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WO2018185943A1 - 蛍光プレミックス粒子、それを含有する蛍光染色液、およびそれらを用いた蛍光染色法 - Google Patents

蛍光プレミックス粒子、それを含有する蛍光染色液、およびそれらを用いた蛍光染色法 Download PDF

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WO2018185943A1
WO2018185943A1 PCT/JP2017/014569 JP2017014569W WO2018185943A1 WO 2018185943 A1 WO2018185943 A1 WO 2018185943A1 JP 2017014569 W JP2017014569 W JP 2017014569W WO 2018185943 A1 WO2018185943 A1 WO 2018185943A1
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WO
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fluorescent
particles
antibody
staining
target protein
Prior art date
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Application number
PCT/JP2017/014569
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English (en)
French (fr)
Inventor
武寿 磯田
大輔 富岡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Inc
Original Assignee
Konica Minolta Inc
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Publication date
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Priority to JP2019511047A priority patent/JPWO2018185943A1/ja
Priority to US16/491,876 priority patent/US20210011007A1/en
Priority to PCT/JP2017/014569 priority patent/WO2018185943A1/ja
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    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D515/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen, oxygen, and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescent premix particle, a fluorescent staining solution containing the same, and a fluorescent staining method using them.
  • a specimen slide is prepared using tissues and cells collected from a patient, and the morphology of cells or tissues is observed based on a stained image obtained by staining with a predetermined method, and a specific living body is observed.
  • evaluating the expression state of a substance it is a method for determining various events such as whether or not the patient suffers from a specific disease or whether a specific therapeutic drug is successful.
  • HER2 gene (HER2 / neu, c-erbB-2) which is a kind of oncogene and / or a membrane protein produced from the HER2 gene
  • HER2 / neu, c-erbB-2 a HER2 gene which is a kind of oncogene and / or a membrane protein produced from the HER2 gene
  • the HER2 protein is thought to perform signal transduction by forming a homodimer or a heterodimer bound to activated EGFR (HER1), HER3 or HER4, and as a receptor for cancer cell growth factor. Presumed to be functional (to date no endogenous ligand binding to HER2 is known).
  • Examples of HER2 testing methods for tumor tissues include immunohistochemistry (IHC) method for staining HER2 protein and fluorescent in situ hybridization (FISH) method for staining HER2 gene.
  • IHC immunohistochemistry
  • FISH fluorescent in situ hybridization
  • ASCO testing procedures and criteria
  • the ASCO / CAP HER2 testing guidelines published in 2007 and revised in 2013 published by the American Society of Clinical Oncology and the American Pathology Society are widely used in various countries.
  • a HER2 examination guide (HER2 examination guide fourth edition, HER2 examination pathology committee, April 2014) compliant with the revised ASCO / CAP HER2 examination guideline is used.
  • an enzyme-labeled antibody is brought into contact with a specimen, and a target protein and antibody are bound directly or indirectly using an antigen-antibody reaction, and then a substrate corresponding to the enzyme is added.
  • a method of developing a color by reacting is generally used. For example, a DAB staining method using peroxidase as an enzyme and diaminobenzidine as a substrate is widely adopted.
  • the staining method based on the reaction between the enzyme and the substrate greatly depends on conditions such as temperature and time, so that the amount of protein that is the actual target can be accurately determined from the coloring concentration. There was a problem that it was difficult to estimate.
  • phosphor-aggregated particles die resin particles in which the particle surface is modified with streptavidin are prepared, and an antigen (HER2 protein) on a tissue section is prepared.
  • a primary antibody anti-HER2 rabbit monoclonal antibody
  • biotin anti-rabbit IgG antibody
  • streptavidin-modified phosphor-aggregated particles are collected.
  • a fluorescence labeling method avidin-biotin combined secondary antibody method
  • production of streptavidin-modified phosphor-aggregated particles is carried out by the following method.
  • Patent Document 2 International Publication No. 2016/129444
  • an appropriate number of disulfide bonds (—S—S—) are reduced to form a thiol group (—SH) by treatment with a specific reducing agent.
  • a specific reducing agent for example, sodium thiol group
  • a binding group capable of reacting with the thiol group for example, maleimide group
  • an appropriate number of antibodies per unit area of the particle surface can be bound.
  • Antibody-bound phosphor-integrated nanoparticles have been disclosed.
  • the antibody may be a primary antibody used in a direct method in the IHC method, a secondary antibody used in an indirect method, or the like.
  • Patent Document 2 an embodiment in which HER2 immunostaining is performed using antibody-modified fluorescent dye-encapsulated silica nanoparticles prepared by the following method is disclosed.
  • Fluorescent dye-encapsulated silica nanoparticles are formed using 3-aminopropyltrimethoxysilane and 5-carboxytetramethylrhodamine (registered trademark “TAMRA”) as raw materials, and succinimidyl as a linker on the silica nanoparticles -[(N-maleimidopropionamide) -dodecaethylene glycol] ester (product name “SM (PEG) 12 ”) is reacted to introduce maleimide groups on the particle surface.
  • TAMRA 3-aminopropyltrimethoxysilane and 5-carboxytetramethylrhodamine
  • a primary antibody (anti-HER2 rabbit monoclonal antibody) or secondary antibody (anti-rabbit IgG antibody) is treated with 2-mercaptoethanol or the like as a reducing agent to reduce a disulfide bond to generate a thiol group. .
  • the target protein contained in the specimen can be fluorescently labeled with a certain degree of accuracy.
  • the binding to the target protein is insufficient, and depending on the staining conditions, the sensitivity, that is, the target protein may not be detected with sufficient accuracy, and there is room for improvement in the staining property.
  • the configuration example of the present invention is as follows.
  • the number of the target protein-binding substances linked per unit area of the surface of the phosphor-aggregated particles is 0.003 to 0.012 / nm 2 [1] to [5]
  • the fluorescent premix particle according to any one of the above.
  • a staining method using a fluorescent staining liquid containing the fluorescent premix particles according to [4], A fluorescence staining method, comprising: a treatment of binding the primary antibody to a target protein; and a treatment of binding the fluorescent premix particles in the fluorescent staining solution to the primary antibody bound to the target protein.
  • a staining method using the fluorescent staining liquid according to [8] A fluorescent staining method comprising a treatment of directly or indirectly binding each of the corresponding fluorescent premix particles in the fluorescent staining solution to each of two or more kinds of target proteins.
  • the present invention it is possible to remarkably improve the sensitivity when fluorescently labeling a target protein as compared with the prior art and improve the accuracy of quantification of the target protein.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing fluorescent premix particles according to an embodiment of the present invention.
  • [1A] represents a phosphor-aggregated particle (10) modified with a first reactive substance (20), for example, streptavidin (21) via a linker (15), and [1B] represents a second reactive substance.
  • the target protein-binding substance (antibody or aptamer) (40) modified with a substance (30), for example, biotin (31), is shown
  • [1C] is the first reactive substance (20) of [1A] and
  • the fluorescent premix particle (1) formed by the 2nd reactive substance (30) of [1B] being connected by interaction is shown.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the procedure of one embodiment (primary reaction type staining method) of the fluorescence staining method of the present invention using fluorescent premix particles to which primary antibodies are linked.
  • [2A] shows a state in which the target protein (150) on the tissue section (100) is unreacted before starting the staining step, and [2B] shows that the primary antibody (41) is added to the target protein (150). The process which couple
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the procedure of one embodiment (secondary reaction type staining method) of the fluorescent staining method of the present invention using fluorescent premix particles to which secondary antibodies are linked.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the procedure of one embodiment of the fluorescent staining method according to the conventional secondary antibody method using biotin-avidin.
  • [4A] shows a state in which the target protein (150) on the tissue section (100) is unreacted before the staining step is started, and [4B] binds the primary antibody (41) to the target protein (150).
  • [4C] represents the treatment of binding the secondary antibody (42) modified with biotin (31) to the primary antibody (41), and [4D] represents the streptoid to biotin (31).
  • bonds the fluorescent substance integration particle (10) modified with avidin (21) is shown.
  • FIG. 5 is a fluorescent staining image taken in Comparative Example 1.
  • FIG. 6 is a fluorescent staining image taken in Example 1.
  • the fluorescent premix particle according to an embodiment of the present invention is at least one selected from the group consisting of a phosphor aggregated particle modified with a first reactive substance and an antibody and aptamer modified with a second reactive substance. It is a complex in which a target protein-binding substance of a species is bound by the interaction between the first reactive substance and the second reactive substance.
  • the present inventor for example, in a conventional fluorescent staining method such as the embodiment (Avidin-biotin combined secondary antibody method) disclosed in Patent Document 1 described above, streptavidin-modified phosphor-integrated particles and biotin-labeled primary Alternatively, a complex is prepared by previously reacting (premixing) with a secondary protein-binding substance, and the complex is bound to a protein of interest contained in a specimen (eg, tissue section), or It has been found that the sensitivity of the fluorescent label is remarkably improved by modifying the method of binding the primary antibody to the target protein and then binding the complex to the primary antibody.
  • a specimen eg, tissue section
  • the reason for this is considered as follows.
  • streptavidin is used as the first reactive substance and biotin is used as the second reactive substance
  • a maximum of four biotin-labeled target protein binding substances are bound to each streptavidin on the surface of the phosphor-aggregated particles. (Up to four biotin molecules bind to one streptavidin molecule), so the phosphor-aggregated particles can carry an extremely large number of target protein binding substances, and target proteins and primary antibodies The coupling efficiency to is significantly increased.
  • fluorescent premix particles are usually contained in a fluorescent staining solution, in other words, used to produce a fluorescent staining solution. Since the fluorescent premix particle itself functions as a “fluorescent staining solution” that binds to and is fluorescently labeled with the target protein, the target protein-binding substance linked to the fluorescent premix particle before binding to the target protein is not yet present. The state of reaction.
  • conventional immunostaining methods for example, an embodiment in which a primary antibody is reacted with a target protein, a biotin-modified secondary antibody is reacted with the primary antibody, and streptavidin-modified phosphor-integrated nanoparticles are further reacted.
  • biotin-avidin combined secondary antibody method since the secondary antibody reacts with the primary antibody, it does not correspond to the fluorescent premix particles.
  • the fluorescent premix particles it is preferable that an appropriate number of target protein-binding substances are linked to the surface of one phosphor-aggregated particle.
  • the number of target protein binding substance linked per unit area of the surface of the phosphor integrated particles is preferably 0.003 pieces / nm 2 or more, 0.003 cells / nm 2 or more 0. 012 pieces / nm 2 or less is more preferable.
  • the target protein-binding substance in an appropriate range or the preferred range can be obtained on the surface. Phosphor-aggregated particles linked to can be produced.
  • the number of target protein-binding substances linked per unit area on the surface of the phosphor-aggregated particles is determined as follows by applying the method described in, for example, International Publication No. 2015/159976. Can: (I) measuring the number per unit area of the first reactive substance introduced into the surface of the phosphor-aggregated particles; (Ii) A coefficient is determined as to how many second reactive substances (target protein-binding substance modified by) bind to one first reactive substance (for example, first reactive substance) 4 if the substance is avidin or the like, and 1 if the first reactive substance is an anti-hapten antibody); (Iii) The maximum number of target protein binding substances that can be linked per unit area of the surface of the phosphor-aggregated particle by multiplying the number per unit area of (i) by the coefficient of (ii) Considered as a value; (Iv) When the amount of the target protein-binding substance modified with the second reactive substance added for the reaction is larger than the maximum value of (iii), the maximum value is expressed in units
  • the first reactive substance and the second reactive substance are a combination of substances that specifically bind to each other by interaction, and both are a target protein binding substance and a target protein to which it binds (or 2 Or a substance that does not react with the specific binding to the third or higher order protein binding substance).
  • the first reactive substance and the second reactive substance are not limited, but for example, when the target protein (antigen etc.) and the labeling substance (phosphor etc.) are indirectly bound in a known staining method. You can choose from those in use.
  • an avidin such as avidin, streptavidin or neutravidin, preferably streptavidin is selected as the first reactive substance
  • Biotin can be selected as the reactive substance.
  • the target biological substance can be detected with higher sensitivity.
  • a hapten (a substance having a relatively low molecular weight that has no immunogenicity but exhibits antigenicity and can react with an antibody) and an anti-hapten antibody are used. It can also be used as a reactive substance and a second reactive substance.
  • Examples of the combination of a hapten and an anti-hapten antibody include dicoxigenin and anti-dicoxigenin antibody, FITC (fluorescein isothiocyanate) and anti-FITC antibody, DNP (2,4-dinitrophenyl) and anti-DNP antibody.
  • the target protein-binding substance is at least one selected from the group consisting of antibodies and aptamers, and is a substance that can bind directly or indirectly to the target protein.
  • the target protein binding substance may be two or more kinds, but is usually one kind.
  • the antibody is not particularly limited as long as it is an antibody that can bind directly or indirectly to the target protein in the immunostaining method.
  • the antibody may be a primary antibody that specifically binds to a target protein (antigen), a secondary antibody that specifically binds to the primary antibody, or a higher-order antibody.
  • a primary antibody or a secondary antibody is preferable.
  • a primary antibody is an antibody that recognizes and binds to a unique epitope to an antigen, and is used by mixing two or more types of monoclonal antibodies, which are preferably monoclonal antibodies over polyclonal antibodies from the viewpoint of the stability of quantification of the target protein. In this case, a combination of monoclonal antibodies that specifically bind to different epitopes for each antibody is preferable.
  • the immunized animal producing the primary antibody is not particularly limited and can be selected from general animals such as mouse, rat, guinea pig, rabbit, goat, sheep and the like.
  • Secondary antibodies or higher antibodies are unique epitopes of primary antibodies or lower antibodies, preferably in regions not involved in binding of these antibodies to target proteins (antigens) etc. (Fc etc.)
  • An antibody that recognizes and binds to an existing epitope is preferably a monoclonal antibody from the viewpoint of the stability of quantification of the target protein, but a polyclonal antibody may be used from an economical viewpoint.
  • An immunized animal that produces a secondary antibody or the like is an animal species that produces a primary antibody or the like or an animal species that forms a region such as Fc from among the animal species or the like exemplified as an immunized animal that produces a primary antibody.
  • an appropriate animal may be selected. For example, when a natural mouse antibody (IgG produced by a mouse) is used as a primary antibody, an antibody that specifically binds to mouse IgG produced by an immunized animal other than a mouse (such as a rabbit) as a secondary antibody It is appropriate to use
  • the antibody may be of any isotype, but is usually IgG or IgM, with IgG being particularly preferred.
  • the antibody may be a natural antibody such as full-length IgG as long as it has the ability to specifically recognize and bind to the target protein or lower-order antibody, or Fab, Fab ′, F (ab ′ 2 )
  • Non-natural antibodies such as antibody fragments such as 2 , Fv, scFv, or artificial antibodies multi-functionalized (multivalent or multispecific) using these antibody fragments may be used. .
  • it may be a natural antibody derived from a specific immunized animal (for example, a mouse antibody produced by a mouse), a chimeric antibody or a humanized antibody prepared by an artificial means using a vector or the like.
  • a specific immunized animal for example, a mouse antibody produced by a mouse
  • a chimeric antibody or a humanized antibody prepared by an artificial means using a vector or the like Alternatively, it may be a fully human antibody.
  • the aptamer is not particularly limited as long as the aptamer can specifically label the target protein by a method according to an immunostaining method (direct method or indirect method) using an antibody.
  • the aptamer may be a primary aptamer that specifically binds to a target protein, a secondary antibody that specifically binds to a primary antibody or primary aptamer bound to the target protein, or higher higher order. Although aptamer may be sufficient, it is preferable that it is a primary aptamer or a secondary aptamer.
  • Aptamers can be broadly classified into nucleic acid (DNA or RNA) aptamers and peptide aptamers, as long as they have the ability to specifically recognize and bind to the target protein or an antibody or lower order aptamer bound to the target protein. Either an aptamer or a peptide aptamer may be used.
  • Nucleic acid aptamers and peptide aptamers can be prepared by known methods.
  • the phosphor-aggregated particles are not particularly limited, but phosphors (for example, fluorescent dyes) are formed inside or on the surface of the base particles made of organic or inorganic substances. Nano-sized particles having a structure in which a plurality of particles are fixed and accumulated (diameter of 1 ⁇ m or less) are preferable, and particles that can emit fluorescence with sufficient luminance are preferable.
  • Such phosphor-aggregated particles have a higher fluorescence intensity (brightness) when labeling the target protein compared to the case where the phosphor is used alone (one molecule without being accumulated), and the cell self-propagation. It is preferably used in fluorescent staining because it is highly distinguishable from noise such as fluorescence and other dyes, and is less likely to be deteriorated by irradiation with excitation light (higher light resistance) than a phosphor alone.
  • the phosphor accumulated on the phosphor-aggregated particles is not particularly limited, and various known organic fluorescent dye molecules and semiconductor nanoparticles (sometimes referred to as quantum dots) can be used, for example.
  • organic fluorescent dye integrated particles phosphor integrated particles when organic fluorescent dyes are used as phosphors
  • semiconductor nanoparticles are used as phosphors
  • inorganic phosphor integrated particles phosphor integrated particles when semiconductor nanoparticles are used as phosphors
  • a phosphor that emits fluorescence having a desired wavelength (color) may be selected according to a desired use.
  • Organic fluorescent dye integrated particles are preferably nano-sized fluorescent particles in which a plurality of organic fluorescent dyes are integrated inside or on the surface of a substance serving as a base of the particles.
  • organic fluorescent dye examples include a fluorescein dye, a rhodamine dye, an Alexa Fluor (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dye, a BODIPY (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dye, and a cascade (registered trademark, Invitrogen).
  • Low molecular organic compounds such as dyes, coumarin dyes, NBD (registered trademark) dyes, pyrene dyes, cyanine dyes, perylene dyes, oxazine dyes, and pyromethene dyes ).
  • rhodamine dyes such as sulforhodamine 101 and its hydrochloride, such as TexasRed (registered trademark), perylene dyes such as perylene diimide, and pyromethene dyes such as pyromethene 556 are preferable because of their relatively high light resistance.
  • Examples of the matrix constituting the organic fluorescent dye integrated particles include substances that can integrate organic fluorescent dyes with physical or chemical bonding force, such as resin and silica, and resins are preferable.
  • resins are preferable.
  • Hydrophobic compounds such as polystyrene, polymelamine, and silica, particularly melamine resins and styrene resins, are preferred because they facilitate the production of fluorescent dye-aggregated particles and provide particles with high emission intensity.
  • organic fluorescent dye integrated particles produced using a fluorescent dye such as perylene diimide, sulforhodamine 101 or its hydrochloride (Texas Red), pyromethene as a phosphor, and a resin such as melamine resin or styrene resin as a matrix. From the viewpoint of excellent labeling performance and the like, the phosphor-aggregated particles are preferable.
  • the inorganic phosphor aggregated particles are preferably nano-sized phosphor particles in which a plurality of semiconductor nanoparticles are accumulated inside or on the surface of a substance serving as a base of the particles.
  • the semiconductor nanoparticles are not particularly limited, and examples thereof include II-VI group compounds, III-V group compounds, or quantum dots containing group IV elements, and particle dots such as CdSe exemplified in International Publication No. 2012/130347. It is done.
  • quantum dots having semiconductor nanoparticles as a core and a shell around the core.
  • the core is CdSe and the shell is ZnS, it is expressed as CdSe / ZnS.
  • semiconductor nanoparticles having a shell include CdSe / ZnS exemplified in International Publication No. 2012/130347.
  • the semiconductor nanoparticles may be surface-treated with an organic polymer or the like as necessary.
  • an organic polymer or the like for example, CdSe / ZnS (manufactured by Invitrogen) whose particle surface is modified with a carboxy group, CdSe / ZnS (manufactured by Invitrogen) whose particle surface is modified with an amino group, and the like can be used.
  • Examples of the matrix constituting the inorganic phosphor aggregated particles include substances that can integrate semiconductor nanoparticles with physical or chemical bonding force, such as resin and silica, and resins are preferable.
  • the resin include thermosetting resins such as melamine resin, urea resin, benzoguanamine resin, phenol resin, xylene resin; styrene resin, (meth) acrylic resin, polyacrylonitrile, AS resin (acrylonitrile-styrene copolymer). And various types of homopolymers and copolymers prepared using one or more monomers such as ASA resin (acrylonitrile-styrene-methyl acrylate copolymer).
