[go: up one dir, main page]

WO2018151223A1 - 細胞評価方法、細胞評価装置、及び細胞評価プログラム - Google Patents

細胞評価方法、細胞評価装置、及び細胞評価プログラム Download PDF

Info

Publication number
WO2018151223A1
WO2018151223A1 PCT/JP2018/005303 JP2018005303W WO2018151223A1 WO 2018151223 A1 WO2018151223 A1 WO 2018151223A1 JP 2018005303 W JP2018005303 W JP 2018005303W WO 2018151223 A1 WO2018151223 A1 WO 2018151223A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
index
cell population
spring constant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/005303
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
田中　求
暁久 山本
盛夫 上野
羽室　淳爾
木下　茂
寛 田中
宗豊 戸田
千恵 外園
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyoto Prefectural PUC
Kyoto University NUC
Original Assignee
Kyoto Prefectural PUC
Kyoto University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyoto Prefectural PUC, Kyoto University NUC filed Critical Kyoto Prefectural PUC
Priority to EP18754407.7A priority Critical patent/EP3611696A4/en
Priority to US16/485,961 priority patent/US11436719B2/en
Priority to JP2018568608A priority patent/JP6985684B2/ja
Publication of WO2018151223A1 publication Critical patent/WO2018151223A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US17/877,057 priority patent/US20230214998A1/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
    • G06T7/0012—Biomedical image inspection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5026—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on cell morphology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5032—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on intercellular interactions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5067—Liver cells
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10056—Microscopic image
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING OR CALCULATING; COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro

