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WO2018142007A1 - Nanoconjugados formados por moléculas dendríticas y péptidos como agentes antitumorales frente al cáncer - Google Patents

Nanoconjugados formados por moléculas dendríticas y péptidos como agentes antitumorales frente al cáncer Download PDF

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WO2018142007A1
WO2018142007A1 PCT/ES2018/070062 ES2018070062W WO2018142007A1 WO 2018142007 A1 WO2018142007 A1 WO 2018142007A1 ES 2018070062 W ES2018070062 W ES 2018070062W WO 2018142007 A1 WO2018142007 A1 WO 2018142007A1
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WO
WIPO (PCT)
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dendritic
nanoconjugates
peptide
nanoconjugate
cells
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/ES2018/070062
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
F.Javier DE LA MATA DE LA MATA
Mª José CARMENA SIERRA
Rafael GÓMEZ RAMÍREZ
Javier SÁNCHEZ-NIEVES FERNÁNDEZ
Laura MUÑOZ MORENO
María SANCHEZ MILLA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universidad de Alcala de Henares UAH
Original Assignee
Universidad de Alcala de Henares UAH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00
    • C08G83/002—Dendritic macromolecules
    • C08G83/003—Dendrimers

Definitions

  • Nanoconjugates that exhibit antitumor activity, mainly against advanced prostate cancer.
  • Nanoconjugates are composed of dendritic systems (dendrimers and dendrons) and neuropeptides.
  • the dendritic molecules are mainly of carbosilane structure and with ammonium functions in the periphery and the peptides are preferably of the glucagon / secretin family (eg, VIP, GHRH, PACAP).
  • PC Prostate cancer
  • this type of cancer has a tendency to metastasize to bone (90%) and lung (46%) (Bubendorf, et ai, Hum Pathol, 2000, 31, 578), which are of the metastases with a lower prognosis of cure.
  • Neuropeptides such as vasoactive intestinal peptide (VIP), growth hormone releasing hormone (GHRH), or pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP), belonging to the glucagon / secretin family (Cardoso, et al., BMC Evol. Biol., 2010, 10, 13), have a wide biological activity in the organism and are very involved in the etiopathogenesis of PC.
  • VIP has a protumoral effect on prostate tumors, increasing proliferation, protecting it from apoptosis (Gutiérrez-Ca ⁇ as, et al., Br. J. Pharmacol., 2003, 139, 1050), increasing angiogenesis (Collado, et al. ., Peptides (Amsterdam, Neth.), 2007, 28, 1896), metastasis (Fernández-Mart ⁇ nez, et al., Prostate, 2009, 69, 774) and helping the progression of cancer towards more aggressive stages (Fernández- Mart ⁇ nez, et al., Cancer Lett., 2010, 299, 11).
  • GPCR type receptors PACi, VPACi, VPAC 2 and FPRL-1 (Garcia-Fernandez, etal., Peptides, 2003, 24, 893, El Zein, et al., 2008, 83, 972 ).
  • GHRH also acts through GPCR receptors, in this case hGHRH and its different variants of "spiicing" (SVs). Its function is to regulate the secretion of growth hormone (GH) (Martinez-Moreno, et al., Gen. Comp. Endocrinol., 2014, 199, 38), which in turn induces the activation of the IGF-1 factor ( Gan, et al., Mol.
  • GH growth hormone
  • the dendritic systems are hyperbranched macromolecules of perfectly defined structure and polyfunctionalized.
  • the dendrimers are of spherical morphology with a multivalent surface and the dendrons are of wedge type topology, also with a multivalent surface and an additional active position at the apex of this wedge called focal point.
  • Dendrons can be considered fragments of dendrimers, and in fact, one of the synthetic procedures of dendrimers uses precisely dendrons as a building block (Sánchez-Nieves, et al., Tetrahedron, 2010, 9203).
  • Dendritic systems have been used as transporters of drugs or antitumor nucleic acids because of their ability to absorb "in vivo" in tumor areas and internalize the treatment in cancer cells due to the EPR (Enhanced Permeability and Retention) effect (Chen, et ai, World J. Surg. Oncol., 2012, 10, 3, Jain, et ai, Eur. J. Pharm. Biopharm., 2014, 87, 500, Huang, et ai, Biomacromolecules, 2014, 15, 915).
  • EPR Enhanced Permeability and Retention
  • cationic systems are generally employed, such as cationic dendritic molecules, which by electrostatic interaction with them, allow these acids to be protected from degradation by nucleases (Svenson, et ai, Advanced Drug Delivery Reviews, 2012 , 64, 102). Similar strategies have been used for studies of peptide therapies, such as against human immunodeficiency virus (HIV) (lonov, et ai, Biochimica et Biophysica Acta, 2015, 1848, 907). Also in these nanoconjugates the electrostatic interaction between the dendritic system and peptide is used to stabilize the peptides and transport them to the cells, where their release facilitates their activity. DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • the present invention provides the preparation of active nanoconjugates against advanced prostate cancer.
  • These systems are made up of dendritic molecules (dendrimers and dendrons) and neuropeptides.
