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WO2018199633A1 - 데커신 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

데커신 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물 Download PDF

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WO2018199633A1
WO2018199633A1 PCT/KR2018/004812 KR2018004812W WO2018199633A1 WO 2018199633 A1 WO2018199633 A1 WO 2018199633A1 KR 2018004812 W KR2018004812 W KR 2018004812W WO 2018199633 A1 WO2018199633 A1 WO 2018199633A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
slc
progerin
aging
formula
preventing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2018/004812
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English (en)
French (fr)
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WO2018199633A4 (ko
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박범준
송규용
오유석
이지현
윤은주
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PRG S&Tech Inc
Original Assignee
PRG S&Tech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Priority claimed from KR1020180045593A external-priority patent/KR102070328B1/ko
Application filed by PRG S&Tech Inc filed Critical PRG S&Tech Inc
Priority to JP2019558763A priority Critical patent/JP6826674B2/ja
Priority to EP18791502.0A priority patent/EP3617211B1/en
Priority to US16/605,802 priority patent/US11008332B2/en
Priority to CN201880027751.9A priority patent/CN110573514B/zh
Priority to ES18791502T priority patent/ES3053011T3/es
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Publication of WO2018199633A4 publication Critical patent/WO2018199633A4/ko
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A61K31/37—Coumarins, e.g. psoralen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the present invention relates to a novel decusin derivative and a composition for preventing or treating aging-related diseases containing the same as an active ingredient.
  • HGPS Hutchinson Gilford progria syndrome
  • HGPS is a very rare autosomal dominant genetic disease caused by a silent mutation of G608G of Lamin A (LMN A).
  • LN A Lamin A
  • the mutation produces a new cleavage donor site and produces a selective cleavage site product, Progerin (Prg), in which the 50 amino acids of the C-terminal domain of Lamin A are deleted.
  • progerin leads to morphological changes such as nuclear membrane irregularity or reduction of nuclear-cytoplasmic lamin A. Inhibition of progerin leads to reduction of nuclear deformation, which has been identified as a major factor of HGPS.
  • the present invention provides a novel compound that inhibits the binding of progerin and lamin A, and to provide a composition comprising the compound as an active ingredient as a pharmaceutical composition for preventing or treating aging-related diseases such as premature mania.
  • the present invention provides a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating aging-related diseases containing a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving wrinkles comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • novel compounds according to the present invention exhibited excellent progerin expression and inhibitory effect of progerin and lamin A binding in premature ejaculation-induced cells and animal models.
  • oral administration resulted in progerin and lamin levels similar to intraperitoneal injection.
  • the compounds of the present invention are aging such as Hutchinson Gilford progria syndrome (HGPS) and Werner syndrome. It can be effectively used in the treatment of related diseases, the novel compounds of the present invention can be provided as a cosmetic composition for preventing or improving wrinkles as it has been found to increase collagen production of skin cells.
  • FIG. 1 is a result of confirming the inhibitory effect of progerin-lamin A binding
  • Figure 1A in vivo PK analysis of JH4 confirmed the suppression of aging phenotype in progeria model mice injected with JH4 intraperitoneally, but very much when PO treatment Disappearing quickly is a confirmed result.
  • Figure 1B is a schematic diagram showing the formation of JH4 derivatives, in order to suppress the rapid degradation in vivo, the side chain was replaced with amino bonds (JH010) or ether bonds (SLC-D011) to confirm the synthesized JH4 derivative compounds.
  • FIG. 1C shows the effect of JH4 derivatives inhibiting Lamin A (LMNA) and progerin interactions.
  • LMNA Lamin A
  • FIG. 1D is a result of confirming the progerin expression inhibitory effect of SLC-D011 (D011) through progerin expression analysis, each compound was treated with progerin-transformed 293 cells 24 hours and confirmed progerin expression, JH4 Or D011 clearly shows an inhibitory effect on progerin expression compared to JH010.
  • 1E shows the effect of D011 on improving nuclear morphology and inhibiting progerin expression, incubating the compound with HGPS cells (AG03198, 10-year-old female; AG03199; 10-year-old female) for 48 hours.
  • FIG. 2 shows the significant in vivo effects of SLC-D011.
  • FIG. 2A shows the in vivo PK analysis of JH010 and SLC-D011. Both compounds showed an appropriate PK profile, and BA showed bioavailability.
  • Figure 2B is a result of confirming the human ERG (hERG) inhibitory effect of SLC-D011, as the hERG inhibitory effect is confirmed in JH010, as a result of confirming the effect of SLC-D011 on hERG, SLC-D011 shows hERG inhibitory effect Did.
  • hERG human ERG
  • FIG. 2C shows the effect of SLC- D011 on prolonging lifespan of Lmna G609G / G609G , a progeria model mouse, compared with SLC-D011 20 compared with an average lifespan of 14.8 weeks (maximum lifespan 15 weeks).
  • Intraperitoneal injection of mg / kg twice a week confirmed that life was extended to 19.5 weeks (up to 21 weeks), and SLC- D011 was injected into 5-week-old Lmna G609G / G609G mice.
  • Figure 2D confirms the overall morphology of the 10-week-old Lmna G609G / G609G mice injected, it was confirmed that mice injected with SLC-D011 at the same age is larger than the control mice.
  • FIG. 2E shows the effect of SLC- D011 on the lifespan of Lmna wt / G609G mice.
  • the injected group was found to have an extended average lifespan of up to 65 weeks, with the injection starting at 43 weeks of age.
  • FIG. 2F shows the entire form of Lmna wt / G609G mice injected with D011 , although weak and weak in 45-week-old Lmna wt / G609G mice, despite the same age as vehicle mice.
  • FIG. 3 shows the effect of oral administration of SLC-D011 on premature aging.
  • FIG. 3A shows that SLC-D011 is very hydrophobic and thus does not dissolve in aqueous solution.
  • the solubility was confirmed in the solution already used in the pharmaceutical formulation, and the solution based on the olein (monoolein) (right) was selected as the dissolution solution.
  • 3B shows the stability of SLC-D011, which requires heating and sonication at 80 ° C. for complete dissolution, but SLC-D011 shows the same pattern as the original compound for heating and sonication as a result of LC-MS analysis. Not confirmed.
  • Figure 3D confirms the increase in the weight of Lmna G609G / G609G mice following oral administration of SLC- D011, it was confirmed that the weight of the treated mice compared with the vehicle group was increased by 35%.
  • Figure 3E is the result of confirming the overall shape of the 8-week-old SLC-D011 treated mice, the results confirmed that the body size of the treated mouse is larger than the vehicle-mouse.
  • FIG. 4A shows that HGPS cells transformed with each vector for 48 hours were stained with H3K9me3 antibody and stained with H3K9me3 antibody.
  • H3K9me3 expression was confirmed in HGPS cells transformed with human WRN (hWRN), while H3K9me3 expression was not observed in HGPS cells transformed with mouse WRN (mWRN).
  • Figure 4B shows the human specific dual region involved in progerin-WRN binding, wherein the beads bound to GST WRN-R1 (non-repeatable peptide) and WRN-R2 (redundant peptide) were GFP-LmnA or progerin traits. Incubated with the injected 293 cell lysates and centrifuged to perform immunoplow assay, followed by Western blot analysis confirming the bound GFP protein.
  • Figure 4C shows the effect of WRN-R2 inhibits the interaction of Lamin A with progerin, 293 lysate and GRN-Lamine A transformed bead-bound GST-progerin with WRN-R1 or R2 The incubation in the presence or absence of the present condition, it was confirmed that the amine A-progerin interaction was clearly reduced in the group to which the recombinant WRN-R2 is added.
  • 4D shows the effect of recombinant WRN-R2 peptides inducing H3K9me3 and improving nuclear malformations after 24 hours of insertion of WRN-R1 and R2 peptides into HGPS cells using protein transport reagents.
  • H3K9me3 expression was increased in the cells and the nuclear shape was confirmed.
  • 4E shows that H3K9me3 expression was induced by progerin removal in Werner syndrome (WS) patient cells.
  • WS cells were transformed with si-control or si-progerin for 48 hours and H3K9me3.
  • Staining with antibody and DAPI nuclear staining
  • Figure 4F is a result confirming the effect of the SLC-D011 to improve the nuclear malformation of WS cells, incubated for 48 hours WS cells and SLC-D011 and confirmed by staining with Lamin A / C antibody and DAPI.
  • 4G shows the effect of induction of H3K9me3 expression by SLC-D011 in WS cells after 48 hours of incubation of SLC-D011 with WS cells, and the WS cells expressing very low H3K9me3 by SLC-D011 treatment. It was confirmed that H3K9me3 expression was clearly induced.
  • FIG. 5 is a result of confirming the effect of SLC-D011 in human skin keratinocytes HaCaT cells and fibroblasts
  • Figure 5A was treated with SLC-D011 in HaCaT cells after incubation for 24 hours confirmed the amount of collagen 1A expression in HaCaT cells
  • FIG. 5B shows collagen 1A after 24 hours incubation with SLC-D011 in normal fibroblasts 9N (GM 00038, 9-year-old female) and N46 (AG13299, 46-year-old male). Western blot analysis results confirmed the expression level.