Definitions

  • One aspect of the present invention relates to a cell evaluation method, a cell evaluation apparatus, and a cell evaluation program.
  • Patent Document 1 describes a technique for calculating a feature quantity such as an aspect ratio or arrangement of cells in an enlarged specimen image and evaluating a cell population based on the feature quantity.
  • the above-mentioned conventional technology sometimes evaluates a cell population using an aspect ratio or the like as an index.
  • an aspect ratio or the like there is no correlation (support) between the index and quality, and the quantitative meaning of the index is sufficiently provided. Absent. Therefore, there is a possibility that the quality of the cell population cannot be quantitatively evaluated.
  • an object of one aspect of the present invention is to provide a cell evaluation method, a cell evaluation apparatus, and a cell evaluation program capable of quantitatively evaluating the quality of a cell population.
  • a cell evaluation method is a cell evaluation method for evaluating the quality of a cell population including a plurality of cells, and represents a degree to which a plurality of cells are clogged based on a captured image of the cell population.
  • An index for calculating an index including at least one of an average distance, a spring constant indicating a degree of distance between a plurality of cells, and a hexagonal lattice order variable indicating a degree of arrangement of a plurality of cells close to a regular hexagon.
  • a cell evaluation apparatus is a cell evaluation apparatus that evaluates the quality of a cell population including a plurality of cells, and represents a degree to which a plurality of cells are clogged based on a captured image of the cell population.
  • An index for calculating an index including at least one of an average distance, a spring constant indicating a degree of distance between a plurality of cells, and a hexagonal lattice order variable indicating a degree of arrangement of a plurality of cells close to a regular hexagon.
  • a cell evaluation program is a cell evaluation program for evaluating the quality of a cell population including a plurality of cells, and represents a degree to which a plurality of cells are clogged based on a captured image of the cell population.
  • An index for calculating an index including at least one of an average distance, a spring constant indicating a degree of distance between a plurality of cells, and a hexagonal lattice order variable indicating a degree of arrangement of a plurality of cells close to a regular hexagon.
  • the computer is caused to execute a calculation process and an evaluation process for evaluating a cell population based on the index calculated in the index calculation process.
  • the present invention in view of the final desired quality in a cell population that small cells are ordered (aligned) in order, at least one of the average distance, the spring constant, and the hexagonal lattice order variable.
  • An index including either one is calculated, and the cell population is evaluated based on the index.
  • the average distance and the spring constant are obtained by applying a quadratic curve fitting to a potential function based on a radial distribution function of a plurality of cells, which is a function obtained using the Boltzmann distribution.
  • the hexagonal lattice order variable may be obtained based on six central angles of a hexagon formed by six cells closest to the cell centered on one of the plurality of cells.
  • the cell evaluation method may include an overlap coefficient calculation step of calculating an overlap coefficient that represents the degree of overlap of the Gaussian distribution determined from the index value and its error component. According to the overlap coefficient, it is possible to grasp the sensitivity of the index (that is, whether or not the index is a delicate variable).
  • the cell evaluation method may include a ROC analysis step of performing ROC analysis using an index as a variable.
  • the index can be evaluated using ROC analysis.
  • the cell may have a two-dimensional close-packed structure with a hexagonal lattice.
  • the cells may be corneal endothelial cells, epithelial cells, hepatocytes, or cultured cells of any of these.
  • epithelial cells include corneal epithelial cells, small airway epithelial cells, mammary epithelial cells, or retinal pigment epithelial cells.
  • the quality of the cell population in the future from the time when the captured image is captured may be predicted.
  • the prognosis of the cell population can be predicted.
  • the cell evaluation method according to one aspect of the present invention may be used for evaluation of a cell population in a drug candidate substance.
  • a cell population in a drug candidate substance For example, in the development of an ophthalmic therapeutic agent, by applying the present invention to the evaluation of a cell population in a drug candidate substance, the verification time for the effectiveness and safety of the drug candidate substance can be shortened.
  • the index may include all of the average distance, the spring constant, and the hexagonal lattice order variable.
  • a cell evaluation method capable of quantitatively evaluating the quality of a cell population.
  • FIG. 1 is a configuration diagram showing a cell evaluation apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 2A is a diagram illustrating the radial distribution function.
  • FIG. 2B is a diagram illustrating the potential function.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the hexagonal lattice order variable.
  • FIG. 4A is a photograph showing a captured image of a low-grade cell population.
  • FIG. 4B is a photographic diagram showing a captured image of a high-quality cell population.
  • FIG. 5A is a graph for explaining the comparative evaluation of OVL.
  • FIG. 5B is another graph for explaining the comparative evaluation of OVL.
  • FIG. 6 is a diagram showing a cell evaluation program.
  • FIG. 1 is a configuration diagram showing a cell evaluation apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 2A is a diagram illustrating the radial distribution function.
  • FIG. 2B is a diagram illustrating the potential function.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the hexagonal la
  • FIG. 7A is a graph showing the relationship between the density and the good cell rate in in vitro according to the first embodiment.
  • FIG. 7B is a graph showing the relationship between the spring constant and the good cell rate in the in vitro according to the first embodiment.
  • FIG. 8A is a graph showing the relationship between the density and the spring constant in the in vitro according to the first embodiment.
  • FIG. 8B is a graph for comparing and evaluating the density OVL and the spring constant OVL in the in-vitro according to the first embodiment.
  • FIG. 9A is a graph showing the relationship between the density and the average distance in the in-vitro according to the first embodiment.
  • FIG. 9B is a graph for comparing and evaluating the density OVL and the average distance OVL in the in-vitro according to the first embodiment.
  • FIG. 10 is a configuration diagram showing a cell evaluation apparatus according to the second embodiment.
  • FIG. 11 (a) is a photograph showing a specular image of a low-grade cell population.
  • FIG. 11 (b) is a photograph showing a specular image of a high-quality cell population.
  • FIG. 12 is a diagram illustrating an example of display on the display unit.
  • FIG. 13A is a graph showing the relationship between the density and the good cell rate in in vivo according to the second embodiment.
  • FIG. 13B is a graph showing the relationship between the spring constant and the good cell rate in in vivo according to the second embodiment.
  • FIG. 13A is a graph showing the relationship between the density and the good cell rate in in vivo according to the second embodiment.
  • FIG. 13B is a graph showing the relationship between the spring constant and the good cell rate
  • FIG. 14A is a graph showing the relationship between the density and the spring constant in in vivo according to the second embodiment.
  • FIG. 14B is a graph for comparing and evaluating the density OVL and the spring constant OVL in the in vivo according to the second embodiment.
  • FIG. 15A is a graph showing the relationship between the density and the average distance in in vivo according to the second embodiment.
  • FIG. 15B is a graph for comparing and evaluating the density OVL and the average distance OVL in the in vivo according to the second embodiment.
  • FIG. 16A is a graph showing the relationship between density and time.
  • FIG. 16B is a graph showing the relationship between the density at 3 months and the spring constant at 3 months.
  • FIG. 16C is a graph showing the relationship between the density at 24 months and the spring constant at 3 months.
  • FIG. 16D is a graph for comparing and evaluating the OVL of the density at 3 months and the OVL of the spring constant at 3 months.
  • FIG. 16E is a graph for comparing and evaluating the OVL of the density at 24 months and the OVL of the spring constant at 3 months.
  • FIG. 17A is a graph showing the relationship between the density and the good cell rate in in vitro according to the first embodiment.
  • FIG. 17B is a graph showing the relationship between the spring constant and the good cell rate in the in vitro according to the first embodiment.
  • FIG. 18 is a graph showing the relationship between the density and the spring constant in the in vitro according to the first embodiment.
  • FIG. 19 is a graph showing the relationship between the density and the average distance in the in-vitro according to the first embodiment.
  • FIG. 20A is a graph showing the relationship between the density and the good cell rate in the second embodiment.
  • FIG. 20B is a graph showing a relationship between a spring constant and a good cell rate in in vivo according to the second embodiment.
  • FIG. 21 is a graph showing a relationship between the density and the spring constant in in vivo according to the second embodiment.
  • FIG. 22 is a graph showing the relationship between the density and the average distance in in vivo according to the second embodiment.
  • FIG. 23A is a graph showing the relationship between the density of in vitro according to the first embodiment and the density of in vivo according to the second embodiment.
  • FIG. 23B is a graph showing the relationship between the spring constant of in vitro according to the first embodiment and the density of in vivo according to the second embodiment.
  • FIG. 23C is a graph showing the results of ROC analysis performed with the density of in vitro according to the first embodiment as a variable and the case where the density of in vivo according to the second embodiment is less than 2000.
  • FIG. 23 (d) is a graph showing the results of ROC analysis performed with the in vitro spring constant according to the first embodiment as a variable and the case where the density of the in vivo according to the second embodiment is less than 2000. is there.
  • FIG. 24A is a graph showing the relationship between density and time.
  • FIG. 24B is a graph showing the relationship between the spring constant at 6 months and the density at 24 months.
  • FIG. 24C is a graph showing the relationship between the density at 6 months and the density at 24 months.
  • FIG. 24D is a graph of the ROC curve when a case where the density at 24 months is 1000 or less is determined by the density at 6 months.
  • FIG. 24E is a graph of the ROC curve when a case where the density at 24 months is 1000 or less is determined by the spring constant at 6 months.
  • FIG. 25 is a diagram in which cell positions and contours that have been automatically extracted are superimposed on a cross-sectional image of muscle fibers and displayed.
  • FIG. 1 is a configuration diagram showing a cell evaluation device 1 according to the first embodiment.
  • the cell evaluation apparatus 1 is an apparatus that evaluates the quality of a cell population C1 including a plurality of cells.
  • the cell evaluation apparatus 1 is used for evaluation of a cell population C1 in drug candidate substances (compounds and the like), for example, in the development of ophthalmic therapeutic agents.
  • the cell evaluation apparatus 1 is used for quality control of cultured cells used in a cell suspension injection method in corneal endothelium regenerative medicine.
  • the cell population C1 includes a plurality of cultured cells of corneal endothelial cells.
  • the cells included in the cell population C1 have a two-dimensional close-packed structure with a hexagonal lattice.
  • the cell evaluation apparatus 1 includes at least a computer 10, a display unit 20, and an operation unit 30.
  • the computer 10 includes a processor (for example, a CPU) that executes an operating system, application programs, and the like, a storage unit that includes a ROM, a RAM, a hard disk, and the like, and a communication control unit that includes a network card or a wireless communication module.
  • the computer 10 implements a cell evaluation method by reading and executing a cell evaluation program described later on a processor. Data or a database necessary for processing is stored in the storage unit of the computer 10.
  • the computer 10 may be composed of a single unit or a plurality of units. In the case of a plurality of units, these are connected via a communication network such as the Internet or an intranet, so that one computer 10 is logically constructed.
  • the computer 10 receives a captured image of the cell population C1 on the culture dish 5 that has been captured by the phase contrast microscope 2 and subjected to image processing by the image processing device 3.
  • the phase contrast microscope 2 is not particularly limited, and various phase contrast microscopes can be employed.
  • the image processing device 3 extracts edge information related to the outlines of a plurality of cells included in the cell population C1 in the captured image by a known image processing method.
  • the image processing device 3 outputs the extracted edge information to the computer 10.
  • the computer 10 includes an index calculation unit 11 and an evaluation unit 12 as functional configurations.
  • the index calculation unit 11 executes an index calculation process for calculating an index for quantitatively evaluating the cell population C1 based on the captured image of the cell population C1. Specifically, the index calculation unit 11 performs arithmetic processing based on edge information of the captured image input from the image processing device 3, and includes at least “average distance”, “spring constant”, and “hexagonal lattice order variable”. Calculate the indicator.
  • the average distance is an index representing the degree to which a plurality of cells are clogged.
  • the spring constant is an index representing the degree of uniformity (uniformity) between a plurality of cells.
  • the average distance and the spring constant are obtained by applying a quadratic curve fitting to a potential function based on the radial distribution function of a plurality of cells, which is a function obtained using the Boltzmann distribution. It can be evaluated that the smaller the average distance, the denser the cells. It can be evaluated that the larger the spring constant is, the more uniform the distance between the plurality of cells (the smaller the difference from the average distance).
  • the index calculation unit 11 can calculate the average distance and the spring constant as follows.
  • FIG. 2A is a diagram illustrating the radial distribution function g (r).
  • FIG. 2B is a diagram for explaining the potential function w (r).
  • the probability that another cell exists at a position dr at a distance r from a certain cell is expressed as a radial distribution function g (r).
  • the radial distribution function g (r) can be expressed as a function of the Boltzmann distribution represented by the following equation (1).
  • the potential function w (r) shown in the following equation (2) is obtained.
  • the center-of-gravity positions of the plurality of cells are calculated from the edge information of the plurality of cells included in the cell population C1 of the captured image.
  • a histogram is generated with the distance between the center of gravity positions as the horizontal axis.
  • the radial distribution function g (r) is acquired based on the frequency (frequency) of each distance between the center of gravity positions calculated from this histogram.
  • the acquired radial distribution function g (r) is introduced into the potential function w (r) of the above equation (2). Thereby, a profile of the potential function w (r) can be obtained.
  • quadratic curve fitting is applied to the profile of the potential function w (r).
  • the following equation (3) is obtained by fitting a quadratic curve using the least square method.
  • r 0 is calculated as an average distance
  • k is calculated as a spring constant.
  • the hexagonal lattice order variable is an index representing the degree to which the arrangement of a plurality of cells is close to a regular hexagon.
  • the hexagonal lattice order variable is obtained based on six central angles of a hexagon formed by six cells closest to the cell centered on one of the plurality of cells.