  • the dendritic macromolecules are of carbosilane structure, mainly with cationic functions in the periphery
  • the neuropeptides are of the glucagon / secretin family, mainly VIP, GHRH and PACAP.
  • These nanoconjugates are formed by combining the dendritic molecule and the corresponding peptide in the necessary proportion. The formation of the nanoconjugate allows to create a system that presents anticancer properties in advanced prostate cancer and avoid metastasis.
  • a first aspect of this invention relates to a combination of peptide and dendritic molecule comprising:
  • a neuropeptide preferably from the glucagon / secretin family.
  • This peptide is preferably the vasoactive intestinal peptide (VIP), the growth hormone releasing hormone (GHRH) or the pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP), without ruling out others having a similar activity.
  • VIP vasoactive intestinal peptide
  • GHRH growth hormone releasing hormone
  • PACAP pituitary adenylate cyclase activating peptide
  • a dendritic compound which refers in the present invention to a highly branched macromolecule where the growth units, branches or branches have carbosilane skeleton.
  • This dendritic compound is preferably a dendrimer, spherical in shape that has a growth nucleus of the polyfunctional molecule.
  • the growth units, branches or branches have carbosilane skeleton and the outer layer, surface or periphery of the dendrimer incorporates preferably cationic groups.
  • the skeleton and structure of these carbosilane dendrimers with different nuclei have been previously described (see for example ES-2444490).
  • the dendritic compound can also be dendritic or dendron wedge type, which refers to a highly branched cone-shaped macromolecule and is defined by a focal point, the units, branches or branches of growth, which start from said focal point and the outer layer, surface or periphery of said branches that incorporates functional groups.
  • dendritic or dendron wedge type refers to a highly branched cone-shaped macromolecule and is defined by a focal point, the units, branches or branches of growth, which start from said focal point and the outer layer, surface or periphery of said branches that incorporates functional groups.
  • the skeleton and structure of these dendrons carbosilanes with different focal points have been previously described (see for example ES-2444490).
  • the dendritic compound further comprises, in the outer layer of the dendrimer or dendron or at the focal point of the dendron, at least one functional group of different nature to the rest of the functional groups, and which can be selected from a molecule etiquette, a steering group or an active substance.
  • tag molecule refers in this description to any biorecognizable substance, chromophore, fluorophore or any other group detectable by spectrophotometric, fluorometric, optical microscopy, fluorescence or confocal, antibody and / or NMR techniques, and which easily allows detection of another molecule that alone is difficult to detect and / or quantify.
  • fluoroforo is selected from a list comprising cytochrome, fluorescein, rhodamine and dansyl.
  • directory group is meant a molecule or functional group capable of directing the dendritic compound specifically to a type of cells or to a specific area of a cell, such as folic acid, a signal peptide or an antibody, among other known by any subject matter expert.
  • Said lead group can be previously functionalized to bind the dendritic compound.
  • active ingredient or “drug” is meant in the present invention any purified chemical substance used in the prevention, diagnosis, treatment, mitigation or cure of a disease; to avoid the appearance of an unwanted physiological process; or to modify physiological conditions for specific purposes.
  • Said active principle is able to bind directly to the dendritic compound or with a previous modification of its structure for it.
  • the present invention also relates to the uses in biomedicine of the peptide / dendritic molecule combinations.
  • this invention is for the development of drugs for the treatment of prostate cancer.
  • other types of cancers are not excluded.
  • the present invention focuses on the treatment of advanced prostate cancer.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the nanoconjugates of the invention for the manufacture of a medicament. More preferably, the medicament is used for the prevention and / or treatment of prostate cancer.
  • a pharmaceutical composition comprising at least one dendritic molecule and a neuropeptide, as described above, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • this pharmaceutical composition may comprise another active ingredient, preferably with antitumor properties.
  • the antitumor may be doxorubicin, methotrexate or platinum compounds or others with antitumor properties.
  • compositions that can be used in said compositions are the vehicles known to a person skilled in the art.
  • pharmaceutical preparations include any solid composition (tablets, pills, capsules, granules, etc.) or liquid (gels, solutions, suspensions or emulsions) for oral, nasal, topical or parenteral administration.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of the composition calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of the composition itself, the age, condition and history of the patient, the severity of the disease, and the route and frequency of administration.
  • Figure 2 Example of third generation cationic carbosilane dendron.
  • X OH, NH 2 , SH, or others of interest.
  • Figure 4 Results of adhesion assays on PC3 cell lines of dendrimer 1 alone or bound to peptide VI P or GHRH. Mean values ⁇ E.S.M. , of 6 experiments, ** p ⁇ 0.01 and *** p ⁇ 0.001 versus control values; # p ⁇ 0.05 and ## p ⁇ 0.01 with respect to the dendrimer.
  • Figure 5 Migration of PC3 cells at time 0, 6 and 24 hours with the different treatments.
  • Figure 6. Migration of PC3 cells at 6 h. of treatment. Mean values ⁇ E.S.M. , of 1 experiment, with 6 duplicates. * p ⁇ 0.05 versus control values.
  • FIG. 7 Flow cytometry test in PC3 cells 24 hours after treatment. Mean values ⁇ E.S.M., of 2 experiments, * p ⁇ 0.05 versus control values are shown.
