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WO2018186720A1 - 저분자량 히알루론산의 제조 방법 - Google Patents

저분자량 히알루론산의 제조 방법 Download PDF

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WO2018186720A1
WO2018186720A1 PCT/KR2018/004127 KR2018004127W WO2018186720A1 WO 2018186720 A1 WO2018186720 A1 WO 2018186720A1 KR 2018004127 W KR2018004127 W KR 2018004127W WO 2018186720 A1 WO2018186720 A1 WO 2018186720A1
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molecular weight
hyaluronic acid
low molecular
solution
weight hyaluronic
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PCT/KR2018/004127
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English (en)
French (fr)
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엄향매
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Youreh Co Ltd
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Youreh Co Ltd
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Publication date
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Priority to US16/495,617 priority patent/US11359030B2/en
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    • A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
    • A61K2800/54—Polymers characterized by specific structures/properties

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing hyaluronic acid in the molecular weight range excellent in skin permeation and moisturizing effect
  • Hyaluronic acid based on D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine, has molecular weights ranging from hundreds of thousands to millions of Daltons, which is the same in almost all living organisms. It is a linear polymer found in structure and is mainly a constituent of extracellular matrix. It is known that there is no immune response regardless of the source because it has the same structure without differences between species. To date, it is a safe natural polysaccharide used in many fields such as degenerative arthritis, cataracts, wrinkle improvement, drug delivery, stem cell support, and cosmetic moisturizing ingredients.
  • the hyaluronic acid which is a polymer has the characteristic that density becomes high, so that molecular weight is large, and has high viscosity.
  • Hyaluronic acid is widely used as a moisturizer for cosmetics because of its ability to dissolve in water and retain a lot of moisture in its molecular structure. It is applied to creams, injections, gauze, etc. It is also used as a formulation. In addition, hyaluronic acid has been used in the field of tissue engineering for the production of porous sponge-like matrices used in wound coatings and dental matrices.
  • hyaluronic acid produced by extraction or fermentation from animal tissues is generally a polymer polysaccharide of 500,000 Daltons or more with high degree of polymerization and thus generally does not penetrate the skin.
  • hyaluronic acid of 500,000 daltons or more when applied to the skin, it can prevent evaporation of moisture from the skin because of its ability to absorb moisture in the air, but because it does not penetrate the skin, it stays on the skin surface, It is washed away, which makes it difficult to maintain the moisturizing effect of the skin.
  • hyaluronic acid of 100,000 Daltons or less can penetrate the skin, but the molecular size is small, so it lacks the property to contain moisture does not last a moisturizing effect.
  • HA up to 20,000 Daltons is known to penetrate the skin effectively but induce an inflammatory response, which is Toll-like receptors 2 and 4, receptors on macrophages in the skin. This is because the immune response can be initiated in combination with.
  • a method of lowering the molecular weight of hyaluronic acid As a method of lowering the molecular weight of hyaluronic acid, a method using gamma rays, ultrasonic waves or ultraviolet rays (Journal of Chromatography, 435, pp335-342, 1988; Int. Biol. Macrmol., P10,1988), a method using an acid or base catalyst ( Japanese Patent Application Laid-Open No. S63-57602, a method using a microfluidizer, and the like are known. However, the known methods are methods for producing hyaluronic acid of 100,000 Daltons or less, and have not been given a method for producing hyaluronic acid in a molecular weight range that can directly absorb or contain moisture.
  • An object of the present invention is to solve the problems of the prior art as described above, while maintaining the moisturizing effect of hyaluronic acid of 500,000 daltons or more used as a raw material of the existing cosmetics, while not being penetrated into the stratum corneum of the skin is washed skin.
  • Means for solving the above problems in the present invention is as follows.
  • a method for producing a low molecular weight hyaluronic acid having a molecular weight of 100,000 to 200,000 daltons comprising heat-treating an aqueous solution containing hyaluronic acid having a molecular weight of 500,000 daltons or more at a pH of 2.5 to 3.5.
  • a molecular weight 100 capable of overcoming the problem of skin permeability, which is a disadvantage of hyaluronic acid, which is used as a raw material for cosmetics can be maintained by simplifying and eliminating various existing complex methods and maintaining maximum moisturizing power as well as skin permeation.
  • the low molecular weight hyaluronic acid prepared by the method proposed in the present invention is suitable for use in cosmetics, medicinal and medical compositions, because it can penetrate the skin and maintains the maximum moisture so as to alleviate atopic symptoms. .
  • Example 1 is an HPLC chromatogram confirming the molecular weight distribution of the low molecular weight sodium hyaluronate prepared in Examples 1 to 3. (Blue: molecular weight 200,000 Dalton standard, red: Example 1, green: Example 2, black: Example 3)
  • Example 3 is an HPLC chromatogram confirming the molecular weight distribution of the low molecular weight sodium hyaluronate prepared in Examples 6 and 7 of the present invention. (Blue: molecular weight 200,000 Dalton standard, red: Example 6, green: Example 7)
  • Figure 4 is an HPLC chromatogram confirming the molecular weight distribution of sodium hyaluronate prepared in Comparative Examples 1 to 3. (Blue: molecular weight 200,000 Daltons standard, red: molecular weight 100,000 Daltons standard, green: Comparative Example 1, black: Comparative Example 2, pink: Comparative Example 3))
  • Example 6 is applied to the fluorescent labeled samples of Example 4, control and Comparative Example 7 by 10 ⁇ L (10 ⁇ g / ml) in the back of Balb / c-nude mice, the left side of the mouse after 15 minutes, the right side After 30 minutes, washed with PBS buffer immediately after removal of residue, after 30 minutes, after 1 hour, after 2 hours, after 6 hours, after 24 hours were measured by IVIS Sepctrum, respectively.
  • Example 7 is applied to the fluorescently labeled samples of Example 4, control and Comparative Example 7 of 10 ⁇ L (10 ⁇ g / ml) in the back of the Balb / c-nude mice, and after 15 minutes washed with PBS buffer to remain After removing the water, the skin section of the mouse was extracted, fixed in 4% formaldehyde to prepare the incision specimen, and the result of the co-focus imaging of the skin tissue slide using a two-photon microscope.