  • the hexagonal lattice order variable has a value from 0 to 1. As the hexagonal lattice order variable is closer to 1, it can be evaluated that the arrangement of a plurality of cells is closer to a regular hexagon.
  • the index calculator 11 calculates hexagonal lattice order variables as follows.
  • Figure 3 is a diagram illustrating a hexagonal lattice order parameter Q 6.
  • the hexagonal lattice order variable Q i 6 for an arbitrary cell i is calculated by the following equations (4) and (5). Then, by taking the average of the hexagonal lattice order parameter Q i 6 for a plurality of cells contained in the cell population C1, it calculates a hexagonal lattice order parameter Q 6.
  • ⁇ ij is a central angle around an arbitrary cell i
  • N (i) is six cells closest to the arbitrary cell i.
  • FIG. 4A is a photograph showing a captured image of the low-quality cell population C1.
  • FIG. 4B is a photograph showing a captured image of the high-quality cell population C1.
  • the finally desired quality in the cell population C1 is that the small cells are arranged (aligned) in an orderly manner.
  • the average distance r 0 , the spring constant k, and the hexagonal lattice order variable Q 6 are indices based on the basic theory of colloid physics and crystal physics based on such quality.
  • the evaluation unit 12 executes an evaluation process for evaluating the cell population C ⁇ b> 1 based on the index calculated by the index calculation unit 11.
  • the evaluation unit 12 may evaluate that the cell population C1 is higher quality (a plurality of cells are dense) as the average distance r 0 is smaller, or the average distance r 0.
  • the cell population C1 may be evaluated as high quality when is below a threshold.
  • the evaluation unit 12 may evaluate that the larger the spring constant k is, the higher the cell population C1 is (the distance between the plurality of cells is uniform), or the spring constant.
  • k is equal to or greater than the threshold value, the cell population C1 may be evaluated as high quality.
  • Evaluation unit 12 if it contains hexagonal lattice order parameter Q 6 as an index, a hexagonal lattice order parameter Q 6 is more cell populations C1 close to 1 is evaluated as high quality (near the arrangement of a plurality of cells in a regular hexagon) it may be a hexagonal lattice order parameter Q 6 cell population C1 when the above threshold may be evaluated with high quality.
  • the evaluation unit 12 performs an OVL calculation process for calculating an overlap coefficient (hereinafter referred to as “OVL”) representing the degree of overlap of the Gaussian distribution determined from the index value and its error component.
  • OTL has a value of 0 or more and 1 or less.
  • OVL When OVL is 0, the Gaussian distribution is completely separated, and when OVL is 1, the Gaussian distribution is completely overlapped.
  • the OVL calculation process and the evaluation by the OVL will be specifically described by exemplifying a case where the OVLs of the parameters A and B that are two arbitrary indexes are compared and evaluated.
  • FIG. 5A and FIG. 5B are graphs for explaining OVL comparative evaluation.
  • the parameter A is on the horizontal axis and the parameter B is on the vertical axis.
  • a plurality of data points are plotted on this graph.
  • Gaussian distributions GA 1 and GB 1 determined from the values A 1 and B 1 and the error component are obtained.
  • Gaussian distributions GA 2 and GB 2 determined from their values A 2 and B 2 and error components are obtained.
  • a line segment extending around the data point is an error bar indicating an error component (the same applies to other figures).
  • the error components of the average distance r 0 and the spring constant k include errors (fitting errors) that occur during fitting.
  • Error component of a hexagonal lattice order parameter Q 6 comprises at least one of a standard deviation and standard error.
  • a reference parameter may be determined, and the scale correction based on the reference parameter may be performed on the three parameters before evaluation. For example, when comparing and evaluating the OVL of the average distance r 0 , the spring constant k, and the hexagonal lattice order variable Q 6 , first, each of these is compared with the cell density (described later) of the cell population C 1. On the basis of the respective comparison results of evaluation, the average distance r 0, the OVL spring constant k and a hexagonal lattice order parameter Q 6 may be comparatively evaluated.
  • the evaluation may be performed by calculating a rank in which the OVLs of these parameters are small.
  • the OVL of the average distance r 0 , the spring constant k, and the hexagonal lattice order variable Q 6 first, the OVL of the average distance r 0 and the spring constant k is compared and evaluated. The OVL of the average distance r 0 and the hexagonal lattice order variable Q 6 is comparatively evaluated. Comparing and evaluating the OVL hexagonal lattice order parameter Q 6 and the spring constant k. Accordingly, the average distance r 0 , the spring constant k, and the hexagonal lattice order variable Q 6 may be compared and evaluated by calculating a rank with a small OVL.
  • FIG. 6 is a diagram showing the cell evaluation program P1.
  • the cell evaluation program P1 is a program for evaluating the quality of the cell population C1, and is stored in the storage unit 13 of the computer 10.
  • the cell evaluation program P1 includes an index calculation module P11 and an evaluation module P12.
  • the index calculation module P11 causes the computer 10 to execute the index calculation process described above.
  • the evaluation module P12 causes the computer 10 to execute the above-described evaluation processing and OVL calculation processing.
  • the cell evaluation program P1 may be provided after being fixedly recorded on a tangible recording medium such as a CD-ROM, DVD-ROM, or semiconductor memory. Alternatively, the cell evaluation program P1 may be provided via a communication network as a data signal superimposed on a carrier wave.
  • the display unit 20 displays at least one of a captured image of the phase contrast microscope 2, an index calculation result by the index calculation unit 11, and an evaluation result of the cell population C1 by the evaluation unit 12. .
  • a display or the like can be used as the display unit 20.
  • the operation unit 30 performs various operations of the operator for the cell evaluation apparatus 1.
  • a mouse or a keyboard can be used as the operation unit 30.
  • the cell population C1 placed on the culture dish 5 is first imaged by the phase contrast microscope 2 in advance.
  • Image processing is performed on the captured image captured by the phase-contrast microscope 2 by the image processing device 3 to acquire edge information of each cell included in the captured image.
  • the quality of the cell population C1 is evaluated based on the edge information of the captured image acquired by the image processing apparatus 3. That is, the index calculation unit 11 executes the above-described index calculation process, and calculates an index including the average distance r 0 , the spring constant k, and the hexagonal lattice order variable Q 6 (index calculation step). Based on the calculated index, the evaluation unit 12 executes the above-described evaluation process to evaluate the cell population C1 (evaluation step). Further, the evaluation unit 12 executes the above-described OVL calculation process for the calculated index to calculate the OVL (overlap coefficient calculation step). Then, at least one of the captured image, the calculated index, the calculated OVL, and the evaluation result of the cell population C1 is displayed on the display unit 20.
  • FIG. 7A is a graph showing the relationship between density d and good cell rate.
  • FIG. 7B is a graph showing the relationship between the spring constant k and the good cell rate.
  • Density d is a degree of density of the plurality of cells in the cell population C1, which is an index represented by the following formula (6) the average value of the area of one cell to the case of the S A.
  • the good cell rate is a rate at which the quality in the cell population C1 is good.
  • both the density d and the spring constant k are positively correlated with the good cell rate.
  • the error component is smaller than the density d. From this, it can be seen that the spring constant k is highly sensitive and highly reliable as an index when the cell population C1 is evaluated.
  • FIG. 8A is a graph showing the relationship between the density d and the spring constant k.
  • FIG. 8B is a graph for comparing and evaluating the OVL with the density d and the OVL with the spring constant k.
  • the horizontal axis of FIG. 8B is the density difference d diff and the spring constant difference k diff .
  • the scale correction is applied to either the density difference d diff or the spring constant difference k diff .
  • the spring constant k has a small error component in comparison with the density d.
  • the spring constant k is a delicate index because the OVL is very small in comparison with the density d.
  • the spring constant k is highly sensitive and highly reliable as an index when the cell population C1 is evaluated.
  • FIG. 9 (a) is a graph showing the relationship between the density d and the average distance r 0.
  • FIG. 9B is a graph for comparing and evaluating the OVL with the density d and the OVL with the average distance r 0 .
  • the average distance r 0 is a delicate index because the OVL is often small in comparison with the density d when evaluating the cell population C1.
  • the index including the average distance r 0 , the spring constant k, and the hexagonal lattice order variable Q 6 is calculated, and the cell is calculated based on the index.
  • Population C1 is evaluated.
  • the quality finally desired in the cell population C1 is that the small cells are arranged (aligned) in an orderly manner. Therefore, in the present embodiment, it is possible to numerically grasp whether or not small cells are arranged in an orderly manner in the cell population C1 by applying an index based on the population order to the evaluation.
  • the index can be correlated with the quality, and a quantitative meaning can be given between the index and the quality.
  • the quality of the cell population C1 can be quantitatively evaluated.
  • the quality of the cell population C1 can be evaluated nondestructively only by the captured image, whether the cell population C1 is high quality or low quality can be clearly identified, and quantitative numerical values are also possible. is there.
  • a quantitative standard technique for a two-dimensional cell population using a statistical physics method can be provided. This embodiment is expected to be used as a quantitative standard in general ophthalmic diagnosis.
  • the cell evaluation program P1 according to the present embodiment can be applied as a process management program for the transplanted cell culture platform.
  • corneal endothelial cells once reduced do not recover spontaneously, effective treatment is necessary.
  • corneal endothelial dysfunction corneal endothelial cells are transplanted in suspension. Endothelial cell transfer therapy has been proposed recently.
  • quality control or cell selection before transplantation is possible only by microscopic observation without staining with a cell marker in the quality control step of cultured cells used in the treatment method. It becomes.
  • the index OVL is calculated.
  • the sensitivity of an index can be grasped using OVL.
  • quantitative quality evaluation of the cell population C1 can be performed with higher accuracy.
  • the average distance r 0 , the spring constant k, and the hexagonal lattice order variable Q 6 are calculated as indices. However, not all of these may be used as indices.
  • the average distance r 0 , the spring constant k, and the hexagonal lattice order or as an indicator at least one of the variable Q 6.
  • the index is not limited to the average distance r 0 , the spring constant k, and the hexagonal lattice order variable Q 6, and may include other parameters.
  • the index may further include at least one of density d, hexagonal ratio, aspect ratio, number of adjacent cells, and film thickness (reflectance).
  • the hexagonal ratio, aspect ratio, number of adjacent cells, and film thickness (reflectance) can be calculated by a known method.
  • at least one parameter included as an index may be appropriately selected.
  • This embodiment can be used for evaluation of the cell population C1 in a drug candidate substance, for example, in the development of an ophthalmic therapeutic agent. As described above, by applying the present embodiment to the evaluation of the cell population C1 in the drug candidate substance, it is possible to shorten the verification time of the effectiveness and safety of the drug candidate substance.
  • FIG. 10 is a configuration diagram showing a cell evaluation device 50 according to the second embodiment.
  • the cell evaluation apparatus 50 according to the present embodiment is an apparatus used as, for example, an ophthalmic ophthalmic examination apparatus, and includes at least a specular microscope 60, a computer 70, a display unit 20, and an operation unit 30. .
  • the specular microscope 60 images a cell population, which is an endothelial tissue including a plurality of corneal endothelial cells of the eye of the patient 80, and acquires a specular image as a captured image.
  • the specular microscope 60 outputs a specular image to the computer 70.
  • the computer 70 has a physical configuration similar to that of the computer 10 (see FIG. 1).
  • the computer 70 includes an image processing unit 71, an index calculation unit 72, and an evaluation unit 73 as functional configurations.
  • the image processing unit 71 extracts edge information regarding the outlines of a plurality of corneal endothelial cells included in the cell population in the specular image captured by the specular microscope 60 by a known image processing method.
  • the image processing unit 71 outputs the extracted edge information to the index calculation unit 72.
  • the index calculation unit 72 executes the above-described index calculation process based on the edge information of the specular image input from the image processing unit 71. Thereby, the index calculation unit 72 calculates an index including at least “average distance r 0 ”, “spring constant k”, and “hexagonal lattice order variable Q 6 ”.
  • the evaluation unit 73 executes the above-described evaluation process based on the index calculated by the index calculation unit 72 and evaluates the cell population.
  • the evaluation unit 73 executes an OVL calculation process to calculate an OVL of the index.
  • FIG. 11 is a photograph showing a specular image of a cell population containing a plurality of corneal endothelial cells.
  • FIG. 11 (a) shows a low quality cell population
  • FIG. 11 (b) shows a high quality cell population.
  • the final desired quality in the cell population including a plurality of corneal endothelial cells is such that small cells are arranged in an orderly manner as in the first embodiment. Is found to be (equipped).
  • the cell population including the corneal endothelial cells of the patient 80 is imaged by the specular microscope 60.
  • the specular image picked up by the specular microscope 60 is subjected to image processing by the image processing unit 71 to acquire edge information of each corneal endothelial cell included in the specular image.
  • the index calculation unit 72 executes the index calculation process described above to calculate the index (index calculation step).
  • the evaluation unit 73 executes the above-described evaluation process to evaluate the cell population (evaluation step).
  • the evaluation unit 12 executes the above-described OVL calculation process for the calculated index, and calculates the OVL (overlap coefficient calculation step). Then, at least one of the specular image, the calculated index, the calculated OVL, and the evaluation result of the cell population is displayed on the display unit 20.
  • FIG. 12 is a diagram illustrating an example of display on the display unit 20.
  • a specular image 61 captured by the specular microscope 60
  • a chart 62 in which index names, values, and OVL are associated with each other, and various icon buttons are displayed.
  • the index here includes a spring constant k, an average distance r 0 , a hexagonal lattice order variable Q 6 , a density d, a hexagonal ratio, an aspect ratio, the number of adjacent cells, and a film thickness. According to such a display, the cell population can be easily evaluated or diagnosed.
  • FIG. 13 (a) is a graph showing the relationship between density d and good cell rate.
  • FIG. 13B is a graph showing the relationship between the spring constant k and the good cell rate.
  • the density d is a degree of density of a plurality of cells in a cell population including corneal endothelial cells
  • the good cell rate is a ratio of good quality in the cell population including corneal endothelial cells.
  • both the density d and the spring constant k are positively correlated with the good cell rate.
  • the error component is smaller than the density d. This shows that the spring constant k is highly sensitive and highly reliable as an index when evaluating a cell population including corneal endothelial cells.