  • Dendrimers and dendrons are dendrimers and dendrons.
  • the formation of the nanoconjugates was carried out by mixing in solution, preferably aqueous in the presence or absence of buffer, the dendritic molecules and the corresponding peptides, in the proportion of interest.
  • the mixtures were made directly on the tumor cells.
  • 445 ⁇ _ of RPMI-1640 medium with 10% fetal bovine serum (FBS) with 1% antibiotic and antifungal (penicillin / streptomycin / amphotericin) were added.
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotic and antifungal penicillin / streptomycin / amphotericin
  • nanoconjugates may also be formed prior to their addition on the well containing the cells.
  • a solution is prepared containing 45 ⁇ _ of RPMI-1640 medium with 10% fetal bovine serum (FBS) with 1% antibiotic and antifungal (penicillin / streptomycin / amphotericin).
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotic and antifungal penicillin / streptomycin / amphotericin
  • 50 ⁇ _ of a 10 "8 M solution of the dendritic system made in the same medium mentioned above are added.
  • 5 ⁇ _ of peptide VIP stock 10 " 4 M or GHRH stock 10 "5 M
  • the cells are maintained in RPMI-1640 medium with 10% serum Fetal bovine (FBS) with 1% antibiotic and antifungal (penicillin / streptomycin / amphotericin).
  • FBS serum Fetal bovine
  • antibiotic and antifungal penicillin / streptomycin / amphotericin
  • the cells are stored at 37 ° C in a humid environment and with 5% C0 2 . Toxicity test by reduction of tetrazolium salts.
  • This technique is a colorimetric assay based on the selective ability of living cells to reduce 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide in formazan insoluble crystals.
  • This method makes it possible to determine the lethal effect of the compounds under study on cell metabolism, since cellular damage results in a decrease in the mitochondrial activity of the cell and the cytotoxicity of these molecules can be measured.
  • This test was carried out according to the manufacturer's instructions (MTT, Sigma-Aldrich, St Louis, USA) - PC-3 cells (15 x 10 4 cells / ml) are plated in 24-well plates. After 24 hours the culture medium is removed and treated.
  • the supernatant containing the treatment is removed at 24 hours and replaced by 500 ⁇ of a culture medium to which 25 ⁇ of MTT in PBS of a concentration of 1 mg / ml is added. After 1.5 hours of incubation under culture conditions, the supernatant is removed with the excess of unreacted MTT. Formazan crystals are subsequently dissolved with 100 ⁇ of isopropanol. The absorbance is read at 570 nm by subtracting the background measured at 620 nm. The relative cell viability (%) with respect to the control (untreated cells) is calculated based on the formula: [A] test / [A] control x 100.
  • the suspension of PC3 cells (25 x 10 4 cells / ml) is separated into several fractions that will depend on the number of treatments to be performed and are kept in suspension for 1 hour, at 37 ° C, with agitation every 10 minutes.
  • the plates with the collagen that acts as matrix are prepared with 100 ⁇ of type I collagen (8 ⁇ g / cm 2 ) diluted in 10 mM acetic acid / well, in P-96 plates, for 1 hour, at 37 ° C, in a dry atmosphere to achieve a complete fixation to the well. After that time, the collagen is aspirated and the plate is washed four times with PBS. 100 ⁇ of the previously treated cell suspension is added to each well and the medium is aspirated at 40 minutes.
  • PC3 cells (20 x 10 4 cells / ml) are seeded in 24-well plates. Cells are treated with the dendrimer and peptides 24 hours. After removing the medium, a wound is made in each well and the progression of its closure at different times is followed by photographs taken with the inverted microscope coupled to the Motic camera. The results are processed by measuring the size of the wound and the% of the progress of the wound is plotted against that of zero time.
  • PC3 cells (7.5 x 10 4 cells / ml) are seeded on P-6 plates and held for 24 h to achieve adhesion, at which time they are deprived with serum-free medium for 24 h. After this time, the different treatments are performed and at 24 hours, the cells are washed with PBS, raised with trypsin and centrifuged. The cell precipitate is fixed and permeabilized with 70% cold ethanol, for 5 days, at 4 o C. Then, the cells are centrifuged to remove the ethanol and washed with PBS.
  • the studied dendrimer / peptide combination (1 / VIP, 1 / GHRH) slows tumor growth and causes cancer cells to die at low concentrations, leading to anticancer behavior (Fig. 3, dendrimer results 1).
  • these peptides studied (VIP / GHRH) have protumoral activity and that although the dendritic systems used (1 and 2) They showed some anti-tumor activity, the combination with VIP and GHRH is much more effective.
  • Subsequent trials showed that these nanoconjugates favored cell adhesion and avoided tumor cell migration processes (Fig. 4, 5, 6, results of dendrimer 1). This effect was contrasted with that which only the dendrimer (1) would have and their inefficiency in preventing adhesion and migration was observed.

