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WO2018038004A1 - ラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法 - Google Patents

ラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法 Download PDF

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WO2018038004A1
WO2018038004A1 PCT/JP2017/029585 JP2017029585W WO2018038004A1 WO 2018038004 A1 WO2018038004 A1 WO 2018038004A1 JP 2017029585 W JP2017029585 W JP 2017029585W WO 2018038004 A1 WO2018038004 A1 WO 2018038004A1
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WO
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culture
fatty acid
plantarum
unsaturated fatty
lactobacillus plantarum
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圭介 古市
孝之 利光
悟 尾崎
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Meiji Co Ltd
Original Assignee
Meiji Co Ltd
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/335—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Lactobacillus (G)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a culture of Lactobacillus plantarum.
  • Interleukin (IL) -10 is an anti-inflammatory cytokine produced by immune cells (such as dendritic cells and macrophages), and plays an important role in suppressing excessive inflammation in vivo.
  • immune cells such as dendritic cells and macrophages
  • diseases caused by inflammation can be improved.
  • enteritis is suppressed by administering a lactic acid bacterium having high IL-10 production-inducing activity (Non-Patent Documents 1 and 2). It has also been reported that IL-10 is excessively expressed by gene recombination to suppress myocardial infarction through suppression of inflammation (Non-patent Document 3).
  • interleukin (IL) -12 is the same as IL-10 in that it is a cytokine produced by immune cells, it has the function of promoting inflammation in vivo, and is different from IL-10. Different. Therefore, the ratio of IL-10 and IL-12 production (the ratio of IL-10 / IL-12 production) is also regarded as an important index of anti-inflammatory activity, as is the IL-10 production-inducing activity. It has been. In other words, a product with high immunoregulatory activity (anti-inflammatory function) if a strain (such as lactic acid bacteria) having high IL-10 production-inducing activity and low IL-12 production-inducing activity can be selected and used. Can be provided. As a result, in addition to diseases such as enteritis and myocardial infarction, it can be expected to improve diseases caused by various inflammations (metabolic syndrome, cancer, autoimmune diseases, neurodegenerative diseases, etc.).
  • Patent Document 1 includes a crushed product of microorganisms belonging to the genus Bifidobacterium, and is used for prevention and / or treatment of autoimmune diseases or gastrointestinal diseases.
  • An interleukin production regulator having an action of maintaining or promoting the production of interleukin-10 and an action of maintaining or suppressing the production of interleukin-12, and a microorganism belonging to the genus Bifidobacterium at 2600 joules per ml
  • a method of manufacturing by a method including the step of ultrasonically crushing with the above energy and the step of preparing a crushed material by removing uncrushed material from the crushed microorganism is described. According to this method, a value of 10 or more can be obtained as the ratio of the production amounts of interleukin-10 and interleukin-12 (interleukin-10 / interleukin-12 production ratio).
  • Patent Document 2 discloses (A) a bacterium or yeast or microorganism treated product that does not have the ability to induce interleukin 12 production, and (B) interleukin (IL) -10.
  • An interleukin 10 production promoter comprising a combination of bacteria having the ability to induce leukin 12 production is described.
  • Patent Document 2 describes Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, etc. as examples of (A).
  • the culture conditions place importance on the growth of lactic acid bacteria (high concentration of bacterial cells). Is set.
  • the composition of a medium capable of increasing the concentration of lactic acid bacteria and the like is selected, and after using such a medium, The cells are cultured until a certain point in the stationary phase after the growth phase.
  • Patent Document 3 fermentation of dough-like dough is carried out over a period of time until yeast and lactic acid bacteria reach the end of the stationary phase through the logarithmic growth phase in the bread seed production method. It is described.
  • Non-Patent Document 4 describes that IL-10 in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) derived from humans in logarithmic growth plantarum WCFS1 as compared to stationary phase plantarum WCFS1. Has been reported to strongly induce the production of.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Non-Patent Document 5 when eight (8) subjects were administered logarithmic growth phase and stationary phase plantarum WCFS1, and gene expression of duodenal mucosa was comprehensively analyzed by microarray, stationary phase plan was obtained.
  • Talam WCFS1 expression of genes related to activation of NF- ⁇ B, an inflammatory mediator, was induced, whereas in Plantarum WCFS1 in logarithmic growth, expression of genes related to anti-inflammatory properties was induced. Has been.
  • Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by g. Biobioc ci. : 16731-16736. Yu Y, Zhang ZH, Wei SG, Chu Y, Weiss RM, Heistad DD, Felder RB. 2007. Central gene transfer of interleukin-10 reduces hypothalamic inflammation and evidence of heart failure in rats after arcyos 304-312. van Hemert S, Meijerink M, Molenaar D, Bron PA, de Vos P, Kleerebezem M, Wells JM and Marco ML. 2010. Identification of Lactobacillus plantarum genes modulating .
  • An object of the present invention is to provide a culture of microorganisms for obtaining a culture having a high ratio of IL-10 and IL-12 production (ratio of IL-10 / IL-12) and excellent anti-inflammatory properties. It is to provide a manufacturing method.
  • the present inventor cultivated Lactobacillus plantarum to a point not exceeding the end point of the logarithmic growth phase using a medium containing an unsaturated fatty acid ester, When a culture of Lactobacillus plantarum was obtained, the ratio of the production amount of IL-10 and IL-12 (IL-10 production amount / It was found that a larger value was obtained for the production amount of IL-12), and the present invention was completed.
  • the present invention provides the following [1] to [12].
  • a culture of Lactobacillus plantarum is obtained by culturing Lactobacillus plantarum using a medium containing an unsaturated fatty acid ester to a point not exceeding the end point of the logarithmic growth phase.
  • a method for producing a culture of Lactobacillus plantarum [2] The end point of the logarithmic growth phase is expressed when the number of bacteria at the time of cultivation of the Lactobacillus plantarum reaches half the maximum number of bacteria reached.
  • a method for producing a culture of Lactobacillus plantarum is expressed when the number of bacteria at the time of cultivation of the Lactobacillus plantarum reaches half the maximum number of bacteria reached.
  • Method. [6] The method for producing a culture of Lactobacillus plantarum according to [4] or [5] above, wherein the unsaturated fatty acid ester is a monooleate.
  • An anti-inflammatory agent comprising, as an active ingredient, a culture of Lactobacillus plantarum produced by the production method according to any one of [1] to [7].
  • a medium containing an unsaturated fatty acid ester each of a plurality of strains of Lactobacillus plantarum was cultured to a point not exceeding the end point of the logarithmic growth phase to obtain a culture of each strain. Thereafter, the interleukin-10 production-inducing activity of the obtained cultures of each strain is evaluated, and a strain having a high degree of anti-inflammatory action is selected from the plurality of strains based on the evaluation results.
  • a method for selecting a strain of Lactobacillus plantarum characterized by the above.