  • FIG. 14A is a graph showing the relationship between the density d and the spring constant k.
  • FIG. 14B is a graph for comparing and evaluating the OVL with the density d and the OVL with the spring constant k.
  • the horizontal axis of FIG.14 (b) is the density difference ddiff and the spring constant difference kdiff .
  • the scale correction is applied to either the density difference d diff or the spring constant difference k diff .
  • the spring constant k has a small error component in comparison with the density d.
  • FIG. 14B it can be seen that the spring constant k is a delicate index because the OVL is very small in comparison with the density d.
  • the spring constant k is highly sensitive and highly reliable as an index when evaluating a cell population including corneal endothelial cells.
  • Figure 15 (a) is a graph showing the relationship between the density d and the average distance r 0.
  • FIG. 15B is a graph for comparing and evaluating the OVL with the density d and the OVL with the average distance r 0 .
  • the average distance r 0 is in evaluating cell populations including corneal endothelial cells, when OVL small number, it can be seen that a delicate indicator in comparison with the density d.
  • the evaluation unit 73 may predict the quality of the cell population in the future from the time when the captured image is captured based on the index calculated by the index calculation unit 72. That is, in the evaluation step described above, based on the index calculated in the index calculation step described above, the quality of the cell population in the future from the imaging time point when the specular image was captured may be predicted. Thereby, it can respond to prognosis prediction of a cell population. In the present embodiment, for example, as described below, it is possible to cope with prognosis prediction particularly after injecting treatment of eye cells.
  • FIG. 16 is a diagram showing the state of corneal endothelial cells of six patients after corneal transplantation. In FIG. 16, it is shown on the basis of the time of transplantation (as 0 months).
  • FIG. 16A is a graph showing the relationship between the density d of corneal endothelial cells of each patient and time.
  • FIG. 16B is a graph showing the relationship between the density d at 3 months and the spring constant k at 3 months for each patient's corneal endothelial cells.
  • FIG. 16C is a graph showing the relationship between the density d at 24 months and the spring constant k at 3 months for each patient's corneal endothelial cells.
  • FIG. 16D is a graph for comparing and evaluating the OVL of the density d at 3 months and the OVL of the spring constant k at 3 months for each patient's corneal endothelial cells.
  • FIG. 16E is a graph for comparing and evaluating the OVL of the density d at 24 months and the OVL of the spring constant k at 3 months for each patient's corneal endothelial cells.
  • the horizontal axis of FIG.16 (d) and FIG.16 (e) is the density difference ddiff and the spring constant difference kdiff .
  • the scale correction is applied to either the density difference d diff or the spring constant difference k diff .
  • FIG. 16 (a) there is no difference in the density d of all patients at 3 months, but the density d of several patients is significantly reduced at 24 months.
  • FIG. 16 (d) it can be seen that the density d is high in OVL and the sensitivity of evaluation of the cell population is low at 3 months.
  • FIG. 16 (e) the density d becomes lower at 24 months when the decrease is actually noticeable, and the OVL becomes lower and the sensitivity of the evaluation of the cell population increases. From these, it can be seen that, at the time of 3 months, when the cell population is evaluated using the density d as an index, it is impossible to judge even the deterioration of the cell quality and tissue quality of the long-term prognosis.
  • the spring constant k at the time of 3 months has less error components than the density d at the time of 3 months and 24 months.
  • the spring constant k has a sufficiently low OVL and the sensitivity of the evaluation of the cell population is high at 3 months. That is, by evaluating the cell population using the spring constant k as an index at the time of 3 months, it is possible to predict the deterioration of cell quality and tissue quality of long-term prognosis that could not be determined from the density d.
  • the cell population is evaluated using the spring constant k as an index, it is possible to isolate a cell population that is highly likely to be of low grade with a long-term prognosis, for example, by follow-up at 3 months.
  • the prediction of the cell quality and tissue quality of such a long-term prognosis it can be assumed that the same result can be obtained depending on the target cell, using the average distance r 0 and the hexagonal lattice order variable Q 6 as indices.
  • the present invention can be applied to corneal endothelium diagnosis in general ophthalmology such as screening examination before ophthalmic surgery and contact lens outpatient.
  • FIG. 17A is a graph showing the relationship between the density d and the good cell rate in vitro (cultured cells) according to the first embodiment.
  • FIG. 17B is a graph showing the relationship between the in vitro spring constant k and the good cell rate according to the first embodiment.
  • the density d is a degree of density of a plurality of cells in the cell population C1 including corneal endothelial cells.
  • the good cell rate is a ratio of good quality in the cell population C1 including corneal endothelial cells.
  • r 2 is a determination coefficient.
  • both the density d and the spring constant k are positively strongly correlated with the good cell rate. This indicates that the spring constant k is highly reliable as an index (as much as the density) when evaluating the cell population C1.
  • FIG. 18 is a graph showing the relationship between the density d and the spring constant k in the in-vitro according to the first embodiment. As shown in FIG. 18, since the density d and the spring constant k are positively strongly correlated, it can be seen that the spring constant k can be used in the same manner as the density d when evaluating the cell population C1.
  • FIG. 19 is a graph showing the relationship between the in vitro density d and the average distance r 0 according to the first embodiment. As shown in FIG. 19, since the density d and the average distance r 0 are positively strongly correlated, it can be seen that the average distance r 0 can be used in the same manner as the density d when evaluating the cell population C1.
  • FIG. 20A is a graph showing the relationship between the density d and the good cell rate in the in vivo (regeneration cornea) according to the second embodiment.
  • FIG. 20B is a graph showing the relationship between the spring constant k and the good cell rate in the second embodiment.
  • both the density d and the spring constant k are positively correlated with the good cell rate. From this, it can be seen that when evaluating the cell population C1, the spring constant k has high sensitivity and high reliability as an index.
  • FIG. 21 is a graph showing the relationship between the density d and the spring constant k in in vivo according to the second embodiment. Since the density d and the spring constant k are positively strongly correlated, it can be seen that the spring constant k can be used in the same manner as the density d when evaluating the cell population C1 including corneal endothelial cells.
  • FIG. 22 is a graph showing the relationship between the in vivo density d and the average distance r 0 according to the second embodiment. As shown in FIG. 22, since the density d and the average distance r 0 are positively correlated with each other, the average distance r 0 should be used in the same manner as the density d when evaluating the cell population C1 including corneal endothelial cells. You can see that
  • FIG. 23 is a diagram showing the relationship between the in-vitro results according to the first embodiment and the in-vivo results according to the second embodiment.
  • FIG. 23A is a graph showing the relationship between the density d of in vitro according to the first embodiment and the density d of in vivo according to the second embodiment.
  • FIG. 23B is a graph showing the relationship between the spring constant k of in vitro according to the first embodiment and the density d of in vivo according to the second embodiment.
  • FIG. 23 (c) is a graph showing the result of ROC analysis performed when the density d of in vitro according to the first embodiment is a variable and the density d of in vivo according to the second embodiment is less than 2000. It is.
  • FIG.23 (d) shows the result of the ROC analysis performed by setting the case where the in-vitro spring constant k according to the first embodiment is a variable and the in-vivo density d according to the second embodiment is less than 2000. It is a graph.
  • the spring constant k has a result equivalent to the density d. From this, it can be seen that the density d of the in vivo according to the second embodiment can be predicted with the same accuracy as the density d using the spring constant k in the in vitro according to the first embodiment. That is, it can be seen that the spring constant k is useful.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristics
  • the evaluation unit 12 executes ROC analysis processing for performing ROC analysis using an index including at least one of the average distance r 0 , the spring constant k, and the hexagonal lattice order variable Q 6 as a variable. That is, the evaluation unit 12 performs ROC analysis processing using the index as a variable, and performs ROC analysis (ROC analysis step). Thereby, an index can be evaluated using ROC analysis.
  • FIG. 24 is a diagram showing the state of corneal endothelial cells of 12 patients after corneal transplantation.
  • FIG. 24A is a graph showing the relationship between the density d and time.
  • FIG. 24B is a graph showing the relationship between the density d at the 6th month and the density d at the 24th month.
  • FIG. 24C is a graph showing the relationship between the spring constant k at 6 months and the density d at 24 months.
  • FIG. 24D is a graph of an ROC curve when a case where the density d at 24 months is 1000 or less is determined by the density d at 6 months.
  • FIG. 24E is a graph of the ROC curve when the case where the density d at 24 months is 1000 or less is determined by the spring constant k at 6 months.
  • the transition of the density d is represented by a scatter diagram and a box plot.
  • the density d of several patients is significantly reduced at 24 months.
  • the density d at the 6th month and the density d at the 24th month are uncorrelated with each other.
  • the spring constant k at 6 months and the density d at 24 months are weakly correlated. That is, it can be seen that the density d at the 24th month can be predicted more accurately by using the spring constant k than the density d at the 6th month.
  • the cell population is evaluated using the spring constant k as an index, it is possible to isolate a cell population that is highly likely to be of low grade with a long-term prognosis, for example, by follow-up at 6 months.
  • the prediction of the cell quality and tissue quality of such a long-term prognosis it can be assumed that the same result can be obtained depending on the target cell, using the average distance r 0 and the hexagonal lattice order variable Q 6 as indices.
  • FIG. 25 is a diagram in which cell positions and contours that have been automatically extracted are superimposed on a cross-sectional image of muscle fibers and displayed.
  • the cross-sectional images in FIG. 25 refer to ““ Multiple Sclerosis Affects Skeletal Muscle Characteristics ”, Inez Wens, et al., PLoS ONE 9, 9, e180158 (2014), doi: 10.1371 / journal.pone.0108158”. ing.
  • the cross-sectional image in FIG. 25 is a stained image of the cross section of the smooth muscle fiber. From the cell position information automatically extracted in advance, it was determined that the spring constant k was 0.00051, the average distance r 0 was 72, and the hexagonal lattice order variable Q 6 was 0.18.
  • a structure such as a cross section of a muscle fiber can be similarly evaluated from the arrangement of each component. In this way, the structure can be evaluated for various objects without being limited to the type.
  • the cells included in the cell population to be evaluated are not particularly limited.
  • the cells may be corneal endothelial cells, epithelial cells, hepatocytes, or cultured cells of any of these.
  • epithelial cells include corneal epithelial cells, small airway epithelial cells, mammary epithelial cells, or retinal pigment epithelial cells.
  • the first embodiment is applied to quality evaluation of cultured cells before transplantation of corneal endothelial cells
  • the second embodiment is applied to quality evaluation and prognosis prediction of corneal endothelial cells after transplantation.
  • One aspect of the invention is applicable both before and after surgery. That is, according to one aspect of the present invention, quantitative evaluation of both preoperative and postoperative cell populations can be performed with the same index based on quality.
  • a diagnostic imaging platform that can be applied both before and after surgery can be established. It is applicable to preoperative process management, prognosis diagnosis and prognosis prediction in cell transplantation therapy. Applications in a wide range of fields such as quantitative standardization of diagnosis in clinical ophthalmology and process management in cell transplant regenerative medicine are expected.
  • the combination including the outermost peripheral cell in the target region is excluded from all combinations of a pair of cells selected from a plurality of cells.
  • a histogram is generated with the distance between the center of gravity positions as the horizontal axis, but the present invention is not limited to this. For example, without generating a combination including the outermost peripheral cells in the target region, a histogram with the horizontal axis as the distance between the center of gravity positions is generated for all combinations of a pair of cells selected from a plurality of cells. Also good.
  • the hexagonal lattice order variable Q i 6 for any cell i excluding the outermost peripheral cells in the target region is calculated by the above equations (4) and (5).
  • the present invention is not limited to this.
  • the hexagonal lattice order variable Q i 6 for any cell i may be calculated without removing the outermost peripheral cells in the target region.
  • the sensitivity of the index may be grasped by using OVL, or may be grasped by using ROC analysis instead of or in addition to this.
  • the spring constant is also referred to as “elastic potential curvature”, for example.
  • the cell evaluation program P1 can be recorded on a computer-readable non-transitory recording medium such as a compact disk, flexible disk, hard disk, magneto-optical disk, digital video disk, magnetic tape, or semiconductor memory. . That is, one aspect of the present invention may be a computer-readable recording medium that records the cell evaluation program P1.
  • the cell evaluation device is a cell evaluation device that evaluates the quality of a cell population including a plurality of cells, and is based on a captured image of the cell population, and the plurality of cells are clogged.
  • An index including at least any one of an average distance representing a spring constant representing a degree that the distances between the plurality of cells are aligned, and a hexagonal lattice order variable representing a degree that the arrangement of the plurality of cells is close to a regular hexagon
  • an evaluation unit that evaluates the cell population based on the index calculated by the index calculation unit, wherein the average distance and the spring constant are obtained using a Boltzmann distribution.
  • the hexagonal lattice order variable is one of the plurality of cells.
  • Around the cells may be obtained based on the six central angle of the hexagon formed by six nearest cell to the cell.
  • the cell evaluation program is a cell evaluation program for evaluating the quality of a cell population including a plurality of cells, and the degree to which the plurality of cells are clogged based on a captured image of the cell population.
  • An index including at least any one of an average distance representing a spring constant representing a degree that the distances between the plurality of cells are aligned, and a hexagonal lattice order variable representing a degree that the arrangement of the plurality of cells is close to a regular hexagon
  • An index calculation process for calculating the cell population and an evaluation process for evaluating the cell population based on the index calculated in the index calculation process are executed by a computer, and the average distance and the spring constant use a Boltzmann distribution.
  • the number may be obtained based on the six central angle of the hexagon formed by six nearest cell to the cells around the one cell of the plurality of the cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Quality & Reliability (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Abstract