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Abstract

La presente invención se refiere a la formación de nanoconjugados que presentan actividad antitumoral, principalmente frente al cáncer de próstata avanzado,pero sin descartar otros. Los nanoconjugados están formados por sistemas dendríticos (dendrímeros o dendrones) y neuropéptidos. Las moléculas dendríticas son principalmente de estructura carbosilano con funciones amonio en la periferia. Los péptidos son preferentemente de la familia glucagón/secretina (ej.: VIP, GHRH, PACAP). La combinación de estos dos sistemas da lugar a un nanoconjugado con propiedades anticancerígenas, diferentes a las de sus precursores por separado. La actividad antitumoral se refleja en la inhibición de crecimiento y muerte de células tumorales de cáncer de próstata avanzado (PC3) y además estos nanoconjugados favorecen la adhesión celular y evitan procesos de migración de las células tumorales, es decir, procesos de metástasis.

Description

NANOCONJUGADOS FORMADOS POR MOLÉCULAS DENDRÍTICAS Y PÉPTIDOS COMO AGENTES ANTITUMORALES FRENTE AL CÁNCER
La presente invención se refiere a la formación de nanoconjugados que presentan actividad antitumoral, principalmente frente al cáncer de próstata avanzado. Los nanoconjugados están compuestos de sistemas dendríticos (dendrímeros y dendrones) y neuropéptidos. Las moléculas dendríticas son principalmente de estructura carbosilano y con funciones amonio en la periferia y los péptidos son preferentemente de la familia glucagón/secretina (ej.: VIP, GHRH, PACAP).
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El cáncer de próstata (CP) es el segundo más frecuente entre los hombres a nivel mundial (Siegel, et al., Cáncer J. Clin., 2014, 64, 9). Se trata de un tumor heterogéneo con una lenta pero constante velocidad de crecimiento, que evoluciona desde un estadio localizado y con sensibilidad a andrógenos hasta un estadio avanzado en el que se pierde dicha sensibilidad. El tratamiento depende del estadio de la enfermedad; si se descubre de forma temprana puede ser tratado satisfactoriamente mediante diferentes procedimientos; desafortunadamente, cuando las células tumorales invaden el área de la glándula, evoluciona hacia un fenotipo de metástasis y los tratamientos actuales no ofrecen posibilidades de curación. Además, este tipo de cáncer tiene tendencia a metastatizar a hueso (90%) y a pulmón (46%) (Bubendorf, et ai, Hum Pathol, 2000, 31 , 578), las cuales son de las metástasis con menor pronóstico de curación. Neuropéptidos como el péptido intestinal vasoactivo (VIP), la hormona liberadora de la hormona de crecimiento (GHRH), o el péptido activador de la adenilatociclasa hipofisaria (PACAP), pertenecientes a la familia del glucagón/secretina (Cardoso, et al., BMC Evol. Biol., 2010, 10, 13), tienen una amplia actividad biológica en el organismo y están muy implicados en la etiopatogénesis del CP. El VIP tiene un efecto protumoral en tumores de próstata, aumentando la proliferación, protegiéndolo de la apoptosis (Gutiérrez- Cañas, et al., Br. J. Pharmacol., 2003, 139, 1050), aumentando la angiogénesis (Collado, et al., Peptides (Amsterdam, Neth.), 2007, 28, 1896), la metástasis (Fernández-Martínez, et al., Prostate, 2009, 69, 774) y ayudando a la progresión del cáncer hacia estadios más agresivos (Fernández-Martínez, et al., Cáncer Lett., 2010, 299, 11). Su mecanismo de acción es a través de receptores tipo GPCRs: PACi , VPACi , VPAC2 y FPRL-1 (Garcia-Fernandez, etal., Peptides, 2003, 24, 893, El Zein, et al., 2008, 83, 972). Por su parte, la GHRH también actúa a través de receptores GPCR, en este caso hGHRH y sus diferentes variantes de "spiicing" (SVs). Su función es regular la secreción de la hormona de crecimiento (GH) (Martinez-Moreno, et al., Gen. Comp. Endocrinol., 2014, 199, 38), que a su vez induce la activación del factor IGF-1 (Gan, et al., Mol. Endocrinol., 2013, 27, 1969), el cual juega un papel crucial en la malignidad, metástasis y tumorogénesis en varios tumores como el CP (Bellyei, et al., Cáncer Lett., 2010, 293, 31 , Shevah, et al., Growth Horm. IGF Res., 2007, 17, 54, Takeuchi, et al., Mol. Cell. Endocrinol., 2014, 384, 1 17).
Tanto VIP como GHRH tienen una acción autocrina y paracrina en las células cancerígenas de próstata (Gutierrez-Cañas, et al., Br. J. Pharmacol., 2003, 139, 1050, Busto, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 2002, 99, 1 1866), por lo que siempre hay una concentración basal de ambos en el interior celular y en su entorno, que "retroalimentan" a las células. Ambos se unen a sus receptores GPCRs de membrana e inician una cascada de eventos mediados por el aumento de AMPc como segundo mensajero principal, aunque también puede ser mediada por otros como Ca2+. Para ambos péptidos se han diseñado antagonistas muy prometedores en el tratamiento de diversos tumores humanos (Plonowski, et al., Int. J. Cáncer, 2002, 98, 624, Fahrenholtz, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A., 2014, 111 , 1084, Muñoz-Moreno, et al., Invest. New Drugs, 2014, 32, 871). Sin embargo, los antagonistas siguen teniendo problemas, ya que aunque su tiempo de vida media es mayor que el de los péptidos originales, sigue siendo corto.