  • the interleukin-12 production-inducing activity was evaluated. Based on these evaluation results, the anti-inflammatory action was selected from the plurality of strains.
  • the method for selecting the strain of Lactobacillus plantarum according to [1].
  • the ratio of IL-10 and IL-12 production (hereinafter also referred to as “IL-10 / IL-12 production ratio” or “IL-10 / IL-12 production ratio”). ) And a culture excellent in anti-inflammatory properties (Lactobacillus plantarum culture) can be obtained.
  • FIG. 3 is a graph showing the amount of IL-10 produced when Lactobacillus plantarum OLL2712 is cultured.
  • 2 is a graph showing the amount of IL-12 produced in the culture shown in FIG. 2 is a graph showing the ratio of IL-10 / IL-12 production in the culture shown in FIG.
  • IL in the case of culturing Lactobacillus plantarum OLL2712 using a medium containing a substance other than unsaturated fatty acid ester (sodium ascorbate, etc .; 13 types) or a medium not containing the substance (for control; 1 type) It is a graph which shows the production amount of -10. 5 is a graph showing the amount of IL-12 produced in the culture shown in FIG. 5 is a graph showing the ratio of IL-10 / IL-12 production in the culture shown in FIG.
  • Lactobacillus -It is a graph which shows a time-dependent change of the production amount of IL-10 during a culture
  • FIG. 8 is a graph showing the change over time in the amount of IL-12 produced during the culture period in the culture shown in FIG.
  • FIG. 8 is a graph showing changes over time in the ratio of IL-10 / IL-12 production during the culture in the culture shown in FIG. 7.
  • Lactobacillus -It is a graph which shows a time-dependent change of the production amount of IL-10 during culture
  • 11 is a graph showing changes over time in the amount of IL-12 produced during the culture period in the culture shown in FIG. 11 is a graph showing a change with time of the ratio of the production amount of IL-10 / IL-12 during the culture period in the culture shown in FIG.
  • the method for producing a culture of Lactobacillus plantarum uses a medium containing an unsaturated fatty acid ester to culture Lactobacillus plantarum to a point not exceeding the end point of the logarithmic growth phase.
  • a culture of Lactobacillus plantarum is obtained.
  • any strain can be used as a Lactobacillus plantarum (hereinafter, abbreviated as plantarum).
  • Lactobacillus plantarum strains include OLL 2712 (Accession Number: FERM BP-11262), OLL 2770, and the like.
  • the fatty acid ester one (unsaturated fatty acid ester) having a chemical structure (unsaturated structure) having one or more double bonds in the molecule is used.
  • the saturated fatty acid ester is used, the ratio of the production amount of IL-10 to IL-12 (IL-10 / IL-12) is smaller than when the unsaturated fatty acid ester is used.
  • the unsaturated fatty acid ester include an ester obtained by reacting a monovalent or polyvalent unsaturated fatty acid with a polyhydric alcohol, and a derivative of the ester.
  • the monovalent unsaturated fatty acid include monovalent unsaturated fatty acids having 16 to 23 carbon atoms.
  • Examples of the monovalent unsaturated fatty acid having 16 to 23 carbon atoms include oleic acid (carbon number: 16), vaccenic acid (carbon number: 16), palmitoleic acid (carbon number: 19), and nervonic acid (carbon number: 23).
  • Examples of the polyunsaturated fatty acid include divalent to tetravalent unsaturated fatty acids having 16 to 23 carbon atoms.
  • Examples of the divalent to tetravalent unsaturated fatty acid having 16 to 23 carbon atoms include linoleic acid (divalent, carbon number: 16), 8,11-icosadienic acid (divalent, carbon number: 19), and linolenic acid.
  • Examples of the polyhydric alcohol include polyglycerin and sorbitan.
  • Examples of the polyglycerin include those obtained by binding 3 to 15 glycerins.
  • Examples of the polyglycerin formed by bonding 3 to 15 glycerin include triglycerin, tetraglycerin, pentaglycerin, hexaglycerin, heptaglycerin, octaglycerin, nonaglycerin, decaglycerin, undecaglycerin, dodecaglycerin and the like. It is done.
  • Examples of the derivative of an ester formed by reacting a monovalent or polyvalent unsaturated fatty acid with a polyhydric alcohol include polysorbate.
  • the polysorbate is obtained by condensing ethylene oxide with a sorbitan fatty acid obtained by reacting a monovalent or polyvalent unsaturated fatty acid with sorbitan.
  • the number of ethylene oxides to be condensed is, for example, 15 to 25.
  • a preferred example of the unsaturated fatty acid ester includes monooleate (for example, one obtained by reacting one molecule of oleic acid with one molecule of polyglycerin, sorbitan, or polysorbate).
  • the concentration of the unsaturated fatty acid ester in the medium is preferably 0.001% by weight or more, more preferably from the viewpoint of increasing the ratio of IL-10 to IL-12 production (IL-10 / IL-12). It is 0.01 weight% or more, More preferably, it is 0.02 weight% or more, More preferably, it is 0.03 weight% or more, More preferably, it is 0.04 weight% or more, Most preferably, it is 0.05 weight% or more.
  • the concentration of the unsaturated fatty acid ester in the medium is preferably 1% by weight or less, more preferably 0.5% by weight or less, and still more preferably from the viewpoint of avoiding an increase in culture cost due to an increase in the amount of unsaturated fatty acid ester.
  • components of the medium other than the unsaturated fatty acid ester general components used for culturing lactic acid bacteria may be used.
  • Lactobacillus plantarum is cultured until the end point of the logarithmic growth phase is not exceeded.
  • the production amount of IL-10 and the ratio of the production amount of IL-10 and IL-12 are decreased.
  • the target culture in the invention cannot be obtained.
  • the end point of the logarithmic growth phase is represented by, for example, the following (a) or (b).
  • the maximum number of reached bacteria refers to the maximum (maximum) number of bacteria estimated to be reached when the culture is continued beyond the end point of the logarithmic growth phase.
  • neutralization culture means culturing while maintaining the pH within a certain range by adding a neutralizing agent (for example, sodium hydroxide) to the culture solution in order to keep the growth of bacteria in an optimum state. To do.
  • a neutralizing agent for example, sodium hydroxide
  • the total amount of neutralizing agent used during neutralization culture is that the neutralizing agent was added so that the pH was within a certain range from the start of culture until the maximum number of bacteria reached. The total amount of neutralizing agent added in the case.
  • the “maximum reached number of bacteria” in the above (a) and the “total consumption” in the above (b) are, for example, the same conditions (for example, Lactobacillus It can be determined in advance by culturing under the plantarum strain type, unsaturated fatty acid ester and other medium component types, culture temperature, etc.).
  • the number of plantarum can be expressed, for example, as a measurement of the turbidity of a suspension containing the plantarum culture.
  • Examples of the turbidity measuring means include a spectrophotometer.