  • the present invention can provide a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating aging-related diseases containing a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is (7S)-(+)-8,8-dimethyl-7- (3-phenyl-allyloxy) -7,8-di Hydro-6H-pyrano [3,2-g] chromen-2-one ⁇ (7S)-(+)-8,8-Dimethyl-7- (3-phenyl-allyloxy) -7,8-dihydro- 6H-pyrano [3,2-g] chromen-2-one (SLC-D011) ⁇ .
  • the aging-related disease may be premature ejaculation.
  • the premature ejaculation may be selected from the group consisting of Werner syndrome and Hutchinson Gilford syndrome.
  • the compound represented by Formula 1 and a pharmaceutically acceptable salt thereof may inhibit the binding between progerin and lamin A.
  • the pharmaceutical composition is any one selected from the group consisting of injections, granules, powders, tablets, pills, capsules, suppositories, gels, suspensions, emulsions, drops or solutions according to conventional methods
  • the pharmaceutical composition is a suitable carrier, excipient, disintegrant, sweetener, coating agent, swelling agent, lubricant, glidant, flavoring agent, antioxidant, buffer, bacteriostatic agent, which are commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions, It may further comprise one or more additives selected from the group consisting of diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants.
  • the carriers, excipients and diluents are lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil can be used, and solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules.
  • solid preparations may be prepared by mixing at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin and the like in the composition.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin and the like
  • lubricants such as magnesium styrate and talc may also be used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, syrups, and the like, and may include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, and the like.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • Witsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like may be used as the base material of the suppository.
  • the pharmaceutical composition is intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrasternal, transdermal, nasal, inhaled, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal Via the route can be administered to the subject in a conventional manner.
  • the preferred dosage of the compound represented by Formula 1 may vary depending on the condition and weight of the subject, the type and extent of the disease, the drug form, the route of administration, and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. According to one embodiment of the present invention, but not limited thereto, the daily dosage may be 0.01 to 200 mg / kg, specifically 0.1 to 200 mg / kg, more specifically 0.1 to 100 mg / kg. Administration may be administered once a day or divided into several times, thereby not limiting the scope of the invention.
  • the 'subject' may be a mammal including a human, but is not limited thereto.
  • the present invention can provide a cosmetic composition for preventing or improving wrinkles comprising a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound represented by Chemical Formula 1 and its pharmaceutically acceptable salt may improve collagen production in keratinocytes and fibroblasts.
  • the cosmetic composition may include conventional auxiliaries such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and a carrier, in addition to the compound represented by Formula 1 as an active ingredient.
  • auxiliaries such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and a carrier, in addition to the compound represented by Formula 1 as an active ingredient.
  • the cosmetic composition may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, oils, powder foundations, emulsion foundations, It may be formulated as a wax foundation and spray, but is not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a sun cream, a flexible lotion, a convergent lotion, a nourishing lotion, a nourishing cream, a massage cream, an essence, an eye cream, a pack, a spray or a powder.
  • the formulation is a paste, cream or gel
  • animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicon, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as a carrier component.
  • the formulation is a powder or a spray
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, in particular in the case of a spray additionally chlorofluorohydrocarbon, propane / butane Or propellants such as dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizer or emulsion is used as carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3 Fatty acid esters of butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan.
  • liquid carrier diluents such as water, ethanol or propylene glycol
  • suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, microcrystalline cellulose as carrier components , Aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant and the like can be used.
  • optical rotations were measured on a JASCO DIP-360 automatic digital polarimeter, and the purity of the chiral material was measured by HPLC (Shimadzu LC-6AD, Japan), column (CHIRACEL OD-H 0.46 cm ⁇ x 25 cm, DAICEL). CHEMICAL IND., Co. Osaka, Japan).
  • Silica gel for the material separation was used SiliaFlash® P60 (SILICYCLE, 230 ⁇ 400mesh), thin film TLC plate was used TLC silica gel 60 F254 (MERCK).
  • Solvents and reagents used in the synthesis of materials were purchased from Sigma-Aldrich, Fluka, TCI, Junsei, Duksan pure chemical, SK Chemical and SAMCHUN chemical.
  • Diisobutylalumminium hydride 1M solution (DIBAL-H; 1M solution in hexane, 74 ml, 74.0 mmol, 3 eq) was slowly added dropwise to the reaction solution over 30 minutes, and then the reaction temperature was adjusted to 0 ° C. Methanol (22 ml) was slowly added dropwise while stirring to raise for 1 hour.
  • DIBAL-H 1M solution in hexane, 74 ml, 74.0 mmol, 3 eq
  • reaction solution was transferred to room temperature, stirred for 30 minutes, and a saturated aqueous solution of Rochelle's salt (88 ml) was added thereto.
  • the reaction mixture was stirred vigorously at room temperature for 2 hours, separated twice with dichloromethane (300 ml) and distilled water (300 ml), and the organic layers were collected and dehydrated with sodium sulfate. The filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • PBr3 phosphorous tribromide, 253.6 ⁇ l, 2.608 mmol, 0.35 eq
  • Diisobutylaluminum hydride 1M solution (DIBAL-H; 1M solution in hexane, 74 ml, 74.0 mmol, 3 eq) was slowly added dropwise to the reaction solution over 30 minutes, and then the reaction temperature was increased to 0 ° C. for 1 hour. Methanol (22 ml) was slowly added dropwise with stirring.
  • reaction solution was transferred to room temperature, stirred for 30 minutes, and a saturated aqueous solution of Rochelle's salt (88 ml) was added thereto.
  • the reaction mixture was stirred vigorously for 2 hours at room temperature, and partitioned twice with dichloromethane (300 ml) and distilled water (300 ml).
  • Trimethylamine (Et3N, 1.04 ml, 7.45 mmol, 1 eq)
  • 4-dimethylaminopyridine (4-dimethylaminopyridine, 4-DMAP, 92 mg, 0.75 mmol, 0.1 eq)
  • di-talt-butyl-dicarbonate (di- tert-butyl-dicarbonate, Boc 2 O, 2.57 ml, 11.18 mmol, 1.5 eq) was added sequentially, and the reaction solution was stirred at room temperature for 2 hours.
  • Lmna G609G / 609G mice were generated through the proper mating of the heterozygous Lmna + / G609G provided by Carlos Lopez-Otin (Universidad de Oviedo, Asturias, Oviedo, Spain).
  • SLC-D011 20 mg / kg mixed with DMOS and PBS was injected intraperitoneally twice a week in 5 week old mice.
  • SLC-D011 dissolved in a concentration of 10 mg / ml in an olein-based solution was orally administered to the mice five times a week, control mice were administered only olein-based solution under the same conditions.
  • Lmna G609G / 609G mice started dosing at 5 weeks of age and were treated with fresh compound solution throughout their lifetime. Lmna + / G609G mice started intraperitoneal treatment at 32 weeks of age.
  • HGPS patients (AG03198, 10-year-old female; AG03199; 10-year-old female), WS patients (AG06300, 37-year-old male; AG03141, 30-year-old female; AG00780, 60-year-old male) and control (GM 00038, 9-year-old female) human fibroblasts obtained from Coriell Cell Repositories (Camden, New Jersey, USA), EMEM medium or antibiotic containing 15% FBS, 2 mM glutamine And maintained in HEMEM containing 26 mM HEPES.
  • HEK293 cell lines were obtained from ATCC and maintained at 37 ° C. using DMEM liquid medium containing 10% FBS and 1% antibiotic.
  • GFP Fluorescence Activated protein
  • GST Glutathione S-transferase
  • Actin 1: 10000; sc-47778; Santa Cruz Biotechnology
  • Lamin A / C 1: 10000; sc-376248; Santa Cruz Biotechnology
  • Progerin Progerin; 1: 300; sc-81611; Santa Cruz Biotechnology
  • Progerin 1: 300; ab66587; Abcam
  • Antibodies such as H3K9me3 (1; 2000; Ab8898; Abcam
  • Lamin A-C Lamin A C-terminal region
  • Progerin C Progerin C
  • the WRN-R1 region (hWRN 424-450) and WRN-R2 region (hWRN 424-476) were produced in a similar manner. Each fragment was loaded into GSH-agarose, washed extensively and eluted using a buffer containing 20 mM reduced glutathione.
  • the eluted fragments were further purified using anion exchange chromatography (HitrapQ) to obtain the WRN-R1 and WRN-R2 amino acid sequences as follows.
  • WRN-R1 HLSPNDNENDTSYVIESDEDELEMEMLK
  • WRN-R2 HLSPNDNENDTSYVIESDEDELEMEMLK HLSPNDNENDTSYVIESDEDELEMEMLK
  • the membrane was incubated with the primary antibody for 1 hour to overnight at 4 ° C. and then reacted for 1 hour at room temperature with the secondary antibody.
  • Peroxidase activity was confirmed by chemiluminescence according to the manufacturer's instructions using the ECL kit (Intron, Seoul, Korea).