Los sistemas (o moléculas) dendríticos (dendrímeros y dendrones) son macromoléculas hiperramificadas de estructura perfectamente definida y polifuncionalizadas. Los dendrímeros son de morfología esférica con una superficie multivalente y los dendrones son de topología tipo cuña, también con una superficie multivalente y una posición activa adicional en el vértice de esta cuña denominada punto focal. Los dendrones se pueden considerar como fragmentos de dendrímeros, y de hecho, uno de los procedimientos sintéticos de dendrímeros emplea precisamente dendrones como bloque de construcción (Sánchez-Nieves, et al., Tetrahedron, 2010, 9203). Además, en el caso de dendrímeros y dendrones con el mismo tipo de esqueleto, se emplean el mismo tipo de reacciones para la síntesis de ambas topologías (Fuentes-Paniagua, et al., RSC Adv., 2016, 6, 7022). Tanto dendrímeros como dendrones permiten concentrar un gran número de grupos funcionales produciendo un efecto único y diferente al que encontraríamos en estos mismos grupos si estuviesen de forma individual (Astruc, et al., Chem. Rev., 2010, 1 10, 1857, Newkome, et al., Dendrimers and Dendrons, Wiley- VCH Verlag GmbH, 2004, 1).
Sistemas dendríticos se han empleado como transportadores de fármacos o de ácidos nucleicos antitumorales por su capacidad de absorberse "in vivo" en zonas tumorales e internalizar el tratamiento en las células cancerígenas debido al efecto EPR (Enhanced Permeability and Retention) (Chen, et ai, World J. Surg. Oncol., 2012, 10, 3, Jain, et ai, Eur. J. Pharm. Biopharm., 2014, 87, 500, Huang, et ai, Biomacromolecules, 2014, 15, 915). Este efecto se basa en que las zonas tumorales con mayor actividad angiogénica presentan una mayor cantidad de vasos sanguíneos cuyo endotelio tiene una mayor permeabilidad (las células suelen estar separadas entre 200-600 nm) que en un vaso sanguíneo "sano", permitiendo el paso de sustancias a través de él con mayor facilidad. Además, una vez que el dendrímero sale del vaso sanguíneo se acumula en la zona tumoral, ya que el flujo del sistema linfático está reducido en estas zonas y es más difícil devolverlos al sistema circulatorio, al contrario que ocurre con las moléculas pequeñas que sí regresan al torrente sanguíneo (Azzopardi, et ai, J. Antimicrob. Chemother., 2013, 68, 257, Fang, et ai, Adv. Drug Delivery Rev., 201 1 , 63, 136, Konno, et ai, Cáncer, 1984, 54, 2367).
Para actuar como transportadores de ácidos nucleicos, se emplean generalmente sistemas catiónicos, como por ejemplo moléculas dendríticas catiónicas, que mediante interacción electrostática con ellos, permiten proteger a dichos ácidos de la degradación por nucleasas (Svenson, et ai, Advanced Drug Delivery Reviews, 2012, 64, 102). Estrategias similares se han empleado para estudios de terapias con péptidos, como por ejemplo contra el virus de inmunodeficiencia humana (HIV) (lonov, et ai, Biochimica et Biophysica Acta, 2015, 1848, 907). También en estos nanoconjugados la interacción electrostática entre el sistema dendrítico y péptido se emplea para estabilizar los péptidos y transportarlos hacia las células, donde su liberación facilita su actividad. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona la preparación de nanoconjugados activos frente al cáncer de próstata avanzado. Estos sistemas están formados por moléculas dendríticas (dendrímeros y dendrones) y neuropéptidos. Preferentemente, las macromoléculas dendríticas son de estructura carbosilano, principalmente con funciones catiónicas en la periferia, y los neuropéptidos son de la familia glucagón/secretina, principalmente VIP, GHRH y PACAP. Estos nanoconjugados se forman por combinación de la molécula dendrítica y el péptido correspondiente en la proporción necesaria. La formación del nanoconjugado permite crear un sistema que presenta propiedades anticancerígenas en cáncer de próstata avanzado y evitar la metástasis.
Por tanto, un primer aspecto de esta invención se refiere a una combinación de péptido y molécula dendrítica que comprende:
Un neuropéptido, preferentemente de la familia glucagón/secretina. Este péptido es preferentemente el péptido intestinal vasoactivo (VIP), la hormona liberadora de la hormona de crecimiento (GHRH) o el péptido activador de la adenilatociclasa hipofisaria (PACAP), sin descartar otros que tengan una actividad similar.
Un compuesto dendrítico, que se refiere en la presente invención a una macromolécula muy ramificada donde las unidades, ramas o ramificaciones de crecimiento tienen esqueleto carbosilano.