  • the present invention relates to a method for producing a low molecular weight hyaluronic acid having a molecular weight of 100,000 to 200,000 daltons, comprising heat-treating an aqueous solution containing hyaluronic acid having a molecular weight of 500,000 daltons or more at a pH of 2.5 to 3.5.
  • the hyaluronic acid having a molecular weight of 500,000 to 3 million daltons used as a starting material includes all of the average molecular weight of 500,000 daltons, which is a general hyaluronic acid cosmetic grade raw material, 1 million daltons of the pharmaceutical raw material grade, and 3 million daltons of hyaluronic acid. It may include. Generally, it is preferable to use hyaluronic acid having an average molecular weight of 500,000 Daltons, which is an inexpensive cosmetic raw material, but is not limited thereto.
  • the aqueous solution may be a solution of a molecular weight of 500,000 to 3 million daltons of hyaluronic acid dissolved in water, preferably distilled water at a concentration of 1 to 2% (weight / volume), the acid is hydrochloric acid, phosphoric acid, acetic acid, etc. You may use any of the acids normally used by.
  • the heat treatment temperature is preferably 80 to 90 °C for the efficiency of the process, the heat treatment time is preferably 15 to 30 minutes depending on the raw material used as the starting material.
  • hyaluronic acid having an average molecular weight of 100,000 to 200,000 daltons can be obtained by adjusting the aqueous solution containing hyaluronic acid having a molecular weight of 500,000 daltons or more to a pH of 2.5 to 3.5 and heat-treating at the same temperature and time.
  • the reaction solution may be neutralized with a base, preferably an aqueous alkali metal hydroxide solution, to obtain low molecular weight hyaluronic acid in the form of an alkali metal salt.
  • a base preferably an aqueous alkali metal hydroxide solution
  • the pH of the reaction solution is adjusted to 6.5 or more, preferably 6.5 to 7.0.
  • the alkali metal hydroxide may be sodium hydroxide, in which case a sodium salt of low molecular weight hyaluronic acid can be obtained.
  • the metal salt of the low molecular weight hyaluronic acid prepared by the above-described method may be added to the reaction solution by adding an organic solvent to form a precipitate and filtered to recover the alkali metal salt of the low molecular weight hyaluronic acid in powder form.
  • the organic solvent may be one or more selected from the group consisting of methanol, ethanol, acetone and isopropyl alcohol, and may be added in a volume ratio of 1: 5 to 1: 6 based on the reaction solution.
  • a commercial cosmetic grade sodium hyaluronate (Bloomage Freda Biopharm. Product, molecular weight 500,000 to 1.2 million daltons) was dissolved in 100 ml of distilled water to prepare a 1.0% (w / v) aqueous solution, and 0.58 ml of 4N HCl was added to pH 2.5. After adjusting, it was bathed in water at 90 ° C. for 15 minutes. Then, the mixture was put in cold water to lower the temperature to room temperature, adjusted to pH 6.5 by adding 4N NaOH solution, and 400 ml of anhydrous ethanol was added to form a precipitate. The precipitate was filtered off and dried at 50 ° C. to obtain 8.9 g of sodium hyaluronate.
  • a sodium hyaluronate salt of 9.1 g was obtained in the same manner as in Example 1 except that 0.23 ml of 4N HCl solution was added to an aqueous solution of sodium hyaluronate and adjusted to pH 3.5, followed by 30 minutes in water at 90 ° C. .
  • Example 1 shows that the average molecular weights of the sodium hyaluronate salts obtained in Examples 1 (red peak) and Example 3 (black peak) overlap with the 200,000 Dalton standard (blue peak), and the hyaluronic obtained in Example 2 (green peak). It shows that the sodium lonate salt is less than 200,000 Daltons (blue peak).
  • Example 2 shows that the average molecular weight of the hyaluronic acid sodium salt obtained in Example 4 (red peak) overlaps the 200,000 Dalton standard, and the molecular weight of the sodium hyaluronate salt obtained in Example 5 (green peak) is 200,000 Dalton standard (blue peak). Shows smaller than
  • Example 2 0.27 ml of 4N HCl was added to an aqueous sodium hyaluronate solution to adjust the pH to 3.0, and the same procedure as in Example 1 was conducted except that the mixture was heated in 80 ° C water for 15 minutes to obtain 8.7 g of sodium hyaluronate salt. .
  • Example 2 0.2 g of 4N HCl was added to an aqueous sodium hyaluronate solution to adjust the pH to 3.0, and the same procedure as in Example 1 was carried out except that the mixture was heated in 80 ° C water for 30 minutes to obtain 8.5 g of sodium hyaluronate salt. .
  • FIG. 3 shows that the molecular weight distribution of the hyaluronic acid sodium salt obtained in Example 6 (red peak) almost matches the 200,000 Dalton standard (blue peak), and the average molecular weight of the sodium hyaluronate salt obtained in Example 7 (green peak) is 200,000. It is smaller than the Dalton standard (blue peak).
  • the pH was adjusted to 3.0 by adding 0.21 ml of 4N HCl solution to an aqueous sodium hyaluronate solution, and the same procedure as in Comparative Example 1 was carried out except that the mixture was heated in 70 ° C. for 30 minutes to give 9.1 g of sodium hyaluronate salt. Got it.
  • Comparative Example 5 shows that the molecular weight of the sodium hyaluronate salt obtained in Comparative Example 4 (green peak), Comparative Example 5 (black peak) and Comparative Example 6 (pink peak) is smaller than the 100,000 Dalton standard (red peak).
  • Hyaluronic acid sodium salt prepared in Example 4 and Comparative Example 7 commercially available cosmetic grade sodium hyaluronate (Bloomage Freda Biopharm. Product, molecular weight 500,000 to 1.2 million daltons)) 1.0% (w) respectively dissolved in distilled water / v)
  • FFF / MALS Flow field-flow fraction / multi-angle light scattering
  • the analysis conditions are as follows.