  • organic fluorescent dye-aggregated particles and the inorganic phosphor aggregates are publicly known, and details such as the phosphor used for the production thereof and the matrix and the production method, and specific examples of the embodiments are described in, for example, International Publication No. 2013/035703, Reference may be made to International Publication No. 2013/147081, International Publication No. 2014/136776, and the like.
  • the average particle diameter of the phosphor-aggregated particles is preferably 30 to 300 nm, more preferably 40 to 160 nm. In general, the smaller the particle size, the larger the specific surface area and the higher the binding force with the specimen. However, when the average particle size is less than 30 nm, the bright spot that should be observed in the fluorescence observation due to the phosphor integrated particles May not be observed at all or may be difficult to observe. Conversely, when the average particle diameter of the phosphor-aggregated particles exceeds 300 nm, it is difficult to accurately count the bright spots without separating the bright spots, such as too many bright spots observed in fluorescence observation. There is a case.
  • the coefficient of variation indicating the variation in the particle diameter of the phosphor integrated particles is not particularly limited, but is preferably about 20% or less.
  • the particle diameter of the phosphor integrated particles is a diameter obtained by taking an image using a scanning electron microscope (SEM), measuring the cross-sectional area of the resin particles for fluorescent labeling, and setting the measured value as the area of a corresponding circle. It can be measured as (area circle equivalent diameter). After measuring the particle diameter of each of the phosphor-aggregated particles contained in a sufficient number (for example, 1000) of the population, the average particle diameter is calculated as the arithmetic average thereof, and the coefficient of variation is expressed by the formula: 100 ⁇ grains Calculated by standard deviation of diameter / average particle diameter.
  • the average particle diameter of the phosphor-aggregated particles can be adjusted within a desired range by adjusting the conditions during the production.
  • an emulsion polymerization method specifically, (co) polymerizing monomers for synthesizing a resin (thermoplastic resin or thermosetting resin) as a base material of the particles.
  • a resin thermoplastic resin or thermosetting resin
  • the phosphor is added and the phosphor is incorporated into or on the surface of the (co) polymer.
  • micelles having an aqueous phase on the outside and an oil phase on the inside are formed by the surfactant, and the monomer constituting the resin is included in the oil phase inside the micelle.
  • a polymerization reaction is performed inside.
  • the average particle diameter is 30 to 30%. 300 nm particles can be produced.
  • the average particle size of the fluorescent dye-aggregated particles can also be changed by changing the ratio of the resin raw material and the phosphor used in the production of the fluorescent dye-aggregated particles to the entire reaction system. The diameter can be adjusted.
  • the average particle size of the inorganic phosphor aggregated particles is, for example, after producing the inorganic phosphor aggregated particles, classified by a size selective precipitation method, and collecting a fraction of the inorganic phosphor aggregated particles having a predetermined particle size.
  • it can be within a predetermined range.
  • an adsorbate having a lipophilic group is adsorbed on the surface of the inorganic phosphor aggregated particle in advance, and then the inorganic phosphor aggregated particle is dispersed in the lipophilic solvent, and amphiphilic addition is added to the solvent.
  • the agent is added little by little to cause precipitation.
  • the dispersibility of the inorganic phosphor aggregated particles strongly depends on the interaction between the adsorbing group on the particle surface and the solvent, so that by gradually adding the additive, aggregated precipitates are formed in order from the large-sized inorganic phosphor aggregated particles.
  • the precipitate is recovered by centrifugation and redispersed in a solvent, whereby inorganic phosphor-aggregated particles having a narrow particle size distribution can be obtained.
  • examples of the adsorbate having a lipophilic group include compounds having an alkyl group such as heptane, octane, and dodecane, and compounds having 8 to 12 carbon atoms are preferable.
  • examples of the lipophilic solvent include pyridine and hexane
  • examples of the amphiphilic additive include chloroform and methanol.
  • lipophilic groups that can be adsorbed on the surface of inorganic phosphors such as quantum dots include phosphino groups such as trioctylphosphine (TOP), phosphine oxide groups such as trioctylphosphine oxide (TOPOT), phosphate groups, amino groups, etc. Is mentioned.
  • phosphino groups such as trioctylphosphine (TOP)
  • phosphine oxide groups such as trioctylphosphine oxide (TOPOT)
  • phosphate groups amino groups, etc. Is mentioned.
  • the fluorescent premix particle includes a phosphor-aggregated particle modified with a first reactive substance, and a target protein binding substance modified with a second reactive substance.
  • the first reactive substance and the second reactive substance The manufacturing method is not particularly limited as long as it has a structure that is connected by the interaction with the.
  • the phosphor-aggregated particles modified with the first reactive substance and the target protein-binding substance modified with the second reactive substance are prepared, and then mixed in an appropriate dispersion medium such as PBS.
  • an appropriate dispersion medium such as PBS.
  • it can be manufactured by the following first to third steps.
  • First step Step of preparing phosphor-aggregated particles modified with a first reactive substance
  • the first step comprises phosphor-aggregated particles modified with a first reactive substance (hereinafter referred to as “first reactive substance-modified fluorescence”). It is also a process for preparing “body accumulated particles”).
  • This step is for preparing phosphor-aggregated particles modified with streptavidin or the like (first reactive substance in the present invention) used in an immunostaining method (ABC method) using a conventional avidin-biotin complex. It can be set as the embodiment similar to this process.
  • the first reactive substance can be produced according to a known method.
  • the reactive site of the synthesized fluorescent particle and the first reactive substance may be directly linked by a covalent bond or the like, or indirectly, specifically, a linker having reactive functional groups at both ends. And reacting each reactive functional group of the linker with the reactive site of the phosphor-aggregated particle and the reactive site of the first reactive substance to form a covalent bond,
  • the first reactive substance may be linked via a linker.
  • the reactive site possessed by the first reactive substance examples include amino groups, carboxy groups, and thiol groups possessed by general proteins.
  • the reactive site may be a site originally possessed by the first reactive substance, or is introduced into the first reactive substance by using a treatment agent (compound) other than the linker (eg, silane coupling). It may be a site introduced to the particle surface by reacting with a compound such as an agent.
  • a treatment agent compound
  • silane coupling e.g, silane coupling
  • It may be a site introduced to the particle surface by reacting with a compound such as an agent.
  • the first reactive substance is a protein such as streptavidin
  • SATA N-succinimidyl S-acetylthioacetate
  • a thiol group By introducing a thiol group into the amino group originally possessed by the first reactive substance, or by using a reducing agent such as dithiothreitol (DTT). Include a method of generating a thiol group by cleaving the disulfide bond (—S—S—) originally possessed by When such a thiol group is used as a reactive site possessed by the first reactive substance, the reactive functional group that the linker used to bind the phosphor-aggregated particles and the first reactive substance should have a thiol group. Those capable of reacting with, for example, maleimide groups are preferred.
  • the linker may have a reactive functional group that can react with the reactive site of the first reactive substance at one or both ends, and the reactive functional groups at both ends may be the same or different. May be.
  • the linker may be a compound having a chain structure such as a polyoxyalkylene moiety in the molecule, typically a PEG (polyethylene glycol) chain.
  • the function of the linker may be performed by the silane coupling agent itself as described below.
  • silanol groups on the surface of the silica particles may be used as reactive sites of the phosphor accumulation particles (silica particles), or a silane coupling agent is used. Then, reactive sites other than silanol groups introduced on the surface of the silica particles may be used.
  • the silane coupling agent used here is a compound having a hydrolyzable group such as an alkoxy group, an acetoxy group or a halo group at one end and a functional group such as an amino group, a mercapto group or an epoxy group at the other end.
  • a hydrolyzable group such as an alkoxy group, an acetoxy group or a halo group at one end
  • a functional group such as an amino group, a mercapto group or an epoxy group at the other end.
  • a functional group such as the amino group described above can be introduced.
  • the introduced functional group such as an amino group may be used for reacting itself with the reactive site of the first reactive substance, and if necessary, the reactive functional group at one end of the linker.
  • the reactive functional group at the other end of the linker may be used to react with the reactive site of the first reactive substance.
  • a mercapto group or amino group introduced by a silane coupling agent is used as a reactive site of the phosphor-aggregated particles
  • a maleimide group or an N-hydroxysuccinimide (NHS) group is formed at one end as a reactive functional group for the reactive site. It is preferable to use a linker having
  • the reactive sites of the phosphor-aggregated particles are synthesized by the raw materials (monomers, etc.) used to synthesize the resin. It may be a functional group remaining afterwards, or may have a predetermined structure formed by a resin synthesis reaction, or by using a treatment agent (compound) other than the linker described above, the phosphor
  • aggregation particles originally have may be sufficient.
  • a silane coupling agent having a hydrolyzable group (for example, trialkoxy group) for adsorbing to the melamine resin at one end and an amino group at the other end Or reacting with linkers having amino groups at both ends, to introduce amino groups as reactive functional groups corresponding to the reactive sites of the first reactive substance on the surface of the melamine resin particles can do.
  • one amino group of the linker reacts with the reactive site of the melamine resin, for example, melamine and formaldehyde used in the synthesis of the melamine resin in advance. It is a reactive functional group for the methylol group (—CH 2 OH) possessed by methylol melamine that is produced when it is made to react, and the etherified product (—CH 2 OR) produced by further reaction with alcohol.
  • phosphor-aggregated particles whose base material is a styrene resin
  • a monomer having a functional group such as an amino group or an epoxy group in the side chain that can be copolymerized with styrene is used when the styrene resin is synthesized.
  • styrene resin particles having a functional group such as an amino group or an epoxy group on the surface as a reactive site for reacting with the reactive functional group at one end of the linker can be obtained.
  • linker and silane coupling agent for the reaction as described above those having various reactive functional groups at both ends are commercially available and can be easily obtained, and desired reactive functional groups are provided at both ends. Those possessed can also be synthesized according to a known method.
  • the linker can be reacted with the first reactive substance and / or the phosphor-aggregated particles according to a known protocol. Reaction conditions between the linker and the first reactive substance and / or phosphor-aggregated particles, for example, the number (density) of reactive sites of the first reactive substance and / or phosphor-aggregated particles, the linker used for the reaction and the first Fluorescence due to the first reactive substance, depending on the ratio of the number of molecules to one reactive substance and / or phosphor aggregated particles (concentration and volume of each solution), the type and amount of reaction reagent, reaction temperature, reaction time, etc. Since the modification state of the body-aggregated particles can vary, these may be adjusted appropriately.
  • the reaction between the linker and the first reactive substance and the reaction between the linker and the phosphor-aggregated particles may be performed sequentially (or simultaneously if possible).
  • the phosphor-aggregated particles and the linker are first bound, and then the linker having one end bound to the phosphor-aggregated particles and the first reactive substance may be bound.
  • a centrifugal separation process preferably, in order to remove unreacted substances and impurities, a centrifugal separation process, a purification process using a column, and a washing process are performed as necessary. Dispersion) is recovered and used in the third step.
  • Second step Step of preparing target protein-binding substance modified with second reactive substance
  • the second step includes target protein-binding substance modified with second reactive substance (hereinafter “second reactive substance”). It is also a process for preparing "modified protein binding substance”.
  • second reactive substance target protein-binding substance modified with second reactive substance
  • linker having reactive functional groups at both ends
  • the reactive functional group of the target protein-binding substance and the reactive site of the second reactive substance are used as the reactive functional group of the linker.
  • this step is a step for preparing an antibody modified with biotin used in an immunostaining method (ABC method) using a conventional avidin-biotin complex. It can be set as the same embodiment.
  • the linker in the second step the same linker as the linker in the first step described above can be used.
  • the reaction mode between the linker and the second reactive substance (preferably biotin) and the reaction mode between the linker and the target protein-binding substance are both described above due to the common nature of the reaction between the linker and the protein. It may be the same as the reaction mode of the linker and the first reactive substance (preferably streptavidin) in the first step, and may be modified as necessary.
  • a linker having a reactive functional group for example, a maleimide group for a thiol group
  • a linker having a reactive functional group for example, a maleimide group for a thiol group
  • a linker having a reactive functional group for example, a maleimide group for a thiol group
  • a linker having a reactive functional group for example, a maleimide group for a thiol group
  • the reaction between the linker and the second reactive substance (not necessary when using a product such as the kit described above) and the reaction between the linker and the target protein binding substance are sequentially (or possible). You can do it at the same time.
  • the same centrifugal separation treatment, purification using a column, washing treatment, etc. are performed as necessary, and then the second reactive substance-modified protein-binding substance is recovered, and the third step Used in.
  • Third step a step of reacting the first reactive substance-modified phosphor-aggregated particles with a second reactive substance-modified target protein binding substance
  • the third step is the first reactive substance modification prepared in the first step
  • the phosphor-aggregated particles are reacted with the second reactive substance-modified protein-binding substance prepared in the second step to finally produce fluorescent premix particles.
  • the first reactive substance-modified phosphor-aggregated particles and the second reactive substance-modified target protein-binding substance are mixed in an appropriate solvent (for example, in a buffer solution such as PBS).
  • the reaction can be performed for a predetermined time.
  • the third step preferably, in order to remove unreacted substances and impurities, centrifugation treatment, purification treatment using a column, washing treatment, etc. are performed as necessary, and then the fluorescent premix particles are collected and appropriately treated. It can be dispersed in a solvent to form a fluorescent staining solution.
  • DOJIN IgG purification kit -A / G is an adsorption separation type column and can be used as appropriate.
  • a fluorescent staining liquid according to an embodiment of the present invention contains the fluorescent premix particles.
  • the fluorescent staining liquid is dispersed in a suitable dispersion medium, for example, PBS (phosphate buffered saline) containing 1% BSA. As a dispersion.
  • the fluorescent staining solution when used in an embodiment in which two or more types of target proteins are targeted for fluorescent labeling, it may contain two or more types of fluorescent premix particles corresponding to each target protein.
  • the fluorescence wavelength peaks of two or more types of fluorescent premix particles are sufficiently separated from each other so as not to adversely affect the distinguishability of the fluorescence (bright spot) of the fluorescent premix particles that label each target protein.
  • the distance is 100 nm or more.
  • the fluorescent staining liquid using such a plurality of target proteins as a target may be a one-pack type in which two or more types of fluorescent premix particles are contained in the same pack (dispersion), It may be a multi-liquid type in which premix particles are contained in separate packs.
  • the fluorescent staining liquid contains a pack of other reagents (for example, a staining liquid for cell morphology observation) in addition to the single-pack or multi-pack of fluorescent premix particles. But you can.
  • the fluorescent staining solution can be used for various fluorescent staining methods.
  • a target protein contained in the specimen is fluorescently labeled by immunostaining, Used to make stained slides.
  • the fluorescence staining method includes a specimen pretreatment process (deparaffinization process, antigen activation process, cell fixation process, washing process, etc.), staining process (immunostaining process, staining process for morphology observation, fluorescent premixed particles). Treatment, washing treatment, blocking treatment, etc.) and sample post-treatment steps (encapsulation treatment, penetration treatment, dehydration treatment, etc.).
  • the analysis method using the completed stained slide can be performed by an observation / photographing process, an image processing / analysis process using the photographed image, and the like.
  • Such fluorescent staining methods and analysis methods include, for example, International Publication No. 2013/035688, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2015-117980, International Publication No. 2014/136985, International Publication No. 2016/129444, International Publication No. It is possible to implement appropriately by referring to patent documents such as 163209 and based on general or known technical matters.
  • the immunostaining process is a process of staining a specimen (eg, tissue section) to fluorescently label a target protein based on an immunostaining method, and a fluorescent premix contained in a fluorescent staining solution to be used. Depending on the particle embodiment, the immunostaining process embodiment also varies.
  • sample tissue section
  • target protein can be fluorescently labeled and used for pathological diagnosis and the like. Is mentioned.
  • the phosphor-aggregated particles and the primary antibody conform to the immunostaining method (primary antibody method) in which the target protein is directly fluorescently labeled and stained.
  • grains which the primary aptamer connected and the process which combines the fluorescent premix particle in the fluorescent staining liquid with the target protein in a test substance is included.
  • the phosphor-aggregated particles and the secondary antibody conform to the immunostaining method (secondary antibody method) in which the target protein is indirectly fluorescently labeled and stained.
  • the immunostaining method secondary antibody method
  • each of the target proteins includes a treatment of directly or indirectly binding each of the corresponding fluorescent premix particles in the fluorescent staining solution.
  • the fluorescent staining liquid may be a multi-liquid type composed of a set of a plurality of fluorescent staining liquids, each containing one kind of each fluorescent premix particle, or 1 containing all the fluorescent premix particles. There may be a one-component type consisting of two fluorescent staining solutions.
  • the immunostaining process may be performed according to known (ideally standardized) procedures and processing conditions corresponding to the above-described embodiment or other modified embodiments.
  • the specimen slide on which the specimen (tissue section) that has undergone the specimen pretreatment process is placed is used as one or more types of reagents (fluorescent staining solution, etc.) according to the embodiment of the immunostaining process. It may be immersed under suitable temperature and time conditions (eg, overnight at 4 ° C.).
  • the specimen slide is first immersed in a solution containing the primary antibody, and then the obtained specimen slide is fluorescent premixed particles to which the secondary antibody or the secondary aptamer is linked. What is necessary is just to immerse in the fluorescent dyeing liquid containing this.
  • the specimen slide when a multi-liquid type fluorescent staining solution is used, the specimen slide may be immersed in each fluorescent staining solution sequentially.
  • the reagents necessary for the immunostaining treatment can be prepared according to a known method or can be obtained as a commercial product.
  • the stained specimen may be washed with a washing solution such as PBS as necessary.
  • a washing solution such as PBS as necessary.
  • the specimen slide can be washed by immersing the specimen slide in PBS at room temperature for 3 to 30 minutes, and if necessary, the PBS may be replaced during the immersion.
  • the staining process for cell morphology observation is a process usually performed after the immunostaining process, and a specimen (tissue) is used in order to obtain the shape of a cell or tissue and positional information of each part of the cell.
  • the section is stained with a staining liquid for morphological observation.
  • staining liquid for morphological observation typically include staining liquids using pigments such as hematoxylin staining liquid, eosin staining liquid, Papanicolaou (Pap) staining liquid, and the like.
  • the dyeing process using such a dye may be performed according to a general procedure. For example, when hematoxylin and eosin (HE) staining is performed, for example, staining may be performed with Mayer's hematoxylin solution for 5 minutes, washed with running water at 45 ° C. for 3 minutes, and then stained with 1% eosin solution for 5 minutes.
  • HE hematoxylin and eosin
  • Fluorescence staining liquid using phosphor-aggregated particles can also be used as the morphological observation staining liquid.
  • a biological material that is constantly expressed on the cell membrane of a specimen and is a biological material other than the target protein hereinafter also referred to as “reference biological material”.
  • reference biological material a biological material that is constantly expressed on the cell membrane of a specimen and is a biological material other than the target protein
  • Is fluorescently stained with phosphor-aggregated particles whereby phosphor-aggregated particles labeled with a reference biological substance on the cell membrane can be observed as bright spots. Since the region where such bright spots are accumulated is the cell membrane in which the reference biological material is expressed or its vicinity (cell membrane region), the shape of the cell or tissue and the position information of the cell can be obtained.
  • Such a process of fluorescent labeling with a reference biological substance and a solution used therefor are also considered as one embodiment of a staining process and a fluorescent staining solution.
  • the fluorescent premix particles may be
  • the reference biological material from biological materials that are uniformly and constantly expressed on the cell membrane and that express a sufficient amount to achieve the purpose of morphological observation.
  • membrane proteins such as ATPase, cadherin, cytokeratin, EpCAM (Epithelial Cell Adhesion / Activating Molecule: also called epithelial cell adhesion molecule, CD326, KSA or TROP1) can be preferred reference biological materials.
  • the staining agent for fluorescently labeling the reference biological material by fluorescent staining includes phosphor-aggregated particles bonded to a substance that specifically binds to the reference biological material.
  • an antibody that specifically recognizes and binds the protein as the reference biological substance as an antigen can be used.
  • an anti-cadherin antibody can be used.
  • the fluorescent premix particle fixing process is a process performed using a predetermined immobilization reagent after the immunostaining process and before other processes such as a staining process for morphology observation.
  • the target protein labeled with the fluorescent premix particles is immobilized on the specimen (tissue section).
  • a similar fixing process may be performed after the process and before other processes.
  • immobilization reagent examples include a reagent capable of cross-linking the fluorescent premix particles bound to the target protein with the target protein or its surrounding proteins.
