermined gas for example, air or carbon dioxide
  • the gas in the culture bag 1 is exhausted from the filter 19.
  • each of the upper ports 4 may be used for exhaust.
  • it is desirable that the position of the lower port 3 and the amount of the medium from the bottom surface of the culture bag 1 are adjusted so that a predetermined gas is vented from the lower port 3 into the liquid medium.
  • the gas aeration amount may be appropriately selected depending on the kind of plant and the growth method, but is preferably 50 to 100 mL / min.
  • the tubes 15 and 17 are fixed to an appropriate position of the culture bag 1 by using a clip 20 or the like in order to prevent them from being entangled.
  • the bag-type culture tank and the equipment using the same are examples of a culture tank or a culture chamber that is an environment for carrying out the method of the present invention.
  • the method according to the present invention can be a method for mass-producing a useful protein by mass-cultivating a plant using a plurality of containers.
  • Example 1 Comparison of plant growth amount and useful protein production amount in solid medium and liquid medium In order to compare growth rate by plant culture method, potato plant in solid culture method and liquid culture method in plant box The body growth was compared.
  • Plant material and its transformation As a plant, a tissue culture seedling of a variety “Sassy” of potato ( Solanum tuberosum L.) was used.
  • the Agrobacterium method was adopted as a transformation method.
  • the Agrobacterium method uses Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (obtained from Takara Bio Inc., product code 9115) as an Agrobacterium strain, and a ⁇ -glucuronidase gene (GUS gene) downstream of the cauliflower mosaic virus 35S promoter as a plant transformation vector. ) And having a kanamycin resistance gene as a selection marker gene are introduced by electroporation (for example, Pulse condition of Gene Pulser II manufactured by BIO-RAD, 25 ⁇ F, 200 ⁇ , 2.25 kV) Used.
  • electroporation for example, Pulse condition of Gene Pulser II manufactured by BIO-RAD, 25 ⁇ F, 200 ⁇ , 2.25 kV
  • the stretched shoots were placed on MS medium containing 250 ppm carbenicin and 100 ppm kanamycin and no plant growth regulator. Individuals containing the kanamycin resistance gene as an exogenous gene from the plant body in which the rooted shoot was grown were resistant to kanamycin.
  • PCR conditions: 95 ° C. for 5 minutes, (95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. 1 Min) was performed 30 times at 72 ° C. for 10 minutes, and the redifferentiated plant body was confirmed to be a transformed plant body.
  • TAAAGCACGAGGAAGCGGT SEQ ID NO: 1
  • GCACAACAGCACAATCGGGCT SEQ ID NO: 2 were used as primers that specifically amplify the kanamycin resistance gene sequence.
  • the in vitro culture conditions for potato are as follows.
  • the culture container used was a plant box (obtained from Sansho Co., Ltd.).
  • the obtained transformed plant was subcultured using a top bud in a solid medium.
  • the solid medium used was MS medium (3% sucrose added, pH 5.8) with 0.8% agar added.
  • MS medium 3% sucrose, pH 5.8
  • modified MS medium modified with 3 times potassium dihydrogen phosphate and 4 times calcium chloride
  • ⁇ -glucuronidase (GUS) activity was measured as follows as an index indicating the production amount of ⁇ -glucuronidase which is a useful protein.
  • a sample with a fresh weight of about 30 mg and 1 ml of extraction buffer were placed in a 2 ml tube and crushed at 4 degrees with a mixer mill MM300 (manufactured by Retsch).
  • the composition of the extraction buffer was 25 mM phosphate buffer (pH 7.0), 10 mM EDTA, 10 mM DTT, 0.1% Triton X-100. After crushing, the tube was centrifuged (15,000 rpm, 10 minutes, 4 degrees) to obtain a supernatant as a protein extract.
  • the measurement of GUS activity was performed by adding 2 ⁇ l of crude enzyme solution and 50 ⁇ l of 5 mM 4-methylumbelliferyl- ⁇ -D-glucuronide as a reaction solution to 150 ⁇ l of an extraction buffer and measuring the generated fluorescence.
  • the solid culture method was 0.8 g
  • the liquid culture method was 3.8 g
  • the liquid culture method was an increase of 4.8 times. From this data, it was shown that the liquid culture method is more suitable for plant growth than the individual culture method (FIG. 1).
  • Example 2 Comparison of the amount of plant growth and the amount of useful protein produced by the amount of liquid medium Next, the amount of growth by different amounts of liquid medium was compared.
  • the plant material used, the production amount verification method of useful proteins, and the liquid medium composition were the same as in Example 1.
  • Plant culture method In a bag-type culture tank (8 L capacity), about 2 g of plant body cultured in a plant box for about 2 months using a solid medium is placed in a 1 L liquid medium (1 L section) and a 4 L liquid medium. The growth of transgenic potato expressing GUS was compared after culturing for 40 days.
  • the GUS production amount per bag-type culture tank was 269521 ⁇ mol / min in the 1L section and 1248768 ⁇ mol / min in the 4L section, and the production amount was 5.0 times (FIG. 3).
  • a culture method in which a plant is always immersed in a liquid has generally been avoided as a method for growing plant seedlings because vitrification of the tissue occurs and habituation after growth is difficult. It was. However, unlike the growth of plant seedlings, the production of useful proteins does not require robustness in consideration of the acclimation process, so liquid immersion culture of plants is possible and the yield per unit culture volume can be increased. It was shown that.
  • a recombinant potato plant expressing the same GUS as in Examples 1 and 2 was subjected to liquid immersion culture for 40 days using a bag-type culture tank, and a part (liquid phase part) that was always immersed in a liquid medium and a liquid surface
  • the GUS activity per total protein in the leaves and stems of the upper grown part (gas phase part) was compared.
  • the conditions were the same as in Examples 1 and 2.
  • the results were as follows.
  • the liquid phase part always immersed in the liquid medium had higher GUS activity per total protein than the gas phase part. That is, in the leaves, the liquid phase part was 700.8 ⁇ mol / min / mg protein compared to 315.8 ⁇ mol / min / mg protein in the gas phase part, which was 2.2 times higher in the liquid phase part (FIG. 4). ).
  • the gas phase part was 1075.1 ⁇ mol / min / mg protein
  • the liquid phase part was 1075.1 ⁇ mol / min / mg protein
  • the liquid phase part was 1.7 times higher (FIG. 5).
  • Example 4 Comparison of useful protein production in liquid immersion culture and soil cultivation Cultivation was performed on the same recombinant plant as the GUS activity value in the leaves during liquid immersion culture confirmed in Example 3 above. The leaves were compared with the case.
  • the soil cultivation conditions in the potato greenhouse were as follows. The top buds of the obtained transformed plants are subcultured in a solid medium, and in vitro seedlings after 14 weeks are acclimated to horticultural soil (Compal luxury horticultural soil, Sumirin Agricultural Industrial Co., Ltd.) for 4 weeks in a greenhouse. I grew up.
  • Plant material and its transformation As the plant, tissue culture seedlings of the cultivar “Green Wave” of leaf lettuce ( Lactuca sativa ) were used.
  • the Agrobacterium method was adopted as a transformation method.
  • the Agrobacterium method uses Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (obtained from Takara Bio Inc., product code 9115) as an Agrobacterium strain, and a ⁇ -glucuronidase gene (GUS gene) downstream of the cauliflower mosaic virus 35S promoter as a plant transformation vector. ), Or a transferrin gene incorporated and having a hygromycin resistance gene as a selection marker gene, electroporation (for example, Gene Pulser II, Pulse Pulse II, 25 ⁇ F, 200 ⁇ , 2 ⁇ ) .25 kV).
  • Green leaves obtained from leaf lettuce cultivar “Green Wave” were cut into about 5 mm ⁇ 5 mm with a scalpel, and used as a material for Agrobacterium infection. This was immersed in the above Agrobacterium solution and placed on a sterilized filter paper to remove excess Agrobacterium. It was placed on a MS medium in a petri dish (containing 1 ppm of BA, 0.1 ppm of NAA, 100 ⁇ M acetosyringone, and 0.3% gellite), and culturing was performed for 3 days at 25 ° C. under dark conditions.