  • the length of the logarithmic growth phase of plantarum is, for example, 9 to 11 hours, although it varies depending on the temperature, the composition of the medium components, and the like.
  • the Lactobacillus plantarum culture produced by the production method of the present invention can be used, for example, as an active ingredient of an anti-inflammatory agent.
  • the ratio of the production amount of IL-10 and IL-12 (the ratio of the production amount of IL-10 / IL-12) is the same as that in the culture produced by the conventional production method (conventional product). It can be distinguished from the conventional product in that it is larger.
  • the ratio of IL-10 / IL-12 production is preferably 20 based on the ratio when a medium not containing an unsaturated fatty acid ester is used. % Or more, more preferably 25% or more, and particularly preferably 30% or more.
  • the method for selecting a strain of Lactobacillus plantarum according to the present invention uses a medium containing an unsaturated fatty acid ester (for example, monooleic acid ester).
  • an unsaturated fatty acid ester for example, monooleic acid ester.
  • Each of a plurality of strains of Bacillus plantarum is cultured until a time point that does not exceed the end point of the logarithmic growth phase to obtain a culture of each strain, and then the interleukin- 10 production-inducing activities are evaluated, and a strain having a high degree of anti-inflammatory action is selected from the plurality of strains based on the evaluation result.
  • the selection method of the present invention evaluates the interleukin-12 production-inducing activity.
  • a strain having a large effect can be selected.
  • the production-inducing activity for each of interleukin-12 and interleukin-10 can be evaluated by, for example, an immunoassay (for example, ELISA; Enzyme-linked immuno-sorbent assay).
  • an activated culture solution of plantarum OLL 2712 is added in an amount of 1% by weight with respect to 100% by weight of the whey decomposition medium, and then static culture (37 ° C., 9 hours) is performed. Then, a culture solution of plantarum OLL2712 was prepared.
  • the composition (weight basis) of the whey decomposition medium is: whey powder 6.25%, whey protein concentrate (WPC80; protein content: 80%), protease 0.12%, yeast extract 0.50%, Fish meat extract 0.50%, manganese sulfate tetrahydrate 0.01%, other auxiliary materials 0.05% (added later; details will be described later) or 0% (for control), distilled water 90.82 % Or 90.87% (for control).
  • the culture solution of Plantarum OLL2712 was centrifuged (8000 ⁇ g, 15 minutes) to collect plantarum OLL2712 cells. Then, the physiological cells of Plantarum OLL2712 are washed twice using physiological saline, and then the bacterial cells of Plantarum OLL2712 are washed once using distilled water. The obtained bacterial cells were suspended in distilled water to prepare a suspension of plantarum OLL2712. Next, the suspension of plantarum OLL2712 was heat-treated (75 ° C., 60 minutes) and then freeze-dried (FD) to prepare freeze-dried cells of plantarum OLL2712. Thereafter, lyophilized cells of plantarum OLL 2712 are suspended in a phosphate buffer solution (PBS) and then diluted to 10 mg / mL using a medium for cell culture. A diluted solution of OLL2712 was prepared.
  • PBS phosphate buffer solution
  • the above-mentioned whey decomposition medium (excluding the above-mentioned auxiliary materials) was mixed with the following auxiliary materials (any one of 18 types) in an amount of 0.05% by weight, A whey decomposition medium was prepared. Thereafter, several types of dilutions of Plantarum OLL2712 were prepared by treatment under the same conditions as above.
  • auxiliary materials for whey decomposition medium [Types of auxiliary materials for whey decomposition medium]
  • Vitamin 9 types (sodium ascorbate, thiamine hydrochloride, riboflavin, nicotinic acid Nicotinamide, calcium pantothenate, pyridoxine hydrochloride, biotin, folic acid)
  • BMDC dendritic cells
  • lyophilized cells of Plantarum OLL 2712 were prepared in the same manner as in Experimental Method 1-1. Thereafter, the lyophilized cells of Plantarum OLL2712 are suspended in a phosphate buffer (PBS), and then diluted to 10 mg / mL using a medium for cell culture. Plantarum OLL2712 A diluted solution was prepared.
  • PBS phosphate buffer
  • the middle phase of the logarithmic growth phase (4 hours after the start of the logarithmic growth phase), the late phase of the logarithmic growth phase (8 hours after the start of the logarithmic growth phase), and the initial phase of the stationary phase (12 hours from the start of the logarithmic growth phase) Later), IL-10 and IL-12 production-inducing activities of immune cells were evaluated at each time point in the middle stage of stationary phase (16 hours after the beginning of the logarithmic growth phase).
  • the end point of the logarithmic growth phase in this culture was a time point 10 hours after the start of the logarithmic growth phase (a time point when the number of bacteria reached half of the maximum reached number).
  • the unsaturated fatty acid ester is added to the whey decomposition medium, and the plantarum OLL2770 is not cultured until the time within the stationary phase (16 hours), but within the logarithmic growth phase (5 hours). It was confirmed that when the culture was terminated, the IL-10 / IL-12 production ratio was improved and an improvement in anti-inflammatory activity could be expected.
  • the unsaturated fatty acid ester is blended in the whey decomposition medium, and the plantarum is not cultured to a point in the stationary phase, It was confirmed that when the culture was terminated at a time point within the logarithmic growth phase, the IL-10 / IL-12 production ratio was improved and anti-inflammatory activity could be expected.