  • the fluorescent premix particles are removed from the target protein even if the specimen (tissue section) is immersed in various solutions such as morphological observation staining treatment, blocking treatment, and washing treatment. It is presumed that the problem of reducing the number of fluorescent bright spots of the fluorescent premix particles can be solved by preventing dissociation or liberation from the vicinity of the target protein and observing and photographing the stained slide.
  • immobilization reagent examples include a reaction site (hereinafter referred to as “first reaction site”) present on the surface of the fluorescent premix particle and a protein around a specimen (tissue section).
  • first reaction site a reaction site
  • second reactive site A compound (crosslinking agent) having a reactive site (hereinafter referred to as a “third reactive site” and a “fourth reactive site”, respectively) capable of reacting with each of the sites (hereinafter referred to as “second reactive sites”).
  • first reaction site and the second reaction site examples include functional groups such as amino groups ( ⁇ -amino group of lysine side chain, ⁇ -amino group of N terminal), thiol group, hydroxy group, carboxy group, aromatic ring, etc. Is mentioned.
  • the first reaction site and the second reaction site may be the same or different.
  • examples of the third reaction site and the fourth reaction site include functional groups such as NHS (N-hydroxysuccinimide) group, maleimide group, aldehyde group, epoxy group and iodo group.
  • the third reaction site and the fourth reaction site may be the same or different, and one functional group may have the functions of both the third reaction site and the fourth reaction site (for example, immobilization).
  • the third reaction site and the fourth reaction site may be linked by a linker such as PEG. There may be a plurality of third reaction sites and / or fourth reaction sites in one molecule of the immobilization reagent.
  • Fluorescent premix particle immobilization treatment can be performed by bringing an immobilizing reagent solution having an appropriate concentration into contact with a specimen (tissue section) for an appropriate time.
  • concentration of the immobilization reagent in the immobilization reagent solution can be adjusted as appropriate, but is preferably 1 to 500 ⁇ M, for example.
  • the crosslinking reaction may not proceed sufficiently if the concentration is too high.
  • the intensity of the fluorescence emitted from the fluorescent premix particles is reduced, making it difficult to identify, or staining processing for morphology observation
  • the reaction between the staining solution used in the above and its target is hindered, and there is a risk that the staining by these treatments will be insufficient.
  • the contact time (immobilization treatment time) between the immobilized reagent solution and the specimen can be appropriately adjusted, and is, for example, about several minutes to several hours at room temperature.
  • Blocking treatment is performed, for example, before or after the antigen-antibody reaction in the immunostaining treatment, and nonspecific adsorption of the fluorescent premix particles to the target protein or avidins (on the surface of the fluorescent premix particles ( Examples include treatment for suppressing adsorption of endogenous biotin present in the living body (unreacted site in the premix treatment).
  • Endogenous biotin is abundant in humans in the liver, kidney, muscle, mammary gland, and digestive tract. Conditions such as cryopreservation of tissue sections and cell fixation treatment in specimen preparation processes (types of immobilization reagents used, etc.) ) May not be deactivated. Therefore, when a section derived from the tissue such as a mammary gland is to be stained, it is preferable to perform a blocking treatment for biotin-avidin reaction.
  • the primary antibody or the primary antibody is treated before the treatment for binding the primary antibody or primary aptamer to the target protein (primary antibody treatment).
  • a reference biological substance is used as a staining treatment for morphology observation.
  • Antigen antibody for suppressing non-specific adsorption of a primary antibody (primary aptamer) or secondary antibody (secondary aptamer) to a protein other than a predetermined target antigen may be carried out.
  • the blocking treatment may be performed using a known blocking agent.
  • a BSA-containing PBS buffer or the like can be used for blocking treatment for antigen-antibody reaction, and avidin solution (fluorescent premixed particles bound to endogenous biotin is used for blocking treatment for avidin-biotin reaction. Of 4 reaction sites such as avidin, etc., which has unreacted sites, and biotin solution (avidin, etc., which the fluorescent premix particles have).
  • a blocking reagent such as the “endogenous avidin / biotin blocking kit” manufactured by Nichirei Biosciences
  • the target protein which is the target of the fluorescent staining, is preferably at least one biological substance contained in the specimen, and is also a target of immunostaining that is mainly performed for the quantification or detection of the protein in pathological diagnosis.
  • a protein antigen
  • proteins proteins (so-called biomarkers) related to cancer pathological diagnosis are preferable.
  • PD-L1 Programmed cell death1 ligand 1
  • CTLA4 cytotoxic T lymphocyte antigen-4
  • CD8 CD30, CD48, CD59
  • EGFR HER1 (Epidermal Growth Factor Receptor: epithelium) Growth factor receptor
  • HER2 Human Epidermal Growth Factor Receptor
  • HER3, HER4, VEGFR Vasular Endothelial Growth Factor Receptor
  • IGFR Insulin-like Growth Factor Receptor
  • HGFR hepatocyte growth factor receptor
  • growth factor receptor receptor
  • important inhibitory immune checkpoint molecules on the T cell surface Receptors of the immune system such as PD-1 (Programmed cell death 1), which is the PD-L1 receptor
  • PD-1 Programmed cell death 1 receptor
  • 0.6 mL of the obtained organoalkoxysilane compound was mixed with 48 mL of 99% ethanol, 0.6 mL of tetraethoxysilane (TEOS), 2 mL of ultrapure water, and 2.0 mL of 28% by mass of ammonia water at 5 ° C. for 3 hours. .
  • TEOS tetraethoxysilane
  • the mixed solution prepared in the above step was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, and the supernatant was removed. Ethanol was added to the precipitate to disperse the precipitate, and washing was performed again by centrifugation. Further, the same washing was repeated twice to obtain Texas red integrated silica particles (excitation wavelength: 590 nm, emission wavelength: 620 nm). When 1000 particles of the obtained particles were observed with an SEM, the particle diameter was measured, and the average particle diameter was calculated.
  • the resulting dispersion was washed with pure water to remove excess impurities such as resin materials and fluorescent dyes. Specifically, it was centrifuged at 20000 G for 15 minutes with a centrifuge (Microcooled Centrifuge 3740 manufactured by Kubota Corporation), and after removing the supernatant, it was redispersed by adding ultrapure water and irradiating with ultrasonic waves. Centrifugation, supernatant removal, and washing by redispersion in ultrapure water were repeated 5 times.
  • pyromethene 556-integrated melamine resin particles (excitation wavelength 490 nm, emission wavelength 520 nm) were produced. It was 155 nm when the SEM observation was performed about 1000 of the obtained particle
  • the obtained reaction solution was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, and the supernatant was removed. PBS containing 2 mM EDTA was added thereto, the precipitate was dispersed, and centrifuged again under the same conditions. By performing washing by the same procedure three times, maleimide group-introduced Texas Red integrated silica particles were obtained.
  • the obtained solution was desalted by passing through a gel filtration column (Zaba Spin Desaling Columns: manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) to obtain a mercapto group-introduced streptavidin capable of binding to maleimide group-introduced Texas red integrated silica particles.
  • a gel filtration column Zaba Spin Desaling Columns: manufactured by Funakoshi Co., Ltd.
  • the total amount of the obtained mercapto group-introduced streptavidin (0.04 mg) and maleimide group-introduced Texas red integrated silica particles so that the concentration of the silica particles is 0.67 nM 740 ⁇ L of the liquid mixed with was prepared and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, 10 mM mercaptoethanol was added to stop the reaction.
  • the obtained streptavidin-modified Texas Red integrated silica particles were found to have a density of 0.0311 particles / nm 2 on the surface of the Texas Red integrated silica particles. Are estimated to be connected.
  • Amino group-introduced Texas Red-integrated melamine resin particles were adjusted to a concentration of 3 nM using PBS containing 2 mM EDTA, and SM (PEG) 12 was added to the resulting liquid as a linker to a final concentration of 10 mM. Mix and react for 1 hour at room temperature with stirring.
  • the obtained reaction solution was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, the supernatant was removed, PBS containing 2 mM of EDTA was added to disperse the precipitate, and centrifugation was performed again under the same conditions. By performing washing by the same procedure three times, maleimide group-introduced Texas Red integrated melamine resin particles were obtained.
  • the hydroxylamine treatment produced a deprotected (free) mercapto group from the protected mercapto group, thereby completing the treatment for introducing the mercapto group into streptavidin.
  • the obtained solution was desalted by passing through a gel filtration column (Zaba Spin Desaling Columns) to obtain streptavidin into which a mercapto group was introduced.
  • the total amount (0.04 mg) of the mercapto group-introduced streptavidin prepared as described above was mixed with maleimide group-introduced Texas Red-integrated melamine resin particles and reacted for 1 hour. Thereafter, 10 mM mercaptoethanol was added to the reaction solution to stop the reaction.
  • linker reagent “maleimide-PEG 2 -biotin” (manufactured by Thermo Scientific, product number 21901) was adjusted to 0.4 mM using DMSO. 8.5 ⁇ L of this linker reagent solution was added to the primary antibody solution, mixed, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes to bind biotin to the anti-HER2 antibody via the PEG chain. The obtained reaction solution was passed through a desalting column to purify the biotin-modified anti-HER2 antibody.
  • biotin-modified primary antibody biotin-modified anti-HER2 antibody
  • the absorbance at a wavelength of 300 nm is measured using a spectrophotometer (Hitachi “F-7000”) to obtain a protein in the solution (biotin-modified primary antibody).
  • Antibody) concentration was calculated.
  • a biotin-modified primary antibody solution was obtained by adjusting the concentration of the biotin-modified primary antibody to 6 ⁇ g / mL using a 50 mM Tris solution.
  • an anti-rabbit IgG antibody in which a disulfide bond was reduced to generate a mercapto group that is, a reduced anti-rabbit IgG antibody was produced. Thereafter, the reaction solution was passed through a desalting column “Zeba Desert Spin Columns” (manufactured by Thermo Scientific, Cat. # 89882) to purify the reduced anti-rabbit IgG antibody.
  • a linker reagent solution was obtained by adjusting the linker reagent “maleimide-PEG 2 -biotin” (manufactured by Thermo Scientific, product number 21901) to be 0.4 mM using DMSO. 8.5 ⁇ L of this linker reagent solution was added to the secondary antibody solution, mixed, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes to bind biotin to the anti-rabbit IgG antibody via the PEG chain. The resulting solution was passed through a desalting column to purify the biotin-modified anti-rabbit IgG antibody.
  • biotin-modified secondary antibody biotin-modified anti-rabbit IgG antibody
  • the absorbance at a wavelength of 300 nm is measured using a spectrophotometer (Hitachi “F-7000”) to obtain a protein in the solution (biotin-modified).
  • the concentration of the secondary antibody was calculated.
  • a biotin-modified secondary antibody solution was obtained by adjusting the concentration of the biotin-modified secondary antibody to 6 ⁇ g / mL using a 50 mM Tris solution.
  • biotin-modified HER2 antigen recognition RNA aptamer was adjusted with a 50 mM Tris solution so that the concentration thereof was 6 ⁇ g / mL to obtain a biotin-modified HER2 antigen recognition RNA aptamer solution.
  • the obtained biotin-modified rabbit IgG recognition RNA aptamer was adjusted with a 50 mM Tris solution so that the concentration thereof was 6 ⁇ g / mL, thereby obtaining a biotin-modified rabbit IgG recognition RNA aptamer solution.
  • the DNP-modified anti-mouse IgG antibody solution was obtained by adjusting the prepared DNP-modified anti-mouse IgG antibody with a 50 mM Tris solution so that the concentration thereof was 6 ⁇ g / mL.
  • the FITC-modified anti-rabbit IgG antibody solution was obtained by adjusting the prepared FITC-modified anti-rabbit IgG antibody so as to have a concentration of 6 ⁇ g / mL using a 50 mM Tris solution.
  • the sample pretreatment step deparaffinization treatment, activation treatment
  • staining step primary antibody treatment, secondary antibody treatment, fluorescent labeling treatment
  • a staining slide based on the immunostaining method was prepared by performing a phosphor-aggregated particle fixing process and a morphology observation staining process) and a specimen post-processing step (encapsulation process) (see FIG. 4). Thereafter, using the prepared staining slide, observation and imaging were performed according to the procedure shown in (4) below.
  • Specimen pretreatment step (1-1) Deparaffinization Tissue array slide (CB-A712) (HER2) manufactured by Cosmo Bio, whose FISH score was calculated in advance using Pathvision HER-2 DNA probe kit (Abbott) Positive staining control specimens) were used.
  • the tissue array slide was deparaffinized by the following procedures (i) to (iii).
  • Phosphor-aggregated particle immobilization treatment was performed by immersing the tissue array slide subjected to the fluorescence labeling treatment (2-1A) in 4% neutral paraformaldehyde aqueous solution for 10 minutes. It was.
  • a fluorescence microscope (OLYMPUS "BX-53") is used to obtain a predetermined excitation light (a wavelength corresponding to the excitation wavelength of Texas Red used as the fluorescent dye). Excitation light) was irradiated to observe the emitted fluorescence, and a fluorescent dyed image was taken with a digital camera for microscope (“DP73” manufactured by Olympus). The excitation light was set to 575 to 600 nm using an optical filter for excitation light. The range of the wavelength (nm) of the fluorescence to be observed was set to 612 to 692 nm by passing through the fluorescence optical filter.
  • the conditions of the excitation wavelength at the time of microscopic observation and image photographing were such that the irradiation energy in the vicinity of the center of the field of view was 900 W / cm 2 with excitation at 580 nm.
  • the exposure time at the time of image capturing was arbitrarily set (for example, set to 4000 ⁇ sec) so that the luminance of the image was not saturated.
  • image processing software ImageJ open source
  • a stained image by hematoxylin staining was photographed by observation and image photographing in a bright field of a fluorescence microscope.
  • the number of bright spots per cell was counted by superimposing the image of fluorescent staining and the image of hematoxylin staining by image processing.
  • the number of bright spots for 1000 cells was counted, and the average value obtained was taken as the number of bright spots in each tissue section.
  • the photographed fluorescent stained image is shown in FIG.
  • the average luminance (luminance per pixel) of the obtained fluorescent dyed image was 141.
  • Example 1 Preparation of fluorescent staining solution (No. 1) containing anti-HER2 antibody-linked Texas Red-integrated silica particles and photographing fluorescent staining image using the same. 0.02 nM streptavidin obtained in Preparation Example 4 25 ⁇ L of the modified Texas Red-integrated silica particle dispersion (reaction solution 1) and 25 ⁇ L of the biotin-modified anti-HER2 antibody (primary antibody) solution (reaction solution 2) having a concentration of 6 ⁇ g / mL obtained in Preparation Example 8 were mixed. By reacting at room temperature for 1 hour, a fluorescent staining solution (No. 1) containing anti-HER2 antibody (primary antibody) -linked Texas Red integrated silica particles (fluorescent premix particles) was prepared.
  • the obtained fluorescent premix particles are estimated to have an anti-HER2 antibody linked to the surface of Texas Red integrated silica particles at a density of 0.012 particles / nm 2 .
  • the concentration of the fluorescent staining solution (No. 1) containing fluorescent premix particles, which are anti-HER2 antibody (primary antibody) -linked Texas Red integrated silica particles is adjusted to 0.02 nM using a 50 mM Tris solution. did. This solution was dropped onto a tissue section on a tissue array slide and allowed to react overnight at 4 ° C.
  • Example 2 Preparation of fluorescent staining solution (No. 2) containing anti-HER2 antibody-linked Texas Red-integrated silica particles and photographing of fluorescent staining image using the same Strain of 0.02 nM obtained in Preparation Example 4
  • a fluorescent staining solution (No. 2) containing anti-HER2 antibody (primary antibody) -linked Texas Red integrated silica particles (fluorescent premix particles) was prepared.
  • the obtained fluorescent premix particles are estimated to have an anti-HER2 antibody linked to the surface of Texas Red integrated silica particles at a density of 0.030 particles / nm 2 .
  • a staining slide was prepared and a fluorescent staining image was taken in the same manner as in Example 1 except that the obtained fluorescent staining solution (No. 2) was used.
  • the average luminance of the obtained fluorescent stained image was 688.
  • Example 3 Preparation of fluorescent staining solution (No. 3) containing anti-HER2 antibody-linked Texas Red-integrated silica particles and photographing of fluorescent staining image using the same. Strept at 0.02 nM concentration obtained in Preparation Example 4 By mixing 95 ⁇ L of the avidin-modified Texas Red-integrated silica particle dispersion and 5 ⁇ L of the biotin-modified anti-HER2 antibody (primary antibody) solution having a concentration of 6 ⁇ g / mL obtained in Preparation Example 8, and reacting at room temperature for 1 hour, A fluorescent staining solution (No. 3) containing anti-HER2 antibody (primary antibody) -linked Texas Red integrated silica particles (fluorescent premix particles) was prepared.
  • the obtained fluorescent premix particles are estimated to have an anti-HER2 antibody linked to the surface of Texas Red-integrated silica particles at a density of 0.003 particles / nm 2 .
  • Example 1 Except for using the obtained fluorescent staining solution (No. 3), a staining slide was prepared and a fluorescent staining image was taken in the same manner as in Example 1. The average luminance of the obtained fluorescent stained image was 630.
  • Example 4 Preparation of fluorescent staining solution (No. 4) containing anti-HER2 antibody-linked Texas Red-integrated silica particles and photographing of fluorescent staining image using the same Strain of 0.02 nM obtained in Preparation Example 4
  • a fluorescent staining solution (No. 4) containing anti-HER2 antibody (primary antibody) -linked Texas Red integrated silica particles (fluorescent premix particles) was prepared.
  • the obtained fluorescent premix particles are estimated to have an anti-HER2 antibody linked to the surface of Texas Red integrated silica particles at a density of 0.001 particles / nm 2 .
  • a staining slide was prepared and a fluorescent staining image was taken in the same manner as in Example 1 except that the obtained fluorescent staining solution (No. 4) was used.
  • the average luminance of the obtained fluorescent stained image was 472.
  • Example 5 Preparation of fluorescent staining solution (No. 5) containing purified anti-HER2 antibody-linked Texas Red-integrated silica particles and photographing fluorescent staining image using the same First, in the same procedure as in Example 1, A fluorescent staining solution (No. 1) was prepared.
  • the fluorescent staining liquid (No. 5) was prepared by purifying the fluorescent staining liquid (No. 1) by the following procedure.
  • protein A (“21184” manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) was further reacted to bind the amino group of protein A to the active esterified carboxyl group by dehydration reaction.
  • the protein A-binding resin thus obtained was packed in a column (1 mL syringe) to produce a protein A-binding resin column.
  • Step B Purification of Anti-HER2 Antibody-Linked Fluorescent Premix Particles Protein A-binding resin prepared in Step A by flowing 5 mL of buffer A (0.1 M glycine + 1.2 M sodium tartrate, pH 9.0) three times The column was equilibrated.
  • buffer A 0.1 M glycine + 1.2 M sodium tartrate, pH 9.0
  • 1.5 mL of the fluorescent staining solution (No. 1) is diluted with 1.5 mL of buffer A and added to an equilibrated protein A binding resin column, and anti-HER2 antibody (IgG) in the fluorescent premix particles is added. Binding to protein A in a protein A binding resin column. After washing the column with 10 mL of buffer A, 3 mL of 0.1 M glycine-HCl (pH 2.8) was flowed to desorb the fluorescent premix particles to obtain a fluorescent staining solution (No. 5).
  • a staining slide was prepared and a fluorescent staining image was taken in the same manner as in Example 1 except that the obtained fluorescent staining solution (No. 5) was used.
  • the obtained fluorescent staining solution No. 5
  • the obtained fluorescent staining image almost no bright spots derived from the aggregated fluorescent premix particles were found, and the average luminance was maintained at a high value of 540.
  • Example 6 Preparation of fluorescent staining solution (No. 6) containing primary aptamer-linked Texas Red-integrated silica particles and photographing of fluorescent staining image using the same Strain of 0.02 nM obtained in Preparation Example 4 Mixing 25 ⁇ L of avidin-modified Texas Red-integrated silica particle dispersion and 25 ⁇ L of a 6 ⁇ g / mL biotin-modified HER2 antigen recognition RNA aptamer (primary aptamer) solution obtained in Preparation Example 10 and reacting at room temperature for 1 hour Thus, a fluorescent staining solution (No. 6) containing HER2 antigen-recognizing RNA aptamer (primary aptamer) -linked Texas Red-integrated silica particles (fluorescent premix particles) was prepared.
  • a staining slide was prepared and a fluorescent staining image was taken in the same manner as in Example 1 except that the obtained fluorescent staining solution (No. 6) was used.