細胞評価方法は、複数の細胞を含む細胞集団の品質を評価する。細胞評価方法は、細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出する指標算出ステップと、指標算出ステップで算出した指標に基づいて、細胞集団を評価する評価ステップと、を含む。

Description

細胞評価方法、細胞評価装置、及び細胞評価プログラム
　本発明の一側面は、細胞評価方法、細胞評価装置、及び細胞評価プログラムに関する。
　従来、細胞集団の品質評価については、細胞マーカーによる識別又は位相差顕微鏡画像の目視に依拠している。また、例えば特許文献１には、拡大検体画像内における細胞のアスペクト比や配列等の特徴量を算出し、この特徴量に基づいて細胞集団を評価する技術が記載されている。
特開２０１５－１３０８０６号公報
　上記従来技術では、前述のように、アスペクト比等を指標として細胞集団を評価する場合があるが、指標と品質との相関（裏付け）はなく、指標の定量的な意味付けは十分になされていない。そのため、細胞集団の品質を定量的に評価できない可能性がある。
　そこで、本発明の一側面は、細胞集団の品質を定量的に評価することが可能な細胞評価方法、細胞評価装置、及び細胞評価プログラムを提供することを課題とする。
　本発明の一側面に係る細胞評価方法は、複数の細胞を含む細胞集団の品質を評価する細胞評価方法であって、細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出する指標算出ステップと、指標算出ステップで算出した指標に基づいて、細胞集団を評価する評価ステップと、を含む。
　本発明の一側面に係る細胞評価装置は、複数の細胞を含む細胞集団の品質を評価する細胞評価装置であって、細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出する指標算出部と、指標算出部で算出した指標に基づいて、細胞集団を評価する評価部と、を含む。
　本発明の一側面に係る細胞評価プログラムは、複数の細胞を含む細胞集団の品質を評価する細胞評価プログラムであって、細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出する指標算出処理と、指標算出処理で算出した指標に基づいて、細胞集団を評価する評価処理と、をコンピュータに実行させる。
　本発明の一側面では、小さい細胞が秩序良く配列されている（揃っている）ことが細胞集団で最終的に望まれる品質であることに鑑み、平均距離、ばね定数及び六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出し、その指標に基づいて細胞集団を評価する。これにより、集団秩序に基づく指標を評価に適用し、細胞集団において小さい細胞が秩序良く配列されているかどうかに関して数値化して把握することが可能となる。すなわち、細胞集団の品質を定量的に評価することが可能となる。
　本発明の一側面では、平均距離及びばね定数は、ボルツマン分布を利用して得られた関数であって複数の細胞の動径分布関数に基づくポテンシャル関数に、二次曲線フィッティングを施して求められ、六角格子秩序変数は、複数の細胞のうちの１つの細胞を中心にして当該細胞に最も近い６つの細胞で形成される六角形の６つの中心角に基づき求められていてもよい。
　本発明の一側面に係る細胞評価方法は、指標の値及びその誤差成分から定まるガウス分布の重なり度合いを表すオーバラップ係数を算出するオーバラップ係数算出ステップを含んでいてもよい。オーバラップ係数によれば、指標の感度（つまり、指標が繊細な変数であるかどうか）を把握することができる。
　本発明の一側面に係る細胞評価方法は、指標を変数としてＲＯＣ解析を行うＲＯＣ解析ステップを含んでいてもよい。ＲＯＣ解析を利用して指標を評価することができる。
　本発明の一側面に係る細胞評価方法において、細胞は、六角格子の二次元最密充填構造を有していてもよい。また、本発明に係る細胞評価方法において、細胞は、角膜内皮細胞、上皮系細胞、肝細胞、又はこれらの何れかの培養細胞であってもよい。なお、上皮系細胞としては、例えば、角膜上皮細胞、小気道上皮細胞、乳腺上皮細胞、もしくは網膜色素上皮細胞等が挙げられる。
　本発明の一側面に係る細胞評価方法において、評価ステップでは、指標算出ステップで算出した指標に基づいて、撮像画像を撮像した時点よりも将来においての細胞集団の品質を予測してもよい。この場合、細胞集団の予後予測に対応できる。
　本発明の一側面に係る細胞評価方法は、薬剤候補物質における細胞集団の評価に用いられてもよい。例えば眼科治療薬の開発において、薬剤候補物質における細胞集団の評価に本発明を適用することで、薬剤候補物質の有効性及び安全性の検証時間を短縮することができる。
　本発明の一側面に係る細胞評価方法では、指標は、平均距離、ばね定数、及び六角格子秩序変数の全てを含んでいてもよい。
　本発明の一側面によれば、細胞集団の品質を定量的に評価することが可能な細胞評価方法、細胞評価装置、及び細胞評価プログラムを提供することができる。
図１は、第１実施形態に係る細胞評価装置を示す構成図である。 図２（ａ）は、動径分布関数を説明する図である。図２（ｂ）は、ポテンシャル関数を説明する図である。 図３は、六角格子秩序変数を説明する図である。 図４（ａ）は、低品位の細胞集団の撮像画像を示す写真図である。図４（ｂ）は、高品位の細胞集団の撮像画像を示す写真図である。 図５（ａ）は、ＯＶＬの比較評価を説明するためのグラフである。図５（ｂ）は、ＯＶＬの比較評価を説明するための他のグラフである。 図６は、細胞評価プログラムを示す図である。 図７（ａ）は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度と良細胞率との関係を示すグラフである。図７（ｂ）は、第１実施形態に係るin vitroにおけるばね定数と良細胞率との関係を示すグラフである。 図８（ａ）は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度とばね定数との関係を示すグラフである。図８（ｂ）は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度のＯＶＬとばね定数のＯＶＬとを比較評価するグラフである。 図９（ａ）は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度と平均距離との関係を示すグラフである。図９（ｂ）は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度のＯＶＬと平均距離のＯＶＬとを比較評価するグラフである。 図１０は、第２実施形態に係る細胞評価装置を示す構成図である。 図１１（ａ）は、低品位の細胞集団のスペキュラー画像を示す写真図である。図１１（ｂ）は、高品位の細胞集団のスペキュラー画像を示す写真図である。 図１２は、表示部の表示の一例を示す図である。 図１３（ａ）は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度と良細胞率との関係を示すグラフである。図１３（ｂ）は、第２実施形態に係るin vivoにおけるばね定数と良細胞率との関係を示すグラフである。 図１４（ａ）は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度とばね定数との関係を示すグラフである。図１４（ｂ）は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度のＯＶＬとばね定数のＯＶＬとを比較評価するグラフである。 図１５（ａ）は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度と平均距離との関係を示すグラフである。図１５（ｂ）は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度のＯＶＬと平均距離のＯＶＬとを比較評価するグラフである。 図１６（ａ）は、密度と時間との関係を示すグラフである。図１６（ｂ）は、３か月時点の密度と３か月時点のばね定数との関係を示すグラフである。図１６（ｃ）は、２４か月時点の密度と３か月時点のばね定数との関係を示すグラフである。図１６（ｄ）は、３か月時点の密度のＯＶＬと３か月時点のばね定数のＯＶＬとを比較評価するグラフである。図１６（ｅ）は、２４か月時点の密度のＯＶＬと３か月時点のばね定数のＯＶＬとを比較評価するグラフである。 図１７（ａ）は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度と良細胞率との関係を示すグラフである。図１７（ｂ）は、第１実施形態に係るin vitroにおけるばね定数と良細胞率との関係を示すグラフである。 図１８は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度とばね定数との関係を示すグラフである。 図１９は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度と平均距離との関係を示すグラフである。 図２０（ａ）は、第２実施形態における密度と良細胞率との関係を示すグラフである。図２０（ｂ）は、第２実施形態に係るin vivoにおけるばね定数と良細胞率との関係を示すグラフである。 図２１は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度とばね定数との関係を示すグラフである。 図２２は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度と平均距離との関係を示すグラフである。 図２３（ａ）は、第１実施形態に係るin vitroの密度と第２実施形態に係るin vivoの密度との関係を示すグラフである。図２３（ｂ）は、第１実施形態に係るin vitroのばね定数と第２実施形態に係るin vivoの密度との関係を示すグラフである。図２３（ｃ）は、第１実施形態に係るin vitroの密度を変数とし、第２実施形態に係るin vivoの密度が２０００を下回る場合を真として行ったＲＯＣ解析の結果を示すグラフである。図２３（ｄ）は、第１実施形態に係るin vitroのばね定数を変数とし、第２実施形態に係るin vivoの密度が２０００を下回る場合を真として行ったＲＯＣ解析の結果を示すグラフである。 図２４（ａ）は、密度と時間との関係を示すグラフである。図２４（ｂ）は、６か月時点のばね定数と２４か月時点の密度との関係を示すグラフである。図２４（ｃ）は、６か月時点の密度と２４か月時点の密度との関係を示すグラフである。図２４（ｄ）は、２４か月時点の密度が１０００以下となる症例を、６か月時点の密度で判定した場合のＲＯＣ曲線のグラフである。図２４（ｅ）は、２４か月時点の密度が１０００以下となる症例を、６か月時点のばね定数で判定した場合のＲＯＣ曲線のグラフである。 図２５は、筋繊維の断面画像に自動抽出された細胞位置及び輪郭を重ねて表示した図である。
　以下、図面を参照しつつ実施形態について詳細に説明する。なお、以下の説明において同一又は相当要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
［第１実施形態］
　図１は、第１実施形態に係る細胞評価装置１を示す構成図である。図１に示されるように、細胞評価装置１は、複数の細胞を含む細胞集団Ｃ１の品質を評価する装置である。細胞評価装置１は、例えば眼科治療薬の開発において、薬剤候補物質（化合物等）における細胞集団Ｃ１の評価に用いられる。特に細胞評価装置１は、角膜内皮の再生医療における細胞懸濁液注入法に用いられる培養細胞の品質管理に利用される。細胞集団Ｃ１は、角膜内皮細胞の培養細胞を複数含んでいる。細胞集団Ｃ１に含まれる細胞は、六角格子の二次元最密充填構造を有する。細胞評価装置１は、コンピュータ１０、表示部２０及び操作部３０を少なくとも備えている。
　コンピュータ１０は、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラム等を実行するプロセッサ（例えばＣＰＵ）と、ＲＯＭ、ＲＡＭ及びハードディスク等で構成される記憶部と、ネットワークカード又は無線通信モジュールで構成される通信制御部と、を有する。コンピュータ１０は、後述する細胞評価プログラムをプロセッサ上に読み込ませて実行することによって細胞評価方法を実現する。コンピュータ１０の記憶部内には、処理に必要なデータ又はデータベースが記憶される。コンピュータ１０は、１台で構成されてもよいし、複数台で構成されてもよい。複数台で構成されている場合には、これらがインターネット又はイントラネット等の通信ネットワークを介して接続されることで、論理的に一つのコンピュータ１０が構築される。
　コンピュータ１０には、位相差顕微鏡２で撮像されて画像処理装置３で画像処理が施された、培養皿５上の細胞集団Ｃ１の撮像画像が入力される。位相差顕微鏡２としては、特に限定されず、種々の位相差顕微鏡を採用できる。画像処理装置３は、公知の画像処理手法により、撮像画像において細胞集団Ｃ１に含まれる複数の細胞の輪郭に関するエッジ情報を抽出する。画像処理装置３は、抽出したエッジ情報をコンピュータ１０に出力する。コンピュータ１０は、機能的構成として、指標算出部１１及び評価部１２を含む。
　指標算出部１１は、細胞集団Ｃ１の撮像画像に基づいて、当該細胞集団Ｃ１を定量的に評価するための指標を算出する指標算出処理を実行する。具体的には、指標算出部１１は、画像処理装置３から入力された撮像画像のエッジ情報に基づく演算処理を行い、「平均距離」、「ばね定数」及び「六角格子秩序変数」を少なくとも含む指標を算出する。
　平均距離は、複数の細胞が詰まっている程度を表す指標である。ばね定数は、複数の細胞の間の距離が揃っている程度（均一性）を表す指標である。平均距離及びばね定数は、ボルツマン分布を利用して得られた関数であって複数の細胞の動径分布関数に基づくポテンシャル関数に、二次曲線フィッティングを施して求められる。平均距離が小さいほど、複数の細胞が密であると評価できる。ばね定数が大きいほど、複数の細胞の間の距離が揃っている（平均距離からの差異が小さい）と評価できる。例えば指標算出部１１では、以下のように平均距離及びばね定数を算出できる。
　図２（ａ）は、動径分布関数ｇ（ｒ）を説明する図である。図２（ｂ）は、ポテンシャル関数ｗ（ｒ）を説明する図である。図２（ａ）に示されるように、細胞集団Ｃ１では、ある細胞から距離ｒの位置ｄｒに他の細胞が存在する確率は、動径分布関数ｇ（ｒ）として表される。そして、動径分布関数ｇ（ｒ）は、下式（１）に示されるボルツマン分布の関数として表すことができる。この動径分布関数ｇ（ｒ）の自然対数をとることで、下式（２）に示されるポテンシャル関数ｗ（ｒ）を得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　そこで、撮像画像の細胞集団Ｃ１に含まれる複数の細胞のエッジ情報から、これら複数の細胞の重心位置を算出する。複数の細胞の中から選択される一対の細胞の組合せの全てについて、その重心位置間距離を横軸としたヒストグラムを生成する。このヒストグラムから算出される重心位置間距離それぞれの頻度（度数）に基づいて、動径分布関数ｇ（ｒ）を取得する。取得した当該動径分布関数ｇ（ｒ）を、上式（２）のポテンシャル関数ｗ（ｒ）に導入する。これにより、ポテンシャル関数ｗ（ｒ）のプロファイルを得ることができる。
　図２（ｂ）に示されるように、ポテンシャル関数ｗ（ｒ）のプロファイルに対して、二次曲線フィッティングを施す。ここでは、最小二乗法を用いて二次曲線をフィッティングすることで、下式（３）が求められる。その結果、下式（３）において、ｒ０が平均距離として算出され、ｋがばね定数として算出される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　六角格子秩序変数は、複数の細胞の配置が正六角形に近い程度を表す指標である。六角格子秩序変数は、複数の細胞のうちの１つの細胞を中心にして当該細胞に最も近い６つの細胞で形成される六角形の６つの中心角に基づき求められる。六角格子秩序変数は、０から１の値を有している。六角格子秩序変数が１に近いほど、複数の細胞の配置が正六角形に近いと評価できる。例えば指標算出部１１では、以下のように六角格子秩序変数を算出する。
　図３は、六角格子秩序変数Ｑ６を説明する図である。下式（４），（５）により、任意の細胞ｉについての六角格子秩序変数Ｑｉ ６を算出する。そして、細胞集団Ｃ１に含まれる複数の細胞に関して六角格子秩序変数Ｑｉ ６の平均をとることで、六角格子秩序変数Ｑ６を算出する。図３に示されるように、θｉｊは任意の細胞ｉを中心にした中心角であり、Ｎ（ｉ）は任意の細胞ｉに最も近い６つの細胞である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　図４（ａ）は、低品位の細胞集団Ｃ１の撮像画像を示す写真図である。図４（ｂ）は、高品位の細胞集団Ｃ１の撮像画像を示す写真図である。図４（ａ）及び図４（ｂ）に示されるように、細胞集団Ｃ１において最終的に望まれる品質は、小さい細胞が秩序良く配列されている（揃っている）ことであることが見出される。平均距離ｒ０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ６は、このような品質に立脚した、コロイド物理学及び結晶物理学の基礎学理に基づく指標であるといえる。