Este compuesto dendrítico es preferentemente un dendrímero, con forma esférica que presenta un núcleo de crecimiento de la molécula polifuncional. Las unidades, ramas o ramificaciones de crecimiento tienen esqueleto carbosilano y la capa externa, superficie o periferia del dendrímero incorpora grupos preferentemente catiónicos. El esqueleto y la estructura de estos dendrímeros carbosilanos con diferentes núcleos han sido descritos previamente (ver por ejemplo ES-2444490). El compuesto dendrítico también puede ser de tipo cuña dendrítica o dendrón, que se refiere a una macromolécula muy ramificada con forma de cono y que está definida por un punto focal, las unidades, ramas o ramificaciones de crecimiento, que parten de dicho punto focal y la capa externa, superficie o periferia de dichas ramificaciones que incorpora grupos funcionales. El esqueleto y la estructura de estos dendrones carbosilanos con diferentes puntos focales han sido descritos previamente (ver por ejemplo ES-2444490).
En otra realización preferida, el compuesto dendrítico comprende además, en la capa externa del dendrímero o dendrón o en el punto focal del dendrón, al menos un grupo funcional de diferente naturaleza al resto de los grupos funcionales, y que se pueden seleccionar entre una molécula etiqueta, un grupo director o un principio activo. Estos dendrímeros y dendrones han sido descritos previamente (ver por ejemplo ES-2444490; P201500669).
El término "molécula etiqueta" se refiere en esta descripción a cualquier sustancia biorreconocible, cromóforo, fluoroforo o cualquier otro grupo detectable por técnicas espectrofotométricas, fluorométricas, de microscopía óptica, fluorescencia o confocal, anticuerpos y/o RMN, y que permite fácilmente la detección de otra molécula que por sí sola es difícil de detectar y/o cuantificar. Por ejemplo, y sin limitarnos, el fluoroforo se selecciona de una lista que comprende citocromo, fluoresceína, rodamina y dansilo.
Por "grupo director" se entiende a una molécula o grupo funcional capaz de dirigir al compuesto dendrítico específicamente hacia un tipo de células o hacia una zona concreta de una célula, como por ejemplo ácido fólico, un péptido señal o un anticuerpo, entre otros conocidos por cualquier experto en la materia. Dicho grupo director se puede funcionalizar previamente para unirse al compuesto dendrítico.
Por "principio activo" o "fármaco" se entiende en la presente invención a toda sustancia química purificada utilizada en la prevención, diagnóstico, tratamiento, mitigación o cura de una enfermedad; para evitar la aparición de un proceso fisiológico no deseado; o para modificar condiciones fisiológicas con fines específicos. Dicho principio activo es capaz de unirse directamente al compuesto dendrítico o con una modificación previa de su estructura para ello.
La presente invención se refiere también a los usos en biomedicina de las combinaciones péptido/molécula dendrítica. Preferentemente, esta invención es para el desarrollo de fármacos para el tratamiento de cáncer de próstata. Sin embargo, no se excluyen otro tipo de cánceres. Más preferentemente, la presente invención se centra en el tratamiento del cáncer de próstata avanzado.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los nanoconjugados de la invención para la elaboración de un medicamento. Más preferiblemente, el medicamento se utiliza para la prevención y/o el tratamiento del cáncer de próstata. Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula dendrítica y un neuropéptido, según se ha descrito anteriormente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, esta composición farmacéutica puede comprender otro principio activo, preferiblemente con propiedades antitumorales. El antitumoral puede ser doxorrubicina, metotrexato o compuestos de platino u otros con propiedades antitumorales.
Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por un experto en la materia. Como ejemplos de preparaciones farmacéuticas se incluye cualquier composición sólida (comprimidos, pildoras, cápsulas, gránulos, etc.) o líquida (geles, soluciones, suspensiones o emulsiones) para administración oral, nasal, tópica o parenteral.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de la composición calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de la composición, la edad, estado y antecedentes del paciente, la severidad de la enfermedad, y de la ruta y frecuencia de administración.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 . Ejemplo de dendrímero carbosilano catiónico de segunda generación con núcleo de tipo polifenólico ([G203(S-NMe2R)i 2]1 2+; (R =(CH2)2OH (1 ), Me (2)).
Figura 2. Ejemplo de dendrón carbosilano catiónico de tercera generación. Por ejemplo, X = OH, NH2, SH, u otros de interés.
Figura 3. Viabilidad celular en presencia de los péptidos VI P y GHRH, dendrímero 1 y nanoconjugado péptido/dendrímero de células PC3. *p < 0.05; **p < 0.01 ; ***p < 0.001 .
Figura 4. Resultados de los ensayos de adhesión en las líneas celulares PC3 del dendrímero 1 solo o unido al péptido VI P o GHRH. Se muestran los valores de la media ± E.S.M. , de 6 experimentos, ** p < 0.01 y *** p < 0.001 frente a los valores del control; # p < 0.05 y ## p < 0.01 respecto al dendrímero.
Figura 5. Migración de células PC3 a tiempo 0, 6 y 24 horas con los distintos tratamientos. Figura 6. Migración de células PC3 a las 6 h. de tratamiento. Se muestran los valores de la media ± E.S.M. , de 1 experimento, con 6 duplicados.* p < 0,05 frente a los valores del control.