  • GST glutathione S-transferase
  • the GST-based fusion lamin AC-terminal region, progerin-C-terminal region, WRN-R1 region or WRN-R2 region was GFP tagged progerin (GFP-Progerin) and lamin A (GFP).
  • GFP-Progerin GFP tagged progerin
  • GFP lamin A
  • anti-lamin A / C, progerin or H3K9Me3 is diluted 1: 200 in blocking buffer to incubate with cells overnight and subsequently anti-goat Ab-FITC or anti-rabbit Ab- Blocking buffer containing rhodamine (1: 500) was incubated for 7 hours and nuclei stained with DAPI. Thereafter, immunofluorescence signals were detected using fluorescence microscopy (Zeiss and Logos).
  • GFP-progerin and GFP-fusion lamin A expression vectors were provided by T. Misteli (National Cancer Institute [NCI], Bethesda, Maryland, USA), and Myc-human WRN vectors and Myc-mouse WRN vectors were purchased from Addgene. .
  • PULSin Polyplus Transfection, New York, USA
  • PULSin reagent 8 ⁇ l was added. The mixture was incubated at room temperature for 15 minutes before cells were added. After 3 hours the serum free medium was replaced with medium containing 10% FBS and incubated for 4 hours. The mixture containing medium was then removed from the wells and filled with fresh medium containing serum.
  • DAPI stained cells were counted in immunofluorescence images.
  • PK pharmacokinetic
  • Hutchinson Gilford's syndrome is a well-known progerin syndrome, a rare genetic disorder. Genetic causes include a single point mutation in Lamin A resulting in abnormal donor conjugation, resulting in progerin with the C-terminal 50 amino acid deleted therein.
  • the inventors of the present invention confirmed that the nuclear malformation of HGPS cells was due to a very strong binding between Lamin A and progerin, and the progerin inhibitor (JH4) from Lamin A binding improved nuclear deformation of HGPS cells. Aging related markers such as, p16 / INK4A, DNA-PK, and H3K9me3 expression were restored. In addition, JH4 treatment via intraperitoneal injection (i.p) prolonged the lifespan of progerin model mice for about 4 weeks.
  • HGPS patients had a very thin blood vessel wall, and intravenous injection was not an appropriate delivery method, confirming the possibility of oral administration of JH4.
  • JH4 JH010 and SLC-D011 compounds exhibited similar activities to JH4, and as shown in FIG. 1D, it was confirmed to exhibit an effect of inhibiting progerin expression.
  • JH010 and SLC-D011 improved the bioavailability (B.A) by 70% and 66%, respectively.
  • SLC-D011 as well as JH4 showed very low water solubility, and since such low water solubility is a problem for compound delivery through oral administration, a suitable solution can be screened to increase the SLC-D011 dissolution rate.
  • Olein-based solutions are also well suited as SLC-D011 carriers because they can increase intestinal absorption without toxicity.
  • SLC-D011 prepared in oral dosage form dissolved in an oleine-based solution was orally administered to Lamn G609G / G609G mice to confirm the in vivo effect. As shown in FIGS. 3C and 3D, the lifespan of Lamn G609G / G609G mice was increased. Extended to 4.5 weeks, weight gain was noted.
  • Olein-based SLC-D011 solution was found to be very useful for HGPS treatment.
  • human and mouse WRN were transfected into HGPS cells and confirmed nuclear morphology and H3K9me3 expression.
  • WRN-R2 was a natural progerin inhibitor.
  • the recombinant WRN-R2 was treated with HGPS cells and WS cells.
  • FIG. was normalized, and H3K9me3 expression was confirmed to be improved.
  • SLC-D011 improved nuclear morphology and cell proliferation similar to HGPS in cells of WS patients, and induced expression of H3K9me3 as in 4G.
  • SLC-D011 can be used to treat Werner's syndrome, which is an adult prematurity.
  • Human skin keratinocytes were incubated with HaCaT cells and normal fibroblasts 9N (GM 00038, 9-year-old female) and N46 (AG13299, 46-year-old male) treated with 2 or 5 ⁇ M SLC-D011 for 24 hours. Afterwards, collagen 1A expression levels were confirmed in HaCaT cells and fibroblasts.
  • SLC-D011 was confirmed to exhibit an effect of increasing the collagen expression in human fibroblasts and keratinocytes.
  • the SLC-D011 compound is suitable as a progerin-lamin A binding inhibitor, and the SLC-D011 compound may be provided for oral administration, so that it may be used as an effective anti-corrosive agent or a composition for improving wrinkles.

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Abstract

본 발명은 신규한 데커신 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 신규한 데커신 유도체는 우수한 프로게린 발현 억제 효과 및 프로게린 및 라민 A의 결합 억제 효과를 나타내었으며, 조로증이 유도된 동물 모델의 생존 기간을 연장시키는 것이 확인됨에 따라, 본 발명의 화합물은 조로증 등과 같은 노화관련 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

데커신 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물
본 발명은 신규한 데커신 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
인간의 수명이 증가함에 따라, 노화의 진행 과정에 대한 관심이 활발히 제기되고 있으나, 아직도 명확히 밝혀지지 않은 부분이 많으며, 최근 연구는 주로 인간 조로증을 대상으로 유전적 또는 분자적인 노화 메커니즘에 대해 이루어지고 있다.
조로증 또는 허친슨 길포드 증후군(Hutchinson Gilford progria syndrome, HGPS)은 어린 아이들에게 조기 노화 현상이 나타나는 치명적이고 희귀한 유전 질환으로, 조로증을 가진 소아의 경우, 초기 유아기에는 정상적인 모습을 보이지만 약 9-24개월이 되면 심각한 성장 지연을 보이기 시작하여 결국 키가 작고 몸무게가 적게 나가는 양상을 보인다. 특징적인 얼굴형을 갖고 있으며 전신 죽상경화증, 심혈관계 질환, 뇌졸증, 고관절 탈골 등이 나타나며, 피부 아래 지방층이 손실되고, 손톱의 결함, 관절의 경질, 골격 손상 등이 나타나게 된다. 이러한 조로증 소화 환자들은 심장 질환으로 인해 보통 8-21세에 사망하며 평균 수명이 13세 정도이다.
HGPS는 매우 드문 상염색체 우성 유전적 질병으로, 라민 A(Lamin A, LMN A)의 G608G의 침묵 돌연변이에 의해 발생한다. 상기 돌연변이는 새로운 절단 도너 사이트를 생성하고, 라민 A의 C-말단 도메인의 50개의 아미노산이 결실된 선택적인 절단 부위 산물인 프로게린(Progerin, Prg)을 생산한다.
프로게린의 발현은 핵막 불규칙성 또는 핵-세포질 라민 A의 감소와 같은 형태학적인 변화를 유발하며, 프로게린의 발현을 저해할 경우 핵 변형의 감소가 유발되는 바, HGPS의 주요 인자로 확인되었다.
이에 따라, 조로증 치료 방법으로 프로게닌의 파네실화(farnesylation)를 저해시키거나, 자가포식(autophage)을 이용하여 파네실화된 라민 A를 제거하여 프로게닌을 완화시키는 방법이 있으나, 두 경우 모두 부작용 문제가 있으며 현재까지는 조로증의 근본적인 치료 방법에 대해 보고되어 있지 않다.
본 발명은 프로게린과 라민 A의 결합을 억제하는 신규한 화합물을 제공하며, 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 조로증과 같은 노화관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물로 제공하고자 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018004812-appb-I000001
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018004812-appb-I000002
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 주름 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018004812-appb-I000003
본 발명에 따른 신규한 화합물은 조로증이 유도된 세포 및 동물모델에서 우수한 프로게린 발현 및 프로게린과 라민 A의 결합 억제 효과를 나타내었으며, 특히 경구투여로 복강내 주사와 유사한 수준으로 프로게린과 라민 A의 결합 억제 효과 및 조로증이 유도된 동물 모델의 생존 기간을 연장시키는 것으로 확인됨에 따라, 본 발명의 화합물은 허친슨 길포드 증후군(Hutchinson Gilford progria syndrome, HGPS) 및 베르너 증후군(werner syndrome)과 같은 노화관련 질환 치료에 효과적으로 사용될 수 있으며, 본 발명의 신규한 화합물이 피부 세포의 콜라겐 생성을 증가시키는 것으로 확인됨에 따라 주름 예방 또는 개선용 화장료조성물로 제공될 수 있다.