  • the average luminance of the obtained fluorescent dyed image was 1701. *
  • Example 7 Preparation of fluorescent staining solution (No. 7) containing secondary aptamer-linked Texas Red-integrated melamine resin particles and photographing of fluorescent staining image using the same. Concentration of 0.02 nM obtained in Preparation Example 5 Streptavidin-modified Texas Red-integrated melamine resin particle dispersion 25 ⁇ L and biotin-modified rabbit IgG recognition RNA aptamer (secondary aptamer) solution 25 ⁇ L obtained in Preparation Example 11 were mixed and reacted at room temperature for 1 hour. By doing so, a fluorescent staining solution (No. 7) containing a rabbit IgG-recognizing RNA aptamer (secondary aptamer) -linked Texas Red-integrated melamine resin particle (fluorescent premix particle) was prepared.
  • Comparative Example 1 except that (2-1A) was changed to the method shown in (2-1C) below, a stained slide was prepared and a fluorescent stained image was taken in the same manner as Comparative Example 1. The average luminance of the obtained fluorescent dyed image was 1920.
  • Example 8 Preparation of fluorescent staining solution (No. 8) containing two types of fluorescent premix particles and photographing of fluorescent staining image using the same [0209] Anti-DNP antibody having a concentration of 0.02 nM obtained in Preparation Example 6 By mixing 10 ⁇ L of the modified pyromethene 556-integrated melamine resin particle dispersion with 90 ⁇ L of the DNP-modified anti-mouse IgG antibody (secondary antibody) solution having a concentration of 6 ⁇ g / mL obtained in Preparation Example 12, and reacting at room temperature for 1 hour. As a first fluorescent premix particle, a fluorescent staining solution (No. 8A) containing anti-mouse IgG antibody (secondary antibody) -linked pyromethene 556-integrated melamine resin particles was prepared.
  • the resulting fluorescent staining liquids (No. 8A) and (No. 8B) are mixed to contain an equal amount of the first and second fluorescent premix particles. No. 8) was prepared.
  • USBiomax Lung Tissue Array Slide “LC241b” Tewo sections of tumor tissue and normal tissue derived from 6 patients, and one section of pheochromocytoma (tissue marker), totaling 25 sections Purchased a slide glass.
  • the sample pretreatment step deparaffinization treatment, activation treatment
  • staining step double immunostaining treatment, phosphor
  • the staining slide based on the immunostaining method was prepared by performing the integrated particle fixing process and the morphological observation staining process) and the specimen post-processing process (encapsulation process). Thereafter, using the prepared staining slide, observation and imaging were performed according to the procedure shown in (4) below.
  • Sample pretreatment step (1-1) Deparaffinization treatment (i) The tissue array slide was immersed in a container containing xylene for 15 minutes. The xylene was changed twice during the process.
  • the one-component fluorescent staining solution (No. 8) is diluted with PBS containing 1% BSA so that the concentration of each premix particle is 0.1 nM, and the diluted solution is obtained in (i). The tissue array slide was left overnight.
  • Fluorescent premix particles target protein-binding substance-linked fluorescent substance integrated particles
  • 10 Fluorescent substance integrated particle
  • 15 Linker 20: First reactive substance 21: Streptavidin 30: Second reactive substance 31: Biotin 40: Target protein binding substance 41: Primary antibody 42: Secondary antibody 100: Tissue Section 150: Protein of interest

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Abstract

本発明は、蛍光プレミックス粒子、それを含有する蛍光染色液、およびそれらを用いた蛍光染色法に関し、該蛍光プレミックス粒子は、第１反応性物質で修飾された蛍光体集積粒子と、第２反応性物質で修飾された、抗体およびアプタマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の目的タンパク質結合性物質とが、第１反応性物質と第２反応性物質との相互作用により連結している粒子である。

Description

蛍光プレミックス粒子、それを含有する蛍光染色液、およびそれらを用いた蛍光染色法
　本発明は、蛍光プレミックス粒子、それを含有する蛍光染色液、およびそれらを用いた蛍光染色法に関する。
　病理診断は、患者から採取した組織や細胞を用いて標本スライドを作製し、所定の方法で染色することによって取得される染色画像に基づいて、細胞または組織の形態を観察するとともに、特定の生体物質の発現状態を評価することにより、その患者が特定の疾患に罹患しているか否か、あるいは特定の治療薬が奏功するか否かといった様々な事象を判断する方法である。
　病理診断では、腫瘍組織を採取して作製された検体を用いて、がん遺伝子の一種であるＨＥＲ２遺伝子（HER2/neu、c-erbB-2）および／またはＨＥＲ２遺伝子から産生される膜タンパク質であるＨＥＲ２タンパクを定量し、評価することによって、乳がん患者の予後を診断したり、分子標的治療薬「トラスツズマブ」（商品名「ハーセプチン」（登録商標）、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体）による治療効果を予測する方法が広く行われている。ＨＥＲ２タンパク質は、ホモ二量体もしくは活性化したＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４と結合したヘテロ二量体を形成してシグナル伝達を行うと考えられており、がん細胞増殖因子の受容体として機能していると推定される（これまでのところＨＥＲ２に結合する内因性リガンドは知られていない）。
　腫瘍組織を対象としたＨＥＲ２の検査法としては、ＨＥＲ２タンパク質を染色する免疫組織化学（ＩＨＣ）法とＨＥＲ２遺伝子を染色する蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法が挙げられる。検査の手順および判定基準（スコア）については、米国臨床腫瘍学会および米国病理学会により発行されているＡＳＣＯ／ＣＡＰ　ＨＥＲ２検査ガイドライン（２００７年制定、２０１３年改訂）が各国において広く用いられており、日本でも、改訂されたＡＳＣＯ／ＣＡＰのＨＥＲ２検査ガイドラインに準拠したＨＥＲ２検査ガイド（ＨＥＲ２検査ガイド第四版、乳癌ＨＥＲ２検査病理部会、２０１４年４月）が用いられている。
　ＩＨＣ法では、酵素標識された抗体を検体に接触させ、抗原抗体反応を利用して検出の目的となるタンパク質と抗体とを直接的または間接的に結合させた後に、その酵素に対応した基質を反応させることで発色させる方法が一般的に用いられており、例えば、酵素としてペルオキシダーゼを用い、基質としてジアミノベンジジンを用いるＤＡＢ染色法が広く採用されている。
　しかしながら、ＤＡＢ染色法のような酵素と基質との反応に基づく染色法は、発色濃度が温度・時間などの条件により大きく左右されるため、発色濃度から実際の目的となるタンパク質の量を正確に見積もることが難しいという課題があった。
　そこで近年、遺伝子またはタンパク質を標識するために、有機蛍光色素や半導体ナノ粒子（量子ドット）などの蛍光体を複数個集積させたナノサイズの粒子、すなわち蛍光体集積粒子（ｐｈｏｓｐｅｒ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｐａｒｔｉｃｌｅ；ＰＩＤ、「蛍光物質集積ナノ粒子」などと呼ばれることもある。）を用いる方法が提案され、実用化が進められている。蛍光体集積粒子を用いて目的とするタンパク質または遺伝子を標識し、その蛍光体に適合する励起光を照射することで、標識されたタンパク質または遺伝子を輝度の高い輝点として観察することが可能となり、タンパク質または遺伝子が発現している位置および量を正確に評価することが可能である。また、蛍光体集積粒子は従来用いられてきた染色剤よりも褪色しにくいため、比較的長時間の観察や撮像が可能となるという利点を有する。
　蛍光体集積粒子を用いて検体に含まれるタンパク質を蛍光標識する方法としては、以下の方法が知られている。例えば、特許文献１（国際公開第２０１４／１３６８８５号）の実施例では、粒子表面をストレプトアビジンで修飾した蛍光体集積粒子（色素樹脂粒子）を作製しておき、組織切片上の抗原（ＨＥＲ２タンパク）に１次抗体（抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体）を結合させ、続いてビオチンで標識した２次抗体（抗ウサギＩｇＧ抗体）を該１次抗体に結合させた後、ストレプトアビジン修飾蛍光体集積粒子を該２次抗体に結合させるという、蛍光標識法（アビジン－ビオチン併用２次抗体法）が開示されている。
　ここで、ストレプトアビジン修飾蛍光体集積粒子の作製は、以下の方法で行われている。
　（ｉ）母体としてメラミン樹脂を用いて蛍光色素を集積（内包）した樹脂粒子を形成した後、そのメラミン樹脂にシランカップリング剤である３－アミノプロピルトリメトキシシランを反応させることで粒子表面にアミノ基を導入し、さらにそのアミノ基にリンカーとしてのスクシンイミジル－［（Ｎ－マレイミドプロピオンアミド）－ドデカエチレングリコール］エステルを反応させることで、メラミン樹脂粒子表面にマレイミド基を導入する。
　（ｉｉ）ストレプトアビジンとＮ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオ酢酸とを反応させて、ストレプトアビジンにチオール基を導入する。
　（ｉｉｉ）前記（ｉ）のメラミン樹脂粒子のマレイミド基と、前記（ｉｉ）のストレプトアビジンのチオール基とを反応させて、両者を結合させる。
　また、特許文献２（国際公開第２０１６／１２９４４４号）では、特定の還元剤を用いた処理によって適度な数のジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）を還元してチオール基（－ＳＨ）を生成させた抗体と、そのチオール基と反応しうる結合基（例えばマレイミド基）を表面に導入した蛍光体集積ナノ粒子とを反応させることにより、粒子表面の単位面積あたり適度な数の抗体を結合させた抗体結合蛍光体集積ナノ粒子が開示されている。前記抗体は、ＩＨＣ法における直接法で用いられる１次抗体であってもよいし、間接法で用いられる２次抗体等であってもよいとされる。
　例えば、特許文献２の実施例では、以下の方法で作製した抗体修飾蛍光色素内包シリカナノ粒子を用いてＨＥＲ２の免疫染色を行う実施形態が開示されている。
　（ｉ）原材料として３－アミノプロピルトリメトキシシランおよび蛍光色素である５－カルボキシテトラメチルローダミン（登録商標「ＴＡＭＲＡ」）を用いて蛍光色素内包シリカナノ粒子を形成し、そのシリカナノ粒子にリンカーとしてのスクシンイミジル－［（Ｎ－マレイミドプロピオンアミド）－ドデカエチレングリコール］エステル（製品名「ＳＭ（ＰＥＧ）12」）を反応させることで、粒子表面にマレイミド基を導入する。
　（ｉｉ）１次抗体（抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体）または２次抗体（抗ウサギＩｇＧ抗体）を、還元剤として２－メルカプトエタノール等を用いて処理し、ジスルフィド結合を還元してチオール基を生成する。
　（ｉｉｉ）前記（ｉ）のシリカナノ粒子のマレイミド基と、前記（ｉｉ）の１次抗体または２次抗体のチオール基とを反応させて両者を結合させる。
国際公開第２０１４／１３６８８５号 国際公開第２０１６／１２９４４４号
　特許文献１、２等に記載されているような従来の蛍光体集積粒子を用いた免疫染色法でも、検体に含まれる目的タンパク質を一定の精度で蛍光標識することはできるが、蛍光体集積粒子の目的タンパク質への結合性が不十分で、染色条件によっては感度、すなわち目的タンパク質を十分な精度で検出できない場合があり、染色性には改善の余地があった。
　本発明の一実施形態では、蛍光体集積粒子を用いて検体に含まれる目的タンパク質を蛍光標識する方法において、従来よりも感度を向上させるための手段を提供することを課題とする。
　本発明者が鋭意検討した結果、下記構成例によれば、前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明の構成例は以下の通りである。
　［１］　第１反応性物質で修飾された蛍光体集積粒子と、第２反応性物質で修飾された、抗体およびアプタマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の目的タンパク質結合性物質とが、第１反応性物質と第２反応性物質との相互作用により連結している、蛍光プレミックス粒子。
　［２］　前記第１反応性物質がストレプトアビジンであり、前記第２反応性物質がビオチンである、［１］に記載に記載の蛍光プレミックス粒子。
　［３］　前記目的タンパク質結合性物質が、目的タンパク質に特異的に結合する１次抗体または１次アプタマーである、［１］または［２］に記載の蛍光プレミックス粒子。
　［４］　前記目的タンパク質結合性物質が、目的タンパク質に特異的に結合する１次抗体に特異的に結合する２次抗体または２次アプタマーである、［１］または［２］に記載の蛍光プレミックス粒子。
　［５］　前記蛍光体集積粒子が、樹脂製の母体と蛍光体とを含む粒子である、［１］～［４］のいずれかに記載の蛍光プレミックス粒子。
　［６］　前記蛍光体集積粒子の表面の単位面積あたりに連結している前記目的タンパク質結合性物質の数が、０．００３～０．０１２個／ｎｍ2である、［１］～［５］のいずれかに記載の蛍光プレミックス粒子。
　［７］　［１］～［６］のいずれかに記載の蛍光プレミックス粒子を含有する蛍光染色液。
　［８］　発光波長のピークが互いに１００ｎｍ以上離れている２種類以上の蛍光プレミックス粒子を含有する、一液型または多液型である、［７］に記載の蛍光染色液。
　［９］　［３］に記載の蛍光プレミックス粒子を含有する蛍光染色液を使用する染色法であって、
　目的タンパク質に前記蛍光染色液中の蛍光プレミックス粒子を結合させる処理を含む、蛍光染色法。
　［１０］　［４］に記載の蛍光プレミックス粒子を含有する蛍光染色液を使用する染色法であって、
　目的タンパク質に前記１次抗体を結合させる処理、および
　目的タンパク質に結合させた１次抗体に前記蛍光染色液中の蛍光プレミックス粒子を結合させる処理を含む、蛍光染色法。
　［１１］　［８］に記載の蛍光染色液を使用する染色法であって、
　２種以上の目的タンパク質のそれぞれに、前記蛍光染色液中の対応する蛍光プレミックス粒子のそれぞれを、直接的または間接的に結合させる処理を含む、蛍光染色法。
　本発明の一実施形態によれば、従来よりも目的タンパク質を蛍光標識する際の感度を著しく向上させ、目的タンパク質の定量の精度を改善することができる。
図１は、本発明の一実施形態の蛍光プレミックス粒子を表す概略模式図である。［１Ａ］は、リンカー（１５）を介して第１反応性物質（２０）、例えばストレプトアビジン（２１）で修飾された蛍光体集積粒子（１０）を示し、［１Ｂ］は、第２反応性物質（３０）、例えばビオチン（３１）で修飾された目的タンパク質結合性物質（抗体またはアプタマー）（４０）を示し、［１Ｃ］は、前記［１Ａ］の第１反応性物質（２０）と前記［１Ｂ］の第２反応性物質（３０）とが相互作用により連結することで形成された、蛍光プレミックス粒子（１）を示す。 図２は、１次抗体が連結された蛍光プレミックス粒子を用いる、本発明の蛍光染色法の一実施形態（１次反応型染色法）の手順を表す概略模式図である。［２Ａ］は、染色工程開始前の、組織切片（１００）上の目的タンパク質（１５０）が未反応の状態を示し、［２Ｂ］は、目的タンパク質（１５０）に、１次抗体（４１）が連結された蛍光プレミックス粒子（１）を結合させる処理を示す。 図３は、２次抗体が連結された蛍光プレミックス粒子を用いる、本発明の蛍光染色法の一実施形態（２次反応型染色法）の手順を表す概略模式図である。［３Ａ］は、染色工程開始前の、組織切片（１００）上の目的タンパク質（１５０）が未反応の状態を示し、［３Ｂ］は、目的タンパク質（１５０）に１次抗体（４１）を結合させる処理を示し、［３Ｃ］は、１次抗体（４１）に、２次抗体（４２）が連結された蛍光プレミックス粒子（１）を結合させる処理を示す。 図４は、従来のビオチン－アビジン併用２次抗体法に準じた蛍光染色法の一実施形態の手順を表す概略模式図である。［４Ａ］は、染色工程開始前の、組織切片（１００）上の目的タンパク質（１５０）が未反応の状態を示し、［４Ｂ］は、目的タンパク質（１５０）に１次抗体（４１）を結合させる処理を示し、［４Ｃ］は、１次抗体（４１）にビオチン（３１）で修飾された２次抗体（４２）を結合させる処理を示し、［４Ｄ］は、ビオチン（３１）に、ストレプトアビジン（２１）で修飾された蛍光体集積粒子（１０）を結合させる処理を示す。 図５は、比較例１において撮影された蛍光染色像である。 図６は、実施例１において撮影された蛍光染色像である。
　－蛍光プレミックス粒子－
　本発明の一実施形態に係る蛍光プレミックス粒子は、第１反応性物質で修飾された蛍光体集積粒子と、第２反応性物質で修飾された、抗体およびアプタマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の目的タンパク質結合性物質とが、第１反応性物質と第２反応性物質との相互作用により結合している複合体である。
　本発明者は、例えば、前述した特許文献１に開示されている実施形態（アビジン－ビオチン併用２次抗体法）等の従来の蛍光染色法において、ストレプトアビジン修飾蛍光体集積粒子とビオチン標識１次または２次目的タンパク質結合性物質とを予め反応させて（プレミックスして）複合体を調製しておき、検体（例：組織切片）に含まれる目的タンパク質に該複合体を結合させる、または、目的タンパク質に１次抗体を結合させた後、該複合体をその１次抗体に結合させる、という方法に改変することにより、蛍光標識の感度が著しく向上することを見出した。
　この理由としては次のようなことが考えられる。
　プレミックスすることにより、第１反応性物質と第２反応性物質との結合効率が優れる。
　また、第１反応性物質としてストレプトアビジンを用い、第２反応性物質として、ビオチンを用いる場合、蛍光体集積粒子表面のストレプトアビジン１個につきそれぞれ最大４個のビオチン標識目的タンパク質結合性物質を結合させることができるため（ストレプトアビジン１分子に対して最大ビオチン４分子が結合するため）、蛍光体集積粒子には極めて多くの目的タンパク質結合性物質を担持させることができ、目的タンパク質や１次抗体への結合効率が著しく高くなる。
　なお、「蛍光プレミックス粒子」は、通常、蛍光染色液に含有され、換言すれば蛍光染色液を製造するために使用される。蛍光プレミックス粒子自体は目的タンパク質に結合して蛍光標識する「蛍光染色液」としての機能を果たすため、目的タンパク質に結合する前の蛍光プレミックス粒子に連結されている目的タンパク質結合性物質は未反応の状態である。