　図１に戻り、評価部１２は、指標算出部１１で算出した指標に基づいて、細胞集団Ｃ１を評価する評価処理を実行する。評価部１２は、指標に平均距離ｒ０が含まれる場合、平均距離ｒ０が小さいほど細胞集団Ｃ１が高品位（複数の細胞が密である）と評価してもよいし、平均距離ｒ０が閾値以下のときに細胞集団Ｃ１が高品位と評価してもよい。評価部１２は、指標にばね定数ｋが含まれる場合、ばね定数ｋが大きいほど細胞集団Ｃ１が高品位（複数の細胞の間の距離が揃っている）と評価してもよいし、ばね定数ｋが閾値以上のときに細胞集団Ｃ１が高品位と評価してもよい。評価部１２は、指標に六角格子秩序変数Ｑ６が含まれる場合、六角格子秩序変数Ｑ６が１に近いほど細胞集団Ｃ１が高品位（複数の細胞の配置が正六角形に近い）と評価してもよいし、六角格子秩序変数Ｑ６が閾値以上のときに細胞集団Ｃ１が高品位と評価してもよい。
　評価部１２は、指標の値及びその誤差成分から定まるガウス分布の重なり度合いを表すオーバラップ係数（overlapping　coefficient：以下、「ＯＶＬ」という）を算出するＯＶＬ算出処理を実行する。ＯＶＬは、０以上１以下の値を有する。ＯＶＬが０の場合、当該ガウス分布が完全に分離していることを表し、ＯＶＬが１の場合、当該ガウス分布が完全に重なることを表す。以下、ＯＶＬ算出処理及びＯＶＬによる評価について、２つの任意の指標であるパラメータＡ，ＢのＯＶＬを比較評価する場合を例示して具体的に説明する。
　図５（ａ）及び図５（ｂ）は、ＯＶＬの比較評価を説明するためのグラフである。図５（ａ）に示されるグラフでは、パラメータＡを横軸とし、パラメータＢを縦軸としている。このグラフ上において、複数のデータ点がプロットされている。例えば（Ａ１，Ｂ１）について、その値Ａ１，Ｂ１及び誤差成分から定まるガウス分布ＧＡ１，ＧＢ１が得られる。また例えば（Ａ２，Ｂ２）について、その値Ａ２，Ｂ２及び誤差成分から定まるガウス分布ＧＡ２，ＧＢ２が得られる。図中において、データ点を中心に広がる線分は、誤差成分を示すエラーバーである（他の図において同様）。なお、平均距離ｒ０及びばね定数ｋの誤差成分は、フィッティングの際に生じる誤差（フィッティングエラー）を含む。六角格子秩序変数Ｑ６の誤差成分は、標準偏差及び標準誤差の少なくとも何れかを含む。
　ガウス分布ＧＡ１，ＧＡ２の重なりから、パラメータＡのＯＶＬであるＡＯＶＬがパラメータ差Ａｄｉｆｆ（＝｜Ａ２－Ａ１｜）と関連付けて算出される。ガウス分布ＧＢ１，ＧＢ２の重なりから、パラメータＢのＯＶＬであるＢＯＶＬがパラメータ差Ｂｄｉｆｆ（＝｜Ｂ２－Ｂ１｜）と関連付けて算出される。このようなＡＯＶＬ及びＢＯＶＬの算出を、グラフ上の複数のデータ点の全てに関して実施する。
　パラメータＡとパラメータＢとを同じ尺度で比較可能にするために、これらの間の線形関係を仮定し、その勾配から、パラメータＡが１変化したときにパラメータＢがいくつ変化するかを求める。パラメータＡが１変化したときに１変化するようにパラメータＢを尺度補正してなるパラメータ＃Ｂ（＃Ｂ＝Ｂ／ｓｌｏｐｅ）を定義する。そして、図５（ｂ）に示されるように、パラメータ差Ａｄｉｆｆ，＃Ｂｄｉｆｆを横軸とし、ＡＯＶＬ，ＢＯＶＬを縦軸としたグラフを作成したとき、例えばＯＶＬが小さい一方（図中では、差分が大きくなるにつれてＯＶＬが急峻に低下するパラメータＢ）が、誤差が重ならない繊細な指標であると評価できる。
　なお、３つ以上のパラメータのＯＶＬを比較評価する場合には、基準パラメータを定め、この基準パラメータに基づく尺度補正を当該３つのパラメータに行った上で、評価してもよい。例えば、平均距離ｒ０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ６のＯＶＬを比較評価する場合、まず、これらそれぞれと細胞集団Ｃ１の細胞の密度（後述）との比較評価を行う。そして、その各比較評価結果に基づいて、平均距離ｒ０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ６のＯＶＬを比較評価してもよい。
　あるいは、３つ以上のパラメータのＯＶＬを比較評価する場合には、これらのパラメータのＯＶＬが小さい順位を算出することで評価してもよい。例えば平均距離ｒ０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ６のＯＶＬを比較評価する場合、まず、平均距離ｒ０及びばね定数ｋのＯＶＬを比較評価する。平均距離ｒ０及び六角格子秩序変数Ｑ６のＯＶＬを比較評価する。六角格子秩序変数Ｑ６及びばね定数ｋのＯＶＬを比較評価する。これにより、平均距離ｒ０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ６について、ＯＶＬが小さい順位を算出して比較評価してもよい。
　図６は、細胞評価プログラムＰ１を示す図である。図６に示されるように、細胞評価プログラムＰ１は、細胞集団Ｃ１の品質を評価するプログラムであって、コンピュータ１０の記憶部１３内に記憶されている。細胞評価プログラムＰ１は、指標算出モジュールＰ１１及び評価モジュールＰ１２を含む。指標算出モジュールＰ１１は、上述した指標算出処理をコンピュータ１０に実行させる。評価モジュールＰ１２は、上述した評価処理及びＯＶＬ算出処理をコンピュータ１０に実行させる。
　細胞評価プログラムＰ１は、例えば、ＣＤ－ＲＯＭやＤＶＤ－ＲＯＭ、半導体メモリなどの有形の記録媒体に固定的に記録された上で提供されてもよい。あるいは、細胞評価プログラムＰ１は、搬送波に重畳されたデータ信号として通信ネットワークを介して提供されてもよい。
　図１に示されるように、表示部２０は、位相差顕微鏡２の撮像画像、指標算出部１１による指標の算出結果、及び、評価部１２による細胞集団Ｃ１の評価結果の少なくとも何れかを表示させる。表示部２０としては、例えばディスプレイ等を用いることができる。操作部３０は、細胞評価装置１に対するオペレータの各種操作を行う。操作部３０としては、例えばマウス又はキーボード等を用いることができる。
　次に、細胞評価装置１を用いて細胞集団Ｃ１の品質を評価する細胞評価方法（細胞評価装置１の作動方法）について説明する。
　まず予め、位相差顕微鏡２により、培養皿５上に載置された細胞集団Ｃ１を撮像する。位相差顕微鏡２で撮像した撮像画像に画像処理装置３により画像処理を施し、撮像画像に含まれる各細胞のエッジ情報を取得する。
　続いて、細胞評価装置１において、画像処理装置３で取得した撮像画像のエッジ情報に基づいて、細胞集団Ｃ１の品質を評価する。すなわち、指標算出部１１により、上述した指標算出処理を実行し、平均距離ｒ０とばね定数ｋと六角格子秩序変数Ｑ６とを含む指標を算出する（指標算出ステップ）。算出した指標に基づいて、評価部１２により、上述した評価処理を実行し、細胞集団Ｃ１を評価する（評価ステップ）。また、算出した指標について、評価部１２により、上述したＯＶＬ算出処理を実行し、ＯＶＬを算出する（オーバラップ係数算出ステップ）。そして、撮像画像、算出した指標、算出したＯＶＬ及び細胞集団Ｃ１の評価結果の少なくとも何れかを、表示部２０に表示させる。
　図７（ａ）は、密度ｄと良細胞率との関係を示すグラフである。図７（ｂ）は、ばね定数ｋと良細胞率との関係を示すグラフである。密度ｄは、細胞集団Ｃ１における複数の細胞の粗密の度合いであって、１つの細胞の面積の平均値をＳＡとした場合に下式（６）で表される指標である。良細胞率は、細胞集団Ｃ１中における品質が良好である割合である。密度ｄの誤差成分は、標準偏差、標準誤差及び細胞の面積ＳＡの計測誤差の少なくとも何れかを含む。
　　　　　　　　　　　　　　ｄ＝１／ＳＡ　…（６）
　図７（ａ）及び図７（ｂ）に示されるように、密度ｄ及びばね定数ｋの双方は、良細胞率に対して正に相関する。特にばね定数ｋにあっては、密度ｄに比べて、誤差成分が少ない。このことから、細胞集団Ｃ１の評価に際して、ばね定数ｋは、感度が良く、指標としての信頼性が高いことが分かる。
　図８（ａ）は、密度ｄとばね定数ｋとの関係を示すグラフである。図８（ｂ）は、密度ｄのＯＶＬとばね定数ｋのＯＶＬとを比較評価するグラフである。図８（ｂ）の横軸は、密度差ｄｄｉｆｆ及びばね定数差ｋｄｉｆｆである。密度差ｄｄｉｆｆ及びばね定数差ｋｄｉｆｆの何れかには、上記の尺度補正が施されている。図８（ａ）に示されるように、ばね定数ｋは、密度ｄとの対比において誤差成分が少ないことが分かる。図８（ｂ）に示されるように、ばね定数ｋは、密度ｄとの対比においてＯＶＬが非常に小さく、繊細な指標であることが分かる。これにより、細胞集団Ｃ１の評価に際して、ばね定数ｋは、感度が良く、指標としての信頼性が高いことが分かる。
　図９（ａ）は、密度ｄと平均距離ｒ０との関係を示すグラフである。図９（ｂ）は、密度ｄのＯＶＬと平均距離ｒ０のＯＶＬとを比較評価するグラフである。図９（ｂ）の横軸は、密度差ｄｄｉｆｆ及び平均距離差ｒ０_ｄｉｆｆである。密度差ｄｄｉｆｆ及び平均距離差ｒ０_ｄｉｆｆの何れかには、上記の尺度補正が施されている。図９（ｂ）に示されるように、平均距離ｒ０は、細胞集団Ｃ１の評価に際して、密度ｄとの対比においてＯＶＬが小さい場合が多く、繊細な指標であることが分かる。
　以上、本実施形態に係る細胞評価方法、細胞評価装置１及び細胞評価プログラムＰ１では、平均距離ｒ０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ６を含む指標を算出し、その指標に基づいて細胞集団Ｃ１を評価する。細胞集団Ｃ１において最終的に望まれる品質は、小さい細胞が秩序良く配列されている（揃っている）ことである。よって、本実施形態では、集団秩序に基づく指標を評価に適用し、細胞集団Ｃ１において小さい細胞が秩序良く配列されているかどうかに関して数値化して把握できる。指標に品質との相関を持たせることができ、指標と品質との間に定量的な意味付けを与えることができる。
　したがって、本実施形態によれば、細胞集団Ｃ１の品質を定量的に評価することが可能となる。本実施形態によれば、撮像画像だけで細胞集団Ｃ１の品質を非破壊的に評価でき、細胞集団Ｃ１が高品位であるか低品位であるかを明確に識別でき、定量数値化も可能である。本実施形態によれば、統計物理学的手法を用いた２次元細胞集団の定量標準技術を提供できる。本実施形態は、眼科一般の診断における定量標準としての運用に期待される。本実施形態に係る細胞評価プログラムＰ１は、移植細胞培養プラットフォームへの工程管理プログラムとして適用できる。
　なお、一度減少した角膜内皮細胞は自然には回復しないために効果的な治療が必要であるところ、角膜内皮の機能不全に対する治療法として、角膜内皮細胞を懸濁液の状態で移植する「角膜内皮細胞移入療法」が近年提唱されている。本実施形態の細胞評価装置１によれば、当該治療法に用いられる培養細胞の品質管理工程において、細胞マーカーでの染色を行わずに顕微鏡観察だけで、移植前の品質管理ないし細胞選別が可能となる。
　本実施形態では、指標のＯＶＬを算出している。これにより、ＯＶＬを用いて指標の感度を把握することができる。指標に加えてそのＯＶＬに基づいて細胞集団Ｃ１を評価することで、細胞集団Ｃ１の定量的な品質評価をより精度よく行うことができる。
　本実施形態においては、平均距離ｒ０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ６を指標として算出したが、これら全てを指標としなくてもよく、平均距離ｒ０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ６の少なくとも何れかを指標としてもよい。また、指標は、平均距離ｒ０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ６に限定されず、その他のパラメータを含んでいてもよい。例えば指標は、密度ｄ、六角形率、アスペクト比、隣接細胞数及び膜厚（反射率）の少なくとも何れかを更に含んでいてもよい。六角形率、アスペクト比、隣接細胞数及び膜厚（反射率）は、公知手法により算出できる。さらにまた、指標として含む少なくとも何れかのパラメータを、適宜選択してもよい。
　本実施形態は、例えば眼科治療薬の開発において、薬剤候補物質における細胞集団Ｃ１の評価に用いることができる。このように、薬剤候補物質における細胞集団Ｃ１の評価に本実施形態を適用することで、薬剤候補物質の有効性及び安全性の検証時間を短縮することができる。
［第２実施形態］
　次に、第２実施形態を説明する。本実施形態の説明では、第１実施形態と異なる点を説明し、重複する説明は省略する。
　図１０は、第２実施形態に係る細胞評価装置５０を示す構成図である。図１０に示すように、本実施形態の細胞評価装置５０は、例えば眼科用の眼検査装置として用いられる装置であり、スペキュラー顕微鏡６０、コンピュータ７０、表示部２０及び操作部３０を少なくとも備えている。
　スペキュラー顕微鏡６０は、患者８０の眼の角膜内皮細胞を複数含む内皮組織である細胞集団を撮像し、スペキュラー画像を撮像画像として取得する。スペキュラー顕微鏡６０は、スペキュラー画像をコンピュータ７０へ出力する。
　コンピュータ７０は、物理的構成としては、上記コンピュータ１０（図１参照）と同様に構成されている。コンピュータ７０は、機能的構成として、画像処理部７１、指標算出部７２及び評価部７３を含む。
　画像処理部７１は、公知の画像処理手法により、スペキュラー顕微鏡６０で撮像されたスペキュラー画像において細胞集団に含まれる複数の角膜内皮細胞の輪郭に関するエッジ情報を抽出する。画像処理部７１は、抽出したエッジ情報を指標算出部７２に出力する。指標算出部７２は、画像処理部７１から入力されたスペキュラー画像のエッジ情報に基づき、上述した指標算出処理を実行する。これにより、指標算出部７２は、「平均距離ｒ０」、「ばね定数ｋ」及び「六角格子秩序変数Ｑ６」を少なくとも含む指標を算出する。評価部７３は、指標算出部７２で算出した指標に基づき、上述した評価処理を実行し、細胞集団を評価する。また評価部７３は、ＯＶＬ算出処理を実行し、指標のＯＶＬを算出する。
　図１１は、複数の角膜内皮細胞を含む細胞集団のスペキュラー画像を示す写真図である。図１１（ａ）は低品位の細胞集団を示し、図１１（ｂ）は高品位の細胞集団を示す。図１１（ａ）及び図１１（ｂ）に示されるように、複数の角膜内皮細胞を含む細胞集団において最終的に望まれる品質は、第１実施形態と同様に、小さい細胞が秩序良く配列されている（揃っている）ことであることが見出される。
　次に、細胞評価装置５０を用いて細胞集団の品質を評価する細胞評価方法（細胞評価装置５０の作動方法）について説明する。
　まず、スペキュラー顕微鏡６０により、患者８０の角膜内皮細胞を含む細胞集団を撮像する。スペキュラー顕微鏡６０で撮像したスペキュラー画像に画像処理部７１により画像処理を施し、スペキュラー画像に含まれる各角膜内皮細胞のエッジ情報を取得する。取得したスペキュラー画像のエッジ情報に基づいて、指標算出部７２により上述した指標算出処理を実行し、指標を算出する（指標算出ステップ）。算出した指標に基づいて、評価部７３により上述した評価処理を実行し、細胞集団を評価する（評価ステップ）。また、算出した指標について、評価部１２により上述したＯＶＬ算出処理を実行し、ＯＶＬを算出する（オーバラップ係数算出ステップ）。そして、スペキュラー画像、算出した指標、算出したＯＶＬ及び細胞集団の評価結果の少なくとも何れかを、表示部２０に表示させる。
　図１２は、表示部２０の表示の一例を示す図である。図１２に示されるように、例えば表示部２０上には、スペキュラー顕微鏡６０で撮像したスペキュラー画像６１、指標の名称と値とＯＶＬが互いに関連付けられたチャート６２、及び、各種のアイコンボタンが表示されている。ここでの指標は、ばね定数ｋ、平均距離ｒ０、六角格子秩序変数Ｑ６、密度ｄ、六角形率、アスペクト比、隣接細胞数及び膜厚を含んでいる。このような表示によれば、細胞集団を容易に評価ないし診断することができる。
　図１３（ａ）は、密度ｄと良細胞率との関係を示すグラフである。図１３（ｂ）は、ばね定数ｋと良細胞率との関係を示すグラフである。本実施形態において、密度ｄは、角膜内皮細胞を含む細胞集団における複数の細胞の粗密の度合いであり、良細胞率は、角膜内皮細胞を含む細胞集団中における品質が良好である割合である。図１３（ａ）及び図１３（ｂ）に示されるように、密度ｄ及びばね定数ｋの双方は、良細胞率に対して正に相関する。特にばね定数ｋにあっては、密度ｄに比べて、誤差成分が少ない。このことから、角膜内皮細胞を含む細胞集団の評価に際して、ばね定数ｋは、感度が良く、指標としての信頼性が高いことが分かる。
　図１４（ａ）は、密度ｄとばね定数ｋとの関係を示すグラフである。図１４（ｂ）は、密度ｄのＯＶＬとばね定数ｋのＯＶＬとを比較評価するグラフである。図１４（ｂ）の横軸は、密度差ｄｄｉｆｆ及びばね定数差ｋｄｉｆｆである。密度差ｄｄｉｆｆ及びばね定数差ｋｄｉｆｆの何れかには、上記の尺度補正が施されている。図１４（ａ）に示されるように、ばね定数ｋは、密度ｄとの対比において誤差成分が少ないことが分かる。図１４（ｂ）に示されるように、ばね定数ｋは、密度ｄとの対比においてＯＶＬが非常に小さく、繊細な指標であることが分かる。これにより、角膜内皮細胞を含む細胞集団の評価に際して、ばね定数ｋは、感度が良く、指標としての信頼性が高いことが分かる。