도 1은 프로게린-라민 A 결합 억제 효과를 확인한 결과로, 도 1A는 JH4의 생체 내 PK 분석결과로 JH4가 복강 내 주사된 프로게리아 모델 마우스에서 노화 표현형 억제가 확인되었으나, PO 처리 시 매우 빠르게 사라지는 것이 확인된 결과이다. 도 1B는 JH4 유도체 형성을 나타낸 모식도로, 생체 내에서 빠른 분해되는 것을 억제하기 위해 곁사슬을 아미노 결합(JH010) 또는 에테르 결합(SLC-D011)으로 대체하여 합성된 JH4 유도체 화합물을 확인한 결과이다. 도 1C는 JH4 유도체가 라민 A(Lamin A; LMNA) 및 프로게린 상호작용을 억제하는 효과를 확인한 결과로, 비드가 결합된 LMNA를 GFP-프로게린으로 형질전환된 293 세포 용해물과 각각의 화합물을 함께 인큐베이션하여 결합 억제 분석을 수행한 결과이다. 도 1D는 프로게린 발현 분석을 통하여 SLC-D011 (D011)의 프로게린 발현 억제효과를 확인한 결과로, 각 화합물을 프로게린으로 형질전환된 293 세포에 24시간 처리하고 프로게린 발현을 확인한 결과, JH4 또는 JH010와 비교하여 D011이 명확하게 프로게린 발현을 억제효과를 나타내는 것을 확인한 결과이다. 도 1E는 D011가 핵 형태를 개선하고 프로게린 발현을 억제시키는 효과를 확인한 결과로, HGPS 세포 (AG03198, 10-year-old female; AG03199; 10-year-old female)와 화합물을 48시간 동안 인큐베이션한 후 프로게린(적색)을 염색한 결과 화합물들은 비정상적인 핵의 형태를 개선시켰으며, 특히 D011의 개선 효과가 우수한 것이 확인된 결과이며, DAPI는 DNA를 의미한다. 도 1F는 JH010 및 D011에 의한 H3K9me3 발현 유도 효과를 확인한 면역염색 결과로, H3K9me3 억제는 조로증 세포에서 매우 잘 알려진 마커이며 면역염색 결과, 모든 화합물은 HGPS 세포에서 H3K9me3 발현을 효과적으로 dbehg하는 결과를 나타내었다.
도 2는 SLC-D011의 생체 내 유의적인 효과를 확인한 결과로, 도 2A는 JH010 및 SLC-D011의 생체 내 PK 분석결과로, 두 화합물 모두 적절한 PK 프로필을 나타내었으며, B.A는 생물학적 이용 가능성(bioavailability)을 의미한다. 도 2B는 SLC-D011의 사람 ERG (hERG) 억제효과를 확인한 결과로, JH010에서 hERG 억제효과가 확인됨에 따라, SLC-D011가 hERG에 미치는 영향을 확인한 결과, SLC-D011는 hERG 억제 효과가 나타나지 않았다. 도 2C는 SLC-D011가 프로게리아 (progeria) 모델 마우스인 LmnaG609G / G609G 의 수명 연장에 미치는 효과를 확인한 결과로, 평균 수명이 14.8 주(최대 수명 15주)인 것과 비교하여 SLC-D011 20 mg/kg을 일주일에 두 번 복강 내 주사한 경우 19.5주로 수명이 연장된 것을 확인한 결과이며(최대 21주), SLC-D011는 5주령 LmnaG609G / G609G 생쥐에게 주사되었다. 도 2D는 주사된 10주령 LmnaG609G / G609G 생쥐의 전체 형태를 확인한 결과로, 동일한 연령에서 SLC-D011 주사된 생쥐는 대조군 생쥐보다 더 큰 것이 확인되었다. 도 2E는 Lmnawt / G609G 생쥐의 수명에 미치는 SLC-D011의 효과를 확인한 결과로, vehicle (ave=44.6 및 max=46) 및 JH4 (ave=54 및 max=56)와 비교하여 SLC-D011가 주사된 그룹은 평균 수명이 65주까지 연장된 것을 확인한 결과로, 주사는 43주령부터 시작하다. 도 2F는 D011가 주사된 Lmnawt / G609G 생쥐의 전체 형태로, vehicle 생쥐와 동일한 연령임에도 불구하고 45주령 Lmnawt / G609G 생쥐에게서는 병약하고 약한 모습이 확인되지 않았다.
도 3은 SLC-D011의 경구 투여가 조로(premature aging)에 미치는 효과를 확인한 결과로, 도 3A는 용해도를 확인한 결과로, SLC-D011는 매우 소수성을 나타내므로 수용액에 용해되지 않는 것이 확인되었으며(왼쪽), 상기 문제점을 해결하기 위해, 이미 의약적 제형으로 사용되고 있는 용액에서 용해도를 확인한 결과, 올레인(monoolein) 기반의 용액(오른쪽)이 용해 용액으로 선택되었다. 도 3B는 SLC-D011의 안정성을 확인한 결과로, 완전한 용해를 위해서는 80℃의 가열 및 초음파 처리 단계가 요구되나 SLC-D011는 LC-MS 분석결과 가열 및 초음파 처리에도 원래 화합물과 동일한 패턴을 나타내어 분해되지 않는 것이 확인되었다. 도 3C는 SLC-D011의 경구투여에 의한 LmnaG609G / G609G 생쥐의 수명 연장 효과를 확인한 결과로, 올레인 용액에 용해된 SLC-D011를 5주령 생쥐에 매일 50 mg/kg 씩 경구투여한 결과 vehicle (ave=14.9 및 max=15.5)과 비교하여 경구투여된 그룹의 수명이 연장(ave=19.3 및 max=19.5)되었다. 도 3D는 SLC-D011의 경구투여에 따른 LmnaG609G / G609G 생쥐의 몸무게 증가를 확인한 결과로, vehicle 그룹과 비교하여 처리된 생쥐의 몸무게가 35% 증가된 것을 확인하였다. 도 3E는 8주령 SLC-D011 처리된 생쥐의 전체 형태를 확인한 결과로, 처리된 마우스의 몸 크기가 vehicle-마우스보다 커진 것을 확인한 결과이다.
도 4는 베르너 증후군(werner syndrome) 세포에서 SLC-D011의 조로(premature aging) 개선 효과를 확인한 결과로, 도 4A는 각각의 벡터로 48시간 형질전환 시킨 HGPS 세포를 고정 후 H3K9me3 항체로 염색하여 H3K9me3 발현 수준을 확인한 결과로, 사람 WRN (hWRN)으로 형질전환된 HGPS 세포에서는 H3K9me3 발현이 확인된 반면, 마우스 WRN (mWRN)로 형질전환된 HGPS 세포에서는 H3K9me3 발현이 나타나지 않았다. 도 4B는 프로게린-WRN 결합에 관련된 사람 특이적 이중 영역을 확인한 결과로, 비드가 결합된 GST WRN-R1 (비반복적인 펩타이드) 및 WRN-R2 (중복 펩타이드)를 GFP-LmnA 또는 프로게린 형질주입된 293 세포 용해물과 인큐베이션하고 원심분리하여 면역 침강(pull down assay) 분석을 수행한 후 결합된 GFP 단백질을 확인한 웨스턴 블롯 분석결과이다. 도 4C는 WRN-R2가 라민 A와 프로게린의 상호작용을 억제하는 효과를 확인한 결과로, 비드가 결합된 GST-프로게린을 GFP-라민 A로 형질전환된 293 용해물과 WRN-R1 또는 R2가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 인큐베이션한 결과, 재조합 WRN-R2이 첨가된 그룹에서 라민 A-프로게린 상호작용이 확실하게 감소된 것을 확인한 결과이다. 도 4D는 단백질 운반 시약을 이용하여 WRN-R1 및 R2 펩타이드를 HGPS 세포에 24시간 삽입시킨 후 재조합 WRN-R2 펩타이드가 H3K9me3를 유도하고 핵 기형을 개선한 효과를 확인한 결과로, WRN-R2가 운반된 세포에서 H3K9me3 발현이 증가하였으며 핵 모양이 개선된 것을 확인한 결과이다. 도 4E는 베르너 증후군(WS) 환자 세포에서 프로게린 제거를 통한 H3K9me3 발현 유도 여부를 확인한 결과로, WS 세포를 si-대조군 (non-target sequence) 또는 si-프로게린으로 48시간 동안 형질전환시키고 H3K9me3 항체 및 DAPI (핵 염색)로 염색한 결과 siRNA를 이용하여 프로게린을 발현 억제시킨 WS 세포에서는 H3K9me3 발현이 유도되었으며, 핵 크기가 감소되었다. 도 4F는 SLC-D011가 WS 세포의 핵 기형을 개선시킨 효과를 확인한 결과로, WS 세포와 SLC-D011을 48시간 동안 인큐베이트하고 라민 A/C 항체 및 DAPI로 염색하여 확인한 결과이다. 도 4G는 WS 세포와 SLC-D011를 48시간 인큐베이션한 후 IF 염색하여 WS 세포에서 SLC-D011에 의한 H3K9me3 발현 유도 효과를 확인한 결과로, SLC-D011 처리에 의해 H3K9me3가 매우 낮게 발현되는 WS 세포에 H3K9me3 발현이 명확하게 유도된 것을 확인하였다.