  • Carrier solution 0.1M NaNO3 + 0.02% NaN 3
  • the average molecular weight of the hyaluronic acid sodium salt prepared in Example 4 of the present invention is 160,000 Daltons
  • the general cosmetic raw material (Comparative Example 7) was analyzed to an average molecular weight of 1 million Daltons.
  • the molecular weight of the hyaluronic acid salts prepared in Examples 1 to 7 and Comparative Examples 1 to 6 was confirmed using an HPLC analyzer (Varian Prostar 210 Solvent Delivery System). 10 mg of each sample of the hyaluronic acid salt prepared in Examples 1 to 7 and Comparative Examples 1 to 6 and the reference substance (100 kDa and 200 kDa products of Life Core, Inc.) were weighed and dissolved in 10 ml of a mobile phase, and 0.45 ⁇ m. Filtered by filter and then analyzed. The results are shown in Figures 1-6.
  • the analysis conditions are as follows.
  • the test was carried out according to the method of measuring the intrinsic viscosity of sodium hyaluronate salt of the European Pharmacopoeia.
  • Hyaluronic acid sodium salt prepared in Examples 4 and 5 Comparative Example 7 and reference material (hyaluronic acid having a molecular weight of 20 kDa, 10 kDa, and 5 kDa) (M 0p ) from Lifecore , respectively, were added to 10.0 g (M 0S ) of the buffer solution. The mixture was shaken at 4 ° C. for 24 hours, filtered through a glass filter, and used as a sample solution (T 0 ). 50 g of the buffer solution was added to 10 g (T 0 ) of the sample solution, followed by shaking for 20 minutes at 25 ° C., followed by filtration through a glass filter.
  • test solution T 1 5 ml of the first filtrate was discarded, and the next filtrate was used as the test solution T 1 .
  • 5 g of the buffer solution was added to 15 g of the test solution (T 1 ), and the test solution T 2 was prepared in the same manner as above.
  • 10 g of the buffer solution was added to 10 g of the test solution (T 1 ), and the test solution T 3 was prepared in the same manner as above.
  • 15 g of the buffer solution was added to 5 g of the test solution (T 1 ) to obtain a test solution T 4 .
  • the time t (s) required for a certain volume of liquid to flow through the capillary is measured, and the kinetic viscosity ⁇ is calculated according to the following equation (1).
  • K (mm 2 / s 2 ) is an integer of the viscometer and is determined in advance using a standard solution for viscometer calibration.
  • Intrinsic viscosity shows the degree of diffusion of a polymer in a liquid (sample liquid), and may be a standard of molecular weight.
  • the time t at which the sample liquid having a concentration c (g / dL) flows down and the time t o at which the solvent flows down are measured, and the ultimate viscosity [ ⁇ ] is calculated according to the following equation.
  • Buffer solution 0.15 M sodium chloride in sodium phosphate buffer solution pH 7.0
  • Solution A prepared by dissolving 1.56 g of NaH 2 PO 4 and 9.0 g of NaCl in 1 L of distilled water
  • Solution B prepared by dissolving 3.58 g of Na 2 HPO 4 and 9.0 g of NaCl in 1 L of distilled water
  • Sample T 1 , T 2 The time at which T 3 , T 4 and the buffer solution flow down the capillary viscometer at 25 ° C. is measured to be t 1 , t 2 , t 3 , t 4 , t 0 , respectively.
  • the same viscometer is used for all tests and three measurements are made for all test solutions. If the deviation of the three measured values is within 0.35% from the average value and t 1 is 1.6 times to 1.8 times with respect to t 0 , this value is determined to be valid. If not a suitable result, test the buffer and sample solution again.
  • Intrinsic viscosity values obtained by experiments as described above are as shown in Table 2 below.
  • Example 4 Sodium hyaluronate prepared in Example 4, fluorescent dye in Lifecore's molecular weight 200 kDa hyaluronic acid as a control and Comparative Example 7 (commercially available cosmetic grade sodium hyaluronic acid (Bloomage Freda Biopharm. Product, molecular weight 500,000 to 1.2 million daltons) : Flamma496-dichlorotriazine and Flamma648-dichlorotriazine were attached, and skin permeability test was conducted on Balb / c-nude mice (male, 5 weeks old, and 14 mice).
  • Example 4 Samples of Example 4, Control and Comparative Example 7 are prepared in PBS at a concentration of 12.5 ug / ml.
  • Fluorescent dye (Flamma496-dichlorotriazine, Flamma648-dichlorotriazine) is dissolved in DMSO at a concentration of 1 mg / ml. Prepared immediately before reaction and used fresh.
  • Fluorescently labeled samples of Example 4, Control and Comparative Example 7 were applied in 10 ⁇ L (10 ⁇ g / ml) to the back of Balb / c-nude mice, and after 15 minutes on the left side of the mouse and 30 minutes on the right side of the PBS buffer Wash to remove residue. Immediately after removal, 30 minutes later, 1 hour later, 2 hours later, 6 hours later, and 24 hours later, IVIS Sepctrum was measured. The results are shown in FIG.
  • Example 4 As shown in Figure 6, the control group and Example 4 can be seen that permeated to the skin, but more effectively penetrated the skin tissue after 30 minutes than after 15 minutes. However, Comparative Example 7 was confirmed to be washed away without penetrating the skin because the molecular weight is larger than Example 4.
  • Example 4 Fluorescently labeled samples of Example 4, Control and Comparative Example 7 were applied to 10 ⁇ L (10 ⁇ g / ml) of Balb / c-nude mice on the back and washed 15 minutes later with PBS buffer to remove residues. The skin sections of the mice were extracted and prepared incision specimens were fixed with 4% formaldehyde, and then skin tissue slides were confocal imaged using a two-photon microscope.
  • Example 4 and the control group were found to be relatively infiltrated into the skin tissue without difference, but in Comparative Example 7, almost the skin tissue. It can be seen that it does not exist within.