　一方、従来の免疫染色法、例えば、目的タンパク質に１次抗体を反応させ、その１次抗体にビオチン修飾２次抗体を反応させ、さらにストレプトアビジン修飾蛍光体集積ナノ粒子を反応させるような実施形態（ビオチン－アビジン併用２次抗体法）では、２次抗体が１次抗体と反応しているため、前記蛍光プレミックス粒子には該当しない。
　蛍光プレミックス粒子は、１個の蛍光体集積粒子の表面に、適度な数の目的タンパク質結合性物質が連結していることが好ましい。具体的には、蛍光体集積粒子の表面の単位面積あたりに連結している目的タンパク質結合性物質の数は、０．００３個／ｎｍ2以上が好ましく、０．００３個／ｎｍ2以上０．０１２個／ｎｍ2以下がより好ましい。後述するような蛍光プレミックス粒子の作製方法（例：第１～第３工程を含む実施形態）における各種の条件を調節することにより、適切な範囲ないし前記好ましい範囲の目的タンパク質結合性物質が表面に連結された蛍光体集積粒子を作製することができる。
　蛍光体集積粒子の表面の単位面積あたりに連結している目的タンパク質結合性物質の数は、例えば国際公開第２０１５／１５９７７６号に記載されている手法を応用して、次のようにして求めることができる：
（ｉ）蛍光体集積粒子の表面に導入した第１反応性物質についての、単位面積あたりの数を測定する；
（ｉｉ）その第１反応性物質１つに対して、最大いくつの第２反応性物質（で修飾された目的タンパク質結合性物質）が結合するか、係数を決定する（例えば、第１反応性物質がアビジン等である場合は４であり、第１反応性物質が抗ハプテン抗体である場合は１である）；
（ｉｉｉ）前記（ｉ）の単位面積あたりの数に、前記（ｉｉ）の係数を乗じた値を、蛍光体集積粒子の表面の単位面積あたりに連結し得る目的タンパク質結合性物質の数の最大値とみなす；
（ｉｖ）反応のために添加した第２反応性物質で修飾された目的タンパク質結合性物質の量が、（ｉｉｉ）の最大値よりも多いときは、その最大値を目的タンパク質結合性物質の単位表面積あたりの数とみなし、（ｉｉｉ）の最大値よりも少ないときは、第２反応性物質で修飾された目的タンパク質結合性物質の添加総数を蛍光体集積粒子の総表面積で除した値を、目的タンパク質結合性物質の単位表面積あたりの数とみなす。
　≪第１反応性物質および第２反応性物質≫
　前記第１反応性物質および第２反応性物質は、相互作用により互いに特異的に結合する物質同士の組み合わせであって、いずれも、目的タンパク質結合性物質とそれが結合する目的タンパク質（または、２次もしくは３次以上の高次目的タンパク質結合性物質）との特異的な結合と交差して反応することのない物質から選択される。第１反応性物質および第２反応性物質としては、いずれも限定されないが、例えば、公知の染色法において目的タンパク質（抗原等）と標識物質（蛍光体等）とを間接的に結合させる際に利用されているものの中から選択することができる。
　例えば、アビジン－ビオチン複合体を利用した免疫染色法（ＡＢＣ法）に準じて、第１反応性物質として、アビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンなどのアビジン類、好ましくはストレプトアビジンを選択し、第２反応性物質としてビオチンを選択することができる。このような実施形態は、１つのアビジン類に対して４つのビオチンが結合することから、目的生体物質をより高感度で検出することができる。特に、１つの蛍光体集積粒子に対してより多くの目的タンパク質結合性物質を連結できるために特に好ましい。
　また、前記アビジン類とビオチンとの組み合わせの代わりに、ハプテン（免疫原性を有さないが抗原性を示し、抗体と反応しうる比較的分子量の低い物質）と抗ハプテン抗体とを、第１反応性物質および第２反応性物質として用いることもできる。
　ハプテンおよび抗ハプテン抗体の組み合わせとしては、例えば、ジコキシゲニンと抗ジコキシゲニン抗体、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）と抗ＦＩＴＣ抗体、ＤＮＰ（２，４－ジニトロフェニル）と抗ＤＮＰ抗体、が挙げられる。
　≪目的タンパク質結合性物質≫
　前記目的タンパク質結合性物質は、抗体およびアプタマーからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、目的タンパク質と直接的にまたは間接的に結合できる物質である。
　該目的タンパク質結合性物質は２種以上であってもよいが、通常、１種である。
　＜抗体＞
　前記抗体は、免疫染色法において目的タンパク質と直接的にまたは間接的に結合できる抗体であれば特に限定されない。該抗体は、目的タンパク質（抗原）に特異的に結合する１次抗体であってもよいし、その１次抗体に特異的に結合する２次抗体、またはそれ以上の高次抗体であってもよいが、１次抗体または２次抗体であることが好ましい。
　１次抗体は、抗原にユニークなエピトープを認識して結合する抗体であり、目的タンパク質の定量の安定性の観点から、ポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体が好ましい２種類以上のモノクローナル抗体を混合して使用する場合、抗体ごとに異なるエピトープについて特異的に結合するモノクローナル抗体の組合せが好ましい。
　１次抗体を産生する免疫動物としては特に限定されず、一般的な動物から選択することができ、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどが挙げられる。
　２次抗体またはそれ以上の高次抗体は、１次抗体または低次抗体にユニークなエピトープ、好ましくはそれらの抗体の目的タンパク質（抗原）等との結合に関与していない領域（Ｆｃ等）に存在するエピトープを認識して結合する抗体である。２次抗体等は、目的タンパク質の定量の安定性の観点から、モノクローナル抗体が好ましいが、経済的な観点からポリクローナル抗体を用いてもよい。
　２次抗体等を産生する免疫動物は、１次抗体を産生する免疫動物として例示した動物種等の中から、１次抗体等を産生する動物種またはＦｃ等の領域を形成している動物種に応じて、適切な動物を選択すればよい。例えば、１次抗体として天然型のマウス抗体（マウスが産生したＩｇＧ）を用いる場合は、２次抗体として、マウス以外の免疫動物（ウサギ等）が産生する、マウスＩｇＧに特異的に結合する抗体を用いることが適切である。
　前記抗体は、いずれのアイソタイプを用いてもよいが、通常はＩｇＧまたはＩｇＭであり、特にＩｇＧが好ましい。抗体は、目的タンパク質または低次抗体を特異的に認識して結合する能力を有する限り、完全長のＩｇＧのような天然型の抗体であってもよいし、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')2、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体断片、または、これらの抗体断片を用いて多機能化（多価化または多重特異性化）された人工抗体などの、非天然型の抗体であってもよい。また、特定の免疫動物に由来する天然型の抗体（例えばマウスによって産生されるマウス抗体）であってもよいし、ベクター等を用いた人工的な手段により作製されるキメラ抗体、ヒト型化抗体または完全ヒト抗体であってもよい。
　＜アプタマー＞
　前記アプタマーとしては、抗体を用いる免疫染色法（直接法または間接法）に準じる方法によって目的タンパク質を特異的に標識できるアプタマーであれば特に限定されない。該アプタマーは、目的タンパク質に特異的に結合する１次アプタマーであってもよいし、目的タンパク質に結合した１次抗体または１次アプタマーに特異的に結合する２次アプタマー、またはそれ以上の高次アプタマーであってもよいが、１次アプタマーまたは２次アプタマーであることが好ましい。
　アプタマーは、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）アプタマーと、ペプチドアプタマーに大別することができ、目的タンパク質または目的タンパク質に結合した抗体や低次アプタマーを特異的に認識して結合する能力を有する限り、核酸アプタマーとペプチドアプタマーのどちらを用いてもよい。
　核酸アプタマーおよびペプチドアプタマーは、公知の手法により作製することができる。
　＜蛍光体集積粒子＞
　前記蛍光体集積粒子（第１反応性物質で修飾される前の粒子）としては、特に制限されないが、有機物または無機物でできた母体となる粒子の内部または表面に、蛍光体（例えば蛍光色素）を複数個固定して集積した構造を有するナノサイズの（直径が１μｍ以下の）粒子であることが好ましく、一粒子で十分な輝度の蛍光を発することができる粒子であることが好ましい。
　このような蛍光体集積粒子は、蛍光体を単独で（集積化せずに一分子で）用いる場合と比較して、目的タンパク質を標識する際の蛍光の強度（輝度）が強く、細胞の自家蛍光等のノイズや他の色素との識別性が高く、また蛍光体単独よりも励起光の照射による劣化が起こりにくい（耐光性の強い）などの点から、蛍光染色において好ましく用いられる。
　蛍光体集積粒子に集積される蛍光体は特に限定されないが、例えば公知の様々な有機蛍光色素分子や半導体ナノ粒子（量子ドット等と称されることもある）を用いることができる。以下、蛍光体として有機蛍光色素を用いた場合の蛍光体集積粒子を有機蛍光色素集積粒子といい、蛍光体として半導体ナノ粒子を用いた場合の蛍光体集積粒子を無機蛍光体集積粒子という。
　蛍光体集積粒子の作製に用いられる蛍光体は、所望の用途に応じ、所望の波長（色）の蛍光を発する蛍光体を選択すればよい。蛍光標識の対象とする目的タンパク質が２種類以上である場合は、それぞれに対応した異なる波長の蛍光を発する蛍光体の組み合わせを選択し、それぞれの蛍光体を集積した蛍光体集積粒子を作製すればよい。そのような２種類以上の蛍光体を用いる場合は、発光波長のピークが互いに１００ｎｍ以上離れている蛍光体を選択することが好ましい。
　（１）有機蛍光色素集積粒子
　有機蛍光色素集積粒子は、粒子の母体となる物質の内部または表面に有機蛍光色素を複数個集積した、ナノサイズの蛍光粒子であることが好ましい。
　有機蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン系色素、ローダミン系色素、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、カスケード（登録商標、インビトロジェン社）系色素、クマリン系色素、ＮＢＤ（登録商標）系色素、ピレン系色素、シアニン系色素、ペリレン系色素、オキサジン系色素、ピロメテン系色素など、低分子有機化合物（ポリマー等の高分子有機化合物ではないもの）からなる蛍光色素が挙げられる。中でも、スルホローダミン１０１およびその塩酸塩であるＴｅｘａｓＲｅｄ（登録商標）などのローダミン系色素や、ペリレンジイミドなどのペリレン系色素、ピロメテン５５６等のピロメテン系色素は、比較的耐光性が高いため好ましい。
　有機蛍光色素集積粒子を構成する母体としては、樹脂やシリカなど、物理的または化学的な結合力で有機蛍光色素を集積化できる物質等が挙げられるが、樹脂が好ましい。具体的には、ポリスチレン、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、ポリグリシジルメタクリレート、ポリメラミン、ポリウレア、ポリベンゾグアナミン、ポリフラン、ポリキシレン、フェノール樹脂、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）等の樹脂；多糖；シリカ等；安定的に有機蛍光色素を集積できる物質等が挙げられる。ポリスチレン、ポリメラミン、シリカなどの疎水性の化合物、特にメラミン樹脂やスチレン樹脂は、蛍光色素集積粒子を作製しやすく、また発光強度の高い粒子が得られるため好ましい。
　たとえば、蛍光体としてペリレンジイミド、スルホローダミン１０１またはその塩酸塩（テキサスレッド）、ピロメテン等の蛍光色素を用い、母体としてメラミン樹脂、スチレン樹脂等の樹脂を用いて作製される有機蛍光色素集積粒子は、標識性能等に優れることから、前記蛍光体集積粒子として好ましい。
　（２）無機蛍光体集積粒子
　無機蛍光体集積粒子は、粒子の母体となる物質の内部または表面に半導体ナノ粒子を複数個集積した、ナノサイズの蛍光粒子であることが好ましい。
　前記半導体ナノ粒子は特に限定されず、ＩＩ－ＶＩ族化合物、ＩＩＩ－Ｖ族化合物またはＩＶ族元素を含有する量子ドット、国際公開第２０１２／１３３０４７号に例示されたＣｄＳｅ等の粒子ドット等が挙げられる。
　また、半導体ナノ粒子をコアとし、その周囲にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。以下、シェルを有する半導体ナノ粒子の表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。
　シェルを有する半導体ナノ粒子としては、具体的には、国際公開第２０１２／１３３０４７号に例示されたＣｄＳｅ／ＺｎＳ等が挙げられる。
　半導体ナノ粒子は必要に応じて、有機ポリマー等により表面処理が施されていてもよい。例えば、粒子表面がカルボキシ基で修飾されているＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、粒子表面がアミノ基で修飾されているＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
　無機蛍光体集積粒子を構成する母体としては、樹脂やシリカなど、物理的または化学的な結合力で半導体ナノ粒子を集積化できる物質等が挙げられるが、樹脂が好ましい。該樹脂としては、例えば、メラミン樹脂、尿素樹脂、ベンゾグアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂等の熱硬化性樹脂；スチレン樹脂、（メタ）アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル－スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）など、１種類または２種類以上のモノマーを用いて作製される各種の単独重合体および共重合体が挙げられる。
　前記有機蛍光色素集積粒子および無機蛍光体集積体は公知であり、その製造に用いられる蛍光体および母体や製造方法などの詳細、実施形態の具体例については、例えば国際公開第２０１３／０３５７０３号、国際公開第２０１３／１４７０８１号、国際公開第２０１４／１３６７７６号などを参照すればよい。
　［蛍光体集積粒子の平均粒子径］
　蛍光体集積粒子の平均粒子径は、好ましくは３０～３００ｎｍ、より好ましくは４０～１６０ｎｍである。一般的に、粒子径が小さくなるほど比表面積が大きくなり、検体との結合力が高まるが、平均粒子径が３０ｎｍを下回ると、蛍光体集積粒子に起因して蛍光観察で観察されるべき輝点が全く観察されないか、または観察されにくい場合がある。逆に、蛍光体集積粒子の平均粒子径が３００ｎｍを上回ると、蛍光観察において観察される輝点が多くなりすぎる等、輝点同士が分離されずに正確に輝点をカウントすることが困難となる場合がある。
　蛍光体集積粒子の粒径のばらつきを示す変動係数は特に限定されないが、２０％程度以下であることが好ましい。
　蛍光体集積粒子の粒子径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて画像を撮影し、蛍光標識用樹脂粒子の断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径（面積円相当径）として測定することができる。十分な数（たとえば１０００個）の集団に含まれる蛍光体集積粒子それぞれついて前記のようにして粒子径を測定した後、平均粒子径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径により算出される。
　蛍光体集積粒子の平均粒子径は、その製造の際の条件を調節することにより、所望の範囲に収まるようにすることができる。
　有機蛍光色素集積粒子の製造方法の一例として、乳化重合法、具体的には、該粒子の母体となる樹脂（熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂）を合成するためのモノマーを（共）重合させながら、蛍光体を添加し、当該（共）重合体の内部または表面に当該蛍光体を取り込ませる方法が挙げられる。乳化重合法における反応系では、界面活性剤により外側が水相で内側が油相のミセルが形成され、該ミセルの内側の油相に前記樹脂を構成するモノマーが包含された状態となり、このミセル内側で重合反応が行われることとなる。このような乳化重合法により有機蛍光色素集積粒子を合成する際に、例えば樹脂原料に対して１０～６０重量％の量の乳化作用を有する界面活性剤を加えることで、平均粒子径が３０～３００ｎｍの粒子を作製できる。また、使用する界面活性剤の量が一定である場合、蛍光色素集積粒子の製造に使用する樹脂原料と蛍光体それぞれの反応系全体に対する割合を変更することによっても、蛍光色素集積粒子の平均粒子径の調節が可能である。
　一方、無機蛍光体集積粒子の平均粒子径は、例えば無機蛍光体集積粒子を製造した後、サイズ選択沈殿法により分級して、所定の粒子径を有する無機蛍光体集積粒子の画分を回収することで、所定の範囲に収めることができる。
　サイズ選択沈殿法とは、予め親油性基を有する吸着物を無機蛍光体集積粒子表面に吸着させた後、親油性溶媒中に無機蛍光体集積粒子を分散させ、溶媒中に両親媒性の添加剤を少量ずつ添加して沈殿させるという方法である。無機蛍光体集積粒子の分散性は、粒子表面の吸着基と溶媒の相互作用に強く依存しているため、添加剤を徐々に加えることで大サイズの無機蛍光体集積粒子から順に凝集沈殿物を形成し、この沈殿を遠心分離で回収し、溶媒中で再分散することで粒子径分布の狭い無機蛍光体集積粒子を得ることができる。
　なお、前記親油性基を有する吸着物としては、へプタン、オクタン、ドデカンなどのアルキル基をもつ化合物が挙げられ、炭素数８～１２の化合物が好ましい。
　また、親油性溶媒としては、ピリジン、へキサンなどが挙げられ、両親媒性の添加剤としてはクロロホルム、メタノールなどが好ましく用いられる。
　量子ドットなどの無機蛍光体集積粒子表面に吸着できる親油性基としては、トリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）等のホスフィノ基、トリオクチルホスフィンオキサイド（ＴＯＰＯＴ）等のホスフィンオキシド基、リン酸基、アミノ基などが挙げられる。
　＜蛍光プレミックス粒子の作製方法＞
　前記蛍光プレミックス粒子は、第１反応性物質で修飾された蛍光体集積粒子と、第２反応性物質で修飾された目的タンパク質結合性物質とが、第１反応性物質と第２反応性物質との相互作用により連結している構造を有していればよく、その作製方法は特に限定されるものではない。
　通常、第１反応性物質で修飾された蛍光体集積粒子、第２反応性物質で修飾された目的タンパク質結合性物質のそれぞれを作製した後、適切な分散媒、例えばＰＢＳ中で混合することによって作製することができ、好ましくは、下記第１～第３工程により作製することができる。
　・第１工程：第１反応性物質で修飾された蛍光体集積粒子の調製工程
　前記第１工程は、第１反応性物質で修飾された蛍光体集積粒子（以下「第１反応性物質修飾蛍光体集積粒子」ともいう。）を調製するための工程である。この工程は、従来のアビジン－ビオチン複合体を利用した免疫染色法（ＡＢＣ法）において用いられる、ストレプトアビジン等（本発明における第１反応性物質）で修飾された蛍光体集積粒子を調製するための工程と同様の実施形態とすることができる。
　第１反応性物質は、公知の手法に従って作製することができる。合成した蛍光体集積粒子が有する反応性部位と第１反応性物質とを共有結合等により直結させてもよいし、間接的に、具体的には、両末端に反応性官能基を有するリンカーを用いて、リンカーのそれぞれの反応性官能基を、蛍光体集積粒子が有する反応性部位および第１反応性物質が有する反応性部位と反応させて共有結合を形成させることにより、蛍光体集積粒子と第１反応性物質とをリンカーを介して連結させてもよい。
　第１反応性物質が有する反応性部位としては、一般的なタンパク質が有するアミノ基、カルボキシ基、チオール基等が挙げられる。反応性部位は、第１反応性物質が元来有する部位であってもよいし、リンカー以外の処理剤（化合物）を用いることで、第１反応性物質に導入された（例：シランカップリング剤等の化合物と反応させることによって粒子表面に導入された）部位であってもよい。例えば、第１反応性物質がストレプトアビジン等のタンパク質である場合、該タンパク質にチオール基を導入するには、Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を反応させた後にヒドロキシルアミンによる脱保護処理を行うことで、第１反応性物質が元来有していたアミノ基にチオール基を導入したり、また、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤を用いた処理により、第１反応性物質が元来有していたジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）を切断してチオール基を生成する方法が挙げられる。第１反応性物質が有する反応性部位としてそのようなチオール基を利用する場合、蛍光体集積粒子と第１反応性物質とを結合させるために用いるリンカーが有すべき反応性官能基はチオール基と反応しうるもの、例えばマレイミド基が好ましい。前記リンカーは、そのような第１反応性物質の反応性部位と反応しうる反応性官能基を一端または両端に有すればよく、両末端の反応性官能基は同じものであっても異なっていてもよい。前記リンカーは、分子中にポリオキシアルキレン部のような鎖状構造、代表的にはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）鎖を有する化合物であってもよい。前記リンカーの機能は、以下に述べるようなシランカップリング剤自体が果たしてもよい。
　蛍光体集積粒子として母体がシリカである粒子を用いる場合、その蛍光体集積粒子（シリカ粒子）が有する反応性部位として、シリカ粒子表面のシラノール基を用いてもよいし、シランカップリング剤を利用してシリカ粒子の表面に導入した、シラノール基以外の反応性部位を用いてもよい。
　ここで用いられるシランカップリング剤は、一端にアルコキシ基、アセトキシ基、ハロ基等の加水分解性基を有し、他端にアミノ基、メルカプト基、エポキシ基等の官能基を有する化合物等が挙げられる。シランカップリング剤の加水分解性基は、加水分解反応によりシラノール基になった後、シリカ粒子表面のシラノール基（または他のシランカップリング剤のシラノール基）と縮合反応を起こすため、シリカ粒子表面に前記のアミノ基等の官能基を導入することができる。
　導入されたアミノ基等の官能基は、それ自身を第１反応性物質が有する反応性部位と反応させるために用いてもよいし、必要に応じて、さらにリンカーの一端にある反応性官能基と反応させることで、リンカーの他端にある反応性官能基を第１反応性物質が有する反応性部位と反応させるために用いてもよい。例えば、シランカップリング剤により導入されたメルカプト基またはアミノ基を蛍光体集積粒子が有する反応性部位とする場合、それらに対する反応性官能基として、一端にマレイミド基またはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基を有するリンカーを用いることが好ましい。
　蛍光体集積粒子として母体が樹脂である粒子を用いる場合、その蛍光体集積粒子（樹脂粒子）が有する反応性部位は、樹脂を合成するために用いた原料（モノマー等）が有していて合成後も残存している官能基であってもよいし、樹脂の合成反応によって形成される所定の構造であってもよいし、前述のリンカー以外の処理剤（化合物）を用いることで、蛍光体集積粒子が元来有する反応性部位に導入された部位であってもよい。