도 5는 사람 피부 케라틴세포인 HaCaT 세포 및 섬유아세포에서 SLC-D011의 효과를 확인한 결과로, 도 5A는 HaCaT 세포에 SLC-D011를 처리하여 24시간 인큐베이션한 후 HaCaT 세포에서 콜라겐 1A 발현량을 확인한 웨스턴 블롯 분석결과이며, 도 5B는 정상 섬유아세포 9N (GM 00038, 9-year-old female) 및 N46 (AG13299, 46-year-old male)에 SLC-D011를 처리하여 24시간 인큐베이션한 후 콜라겐 1A 발현량을 확인한 웨스턴 블롯 분석결과이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018004812-appb-I000004
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018004812-appb-I000005
보다 상세하게는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 (7S)-(+)-8,8-디메틸-7-(3-페닐-알릴옥시)-7,8-디하이드로-6H-피라노[3,2-g]크로멘-2-온 {(7S)-(+)-8,8-Dimethyl-7-(3-phenyl-allyloxy)-7,8-dihydro-6H-pyrano [3,2-g]chromen-2-one (SLC-D011)}일 수 있다.
상기 노화 관련 질환은 조로증일 수 있다.
보다 상세하게는 상기 조로증은 베르너 증후군 및 허친슨 길포드 증후군으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 프로게린과 라민 A간의 결합을 억제할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 주름 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018004812-appb-I000006
상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 케라틴세포 및 섬유아세포에서 콜라겐 생성을 향상시킬 수 있다.
상기 화장료조성물은 유효성분인 화학식 1로 표시되는 화합물 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜,실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<참고예> 물질 및 장비
1H 및 13C NMR 스펙트럼은 JNM-AL 400 spectrometer (400MHz, JEOL, Japan)를 이용하여 측정되었고, 녹는점 (Melting point)은 Electrotheramal melting point apparatus (Yamaco. MD-S3)에서, 질량분석을 위한 기기로는 API 2000 LC/MS/MS spectrometer(PE Sciex, Canada)를 각각 사용하여 수행하였다.
또한, 편광도 (Optical rotations)는 JASCO DIP-360 automatic digital polarimeter에서 측정되었으며, 카이랄 물질에 대한 순도측정은 HPLC (Shimadzu LC-6AD, Japan), 컬럼(CHIRACEL OD-H 0.46cmф x 25cm, DAICEL CHEMICAL IND., Co. Osaka, Japan)을 사용하여 측정하였다.
물질 분리를 위한 실리카겔(Silica gel)은 SiliaFlash®P60 (SILICYCLE, 230~400mesh)를 사용하였으며, 박막 TLC 판은 TLC silica gel 60 F254 (MERCK) 제품을 사용하였다.
물질의 합성에 사용된 용매와 시약은 Sigma-Aldrich, Fluka, TCI, Junsei, Duksan pure chemical, SK Chemical 및 SAMCHUN chemical 사에서 Reagent 등급을 구입하여 사용하였다.
< 실시예 1> 에테르 형(Ether-form)의 (+)- 데커신 ( decursin ) 유도체 합성(SLC-D011)
하기 반응식 1 및 2와 같은 과정으로 (7S)-(+)-8,8-디메틸-7-(3-페닐-알릴옥시)-7,8-디하이드로-6H-피라노[3,2-g]크로멘-2-온 {(7S)-(+)-8,8-Dimethyl-7-(3-phenyl-allyloxy)-7,8-dihydro-6H-pyrano[3,2-g]chromen-2-one; SLC-D011}을 합성하였다.
1. 합성과정 Ⅰ
[반응식 1]
Figure PCTKR2018004812-appb-I000007
단계(Ⅰ) : 100 ml 라운드 플라스크에 트랜스-신남산(trans-cinnamic acid; D011a, 5 g, 33.7 mmol)을 메탄올(50 ml)로 용해시킨 후, 농축된 H2SO4 5방울을 넣고 80℃에서 24시간 동안 가열하여 환류시키고, 반응혼액을 실온으로 냉각시킨 후 감압농축하였다.
그 후 디클로로메탄(300 ml)과 증류수(300 ml)로 분액하여 유기층을 모아 황산나트륨(sodium sulfate)으로 탈수 후 여과하였다.
여과 후 얻은 여액을 감압 농축하여 순수한 생성물인 3-페닐-아크릴산, 메틸 에스테르(3-phenyl-acrylic acid, methyl ester; D011b, 5.39 g, yield= 98.5%)를 얻었으며 이를 다음 단계에 적용하였다.
단계(Ⅱ) : N2 가스가 충전된 500 ml 라운드 플라스크에 3-페닐-아크릴 산, 메틸 에스터(3-phenyl-acrylic acid, methyl ester; D011b, 4g, 24.7mmol, 1eq)를 넣고 무수 디클로로메탄(dichloromethane)으로 용해시킨 후, -78℃로 맞춰진 저온반응기에 설치하였다.
반응액에 디이소부틸알루미늄 하이드라이드(Diisobutylalumminium hydride) 1M 용액 (DIBAL-H; 1M solution in hexane, 74 ml, 74.0 mmol, 3 eq)을 30분에 걸쳐 천천히 적가한 후, 반응온도를 0℃로 높여 1시간 동안 교반하면서, 메탄올 (22 ml)을 천천히 적가하였다.
상기 반응액을 실온으로 옮겨 30분간 교반한 후 포화 로셀염 수용액(Rochelle's salt, 88 ml)을 가하였다.
반응혼합액을 실온에서 격렬하게 2시간 동안 교반하고 디클로로메탄 (300 ml)과 증류수 (300ml)로 2회 분액한 후 유기층을 모아 황산 나트륨(sodium sulfate)으로 탈수 후, 여과하여 여액을 감압농축 하였다.
농축액은 실리카겔 컬럼분리(ethyl acetate : n-hexane = 3:1)를 통해 순수한 생성물 3-페닐-프로-2-펜-1-올(3-phenyl-pro-2-pen-1-ol; D011c, 3.1g, yield= 93.9%, Rf = 0.37 (2:1 n-hexane-ethyl acetate))을 얻었으며 이를 다음 단계에 적용하였다.
단계(Ⅲ) : 100 ml 라운드 플라스크에 3-페닐-프로-2-펜-1-올(3-phenyl-pro-2-pen-1-ol, D011c, 1 g, 7.45 mmol, 1 eq)을 넣고 무수 디클로로메탄(dichloromethane)으로 용해시킨 후, 수증빙용상에서 PBr3(phosphorous tribromide, 253.6㎕, 2.608 mmol, 0.35 eq)을 넣고 1시간 동안 교반하였다.
반응혼액은 농축한 후, 실리카겔 컬럼 분리 (ethyl acetate : n-hexane = 1 : 8)를 통해 순수한 생성물 (3-브로모-프로펜일)-벤젠[(3-bromo-propenyl)-benzene, D005d, 1.42 g, yield= 96.2 %, Rf = 0.34 (5:1 n-hexane-ethyl acetate)]을 얻었으며 이를 다음 단계에 적용하였다.
단계(Ⅳ) : N2 가스 하에서, 100 ml 라운드 플라스크에 (S)-(+)-데쿠시놀(decursinol) (SLC-B001, 2.33 g, 9.47 mmol, 1 eq)을 무수 N,N-디메틸포름아마이드(N,N-dimethylformamide, DMF; 10 ml)로 용해하였으며, 이를 -20℃로 설정된 저온반응기에 설치하였다.
반응혼합액에 (3-브로모-프로펜일)-벤젠 [(3-bromo-propenyl)-benzene, D005d, 2.8 g, 14.2 mmol, 1.5 eq]와 황산 나트륨 (NaH 60%, 757 mg, 18.9 mmol, 2 eq)을 넣고 4시간 동안 교반한 후 증류수 3ml을 넣고 10분 후에 저온반응기에서 꺼낸 다음 디클로로메탄 200 ml과 증류수 200 ml로 2회 분액하였으며, 유기층을 모아 황산 나트륨으로 탈수하고 여과한 후 여액을 감압 농축하였다.
농축액은 실리카겔 컬럼 분리(ethyl acetate : n-hexane = gradient elution to 1:3 from 1:10)하여 (7S)-(+)-8,8-디메틸-7-(3-페닐-알릴옥시)-7,8-디하이드로-6H-피라노[3,2-g]크로멘-2-온 {(7S)-(+)-8,8-Dimethyl-7-(3-phenyl-allyloxy)-7,8-dihydro-6H-pyrano [3,2-g]chromen-2-one (SLC-D011)} 1.21g, (35.3%)을 얻었다; 수율 35.3%, 흰색 고체, mp: 143℃, Rf = 0.39 (2:1 n-hexane-ethyl acetate); [α]25 D + 117.6 (c=1, CHCl3); 1H NMR(400MHz, CDCl3): δH 7.56(1H, d, J= 9.6Hz, H-4), 7.38-7.23(5H, m, H-5’, H-6’, H-7’, H-8’, H-9’), 7.15(1H, s, H-5), 6.76(1H, s, H-10), 6.59(1H, d, J= 16.0Hz, H-3’), 6.30-6.23(1H, m, H-2’), 6.20(1H, d, J= 9.6Hz, H-3), 4.34(1H, dd, J= 6.0, 12.8Hz, H-1a’), 4.21(1H, dd, J= 6.0, 12.4Hz, H-1b’), 3.59(1H, dd, J= 5.2, 7.6Hz, H-7), 3.07(1H, dd, J= 4.8, 16.0Hz, H-6a), 2.85(1H, dd, J= 7.2, 16.4Hz, H-6b), 1.41(3H, s CH3-8), 1.36(3H, s, CH3-8); 13C NMR (100 MHz, acetone-d6) δC 161.2(C-2), 157.8(C-9a), 155.3(C-10a), 144.5(C-4), 137.9(C-4’), 132.9(C-3'), 130.4(C-5), 129.6(C-6’,C-8'), 128.6(C-7’), 127.5(C-2’), 127.4(C-5',C-9’), 118.3(C-5a), 113.7(C-3), 113.6(C-4a), 104.5(C-10), 78.8(C-7), 76.4(C-8), 70.8(C-1’), 27.8(C-6), 26.1(CH3-8), 22.2(CH3-8); ESI-MS: m/z=363 [M+H]+ . Anal. Calc. for C23H22O4: C, 76.22; H, 6.12; Found: C, 76.20; H, 6.10.