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Abstract

본 발명은 분자량 50만 달톤 이상의 히알루론산을 함유하는 수용액을 pH 2.5 내지 3.5 범위에서 열처리하는 것을 포함하는, 분자량 10만 내지 20만 달톤의 저분자량 히알루론산의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

저분자량 히알루론산의 제조 방법
본 발명은 피부 투과 및 보습 효과가 우수한 분자량 범위의 히알루론산을 제조하는 방법에 관한 것이다,
히알루론산은 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid)과 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)을 기본 단위로 하여 분자량이 수십만 내지 수백만 달톤에 이르며, 거의 모든 생체에서 동일한 구조로 발견되는 직쇄상 폴리머(liner polymer)이며 주로 세포외 매트릭스(extracellular matrix)의 구성 성분이다. 종간 차이 없이 동일한 구조를 가지므로 추출원에 무관하게 면역반응이 없는 것으로 알려져 있다. 현재까지 퇴행성 관절염, 백내장, 주름 개선, 약물 전달, 줄기세포 지지체, 화장품 보습 유지 성분 등 많은 분야에서 사용되는 안전한 천연 다당류이다. 중합체인 히알루론산은 분자량이 클수록 밀도가 높아지는 특징이 있어 높은 점성을 가진다.
초기에는 닭의 벼슬에서 히알루론산을 추출하여 의약품, 화장품, 식품용 등으로 산업화사용되었다[Biomacromolecules, 5, 2122-2127 (2004)]. 그러나 최근에는 조류독감 등 동물로부터 유발될 수 있는 감염성 질환의 우려 때문에 주로 미생물을 이용한 발효법으로 생산하여 사용한다[Appl. Microbiol. Biotechnol. 66(4): 341-51 (2005)].
인체 피부에서 히알루론산의 양은 노화와 함께 감소되는 것으로 보고되었는데, 피부 탄력 저하 및 수분 함유량 감소의 직접적인 원인 중 하나로 여겨지고 있다[In: Free radical Damage ant Its control, 281-300, Elsevier Science (1994)].
히알루론산은 물에 잘 용해되며 분자 구조 내에 많은 수분을 보유할 수 있는 특성으로 인해 화장품의 보습제로 널리 사용되고 있고, 화상이나 창상에 바르는 크림, 주사제, 거즈 등에 적용되고 있으며, 각막의 안쪽을 보호하는 제제로도 사용되고 있다. 또한, 히알루론산은 조직공학 분야에서 창상 피복재나 치과용 매트릭스에 사용되는 다공성 스펀지 형태의 매트릭스의 제조에 사용되어 왔다.
그러나 동물 조직으로부터의 추출 또는 발효법으로 생산되는 히알루론산은 중합도가 높은 50만 달톤 이상의 고분자 다당류이기 때문에 일반적으로 피부를 투과하지 못한다. 즉, 50만 달톤 이상의 히알루론산을 피부에 도포하면 공기 중의 수분을 흡수하려는 성질 때문에 피부로부터 수분 증발을 막을 수는 있지만, 피부를 투과하지 못하기 때문에 피부 표면에 머물다가 세안 등에 의해 쉽게 피부 표면에서 씻겨나가고, 이로 인해 피부의 보습 효과가 지속되기 어렵다. 반면에, 10만 달톤 이하의 히알루론산은 피부를 투과할 수는 있지만 분자 크기가 작아 수분을 함유하려는 성질이 부족하여 보습 효과가 지속되지 않는다.
또한, 2만 달톤 이하의 HA는 피부를 효과적으로 투과하지만 염증 반응(pro-inflammatory response)을 유발하는 것으로 알려져 있는데, 이는 피부 내 대식세포 상의 수용체인 톨-유사(Toll-like) 수용체-2 및 4와 결합하여 면역 반응을 개시할 수 있기 때문이다.
히알루론산을 저분자화하는 방법으로는 감마선, 초음파 또는 자외선을 이용하는 방법(Journal of Chromatography, 435, pp335-342, 1988; Int. Biol. Macrmol., p10,1988), 산 또는 염기 촉매를 이용하는 방법(일본특허공개 S63-57602), 마이크로 플루이다이저(microfluidizer)를 사용하는 방법 등이 알려져 있다. 그러나 공지의 방법들은 10만 달톤 이하의 히알루론산을 제조하는 방법으로, 피부 투과의 직접적인 효과나, 수분 흡수 및 함유가 가능한 분자량 범위의 히알루론산을 효과적으로 제조하는 방법은 제시된 적이 없다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 하는 것으로서, 기존 화장품 등의 원료로 사용되는 50만 달톤 이상의 히알루론산이 가지는 보습 효과를 유지하면서도, 피부의 각질층에 투과되지 못하고 씻겨나가 피부에 장시간 보습 효과를 제공하지 못하는 단점을 극복하여, 피부에 투과되고 또한 최적의 습윤 상태의 유지가 가능한 저분자량 히알루론산을 효과적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 상기와 같은 과제를 해결하기 위한 수단은 다음과 같다.
1. 분자량 50만 달톤 이상의 히알루론산을 함유하는 수용액을 pH 2.5 내지 3.5 범위에서 열처리하는 것을 포함하는, 분자량 10만 내지 20만 달톤의 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
2. 수용액의 농도가 1 내지 2% (중량/부피)인 상기 1의 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
3. 열처리 온도가 80 내지 90℃인 상기 1의 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
4. 열처리 시간이 15 내지 30분인 상기 1의 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
5. 열처리 후에 반응 용액을 알칼리금속 수산화물 수용액으로 중화하여 저분자량 히알루론산을 알칼리금속염의 형태로 수득하는 것인 상기 1의 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
6. 알칼리금속염이 나트륨염인 상기 1의 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
7. 중화 후에 반응 용액에 유기 용매를 첨가하여 침전물을 생성시키고 여과하여 히알루론산의 알칼리금속염을 분말 형태로 수득하는 것인 상기 5의 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
8. 유기 용매가 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이소프로필 알코올로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것인 상기 7의 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
9. 유기 용매를 반응 용액을 기준으로 1:5 내지 1:6의 부피비로 첨가하는 것인 상기 7의 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
본 발명에 따라 기존의 여러 복잡한 방법을 생략하고 단순화된 방법을 통하여 기존의 화장품 원료로 사용되는 히루안산의 단점인 피부투과가 어려운 문제를 극복하고 피부투과 뿐 아니라 최대의 보습력을 유지할 수 있는 분자량 100 내지 200kDa의 히알루론산을 제조하는 방법을 제공하였다. 본 발명에서 제시한 방법으로 제조한 저분자량 히알루론산은 피부 투과가 가능하며 최대한의 함습 상태를 유지함으로써 아토피증상 완화 등의 기능성이 있으므로, 이를 화장품용, 의약용 및 의료용 조성물에 사용하기에 적합하다.