　例えば、母体がメラミン樹脂である蛍光体集積粒子を用いる場合、一端にメラミン樹脂に吸着させるための加水分解性基（例えばトリアルコキシ基）を有し、他端にアミノ基を有するシランカップリング剤を反応させることによって、または両端にアミノ基を有するリンカーを反応させることによって、メラミン樹脂粒子の表面に、第１反応性物質が有する反応性部位に対応した反応性官能基としてのアミノ基を導入することができる。なお、前記の両端にアミノ基を有するリンカーにおいて、リンカーが有する一方のアミノ基が反応するのは、メラミン樹脂が有する反応性部位、例えばメラミン樹脂の合成に用いられる、メラミンとホルムアルデヒドとを予め反応させた際に生じるメチロールメラミンが有するメチロール基（－ＣＨ2ＯＨ）や、それがさらにアルコールと反応することで生成するエーテル化物（－ＣＨ2ＯＲ）に対する反応性官能基である。
　また、母体がスチレン樹脂である蛍光体集積粒子を用いる場合、そのスチレン樹脂を合成する際に、スチレンと共重合しうる、側鎖にアミノ基、エポキシ基等の官能基を有するモノマーを用いることによって、リンカーの一端にある反応性官能基と反応させるための反応性部位として、アミノ基、エポキシ基等の官能基を表面に有するスチレン樹脂粒子が得られる。
　前述したような反応のためのリンカーおよびシランカップリング剤は、両端に様々な反応性官能基を有するものが市販されていて容易に入手することができ、また両端に所望の反応性官能基を有するものは公知の手法に従って合成することも可能である。例えば、ＰＥＧ鎖の一端にＮＨＳ基（アミノ基と反応しうる反応性官能基）、他端にマレイミド基（チオール基と反応しうる反応性官能基）を有するリンカーとして、「ＳＭ(ＰＥＧ)n」（ｎ＝２，４，６，８，１２，２４）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等の製品を用いることができる。
　リンカーと、第１反応性物質および／または蛍光体集積粒子とは、公知のプロトコールに従って反応させることができる。リンカーと、第１反応性物質および／または蛍光体集積粒子との反応条件、例えば第１反応性物質および／または蛍光体集積粒子が有する反応性部位の数（密度）、反応に用いるリンカーと第１反応性物質および／または蛍光体集積粒子との分子数の比率（各溶液の濃度および容量）、反応試薬の種類および使用量、反応温度、反応時間等などによって、第１反応性物質による蛍光体集積粒子の修飾状態は変動しうるので、これらを適切に調節すればよい。
　第１工程では、リンカーと第１反応性物質との反応、およびリンカーと蛍光体集積粒子との反応を、順次（または可能であれば同時に）行えばよい。例えば、まず蛍光体集積粒子とリンカーを結合させ、次に、一端が蛍光体集積粒子に結合しているそのリンカーと第１反応性物質とを結合させればよい。
　第１工程の後、好ましくは未反応物や不純物を除去するために、遠心分離処理、カラムを用いた精製処理、洗浄処理を必要により行ってから、第１反応性物質修飾蛍光体集積粒子（分散液）を回収し、第３工程で用いる。
　・第２工程：第２反応性物質で修飾された目的タンパク質結合性物質の調製工程
　前記第２工程は、第２反応性物質で修飾された目的タンパク質結合性物質（以下「第２反応性物質修飾目的タンパク質結合性物質」ともいう。）を調製するための工程である。典型的には、両末端に反応性官能基を有するリンカーを用いて、リンカーのそれぞれの反応性官能基を、目的タンパク質結合性物質が有する反応性部位および第２反応性物質が有する反応性部位と反応させて共有結合を形成することにより、目的タンパク質結合性物質と第２反応性物質とをリンカーを介して連結する。例えば、第２反応性物質としてビオチンを用いる場合、この工程は、従来のアビジン－ビオチン複合体を利用した免疫染色法（ＡＢＣ法）において用いられる、ビオチンで修飾された抗体を調製するための工程と同様の実施形態とすることができる。
　第２工程のリンカーとしては、前述した第１工程のリンカーと同様のリンカーを用いることができる。また、リンカーと第２反応性物質（好ましくはビオチン）との反応様式、およびリンカーと目的タンパク質結合性物質との反応様式は、リンカーとタンパク質との反応であるという共通性により、いずれも前述した第１工程におけるリンカーと第１反応性物質（好ましくはストレプトアビジン）との反応様式と同様でもよく、必要に応じて改変してもよい。
　また、一端にビオチンが予め結合され、他端に目的タンパク質結合性物質が有する反応性部位に対する反応性官能基（例えば、チオール基に対するマレイミド基）を有するリンカーは、必要な反応試薬等も含めて、いわゆるビオチンラベリングキットのような製品として市販されており、慣用されている。そのようなキットを用いる場合、第２工程は、目的タンパク質結合性物質にビオチン化されたリンカーを結合させるための反応を行うだけでよい。
　第２工程では、リンカーと第２反応性物質との反応（前述したキットのような製品を用いる場合は不要である）、およびリンカーと目的タンパク質結合性物質との反応を、順次（または可能であれば同時に）行えばよい。
　第２工程の反応後、従来と同様の遠心分離処理、カラムを用いた精製処理、洗浄処理等を必要により行ってから、第２反応性物質修飾目的タンパク質結合性物質を回収し、第３工程で用いる。
　・第３工程：第１反応性物質修飾蛍光体集積粒子と第２反応性物質修飾目的タンパク質結合性物質との反応工程
　前記第３工程は、第１工程において調製された第１反応性物質修飾蛍光体集積粒子と、第２工程において調製された第２反応性物質修飾目的タンパク質結合性物質とを反応させて、最終的に蛍光プレミックス粒子を作製するための工程である。
　このような第３工程は、適切な溶媒中で（例えばＰＢＳ等の緩衝液中で）、第１反応性物質修飾蛍光体集積粒子と第２反応性物質修飾目的タンパク質結合性物質とを混合し、所定の時間反応させることで行うことができる。
　第３工程の後、好ましくは未反応物や不純物を除去するために、遠心分離処理、カラムを用いた精製処理、洗浄処理等を必要により行ってから、蛍光プレミックス粒子を回収し、適切な溶媒中に分散させて、蛍光染色液とすることができる。
　前記精製処理については、サイズ分離カラム処理、ゲル濾過カラム処理、吸着分離カラム処理などを用いることができ、粒子よりも小さな分子やタンパク質などを除去するのに適している。DOJIN  IgG purification kit -A/Gは吸着分離型のカラムであり、適宜用いることができる。
　－蛍光染色液－
　本発明の一実施形態に係る蛍光染色液は、前記蛍光プレミックス粒子を含有する。蛍光染色液は一般的に、蛍光プレミックス粒子を調製し、回収した後、その蛍光プレミックス粒子を適切な分散媒、例えば１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に分散させた分散液として調製することができる。
　蛍光染色液を、２種類以上の目的タンパク質を蛍光標識の対象とする実施形態において使用する場合は、各目的タンパク質に対応する２種類以上の蛍光プレミックス粒子を含有していてもよい。その場合、２種類以上の蛍光プレミックス粒子は、各目的タンパク質を標識する蛍光プレミックス粒子の蛍光（輝点）の識別性に悪影響を及ぼさないよう、蛍光波長のピークは互いに十分に離れていることが好ましく、例えば１００ｎｍ以上離れていることが好ましい。また、このような複数の目的タンパク質を対象として用いる蛍光染色液は、２種類以上の蛍光プレミックス粒子が同じパック（分散液）に含まれている一液型であってもよいし、各蛍光プレミックス粒子が別々のパックに含まれている多液型であってもよい。染色方法の実施形態に応じて、蛍光染色液は、蛍光プレミックス粒子の１液型または多液型のパックに加えて、それ以外の試薬（例えば細胞形態観察用の染色液）のパックを含んでもよい。
　－蛍光染色法－
　前記蛍光染色液は、様々な蛍光染色法に利用することができるが、典型的には、検体である組織切片から作製した組織スライドにおいて、検体に含まれる目的タンパク質を免疫染色により蛍光標識した、染色スライドを作製するために利用される。
　蛍光体集積粒子を用いた蛍光染色法および作製された染色スライドを用いた病理診断等の分析法の基本的な実施形態は公知である。蛍光染色法は、一般的には、標本前処理工程（脱パラフィン処理、抗原賦活化処理、細胞固定処理、洗浄処理等）、染色工程（免疫染色処理、形態観察用染色処理、蛍光プレミックス粒子処理、洗浄処理、ブロッキング処理等）、標本後処理工程（封入処理、透徹処理、脱水処理等）などの工程によって実施することができる。また、完成した染色スライドを用いた分析法は、観察・撮影工程、撮影された画像を用いた画像処理・分析工程などによって実施することができる。このような蛍光染色法および分析法は、例えば、国際公開第２０１３／０３５６８８号、特開２０１５－１１７９８０号公報、国際公開第２０１４／１３６８８５号、国際公開第２０１６／１２９４４４号、国際公開第２０１５／１６３２０９号等の特許文献を参照したり、一般的ないし公知の技術的事項に基づくことで、適切に実施することができる。
　≪染色工程≫
　（１）免疫染色処理
　免疫染色処理は、免疫染色法に基づき、目的タンパク質を蛍光標識するために検体（例：組織切片）を染色する処理であり、使用する蛍光染色液に含まれる蛍光プレミックス粒子の実施形態に応じて、免疫染色処理の実施形態も変化する。
　免疫染色法には様々な手法があり、目的タンパク質を蛍光標識して病理診断等に用いることのできるよう検体（組織切片）を染色することができれば特に限定されないが、代表的には次の方法が挙げられる。
　免疫染色処理の第１実施形態（１次反応型染色法）は、目的タンパク質を直接的に蛍光標識し染色する免疫染色法（１次抗体法）に準じた、蛍光体集積粒子と１次抗体または１次アプタマーが連結した蛍光プレミックス粒子を含有する蛍光染色液を用いる実施形態であり、検体における目的タンパク質にその蛍光染色液中の蛍光プレミックス粒子を結合させる処理を含む。
　免疫染色処理の第２実施形態（２次反応型染色法）は、目的タンパク質を間接的に蛍光標識し染色する免疫染色法（２次抗体法）に準じた、蛍光体集積粒子と２次抗体または２次アプタマーが連結した蛍光プレミックス粒子を含有する蛍光染色液を用いる実施形態であり、検体における目的タンパク質に１次抗体または１次アプタマーを結合させる処理、およびその１次抗体または１次アプタマーに蛍光染色液中の蛍光プレミックス粒子を結合させる処理を含む。
　また、前記２つの実施形態を応用した、免疫染色処理の第３実施形態（１次反応型多重染色法）および第４実施形態（２次反応型多重染色法）として、検体中の２種以上の目的タンパク質のそれぞれに、蛍光染色液中の対応する蛍光プレミックス粒子のそれぞれを、直接的または間接的に結合させる処理を含む実施形態も挙げられる。この場合、各蛍光プレミックス粒子の発光波長のピークは、互いに１００ｎｍ以上離れていることが好ましい。また、蛍光染色液は、各蛍光プレミックス粒子を１種類ずつ含有するような、複数の蛍光染色液のセットからなる多液型であってもよいし、すべての蛍光プレミックス粒子を含有する１つの蛍光染色液からなる一液型あってもよい。
　免疫染色処理は、前述したような実施形態またはその他の改変された実施形態に対応する、公知の（理想的には標準化された）手順および処理条件に従って行えばよい。
　一般的には、標本前処理工程を終えた検体（組織切片）を載置した検体スライドを、免疫染色処理の実施形態に応じた１種類または２種類以上の試薬（蛍光染色液等）に、適切な温度および時間条件の下（例えば４℃で一晩）、浸漬すればよい。
　第２または第４実施形態においては、まず１次抗体を含有する溶液に検体スライドを浸漬し、続いて、得られた検体スライドを、２次抗体または２次アプタマーが連結された蛍光プレミックス粒子を含有する蛍光染色液に浸漬すればよい。
　第３または第４実施形態において、多液型の蛍光染色液を用いる場合は、各蛍光染色液に順次、検体スライドを浸漬すればよい。
　なお、免疫染色処理に必要な試薬は、公知の方法に従って作製するか、市販品として入手することができる。
　免疫染色処理に含まれる各染色の間や免疫染色処理全体の後には、必要に応じて、ＰＢＳ等の洗浄液を用いて、染色された検体を洗浄してもよい。例えば、検体スライドを、室温で、３～３０分間、ＰＢＳに浸漬することにより検体スライドを洗浄することができ、必要に応じて、浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
　（２）細胞形態観察用染色処理
　細胞形態観察用染色処理は、通常、免疫染色処理の後に行われる処理であって、細胞ないし組織の形状や細胞の各部の位置情報を得るために検体（組織切片）を形態観察用染色液で染色する処理である。
　形態観察用染色液としては、典型的には、ヘマトキシリン染色液、エオシン染色液、パパニコロウ（Ｐａｐ）染色液等の色素を用いた染色液が挙げられる。このような色素を用いた染色処理は、一般的な手順に従って行えばよい。例えば、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色を行なう場合、例えば、マイヤーヘマトキシリン液で５分間染色し、４５℃の流水で３分間洗浄した後、１％エオシン液で５分間染色すればよい。
　形態観察用染色液として、蛍光体集積粒子を用いた蛍光染色液を用いることもできる。例えば、国際公開第２０１５／１４６８９６号に記載されているように、検体の細胞膜に恒常的に発現している生体物質であって目的タンパク質以外の生体物質（以下「参照生体物質」ともいう。）を、蛍光体集積粒子を用いて蛍光染色することにより、細胞膜上の参照生体物質を標識した蛍光体集積粒子を輝点として観察することができる。このような輝点が集積している領域は、参照生体物質が発現している細胞膜またはその近傍（細胞膜領域）であることから、細胞ないし組織の形状や細胞の位置情報を得ることができる。このような参照生体物質により蛍光標識する処理およびそのために用いられる溶液も、染色処理および蛍光染色液の一実施形態とみなす。参照生体物質を免疫染色するために、前記蛍光プレミックス粒子を利用してもよい。
　参照生体物質は、細胞膜上に均一かつ恒常的に発現しており、さらに形態観察の目的を達するために十分な量を発現している生体物質から選択することが適切である。たとえば、ＡＴＰａｓｅ、カドヘリン、サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ（Epithelial Cell Adhesion/Activating Molecule：上皮細胞接着分子、ＣＤ３２６、ＫＳＡまたはＴＲＯＰ１とも呼ばれる。）などの膜タンパク質は、好ましい参照生体物質になり得る。
　参照生体物質を蛍光染色によって蛍光標識化するための染色剤は、参照生体物質に特異的に結合する物質に結合した蛍光体集積粒子を含むことが好ましい。
　参照生体物質に特異的に結合する物質には、参照生体物質としてのタンパク質を抗原として特異的に認識して結合する抗体を用いることができる。たとえば、カドヘリンを参照生体物質とする場合は抗カドヘリン抗体を用いることができる。
　（３）蛍光プレミックス粒子固定処理
　蛍光プレミックス粒子固定処理は、免疫染色処理の後、形態観察用染色処理等の他の処理の前に、所定の固定化試薬を用いて行われる処理であって、蛍光プレミックス粒子で標識された目的タンパク質を検体（組織切片）上に固定化する処理である。なお、細胞形態観察用染色処理として、参照生体物質を対象とする蛍光染色処理を行う場合は、その処理の後、他の処理の前に、同様の固定処理を行ってもよい。
　固定化試薬としては、例えば、目的タンパク質に結合した蛍光プレミックス粒子を、目的タンパク質またはその周辺のタンパク質と架橋させることができる試薬が挙げられる。
　このように蛍光プレミックス粒子固定処理を行うことで、形態観察用染色処理、ブロッキング処理、洗浄処理等、各種の溶液に検体（組織切片）を浸漬しても、蛍光プレミックス粒子が目的タンパク質から解離したり、目的タンパク質の近傍から遊離することを防止し、染色スライドを観察・撮影する際に蛍光プレミックス粒子の蛍光輝点数が減少する問題を解決できると推測される。
　（固定化試薬）
　前記蛍光プレミックス粒子用の固定化試薬としては、例えば、蛍光プレミックス粒子表面に存在する反応部位（以下「第１反応部位」と呼ぶ。）および検体（組織切片）の周辺のタンパク質が有する反応部位（以下「第２反応部位」と呼ぶ。）のそれぞれと反応しうる反応部位（それぞれ、以下「第３反応部位」および「第４反応部位」と呼ぶ。）を有する化合物（架橋剤）が挙げられる。
　第１反応部位および第２反応部位としては、例えば、アミノ基（リジン側鎖のε－アミノ基、Ｎ末端のα－アミノ基）、チオール基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、芳香環等の官能基が挙げられる。第１反応部位と第２反応部位は、同一であっても、異なってもよい。
　一方、第３反応部位および第４反応部位としては、例えば、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）基、マレイミド基、アルデヒド基、エポキシ基およびヨード基等の官能基が挙げられる。第３反応部位と第４反応部位は、同一であっても、異なってもよく、１つの官能基が第３反応部位と第４反応部位の両方の機能を兼ね備えていてもよい（例えば、固定化試薬としてホルムアルデヒドを使用する場合のアルデヒド基）。第３反応部位と第４反応部位はＰＥＧ等のリンカーで連結されていてもよい。固定化試薬１分子中に第３反応部位および／または第４反応部位が複数存在してもよい。
　蛍光プレミックス粒子固定処理は、適切な濃度の固定化試薬液を適切な時間、検体（組織切片）に接触させることで行うことができる。固定試薬液中の固定化試薬の濃度は適宜調節することができるが、例えば１～５００μＭが好ましい。特にＰＥＧ等のリンカーを介して両端に官能基が結合している固定化試薬を用いる場合、濃度が高すぎると架橋反応が十分に進まない場合がある。すなわち、固定化試薬の分子一端の官能基だけが検体（組織切片）の周辺のタンパク質または蛍光プレミックス粒子に結合し、リンカーを介した反対側のもう一方の官能基が架橋の相手と反応せず余った状態となる（その架橋の相手には別の固定化試薬の分子がすでに結合している）おそれがある。また、過剰の固定化試薬によって蛍光プレミックス粒子および検体（組織切片）が覆われてしまうと、蛍光プレミックス粒子から発せられる蛍光の強度が低下して識別しにくくなったり、形態観察用染色処理で使用される染色液とその対象との反応が妨げられ、それらの処理による染色が不十分となるおそれがある。
　固定化試薬液と検体との接触時間（固定化処理時間）も適宜調節することができるが、例えば、室温で、数分間～数時間程度である。
　（４）ブロッキング処理
　ブロッキング処理は、例えば、免疫染色処理の抗原抗体反応の前後に行われ、蛍光プレミックス粒子の目的タンパク質への非特異的吸着や、蛍光プレミックス粒子の表面にあるアビジン類（プレミックス処理における未反応部位）の生体内に存在する内因性ビオチンへの吸着を抑制するための処理が挙げられる。
　なお、内因性ビオチンは、ヒトでは肝臓、腎臓、筋肉、乳腺、消化管に多く存在しており、組織切片の凍結保存や、標本作製工程における細胞固定処理（用いる固定化試薬の種類等の条件）によっては失活しないことがある。したがって、乳腺等、前記組織に由来する切片を染色の対象とする場合は、ビオチン－アビジン反応用のブロッキング処理を行うことが好ましい。
　例えば、免疫染色法として２次抗体法に準じた方法を用いる場合は、目的タンパク質に対して１次抗体または１次アプタマーを結合させる処理（１次抗体処理）を行う前や、その１次抗体または１次アプタマーに対して２次抗体または２次アプタマーが連結された蛍光プレミックス粒子を結合させる処理（蛍光プレミックス粒子処理）を行う前、さらに、形態観察用染色処理として参照生体物質を利用する蛍光染色を行う場合には、参照生体物質に対して１次抗体を結合させる処理を行う前や、その１次抗体に対して蛍光標識された２次抗体を結合させる処理を行う前に、１次抗体（１次アプタマー）または２次抗体（２次アプタマー）等が標的とする所定の抗原等以外のタンパク質に非特異的に吸着することを抑制するための、抗原抗体反応用のブロッキング処理を行ってもよい。
　ブロッキング処理は、公知のブロッキング剤を用いて行えばよい。例えば、抗原抗体反応用のブロッキング処理には、ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液などを用いることができ、アビジン－ビオチン反応用のブロッキング処理には、アビジン溶液（内因性ビオチンに結合させて、蛍光プレミックス粒子が有するアビジン等の４箇所の反応部位のうち未反応の部位が結合することをブロッキングするための処理液）およびビオチン溶液（蛍光プレミックス粒子が有するアビジン等の４箇所の反応部位のうち未反応の部位に結合させて封止し、内因性ビオチンに結合することをブロッキングするための処理液）などを含むブロッキング試薬（例えばニチレイバイオサイエンス社製「内因性アビジン・ビオチンブロッキングキット」）を用いることができる。目的タンパク質が複数種あるときの多重染色のように、同一の検体（組織切片）に対して複数回の染色処理が実施される場合は、必要に応じて、ブロッキング処理およびそれに先立つ蛍光プレミックス固定処理を複数回行ってもよい。
　≪目的タンパク質≫
　前記蛍光染色の対象である、目的タンパク質は、検体に含まれる少なくとも１種の生体物質であることが好ましく、さらに主に病理診断において、タンパク質の定量ないし検出のために行われる免疫染色の対象であるタンパク質（抗原）であることが最も好ましい。典型的には、例えば、がんの病理診断に関係するタンパク質（いわゆるバイオマーカー）が好ましい。具体的には、ＰＤ－Ｌ１（Programmed cell death1 ligand 1）、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４）、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ４８、ＣＤ５９、あるいは、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）（Epidermal Growth Factor Receptor：上皮増殖因子受容体）、ＨＥＲ２（Human Epidermal Growth Factor Receptor：ヒト上皮増殖因子受容体）、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦＲ（Vasular Endothelial Growth Factor Receptor：血管内皮細胞増殖因子受容体）、ＩＧＦＲ（Insulin-like Growth Factor Receptor：インスリン様増殖因子受容体）、ＨＧＦＲ（Hepatocyte Growth Factor Receptor：肝細胞増殖因子受容体）といった増殖因子の受容体（レセプター）や、Ｔ細胞表面上にある重要な抑制性の免疫チェックポイント分子であって前記ＰＤ－Ｌ１の受容体であるＰＤ－１（Programmed cell death 1）などの免疫系の受容体であるタンパク質が例示できる
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
　下記の表に、作製例、実施例および比較例の概要を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　［作製例１］テキサスレッド集積シリカ粒子の作製
　赤色の有機蛍光色素である「テキサスレッド－Ｘ」（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １０１－Ｘ、シグマアルドリッチ社製）３．４ｍｇと３－アミノプロピルトリメトキシシラン（信越シリコーン社製、ＫＢＭ９０３）３μＬとを、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。