2. 합성과정 Ⅱ
[반응식 2]
Figure PCTKR2018004812-appb-I000008
단계(Ⅰ) : 100 ml 라운드 플라스크에 트랜스-신남산(trans-cinnamic acid; D011a, 5g, 33.7mmol)을 메탄올 50ml로 용해시킨 후, 농축된 H2SO4 5방울을 넣고 80℃에서 24시간 동안 가열하여 환류시켰다. 반응혼액을 실온으로 냉각시킨 후 감압농축하고 디클로로메탄(dichloromethane; 300 ml)와 증류수 (300 ml)로 분액하여 유기층을 수집하고 황산나트륨으로 탈수한 후 여과하였다.
여과 후 얻은 여액을 감압 농축하여 순수한 생성물인 3-페닐-아크릴산, 메틸 에스테르 (3-phenyl-acrylic acid, methyl ester, D011b, 5.39 g, yield= 98.5%)를 얻었으며 상기 화합물을 다음 단계에 적용하였다.
단계(Ⅱ) : N2 가스가 충전된 500ml 라운드 플라스크에 3-페닐-아크릴산, 메틸 에스테르(D011b, 4g, 24.7mmol, 1eq)를 넣고 무수 디클로로메탄(dichloromethane)으로 용해시킨 후, -78℃로 맞춰진 저온반응기에 설치하였다.
반응액에 디이소부틸알루미늄 하이드라이드 1M 용액 (DIBAL-H; 1M solution in hexane, 74 ml, 74.0 mmol, 3 eq)을 30분에 걸쳐 천천히 적가시킨 후, 반응온도를 0℃로 높여 1시간 동안 교반하면서 메탄올 (22 ml)을 천천히 적가하였다.
반응액을 실온으로 옮겨 30분간 교반한 후 포화 로셀염 수용액(Rochelle's salt, 88 ml)을 가하였다. 반응혼액을 실온에서 격렬하게 2시간 동안 교반하고, 디클로로메탄 (300 ml)과 증류수 (300ml)로 2회 분액하였다.
유기층을 모아 황산나트륨으로 탈수하고 여과한 후 여액을 감압농축하였다.
농축액을 실리카겔 컬럼분리(ethyl acetate : n-hexane = 3:1)하여 순수한 생성물 3-페닐-프로-2-펜-1-올(3-phenyl-pro-2-pen-1-ol, D011c, 3.1g, yield= 93.9%, Rf = 0.37 (2:1 n-hexane-ethyl acetate))을 얻었으며 상기 화합물을 다음 단계에 적용하였다.
단계(Ⅲ) : N2 가스가 충전된 100ml 라운드 플라스크에 3-페닐-프로-2-펜-1-올(D011c, 1 g, 7.45 mmol, 1 eq)을 넣고 무수 디클로로메탄으로 용해시킨 후, 트리메틸아민 (Et3N, 1.04 ml, 7.45 mmol, 1 eq), 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine, 4-DMAP, 92 mg, 0.75 mmol, 0.1 eq), 디-털트-부틸-디카보네이트(di-tert-butyl-dicarbonate, Boc2O, 2.57 ml, 11.18 mmol, 1.5 eq)를 순차적으로 첨가한 후 반응액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다.
반응혼액을 농축한 후, 실리카겔 컬럼 분리(ethyl acetate : n-hexane = 1 : 30)를 수행하여 순수한 생성물 털트-부틸 신나밀 카보네이트(tert-butyl cinnamyl carbonate, D011d, 1.30 g, yield= 74.7%, Rf = 0.32 (20:1 n-hexane-ethyl acetate))을 얻었으며 상기 화합물을 다음 단계에 적용하였다.
단계(Ⅳ) : 100ml 라운드 플라스크에 털트-부틸 신나밀 카보네이트 (D011d, 1.43 g, 6.09 mmol, 1.5 eq), (S)-(+)-데쿠시놀(decursinol) (SLC-B001, 1 g, 4.06 mmol, 1 eq)를 넣고 진공 상태에서 1시간 동안 건조하였다.
건조된 혼합물을 N2 가스 하에서 무수 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran)으로 용해시키고, N2 가스를 이용하여 용해액을 1시간 동안 버블링(bubbling)한 후, 반응혼액에 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라디움 (Pd(PPh3)4, 188 mg, 0.162 mmol, 0.04 eq)을 투입한 후, 하룻밤 동안 환류시켰다. 혼합액을 감압조건하에서 농축시킨 후, 실리카겔 컬럼 분리(ethyl acetate : n-hexane = gradient elution to 1:4 from 1:8)하여 화합물 (7S)-(+)-8,8-디메틸-7-(3-페닐-알릴옥시)-7,8-디하이드로-6H-피라노[3,2-g]크로멘-2-온 {(7S)-(+)-8,8-Dimethyl-7-(3-phenyl-allyloxy)-7,8-dihydro-6H-pyrano [3,2-g]chromen-2-one (SLC-D011)} 1.20g (81.3%)을 얻었다.
수율 81.3%, 흰색 고체, mp: 143℃, Rf = 0.39 (2:1 n-hexane-ethyl acetate); [α]25 D + 117.6 (c=1, CHCl3); 1H NMR(400MHz, CDCl3): δH 7.56(1H, d, J= 9.6Hz, H-4), 7.38-7.23(5H, m, H-5’, H-6’, H-7’, H-8’, H-9’), 7.15(1H, s, H-5), 6.76(1H, s, H-10), 6.59(1H, d, J= 16.0Hz, H-3’), 6.30-6.23(1H, m, H-2’), 6.20(1H, d, J= 9.6Hz, H-3), 4.34(1H, dd, J= 6.0, 12.8Hz, H-1a’), 4.21(1H, dd, J= 6.0, 12.4Hz, H-1b’), 3.59(1H, dd, J= 5.2, 7.6Hz, H-7), 3.07(1H, dd, J= 4.8, 16.0Hz, H-6a), 2.85(1H, dd, J= 7.2, 16.4Hz, H-6b), 1.41(3H, s CH3-8), 1.36(3H, s, CH3-8); 13C NMR (100 MHz, acetone-d6) δC 161.2(C-2), 157.8(C-9a), 155.3(C-10a), 144.5(C-4), 137.9(C-4’), 132.9(C-3'), 130.4(C-5), 129.6(C-6’, C-8'), 128.6(C-7’), 127.5(C-2’), 127.4(C-5',C-9’), 118.3(C-5a), 113.7(C-3), 113.6(C-4a), 104.5(C-10), 78.8(C-7), 76.4(C-8), 70.8(C-1’), 27.8(C-6), 26.1(CH3-8), 22.2(CH3-8); ESI-MS: m/z=363 [M+H]+ . Anal. Calc. for C23H22O4: C, 76.22; H, 6.12; Found: C, 76.20; H, 6.10.
<실시예 2> 라민 A(LMN A)-프로게린 결합 억제제로서 SLC-D011의 효과 확인
1. 동물실험
동물실험은 부산국립대학교에서 승인받은 동물 정책에 따라, 인증 평가 협회 및 실험실 동물 관리 인증 기관에서 수행되었다.
Carlos Lopez-Otin (Universidad de Oviedo, Asturias, Oviedo, Spain)에서 제공받은 이형접합 Lmna+/ G609G의 적절한 교배를 통하여 LmnaG609G /609G 생쥐를 발생시켰다.
DMOS 및 PBS와 혼합한 SLC-D011 20 mg/kg을 5주령 생쥐에 일주일에 두 번 복강내 주사하였다. 또한, 올레인 기반의 용액에 10mg/ml 농도로 용해시킨 SLC-D011를 일주일에 5번 생쥐에 경구투여하였으며, 대조군 생쥐는 상기와 동일한 조건으로 올레인 기반 용액만 투여하였다.
LmnaG609G /609G 생쥐는 5주령부터 투여를 시작하였으며, 수명 내내 신선한 화합물 용액을 처리하였다. Lmna+/G609G 생쥐는 32주령부터 복강내 처리를 시작하였다.