도 1은 실시예 1 내지 3에서 제조한 저분자량 히알루론산나트륨의 분자량 분포를 확인한 HPLC 크로마토그램이다. (청색: 분자량 20만 달톤 표준, 적색: 실시예 1, 녹색: 실시예 2, 검정색: 실시예 3)
도 2는 본 발명의 실시예 4 및 5에서 제조한 저분자량 히알루론산나트륨의 분자량 분포를 확인한 HPLC 크로마토그램이다. (청색: 분자량 20만 달톤 표준, 적색: 실시예 4, 녹색: 실시예 5)
도 3은 본 발명의 실시예 6 및 7에서 제조한 저분자량 히알루론산나트륨의 분자량 분포를 확인한 HPLC 크로마토그램이다. (청색: 분자량 20만 달톤 표준, 적색: 실시예 6, 녹색: 실시예 7)
도 4는 비교예 1 내지 3에서 제조한 히알루론산나트륨의 분자량 분포를 확인한 HPLC 크로마토그램이다. (청색: 분자량 20만 달톤 표준, 적색: 분자량 10만 달톤 표준, 녹색: 비교예 1, 검정색: 비교예 2, 분홍색: 비교예 3))
도 5는 본 발명의 비교예 4 내지 6에서 제조한 히알루론산나트륨의 분자량 분포를 확인한 HPLC 크로마토그램이다. (청색: 분자량 20만 달톤 표준, 적색: 분자량 10만 달톤 표준, 녹색: 비교예 4, 검정색: 비교예 5, 분홍색: 비교예 6))
도 6은 형광 표지된 본 발명 실시예 4, 대조군 및 비교예 7의 시료를 Balb/c-nude 마우스의 등에 10 μL (10 ㎍/ml)씩 도포하고, 마우스의 왼쪽은 15분 후, 오른쪽은 30분 후에 PBS 완충액으로 세척하여 잔류물 제거 후 즉시, 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 6시간후, 24시간 후 각각 IVIS Sepctrum으로 측정한 결과이다.
도 7은 형광 표지된 본 발명의 실시예 4, 대조군 및 비교예 7의 시료를 Balb/c-nude 마우스의 등에 10 μL (10 ㎍/ml)씩 도포하고, 15분 후 PBS 완충액으로 세척하여 잔류물을 제거한 다음, 마우스의 피부 절편을 적출하여 4% 포름알데히드로 고정하여 절개 시편을 제작하고, 이광자 현미경을 이용하여 피부 조직 슬라이드를 공-초점 이미징한 결과이다.
본 발명은 분자량 50만 달톤 이상의 히알루론산을 함유하는 수용액을 pH 2.5 내지 3.5 범위에서 열처리하는 것을 포함하는, 분자량 10만 내지 20만 달톤의 저분자량 히알루론산의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 출발 물질로 사용하는 분자량 50만 내지 300만 달톤의 히알루론산은 일반적인 히알루론산 화장품 등급 원료인 평균 분자량 50만 달톤, 의약품 원료 등급인 100만 달톤 및 300만 달톤의 히알루론산을 모두 포함할 수 있다. 일반적으로 가격이 저렴한 화장품 원료인 평균 분자량 50만 달톤의 히알루론산을 사용하는 것이 경제적인 측면에서 바람직할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 수용액은 분자량 50만 내지 300만 달톤의 히알루론산을 물, 바람직하게는 증류수에 1 내지 2% (중량/부피)의 농도로 용해시킨 것일 수 있으며, 상기 산은 염산, 인산, 초산 등 본 발명 분야에서 통상적으로 사용하는 산 중에서 어떤 것을 사용하여도 무방하다.
상기 열처리 온도는 공정의 효율성을 위하여 80 내지 90℃인 것이 바람직하고, 열처리 시간은 출발 물질로 사용하는 원료에 따라 15 내지 30분이 바람직하다.
본 발명에서는 분자량 50만 달톤 이상의 히알루론산을 함유하는 수용액을 pH 2.5 내지 3.5 범위로 조정하고, 상기와 같은 온도 및 시간으로 열처리함으로써 평균 분자량 10만 내지 20만 달톤의 히알루론산을 수득할 수 있다.
본 발명에서는 상기 열처리 후에 반응 용액을 염기, 바람직하게는 알칼리금속 수산화물 수용액으로 중화하여 저분자량 히알루론산을 알칼리금속염의 형태로 수득할 수도 있다. 이 경우 반응 용액의 pH를 6.5 이상, 바람직하게는 6.5 내지 7.0으로 조정한다. 상기 알칼리금속 수산화물은 수산화나트륨일 수 있고, 이 경우 저분자량 히알루론산의 나트륨염을 수득할 수 있다.
상술한 방법으로 제조한 저분자량 히알루론산의 금속염은 반응 용액에 유기 용매를 첨가하여 침전물을 생성시키고 여과하여 저분자량 히알루론산의 알칼리금속염을 분말 형태로 회수할 수 있다. 상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이소프로필 알코올로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것일 수 있으며, 반응 용액을 기준으로 1:5 내지 1:6의 부피비로 첨가할 수 있다.
실시예
이하에서는 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이하에 제시된 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
1. 저분자량 히알루론산 나트륨염 제조 조건 최적화
실시예 1
시판되는 화장품 등급의 히알루론산 나트륨(Bloomage Freda Biopharm. 제품, 분자량 50만 내지 120만 달톤) 1g을 증류수 100ml에 녹여 1.0% (w/v) 수용액을 제조하고, 4N HCl 0.58ml를 가하여 pH 2.5로 조정한 다음, 90℃의 물에서 15분 동안 중탕하였다. 그 다음, 냉수에 넣어 실온으로 온도를 낮춘 후, 4N NaOH 용액을 가하여 pH 6.5로 조정한 다음, 무수 에탄올 400ml를 가하여 침전을 생성시켰다. 침전물을 여과한 후 50℃에서 건조하여 8.9g의 히알루론산 나트륨염을 얻었다.