　図１５（ａ）は、密度ｄと平均距離ｒ０との関係を示すグラフである。図１５（ｂ）は、密度ｄのＯＶＬと平均距離ｒ０のＯＶＬとを比較評価するグラフである。図１５（ｂ）の横軸は、密度差ｄｄｉｆｆ及び平均距離差ｒ０_ｄｉｆｆである。密度差ｄｄｉｆｆ及び平均距離差ｒ０_ｄｉｆｆの何れかには、上記の尺度補正が施されている。図１５（ｂ）に示されるように、平均距離ｒ０は、角膜内皮細胞を含む細胞集団の評価に際して、密度ｄとの対比においてＯＶＬが小さい場合が多く、繊細な指標であることが分かる。
　なお、評価部７３は、指標算出部７２で算出した指標に基づいて、撮像画像を撮像した時点よりも将来においての細胞集団の品質を予測してもよい。すなわち、上述した評価ステップでは、上述した指標算出ステップで算出した指標に基づいて、スペキュラー画像を撮像した撮像時点よりも将来においての細胞集団の品質を予測してもよい。これにより、細胞集団の予後予測に対応できる。本実施形態では、例えば以下に説明するように、特に眼の細胞を注入治療した後での予後予測にも対応できる。
　図１６は、角膜移植後における６人の患者の角膜内皮細胞の状態を示す各図である。図１６中においては、移植時を基準に（０か月として）示している。図１６（ａ）は、各患者の角膜内皮細胞の密度ｄと時間との関係を示すグラフである。図１６（ｂ）は、各患者の角膜内皮細胞についての３か月時点の密度ｄと３か月時点のばね定数ｋとの関係を示すグラフである。図１６（ｃ）は、各患者の角膜内皮細胞についての２４か月時点の密度ｄと３か月時点のばね定数ｋとの関係を示すグラフである。図１６（ｄ）は、各患者の角膜内皮細胞についての３か月時点の密度ｄのＯＶＬと３か月時点のばね定数ｋのＯＶＬとを比較評価するグラフである。図１６（ｅ）は、各患者の角膜内皮細胞についての２４か月時点の密度ｄのＯＶＬと３か月時点のばね定数ｋのＯＶＬとを比較評価するグラフである。図１６（ｄ）及び図１６（ｅ）の横軸は、密度差ｄｄｉｆｆ及びばね定数差ｋｄｉｆｆである。密度差ｄｄｉｆｆ及びばね定数差ｋｄｉｆｆの何れかには、上記の尺度補正が施されている。
　図１６（ａ）に示されるように、３か月時点では、全患者の密度ｄに差はみられないものの、２４か月時点では、数名の患者の密度ｄが著しく低下している。図１６（ｄ）に示されるように、３か月時点においては、密度ｄは、ＯＶＬが高く、細胞集団の評価の感度が低いことがわかる。図１６（ｅ）に示されるように、密度ｄは、その低下が実際に顕著化した２４か月時点になって、ＯＶＬが低くなり、細胞集団の評価の感度が高まっている。これらにより、３か月時点においては、密度ｄを指標として細胞集団を評価した場合、長期予後の細胞品質及び組織品質の低下までは判断できないことがわかる。
　一方、図１６（ｂ）及び図１６（ｃ）に示されるように、３か月時点のばね定数ｋは、３か月時点及び２４か月時点の密度ｄに対して、誤差成分が少ない。図１６（ｄ）に示されるように、３か月時点において、ばね定数ｋは、ＯＶＬが十分に低く、細胞集団の評価の感度が高いことがわかる。つまり、３か月時点において、ばね定数ｋを指標として細胞集団を評価することで、密度ｄからでは判断し得なかった長期予後の細胞品質及び組織品質の低下までを予測することができる。よって、ばね定数ｋを指標として細胞集団を評価する場合、例えば３か月時点の経過観察にて、長期予後に低品位化する可能性が高い細胞集団を分離することが可能となる。なお、このような長期予後の細胞品質及び組織品質の予測に関して、対象となる細胞によっては、平均距離ｒ０及び六角格子秩序変数Ｑ６を指標としても同様な結果が得られることが想定できる。
　以上、本実施形態においても、第１実施形態と同様の効果、すなわち、細胞集団の品質を定量的に評価することが可能となる等の効果を奏する。また、本実施形態では、薬剤・眼科手術・コンタクトレンズ等による角膜内皮障害の発症・進展予測が可能になる。例えば眼科手術前のスクリーニング検査やコンタクトレンズ外来等の眼科一般における角膜内皮診断への応用が可能である。
　図１７（ａ）は、第１実施形態に係るin vitro（培養細胞）における密度ｄと良細胞率との関係を示すグラフである。図１７（ｂ）は、第１実施形態に係るin vitroにおけるばね定数ｋと良細胞率との関係を示すグラフである。密度ｄは、角膜内皮細胞を含む細胞集団Ｃ１における複数の細胞の粗密の度合いである。良細胞率は、角膜内皮細胞を含む細胞集団Ｃ１中における品質が良好である割合である。図中においてｒ２は、決定係数である。
　図１７（ａ）及び図１７（ｂ）に示されるように、密度ｄ及びばね定数ｋの双方は、良細胞率に対して正に強く相関する。このことから、細胞集団Ｃ１の評価に際して、ばね定数kは、指標としての信頼性が（密度と同程度に）高いことがわかる。
　図１８は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度ｄとばね定数ｋとの関係を示すグラフである。図１８に示されるように、密度ｄとばね定数ｋとは正に強く相関することから、細胞集団Ｃ１の評価に際して、ばね定数kは、密度ｄと同様に用いることができることがわかる。
　図１９は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度ｄと平均距離ｒ0との関係を示すグラフである。図１９に示されるように、密度ｄと平均距離ｒ０とは正に強く相関することから、細胞集団Ｃ１の評価に際して、平均距離ｒ０は、密度ｄと同様に用いることができることがわかる。
　図２０（ａ）は、第２実施形態に係るin vivo（再生角膜）における密度ｄと良細胞率との関係を示すグラフである。図２０（ｂ）は、第２実施形態におけるばね定数ｋと良細胞率との関係を示すグラフである。図２０（ａ）及び図２０（ｂ）に示されるように、密度ｄ及びばね定数ｋの双方は、良細胞率に対して正に相関する。このことから、細胞集団Ｃ１の評価に際して、ばね定数ｋは、感度がよく、指標としての信頼性が高いことがわかる。
　図２１は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度ｄとばね定数ｋとの関係を示すグラフである。密度ｄとばね定数ｋとは正に強く相関することから、角膜内皮細胞を含む細胞集団Ｃ１の評価に際して、ばね定数kは、密度ｄと同様に用いることができることがわかる。
　図２２は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度ｄと平均距離ｒ0との関係を示すグラフである。図２２に示されるように、密度ｄと平均距離ｒ0とは正に強く相関することから、角膜内皮細胞を含む細胞集団Ｃ１の評価に際して、平均距離ｒ0は、密度ｄと同様に用いることができることがわかる。
　図２３は、第１実施形態に係るin vitroの結果と第２実施形態に係るin vivoの結果との関係を示す各図である。図２３（ａ）は、第１実施形態に係るin vitroの密度ｄと第２実施形態に係るin vivoの密度ｄとの関係を示すグラフである。図２３（ｂ）は、第１実施形態に係るin vitroのばね定数ｋと第２実施形態に係るin vivoの密度ｄとの関係を示すグラフである。図２３（ｃ）は、第１実施形態に係るin vitroの密度ｄを変数とし、第２実施形態に係るin vivoの密度ｄが２０００を下回る場合を真として行ったＲＯＣ解析の結果を示すグラフである。図２３（ｄ）は、第１実施形態に係るin vitroのばね定数ｋを変数とし、第２実施形態に係るin vivoの密度ｄが２０００を下回る場合を真として行ったＲＯＣ解析の結果を示すグラフである。
　図２３（ａ）～図２３（ｄ）に示される決定係数及びＲＯＣ曲線下面積から分かるように、ばね定数ｋは、密度ｄと同等の成績を有することがわかる。このことから、第１実施形態に係るin vitroにおいてばね定数ｋを用いれぱ、密度ｄを用いるのと同等の精度で、第２実施形態に係るin vivoの密度ｄを予測できることがわかる。つまり、ばね定数ｋが有用であることがわかる。
　ＲＯＣ（Receiver Operating Characteristics：受信者操作特性）解析とは、信号処理の概念である。ある変数を用いて正常と異常との二項分類を行うとき、その変数の分類精度の測度となる。例えば、ある検査の結果から得られる数値を用いて、被検査群を陽性と陰性とに二項分類する場合を考える。この検査数値に対してある閾値を導入すると、閾値以上を陽性、閾値未満を陰性と判定するとき、真の陽性者を正しく陽性として補足する割合（感度）、真の陰性者を正しく陰性として補足する割合（特異度）が得られる。閾値を媒介変数として単調に変化させながら、横軸に偽陽性率（＝１－特異度）、縦軸に感度をプロットすると、曲線が得られる（ＲＯＣ曲線）。このとき、曲線下面積は０から１までの値をとり得るが、曲線下面積が１に近いほど、使用した変数が被検査群をより正確に二項分類する性能を有することを示す。
　評価部１２は、平均距離ｒ０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ６の少なくとも何れかを含む指標を変数としてＲＯＣ解析を行うＲＯＣ解析処理を実行する。つまり、評価部１２により、指標を変数としてＲＯＣ解析処理を実行し、ＲＯＣ解析を行う（ＲＯＣ解析ステップ）。これにより、ＲＯＣ解析を利用して指標を評価することができる。
　図２４は、角膜移植後における１２人の患者の角膜内皮細胞の状態を示す各図である。図２４（ａ）は、密度ｄと時間との関係を示すグラフである。図２４（ｂ）は、６か月時点の密度ｄと２４か月時点の密度ｄとの関係を示すグラフである。図２４（ｃ）は、６か月時点のばね定数ｋと２４か月時点の密度ｄとの関係を示すグラフである。図２４（ｄ）は、２４か月時点の密度ｄが１０００以下となる症例を、６か月時点の密度ｄで判定した場合のＲＯＣ曲線のグラフである。図２４（ｅ）は、２４か月時点の密度ｄが１０００以下となる症例を、６か月時点のばね定数ｋで判定した場合のＲＯＣ曲線のグラフである。図２４（ａ）では、散布図及び箱ひげ図で密度ｄの推移が表されている。
　図２４（ａ）に示されるように、３か月時点では、全患者の密度ｄに差はみられないものの、２４か月時点では、数名の患者の密度ｄが著しく低下している。図２４（ｂ）に示されるように、６か月時点での密度ｄと２４か月時点での密度ｄとは、互いに無相関である。図２４（ｃ）に示されるように、６か月時点でのばね定数ｋと２４か月時点での密度ｄとは、弱く相関している。つまり、６か月時点では密度ｄよりもばね定数ｋを用いるほうが、２４か月時点での密度ｄをより正確に予測できることがわかる。
　一方、ＲＯＣ解析の結果、図２４（ｄ）に示されるように、６か月時点の密度ｄを変数に用いた場合、曲線下面積は小さく、細胞集団の評価の感度が低いことがわかる。図２４（ｅ）に示されるように、６か月時点のばね定数ｋは、曲線下面積が大きく、細胞集団の評価の感度が高まっている。つまり、６か月時点において、ばね定数ｋを指標として細胞集団を評価することで、密度ｄからでは判断し得なかった長期予後の細胞品質及び組織品質の低下までを予測することができる。よって、ばね定数kを指標として細胞集団を評価する場合、例えば６か月時点の経過観察にて、長期予後に低品位化する可能性が高い細胞集団を分離することが可能となる。なお、このような長期予後の細胞品質及び組織品質の予測に関して、対象となる細胞によっては、平均距離ｒ０及び六角格子秩序変数Ｑ６を指標としても同様な結果が得られることが想定できる。
　図２５は、筋繊維の断面画像に自動抽出された細胞位置及び輪郭を重ねて表示した図である。図２５中の断面画像については、「“Multiple Sclerosis Affects Skeletal Muscle Characteristics”、Inez Wens, et al.、PLoS ONE 9, 9, e180158 (2014)、doi:10.1371/journal.pone.0108158」を参照している。図２５中の断面画像は、平滑筋繊維の断面の染色画像である。事前に自動抽出された細胞の位置の情報から、ばね定数ｋが０．０００５１、平均距離ｒ０が７２、六角格子秩序変数Ｑ６が０．１８であることが求められた。筋繊維の断面のような構造に対しても、構成要素1つ1つの配置から同様に評価することもできる。このように、その種類に制限されず、多様な対象に対して構造を評価することができる。
　以上、実施形態について説明したが、本発明の一側面は、上記実施形態に限られるものではない。
　上記実施形態において、評価の対象となる細胞集団に含まれる細胞は、特に限定されるものではない。細胞としては、角膜内皮細胞、上皮系細胞、肝細胞、又はこれらの何れかの培養細胞であってもよい。なお、上皮系細胞としては、例えば、角膜上皮細胞、小気道上皮細胞、乳腺上皮細胞、もしくは網膜色素上皮細胞等が挙げられる。
　上記第１実施形態では、角膜内皮細胞の移植前の培養細胞における品質評価に適用され、上記第２実施形態では、移植後の角膜内皮細胞の品質評価及び予後予測に適用されているが、本発明の一側面は、術前及び術後の両方に適用可能なものである。すなわち、本発明の一側面によれば、術前及び術後の両方の細胞集団の定量的評価を、品質に基づく同じ指標により行うことができる。術前及び術後の両方に適用できる画像診断プラットフォームを確立できる。細胞移植治療における術前工程管理と予後診断と予後予測とに適用可能である。臨床眼科学における診断の定量標準化ないし細胞移植型再生医療における工程管理等、幅広い分野での応用が見込まれる。
　上記実施形態では、平均距離ｒ０及びばね定数ｋを算出する際、複数の細胞の中から選択される一対の細胞の組合せ全てのうち、対象領域における最外周の細胞が含まれる組合せを除いたものについて、その重心位置間距離を横軸としたヒストグラムを生成しているが、これに限定されない。例えば、対象領域における最外周の細胞が含まれる組合せを除かずに、複数の細胞の中から選択される一対の細胞の組合せ全てについて、その重心位置間距離を横軸としたヒストグラムを生成してもよい。
　上記実施形態では、六角格子秩序変数Ｑ６を算出する際、上式（４），（５）により、対象領域における最外周の細胞を除いた任意の細胞ｉについての六角格子秩序変数Ｑｉ ６を算出しているが、これに限定されない。例えば、対象領域における最外周の細胞を除かずに、任意の細胞ｉについての六角格子秩序変数Ｑｉ ６を算出してもよい。上記実施形態では、指標の感度は、ＯＶＬを利用して把握してもよいし、これに代えてもしくは加えて、ＲＯＣ解析を利用して把握してもよい。上記において、ばね定数は、例えば「弾性ポテンシャル曲率」とも称される。
　上記実施形態では、細胞評価プログラムＰ１は、コンパクトディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、光磁気ディスク、ディジタルビデオディスク、磁気テープ又は半導体メモリ等のコンピュータ読取可能な非一時的な記録媒体に記録することができる。つまり、本発明の一態様は、細胞評価プログラムＰ１を記録するコンピュータ読取可能な記録媒体であってもよい。
　本発明の一側面に係る細胞評価装置は、複数の細胞を含む細胞集団の品質を評価する細胞評価装置であって、前記細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の前記細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の前記細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の前記細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出する指標算出部と、前記指標算出部で算出した前記指標に基づいて、前記細胞集団を評価する評価部と、を含み、前記平均距離及び前記ばね定数は、ボルツマン分布を利用して得られた関数であって複数の前記細胞の動径分布関数に基づくポテンシャル関数に、二次曲線フィッティングを施して求められ、前記六角格子秩序変数は、複数の前記細胞のうちの１つの細胞を中心にして当該細胞に最も近い６つの細胞で形成される六角形の６つの中心角に基づき求められていてもよい。
　本発明の一側面に係る細胞評価プログラムは、複数の細胞を含む細胞集団の品質を評価する細胞評価プログラムであって、前記細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の前記細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の前記細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の前記細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出する指標算出処理と、前記指標算出処理で算出した前記指標に基づいて、前記細胞集団を評価する評価処理と、をコンピュータに実行させ、前記平均距離及び前記ばね定数は、ボルツマン分布を利用して得られた関数であって複数の前記細胞の動径分布関数に基づくポテンシャル関数に、二次曲線フィッティングを施して求められ、前記六角格子秩序変数は、複数の前記細胞のうちの１つの細胞を中心にして当該細胞に最も近い６つの細胞で形成される六角形の６つの中心角に基づき求められていてもよい。
　１，５０…細胞評価装置、１０…コンピュータ、１１，７２…指標算出部、１２，７３…評価部、６１…スペキュラー画像（撮像画像）、Ｃ１…細胞集団、Ｐ１…細胞評価プログラム。