  • the stretched shoots were placed on MS medium containing 250 ppm carbenicin and 25 ppm hygromycin and no plant growth regulator.
  • Individuals containing a hygromycin resistance gene from rooted shoots (plants) were subjected to PCR (conditions: 95 ° C. for 3 minutes, (95 ° C. for 20 seconds, 62 ° C. for 15 seconds, 72 ° C. for 30 seconds) 35 times, 72 ° C. for 5 minutes), and the redifferentiated plant body was confirmed to be a transformed plant body.
  • CGGAAGTGCTTGACATTG SEQ ID NO: 3
  • AGAAGAAGAGTGTGGCGACC SEQ ID NO: 4
  • GUS Useful protein production verification method
  • a sample with a fresh weight of about 100 mg and 300 ⁇ L of extraction buffer were added to a 3 ml tube and crushed with a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.).
  • the composition of the extraction buffer was 20 mM Tris-HCL, 1% Triton ⁇ -100. After crushing, the tube was centrifuged (15,000 rpm, 4 ° C., 10 minutes), and the supernatant was obtained as a protein extract.
  • the protein concentration of the protein extract was quantified with a calibration curve using bovine serum albumin using TaKaRa Bradford Protein Assay Kit (TakaRa).
  • the measurement of GUS activity was performed in the same manner as in Example 1. Specifically, 2 ⁇ l of the crude enzyme solution and 50 ⁇ l of 5 mM 4-methylumbelliferyl- ⁇ -D-glucuronide as a substrate were added to 150 ⁇ l of the extraction buffer as a reaction solution, and the generated fluorescence was measured.
  • transferrin The production amount of transferrin, a useful protein, was measured as follows.
  • extraction buffer As a sample, 300 ⁇ L of extraction buffer was added to a 3 ml tube for about 100 mg of fresh weight, and crushed with a multi-bead shocker (Yasui Kikai Co., Ltd.). The composition of the extraction buffer was 20 mM Tris-HCL, 1% Triton ⁇ -100. After crushing, the tube was centrifuged (15,000 rpm, 4 ° C., 10 minutes), and the supernatant was obtained as a protein extract.
  • the protein concentration of the protein extract was quantified with a calibration curve using bovine serum albumin using TaKaRa Bradford Protein Assay Kit (TakaRa).
  • the transferrin content in the extract was measured using a commercially available ELISA (Human Transrin ELISA Kit, Bethyl Laboratories Inc., E88-128). The extract was used after diluting 1,000 times with Buffer in the kit.
  • the solid culture method was 0.6 g
  • the liquid culture method was 12.9 g
  • the liquid culture method was an increase of 21.5 times. From this data, it was shown that the liquid culture method is more suitable for plant growth than the individual culture method (FIG. 7).
  • the GUS activity per total protein increased 2.8-fold with 248.7 ⁇ mol / min / mg protein in the leaves of liquid immersion culture compared to 90.0 ⁇ mol / min / mg protein in the leaves of solid culture (Fig. 8).
  • the solid culture method is 0.4 mmol / min
  • the liquid immersion culture method is 13.7 mmol / min
  • the liquid immersion culture method is 34.1 times as much. (Fig. 9).
  • the transferrin content per total protein increased 1.7 times with 2.5 ⁇ g / mg protein in the liquid immersion culture, compared with 2.5 ⁇ g / mg protein in the solid culture leaf (FIG. 10). ).
  • the solid culture method is 16.6 ⁇ g
  • the liquid immersion culture method is 315.1 ⁇ g
  • the liquid immersion culture method is a 19.0-fold increase. Amount (FIG. 11).
  • a culture method in which a plant is always immersed in a liquid has generally been avoided as a method for growing plant seedlings because vitrification of the tissue occurs and habituation after growth is difficult. It was. However, unlike the growth of plant seedlings, the production of useful proteins does not require robustness in consideration of the acclimation process, so liquid immersion culture of plants is possible and the yield per unit culture volume can be increased. It was shown that.

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Abstract

本発明は、容器内において、有用タンパク質の生産が可能な植物体の少なくとも一部を、液体培地に浸漬させたまま培養して、植物体を増殖させることを含む、植物による有用物質の生産方法に関する。本発明によれば、植物を用いて、有用タンパク質を、安定的かつ効率的に生産することができる。

Description

植物による有用タンパク質の生産方法 関連出願の参照
　本願は、先行する日本国特許出願である特願２０１６－２３３３１９号（出願日：２０１６年１１月３０日）に基づくものであって、その優先権の利益を主張するものであり、その開示内容全体は参照することによりここに組み込まれる。
