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WO2018021515A1 - 血管障害の予防又は治療剤 - Google Patents

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WO2018021515A1
WO2018021515A1 PCT/JP2017/027383 JP2017027383W WO2018021515A1 WO 2018021515 A1 WO2018021515 A1 WO 2018021515A1 JP 2017027383 W JP2017027383 W JP 2017027383W WO 2018021515 A1 WO2018021515 A1 WO 2018021515A1
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WO
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aneurysm
cells
cell
muse
cell preparation
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PCT/JP2017/027383
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English (en)
French (fr)
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佳克 齋木
真理 出澤
勝寛 細山
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Tohoku University NUC
Life Science Institute Ltd
Life Science Institute Inc
Original Assignee
Tohoku University NUC
Life Science Institute Ltd
Life Science Institute Inc
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Publication date
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Priority to US16/321,203 priority patent/US11419899B2/en
Priority to SG11201900796UA priority patent/SG11201900796UA/en
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS

Definitions

  • the present invention relates to a cell preparation in regenerative medicine. More specifically, the present invention relates to a cell preparation containing pluripotent stem cells effective for repair and regeneration of damaged blood vessels.
  • An aneurysm is a condition in which the weakened part of the arterial wall swells, a true aneurysm that expands while maintaining the three-layer structure of the intima, media, and adventitia, and the medial wall of the artery tears and causes arterial dissection A dissecting aneurysm that expands after coming is known.
  • These disorders are at risk of direct death.
  • aortic aneurysms have long been thought to be caused by vascular wall damage due to arteriosclerosis or hypertension, but recent research has shown that inflammation, oxidative stress, etc. caused by vascular walls, especially the media and adventitia This is considered to be a factor (for example, Non-Patent Documents 1 to 3).
  • Non-Patent Documents 4 to 7 Due to the above factors, inflammatory cells such as lymphocytes and monocytes / macrophages infiltrate the arterial wall, and various proteolytic enzymes such as matrix metalloproteinases (MMPs) are activated. Degradation and rupture of the extracellular matrix composed of elastin fibers and collagen fibers of the membrane occurs, and at the same time, the aortic wall thins and weakens due to vascular endothelial cell loss and dysfunction, smooth muscle cell apoptosis, etc., irreversible It is considered to expand and form an aneurysm (for example, Non-Patent Documents 4 to 7).
  • MMPs matrix metalloproteinases
  • aortic dissection is also caused by a crack in the intima of the aorta caused by deterioration of the arterial wall caused by arteriosclerosis or hypertension. Caused by dissociation into two cavities.
  • aneurysm occurs in many cases due to the vulnerability of the aortic wall and various risk factors for arteriosclerosis.
  • Vaginal aortic aneurysms do not show symptoms until arterial rupture or dissection occurs, and are often found in regular health examinations or medical examinations or image examinations performed for other purposes. Usually, if the diameter of the aortic aneurysm is about 5 centimeters or more, to replace the aneurysm, it is replaced with an artificial blood vessel by surgery, or stent graft insertion (folding from a small inguinal incision to the aorta) And other treatments are performed.
  • true or dissecting aneurysms are difficult to detect early, and aortic aneurysms rarely rupture if their diameter is less than about 5 centimeters.
  • aortic aneurysms rarely rupture if their diameter is less than about 5 centimeters.
  • fundamental treatment such as blood vessel regeneration at the initial stage of a true aneurysm or dissecting aneurysm and a vascular disorder connected to the true aneurysm is desired.
  • Non-Patent Document 8 discloses endovascular treatment using vascular smooth muscle cells in a rat xenograft model, and shows that an aneurysm reduction effect was seen in 8 weeks after transcatheter administration.
  • Non-Patent Document 9 discloses a treatment using an adenovirus vector containing a recombinant tropoelastin gene in a rat elastase model, and shows that aneurysm diameter reduction accompanied by elastin fiber hyperplasia was observed. Has been.
  • Non-Patent Document 10 discloses a treatment using endothelial cells in a rat xenograft model, and shows that an aneurysm reduction effect was seen in 8 weeks after transcatheter administration. However, these are all related to vascular cell transplantation and gene therapy, and their effects are not sufficient.
  • mesenchymal stem cells which have self-proliferation ability and multipotency, not only differentiate into vascular endothelial cells, but also vascular endothelial growth factor (VEGF). It has been found to be secreted (for example, Non-Patent Documents 11 to 13), and treatment of aneurysms by regenerative medicine using mesenchymal stem cells (MSC) has also been attempted (for example, Non-Patent Documents 14 to 17).
  • MSC mesenchymal stem cells
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • SSEA-3 Stage-Specific Embryonic Antigen-3
  • Muse cells Pluripotent stem cells expressing as a surface antigen (Multilineage-differentiating Stress Enduring cells; Muse cells) are responsible for the pluripotency of the mesenchymal cell fraction and can be applied to disease treatment aiming at tissue regeneration It has been found that there is a possibility (for example, Patent Document 1; Non-Patent Documents 18 to 20). However, there is no example that shows that the expected therapeutic effect can be obtained by using Muse cells for the prevention and / or treatment of vascular disorders.