2. 세포 배양 및 시약
HGPS 환자(AG03198, 10-year-old female; AG03199; 10-year-old female), WS patients (AG06300, 37-year-old male; AG03141, 30-year-old female; AG00780, 60-year-old male) 및 대조군(GM 00038, 9-year-old female)의 사람 섬유아 세포를 Coriell Cell Repositories (Camden, New Jersey, USA)로부터 얻었으며, 15% FBS, 2 mM 글루타민이 포함된 EMEM 배지 또는 항생제 없이 26 mM HEPES가 포함된 HEMEM에서 유지시켰다.
HEK293 세포 주는 ATCC에서 얻었으며, 10% FBS 및 1% 항생제가 포함된 DMEM 액체 배지를 이용하여 37℃에서 유지되었다.
3. 항체 및 시약
GFP (Full name; 1:1000; sc-9996; Santa Cruz Biotechnology); 글루타티온 S-전이효소(Glutathione S-transferase; GST; 1:5000; sc-138; Santa Cruz Biotechnology); 액틴 (Actin; 1:10000; sc-47778; Santa Cruz Biotechnology); 라민 A/C (Lamin A/C; 1:10000; sc-376248; Santa Cruz Biotechnology); 프로게린 (Progerin; 1:300; sc-81611; Santa Cruz Biotechnology); 프로게린 (1:300; ab66587; Abcam); H3K9me3 (1;2000; Ab8898; Abcam)와 같은 항체를 실험에 사용하였다.
4. 재조합 단백질
재조합 단백질을 생산하기 위해, PCR을 통하여 종결 코돈의 업스트림으로부터 100 AA의 클로닝하여 재조합 라민 A C-말단 영역(Lamin A-C) 및 프로게린 C-말단 영역(Progerin C)을 생산하였다.
WRN-R1 영역(hWRN 424-450) 및 WRN-R2 영역(hWRN 424-476)을 유사한 방법으로 생산하였다. 각 단편을 GSH-아가로스에 로딩한 후, 광범위하게 세척하고 20 mM 환원된 글루타티온이 함유된 버퍼를 이용하여 용출시켰다.
용출된 단편을 음이온 교환 크로마토그래피(HitrapQ)를 이용하여 추가 정제하여 하기와 같은 WRN-R1 및 WRN-R2 아미노산 서열을 얻었다.
WRN-R1: HLSPNDNENDTSYVIESDEDELEMEMLK
WRN-R2: HLSPNDNENDTSYVIESDEDELEMEMLK HLSPNDNENDTSYVIESDEDELEMEMLK
5. 웨스턴 블롯 분석
RIPA를 이용하여 전체 세포 용해물을 준비하였다.
15 ㎍ 세포 추출물을 SDS-PAGE에서 분리시키고 PVDF 막 위로 옮겼다.
막을 1차 항체와 함께 1시간 내지 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션한 후 이차 항체를 이용하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.
ECL 키트(Intron, Seoul, Korea)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라, 화학 발광으로 페록시다아제 활성을 확인하였다.
6. 단백질-단백질 상호작용 분석
단백질-단백질 상호작용을 분석하기 위해, 글루타티온 S-전이효소(Glutathione S-transferase; GST) 면역 침강(pull-down) 분석을 수행하였다.
상호작용을 검출하기 위해, GST-기반 융합 라민 A-C-말단 영역, 프로게린-C-말단 영역, WRN-R1 영역 또는 WRN-R2 영역을 GFP 태그된 프로게린(GFP-Progerin) 및 라민 A(GFP-Lamin A)가 형질주입된 HEK293 세포 용해물과 실온에서 30분간 인큐베이션하였다.
그 후, PBS로 1회 세척하고, 침전된 물질을 수집하여 SDS-PAGE에서 분리시킨 후 항-GFP 및 GST로 웨스턴 블롯을 수행하였다.
프로게린과 라민 A 결합에 대한 WRN-R1 및 R2의 경쟁반응을 확인하기 위해, WRN-R1 또는 R2 재조합 단백질이 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 GST-프로게린이 결합된 비드를 GFP-라민 A가 과발현된 293 용해물과 인큐베이션하였다.
7. 면역형광 염색 및 노화 특이적 산성의 β-갈락토시다아제 활성 염색
세포를 커버 글라스 위에 접종하고 적절한 벡터를 형질주입하였다.
100% 메탄올 또는 1% 파라포름알데하이드(PFA)를 이용하여 4℃에서 1시간 동안 고정시킨 후 세포를 블로킹 버퍼(PBS+anti-human-Ab; 1:400)로 인큐베이트하였다.
PBS로 두 번 세척한 후, 항-라민 A/C, 프로게린 또는 H3K9Me3를 블로킹 버퍼에 1:200으로 희석하여 세포와 하룻밤 동안 인큐베이트하고 연속하여 항-고트 Ab-FITC 또는 항-래빗 Ab-로다민(rhodamin)이 포함된 블로킹 버퍼(1:500)를 7시간 동안 인큐베이션하였으며, 핵은 DAPI로 염색하였다. 그 후 fluorescence microscopy (Zeiss and Logos)를 이용하여 면역 형광 신호를 검출하였다.
노화 특이적 산성-β-갈락토시다아제 활성 염색을 위해, 세포를 PBS (pH 7.2)로 한 번 세척하고 0.5% 글루타르알데하이드가 포함된 PBS로 고정하였다.
그 후 PBS로 세척하고 37℃에서 세포를 X-gal 용액으로 하룻밤 동안 염색하였다.
8. 플라즈마 형질주입 및 단백질 운반
GFP-프로게린 및 GFP-융합 라민 A 발현 벡터를 T. Misteli (National Cancer Institute [NCI], Bethesda, Maryland, USA)에게서 제공받았으며, Myc-사람 WRN 벡터 및 Myc-마우스 WRN 벡터는 Addgene에서 구입하였다.
jetPEI (Polyplus Transfection) 및 PULSin (Polyplus Transfection, New York, USA)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라, 형질주입을 수행하였다.
WRN-R1 및 R2 단백질을 HGPS 세포 내로 전달하기 위해, 제조사의 설명서에 따라 PULSin (Polyplus Transfection, New York, USA)를 사용하였다.
20 mM Hepes 200 ㎕으로 재조합 단백질(2 ㎍)를 희석한 후 PULSin 시약(8 ㎕)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 15분간 인큐베이트한 후 세포를 첨가하였다. 3시간 후 무혈청 배지를 10% FBS가 포함된 배지로 교체하고 4시간 인큐베이션하였다. 그 후 배지가 포함된 혼합물을 웰에서 제거하고 혈청이 포함된 신선한 배지를 채웠다.
9. 세포 계수
기형의 핵을 가진 세포를 계수하기 위해, 획득된 면역 형광 이미지를 사용하였다. 라민 A 염색 의존적으로 기형으로 보이는 핵막을 무작위로 선택된 구역에서 계수하고 계수된 세포를 백분율로 나타내었다.
세포 증식을 측정하기 위해, DAPI 염색된 세포를 면역 형광 이미지에서 계수하였다.
10. 화합물 약동학(pharmacokinetic; PK) 분석 및 in vitro ADME 확인
약동학(PK) 분석을 위해 JH4 5mg/kg을 용해시킨 10% DMSO, 5% Tween 90 및 95% 생리식염수 용액을 복강내 주사하였으며, JH4 10mg/kg을 용해시킨 10% NMP 및 90% PEG400 용액을 경구 투여하였다. 정해진 시간마다 JH4의 혈액 농도를 LC-MS/MS로 분석하였으며, 다른 화합물들 역시 동일한 과정으로 PK 분석하였다.
In vitro ADME 연구(플라즈마 단백질 결합, CYP 억제, 마이크로솜(microsomal) 안정성, 플라즈마 안정성 및 hERG 억제)는 표준 방법으로 신규 약물 개발 센터에서 수행되었다.
11. 프로게린-라민 A 결합 억제제로서의 SLC-D011 효과 확인
허친슨 길포드 증후군은 잘 알려진 프로게린 증후군으로 매우 드문 유전질환이다. 유전적 원인으로는 라민 A 내 한점 돌연변이가 발생하여 비정상적인 공여부 접합이 나타나고 이에 따라, C-말단 50 아미노산이 내부에서 삭제된 프로게린을 생성하게 된다.
이전 보고에서 본 발명의 발명자들은 HGPS 세포의 핵 기형은 라민 A와 프로게린 사이의 매우 강력한 결합에 의한 것임을 확인하였으며, 라민 A 결합으로부터 프로게린 억제제(JH4)는 HGPS 세포의 핵 변형을 개선시켰으며, p16/INK4A, DNA-PK, 및 H3K9me3 발현과 같은 노화 관련 마커를 회복시켰다. 또한, 복강내주사(i.p)를 통한 JH4 처리는 프로게린 모델 마우스의 수명을 약 4주간 연장시켰다.
그러나 환자의 조건을 고려할 때 HGPS 환자는 매우 얇은 혈관벽을 가져 정맥 내 주사는 적절한 전달방법이 아니므로 JH4의 경구 투여 가능성을 확인하였다.