　本発明は、植物による物質の生産方法に関する。すなわち、本発明は、植物を液体浸漬状態で継続的に培養することにより、安定的かつ効率的に有用タンパク質を生産する方法に関する。
　植物バイオテクノロジーの進展に伴い、植物の一次代謝および二次代謝の機能を利用した各種の有用物質の生産およびその検討が盛んに行われている。
　従来、有用タンパク質などの有用物質は、微生物等の生物材料からの分離精製、大型発酵槽を使用した微生物の大量培養や、動物細胞大量培養などの技術、および遺伝子組換え技術などを利用して、生産が行われている。ところがこれらの技術には、多額の設備投資が必要である他、高いランニングコストや動物由来病原体や大腸菌由来毒素等の混入リスクがあるなど、依然として課題が残るものであった。
　植物を用いた生産によれば、動物由来病原体や大腸菌由来毒素等の混入リスクが無く、従来からの食経験から安全が保証されている場合も多い。さらに、従来から食用に用いられてきた植物を使用すれば、生産された有用タンパク質を分離精製することなく、有用タンパク質が蓄積された植物自体または果実等その部分を直接、摂取させることも可能である。このため、植物を物質生産に活用することへの期待が高まっている。
　植物体による物質生産法としては、圃場や温室での栽培や室内での固体培地培養が一般的に知られている（例えば、国際公開公報ＷＯ２０１５／１５６３４０号パンフレット（特許文献１））。圃場や温室での栽培のためには大量の種子や苗を準備する必要があり、生育ステージによって苗のポットを移動させたり、植え替えたりといった作業が必要となる。また植物体が遺伝子組換え体であったり、アグロバクテリウムによる一過性発現を用いたりする場合には、隔離圃場や閉鎖系温室等の環境への拡散防止策がとられた設備や手間が必要となる。一方、室内での固体培地培養では一般的に人手で継代増殖作業を行う必要があるため、大量の有用物質生産のためには、植物体の増殖のために多額の人件費がかかるといった課題がある。
　また、植物細胞培養を利用した有用物質の生産技術も、従来より検討されている。
　例えば、特表２００８－５２５４５４号公報（特許文献２）には、抗体を製造するように遺伝子改変された植物細胞を、懸濁培養により増殖させ、抗体を生産するシステムが提案されている。しかしながら、植物では分化した組織や器官で特異的に有用物質の生産及び蓄積を行うことが知られている。二次代謝産物でいえば、例えばオウレンのベルべリンは根茎に、ムラサキのシコニンは根に特異的に蓄積されるし、タンパク質の例では、種子に貯蔵タンパク質として蓄積されること等が知られている。従って、脱分化した培養細胞を用いた場合は、植物組織の場合よりも、有用タンパク質の生産効率において劣る問題がある。
　また、アグロバクテリウム・リゾジェネス（Agrobacterium rhizogenes、または、Rhizobium rhizogenes)を利用して植物に毛状根を生成・増殖させて有用物質を生産することも従来試みられてきた（日本農芸化学会誌　Vol. 65 (1991) No. 7, P.1127-1128（非特許文献１））。この方法は、根特異的に生産される有用物質の生産に適しているとされるが、汎用性に欠け、扱いも手間がかかるため、実用化された事例はほとんど知られていない。
　さらに最近、「一時的液体浸漬培養系」を用いた有用物質の生産方法について報告がされている（特表２０１３－５０４３１７号公報（特許文献３））。「一時的液体浸漬培養系」については、例えば、Ｈ．Ｅtｉｅｎｎｅ等による文献（Plant cell, Tissue and Organ Culture 69, pp.215-231, 2002（非特許文献２））に詳しく報告がされており、植物苗の増殖法として広く利用されている。しかしながら、このような一時的液体浸漬培養系を用いて植物を増殖し有用タンパク質を大量生産する場合、多数の特殊な培養容器等の設備や手間が必要であり、あまり汎用性の高い手段ではない。
　一方で、植物体の液体培養による大量増殖に関する技術としては、過去に、バレイショでの種イモ生産等の種苗分野の応用例の報告が僅かにあるのみであり（特許第２９０４９２４号公報（特許文献４））、本発明者らの知る限り、これをさらに有用物質の生産に応用させた例は知られていない。
　以上のように、植物による有用タンパク質の生産効率の向上を達成しうる手段の提供が引き続き望まれている。
国際公開公報ＷＯ２０１５／１５６３４０号パンフレット 特表２００８－５１５４５４号公報（又は、国際公開公報ＷＯ２００６／０４０７６４号パンフレット） 特表２０１３－５０４３１７号公報（又は、国際公開公報ＷＯ２０１１／０３００８３号パンフレット） 特許第２９０４９２４号公報
日本農芸化学会誌　Vol. 65 (1991) No. 7, P.1127-1128 Plant cell, Tissue and Organ Culture 69, pp.215-231, 2002
　本発明者らは今般、植物体を液体浸漬状態で培養することによって、単位容器空間あたりの有用タンパク質生産量が高まりを効率的に生産できることを発見した。さらに、このとき、一連の過程を、液体浸漬培養条件下において実施することによって、増殖された植物体における総タンパク量当たりの目的タンパク量の比率が予想外にも高まることを見出した。このように、一連の過程を、液体浸漬培養条件下において、継続した培養を行うことにより、有用タンパク質の生産をより一層効率的に行うことに成功した。このために、温室栽培で実施するような植え替えや、苗のポットの移動が不要となり、作業全体が簡便となり作業効率を高めることができた。さらに、液体浸漬培養により植物体の成長速度を速めることで、時間的な生産効率をも高めることができた。
　また、有用物質生産に遺伝子組換え植物体を用いる場合には特別に許可を得ない限りは規制により閉鎖系に封じ込める必要がある。本発明者等による手法によれば、一連の過程を液体浸漬培養条件のみで実現可能であることから、閉鎖系または準閉鎖系での培養による物質生産を、簡便かつ容易にすることができる。例えば、本発明者等の手法で使用されうる袋型培養槽のような培養槽を用いた場合には、個々の袋が閉鎖系であるために、遺伝子組換え植物体の封じ込めが、一層、簡便かつ容易であった。
　本発明はこれらの知見に基づくものである。
　よって、本発明は、液体培養条件において、植物を用いて、有用な物質である目的タンパク質を、安定的かつ、効率的に生産する方法を提供することをその目的とする。
　すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
　＜１＞　容器内において、有用タンパク質の生産が可能な植物体の少なくとも一部を、液体培地に浸漬させたまま培養し、植物体を増殖させることを含む、植物による有用タンパク質の生産方法。
　＜２＞　植物体が、有用タンパク質の生産が可能なように改変された植物体である、前記＜１＞の方法。
　＜３＞　植物体が、安定な遺伝子組換え植物である、前記＜１＞または＜２＞の方法。
　＜４＞　生産される有用タンパク質が、医療用タンパク質または産業用タンパク質である、前記＜１＞～＜３＞のいずれかの方法。
　＜５＞　タンパク質が構成的発現プロモーターを用い発現されるものである、前記＜１＞～＜４＞のいずれかの方法。
　＜６＞　増殖させた植物体から、有用タンパク質を抽出または分離する工程をさらに含む、前記＜１＞～＜５＞のいずれかの方法。
　＜７＞　使用する植物種が、ジャガイモ、レタス、タバコ、トマト、イネ、オオムギ、コムギ、ダイズ、およびトウモロコシからなる群より選択されるいずれかである、前記＜１＞～＜６＞のいずれかの方法。
　＜８＞　植物体の培養および増殖を、無菌化した容器内において行う、前記＜１＞～＜７＞のいずれかの方法。
　＜９＞　容器が、袋型培養槽である、前記＜１＞～＜８＞のいずれかの方法。
　＜１０＞　複数の容器を用いて植物を大量培養して、有用タンパク質を大量生産する、前記＜１＞～＜９＞のいずれかの方法。
　本発明によれば、植物を用いて、目的とする有用タンパク質を効率的に生産することができる。すなわち、本発明によれば、温室栽培や固体培地培養等と比較して、所要資源、労力、時間などの観点を総合して、目的タンパク質の生産効率を高めることができる。換言すると、本発明によれば、植物体を液体浸漬状態で培養することによって、単位容器空間あたりの有用タンパク質生産量を高めることができる。その結果、本発明によれば、生産コストの低減を図ることができる。また、本発明の方法によれば、一連の過程を、液体浸漬培養条件下において実施することにより、植物体における総タンパク質量当たりの目的タンパク質含量の比率を大幅に高めることができる。その結果、本発明によれば、抽出コストの低減が期待でき、有用タンパク質の生産をより一層効率的に行うことが可能となる。このため、本発明による方法は、目的タンパク質の実生産上有用なタンパク生産法であるといえる。
　また本発明によれば、温室栽培で実施するような植え替えや、苗のポットの移動が不要となり、作業全体が簡便となり作業効率を高めることができる。さらに、液体浸漬培養により植物体の成長速度を速めることで、時間的な生産効率をも高めることができる。
　これらのことから、本発明によれば、目的とする物質の生産をより効率的かつ低コスト、かつ安全に行うことが可能である。また、遺伝子組換え体は規制により閉鎖系に封じ込めることが必要であるが、袋型培養槽のような容器を用いた場合には、個々の容器を閉鎖系とできるために、遺伝子組換え体の封じ込めが容易であり、より一層、簡便に作業を実施できる。