실시예 2
90℃의 물에서 30분 동안 중탕한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 8.7g의 히알루론산 나트륨염을 얻었다.
실시예 3
히알루론산 나트륨 수용액에 4N HCl 용액 0.23ml를 가하여 pH 3.5로 조정하고 90℃의 물에서 30분 동안 중탕한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 9.1g의 히알루론산 나트륨염을 얻었다.
도 1은 실시예 1 (적색 피크) 및 실시예 3 (검정색 피크)에서 얻어진 히알루론산 나트륨염의 평균 분자량이 20만 달톤 표준 (청색 피크)과 중첩된다는 것과, 실시예 2 (녹색 피크)에서 얻어진 히알루론산 나트륨염의 분자량이 20만 달톤 (청색 피크)보다 작다는 것을 보여준다.
실시예 4
히알루론산 나트륨 수용액에 4N HCl 용액 0.21ml를 가하여 pH 3.0으로 조정한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 8.9g의 히알루론산 나트륨염을 얻었다.
실시예 5
히알루론산 나트륨 수용액에 4N HCl 용액 0.21ml를 가하여 pH 3.0으로 조정하고, 90℃의 물에서 30분 동안 중탕한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 8.2g의 히알루론산 나트륨염을 얻었다.
도 2는 실시예 4 (적색 피크)에서 얻어진 히알루론산 나트륨염의 평균 분자량이 20만 달톤 표준과 중첩되고, 실시예 5 (녹색 피크)에서 얻어진 히알루론산 나트륨염의 분자량은 20만 달톤 표준 (청색 피크)보다 작은 것을 보여준다.
실시예 6
히알루론산 나트륨 수용액에 4N HCl 0.21ml를 가하여 pH 3.0으로 조정하고, 80℃의 물에서 15분 동안 중탕한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 8.7g의 히알루론산 나트륨염을 얻었다.
실시예 7
히알루론산 나트륨 수용액에 4N HCl 0.21ml를 가하여 pH 3.0으로 조정하고, 80℃의 물에서 30분 동안 중탕한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 8.5g의 히알루론산 나트륨염을 얻었다.
도 3은 실시예 6 (적색 피크)에서 얻어진 히알루론산 나트륨염의 분자량 분포가 20만 달톤 표준 (청색 피크)과 거의 일치하고, 실시예 7 (녹색 피크)에서 얻어진 히알루론산 나트륨염의 평균 분자량이 20만 달톤 표준 (청색 피크)보다 작다는 것을 보여준다.
비교예 1
시판되는 화장품 등급의 히알루론산 나트륨(Bloomage Freda Biopharm. 제품, 분자량 50만 내지 120만 달톤) 1g을 증류수 100ml에 녹여 1.0% (w/v) 수용액을 제조하고, 4N HCl 0.62ml를 가하여 pH 2.0으로 조정한 다음, 90℃의 물에서 15분 동안 중탕하였다. 그 다음, 냉수에 넣어 실온으로 온도를 낮춘 후, 4N NaOH 용액을 가하여 pH 6.5로 조정한 다음, 무수 에탄올 400ml를 가하여 침전을 생성시켰다. 침전물을 여과한 후 50℃에서 건조하여 7.3g의 히알루론산 나트륨염을 얻었다.
비교예 2
90℃의 물에서 30분 동안 중탕한 것을 제외하고는 비교예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 6.9g의 히알루론산 나트륨염을 얻었다.
비교예 3
히알루론산 나트륨 수용액에 4N HCl 0.18ml를 가하여 pH 4.0으로 조정하고, 90℃의 물에서 30분 동안 중탕한 것을 제외하고는 비교예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 9.3g의 히알루론산 나트륨염을 얻었다.
도 4는 비교예 1 (녹색 피크), 비교예 2 (검정색 피크) 및 비교예 3 (분홍색 피크)에서 얻어진 히알루론산 나트륨염의 분자량이 10만 달톤 표준 (적색 피크)보다 작은 것을 보여준다.
비교예 4
히알루론산 나트륨 수용액에 4N HCl 용액 0.21ml를 가하여 pH 3.0으로 조정하고, 70℃의 물에서 30분 동안 중탕한 것을 제외하고는 비교예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 9.1g의 히알루론산 나트륨염을 얻었다.
비교예 5
히알루론산 나트륨 수용액에 4N HCl 용액 0.21ml를 가하여 pH 3.0으로 조정하고, 100℃의 물에서 15분 동안 중탕한 것을 제외하고는 비교예 1에서와 동일한 방법으로 실시하여 7.8g의 히알루론산 나트륨염을 얻었다.
비교예 6
100℃의 물에서 30분 동안 중탕한 것을 제외하고는 비교예 5에서와 동일한 방법으로 실시하여 7.4g의 히알루론산 나트륨염을 얻었다.
도 5는 비교예 4 (녹색 피크), 비교예 5 (검정색 피크) 및 비교예 6 (분홍색 피크)에서 얻어진 히알루론산 나트륨염의 분자량이 10만 달톤 표준 (적색 피크)보다 작은 것을 보여준다.
실험예
실험예 1. FFF-MALS를 이용한 분자량 분포도 확인
상기 실시예 4에서 제조한 히알루론산 나트륨염 및 비교예 7 (시판되는 화장품 등급의 히알루론산 나트륨 (Bloomage Freda Biopharm. 제품, 분자량 50만 내지 120만 달톤))을 각각 증류수에 용해시킨 1.0%(w/v) 수용액을 분석 시료로 하여 FFF/MALS (Flow field-flow fraction/multi-angle light scattering) 분석 장치(Wyatt Technology 사)로 분자량 분포를 분석하였다. 결과는 하기 표 1과 같다.
분석 조건은 다음과 같다.