  • the object of the present invention is to provide a cell preparation for the prevention and / or treatment of vascular disorders.
  • the present inventors have injured Muse cells by administering human Muse cells from blood vessels or the like, or directly to the vascular injury site of the subject and its surroundings. It is found that the damaged blood vessels are accumulated and engrafted to reconstruct and repair the damaged blood vessels, resulting in improvement or recovery of the vascular injury, so that Muse cells are suitable for the treatment and prevention of vascular disorders including aortic aneurysms The inventors have found that it can be used and have completed the present invention.
  • a cell preparation for preventing and / or treating vascular disorders comprising SSEA-3-positive pluripotent stem cells derived from living mesenchymal tissue or cultured mesenchymal cells.
  • the cell preparation according to [3], wherein the aortic aneurysm is an abdominal aortic aneurysm or a thoracic aortic aneurysm.
  • the pluripotent stem cell is a pluripotent stem cell having all of the following properties: (I) low or no telomerase activity; (Ii) has the ability to differentiate into cells of any germ layer of the three germ layers; (Iii) does not show neoplastic growth; and (iv) has a self-renewal capability.
  • a vascular disorder comprising a step of administering an effective amount of SSEA-3-positive pluripotent stem cells derived from mesenchymal tissue or cultured mesenchymal cells in a living body to a subject in need of prevention or treatment Methods for preventing and / or treating.
  • a Muse cell is administered from a blood vessel or the like to a subject suffering from a vascular disorder or directly administered to and around the vascular disorder site of the subject, thereby reconstructing and repairing the damaged blood vessel. Function can be improved or restored. Since the cell preparation of the present invention can exert an effect not only in the acute phase of vascular disorder but also in the chronic phase, the therapeutic effect can be sustained over a long period of time.
  • Muse cells can efficiently migrate to and engraft damaged blood vessels, and spontaneously differentiate into constituent cells such as vascular cells at the site of engraftment, so that they can be treated before treatment. Differentiation induction is unnecessary. Moreover, it is non-tumorigenic and excellent in safety. Furthermore, since Muse cells do not undergo immune rejection, treatment with other products prepared from donors is also possible. Therefore, the Muse cell having the excellent performance described above can provide an easily feasible means for treating a patient having a vascular disorder.
  • FIG. 1 is a photograph of an aortic aneurysm removed from each group of mice after 8 weeks.
  • the scale bar indicates 3 mm.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of measuring the aortic aneurysm diameter of each group after 3 weeks and 8 weeks by microscopic measurement. * Indicates P ⁇ 0.05, and ** indicates P ⁇ 0.01.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measuring the diameter of the aortic aneurysm of each group of mice by an ultrasonic measurement method. The vertical axis shows the diameter of the aortic aneurysm (mm).
  • FIG. 4 is a photomicrograph showing the results of Elastica-Masson staining of the aortic aneurysm tissue of each group of mice after 3 weeks.
  • the scale bar indicates 200 ⁇ m.
  • FIG. 5 is a graph showing the result of quantifying the elastic fiber (Elastin) area by the ratio of the elastic fiber area and the total vessel wall cross-sectional area in each group after 3 weeks and 8 weeks. * Indicates P ⁇ 0.05, and ** indicates P ⁇ 0.01.
  • the left figure of FIG. 6 is a photomicrograph showing the result of immunostaining of alpha-smooth muscle actin ( ⁇ SMA) / GFP 3 weeks after Muse cell administration (scale bar shows 50 ⁇ m), and the right figure of FIG. 6 is 3 weeks.
  • ⁇ SMA alpha-smooth muscle actin
  • FIG. 7 It is a graph which shows the number per unit area of both ⁇ SMA / GFP positive cells of each group after and after 8 weeks.
  • the left figure of FIG. 7 is a photomicrograph showing the result of immunostaining of CD31 / GFP 3 weeks after Muse cell administration (scale bar shows 50 ⁇ m), and the right figure of FIG. 7 shows the results after 3 weeks and 8 weeks, respectively.
  • the left figure of FIG. 8 is a micrograph showing the result of immunostaining of F4 / 80 3 weeks after Muse cell administration, and the right figure of FIG. 8 shows the F4 / 80 positive cells of each group after 3 weeks and 8 weeks.
  • FIG. 9 is a photomicrograph showing the result of immunostaining of Ki67 / GFP 3 weeks after Muse cell administration (scale bar shows 50 ⁇ m), and the right figure of FIG. 9 is Muse after 3 weeks and 8 weeks. It is a graph which shows the ratio of the Ki67 positive cell of a cell administration group.
  • FIG. 10 is a graph showing the detection results of the Alu sequence in each organ of the Muse cell administration group and the non-Muse cell administration group after 8 weeks. The aorta-derived Alu sequence detection concentration of the non-Muse cell administration group is taken as 1, and the ratios to the values of the other organs and the Muse cell administration group are shown.