　さらに、適切なプロモーターを選択して発現・蓄積部位を限定することができれば、生産された有用タンパク質の分離精製も比較的容易である場合が多い。また、従来より食用に用いられてきた植物部位を使用すれば、分離精製することなく、有用タンパク質が生産され蓄積した植物自体またはその部分を直接、摂取させることも可能である。本発明によれば、これらの点も容易に実現可能であるといえる。
実施例１で行った実験結果を示す。具体的には、培養方法の違いによる植物体（ばれいしょ）の成長量の比較を示す。 実施例２で行った実験結果を示す。具体的には、液体培地量の違いによる植物体（ばれいしょ）の成長量の比較を示す。 実施例２で行った実験結果を示す。具体的には、袋型培養槽あたりのＧＵＳ生産量を示す。 実施例３で行った実験結果を示す。具体的には、袋型培養槽の気相部と液相部のＧＵＳ活性（葉）を示す。 実施例３で行った実験結果を示す。具体的には、袋型培養槽の気相部と液相部のＧＵＳ活性（茎）を示す。 実施例４で行った実験結果を示す。具体的には、液体浸漬培養と土耕のＧＵＳ活性（葉）を示す。 実施例５で行った実験結果を示す。具体的には、培養方法の違いによる同一容器での植物体（レタス）の成長量の比較を示す。 実施例５で行った実験結果を示す。具体的には、培養方法の違いによるＧＵＳ活性の比較を示す。 実施例５で行った実験結果を示す。具体的には、同一容器あたりのＧＵＳ生産量（４週間）を示す。 実施例５で行った実験結果を示す。具体的には、培養方法の違いによるトランスフェリン含有量の比較を示す。 実施例５で行った実験結果を示す。具体的には、同一容器あたりのトランスフェリン生産量（４週間）を示す。 使用状態における単一の容器（袋型培養槽）の一例を示す。 培養袋（袋型培養槽）を用いて有用タンパク質を大量生産している状態の一例を示す。
　以下、本発明の実施形態について説明する。
　本発明は、前記したように、容器内において、有用タンパク質の生産が可能な植物体の少なくとも一部を、液体に浸漬させたまま培養して、植物体を増殖させることを含む、植物による有用タンパク質の生産方法に関する。
　本発明の好ましい態様によれば、この方法は、液体培養条件下にて行われる。
　ここで有用タンパク質の生産には、目的遺伝子として有用タンパク質をコードする遺伝子を導入し、その発現により有用タンパク質を得ること、および、目的遺伝子の発現により特定の遺伝子発現を制御することで、目的の有用タンパク質の生産量を増加させること等が包含される。
　本発明において使用される植物は、有用タンパク質の生産が可能な植物である。したがって、本発明で使用可能な植物は、有用タンパク質を生産可能なように遺伝子組換え技術などにより遺伝的に改変された植物や、有用タンパク質を生産するように改変されたウイルスベクターが導入された植物等のように、有用タンパク質の生産が可能なように改変された植物体や、有用タンパク質の生産が可能な特性をもった天然の植物や、そのような特性を保持するように育種された品種などであってもよい。
　本発明の好ましい態様によれば、植物は、有用タンパク質の生産が可能なように改変された植物であり、特に好ましい態様としては、安定な遺伝子組換え植物である。
　本発明で用いることができる植物種としては、有用タンパク質の生産が可能なものであれば特に制限はない。望ましくは、植物種としては、アグロバクテリウム法やパーティグルガン法などによる形質転換が可能な植物であり、目的遺伝子を安定発現する植物である。例えば、双子葉植物と単子葉植物が挙げられる。具体的には、双子葉植物としては、ナス科植物（ジャガイモ（ばれいしょ）、タバコ、ベンサミアナタバコ、トマト等）、アブラナ科植物（ルッコラ、コマツナ、ミズナ、カラシナ、シロイズナズナ等）、キク科植物（レタス、アーティチョーク等）、マメ科植物（アルファルファ、ダイズ等）、アカザ科植物（ホウレンソウ、テンサイ等）、シソ科植物（シソ、バジル等）、セリ科植物（ニンジン、ミツバ等）、ウリ科（メロン、スイカ、キュウリ、カボチャ等）、アオイ科植物（ワタ等）、が挙げられる。また単子葉植物としては、イネ科植物（イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ等）、サトイモ科（サトイモ、コンニャク等）、ユリ科（タマネギ、ネギ、アスパラガス等）が挙げられる。また、形質転換に用いる植物としては必ずしも野生型である必要ではなく、遺伝子組換え植物も使用することが可能である。例えば、有用タンパク質として糖タンパク質を想定した場合に、ヒト型の糖転移酵素を発現する組換え植物などを形質転換に用いることもできる。
　本発明の好ましい態様によれば、用いられる植物種は、ジャガイモ、レタス、タバコ、トマト、イネ、オオムギ、コムギ、ダイズ、およびトウモロコシからなる群より選択されるいずれかであり、より好ましくは、ジャガイモ、レタス、タバコ、およびイネからなる群より選択されるいずれかである。
　なお本発明において「植物体」とは、植物の器官、部分、および部位を意味し、例えば、葉、茎、根（不定根を含む）、芽（不定芽を含む）、花弁、子葉、胚軸、葯、胚（不定胚を含む）、種子、実、地下茎、塊根、塊茎、球根など、およびそれらの一部が含まれる。このとき、典型的には、「植物体」は、植物体から分離しても分枝、伸長するような改変部位（例えば、毛状根培養における毛状根）は包含されない意味で使用される。換言すると、「植物体」は、典型的には、植物体であって毛状根を除く（または毛状根のみを除く）ものであることができる。好ましくは、「植物体」は、脱分化した細胞、細胞塊（カルス）、分化した植物の器官、組織、部分および／または部位を意味する。
　本発明においては、植物体の少なくとも一部を、液体培地に浸漬させた状態で培養する。
　ここでいう「少なくとも一部」とは、植物体の全体を含む他、前記した植物の器官、部分、および部位のいずれか、またはその組合せの他に、植物の器官、部分、および部位の一部である場合も包含される。
　ここで「液体培地」とは、植物を良好に増殖するための、植物の増殖に必須の炭素源、窒素源等の栄養素を含み、浸透圧およびｐＨが適宜調整された液体であって、植物組織培養技術において公知の液体基本培地またはその改変培地、または一部成分を削除した培地であることができる。そのような公知の培地の例としては、Ｗｈｉｔｅの培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０～ｐ３６に記載）、Ｈｅｌｌｅｒの培地（Heller R, Bot. Biol. Veg. Paris 14 1-223(1953)）、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０～ｐ３６に記載）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０～ｐ３６に記載）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０～ｐ３６に記載）、ＭＢ培地、および、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ　Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地が挙げられる。
　液体培地のｐＨは、植物にあわせて適宜調整することができるが、５．０～６．５が好ましい。
　液体培地の使用量は、培養期間を通じて植物体の少なくとも一部が浸漬される状態が継続できる量であれば良く、容器の大きさにあわせて適宜調整できるが、後の実施例に記載するように、液体に浸漬された状態の方が有用タンパク質の生産上有利であるため、多い方が好ましい。例えば、植物体の全体の５０％以上、より好ましくは７５％以上が培養期間を通じて浸漬されるような量で、液体培地を使用するのが好ましい。
　本発明において、使用する植物体が、有用タンパク質の生産が可能なように遺伝的に改変された植物体である場合、目的遺伝子を導入することにより得られたものであることが好ましい。通常、目的遺伝子は、目的遺伝子を含む発現可能な核酸構築物として、植物体に導入される。
　本発明において、目的遺伝子とは、植物またはその部分に導入する遺伝子を意味する。目的遺伝子としては、植物に導入された結果、当該植物の遺伝的形質を変化させ得るものであれば特に限定されるものではなく、導入される植物以外の生物由来の遺伝子であってもよく、人工的に作製した遺伝子であってもよい。人工的に作製した遺伝子としては、例えば、２種類以上の遺伝子をつなぎ合わせたキメラ遺伝子であってもよく、いずれかの生物が有する遺伝子を変異させた変異遺伝子であってもよい。変異遺伝子としては、例えば、遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列のうちの一部の塩基を欠損させたものであってもよく、置換させたものであってもよい。また、該塩基配列の途中に部分塩基配列を挿入したものであってもよい。
　目的遺伝子を植物内で過剰発現させるには、該遺伝子を適当なプロモーターの下流に機能的に連結し、得られた核酸構築物を公知の手法によって植物細胞に導入すればよい。本発明の好ましい態様によれば、構成的発現プロモーターを用いることができる。このような構成的発現プロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーターやElongation factor 1βプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーターなどを挙げることができるが、これらに限定されず、目的の組織にあわせて選択し使用すればよい。また、目的遺伝子を過剰発現させ、有用タンパク質を特定のオルガネラに蓄積させる、あるいは細胞外に分泌させることもでき、そのために適当なシグナルペプチドを付与することも可能である。