Claims (11)

  1. 　複数の細胞を含む細胞集団の品質を評価する細胞評価方法であって、
    　前記細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の前記細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の前記細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の前記細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出する指標算出ステップと、
    　前記指標算出ステップで算出した前記指標に基づいて、前記細胞集団を評価する評価ステップと、を含む、細胞評価方法。
  2. 　前記平均距離及び前記ばね定数は、ボルツマン分布を利用して得られた関数であって複数の前記細胞の動径分布関数に基づくポテンシャル関数に、二次曲線フィッティングを施して求められ、
    　前記六角格子秩序変数は、複数の前記細胞のうちの１つの細胞を中心にして当該細胞に最も近い６つの細胞で形成される六角形の６つの中心角に基づき求められる、請求項１に記載の細胞評価方法。
  3. 　前記指標の値及びその誤差成分から定まるガウス分布の重なり度合いを表すオーバラップ係数を算出するオーバラップ係数算出ステップを含む、請求項１又は２に記載の細胞評価方法。
  4. 　前記指標を変数としてＲＯＣ解析を行うＲＯＣ解析ステップを含む、請求項１又は２に記載の細胞評価方法。
  5. 　前記細胞は、六角格子の二次元最密充填構造を有する、請求項１～４の何れか一項に記載の細胞評価方法。
  6. 　前記細胞は、角膜内皮細胞、上皮系細胞、肝細胞、又はこれらの何れかの培養細胞である、請求項１～５の何れか一項に記載の細胞評価方法。
  7. 　前記評価ステップでは、前記指標算出ステップで算出した前記指標に基づいて、前記撮像画像を撮像した時点よりも将来においての前記細胞集団の品質を予測する、請求項１～６の何れか一項に記載の細胞評価方法。
  8. 　薬剤候補物質における前記細胞集団の評価に用いられる、請求項１～７の何れか一項に記載の細胞評価方法。
  9. 　前記指標は、前記平均距離、前記ばね定数、及び前記六角格子秩序変数の全てを含む、請求項１～８の何れか一項に記載の細胞評価方法。
  10. 　複数の細胞を含む細胞集団の品質を評価する細胞評価装置であって、
    　前記細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の前記細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の前記細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の前記細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出する指標算出部と、
    　前記指標算出部で算出した前記指標に基づいて、前記細胞集団を評価する評価部と、を含む、細胞評価装置。
  11. 　複数の細胞を含む細胞集団の品質を評価する細胞評価プログラムであって、
    　前記細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の前記細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の前記細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の前記細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出する指標算出処理と、
    　前記指標算出処理で算出した前記指標に基づいて、前記細胞集団を評価する評価処理と、をコンピュータに実行させる、細胞評価プログラム。
PCT/JP2018/005303 2017-02-16 2018-02-15 細胞評価方法、細胞評価装置、及び細胞評価プログラム Ceased WO2018151223A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18754407.7A EP3611696A4 (en) 2017-02-16 2018-02-15 CELL EVALUATION PROCESS, CELL EVALUATION DEVICE AND CELL EVALUATION PROGRAM
US16/485,961 US11436719B2 (en) 2017-02-16 2018-02-15 Cell evaluation method, cell evaluation device, and recording medium storing cell evaluation program
JP2018568608A JP6985684B2 (ja) 2017-02-16 2018-02-15 細胞評価方法、細胞評価装置、及び細胞評価プログラム
US17/877,057 US20230214998A1 (en) 2017-02-16 2022-07-29 Cell Evaluation Method, Cell Evaluation Device, and Cell Evaluation Program

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-027247 2017-02-16
JP2017027247 2017-02-16

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/485,961 A-371-Of-International US11436719B2 (en) 2017-02-16 2018-02-15 Cell evaluation method, cell evaluation device, and recording medium storing cell evaluation program
US17/877,057 Continuation US20230214998A1 (en) 2017-02-16 2022-07-29 Cell Evaluation Method, Cell Evaluation Device, and Cell Evaluation Program

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018151223A1 true WO2018151223A1 (ja) 2018-08-23

Family

ID=63170726

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/005303 Ceased WO2018151223A1 (ja) 2017-02-16 2018-02-15 細胞評価方法、細胞評価装置、及び細胞評価プログラム

Country Status (4)

Country Link
US (2) US11436719B2 (ja)
EP (1) EP3611696A4 (ja)
JP (1) JP6985684B2 (ja)
WO (1) WO2018151223A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2021085648A1 (ja) * 2019-10-31 2021-05-06
JP2022504634A (ja) * 2018-10-23 2022-01-13 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 距離に基づく組織状態の決定

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12062178B2 (en) * 2020-03-05 2024-08-13 Case Western Reserve University Automated segmentation and guided correction of endothelial cell images

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006238802A (ja) * 2005-03-03 2006-09-14 Olympus Corp 細胞観察装置、細胞観察方法、顕微鏡システム、及び細胞観察プログラム
JP2007222073A (ja) * 2006-02-23 2007-09-06 Yamaguchi Univ 画像処理により細胞運動特性を評価する方法、そのための画像処理装置及び画像処理プログラム
WO2012108069A1 (ja) * 2011-02-09 2012-08-16 株式会社オーガンテクノロジーズ ガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法、当該方法によって製造される、ガイドを有する移植用再生器官原基を含む組成物、およびガイドを有する移植用再生器官原基の移植方法
WO2012118049A1 (ja) * 2011-02-28 2012-09-07 ソニー株式会社 表示制御装置および方法、画像処理装置および方法、並びに、プログラム
JP2013502233A (ja) * 2009-08-22 2013-01-24 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 胚、卵母細胞、および幹細胞の撮像および評価
JP2013517459A (ja) * 2010-01-12 2013-05-16 ライジェル ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 作用機序スクリーニング法
JP2013529181A (ja) * 2010-03-25 2013-07-18 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 神経障害を治療するための組成物および方法
JP2014521926A (ja) * 2011-04-22 2014-08-28 ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ 細胞におけるバイオマーカーの発現の積率による解析
JP2014198223A (ja) * 2012-12-28 2014-10-23 キヤノン株式会社 画像処理装置及び画像処理方法
WO2015016371A1 (ja) * 2013-07-30 2015-02-05 京都府公立大学法人 角膜内皮細胞マーカー
JP2015130806A (ja) 2014-01-09 2015-07-23 大日本印刷株式会社 成育情報管理システム及び成育情報管理プログラム
JP2015533210A (ja) * 2012-08-09 2015-11-19 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 顕微分析のための生体標本を調製するための方法および組成物
JP2016059306A (ja) * 2014-09-17 2016-04-25 富士フイルム株式会社 細胞配置決定装置および方法並びにプログラム
JP2016514968A (ja) * 2013-03-15 2016-05-26 オルガノボ，インク． 操作した肝臓組織、そのアレイ、およびそれを製造する方法

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006238802A (ja) * 2005-03-03 2006-09-14 Olympus Corp 細胞観察装置、細胞観察方法、顕微鏡システム、及び細胞観察プログラム
JP2007222073A (ja) * 2006-02-23 2007-09-06 Yamaguchi Univ 画像処理により細胞運動特性を評価する方法、そのための画像処理装置及び画像処理プログラム
JP2013502233A (ja) * 2009-08-22 2013-01-24 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 胚、卵母細胞、および幹細胞の撮像および評価
JP2013517459A (ja) * 2010-01-12 2013-05-16 ライジェル ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 作用機序スクリーニング法
JP2013529181A (ja) * 2010-03-25 2013-07-18 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 神経障害を治療するための組成物および方法
WO2012108069A1 (ja) * 2011-02-09 2012-08-16 株式会社オーガンテクノロジーズ ガイドを有する移植用再生器官原基の製造方法、当該方法によって製造される、ガイドを有する移植用再生器官原基を含む組成物、およびガイドを有する移植用再生器官原基の移植方法
WO2012118049A1 (ja) * 2011-02-28 2012-09-07 ソニー株式会社 表示制御装置および方法、画像処理装置および方法、並びに、プログラム
JP2014521926A (ja) * 2011-04-22 2014-08-28 ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ 細胞におけるバイオマーカーの発現の積率による解析
JP2015533210A (ja) * 2012-08-09 2015-11-19 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 顕微分析のための生体標本を調製するための方法および組成物
JP2014198223A (ja) * 2012-12-28 2014-10-23 キヤノン株式会社 画像処理装置及び画像処理方法
JP2016514968A (ja) * 2013-03-15 2016-05-26 オルガノボ，インク． 操作した肝臓組織、そのアレイ、およびそれを製造する方法
WO2015016371A1 (ja) * 2013-07-30 2015-02-05 京都府公立大学法人 角膜内皮細胞マーカー
JP2015130806A (ja) 2014-01-09 2015-07-23 大日本印刷株式会社 成育情報管理システム及び成育情報管理プログラム
JP2016059306A (ja) * 2014-09-17 2016-04-25 富士フイルム株式会社 細胞配置決定装置および方法並びにプログラム

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INEZ WENS ET AL.: "Multiple Sclerosis Affects Skeletal Muscle Characteristics", PLOS ONE, vol. 9, no. 9, 2014, pages el80158
See also references of EP3611696A4

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022504634A (ja) * 2018-10-23 2022-01-13 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 距離に基づく組織状態の決定
JPWO2021085648A1 (ja) * 2019-10-31 2021-05-06
WO2021085648A1 (ja) * 2019-10-31 2021-05-06 株式会社ニコン 細胞評価装置、プログラム、及び細胞評価方法
JP7416084B2 (ja) 2019-10-31 2024-01-17 株式会社ニコン 細胞評価装置、プログラム、及び細胞評価方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2018151223A1 (ja) 2019-12-26
US20200234433A1 (en) 2020-07-23
JP6985684B2 (ja) 2021-12-22
EP3611696A1 (en) 2020-02-19
EP3611696A4 (en) 2021-02-17
US11436719B2 (en) 2022-09-06
US20230214998A1 (en) 2023-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ting et al. Artificial intelligence for anterior segment diseases: Emerging applications in ophthalmology
Tong et al. Application of machine learning in ophthalmic imaging modalities
Hogarty et al. Current state and future prospects of artificial intelligence in ophthalmology: a review
Mirzania et al. Applications of deep learning in detection of glaucoma: a systematic review
Khanna et al. Deep learning based computer-aided automatic prediction and grading system for diabetic retinopathy
US20230214998A1 (en) Cell Evaluation Method, Cell Evaluation Device, and Cell Evaluation Program
Alcantud et al. Glaucoma diagnosis: A soft set based decision making procedure
Hayashi et al. A deep learning approach in rebubbling after Descemet's membrane endothelial keratoplasty
Ahmad Fadzil et al. Analysis of retinal fundus images for grading of diabetic retinopathy severity
Murugan et al. RETRACTED ARTICLE: An abnormality detection of retinal fundus images by deep convolutional neural networks
Duyan Yüksel et al. Evaluation of temporomandibular joint disc displacement with MRI-based radiomics analysis
Ghosh et al. Evaluating the morphology of erythrocyte population: An approach based on atomic force microscopy and flow cytometry
Koprowski et al. Automatic method of analysis of OCT images in assessing the severity degree of glaucoma and the visual field loss
Wang et al. A fully automatic estimation of tear meniscus height using artificial intelligence
Foo et al. Deep learning for detection of Fuchs endothelial dystrophy from widefield specular microscopy imaging: a pilot study
WO2020152953A1 (ja) 判別装置、細胞塊の判別方法、及びコンピュータプログラム
CN115239945A (zh) 图像标注可靠性预测方法、装置、电子设备及存储介质
Liu et al. Current applications of artificial intelligence for Fuchs endothelial corneal dystrophy: a systematic review
Piersanti et al. Diabetic Retinopathy Detection: A Machine-Learning Approach Based on Continuous Glucose Monitoring Metrics
Goldbaum Unsupervised learning with independent component analysis can identify patterns of glaucomatous visual field defects
Le et al. Classification of age-related macular degeneration using very deep learning neural network based on transfer learning
Sharma et al. Modular neural network for detection of diabetic retinopathy in retinal images
Sun et al. Automatic quantifying and monitoring follow-ups for implantable collamer lens implantation using AS-OCT images
Saleh et al. Artificial intelligence in corneal topography
Antony Ammal et al. Metric measures of optic nerve head in screening glaucoma with machine learning

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18754407

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018568608

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018754407

Country of ref document: EP

Effective date: 20190916