Figura 7. Ensayo de citometría de flujo en células PC3 a las 24 horas del tratamiento. Se muestran los valores de la media ± E.S.M., de 2 experimentos, * p < 0.05 frente a los valores del control.
EJEMPLOS
Dendrímeros y dendrones.
Se analizaron 2 tipos de dendrímeros de estructura carbosilano de segunda generación funcionalizados con distintos grupos amonio (G20s(S-NMe2R+)i 2; R =(CH2)2OH (1 ), Me (2), Figura 1 ). Formación de nanoconjugados.
La formación de los nanoconjugados se llevó a cabo mezclando en disolución, preferentemente acuosa en presencia o ausencia de tampón, las moléculas dendríticas y los correspondientes péptidos, en la proporción de interés.
En una realización preferida, las mezclas se realizaron directamente sobre las células tumorales. En un pocilio que contiene 25 x 104 células/ml se adicionaron 445 μΙ_ de medio RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino (FBS) con un 1 % de antibiótico y antimicótico (penicilina/ estreptomicina/ anfotericina). A continuación se añadieron 50 μΙ_ de una disolución 10"8 M del sistema dendrítico realizada en el mismo medio citado anteriormente. Seguidamente se añadieron 5 μΙ_ de péptido (VIP stock 10"4 M o GHRH stock 10"5M).
En otra realización preferida, también se pueden formar los nanoconjugados previamente a su adición sobre el pocilio que contiene las células. Para ello, se prepara una disolución que contiene 45 μΙ_ de medio RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino (FBS) con un 1 % de antibiótico y antimicótico (penicilina/ estreptomicina/ anfotericina). A continuación se añaden 50 μΙ_ de una disolución 10"8 M del sistema dendrítico realizada en el mismo medio citado anteriormente. Seguidamente se añaden 5 μΙ_ de péptido (VIP stock 10"4 M o GHRH stock 10"5M).
ACTIVIDAD ANTITUMORAL DE NANOCONJUGADOS PÉPTIDO/DENDRÍMERO FRENTE A CÁNCER DE PRÓSTATA MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos.
Como controles para los ensayos de toxicidad celular se empleó el mismo medio empleado en la disolución de los nanoconjugados.
Células.
Se utiliza la línea celular de próstata humana, PC3, representativa de un estadio andrógeno-independiente de cáncer de próstata, obtenida de ATCC (American Type Culture Collection). Las células se mantienen en medio RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino (FBS) con un 1 % de antibiótico y antimicótico (penicilina/ estreptomicina/ anfotericina). Las células se conservan a 37° C en ambiente húmedo y con un 5% de C02. Ensayo de toxicidad por reducción de sales de tetrazolio.
Esta técnica es un ensayo colorimétrico basado en la capacidad selectiva de las células vivas para reducir el bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio en cristales insolubles de formazán. Este método permite determinar el efecto letal de los compuestos en estudio sobre el metabolismo celular, ya que los daños celulares se traducen en una disminución de la actividad mitocondrial de la célula pudiéndose medir la citotoxicidad de dichas moléculas. Este ensayo se llevó a cabo de acuerdo a las instrucciones del fabricante (MTT, Sigma-Aldrich, St Louis, EE.UU.)- Se siembran células PC-3 (15 x 104 células/ml) en placas de 24 pocilios. A las 24 horas se elimina el medio de cultivo y se tratan. El sobrenadante que contiene el tratamiento se retira a las 24 horas y se sustituye por 500 μΙ de un medio de cultivo al que se añaden 25 μΙ de MTT en PBS de una concentración 1 mg/ml. Después de 1.5 horas de incubación en condiciones de cultivo, se procede a la retirada del sobrenadante con el exceso de MTT que no reacciona. Los cristales de formazán se disuelven posteriormente con 100 μΙ de isopropanol. La absorbancia se lee a 570 nm restándole el fondo medido a 620 nm. La viabilidad celular relativa (%) respecto del control (células sin tratar) se calcula en base a la fórmula: [A] test / [A] control x 100.
Ensayos de adhesión.
La suspensión de células PC3 (25 x 104 células/ml) se separa en varias fracciones que dependerán del número de tratamientos a realizar y se mantienen en suspensión durante 1 hora, a 37° C, con agitaciones cada 10 minutos. Las placas con el colágeno que actúa como matriz, se preparan con 100 μΙ de colágeno tipo I (8 μg/cm2) diluido en ácido acético 10 mM/pocillo, en placas P-96, durante 1 hora, a 37° C, en atmósfera seca para conseguir una fijación completa al pocilio. Pasado ese tiempo, se aspira el colágeno y se lava cuatro veces la placa con PBS. A cada pocilio se adicionan 100 μΙ de la suspensión celular previamente tratada y se aspira el medio a los 40 minutos. Finalmente, se continúa la valoración de las células adheridas al colágeno mediante un ensayo de MTT, donde se añaden 100 μΙ de medio sin suero y 0.1 mg/ml MTT a cada pocilio. Tras la retirada del sobrenadante con el exceso de MTT que no reacciona, se disuelven los cristales de formazán con 100 μΙ de isopropanol. Se mide la absorbancia a 570 nm restándole el fondo a 620 nm. Los resultados se expresan en % respecto a la absorbancia del control (células sin tratar): [A] test / [A] control x 100. Ensayo de Migración.