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Abstract

ＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生量の比率（ＩＬ－１０／ＩＬ－１２の比率）が大きい、抗炎症性に優れた培養物を得るための、微生物の培養物の製造方法を提供する。　不飽和脂肪酸エステルを含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムを、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、ラクトバチルス・プランタラムの培養物を得る、ラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。不飽和脂肪酸エステルは、一価もしくは多価の不飽和脂肪酸と多価アルコールとが反応してなるエステル、または、該エステルの誘導体である。不飽和脂肪酸エステルの好ましい一例は、モノオレイン酸エステルである。

Description

ラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法
　本発明は、ラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法に関する。
　インターロイキン（ＩＬ）－１０は、免疫細胞（樹状細胞やマクロファージなど）によって産生される抗炎症性のサイトカインであり、生体内において過剰な炎症を抑制する重要な役割を担っている。つまり、ＩＬ－１０の産生を誘導することで、炎症に起因する疾病などを改善することができる。例えば、ＩＬ－１０の産生誘導活性が高い乳酸菌を投与することで、腸炎を抑制することが報告されている（非特許文献１～２）。また、遺伝子組換により、ＩＬ－１０を過剰に発現させることで、炎症の抑制を介し、心筋梗塞を抑制することが報告されている（非特許文献３）
　一方、インターロイキン（ＩＬ）－１２は、免疫細胞によって産生されるサイトカインである点では、ＩＬ－１０と同じであるものの、生体内において炎症を促進する機能を発揮する点で、ＩＬ－１０と異なる。
　したがって、ＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生量の比率（ＩＬ－１０／ＩＬ－１２の産生量の比率）も、ＩＬ－１０の産生誘導活性と同様に、抗炎症活性の重要な指標と捉えられている。つまり、ＩＬ－１０の産生誘導活性が高くて、かつ、ＩＬ－１２の産生誘導活性が低い菌株（乳酸菌など）を選抜して使用することができれば、免疫調節活性（抗炎症機能）が高い商品を提供することができる。そして、その結果として、腸炎や心筋梗塞などの疾病以外にも、様々な炎症に起因する疾病（メタボリックシンドローム、癌、自己免疫疾患、神経変性疾患など）を改善することを期待できる。
　ＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生量の比率に関する技術として、特許文献１に、ビフィドバクテリウム属に属する微生物の破砕物を含み、自己免疫疾患又は消化管疾患の予防及び／又は治療用である、インターロイキン－１０の産生の維持又は促進作用と、インターロイキン－１２の産生の維持又は抑制作用とを有するインターロイキン産生調節剤を、ビフィドバクテリウム属に属する微生物を試料１ｍｌあたり２６００ジュール以上のエネルギーで超音波破砕する工程、破砕した微生物から未破砕物を除去して破砕物を調製する工程、を含む方法によって、製造する方法が記載されている。
　この方法によれば、インターロイキン－１０とインターロイキン－１２の産生量の比率（インターロイキン－１０／インターロイキン－１２の産生量の比率）として、１０以上の値を得ることができる。
　また、インターロイキン（ＩＬ）－１０の産生を促進するための剤として、特許文献２に、（Ａ）インターロイキン１２産生誘導能を有さない細菌若しくは酵母又は微生物処理物と、（Ｂ）インターロイキン１２産生誘導能を有する細菌を組み合わせてなるインターロイキン１０産生促進剤が記載されている。また、特許文献２に、前記（Ａ）の例として、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アシドフィラス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダムなどが記載されている。
　ところで、通常では、乳酸菌などを商業的な規模で培養して、この培養物を商品の原料として使用する場合に、その培養条件は、乳酸菌などの増殖性（菌体の高濃度化）を重視して設定される。つまり、通常では、乳酸菌などの菌体の濃度を最大化できる培養条件として、乳酸菌などを高濃度化できる培地の組成などを選定し、そのような培地を使用した上で、乳酸菌などを、対数増殖期を過ぎた、定常期のある時点まで培養している。
　乳酸菌などの培養期間については、例えば、特許文献３に、パン種の製造方法において、パン生地状の生地の発酵を、酵母と乳酸菌が対数増殖期を経て定常期の終了に到るまでの期間にわたり行うことが記載されている。
　一方、定常期まで培養を行った場合と、定常期に至らない対数増殖期まで培養を行った場合を比較した論文も、知られている。
　例えば、非特許文献４に、定常期のプランタラム菌（L. plantarum）WCFS1に比べて、対数増殖期のプランタラム菌WCFS1では、ヒト由来の末梢血単核球（PBMC）において、ＩＬ－１０の産生を強く誘導することが報告されている。
　また、非特許文献５に、被験者（８名）に対数増殖期と定常期のプランタラム菌WCFS1を投与して、十二指腸粘膜の遺伝子の発現をマイクロアレイで網羅的に解析したところ、定常期のプランタラム菌WCFS1では、炎症メディエーターのNF-κBの活性化に関わる遺伝子群の発現を誘導したが、対数増殖期の プランタラム菌WCFS1では、抗炎症性に関わる遺伝子群の発現を誘導したことが 報告されている。
特許第４９７９６８９号公報 特開２００８－３１１５３号公報 特開２００７－８９４９７号公報
O'Mahony L, McCarthy J, Kelly P, Hurley G, Luo F, Chen K, O'Sullivan GC, Kiely B, Collins JK, Shanahan F, Quigley EM. 2005. Lactobacillus and bifidobacterium in irritable bowel syndrome: symptom responses and relationship to cytokine profiles. Gastroenterology 128:541-551. Sokol H, Pigneur B, Watterlot L, Lakhdari O, Bermúdez-Humarán LG, Gratadoux JJ, Blugeon S, Bridonneau C, Furet JP, Corthier G, Grangette C, Vasquez N, Pochart P, Trugnan G, Thomas G, Blottière HM, Doré J, Marteau P, Seksik P, Langella P. 2008. Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:16731-16736. Yu Y, Zhang ZH, Wei SG, Chu Y, Weiss RM, Heistad DD, Felder RB. 2007. Central gene transfer of interleukin-10 reduces hypothalamic inflammation and evidence of heart failure in rats after myocardial infarction. Circ. Res. 101:304-312. van Hemert S, Meijerink M, Molenaar D, Bron PA, de Vos P, Kleerebezem M, Wells JM and Marco ML. 2010. Identification of Lactobacillus plantarum genes modulating the cytokine response of human peripheral blood mononuclear cells. BMC Microbiol. 10:293. van Baarlen P, Troost FJ, van Hemert S, van der Meer C, de Vos WM, de Groot PJ, Hooiveld GJ, Brummer RJ and Kleerebezem M. 2008. Differential NF-kappaB pathways induction by Lactobacillus plantarum in the duodenum of healthy humans correlating with immune tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:2371-2376.