　目的遺伝子はまた、好適には、マーカー遺伝子、場合により、レポーター遺伝子とともにベクターに組み込まれる。マーカー遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔＩ）、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。植物体での発現位置を確認するためのレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）等を挙げることができる。したがって、本発明の発現可能な核酸構築物は、プロモーターや、マーカー遺伝子、レポーター遺伝子などともに目的遺伝子を含むことができる。
　目的遺伝子を含む発現可能な核酸構築物を、植物細胞へ導入する手法としては、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ウイスカー法、フローラルディップ法等がある。
　アグロバクテリウム法を例に、導入手法を以下に説明する。
　アグロバクテリウム法では、目的遺伝子を含む発現可能な核酸構築物を含むアグロバクテリウム菌を、植物に接種する。接種に使用するアグロバクテリウム菌の調製方法は以下の通りである。
　使用可能なアグロバクテリウムとしては、含有する核酸構築物を植物細胞に導入させることができる微生物であれば特に限定されるものではないが、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens、または、Rhizobium radiobacter）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes、または、Rhizobium rhizogenes）が挙げられる。好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンスである。
　目的遺伝子を含む発現可能な核酸構築物を含むアグロバクテリウムは、従来公知の何れの手法を用いて作製することができる。
　例えば、アグロバクテリウムが有するＴｉプラスミドのＴ－ＤＮＡ領域と相同組み換え可能なプラスミドに、標的遺伝子等を組み込んだ標的遺伝子組み換え中間ベクターを作製し、該標的遺伝子組み換え中間ベクターをアグロバクテリウムに導入してもよい。また、アグロバクテリウム法において汎用されているバイナリーベクターに標的遺伝子等を組み込んだ標的遺伝子バイナリーベクターをアグロバクテリウムに導入してもよい。
　すなわち、本発明でいう発現可能な核酸構築物とは、アグロバクテリウムを感染させた植物内で目的遺伝子を発現可能なように設計された核酸による構築物のことであり、例えば、このような核酸構築物としては、目的遺伝子を含むベクター、プラスミド等をいう。
　バイナリーベクターの具体例として、ｐＢＩ系ベクター（例えば、ｐＲｉｃｅＦＯＸ）、ｐＰＺＰ系ベクター（Plant Molecular Biology 25(6): 989-94. (1994)）、ｐＣＡＭＢＩＡ系ベクター（ベクター骨格：ｐＰＺＰベクター）、ｐＳＭＡ系ベクター（Plant Cell Reports 19: 448-453. (2000)）を挙げることができるが、これらに限定されない。
　本発明において、有用タンパク質の生産が可能なように改変された植物体としては、安定な（stable）遺伝子組換え植物の植物体の他、ウイルスベクターが導入された植物体等が挙げられるが、好ましくは、遺伝子組換え植物、すなわち、安定な遺伝子組換え植物である。
　なおここで、安定な（stable）遺伝子組換え植物とは、安定形質転換体をいい、前記した遺伝子組換え植物の遺伝子導入手法に従って得られた植物体を、一定の代数、継代し、所定のマーカー等を指標にして選抜を繰り返して、導入された遺伝子が植物体全体で安定して保持されるようになった植物をいう。
　本発明における目的遺伝子としては、その発現により有用物質としてのタンパク質が得られる遺伝子であり、そのような有用タンパク質として、医療用タンパク質、産業用タンパク質などが挙げられる。
　医療用タンパク質としては、治療用タンパク質と診断タンパク質に分類され、治療用タンパク質としては、ペプチド、ワクチン、抗体、酵素、ホルモン（好ましくはペプチドホルモン）などが例示され、より具体的には、ワクチンとして使用されるウイルスタンパク質、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン等の造血因子、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のような成長因子、インターフェロン、インターロイキン（ＩＬ）－１やＩＬ－６等のサイトカイン、モノクローナル抗体またはその断片、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、インシュリン、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）などが例示される。なおここでは治療用には、予防用も含む意味で使用されている。また、診断タンパク質としては、抗体、酵素、ホルモン等が例示される。
　ワクチンとして使用されるウイルスタンパク質として好ましくは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の構成タンパク質が挙げられる。ＶＬＰの構成タンパク質は単一のタンパク質でもよいし、１つ以上のタンパク質を含んでもよい。ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などが挙げられ、インフルエンザウイルスのＶＬＰの構成タンパク質としてはインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質などが例示される。
　産業用タンパク質とは、食品、飼料、化粧品、繊維、洗剤、化学品などに用いられるタンパク質であり、ペプチド、酵素、機能性タンパク質が例示される。具体的には、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、アルブミン、ペプチダーゼ、ルシフェラーゼ、ラクタマーゼ、コラーゲン、ゼラチン、ラクトフェリン、トランスフェリン、クラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）などが例示される。
　本発明においては、液体培地に浸漬させた植物体の少なくとも一部を、浸漬させたまま培養し、植物体として増殖させる。すなわち、本発明においては、浸漬させた植物体を培養する際には、培地への接触を間欠的に繰り返すようなことは行わず、継続的に培地に浸漬させる。
本発明の方法を実施する環境条件
　本発明の方法は、植物体の液体培養を継続的に実施できるような環境で行うことが望ましい。
　したがって、植物体の液体培地液体無菌もしくはそれに準じる環境であることが好ましい。
　本発明の方法を実施する場合の温度、湿度、二酸化炭素濃度、光照射などの条件については、植物体が生育し、増殖可能な条件であれば、特に制限はない。
　例えば、温度条件としては、植物の種類や使用する部位にもよるが、通常１０℃以上、好ましくは２０℃以上であり、また、通常４０℃以下、好ましくは３０℃以下であることができる。
　また湿度条件は、好ましくは５０％以上であり、また、通常１００％以下である。
　二酸化炭素の濃度条件は、通常３００ｐｐｍ以上、好ましくは５００ｐｐｍ以上であり、また、通常５０００ｐｐｍ以下、好ましくは３０００ｐｐｍ以下であることができる。
　光照射条件については、暗所または明所を適宜選択できる。明所条件において使用される光源としては、特に制限されないが、太陽光、蛍光灯、ＬＥＤ、冷陰極蛍光ランプ（ＣＣＦＬ、ＨＥＦＬ）、無機・有機ＥＬ等を例示することができる。
　光強度としては、光合成有効光量子束密度（ＰＰＦＤ）等を測定することで評価できる。ＰＰＦＤとは、光合成に有効な可視領域４００～７００ｎｍの光の単位時間、単面積当たりの光量子数で表され、単位は、μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１である。ＰＰＦＤは、通常２０００μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１以下、好ましくは、１５００μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１以下、さらに好ましくは、１０００μｍｏｌ・ｍ－２・ｓ－１以下で実施される。ここで、ＰＰＦＤは、光量子計などを用いて測定することができる。
　植物体の増殖時間については、通常３０から９０日であるが、植物種や投入する植物体や液体培地の量、その他環境条件等により異なり、容器内での植物体の増殖量や老化の有無等を考慮して適宜調整が可能である。
抽出／分離工程
　本発明においてはさらに、得られた植物体から、目的とする有用タンパク質を、増殖させた植物体もしくは液体培地から抽出し、または分離する工程をさらに含むことができる。すなわち、増殖させた植物体もしくは液体培地から目的タンパク質を含む画分を取得し、目的タンパク質を適当な方法により分離・精製することが好ましい。なお、目的タンパク質をコードする目的遺伝子を含む核酸構築物には、例えば、精製のためのタグ配列や植物細胞外への分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。