스페이서 두께 (spacer thickness): 250 ㎛
멤브레인: Composite Regenerated Cellulose 20kDa(Millipore)
주입량(injection amount): 20 ㎍
시료 농도: 1 ㎎/㎖
캐리어 용액: 0.1M NaNO3 + 0.02% NaN3
시료 흐름 속도(sample flow rate): 0.1 mL/min
교차 흐름 속도(cross flow rate): 0-4분 동안 2.0 mL/min; 4-5분 동안 0.5 mL/min; 5-6분 동안 0.1 mL/min; 6-8분 동안 0.02 mL/min
중량평균 분자량(g/mol) 수평균 분자량(g/mol) 다원 다양성 Rw(nm) Rn(nm)
실시예4 (1.98±0.43)x105 (1.54±0.40)x105 1.09±0.02 500.4±35.4 494.2±34.2
실시예7 (1.05±0.08)x106 (9.13±2.25)x105 11.90±3.26 213.1±10.2 151.8±16.6
표 1에서 보는 것과 같이, 본 발명의 실시예 4에서 제조한 히알루론산 나트륨염의 평균 분자량은 16만 달톤인 데에 비해, 일반적인 화장품 원료 (비교예 7)는 평균 분자량이 100만 달톤으로 분석되었다.
실험예 2. HPLC를 이용한 분자량 확인
HPLC 분석 장치 (Varian Prostar 210 Solvent Delivery System)를 사용하여 실시예 1 내지 7 및 비교예 1 내지 6에서 제조한 히알루론산염의 분자량을 확인하였다. 상기 실시예 1 내지 7 및 비교예 1 내지 6에서 제조한 히알루론산염과 기준 물질(Life Core사의 100 kDa 및 200 kDa 제품)의 각 시료를 10 mg을 칙량하여 이동상 10 ml에 용해시키고, 0.45 ㎛ 필터로 여과한 다음 분석하였다. 결과는 도 1 내지 6과 같다.
분석 조건은 다음과 같다.
- 칼럼: 1) 울트라하이드로겔(Ultrahydrogel) 1000, 12 ㎛, 7.8 x 300 ㎜, 2K-4M 칼럼/2) 울트라하이드로겔 500, 10 ㎛, 7.8 x 300 ㎜, 10K-400K 칼럼, 직렬연결 (tandem connection)
- 칼럼 오븐: 실온
- 유속: 0.8 ㎖/min
- 주입 부피: 100 ㎕
- 검출기: Alltech ELSD 3300
- 기체 유량(gas flow): 1 L/min, 온도 : 70℃
- 이동상: 20 mM - 탄산암모늄 (pH 7.8)
- 분자량 기준 물질: 200kDa, 100kDa HA
실험예 3. 극한 점도 측정을 통한 수분 함유도 측정
분자량에 따른 수분 함유 정도를 확인하기 위해 유럽 약전의 히알루론산 나트륨염의 극한점도 측정 방법에 따라 다음과 같이 시험하였다.
점도계로는 우베로오데(Ubbelohde)형 점도계를 사용하였다. 실시예 4 및 5에서 제조한 히알루론산 나트륨염, 비교예 7 및 기준 물질 (Lifecore사의 분자량 20 kDa, 10 kDa, 5 kDa의 히알루론산) (M0p)을 각각 완충 용액 10.0g (M0S)에 넣고 4℃에서 24 시간 동안 흔들어 섞은 다음 유리 여과기로 여과하여 검액(T0)으로 사용하였다. 이 검액 10g(T0)에 완충 용액 50g을 넣고 25℃에서 20분간 동한 흔들어 섞은 다음 유리 여과기로 여과하였다. 처음 여액 5 ㎖를 버리고 다음 여액을 검액 T1으로 하였다. 검액(T1) 15g에 완충 용액 5g을 넣고 위와 동일한 과정을 거쳐 검액 T2로 하였다. 검액(T1) 10g에 완충 용액 10g을 넣고 위와 동일한 과정을 거쳐 검액 T3로 하였다. 검액(T1) 5g에 완충 용액 15g을 넣고 위와 동일한 과정을 거쳐 검액 T4로 하였다.
검액을 점도계에 넣어 검액의 액면이 구 A의 두 개의 표선 사이에 오도록 한다. 이 점도계를 동물용 의약품 각조에서 규정하는 온도 (ㅁ 0.1℃)의 항온조에 구 D가 완전히 물속에 잠기도록 넣고 수직으로 유지하여 검액이 규정 온도에 도달할 때까지 약 20 분간 정치한다. 관 M을 손가락으로 막고 공기 기포가 관 N 속에 들어가지 않도록 하여 관 N의 위 끝으로부터 약하게 흡입하여 액면을 구 D의 중심부까지 끌어 올린 다음 흡입을 그치고 관 M의 입구를 열고 곧 관 N의 입구를 막는다. 모세관의 최하단의 액주가 끊어져 있는 것을 확인한 다음 관 N의 입구를 열어 액면이 구 C의 위 표선에서 아래 표선까지 흘러내리는 시간 t (초)를 측정한다.
1. 점도 측정법 : 모세관 점도계법
뉴턴 액체의 점도를 측정하는 방법으로 일정 부피의 액체가 모세관을 통하여 흘러내리는 데 소요되는 시간 t(s)를 측정하여 다음 식 1에 따라 운동 점도 ν를 계산한다.
[식 1]
ν = K·t
점도 η를 구하려면 다시 그 온도에서의 액체의 밀도 ρ (g/ mL)를 측정하고 다음 식 2에 따라 계산한다.
[식 2]
η = ν·ρ = K·t·ρ
식 1 및 2에서, K (mm2/s2)는 점도계의 정수이고, 점도계 교정용 표준액을 사용하여 미리 결정해 놓는다. 극한 점도는 액체 (검액) 중에서 고분자의 확산 정도를 나타내는 것으로, 분자량의 표준으로도 된다. 농도 c (g/dL)인 검액이 흘러내리는 시간 t 및 용매가 흘러내리는 시간 t o을 측정하여 극한 점도 [η]를 다음 식 3에 따라 계산한다.