　本発明の目的は、ＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生量の比率（ＩＬ－１０／ＩＬ－１２の比率）が大きい、抗炎症性に優れた培養物を得るための、微生物の培養物の製造方法を提供することである。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、不飽和脂肪酸エステルを含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムを、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、ラクトバチルス・プランタラムの培養物を得た場合、得られた培養物について、定常期まで培養した場合に比べて、ＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生量の比率（ＩＬ－１０の産生量／ＩＬ－１２の産生量）について、より大きな値が得られることを見出し、本発明を完成した。
　本発明は、以下の［１］～［１２］を提供するものである。
［１］　不飽和脂肪酸エステルを含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムを、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、ラクトバチルス・プランタラムの培養物を得ることを特徴とするラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
［２］　上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの培養時の菌数が最高到達菌数の半分の菌数に達した時点で表される、上記［１］に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
［３］　上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの中和培養時に用いる中和剤の消費量が消費総量の半分の量に達した時点で表される、上記［１］に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
［４］　上記不飽和脂肪酸エステルが、一価もしくは多価の不飽和脂肪酸と多価アルコールとが反応してなるエステル、または、該エステルの誘導体である、上記［１］～［３］のいずれかに記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
［５］　上記一価もしくは多価の不飽和脂肪酸が、炭素数１６～２３の一価～三価の不飽和脂肪酸である、上記［４］に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
［６］　上記不飽和脂肪酸エステルが、モノオレイン酸エステルである、上記［４］又は［５］に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
［７］　上記不飽和脂肪酸エステルが、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、または、ポリソルベートである、上記［６］に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
［８］　上記［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法によって製造されたラクトバチルス・プランタラムの培養物を有効成分として含むことを特徴とする抗炎症剤。
［９］　不飽和脂肪酸エステルを含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムの複数の菌株の各々を、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、各菌株の培養物を得た後、得られた各菌株の培養物について、インターロイキン－１０の産生誘導活性を評価し、その評価結果に基いて、上記複数の菌株の中から、抗炎症作用の程度が大きい菌株を選抜することを特徴とするラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
［１０］　上記インターロイキン－１０の産生誘導活性の評価に加えて、インターロイキン－１２の産生誘導活性を評価し、これらの評価結果に基いて、上記複数の菌株の中から、抗炎症作用の程度が大きい菌株を選抜する、上記［９］に記載のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
［１１］　上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの培養時の菌数が最高到達菌数の半分の菌数に達した時点で表される、上記［９］又は［１０］に記載のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
［１２］　上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの中和培養時に用いる中和剤の消費量が消費総量の半分の量に達した時点で表される、上記［９］又は［１０］に記載のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
　本発明によれば、ＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生量の比率（以下、「ＩＬ－１０／ＩＬ－１２の産生量の比率」または「ＩＬ－１０／ＩＬ－１２産生比率」ともいう。）が大きい、抗炎症性に優れた培養物（ラクトバチルス・プランタラムの培養物）を得ることができる。
不飽和脂肪酸エステルを含む培地（４種）、飽和脂肪酸エステルを含む培地（比較用；１種）、または、不飽和脂肪酸エステル及び飽和脂肪酸エステルを含まない培地（対照用；１種）を用いて、ラクトバチルス・プランタラムＯＬＬ２７１２を培養した場合における、ＩＬ－１０の産生量を示すグラフである。 図１に示す培養におけるＩＬ－１２の産生量を示すグラフである。 図１に示す培養における、ＩＬ－１０／ＩＬ－１２の産生量の比率を示すグラフである。 不飽和脂肪酸エステル以外の物質（アスコルビン酸ナトリウム等；１３種）を含む培地または該物質を含まない培地（対照用；１種）を用いて、ラクトバチルス・プランタラムＯＬＬ２７１２を培養した場合における、ＩＬ－１０の産生量を示すグラフである。 図４に示す培養におけるＩＬ－１２の産生量を示すグラフである。 図４に示す培養におけるＩＬ－１０／ＩＬ－１２の産生量の比率を示すグラフである。 不飽和脂肪酸エステルの一種であるモノオレイン酸デカグリセリンを含む培地（Ｑ－１７Ｓ（＋））、または、モノオレイン酸デカグリセリンを含まない培地（Ｑ－１７Ｓ（－））を用いて、ラクトバチルス・プランタラムＯＬＬ２７１２を培養した場合における、培養期間中のＩＬ－１０の産生量の経時変化を示すグラフである。 図７に示す培養における、培養期間中のＩＬ－１２の産生量の経時変化を示すグラフである。 図７に示す培養における、培養期間中のＩＬ－１０／ＩＬ－１２の産生量の比率の経時変化を示すグラフである。 不飽和脂肪酸エステルの一種であるモノオレイン酸デカグリセリンを含む培地（Ｑ－１７Ｓ（＋））、または、モノオレイン酸デカグリセリンを含まない培地（Ｑ－１７Ｓ（－））を用いて、ラクトバチルス・プランタラムＯＬＬ２７７０を培養した場合における、培養期間中のＩＬ－１０の産生量の経時変化を示すグラフである。 図１０に示す培養における、培養期間中のＩＬ－１２の産生量の経時変化を示すグラフである。 図１０に示す培養における、培養期間中のＩＬ－１０／ＩＬ－１２の産生量の比率の経時変化を示すグラフである。
　本発明のラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）の培養物の製造方法は、不飽和脂肪酸エステルを含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムを、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、ラクトバチルス・プランタラムの培養物を得るものである。
　ラクトバチルス・プランタラム（以下、プランタラム菌と略すことがある。）としては、任意の菌株を用いることができる。
　ラクトバチルス・プランタラムの菌株の例としては、ＯＬＬ２７１２（受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１２６２）、ＯＬＬ２７７０等が挙げられる。
　本発明において、脂肪酸エステルとしては、分子中に二重結合を１個以上有する化学構造（不飽和の構造）を有しているもの（不飽和脂肪酸エステル）が用いられる。飽和脂肪酸エステルを用いた場合には、不飽和脂肪酸エステルを用いた場合に比べて、ＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生量の比率（ＩＬ－１０／ＩＬ－１２）が小さくなる。
　不飽和脂肪酸エステルとしては、例えば、一価もしくは多価の不飽和脂肪酸と多価アルコールとが反応してなるエステルや、該エステルの誘導体が挙げられる。
　一価の不飽和脂肪酸としては、例えば、炭素数１６～２３の一価の不飽和脂肪酸が挙げられる。炭素数１６～２３の一価の不飽和脂肪酸としては、例えば、オレイン酸（炭素数：１６）、バクセン酸（炭素数：１６）、パルミトレイン酸（炭素数：１９）、ネルボン酸（炭素数：２３）等が挙げられる。
　多価の不飽和脂肪酸としては、例えば、炭素数１６～２３の二価～四価の不飽和脂肪酸が挙げられる。炭素数１６～２３の二価～四価の不飽和脂肪酸としては、例えば、リノール酸（二価、炭素数：１６）、８，１１－イコサジエン酸（二価、炭素数：１９）、リノレン酸（三価、炭素数：１６）、エレオステアリン酸（三価、炭素数：１６）、５，８，１１－イコサトリエン酸（三価、炭素数：１８）、アラキドン酸（四価、炭素数：１８）等が挙げられる。
　多価アルコールとしては、例えば、ポリグリセリン、ソルビタン等が挙げられる。ポリグリセリンとしては、例えば、グリセリンが３～１５個結合してなるものが挙げられる。
　グリセリンが３～１５個結合してなるポリグリセリンとしては、例えば、トリグリセリン、テトラグリセリン、ペンタグリセリン、ヘキサグリセリン、ヘプタグリセリン、オクタグリセリン、ノナグリセリン、デカグリセリン、ウンデカグリセリン、ドデカグリセリン等が挙げられる。
　一価もしくは多価の不飽和脂肪酸と多価アルコールとが反応してなるエステルの誘導体としては、例えば、ポリソルベート等が挙げられる。
　ポリソルベートは、一価もしくは多価の不飽和脂肪酸とソルビタンとが反応してなるソルビタン脂肪酸に、酸化エチレンを縮合させてなるものである。ここで、縮合させる酸化エチレンの数は、例えば、１５～２５個である。