　タンパク質の抽出を行う場合に用いる抽出液は公知の緩衝液、例えばＧｌｙｃｉｎｅ緩衝液、Ｃｉｔｒａｔｅ緩衝液、Ａｃｅｔａｔｅ緩衝液、Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ緩衝液、Ｍａｌａｔｅ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ＴＥＳ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液、Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液、ＴＡＰＳ緩衝液、ホウ酸緩衝液などを使用することが出来る。タンパク質の抽出の際には、公知のプロテアーゼ阻害剤、例えばｂｅｎｚａｍｉｄｅ，　ＰＭＳＦ，　ＡＥＢＳＦ，　ａｎｔｉｐａｉｎ，　ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ，　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ，　ｐｈｓｐｈｒａｍｉｄｏｎ，　ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，　ＥＤＴＡなどを使用することが出来る。タンパク質の抽出の際には、公知の酸化防止剤を用いることが可能であり、例えば、ＤＴＴ、ＧＳＨ、β－メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ、システイン、メルカプトエチルアミン、メルカプトプロピオン酸などが挙げられる。また界面活性剤は公知の界面活性剤を用いることが可能であり、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＮＰ－４０、Ｔｗｅｅｎ　２０、ＣＨＡＰＳ、ＣＴＡＢ、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ＳＤＳなどが挙げられる。タンパク質抽出のための植物の破砕方法は公知の方法を用いることが可能であり、例えばビーズ式破砕装置、ミキサー、超音波破砕装置などによる破砕が可能である。
　本発明において、精製は、公知の手法により行うことが可能である。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどが挙げられ、これらを適宜組み合わせて用いても良い。
　経口摂取型ワクチンなどを用途とする場合には、得られた植物体をそのまま乾燥粉末化する等加工して使用することができる。
培養容器
　本発明の方法は、容器内において実施する。容器内において実施すると、無菌もしくはそれに準じる環境を保持し易い。すなわち、ここで培養容器とは、室内に培養槽を配置したような培養室自体や水耕栽培可能な温室自体などを含まない意味で使用される。好ましくは、無菌化した培養容器内で実施するのがよく、より好ましくは、フィルター等で無菌化した空気等ガスの導入部と排出部を有する容器内での実施が望ましい。
　本発明の方法は、好ましくは、袋型培養槽内において行うのがよい。
　また本発明の方法は、好ましくは、液体浸漬培養用の容器（または、培養槽）である。このような液体浸漬培養用の容器については蒸気やガンマ線などによる滅菌が可能な素材、例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタラート製等であり、袋型、ボックス型など様々な形態の培養槽が可能であるが、これらに限定されるものではない。
　本発明においては、そのような培養槽として、１００～数１００Ｌを超えるような大型の培養槽を利用してもよいが、その代わりに、２０Ｌを下回るような小型の培養槽を利用し、必要に応じてそれを多数用意して実施することが好ましい。
　このような小型の培養槽として、折りたたまれた状態から展開することで自立可能なように構成された袋型の培養槽（培養袋）が好ましい。このような培養槽の好ましい例として、以下に述べるような袋型培養槽が挙げられる。すなわち、本発明の方法は、好ましくは、このような袋型培養槽内において行うのがよい。
　袋型培養槽の例
　好ましい袋型培養槽（培養袋）およびそのような培養槽を使用した大量生産設備の例を図１２および図１３にそれぞれ例示する。
　図において、培養袋１は、軟質樹脂の一例として、ＰＥＴ（ポチエチレンテレフタレート）及びＣＰＰ（無軸延伸ポリプロピレン）の複合フィルム（厚さは一例として１００μｍ）を素材とし、そのフィルムを縦長でかつ底部にガゼット２が設けられた底ガゼットタイプの袋形状に成形することにより作製される。培養袋１の素材に用いられる樹脂には、植物の培養に必要な光の波長域に対して透過性を有するものが選択される。培養袋１の上端はその全幅に亘って開口部とされ、その開口部分を除く培養袋１の周囲は密封されている。ガゼット２が折り畳まれた状態から培養袋１を展開することにより、培養袋１の底部が一定の大きさに拡大する。それにより、培養袋１には自立性が生じ、支持手段を用いることなく培養袋１を並べ置くことが可能である。また、非使用時にはガゼット２を折り畳むことにより、比較的狭いスペースにて多数の培養袋１を保管することができる。
　培養袋１の側面には、単一の下部ポート３と、二つの上部ポート４とが取り付けられている。これらのポート３、４は培養袋１の内部にガスを導入し、あるいは培養袋１からガスを排気するためのものである。ポート３、４は一例としてポリプロピレン樹脂を素材とする成形品を培養袋１に接着することにより設けられる。ポート３、４は例えばチューブ類を接続可能な形状に形成される。さらに、上部ポート４の上端から培養袋１の上端までの領域は、培養袋１内に培地や植物材料を収容した後に培養袋１を密封するための封止部として機能する。
　培養袋１を滅菌するためのオートクレーブ処理に耐え得るものであれば、培養袋１及びポート３、４の材質は適宜に変更可能である。培養袋１の容量は、培地と植物材料とを収容した単一の培養袋１を作業者が持ち上げることができる範囲であれば適宜に設定されてよい。本形態では、培養袋１の容量が最大でも１２Ｌ（リットル）、好ましくは８Ｌに設定され、その内部に収容される培地と浸漬された植物材料は、両者を合計して培養袋１の容量の６割程度、すなわち、培養袋１の容量が１２Ｌの場合は７Ｌを目安とし、培養袋１の容量が８Ｌの場合は５Ｌを目安として設定される。
　図１３は、植物の生産過程における培養袋１の使用例を示し、これは大量生産設備の例である。図１２はその使用状態における単一の培養袋１の一例を示している。図１２に示すように、本形態では、所定の培養室１０内に保管棚１１が設置される。培養室１０は、温度、湿度、照明といった植物の培養環境を構成する各種の物理パラメータを管理可能な培養スペースとして区分されている。
　保管棚１１の各段には多数の培養袋１が並べて設置される。図１２により詳しく示したように、各培養袋１には、フィルタ濾過等により滅菌された培地１２と植物材料１３とが収容され、各培養袋１の上端の開口部はヒートシールといった密封方法を用いて無菌状態で密封されている。培地１２の上方は気相部１４が確保されている。培地１２には、植物材料１３の種類とその生産工程とに応じて、適切な組成の液体培地が適宜に選択して使用される。培養袋１の下部ポート３には通気用のチューブ１５及びフィルタ１６が接続され、一方の上部ポート４にも通気用のチューブ１７及びフィルタ１８が接続され、他方の上部ポート４にはフィルタ１９が接続される。チューブ１５、１７から培養袋１内には所定のガス、例えば空気又は二酸化炭素が導入され、それと引き換えにフィルタ１９から培養袋１内のガスが排気される。ただし、上部ポート４のそれぞれが排気用に利用されてもよい。また、下部ポート３から所定のガスが液体培地中に通気されるよう、培養袋１の底面からの下部ポート３の配置位置と培地量とが調整されることが望ましい。液体培地中に通気されることにより、植物体へ所定のガスが効率的に供給され、さらには液体培地中又は植物体の撹拌効果も期待できる。ガス通気量は植物の種類や増殖法により適宜に選択されてよいが、好ましくは５０～１００ｍＬ／分である。チューブ１５、１７は、それらの絡み付き等を防ぐために、クリップ２０等を用いて培養袋１の適宜の位置に固定される。
　なお上記したとおり、上記の袋型培養槽およびそれを用いた設備は、共に本発明の方法を実施する環境である培養槽または培養室の例示である。
　すなわち、本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明による方法は、複数の容器を用いて植物を大量培養し有用タンパク質を大量生産する方法であることができる。
　以下において、本発明を下記の実施例によって詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
（実施例１）　固体培地と液体培地での植物増殖量及び有用タンパク質生産量の比較
　植物体培養法による成長速度の比較を行うため、プラントボックスにて固体培養法と液体培養法でのジャガイモ植物体の成長量の比較を行った。
　植物材料とその形質転換：
　植物としては、ばれいしょ（Solanum tuberosum L.）の品種「サッシー」の組織培養苗を用いた。
　形質転換方法としては、アグロバクテリウム法を採用した。アグロバクテリウム法は、アグロバクテリウム株であるAgrobacterium tumefaciens LBA4404（タカラバイオ株式会社より入手、製品コード９１１５）に、植物形質転換用ベクターとしてカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流にβ－グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）が組み込まれたもので、選抜マーカー遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を保有するものを、エレクトロポレーション法（例えば、ＢＩＯ－ＲＡＤ社製　Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ IIのＰｕｌｓｅ条件を２５μＦ、２００Ω、２．２５ｋＶ）により導入して使用した。