그 결과, 도 1A, 표 1 및 표 2와 같이 정맥 내 주사 및 경구투여된 JH4는 생체 내에서 매우 짧은 반감기를 나타내었으며, 이에 따라 생체 내 이용가능성(B.A)을 확인할 수 없었다.
Figure PCTKR2018004812-appb-T000001
Figure PCTKR2018004812-appb-T000002
이에 따라, 생체 내에서 안정적인 화합물을 얻기 위해 JH4로부터 다양하게 화합물을 변형시키고, GST-면역 침강 분석(pull down assay) 및 프로게린 발현 분석을 수행하여 다른 41가지 종류의 JH4 유도체를 확인한 결과, 도 1C와 같이 JH010 및 SLC-D011 화합물이 JH4와 유사한 활성을 나타내었으며, 도 1D와 같이 프로게린 발현을 억제시키는 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
또한, 도 1E 및 1F를 참고하면, JH010 및 SLC-D011 화합물이 H3K9me3 발현을 유도하였으며, HGPS 세포의 핵 기형을 개선시켰다.
PK 분석 결과에서도 도 2A와 같이 JH010 및 SLC-D011(progerinin)은 생체 내 이용가능성(B.A)을 각각 70% 및 66% 개선시켰다.
그러나 in vitro ADME 분석 결과에서 JH010 화합물에서 hERG 이온 채널 억제가 확인됨에 따라, SLC-D011가 hERG 이온 채널에 미치는 영향을 확인한 결과, 도 2b와 같이 JH010와 비교하여 SLC-D011에서는 심각한 hERG 억제가 나타나지 않았으며, 표 3 내지 표 6과 같이 SLC-D011 화합물은 양호한 플라즈마 안정성과 CYP 억제의 적당한 범위를 나타내는 것이 확인되었다.
Figure PCTKR2018004812-appb-T000003
Figure PCTKR2018004812-appb-T000004
Figure PCTKR2018004812-appb-T000005
Figure PCTKR2018004812-appb-T000006
상기 결과와 같이 안정성이 확인된 SLC-D011의 생체 내 효과를 확인하기 위해, i.p 주사한 결과, 도 2C와 같이 LamnG609G / G609G 마우스의 수명이 20주까지 연장되었으며, 도 2D와 같이 SLC-D011 처리에 의해 몸 크기 증가 및 전체 형태(Gross morphology) 역시 개선되었다.
특히 흥미로운 것은 Lamnwt / G609G 모델에서 SLC-D011 처리에 의해 45에서 64주까지 마우스의 수명이 연장된 것으로, 도 2E를 참고하면 약 10주 수명을 연장시켰던 JH4와 비교하여 매우 향상된 결과이다. 또한, 도 2F와 같이 SLC-D011가 처리된 마우스의 털 상태 및 몸 사이즈와 같은 형태가 매우 개선된 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 SLC-D011는 HGPS에 대한 매우 우수한 후보로 제안될 수 있다.
12. SLC-D011 경구투여 효과 확인
JH4뿐만 아니라 SLC-D011은 매우 낮은 수용성이 나타났으며, 이러한 낮은 수용성은 경구 투여를 통한 화합물 전달에 문제가 되기 때문에 SLC-D011 용해율을 높일 수 있는 적합한 용액을 스크리닝하였다.
그 결과, 도 3A와 같이 올레인(monoolein) 기반의 용액이 SLC-D011을 용해시키는 데 유용한 것을 확인할 수 있었으며, 용액 내 SLC-D011은 도 3B와 같이 가열 및 초음파 처리에도 분해되지 않고 안정한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 올레인 기반의 용액은 독성 없이 장내 흡수를 증가시킬 수 있으므로 SLC-D011 운반체로 매우 적합하다.
올레인 기반의 용액에 용해시켜 경구투여용 제형으로 제조된 SLC-D011를 LamnG609G/G609G 마우스에 경구투여하여 생체 내 효과를 확인한 결과, 도 3C 및 도 3D와 같이 LamnG609G / G609G 마우스의 수명이 4.5 주까지 연장되었으며, 몸무게 증가가 확인되었다.
상기 결과로부터 올레인 기반의 SLC-D011 용액이 HGPS 치료에 매우 유용한 것으로 확인되었다.
<실시예 3> 베르너 증후군 치료제로서의 SLC-D011 효과 확인
노화에 의해 프로게린 발현이 증가하기 때문에 다른 조로증 질환인 베르너 증후군(WS)과 정상 노화 모델에서도 SLC-D011의 효과를 확인하였다.
먼저, 베르너 유전자(WRN)의 부족과 프로게리아 사이의 관련성을 확인하였다. 이전 보고에 따르면, WRN 발현이 억제된 생쥐의 몸무게 및 수명은 야생형 생쥐와 분명한 차이가 확인되지 않았으며, 본 발명에서도 역시 mWRN-/- 생쥐의 수명 및 몸 무게가 Lamnwt/G609G 생쥐와 차이를 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 마우스와 사람 WRN의 아미노산 서열을 비교한 결과, 사람 WRN에서 특이적으로 반복되는 서열(WRN-R2)을 확인되었으며, 실제로 hWRN의 중복은 반복된 cDNA로 인해 발생하였다.
hWRN와 프로게린의 관련성을 조사하기 위해, HGPS 세포 내로 사람 및 마우스 WRN를 형질주입하고 핵 형태 및 H3K9me3 발현을 확인하였다.
그 결과, 흥미롭게도 도 4A와 같이 오직 hWRN에서 핵 변형이 개선되었으며, H3K9me3 발현이 유도되었다. 또한, 단일 및 이중 반복된 아미노산으로 재조합 펩타이드를 만들고 프로게린과의 상호작용을 확인하였다.
WRN-R1과 비교한 결과, 도 4B와 같이 이중 펩타이드는 프로게린과 강하게 결합하는 것을 확인할 수 있었으며, 도 4C와 같이 WRN-R2은 프로게린과 라민 A의 상호작용을 차단하는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 WRN-R2가 천연 프로게린 억제제인 것이 확인됨에 따라, 재조합 WRN-R2를 HGPS 세포와 WS 세포에 처리한 결과, 도 4D와 같이 HGPS 세포 내로 재조합 WRN-R2가 운반된 세포에서는 핵 형태가 정상화되었으며, H3K9me3 발현이 향상된 것을 확인할 수 있었다.
그러나 프로게린이 제거된 WS 세포에서도 상기와 같은 효과가 나타나는 것이 확인됨에 따라, SLC-D011이 WS 세포 치료에 적합한 치료제로 사용될 수 있는지를 확인하기 위해, WS 세포에 SLC-D011을 처리한 후 핵 형태 및 세포 증식을 확인하였다.
그 결과, 도 4F와 같이 SLC-D011은 WS 환자의 세포에서 HGPS와 유사하게 핵 형태 및 세포 증식을 개선시켰으며, 4G와 같이 H3K9me3의 발현을 유도하였다.
상기 결과로부터 SLC-D011은 성인조로증인 베르너 증후군 치료에도 사용될 수 있음이 확인되었다.
<실시예 4> SLC-D011 화합물의 피부노화 개선 효과 확인
앞선 실험에서 SLC-D011 화합물이 노화관련 질환에 치료효과를 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 사람 피부 케라틴세포인 HaCaT 세포 및 섬유아세포에서 화합물의 영향을 확인하였다.
사람 피부 케라틴세포인 HaCaT 세포와 정상 섬유아세포 9N (GM 00038, 9-year-old female) 및 N46 (AG13299, 46-year-old male)에 2 또는 5 μM SLC-D011를 처리하여 24시간 인큐베이션한 후 HaCaT 세포 및 섬유아세포에서 콜라겐 1A 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 5A 및 도 5B와 같이 SLC-D011은 사람 섬유아세포 및 케라틴 세포에서 콜라겐 발현을 증가시키는 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들로부터 SLC-D011 화합물은 프로게린-라민 A 결합 억제제로 적합한 것으로 확인되었으며, 상기 SLC-D011 화합물은 경구 투여용으로 제공될 수 있어 효과적인 조로증 치료제 또는 주름 개선용 조성물로 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018004812-appb-I000009
  2. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018004812-appb-I000010
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 (7S)-(+)-8,8-디메틸-7-(3-페닐-알릴옥시)-7,8-디하이드로-6H-피라노[3,2-g]크로멘-2-온 {(7S)-(+)-8,8-Dimethyl-7-(3-phenyl-allyloxy)-7,8-dihydro-6H-pyrano [3,2-g]chromen-2-one (SLC-D011)}인 것을 특징으로 하는 노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 노화 관련 질환은 조로증인 것을 특징으로 하는 노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 조로증은 베르너 증후군(werner syndrome) 및 허친슨 길포드 증후군(Hutchinson Gilford progria syndrome)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  6. 청구항 2에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 프로게린과 라민 A간의 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는 노화 관련 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  7. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 주름 예방 또는 개선용 화장료조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018004812-appb-I000011
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 케라틴세포 및 섬유아세포에서 콜라겐 생성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 주름 예방 또는 개선용 화장료조성물.
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