　本発明において、不飽和脂肪酸エステルの好ましい一例としては、モノオレイン酸エステル（例えば、オレイン酸１分子と、ポリグリセリン、ソルビタンまたはポリソルベート１分子が反応してなるもの）が挙げられる。
　培地中の不飽和脂肪酸エステルの濃度は、ＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生量の比率（ＩＬ－１０／ＩＬ－１２）を高める観点からは、好ましくは０．００１重量％以上、より好ましくは０．０１重量％以上、さらに好ましくは０．０２重量％以上、さらに好ましくは０．０３重量％以上、さらに好ましくは０．０４重量％以上、特に好ましくは０．０５重量％以上である。
　培地中の不飽和脂肪酸エステルの濃度は、不飽和脂肪酸エステルの量の増大による培養のコストの増大を避ける観点からは、好ましくは１重量％以下、より好ましくは０．５重量％以下、さらに好ましくは０．３重量％以下、さらに好ましくは０．１重量％以下、特に好ましくは０．０８重量％以下である。
　不飽和脂肪酸エステル以外の培地の成分としては、乳酸菌の培養に用いられている一般的な成分を用いればよい。
　本発明において、ラクトバチルス・プランタラムは、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養される。対数増殖期の終了時点を超える時点まで培養を行った場合、ＩＬ－１０の産生量、及びＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生量の比率（ＩＬ－１０／ＩＬ－１２）が低下し、本発明で目的とする培養物を得ることができない。
　対数増殖期の終了時点は、例えば、以下の（ａ）または（ｂ）で表される。
（ａ）ラクトバチルス・プランタラムの培養時の菌数が、最高到達菌数の半分の菌数に達した時点
（ｂ）ラクトバチルス・プランタラムの中和培養時に用いる中和剤の消費量が、消費総量の半分の量に達した時点
　上記（ａ）において、最高到達菌数とは、対数増殖期の終了時点を超えて、培養を継続させた場合に、到達すると推測される最高（最大）の菌数をいう。
　上記（ｂ）において、中和培養とは、菌の増殖を最適な状態に保つために、中和剤（例えば、水酸化ナトリウム）を培養液に添加してｐＨを一定の範囲に保ちながら培養することをいう。
　また、中和培養時に用いる中和剤の消費総量とは、培養の開始時から、最高到達菌数が得られる時まで、ｐＨが一定の範囲になるように中和剤を添加していった場合における、添加された中和剤の総量をいう。
　上記（ａ）の「最高到達菌数」および上記（ｂ）の「消費総量」は、例えば、本発明の製造方法の一例を実施する前に、この一例と全く同じ条件（例えば、ラクトバチルス・プランタラムの菌株の種類、不飽和脂肪酸エステルおよび他の培地成分の種類、培養時の温度等）の下で培養を行なうことによって、予め定めておくことができる。
　プランタラム菌の数は、例えば、プランタラム菌の培養物を含む懸濁液の濁度の測定値として表すことができる。濁度の測定手段としては、例えば、分光光度計が挙げられる。
　プランタラム菌の対数増殖期の長さは、温度、培地の成分組成等によっても異なるが、例えば、９～１１時間である。
　本発明の製造方法によって製造されたラクトバチルス・プランタラムの培養物は、例えば、抗炎症剤の有効成分として用いることができる。
　この培養物は、ＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生量の比率（ＩＬ－１０／ＩＬ－１２の産生量の比率）が、従来の製造方法によって製造された培養物（従来品）における該比率よりも大きいものである点で、従来品と区別することができる。
　本発明の製造方法によって製造される培養物において、ＩＬ－１０／ＩＬ－１２の産生量の比率は、不飽和脂肪酸エステルを配合しない培地を用いた場合の該比率を基準にして、好ましくは２０％以上大きいものであり、より好ましくは２５％以上大きいものであり、特に好ましくは３０％以上大きいものである。
　次に、本発明のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法について説明する。
　本発明のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法（以下、本発明の選抜方法と略すことがある。）は、不飽和脂肪酸エステル（例えば、モノオレイン酸エステル）を含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムの複数の菌株の各々を、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、各菌株の培養物を得た後、得られた各菌株の培養物について、インターロイキン－１０の産生誘導活性を評価し、その評価結果に基いて、上記複数の菌株の中から、抗炎症作用の程度が大きい菌株を選抜するものである。
　本発明の選抜方法は、インターロイキン－１０の産生誘導活性の評価に加えて、インターロイキン－１２の産生誘導活性を評価し、これらの評価結果に基いて、複数の菌株の中から、抗炎症作用の程度が大きい菌株を選抜するものとすることができる。
　インターロイキン－１２およびインターロイキン－１０の各々についての産生誘導活性は、例えば、免疫学的測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ；Enzyme-linked immuno-sorbent assay）等によって評価することができる。
［１．培地中の不飽和脂肪酸エステルの有無によるＩＬ－１０／ＩＬ－１２の産生量の比率への影響］
　ビタミン類、ミネラル類、飽和脂肪酸エステル類、または不飽和脂肪酸エステル類（モノオレイン酸エステル類）を配合した培地を使用し、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養して、これら各成分の抗炎症活性への影響について検討した。
［実験方法１－１］　プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の調製方法
　ＭＲＳ培地（Becton Dickinson社）を使用し、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を静置培養（３７℃、１８時間、２回）して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の賦活培養液を調製した。そして、ホエイ分解培地を使用し、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の賦活培養液を、ホエイ分解培地１００重量％に対して１重量%の量で添加してから、静置培養（３７℃、９時間）して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の培養液を調製した。
　ここで、ホエイ分解培地の組成（重量基準）は、ホエイパウダー６．２５％、ホエイタンパク濃縮物（ＷＰＣ８０；タンパク質の含有率：８０％）、プロテアーゼ０．１２％、酵母エキス０．５０％、魚肉エキス０．５０％、硫酸マンガン四水和物０．０１％、他の副原料０．０５％（後で添加；詳細は後述する。）または０％（対照用）、蒸留水９０．８２％または９０．８７％（対照用）である。
　その後に、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の培養液を遠心分離処理（８０００×ｇ、１５分間）して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の菌体を集菌した。そして、生理食塩水を使用して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の菌体を２回で洗浄し、次いで、蒸留水を使用して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の菌体を１回で洗浄し、その後、得られた菌体を蒸留水に懸濁し、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の懸濁液を調製した。次いで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の懸濁液を加熱処理（７５℃、６０分間）してから、凍結乾燥処理（FD）し、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の凍結乾燥菌体を調製した。
　その後に、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の凍結乾燥菌体をリン酸緩衝液（PBS）に懸濁してから、細胞培養用の培地を使用して、１０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の希釈液を調製した。
　ここで、上述のホエイ分解培地（上述の副原料を除くもの）に、以下に示す副原料（全１８種類のいずれか１つ）を０．０５重量％の量で配合し、全１８種類のホエイ分解培地を調製した。その後、上記と同等な条件の処理によって、数種類のプランタラム菌ＯＬＬ２７１２の希釈液を調製した。
［ホエイ分解培地の副原料の種類］
（ａ）不飽和脂肪酸エステル：４種類
（ａ－１）モノオレイン酸デカグリセリン：サンソフトＱ－１７Ｓ（商品名）、親水性、太陽化学社製
（ａ－２）ペンタグリセリンモノオレイン酸エステル：サンソフトＡ－１７１Ｅ（商品名）、親水性、太陽化学社製
（ａ－３）ソルビタンモノオレイン酸エステル：サンソフトＮｏ．８１Ｓ（商品名）、親油性、太陽化学社製
（ａ－４）モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン：Ｔｗｅｅｎ８０（商品名）、親水性、和光純薬工業社製
（ｂ）飽和脂肪酸エステル：１種類
（ｂ－１）モノステアリン酸デカグリセリン：サンソフトＱ－１８Ｓ（商品名）、両親媒性、太陽化学社製
（ｃ）ビタミン類：９種類（アスコルビン酸ナトリウム、チアミン塩酸塩、リボフラビン、ニコチン酸、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、ピリドキシン塩酸塩、ビオチン、葉酸）
（ｄ）ミネラル類：４種類（硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸鉄、硫酸第二鉄アンモニウム）
［実験方法１－２］免疫細胞のＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生誘導活性の評価方法
　自動磁気細胞分離装置（auto MACS、Miltenyi Biotec 社）を使用し、8週齢の雄BALB/cマウス（日本SLC社）の骨髄から未分化の樹状細胞のみを分離した。そして、Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor （以下、ＧＭ－ＣＳＦと略す。）を含むＲＰＭＩ培地（Invitrogen社）を使用し、未分化の樹状細胞を培養（３７℃、ＣＯ２（５％）の環境下、８日間）して、十分に分化させることで、骨髄由来の樹状細胞（BMDC；免疫細胞）を調製した。