　ジャガイモの形質転換は、文献［門馬、植物組織培養７：５７－６３（１９９０）］の記載に従い実施した。
　ジャガイモ品種「サッシー」（ジャパンポテト社）から得られたマイクロチューバーを２～３ｍｍにスライスし、アグロバクテリウム感染用の材料とした。これを上記のアグロバクテリウムの菌液に浸した後、滅菌済みの濾紙上に置いて過剰のアグロバクテリウムを除いた。シャーレ内のＭＳ培地（Ｚｅａｔｉｎ　１ｐｐｍ，　ＩＡＡ　０．１ｐｐｍ，　アセトシリンゴン１００μＭ、及び寒天０．８％を含む）上に置き、培養は３日間２５℃、１６時間照明（光量子束密度３２μＥ／ｍ２ｓ）／８時間無照明の条件下で行った。
　ついで、アセトシリンゴンの代わりにカルベニシリン２５０ｐｐｍを含んだ培地で１週間培養した。その後、さらに選抜マーカーの抗生物質であるカナマイシン５０ｐｐｍを含む培地上に移し、２週間ごとに継代した。この間に不定芽が形成し、シュートを生じた。
　伸張したシュートをカルベニシン２５０ｐｐｍ及びカナマイシン１００ｐｐｍを含み、植物生長調節物質を含まないＭＳ培地に置床した。発根したシュートをカナマイシン耐性の生長した植物体の中から外来遺伝子としてカナマイシン耐性遺伝子を含有する個体を、ＰＣＲ（条件：９５℃５分、（９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分）を３０回、７２℃１０分）を行うことによって検出し、該再分化植物体が形質転換植物体であることを確認した。
　ここで、カナマイシン耐性遺伝子の配列を特異的に増幅するプライマーとして、ＴＡＡＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＴ（配列番号１）、及びＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴ（配列番号２）を用いた。
　以上のようにして、β－グルクロニダーゼ遺伝子が導入されたジャガイモの形質転換植物体３系統を取得した。実験には得られた３系統のうち、代表的な系統としてｐＫＴ１９－１を使用した。
　培養方法：
　ジャガイモのｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養条件は以下の通りである。
　培養容器はプラントボックス（株式会社三商より入手）を使用した。得られた形質転換植物体は、固体培地にて頂芽を用いて継代した。固体培地は、ＭＳ培地（スクロース３％を添加し、ｐＨ５．８）に寒天０．８％を加えたものを使用した。
　液体培地の場合には、ＭＳ培地（スクロース３％を添加し、ｐＨ５．８）を使用した。袋型培養槽で生育させる場合には、改変ＭＳ培地（リン酸二水素カリウム量を３倍量に、塩化カルシウム量を４倍量に改変）にショ糖２０ｇ／Ｌと０．０２ｐｐｍのベンジルアミノプリンを加えてｐＨ５．８に調整した液体培地を使用した。
　有用タンパク質の生産量検証方法：
　有用タンパク質であるβ－グルクロニダーゼの生産量を示す指標として、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性を以下のように測定した。
　新鮮重約３０ｍｇのサンプルと抽出バッファー１ｍｌを２ｍｌチューブに入れを、ミキサーミル　ＭＭ３００（ｒｅｔｓｃｈ社製）にて４度にて破砕した。抽出バッファーの組成は、２５　ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ　７．０）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００であった。破砕後、チューブを遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，１０分，４度）して上清をタンパク質抽出液として得た。もしくは新鮮重１ｇに対して１ｍｌの抽出バッファーを加えて、乳棒・乳鉢にて破砕した破砕液をガーゼでろ過し、得られたろ液を遠心分離（３０００ｒｐｍ，４度，２０分）して上清をタンパク質抽出液として得た。
　タンパク質抽出液のタンパク質濃度はＲＣ　ＤＣプロテインアッセイキットII（ＢＩＯ　ＲＡＤ社製）を使用し、牛血清アルブミンを用いた検量線により定量した。
　ＧＵＳ活性の測定は、反応溶液として抽出バッファー１５０μｌに、粗酵素液２μｌ及び基質として５ｍＭの４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルクロニド５０μｌを添加し、発生する蛍光を測定して行った。
　結果：
　結果は下記の通りであった。
　２週間の培養後の新鮮重量増加量を比較すると、固体培養法は０．８ｇ、液体培養法は３．８ｇであり、液体培養法の方が４．８倍の増加量となった。このデータから、植物体の成長には個体培養法よりも液体培養法の方が適していることが示された（図１）。
（実施例２）　液体培地量による植物増殖量および有用タンパク質生産量の比較
　次に、異なる液体培地量での成長量の比較を行った。
　用いた植物材料、有用タンパク質の生産量検証方法および液体培地組成は実施例１と同様であった。
　植物の培養方法：
　袋型培養槽（８Ｌ容）に、プラントボックスで固体培地を用いて約２か月培養した約２ｇの植物体を、１Ｌの液体培地に入れたもの（１Ｌ区）と、４Ｌの液体培地に入れたもの（４Ｌ区）で、ＧＵＳを発現する遺伝子組換えジャガイモの成長を４０日間培養後に比較した。
　結果：
　結果は下記の通りであった。
　４０日間の培養後の新鮮重量を比較すると、１Ｌ区では１３９ｇ、４Ｌ区では５７６ｇとなり、その収穫量は４．１倍であった（図２）。この際、１Ｌ区も４Ｌ区もいずれも良好に成長し、１Ｌ区では主に液体培地の液面より上部（気相部）への成長が、４Ｌ区では主に液体培地内（液相部）への成長が認められた。
　またこのとき、袋型培養槽あたりのＧＵＳ生産量は、１Ｌ区では２６９５２１μｍｏｌ／ｍｉｎ，４Ｌ区では１２４８７６８μｍｏｌ／ｍｉｎとなり、その生産量は５．０倍となった（図３）。
　液体に植物体を常に浸漬させた培養方法は、組織のガラス化（ビトリフィケーション）が生じ、増殖後の馴化に難があることから、植物苗の増殖法としては一般的には避けられてきた。しかし、有用タンパク質の生産にあたっては、植物苗の増殖と異なり、馴化工程を考慮した強健さは不要であるため、植物体の液体浸漬培養が可能であり、単位培養容積あたりの収穫量を高められることが示された。
（実施例３）　植物体の液体浸漬部と気相部での総タンパク質量あたりの有用タンパク質含量の比較
　実施例１および２と同じＧＵＳを発現する組換えジャガイモ植物体を、袋型培養槽を用いて４０日間液体浸漬培養し、液体培地に常時浸漬していた部分（液相部）と液面より上部に成長した部分（気相部）の葉および茎における総タンパク質あたりのＧＵＳ活性を比較した。諸条件は実施例１および２と同様とした。
　結果：
　結果は下記の通りであった。
　液体培地に常時浸漬していた液相部は気相部よりも、総タンパク質あたりのＧＵＳ活性が高かった。すなわち、葉では気相部で３１５．８μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎに対し、液相部が７００．８μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであり、液相部で２．２倍高い値となった（図４）。
　さらに茎では気相部が６２６．３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎに対して、液相部が１０７５．１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎであり、液相部が１．７倍高い値となった（図５）。
　この結果から、有用タンパク質生産には液体に浸漬させた状態での培養が適していることが示された。
（実施例４）　液体浸漬培養と土耕栽培での有用タンパク質生産量の比較
　上記実施例３で確認された液体浸漬培養時の葉でのＧＵＳ活性値と、同じ組換え植物を土耕栽培した場合と葉比較した。ジャガイモの温室での土耕栽培条件は以下の通りであった。
　得られた形質転換植物体の頂芽を固体培地にて継代し、１４週経過したｉｎ　ｖｉｔｒｏ苗を園芸用土（コンパル高級園芸用土、スミリン農産工業株式会社）に馴化し、４週間温室にて育成した。
　結果：
　結果は下記の通りであった。
　液体浸漬培養の葉と比較して、土耕栽培の葉では総タンパク質あたりのＧＵＳ活性が１２３．９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎに低下した（図６）。このことからも今回達成された液体浸漬培養による有用タンパク質生産は産業上有用な方法であることが確認できた。
（実施例５）　リーフレタスの固体培養と液体浸漬培養での有用タンパク質生産量の比較
　リーフレタスにおける植物体培養法による有用タンパク質生産量の比較を行うため、固体培養法と液体浸漬培養法での比較を行った。
　植物材料とその形質転換：
　植物としては、リーフレタス（Lactuca sativa）の品種「グリーンウェーブ」の組織培養苗を用いた。
　形質転換方法としては、アグロバクテリウム法を採用した。アグロバクテリウム法は、アグロバクテリウム株であるAgrobacterium tumefaciens LBA4404（タカラバイオ株式会社より入手、製品コード９１１５）に、植物形質転換用ベクターとしてカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流にβ－グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）、またはトランスフェリン遺伝子が組み込まれたもので、選抜マーカー遺伝子としてハイグロマイシン耐性遺伝子を保有するものを、エレクトロポレーション法（例えば、ＢＩＯ－ＲＡＤ社製　Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ IIのＰｕｌｓｅ条件を２５μＦ、２００Ω、２．２５ｋＶ）により導入して使用した。