Se siembran células PC3 (20 x 104 células/ml) en placas de 24 pocilios. Se tratan las células con el dendrímero y los péptidos 24 horas. Tras eliminar el medio se realiza una herida en cada pocilio y se sigue la progresión de su cierre a distintos tiempos mediante fotografías realizadas con el microscopio invertido acoplado a cámara Motic. Los resultados se procesan midiendo el tamaño de la herida y se representa el % del avance de la herida respecto a la de tiempo cero.
Ensayos de Ciclo Celular.
Se siembran células PC3 (7,5 x 104células/ml) en placas P-6 y se mantienen durante 24 h para conseguir su adherencia, momento en el que se deprivan con medio sin suero durante 24 h. Transcurrido este tiempo, se realizan los distintos tratamientos y a las 24 horas, las células se lavan con PBS, se levantan con tripsina y se centrifugan. El precipitado de células se fija y se permeabiliza con etanol frío al 70%, durante 5 días, a 4o C. Después, las células se centrifugan para retirar el etanol y se lavan con PBS. Finalmente, se resuspenden en una solución de tinción (PBS, 50 mg/ml de ioduro de propidio (IP) y 10 μg/ml de RNasa), antes del análisis por citometría de flujo con FACSCalibur. La cantidad DNA que se distribuye en las diferentes fases del ciclo celular se analiza con el programa Cyflogic v 1.2.1. Análisis estadístico.
Los datos se expresan como la media ± S.E.M. Los análisis estadísticos se realizan usando el test de Annova y considerando significativos los resultados con P<0,05.
RESULTADOS
La combinación estudiada dendrímero/péptido (1/VIP, 1/GHRH)) consigue frenar el crecimiento tumoral y provoca la muerte de las células cancerígenas a concentraciones bajas, dando lugar a un comportamiento anticancerígeno (Fig. 3, resultados de dendrímero 1). Hay que indicar que estos péptidos estudiados (VIP/GHRH) presentan actividad protumoral y que aunque los sistemas dendríticos empleados (1 y 2) mostraban cierta actividad antitumoral, la combinación con VIP y GHRH es muchísimo más efectiva. Posteriores ensayos mostraban que estos nanoconjugados favorecían la adhesión celular y evitaban procesos de migración de las células tumorales (Fig. 4, 5, 6, resultados del dendrímero 1). Este efecto se contrastó con el que tendrían solo el dendrímero (1) y se observó la ineficacia de estos en evitar la adhesión y la migración.
Para poder conocer si los tratamientos estaban produciendo apoptosis o algún cambio en el ciclo celular se realizaron ensayos de citometría de flujo (Fig. 7, resultados para dendrímero 1). Como se puede observar ningún tratamiento induce la apoptosis, aunque si hay una variación en el ciclo celular para los tratamientos de los péptidos unidos al dendrímero. Para estos casos se observa que el ciclo se queda parado en la fase de síntesis (S), aumentando el número de células en esta fase y disminuyendo las células de las fases siguientes (G2 y Mitosis).

Claims

REIVINDICACIONES
1 Una combinación de péptido y molécula dendrítica, dendrímero o dendrón, preferentemente de estructura carbosilano aunque sin descartar otras, denominado nanoconjugado.
2. El péptido según la reivindicación anterior es preferentemente un neuropéptido, preferentemente de la familia glucagón/secretina.
3. Nanoconjugado según la reivindicación anterior donde el neuropéptido es el péptido intestinal vasoactivo, VIP, la hormona liberadora de la hormona de crecimiento, GHRH, o el péptido activador de la adenilatociclasa hipofisaria, PACAP, sin descartar otros que tengan una actividad similar.
4. Nanoconjugado según las reivindicaciones 1 a 3, donde el compuesto dendrítico es una cuña dendrítica o un dendrímero. Preferentemente estos compuestos son catiónicos de estructura carbosilano.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la capa externa de las moléculas dendríticas, dendrímeros o dendrones, o el punto focal de los dendrones comprende además una función adicional. Estas funciones adicionales se pueden seleccionar entre una molécula etiqueta, preferiblemente un fluoróforo, un grupo director o un principio activo.
6. Procedimiento de obtención de los nanoconjugados descritos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una reacción entre el péptido y la molécula dendrítica o su combinación en el medio adecuado.
7. Procedimiento de obtención de los nanoconjugados descritos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha reacción o combinación se lleva a cabo preferentemente en presencia de un disolvente polar como agua, DMSO o un alcohol R1-OH, donde R1es un grupo alquilo (C1-C10), o una mezcla de ellos.
8. Uso de los compuestos descritos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, como principios activos para el desarrollo de un fármaco anticancerígeno.
9. Uso según la reivindicación anterior, donde cáncer es cáncer de próstata, preferentemente cáncer de próstata avanzado.
10. Composición farmacéutica que comprende un nanoconjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
1 1. Composición farmacéutica según la reivindicación anterior que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable y/u otro principio activo, preferiblemente un antibiótico, antiinflamatorio o anticancerígeno.
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