　その後に、この樹状細胞（BMDC）を回収して、２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度になるように、４８ウェル・プレートに播種してから、上述の各種のホエイ培地で培養したプランタラム菌ＯＬＬ２７１２を、乾燥重量で５０μｇ／ｍＬとなるように添加した。そして、ＧＭ－ＣＳＦを含むＲＰＭＩ培地を使用し、前記の４８ウェル・プレートを培養（３７℃、ＣＯ２（５％）の環境下、２４時間）してから、この培養上清を回収した。
　そして、「Mouse IL-10 ELISA Set」（Becton Dickinson社）を使用し、この培養上清のＩＬ－１０濃度を測定すると共に、「Mouse IL-12 (p70) ELISA Set」（Becton Dickinson社）を使用し、この培養上清のＩＬ－１２濃度を測定した。ここで、ＩＬ－１２濃度では、活性型であるＩＬ－１２ （ｐ７０）濃度を測定した。
［実験結果１］　免疫細胞のＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生誘導活性の評価結果
　以上の実験の結果（４回の実験の平均値、および、標準偏差等）を表１～表６および図１～図６に示す。
　表１～表３（図１～図３）は、副原料として、不飽和脂肪酸エステル（４種類のいずれか）、または飽和脂肪酸エステル（１種類；Ｑ－１８Ｓ）を用いた場合の結果、及び、副原料を用いなかった場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の結果を示す。表４～表６（図４～図６）は、副原料として、ビタミン類（９種類のいずれか）またはミネラル類（４種類のいずれか）を用いた場合の結果、及び、副原料を用いなかった場合（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表１（図１）から、ホエイ分解培地に、脂肪酸エステル（不飽和、飽和）を配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養しても、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、免疫細胞のＩＬ－１０の産生誘導活性が向上されないことを確認できた。
　表２（図２）から、ホエイ分解培地に、脂肪酸エステルのうち、飽和脂肪酸エステルであるモノステアリン酸デカグリセリンを配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、免疫細胞のＩＬ－１２の産生誘導活性が、大きくは低減されないこと、および、脂肪酸エステルのうち、不飽和脂肪酸エステル（４種類のいずれか）を配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、免疫細胞のＩＬ－１２の産生誘導活性が大きく低減されることを確認できた。
　表３（図３）から、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステル（４種類のいずれか）を配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）や飽和脂肪酸エステルに比べて、免疫細胞のＩＬ－１０／ＩＬ－１２産生比率が大きく増大することを確認できた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表４（図４）から、ホエイ分解培地に、ビタミン類やミネラル類を配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養しても、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、免疫細胞のＩＬ－１０の産生誘導活性が大きくは変化しないことを確認できた。
　表５（図５）から、ホエイ分解培地に、ビタミン類やミネラル類を配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養しても、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、免疫細胞のＩＬ－１２の産生誘導活性が大きくは変化しないことを確認できた。
　表６（図６）から、ホエイ分解培地に、ビタミン類やミネラル類を配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養しても、対照（（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、免疫細胞のＩＬ－１０／ＩＬ－１２産生比率が大きくは変化しないことを確認できた。
　以上の結果から、不飽和脂肪酸エステルを配合した培地を使用し、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、ＩＬ－１０／ＩＬ－１２産生比率が著しく大きくなり、例えば抗炎症活性の向上を期待できること、および、不飽和脂肪酸エステル以外の物質（飽和脂肪酸エステル、ビタミン類、ミネラル類）では、このような効果（ＩＬ－１０／ＩＬ－１２産生比率の著しい増大など）が期待できないことを確認できた。
［２．培養期間の長さを変えることによるＩＬ－１０／ＩＬ－１２の産生量の比率への影響（プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を用いた場合）］
［実験方法２－１］　プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の調製方法
　実験方法１－１と同様にして、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の賦活培養液を調製した。そして、実験方法１－１で用いたホエイ分解培地と同じ培地を使用し、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の賦活培養液を４重量％で添加してから、中和剤にＫ２ＣＯ３（４０重量%）を使用し、ｐＨを５．８に制御しながら撹拌培養（３３℃、Ｎ２の上面の通気下、２００ｒｐｍ）して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の高濃度培養液を調製した。なお、この撹拌培養では、事前に培養条件を検討し、最高の菌体濃度が得られる培養条件に設定した。
　その後に、実験方法１－１と同様にして、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の凍結乾燥菌体を調製した。
　その後に、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の凍結乾燥菌体をリン酸緩衝液（PBS）に懸濁してから、細胞培養用の培地を使用し、１０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２の希釈液を調製した。
［実験方法２－２］　免疫細胞のＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生誘導活性の評価方法
　実験方法１－１で調製したホエイ分解培地であって、副原料として、モノオレイン酸デカグリセリン（サンソフトＱ－１７Ｓ（商品名））を含むもの、または、副原料を含まないものを用いて、実験方法１－２と同様にして、免疫細胞のＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生誘導活性を評価した。
　この際、対数増殖期の中期（対数増殖期の始点から４時間後）、対数増殖期の後期（対数増殖期の始点から８時間後）、定常期の初期（対数増殖期の始点から１２時間後）、定常期の中期（対数増殖期の始点から１６時間後）の各時点にて、免疫細胞のＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生誘導活性を評価した。
　なお、この培養における対数増殖期の終了時点は、対数増殖期の始点から１０時間経過後の時点（最高到達菌数の半分の菌数に到達した時点）であった。
［実験結果２］　免疫細胞のＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生誘導活性の評価結果
　以上の実験の結果（４回の実験の平均値、および、標準偏差）を表７～表９および図７～図９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表７（図７）から、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合して、対数増殖期（４時間、８時間）までプランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合せず、対数増殖期（４時間、８時間）までプランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ－１０の産生誘導活性が向上されることを確認できた。
　また、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合して、定常期（１２時間、１８時間）までプランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合せず、定常期（１２時間、１８時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ－１０の産生誘導活性が低減されることを確認できた。
　表８（図８）から、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、対数増殖期（４時間、８時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、対数増殖期（４時間、８時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ－１２の産生誘導活性が低減されることを確認できた。
　また、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合して、定常期（１２時間、１８時間）までプランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合せず、定常期（１２時間、１８時間）までプランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ－１２の産生誘導活性が変化しないことを確認できた。