　リーフレタスの形質転換は、文献［形質転換プロトコール（植物編）、田部井豊編、化学同人］の記載に従い実施した。
　リーフレタス品種「グリーンウェーブ」から得られた緑葉を約５ｍｍｘ５ｍｍにメスで切断し、アグロバクテリウム感染用の材料とした。これを上記のアグロバクテリウムの菌液に浸した後、滅菌済みの濾紙上に置いて過剰のアグロバクテリウムを除いた。シャーレ内のＭＳ培地（ＢＡ　１ｐｐｍ，ＮＡＡ　０．１ｐｐｍ，アセトシリンゴン１００μＭ、及びゲルライト０．３％を含む）上に置き、培養は３日間、２５℃、暗所の条件下で行った。
　ついで、除菌薬剤カルベニシリン２５０ｐｐｍおよび選抜マーカーの抗生物質であるハイグロマイシン２５ｐｐｍを含む培地上に移し、２週間ごとに継代した。この間に不定芽が形成し、シュートを生じた。
　伸張したシュートをカルベニシン２５０ｐｐｍ及びハイグロマイシン２５ｐｐｍを含み、植物生長調節物質を含まないＭＳ培地に置床した。発根したシュート（植物体）の中からハイグロマイシン耐性遺伝子を含有する個体を、ＰＣＲ（条件：９５℃３分、（９５℃２０秒、６２℃１５秒、７２℃３０秒）を３５回、７２℃５分）を行うことによって検出し、該再分化植物体が形質転換植物体であることを確認した。
　ここで、ハイグロマイシン耐性遺伝子の配列を特異的に増幅するプライマーとして、ＣＧＧＡＡＧＴＧＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＧ（配列番号３）、及びＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＣ（配列番号４）を用いた。
　以上のようにして、β－グルクロニダーゼ遺伝子またはトランスフェリン遺伝子が導入されたリーフレタスの形質転換植物体を取得した
　培養方法：
　リーフレタスのｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養条件は以下の通りである。
　培養容器はプラントボックス（株式会社三商より入手）を使用した。得られた形質転換
植物体は、固体培地にて頂芽を用いて継代した。固体培地は、ＭＳ培地（スクロース３％
を添加し、ｐＨ５．８）に寒天０．８％を加えたものを使用した。
　液体培地の場合には、ＭＳ培地（スクロース３％及びＢＡ０．０２ｐｐｍ、ジベレリン０．００１ｐｐｍを添加し、ｐＨ５．８）を使用した。
　有用タンパク質の生産量検証方法（ＧＵＳ）：
　有用タンパク質であるβ－グルクロニダーゼの生産量を示す指標として、β－グルクロ
ニダーゼ（ＧＵＳ）活性を以下のように測定した。
　新鮮重約１００ｍｇのサンプルとと抽出バッファー３００μＬを３ｍｌチューブに加えマルチビーズショッカー（安井器械株式会社）にて破砕した。抽出バッファーの組成は、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１％　Ｔｒｉｔｏｎ×－１００であった。破砕後、チューブを遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分）して、上清をタンパク質抽出液として得た。
　タンパク質抽出液のタンパク質濃度はＴａＫａＲａ　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＴａｋａＲａ）を使用し、牛血清アルブミンを用いた検量線により定量した。
　ＧＵＳ活性の測定は、実施例１と同様に行った。すなわち、反応溶液として抽出バッファー１５０μｌに、粗酵素液２μｌ及び基質として５ｍＭの４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルクロニド５０μｌを添加し、発生する蛍光を測定して行った。
　有用タンパク質の生産量検証方法（トランスフェリン）：
　有用タンパク質であるトランスフェリンの生産量を以下のように測定した。
　サンプルとして新鮮重約１００ｍｇに対し抽出バッファー３００μＬを３ｍｌチューブに加えマルチビーズショッカー（安井器械株式会社）にて破砕した。抽出バッファーの組成は、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１％　Ｔｒｉｔｏｎ×－１００であった。破砕後、チューブを遠心分離（１５,０００ｒｐｍ、４℃、１０分）して、上清をタンパク質抽出液として得た。
　タンパク質抽出液のタンパク質濃度はＴａＫａＲａ　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＴａｋａＲａ）を使用し、牛血清アルブミンを用いた検量線により定量した。
　抽出液中のトランスフェリン含有量は、市販ＥＬＩＳＡを使用して測定した（Human Transferrin ELISA Kit, Bethyl Laboratories Inc., E88‐128）。抽出液はキット内のＢｕｆｆｅｒで１，０００倍に希釈して供試した。
　結果：
　結果は下記の通りであった。
　４週間の培養後の新鮮重量増加量を比較すると、固体培養法は０．６ｇ、液体培養法は
１２．９ｇであり、液体培養法の方が２１．５倍の増加量となった。このデータから、植物体の成長には個体培養法よりも液体培養法の方が適していることが示された（図７）。
　総タンパク質あたりのＧＵＳ活性は、固体培養の葉での９０．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎに対して、液体浸漬培養の葉では２４８．７μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎと２．８倍に上昇した（図８）。
　４週間培養後の培養容器あたりのＧＵＳ生産量を比較すると、固体培養法は０．４ｍｍｏｌ／ｍｉｎ、液体浸漬培養法は１３．７ｍｍｏｌ／ｍｉｎであり、液体浸漬培養法の方が３４．１倍の増加量となった（図９）。
　一方、総タンパク質あたりのトランスフェリン含有量は、固体培養の葉での２．５μｇ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎに対して、液体浸漬培養の葉では４．３μｇ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎと１．７倍に上昇した（図１０）。
　さらに、４週間培養後の培養容器あたりのトランスフェリン生産量を比較すると、固体培養法は１６．６μｇ、液体浸漬培養法は３１５．１μｇであり、液体浸漬培養法の方が１９．０倍の増加量となった（図１１）。
　液体に植物体を常に浸漬させた培養方法は、組織のガラス化（ビトリフィケーション）が生じ、増殖後の馴化に難があることから、植物苗の増殖法としては一般的には避けられてきた。しかし、有用タンパク質の生産にあたっては、植物苗の増殖と異なり、馴化工程を考慮した強健さは不要であるため、植物体の液体浸漬培養が可能であり、単位培養容積あたりの収穫量を高められることが示された。
　１　培養袋
　２　ガゼット
　３　下部ポート
　４　上部ポート
　１０　培養室（培養スペース）
　１１　保管棚
　１２　培地
　１３　植物材料
　２４　分岐管路
　２５　マニホールド
　２６　チューブ継ぎ手
　２７　開閉弁

Claims (10)

  1. 　容器内において、有用タンパク質の生産が可能な植物体の少なくとも一部を、液体培地に浸漬させたまま培養し、植物体を増殖させることを含む、植物による有用タンパク質の生産方法。
  2. 　植物体が、有用タンパク質の生産が可能なように改変された植物体である、請求項１に記載の方法。
  3. 　植物体が、安定な遺伝子組換え植物である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　生産される有用タンパク質が、医療用タンパク質または産業用タンパク質である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　タンパク質が構成的発現プロモーターを用い発現されるものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　増殖させた植物体から、有用タンパク質を抽出または分離する工程をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　使用する植物種が、ジャガイモ、レタス、タバコ、トマト、イネ、オオムギ、コムギ、ダイズ、およびトウモロコシからなる群より選択されるいずれかである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　植物体の培養および増殖を、無菌化した容器内において行う、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　容器が、袋型培養槽である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　複数の容器を用いて植物を大量培養して、有用タンパク質を大量生産する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
     
     
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