　得られたオルガノアルコキシシラン化合物０．６ｍＬを、９９％エタノール４８ｍＬ、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）０．６ｍＬ、超純水２ｍＬ、および２８質量％のアンモニア水２．０ｍＬと５℃で３時間混合した。
　前記工程で作製した混合液を１００００Ｇで２０分間遠心分離し、上澄みを除去した。この沈殿に対して、エタノールを加えて、沈殿物を分散させ、再度遠心分離をする洗浄を行った。さらに同様の洗浄を２回繰り返し、テキサスレッド集積シリカ粒子（励起波長５９０ｎｍ、発光波長６２０ｎｍ）を得た。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行って粒子径を測定し、平均粒子径を算出したところ、１６０ｎｍであった。
　［作製例２］テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の作製
　赤色の有機蛍光色素である「テキサスレッド」（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ １０１、シグマアルドリッチ社製）５．２５ｍｇを純水２２．５ｍＬに溶解した後、ホットスターラーで溶液の温度を７０℃に維持しながら２０分間撹拌した。撹拌後の溶液に、メラミン樹脂原料「ニカラックＭＸ－０３５」（日本カーバイド工業社製）０．２１ｇを加え、さらに同一条件で５分間加熱撹拌した。
　得られた溶液に反応開始剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を６８０μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した後、その溶液を放置して室温まで冷却した。得られたテキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や有機蛍光色素等の不純物を除くため、冷却した後の溶液を複数の遠心用チューブに分注して、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、溶液に含まれるテキサスレッド集積メラミン樹脂粒子を沈殿させた。上澄みを除去し、沈殿した粒子をエタノールおよび水で洗浄して、テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子を得た。
　得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行って粒子径を測定し、平均粒子径を算出したところ、４０ｎｍであった。
　［作製例３］ピロメテン５５６集積メラミン樹脂粒子の作製
　緑色の有機蛍光色素である「ピロメテン５５６」（Ｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ５５６）１４．４ｍｇを水２２ｍＬに加えて溶解させた。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルゲン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、メラミン樹脂原料「ニカラックＭＸ－０３５」（日本カーバイド工業社製）を０．６５ｇ加えた。
　さらに、この溶液に反応開始剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。
　得られた分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素などの不純物を除くため、純水による洗浄を行った。具体的には、遠心分離機（久保田商事社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射することで再分散させた。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。
　以上の処理により、ピロメテン５５６集積メラミン樹脂粒子（励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）を作製した。得られた粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行って粒子径を測定し、平均粒子径を算出したところ、１５５ｎｍであった。
　［作製例４］ストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積シリカ粒子の作製
　作製例１で得られたテキサスレッド集積シリカ粒子を、２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有するＰＢＳを用いて３ｎＭの濃度に調整し、得られた液体に、リンカーとしてＳＭ(ＰＥＧ)12（スクシンイミジル－[(Ｎ－マレイミドプロピオンアミド)－ドデカンエチレングリコール]エステル、サーモサイエンティフィック社製）を最終濃度が１０ｍＭとなるように添加、混合し、５℃で１時間反応させた。
　得られた反応液を、１００００Ｇで２０分間遠心分離し、上澄みを除去した。そこに、２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、同一条件で再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、マレイミド基導入テキサスレッド集積シリカ粒子を得た。
　一方、１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン（和光純薬工業社製）の水溶液４０μＬを２１０μＬのボレートバッファーに加えた後、そこに、６４ｍｇ／ｍＬに調整した２－イミノチオラン塩酸塩（シグマアルドリッチ社製）７０μＬを加え、室温で１時間反応させた。これにより、ストレプトアビジンのアミノ基に対してメルカプト基を導入した（－ＮＨ－Ｃ(＝ＮＨ2+Ｃｌ-)－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＳＨ）。得られた溶液を、ゲルろ過カラム（Ｚａｂａ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎｓ：フナコシ社製）に通して脱塩して、マレイミド基導入テキサスレッド集積シリカ粒子と結合可能な、メルカプト基導入ストレプトアビジンを得た。
　２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを用い、得られたメルカプト基導入ストレプトアビジンの全量（０．０４ｍｇ）と、マレイミド基導入テキサスレッド集積シリカ粒子とを、当該シリカ粒子の濃度が０．６７ｎＭとなるように混合した液体７４０μＬを調製し、室温で１時間反応させた。その後、１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。
　得られた液体を遠心フィルターで濃縮した後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応物を除去して、ストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積シリカ粒子を得た。５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液を用いて、該粒子の濃度を０．０２ｎＭに調整した、精製したストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積シリカ粒子分散液を調製した。
　国際公開第２０１５／１５９７７６号に記載の方法に従って測定したところ、得られたストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積シリカ粒子は、０．０３１１個／ｎｍ2の密度で、テキサスレッド集積シリカ粒子の表面にストレプトアビジンが連結していると推定される。
　［作製例５］ストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の作製
　作製例２で得られたテキサスレッド集積メラミン樹脂粒子０．１ｍｇをエタノール１．５ｍＬ中に分散させ、アミノプロピルトリメトキシシラン「ＬＳ－３１５０」（信越化学工業社製）２μＬを加えて８時間撹拌しながら室温で反応させて、粒子表面にアミノ基を導入した。
　アミノ基導入テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子を、２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳを用いて３ｎＭの濃度に調整し、得られた液体にリンカーとしてＳＭ(ＰＥＧ)12を最終濃度が１０ｍＭとなるよう添加、混合して、撹拌しながら室温で１時間反応させた。
　得られた反応液を、１０，０００Ｇで２０分間遠心分離し、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有するＰＢＳを加えて沈降物を分散させ、同一条件で再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、マレイミド基導入テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子を得た。
　一方、１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン（和光純薬工業社製）の水溶液４０μＬに、６４ｍｇ／ｍＬに調整したＮ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ、ｐｉｒｃｅ社製）の水溶液７０μＬを加え、室温で１時間反応させた。これにより、ストレプトアビジンのアミノ基に対して保護されたメルカプト基を導入した（－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ2－Ｓ－ＣＯ－ＣＨ3）。続いて、ヒドロキシルアミン処理により、保護されたメルカプト基から脱保護された（フリーの）メルカプト基を生成させて、ストレプトアビジンにメルカプト基を導入する処理を完了させた。得られた溶液をゲルろ過カラム（Ｚａｂａ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎｓ：フナコシ）に通して脱塩して、メルカプト基が導入されたストレプトアビジンを得た。
　２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中で、前記のようにして作製したメルカプト基導入ストレプトアビジンの全量（０．０４ｍｇ）と、マレイミド基導入テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子とを混合し、１時間反応させた後、反応液に１０ｍＭメルカプトエタノールを添加して反応を停止させた。
　得られた液体を遠心フィルターで濃縮した後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応物を除去して、ストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の精製物を回収した。５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液を用いて、濃度を０．０２ｎＭに調整した、精製したストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の分散液を調製した。
　［作製例６］抗ＤＮＰ抗体修飾ピロメテン５５６集積メラミン樹脂粒子の作製
　作製例２で得られたテキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の代わりに、作製例３で得られたピロメテン５５６集積メラミン樹脂粒子を用い、ストレプトアビジンの代わりに抗ＤＮＰ（ジニトロフェニル）抗体を用いたこと以外、作製例５と同様の手順に従って、抗ＤＮＰ抗体修飾ピロメテン５５６集積メラミン樹脂粒子の分散液を調製した。
　［作製例７］抗ＦＩＴＣ抗体修飾テキサスレッド集積シリカ粒子の作製
　ストレプトアビジンの代わりに抗ＦＩＴＣ抗体を用いたこと以外、作製例４と同様の手順に従って、抗ＦＩＴＣ抗体修飾テキサスレッド集積シリカ粒子の分散液を調製した。
　［作製例８］ビオチン修飾抗ＨＥＲ２抗体（ビオチン修飾１次抗体）の作製
　目的タンパク質ＨＥＲ２に対する１次抗体、すなわち抗ＨＥＲ２抗体として、ウサギモノクローナル抗体であるＡｎｔｉ－Ｅｒｂ　２　ａｎｔｉｂｏｄｙ［ＥＰ１０４５Ｙ］（ａｂｃａｍ社製）を用いた。この抗ＨＥＲ２抗体を５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液に溶解して１次抗体溶液を調製した。
　一方、リンカー試薬「マレイミド－ＰＥＧ2－ビオチン」（サーモサイエンティフィック社製、製品番号２１９０１）を、ＤＭＳＯを用いて０．４ｍＭとなるように調整した。このリンカー試薬溶液８．５μＬを前記１次抗体溶液に添加、混合し、３７℃で３０分間反応させることにより、抗ＨＥＲ２抗体にＰＥＧ鎖を介してビオチンを結合させた。得られた反応溶液を脱塩カラムに通して、ビオチン修飾抗ＨＥＲ２抗体を精製した。
　精製したビオチン修飾１次抗体（ビオチン修飾抗ＨＥＲ２抗体）溶液について、波長３００ｎｍにおける吸光度を分光高度計（日立製「Ｆ－７０００」）を用いて測定することにより、溶液中のタンパク質（ビオチン修飾１次抗体）の濃度を算出した。５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液を用いて、ビオチン修飾１次抗体の濃度を６μｇ／ｍＬに調整することで、ビオチン修飾１次抗体溶液を得た。
　［作製例９］ビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体（２次抗体）の作製
　前記抗ＨＥＲ２抗体（ウサギモノクローナル抗体）に対する２次抗体として、抗ウサギＩｇＧ抗体「ＬＯ－ＲＧ１」（ＧｅｎｅＴｅｘ社製、ｃｏｒｄ　ＧＴＸ４０３８３）を用いた。この抗ウサギＩｇＧ抗体５０μｇを５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液に溶解し、この溶液に還元剤であるＤＴＴ（ジチオトレイトール）を最終濃度が３ｍＭとなるように添加、混合し、３７℃で３０分間反応させることにより、ジスルフィド結合を還元してメルカプト基を生成させた抗ウサギＩｇＧ抗体、すなわち還元型抗ウサギＩｇＧ抗体を作製した。その後、反応溶液を脱塩カラム「Ｚｅｂａ　Ｄｅｓａｌｔ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎｓ」（サーモサイエンティフィック社製、Ｃａｔ．＃８９８８２）に通して、還元型抗ウサギＩｇＧ抗体を精製した。
　精製した還元型抗ウサギＩｇＧ抗体全量のうち２００μＬを５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液に溶解して２次抗体溶液を調製した。
　一方、リンカー試薬「マレイミド－ＰＥＧ2－ビオチン」（サーモサイエンティフィック社製、製品番号２１９０１）を、ＤＭＳＯを用いて０．４ｍＭとなるように調整することでリンカー試薬溶液を得た。このリンカー試薬溶液８．５μＬを前記２次抗体溶液に添加、混合し、３７℃で３０分間反応させることにより、抗ウサギＩｇＧ抗体にＰＥＧ鎖を介してビオチンを結合させた。得られた溶液を脱塩カラムに通して、ビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体を精製した。
　精製したビオチン修飾２次抗体（ビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体）溶液について、波長３００ｎｍにおける吸光度を分光光度計（日立製「Ｆ－７０００」）を用いて測定することにより、溶液中のタンパク質（ビオチン修飾２次抗体）の濃度を算出した。５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液を用いて、ビオチン修飾２次抗体の濃度を６μｇ／ｍＬに調整することで、ビオチン修飾２次抗体溶液を得た。
　［作製例１０］ビオチン修飾ＨＥＲ２抗原認識ＲＮＡアプタマーの作製
　５’末端がビオチン修飾された、ＨＥＲ２抗原認識ＲＮＡアプタマー（RNA 5-AGCCGCGAGGGGAGGGAUAGGGUAGGGCGCGGCU-3、NUCLEIC ACID THERAPEUTICS, Volume 21, Number 3, 2011, 173）を、北海道システムサイエンス社に合成依頼して入手した。
　入手したビオチン修飾ＨＥＲ２抗原認識ＲＮＡアプタマーを、その濃度が６μｇ／ｍＬになるように、５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液を用いて調整することで、ビオチン修飾ＨＥＲ２抗原認識ＲＮＡアプタマー溶液を得た。
　［作製例１１］ビオチン修飾ウサギＩｇＧ認識ＲＮＡアプタマーの作製
　５’末端がビオチン修飾された、ウサギＩｇＧ認識ＲＮＡアプタマー（RNA 5-GGGAGAAUUCCGACCAGAAG-UUCGAUACGCCGUGGGGUGACGUUGGCUAC-CCUUUCCUCUCUCCUCCUUCUUC-3、Analytical Biochemistry, 375, 2008, 217-222）を、北海道システムサイエンス社に合成依頼して入手した。
　入手したビオチン修飾ウサギＩｇＧ認識ＲＮＡアプタマーを、その濃度が６μｇ／ｍＬになるように、５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液を用いて調整することで、ビオチン修飾ウサギＩｇＧ認識ＲＮＡアプタマー溶液を得た。
　［作製例１２］ＤＮＰ修飾抗マウスＩｇＧ抗体の作製
　ＮＨＳ―ＤＮＰ試薬（ＢＰ－２２３９７、ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ社製）を用いて、ゴート由来抗マウスＩｇＧ抗体「ａｂ１８２０１７」（ａｂｃａｍ社製）のアミノ基にＮＨＳ―ＤＮＰ基を反応させて、ＤＮＰ修飾抗マウスＩｇＧ抗体を作製した。
　作製したＤＮＰ修飾抗マウスＩｇＧ抗体を、その濃度が６μｇ／ｍＬになるように、５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液を用いて調整することで、ＤＮＰ修飾抗マウスＩｇＧ抗体溶液を得た。
　［作製例１３］ＦＩＴＣ修飾抗ウサギＩｇＧ抗体の作製
　ＮＨＳ―ＦＩＴＣ試薬（ＢＰ－２２４０１、ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ社製）を用いて、ラット由来抗ウサギＩｇＧ抗体「ＬＯ－ＲＧ１」（ＧｅｎｅＴｅｘ社製、ｃｏｒｄ　ＧＴＸ４０３８３）のアミノ基にＮＨＳ―ＦＩＴＣ基を反応させて、ＦＩＴＣ修飾抗ウサギＩｇＧ抗体を作製した。
　作製したＦＩＴＣ修飾抗ウサギＩｇＧ抗体を、その濃度が６μｇ／ｍＬになるように、５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液を用いて調整することで、ＦＩＴＣ修飾抗ウサギＩｇＧ抗体溶液を得た。
　［比較例１］従来のアビジン－ビオチン併用２次抗体法に準じた染色スライドの作製
　１次抗体として作製例８で用いた抗ＨＥＲ２抗体（作成例８において、ビオチンを修飾する前の抗ＨＥＲ２抗体）を用い、２次抗体として作製例９で得られたビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体を用い、蛍光染色液として作製例４で得られたストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積シリカ粒子を用いた。下記（１）、（２Ａ）および（３）に示すような手順で、標本前処理工程（脱パラフィン処理、賦活化処理）、染色工程（１次抗体処理、２次抗体処理、蛍光標識処理、蛍光体集積粒子固定処理および形態観察用染色処理）、標本後処理工程（封入処理）を行うことにより、免疫染色法に基づく染色スライドを作製した（図４参照）。その後、作製された染色スライドを用いて、下記（４）に示す手順で観察および撮像を行った。
　（１）標本前処理工程
　（１－１）脱パラフィン処理
　予めパスビジョンＨＥＲ－２　ＤＮＡプローブキット（アボット）を用いてＦＩＳＨスコアを算出したコスモバイオ社製の組織アレイスライド（ＣＢ－Ａ７１２）（ＨＥＲ２陽性染色対照標本）を用いた。該組織アレイスライドに対し、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の手順で脱パラフィン処理を行った。
　（ｉ）キシレンを入れた容器に組織アレイスライドを３０分間、常温で浸漬させた。途中３回キシレンを交換した。
　（ｉｉ）（ｉ）で得られた組織アレイスライドを、エタノールを入れた容器に常温で３０分間浸漬させた。途中３回エタノールを交換した。
　（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた組織アレイスライドを、水を入れた容器に３０分間浸漬させた。途中３回水を交換した。
　（１－２）賦活化処理
　脱パラフィン処理した組織アレイスライドを、以下の（ｉ）～（ｉｖ）の手順で賦活化処理した。
　（ｉ）組織アレイスライドの溶媒を水に置換する洗浄を行った。
　（ｉｉ）（ｉ）で得られた組織アレイスライドを、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に入れ、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理を行った。
　（ｉｉｉ）オートクレーブ処理後の組織アレイスライドを、ＰＢＳを入れた容器に３０分間浸漬し、洗浄した。
　（ｉｖ）（ｉｉｉ）で得られた組織アレイスライドと、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳとを接触させて、１時間ブロッキング処理を行った。
　（２）染色工程
　（２－１Ａ）免疫染色処理
　賦活化処理（１－２）を行った組織アレイスライドに対して、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の手順で免疫染色処理を行った。
　（ｉ）１次抗体処理：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて、ウサギモノクローナル抗体であるＡｎｔｉ－Ｅｒｂ　２　ａｎｔｉｂｏｄｙ［ＥＰ１０４５Ｙ］（ａｂｃａｍ社製）の０．０５ｎＭ溶液を、組織アレイスライド上の組織切片に滴下して、４℃で一晩反応させた。
　（ｉｉ）２次抗体処理：１次反応を行った組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、作製例９で得られた６μｇ／ｍＬのビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体溶液を組織切片に滴下し、室温で３０分間反応させた。
　（ｉｉｉ）蛍光標識処理：２次反応を行った組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した後、作製例４で得られた０．０２ｎＭのストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積シリカ粒子溶液を組織切片に滴下し、４℃で一晩反応させた。
　（２－２）蛍光体集積粒子固定処理