　表９（図９）から、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、対数増殖期（４時間、８時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、対数増殖期（４時間、８時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ－１０／ＩＬ－１２産生比率が向上されることを確認できた。
　また、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、定常期（１２時間、１８時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養すると、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、定常期（１２時間、１８時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ－１０／ＩＬ－１２産生比率が低減されることを確認できた。
　以上から、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を定常期の範囲内の時点まで培養せず、対数増殖期の範囲内の時点で培養を終了させると、ＩＬ－１０／ＩＬ－１２産生比率が著しく増大し、抗炎症活性の向上を期待できることを確認できた。
［３．培養期間の長さを変えることによるＩＬ－１０／ＩＬ－１２の産生量の比率への影響（プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を用いた場合）］
　プランタラム菌ＯＬＬ２７１２に代えて、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を用いたこと、および、免疫細胞のＩＬ－１０とＩＬ－１２の産生誘導活性の測定時点を、４つの時点から、対数増殖期の中期（培養開始から５時間後）、定常期の中期（培養開始から１６時間後）の２つの時点に変更したこと以外は、上記「２．培養期間の長さを変えることによるＩＬ－１０／ＩＬ－１２の産生量の比率への影響（プランタラム菌ＯＬＬ２７１２を用いた場合）」と同様にして、実験した。
　なお、この培養における対数増殖期の終了時点は、培養開始から７時間経過後の時点（中和剤が消費総量の半分に達した時点）であった。
　以上の実験の結果（４回の実験の平均値、および、標準偏差）を表１０～表１２および図１０～図１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１０（図１０）から、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合して、対数増殖期（５時間）までプランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養すると、ホエイ分解培地に不飽和脂肪酸エステルを配合せず、対数増殖期（５時間）までプランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ－１０の産生誘導活性が向上されることを確認できた。
　また、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、定常期（１６時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養すると、 ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、定常期（１６時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ－１０の産生誘導活性が変化しないことを確認できた。
　表１１（図１１）から、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、対数増殖期（５時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養すると、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、対数増殖期（５時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ－１２の産生誘導活性が有意に低減することを確認できた。
　また、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、定常期（１６時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養すると、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、定常期（１６時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ－１２の産生誘導活性が変化しないことを確認できた
　表１２（図１２）から、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、対数増殖期（５時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養すると、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、対数増殖期（５時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ－１０／ＩＬ－１２産生比率が向上されることを確認できた。
　また、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、定常期（１６時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養すると、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合せず、定常期（１６時間）まで、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を培養した場合に比べて、免疫細胞のＩＬ－１０／ＩＬ－１２産生比率が有意に低減することを確認できた。
　以上から、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、プランタラム菌ＯＬＬ２７７０を定常期の範囲内の時点（１６時間）まで培養せず、対数増殖期の範囲内の時点（５時間）で培養を終了させると、ＩＬ－１０／ＩＬ－１２産生比率が向上し、抗炎症活性の向上を期待できることを確認できた。
　したがって、プランタラム菌の種類に影響されず、プランタラム菌に共通して、ホエイ分解培地に、不飽和脂肪酸エステルを配合して、 プランタラム菌を定常期の範囲内の時点まで培養せず、 対数増殖期の範囲内の時点で培養を終了させると、ＩＬ－１０／ＩＬ－１２産生比率が向上し、抗炎症活性の向上を期待できることを確認できた。

Claims (12)

  1. 　不飽和脂肪酸エステルを含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムを、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、ラクトバチルス・プランタラムの培養物を得ることを特徴とするラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
  2. 　上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの培養時の菌数が最高到達菌数の半分の菌数に達した時点で表される、請求項１に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
  3. 　上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの中和培養時に用いる中和剤の消費量が消費総量の半分の量に達した時点で表される、請求項１に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
  4. 　上記不飽和脂肪酸エステルが、一価もしくは多価の不飽和脂肪酸と多価アルコールとが反応してなるエステル、または、該エステルの誘導体である請求項１～３のいずれか１項に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
  5. 　上記一価もしくは多価の不飽和脂肪酸が、炭素数１６～２３の一価～三価の不飽和脂肪酸である請求項４に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
  6. 　上記不飽和脂肪酸エステルが、モノオレイン酸エステルである請求項４又は５に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
  7. 　上記不飽和脂肪酸エステルが、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、または、ポリソルベートである請求項６に記載のラクトバチルス・プランタラムの培養物の製造方法。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法によって製造されたラクトバチルス・プランタラムの培養物を有効成分として含むことを特徴とする抗炎症剤。
  9. 　不飽和脂肪酸エステルを含む培地を用いて、ラクトバチルス・プランタラムの複数の菌株の各々を、対数増殖期の終了時点を超えない時点まで培養して、各菌株の培養物を得た後、得られた各菌株の培養物について、インターロイキン－１０の産生誘導活性を評価し、その評価結果に基いて、上記複数の菌株の中から、抗炎症作用の程度が大きい菌株を選抜することを特徴とするラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
  10. 　上記インターロイキン－１０の産生誘導活性の評価に加えて、インターロイキン－１２の産生誘導活性を評価し、これらの評価結果に基いて、上記複数の菌株の中から、抗炎症作用の程度が大きい菌株を選抜する請求項９に記載のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
  11. 　上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの培養時の菌数が最高到達菌数の半分の菌数に達した時点で表される、請求項９又は１０に記載のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
  12. 　上記対数増殖期の終了時点が、上記ラクトバチルス・プランタラムの中和培養時に用いる中和剤の消費量が消費総量の半分の量に達した時点で表される、請求項９又は１０に記載のラクトバチルス・プランタラムの菌株の選抜方法。
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