[식 3]
Figure PCTKR2018004127-appb-I000001
2. 완충 용액: 0.15 M 염화나트륨 인산나트륨 완충 용액(sodium chloride in sodium phosphate buffer solution) pH 7.0
용액 A: NaH2PO4 1.56g과 NaCl 9.0g을 증류수 1L에 용해시켜 제조
용액 B: Na2HPO4 3.58g 과 NaCl 9.0g을 증류수 1L에 용해시켜 제조
용액 A에 용액 B를 pH 7.0이 될 때까지 섞은 후, 유리 여과기로 여과
3. 실험의 유효성 판정
검액 T1, T2, T3, T4 및 완충 용액이 25℃에서 모세관 점도계를 흘러내리는 시간을 측정하여 각각 t1, t2, t3, t4, t0로 한다. 모든 시험에 대해 동일한 점도계를 사용하며, 모든 시험액에 대해 3회 측정한다. 3회 측정값의 편차가 평균값으로부터 0.35% 이내이고, t1이 t0에 대해 1.6배 내지 1.8배이면 이 값은 유효한 것으로 판정한다. 적합한 결과가 아닌 경우 완충 용액과 검액을 다시 조제하여 시험한다.
위와 같은 방법으로 실험하여 얻은 극한점도 값은 하기 표 2에 나타낸 것과 같다.
히알루론산나트륨 극한점도 (m3/kg)
실시예 4 0.32
실시예 5 0.25
비교예 7 1.97
20 kDa (Lifecore) 0.08
10 kDa (Lifecore) 0.03
5 kDa (Lifecore) 0.02
표 2에서 보는 것과 같이, 분자량이 작을수록 극한점도 값이 낮은 것으로 나타났고, 이로부터 분자량이 작을수록 수분을 함유하는 능력이 감소한다는 것을 확인할 수 있다.
실험예 4. 동물 모델을 이용한 피부 투과 시험
실시예 4에서 제조한 히알루론산 나트륨, 대조군으로서 Lifecore사의 분자량 200 kDa 히알루론산 및 비교예 7 (시판되는 화장품 등급의 히알루론산 나트륨(Bloomage Freda Biopharm. 제품, 분자량 50만 내지 120만 달톤)에 형광 염료: Flamma496-디클로로트리아진, Flamma648-디클로로트리아진을 부착하여 Balb/c-nude 마우스 (수컷, 5주령, 14 마리)를 대상으로 피부 투과도 시험을 진행하였다. 시험 방법은 다음과 같다.
1. 측정 장비
- IVIS Sepctrum (제조사: Perkin Elmer, 제품 번호: 124262)
- Two Photon Microscopy (제조사: Leica Microsystems)
2. 약물의 형광 표지
a. 실시예 4, 대조군 및 비교예 7의 시료를 PBS에 12.5ug/ml 농도로 준비한다.
b. 형광 염료 (Flamma496-디클로로트리아진, Flamma648-디클로로트리아진)를 1 mg/ml 농도로 DMSO에 용해시킨다. 반응 직전에 제조하여 신선한 상태로 사용한다.
c. a의 약물 용액 1 mL에 b의 형광 염료 용액 20 μL를 넣는다.
d. 상온에서 2시간 동안 배양한다. 15분마다 아래 위를 뒤집는다.
3. 광학 이미징을 이용한 약물의 피부 침투 확인
형광 표지된 실시예 4, 대조군 및 비교예 7의 시료를 Balb/c-nude 마우스의 등에 10 μL (10 ㎍/ml)씩 도포하고, 마우스의 왼쪽은 15분 후, 오른쪽은 30분 후에 PBS 완충액으로 세척하여 잔류물을 제거한다. 제거 후 즉시, 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 6시간후, 24시간 후 각각 IVIS Sepctrum으로 측정하였다. 결과는 도 6과 같다.
도 6에서 보는 것과 같이, 대조군 및 실시예 4의 경우 피부에 투과된 것을 알 수 있으나 15분 후에 비해 30분 후에 더 효과적으로 피부 조직에 투과되었다. 그러나 비교예 7은 분자량이 실시예 4에 비해 크기 때문에 피부에 투과되지 않고 씻겨나간 것으로 확인되었다.
4. 이광자 현미경 (Two Photon Microscopy, TPM) 이미징을 이용한 약물의 피부 침투 확인
형광 표지된 실시예 4, 대조군 및 비교예 7의 시료를 Balb/c-nude 마우스의 등에 10 μL (10 ㎍/ml)씩 도포하고, 15분 후 PBS 완충액으로 세척하여 잔류물을 제거한다. 마우스의 피부 절편을 적출하여 4% 포름알데히드로 고정하여 절개 시편을 제작한 다음, 이광자 현미경을 이용하여 피부 조직 슬라이드를 공촛점 이미징(confocal imaging) 하였다.
도 7에서 보는 것과 같이, 피부 조직을 잘라서 TPM 이미징을 이용한 약물의 피부 침투 확인하였을 때는 실시예 4와 대조군은 상대적으로 차이가 없이 피부 조직에 침투된 것으로 확인되었으나, 비교예 7의 경우 거의 피부 조직 내에 존재하지 않는 것을 알 수 있다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 다양하게 변형된 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 상술한 실시 예들은 모든 면에 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허등록청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허등록청구범위의 의미 및 범위 그리고 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 분자량 50만 달톤 이상의 히알루론산을 함유하는 수용액을 pH 2.5 내지 3.5 범위에서 열처리하는 것을 포함하는, 분자량 10만 내지 20만 달톤의 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 수용액의 농도는 1 내지 2% (중량/부피)인, 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 열처리 온도는 80 내지 90℃인, 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 열처리 시간은 15 내지 30분인, 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    열처리 후에 반응 용액을 알칼리금속 수산화물 수용액으로 중화하여 저분자량 히알루론산을 알칼리금속염의 형태로 수득하는 것인, 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 알칼리금속염은 나트륨염인, 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    중화 후에 반응 용액에 유기 용매를 첨가하여 침전물을 생성시키고 여과하여 히알루론산의 알칼리금속염을 분말 형태로 수득하는 것인, 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이소프로필 알코올로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것인 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 유기 용매는 반응 용액을 기준으로 1:5 내지 1:6의 부피비로 첨가하는 것인 저분자량 히알루론산의 제조 방법.
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