　蛍光標識処理（２－１Ａ）を行った組織アレイスライドを４％中性パラホルムアルデヒド水溶液中に１０分間浸漬することにより、蛍光体集積粒子固定処理を行った。
　（２－３）形態観察用染色処理
　蛍光体集積粒子固定処理（２－２）を行った組織アレイスライドに対して、以下の（ｉ）～（ｉｉ）の手順で形態観察用染色処理（ＨＥ染色、ヘマトキシリン－エオシン染色）を行った。
　（ｉ）処理（２－２）を行った組織アレイスライドを、マイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該スライドを４５℃の流水で３分間洗浄した。
　（ｉｉ）洗浄後の組織アレイスライドに、１％エオシン液で５分間染色してエオシン染色を行い、染色スライドを作製した。
　（３）標本後処理工程
　形態観察用染色処理（２－３）を行った染色スライドに対して、以下の（ｉ）～（ｉｉ）の手順で封入処理を行った。
　（ｉ）前記染色スライドに、常温でエンテランニュー（メルク社製）を滴下した後、カバーガラスを被せ、常温で１０分間、風乾することで、封入処理を行った。
　（ｉｉ）（ｉ）の後、観察および染色画像の撮影まで、封入処理が行われた染色スライドを遮光して保存した。
　（４）観察
　封入処理を終えた染色スライドに対して、蛍光顕微鏡（オリンパス社製「ＢＸ－５３」）を用いて所定の励起光（蛍光色素として用いたテキサスレッドの励起波長に対応した波長を有する励起光）を照射し、発光した蛍光を観察するとともに、顕微鏡用デジタルカメラ（オリンパス社製「ＤＰ７３」）により蛍光染色画像の撮影を行った。前記励起光は、励起光用光学フィルターを用いて、５７５～６００ｎｍに設定した。また、観察する蛍光の波長（ｎｍ）の範囲についても、蛍光用光学フィルターを通すことで６１２～６９２ｎｍに設定した。
　顕微鏡観察、画像撮影時の励起波長の条件は、５８０ｎｍの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ2となるようにした。画像撮影時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないように任意に設定（例えば４０００μ秒に設定）した。４００倍で撮像した画像をもとに画像処理ソフトＩｍａｇｅＪ（オープンソース）により輝度の極大点を検出し、輝点として計数した。
　次に、蛍光顕微鏡の明視野における観察および画像撮影により、ヘマトキシリン染色による染色像を撮影した。蛍光染色の画像とヘマトキシリン染色の画像とを、画像処理により重ねあわせることで、１細胞当たりの輝点数を計数した。１０００細胞について輝点数を計数し、得られた平均値を各組織切片における輝点数とした。
　撮影された蛍光染色像を図５に示す。得られた蛍光染色像の平均輝度（１画素あたりの輝度）は１４１であった。
　［実施例１］抗ＨＥＲ２抗体連結テキサスレッド集積シリカ粒子を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．１）の調製およびそれを用いた蛍光染色像の撮影
　作製例４で得られた０．０２ｎＭのストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積シリカ粒子分散液（反応液１）２５μＬと、作製例８により得られた濃度６μｇ／ｍＬのビオチン修飾抗ＨＥＲ２抗体（１次抗体）溶液（反応液２）２５μＬとを混合し、室温で１時間反応させることにより、抗ＨＥＲ２抗体（１次抗体）連結テキサスレッド集積シリカ粒子（蛍光プレミックス粒子）を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．１）を調製した。
　得られた蛍光プレミックス粒子は、０．０１２個／ｎｍ2の密度で、テキサスレッド集積シリカ粒子の表面に抗ＨＥＲ２抗体が連結しているものと推定される。
　比較例１において、前記（２－１Ａ）を下記（２－１Ｂ）に示す方法に変更した以外は、比較例１と同様にして、染色スライドを作成し（図２参照）、蛍光染色像を撮影した。撮影された蛍光染色像を図６に示す。得られた蛍光染色像の平均輝度は６１２であった。
　（２－１Ｂ）免疫染色処理
　賦活化処理（１－２）を行った組織アレイスライドに対して、以下の手順で免疫染色処理を行った。
　すなわち、抗ＨＥＲ２抗体（１次抗体）連結テキサスレッド集積シリカ粒子である蛍光プレミックス粒子を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．１）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液を用いて、濃度を０．０２ｎＭに調整した。この溶液を組織アレイスライド上の組織切片に滴下して、４℃で一晩反応させた。
　［実施例２］抗ＨＥＲ２抗体連結テキサスレッド集積シリカ粒子を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．２）の調製およびそれを用いた蛍光染色像の撮影
　作製例４で得られた濃度０．０２ｎＭのストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積シリカ粒子分散液１０μＬと、作製例８で得られた濃度６μｇ／ｍＬのビオチン修飾抗ＨＥＲ２抗体（１次抗体）溶液９０μＬとを混合し、室温で１時間反応させることで、抗ＨＥＲ２抗体（１次抗体）連結テキサスレッド集積シリカ粒子（蛍光プレミックス粒子）を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．２）を調製した。
　得られた蛍光プレミックス粒子は、０．０３０個／ｎｍ2の密度で、テキサスレッド集積シリカ粒子の表面に抗ＨＥＲ２抗体が連結しているものと推定される。
　得られた蛍光染色液（Ｎｏ．２）を用いた以外は実施例１と同様にして、染色スライドを作製し、蛍光染色像を撮影した。得られた蛍光染色像の平均輝度は６８８であった。
　［実施例３］抗ＨＥＲ２抗体連結テキサスレッド集積シリカ粒子を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．３）の調製およびそれを用いた蛍光染色像の撮影
　作製例４で得られた濃度０．０２ｎＭのストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積シリカ粒子分散液９５μＬと、作製例８で得られた濃度６μｇ／ｍＬのビオチン修飾抗ＨＥＲ２抗体（１次抗体）溶液５μＬとを混合し、室温で１時間反応させることで、抗ＨＥＲ２抗体（１次抗体）連結テキサスレッド集積シリカ粒子（蛍光プレミックス粒子）を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．３）を調製した。
　得られた蛍光プレミックス粒子は、０．００３個／ｎｍ2の密度で、テキサスレッド集積シリカ粒子の表面に抗ＨＥＲ２抗体が連結しているものと推定される。
　得られた蛍光染色液（Ｎｏ．３）を用いた以外は実施例１と同様にして、染色スライドを作製し、蛍光染色像を撮影した。得られた蛍光染色像の平均輝度は６３０であった。
　［実施例４］抗ＨＥＲ２抗体連結テキサスレッド集積シリカ粒子を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．４）の調製およびそれを用いた蛍光染色像の撮影
　作製例４で得られた濃度０．０２ｎＭのストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積シリカ粒子分散液９８μＬと、作製例８で得られた濃度６μｇ／ｍＬのビオチン修飾抗ＨＥＲ２抗体（１次抗体）溶液２μＬとを混合し、室温で１時間反応させることで、抗ＨＥＲ２抗体（１次抗体）連結テキサスレッド集積シリカ粒子（蛍光プレミックス粒子）を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．４）を調製した。
　得られた蛍光プレミックス粒子は、０．００１個／ｎｍ2の密度で、テキサスレッド集積シリカ粒子の表面に抗ＨＥＲ２抗体が連結しているものと推定される。
　得られた蛍光染色液（Ｎｏ．４）を用いた以外は実施例１と同様にして、染色スライドを作製し、蛍光染色像を撮影した。得られた蛍光染色像の平均輝度は４７２であった。
　［実施例５］精製した抗ＨＥＲ２抗体連結テキサスレッド集積シリカ粒子を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．５）の調製およびそれを用いた蛍光染色像の撮影
　まず、実施例１と同様の手順で、蛍光染色液（Ｎｏ．１）を調製した。
　続いて、該蛍光染色液（Ｎｏ．１）を下記の手順により精製することで、蛍光染色液（Ｎｏ．５）を調製した。
　［工程Ａ］プロテインＡ結合樹脂カラムの作製
　ゲル濾過担体「Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１０００　ＳＦ」（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製、アリルデキストランとN,N-メチレンビスアクリルアミドが共有架橋結合した樹脂マトリックス）のデキストラン水酸基とブロモ酢酸とを１６時間反応させることにより、担体表面をカルボキシメチル化した（Monchaux, E., and Vermette, P. (2008). Cell adhesion resistance mechanisms using arrays of dextran-derivative layers. J Biomed Mater Res A 85, 1052-1063参照）。なお、「Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１０００　ＳＦ」は、粒径２３０ｎｍの物体（リポソーム）が侵入し、通過できる程度の空隙を有する多孔質体である（http://lifesciencedb.jp/dbsearch/Literature/get_pne_cgpdf.php?year=1990&number=3511&file=2Qgovzb50x7RW4IcCUhKPw==参照）。
　続いて、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）として１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ：(株)同仁化学研究所製）を４００ｎＭの濃度で、N-ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ：サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１００ｍＭの濃度で含有する混合液を調製し、前記カルボキシメチル化担体と該混合液とを反応させることにより、カルボキシル基を活性エステル化した。そこに、さらにプロテインＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製「２１１８４」）の溶液を反応させ、脱水反応によりプロテインＡが有するアミノ基を前記活性エステル化したカルボキシル基に結合させた。このようにして得られたプロテインＡ結合樹脂をカラム（１ｍＬ注射筒）に充填し、プロテインＡ結合樹脂カラムを作製した。
　［工程Ｂ］抗ＨＥＲ２抗体連結蛍光プレミックス粒子の精製処理
　５ｍＬの緩衝液Ａ（０．１Ｍグリシン＋１．２Ｍ酒石酸ナトリウム、ｐＨ９．０）を３回流すことによって工程Ａで作製したプロテインＡ結合樹脂カラムを平衡化した。
　前記蛍光染色液（Ｎｏ．１）１．５ｍＬを、１．５ｍＬの緩衝液Ａで希釈して、平衡化したプロテインＡ結合樹脂カラムに添加し、蛍光プレミックス粒子における抗ＨＥＲ２抗体（ＩｇＧ）をプロテインＡ結合樹脂カラムにおけるプロテインＡに結合させた。１０ｍＬの緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、３ｍＬの０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．８）を流し、蛍光プレミックス粒子を脱離させて、蛍光染色液（Ｎｏ．５）を得た。
　得られた蛍光染色液（Ｎｏ．５）を用いた以外は実施例１と同様にして、染色スライドを作製し、蛍光染色像を撮影した。得られた蛍光染色像において、凝集した蛍光プレミックス粒子に由来する輝点はほぼ見当たらず、平均輝度は５４０と高い値を維持した。
　［実施例６］１次アプタマー連結テキサスレッド集積シリカ粒子を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．６）の調製およびそれを用いた蛍光染色像の撮影
　作製例４により得られた濃度０．０２ｎＭのストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積シリカ粒子分散液２５μＬと、作製例１０により得られた濃度６μｇ／ｍＬのビオチン修飾ＨＥＲ２抗原認識ＲＮＡアプタマー（１次アプタマー）溶液２５μＬとを混合し、室温で１時間反応させることにより、ＨＥＲ２抗原認識ＲＮＡアプタマー（１次アプタマー）連結テキサスレッド集積シリカ粒子（蛍光プレミックス粒子）を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．６）を調製した。
　得られた蛍光染色液（Ｎｏ．６）を用いた以外は実施例１と同様にして、染色スライドを作製し、蛍光染色像を撮影した。得られた蛍光染色像の平均輝度は１７０１であった。　　　
　［実施例７］２次アプタマー連結テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．７）の調製およびそれを用いた蛍光染色像の撮影
　作製例５で得られた濃度０．０２ｎＭのストレプトアビジン修飾テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子分散液２５μＬと、作製例１１で得られた濃度６μｇ／ｍＬのビオチン修飾ウサギＩｇＧ認識ＲＮＡアプタマー（２次アプタマー）溶液２５μＬとを混合し、室温で１時間反応させることにより、ウサギＩｇＧ認識ＲＮＡアプタマー（２次アプタマー）連結テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子（蛍光プレミックス粒子）を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．７）を調製した。
　比較例１において、前記（２－１Ａ）を下記（２－１Ｃ）に示す方法に変更した以外は、比較例１と同様にして、染色スライドを作成し、蛍光染色像を撮影した。得られた蛍光染色像の平均輝度は１９２０であった。
　（２－１Ｃ）免疫染色処理
　賦活化処理（１－２）を行った組織アレイスライドに対して、以下の（ｉ）および（ｉｉ）の手順で免疫染色処理を行った。
　（ｉ）１次反応：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて、ウサギモノクローナル抗体であるＡｎｔｉ－Ｅｒｂ　２　ａｎｔｉｂｏｄｙ［ＥＰ１０４５Ｙ］（ａｂｃａｍ社製）の０．０５ｎＭ溶液を、組織アレイスライド上の組織切片に滴下して、４℃で一晩反応させた。
　（ｉｉ）２次反応：１次反応を行った組織アレイスライドをＰＢＳで洗浄した。その後、前記蛍光染色液（Ｎｏ．７）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液を用いて、濃度を０．０２ｎＭに調整した液体を、前記洗浄後の組織アレイスライド上の組織切片に滴下して、４℃で一晩反応させた。
　［実施例８］２種類の蛍光プレミックス粒子を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．８）の調製およびそれを用いた蛍光染色像の撮影
　作製例６で得られた濃度０．０２ｎＭの抗ＤＮＰ抗体修飾ピロメテン５５６集積メラミン樹脂粒子分散液１０μＬと、作製例１２で得られた濃度６μｇ／ｍＬのＤＮＰ修飾抗マウスＩｇＧ抗体（２次抗体）溶液９０μＬとを混合し、室温で１時間反応させることにより、第１の蛍光プレミックス粒子として、抗マウスＩｇＧ抗体（２次抗体）連結ピロメテン５５６集積メラミン樹脂粒子を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．８Ａ）を調製した。
　作製例７で得られた濃度０．０２ｎＭの抗ＦＩＴＣ抗体修飾テキサスレッド集積シリカ粒子分散液１０μＬと、作製例１３で得られた濃度６μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ修飾抗ウサギＩｇＧ抗体（２次抗体）溶液９０μＬとを混合し、室温で１時間反応させることにより、第２の蛍光プレミックス粒子として、抗ウサギＩｇＧ抗体（２次抗体）連結テキサスレッド集積シリカ粒子を含有する蛍光染色液（Ｎｏ．８Ｂ）を調製した。
　得られた蛍光染色液（Ｎｏ．８Ａ）および（Ｎｏ．８Ｂ）を混合して、第１および第２の蛍光プレミックス粒子を等量含有する、二重染色用の一液型蛍光染色液（Ｎｏ．８）を調製した。
　ＵＳＢｉｏｍａｘ社製の肺組織アレイスライド「ＬＣ２４１ｂ」（６名の患者に由来する腫瘍組織および正常組織の切片が２枚ずつと、褐色細胞腫（組織マーカー）の切片が１枚、合計２５枚の切片が積載されているスライドグラス）を購入した。該組織アレイスライドを用いて、下記（１）、（２）および（３）に示す手順で、標本前処理工程（脱パラフィン処理、賦活化処理）、染色工程（二重免疫染色処理、蛍光体集積粒子固定処理および形態観察用染色処理）、標本後処理工程（封入処理）を行うことにより、免疫染色法に基づく染色スライドを作製した。その後、作製された染色スライドを用いて、下記（４）に示す手順で観察および撮像を行った。
　（１）標本前処理工程
　（１－１）脱パラフィン処理
　（ｉ）キシレンを入れた容器に組織アレイスライドを１５分間浸漬させた。途中２回キシレンを交換した。
　（ｉｉ）（ｉ）で得られた組織アレイスライドを、エタノールを入れた容器に１０分間浸漬させた。途中２回エタノールを交換した。
　（１－２）賦活化処理
　（ｉ）脱パラフィン処理した組織アレイスライドを水を入れた容器に１０分間浸漬させた。
　（ｉｉ）（ｉ）で得られた組織アレイスライドを、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸漬させた。
　（ｉｉｉ）１２１℃で５分間オートクレーブ処理を行った。
　（ｉｖ）ＰＢＳを入れた容器に、オートクレーブ処理後の組織アレイスライドを１５分間浸漬させた。途中３回ＰＢＳを交換した。
　（ｖ）（ｉｖ）で得られた組織アレイスライドと、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳとを接触させて、１時間放置した。
　（２）染色工程
　（２－１）二重免疫染色処理
　（ｉ）１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでそれぞれの濃度が０．０５ｎＭとなるよう希釈した抗ＰＤ－Ｌ１マウス抗体・抗ＥＧＦＲウサギ抗体含有溶液を、賦活化処理した組織アレイスライドに載せて一晩放置した。
　（ｉｉ）前記一液型蛍光染色液（Ｎｏ．８）を、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでそれぞれのプレミックス粒子の濃度が０．１ｎＭとなるよう希釈し、その希釈液を（ｉ）で得られた組織アレイスライドに載せて一晩放置した。
　（２－２）蛍光体集積粒子固定処理および形態観察用染色処理
　（ｉ）ＰＢＳを入れた容器に、二重免疫染色処理後の組織アレイスライドを３０分間浸漬させた。
　（ｉｉ）（ｉ）で得られた組織アレイスライドを、４％中性パラホルムアルデヒド溶液に１０分間浸漬することにより、蛍光体集積粒子固定処理を行った後、ＨＥ染色を行うことで、染色スライドを作製した。
　（３）標本後処理工程
　得られた染色スライドにＭｅｒｃｋ社製Ａｑｕａｔｅｘを滴下後、カバーガラスを載せることで封入処理を行った。
　（４）観察
　封入処理を終えた染色スライドを、緑色用および赤色用の２種類のフィルターセット（Ｓｅｍｒｏｃｋ社製、下記表３参照）を備えた蛍光顕微鏡（Carl Zeiss社製）のステージに設置した。両方のフィルターセットのそれぞれにおいて、染色スライドの蛍光像の画面全体の蛍光輝点から算出された合計輝度値および一輝点毎の輝度値を計測した。国際公開第２０１７／０１４１９６号に記載の「第１の算出方法」および「第２の算出方法」に従って、２種類の蛍光プレミックス粒子それぞれの輝度比率を算出したところ、どちらの輝度比率も同じであり（表４参照）、また、ＰＤ－Ｌ１：ＥＧＦＲ＝１００：１９００の割合で発現していることが確認された（表５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　　１：蛍光プレミックス粒子（目的タンパク質結合性物質連結蛍光体集積粒子）
　１０：蛍光体集積粒子
　１５：リンカー
　２０：第１反応性物質
　２１：ストレプトアビジン
　３０：第２反応性物質
　３１：ビオチン
　４０：目的タンパク質結合性物質
　４１：１次抗体
　４２：２次抗体
１００：組織切片
１５０：目的タンパク質

Claims (11)

  1. 　第１反応性物質で修飾された蛍光体集積粒子と、第２反応性物質で修飾された、抗体およびアプタマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の目的タンパク質結合性物質とが、第１反応性物質と第２反応性物質との相互作用により連結している、蛍光プレミックス粒子。
  2. 　前記第１反応性物質がストレプトアビジンであり、前記第２反応性物質がビオチンである、請求項１に記載に記載の蛍光プレミックス粒子。
  3. 　前記目的タンパク質結合性物質が、目的タンパク質に特異的に結合する１次抗体または１次アプタマーである、請求項１または２に記載の蛍光プレミックス粒子。
  4. 　前記目的タンパク質結合性物質が、目的タンパク質に特異的に結合する１次抗体に特異的に結合する２次抗体または２次アプタマーである、請求項１または２に記載の蛍光プレミックス粒子。
  5. 　前記蛍光体集積粒子が、樹脂製の母体と蛍光体とを含む粒子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の蛍光プレミックス粒子。
  6. 　前記蛍光体集積粒子の表面の単位面積あたりに連結している前記目的タンパク質結合性物質の数が、０．００３～０．０１２個／ｎｍ2である、請求項１～５のいずれか一項に記載の蛍光プレミックス粒子。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の蛍光プレミックス粒子を含有する蛍光染色液。
  8. 　発光波長のピークが互いに１００ｎｍ以上離れている２種類以上の蛍光プレミックス粒子を含有する、一液型または多液型である、請求項７に記載の蛍光染色液。
  9. 　請求項３に記載の蛍光プレミックス粒子を含有する蛍光染色液を使用する染色法であって、
    　目的タンパク質に前記蛍光染色液中の蛍光プレミックス粒子を結合させる処理を含む、蛍光染色法。
  10. 　請求項４に記載の蛍光プレミックス粒子を含有する蛍光染色液を使用する染色法であって、
    　目的タンパク質に前記１次抗体を結合させる処理、および
    　目的タンパク質に結合させた１次抗体に前記蛍光染色液中の蛍光プレミックス粒子を結合させる処理を含む、蛍光染色法。
  11. 　請求項８に記載の蛍光染色液を使用する染色法であって、
    　２種以上の目的タンパク質のそれぞれに、前記蛍光染色液中の対応する蛍光プレミックス粒子のそれぞれを、直接的または間接的に結合させる処理を含む、蛍光染色法。
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