  • FIG. 10 is a graph showing the detection results of the Alu sequence in each organ of the Muse cell administration group and the non-Muse cell administration group after 8 weeks. The aorta-derived Alu sequence detection concentration of the non-Muse cell administration group is taken as 1, and the ratios to the values of the other organs and the Muse cell administration
  • FIG. 11 shows early endothelial cell markers (AC), dedifferentiated smooth muscle cell markers (DF) and stress tolerance related markers (GI) in human Muse cells, endothelial progenitor cells (EPC) and CD34 + progenitor cells.
  • AC early endothelial cell markers
  • DF dedifferentiated smooth muscle cell markers
  • GI stress tolerance related markers
  • FIG. 12A shows a representative multiphoton laser microscope image of a mouse aneurysm co-cultured with Muse cells (photograph).
  • the left column shows a three-dimensional reconstructed image of the arterial sample showing the positions of the axial images (broken lines 1 to 4) captured every 20 ⁇ m from the cavity side to the outside.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 12B shows a representative sagittal section of a frozen section stained with CD31 or CD34 (photograph). Arrowheads indicate GFP and both positive cells.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • FIG. 13A shows representative multiphoton laser microscopic images of aneurysms obtained on days 3 and 5 in an in vivo aneurysm model administered with Muse cells (photograph). The left column shows a three-dimensional reconstructed image of the arterial sample showing the positions of the axial images (broken lines 1 to 4) captured every 20 ⁇ m from the cavity side to the outside. The scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 13B shows a schematic diagram of aneurysm treatment with Muse cells.
  • the present invention relates to a cell preparation for preventing and / or treating vascular disorders, including SSEA-3-positive pluripotent stem cells (Muse cells).
  • SSEA-3-positive pluripotent stem cells Muse cells
  • the cell preparation containing SSEA-3-positive pluripotent stem cells (Muse cells) of the present invention is used for the prevention and / or treatment of vascular disorders.
  • the “vascular disorder” is caused by arteriosclerosis or hypertension, or by inflammation, oxidative stress, etc. caused on the blood vessel wall, particularly in the media and adventitia. Examples include vascular disorders caused by bacterial or fungal infections, and specific examples include an aneurysm in which a portion of an arterial wall weakened due to a vascular disorder swells.
  • vascular disorder means that the arterial wall becomes weak due to the above causes and results in an aneurysm, but also includes an early stage vascular disorder before reaching the aneurysm.
  • the aneurysm includes thoracic aortic aneurysm, abdominal aortic aneurysm, internal organ aneurysm, peripheral aneurysm, cerebral aneurysm, coronary aneurysm, etc. Examples include spindle aneurysms and saccular aneurysms, and classification according to the state of the blood vessel wall includes true aneurysms, dissecting aneurysms, and pseudoaneurysms. Inflammatory aneurysms, infectious aneurysms and the like.
  • Pluripotent stem cells The pluripotent stem cell used in the cell preparation of the present invention was found by Dezawa, one of the present inventors, in the human body and named “Muse (Multilineage-differentiating Stress Ending) cell”. It is. Muse cells are obtained from bone marrow fluid, adipose tissue (Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013 (Epub) (published on Jan 17, 2014)), dermal connective tissue of skin, etc. It is widely known to exist in connective tissues of tissues and organs. This cell is a cell having the properties of both a pluripotent stem cell and a mesenchymal stem cell.
  • a cell surface marker “SSEA-3 (Stage-specific embryonic antigen-3)” positive cell preferably Are identified as SSEA-3 positive and CD-105 positive double positive cells. Therefore, Muse cells or cell populations containing Muse cells can be separated from living tissues using, for example, SSEA-3 alone or the expression of SSEA-3 and CD-105 as an index. Details such as a method for separating Muse cells, an identification method, and characteristics are disclosed in International Publication No. WO2011 / 007900.
  • Muse cells using Muse cells' high resistance to various external stresses, proteolytic enzyme treatment, hypoxic conditions, low phosphate conditions, low serum concentrations, low nutrient conditions, exposure to heat shock, harmful Muse cells can be selectively enriched by culturing under various external stress conditions such as substances, active oxygen, mechanical stimulation, pressure treatment, and the like.
  • pluripotent stem cells prepared from living mesenchymal tissue or cultured mesenchymal tissue using SSEA-3 as an index as a cell preparation for treating vascular disorders. Cell) or a cell population containing Muse cells may be simply referred to as “SSEA-3 positive cells”.
  • the “non-Muse cell” refers to a cell contained in a mesenchymal tissue or cultured mesenchymal cell in a living body and other than “SSEA-3 positive cell”. is there.
  • Muse cells or cell populations containing Muse cells can be prepared from living tissue (eg, mesenchymal tissue) using cell surface markers SSEA-3 or SSEA-3 and CD-105 as indicators.
  • living body means a living body of a mammal. In the present invention, the living body does not include embryos whose developmental stage is earlier than the fertilized egg or blastocyst stage, but includes embryos in the developmental stage after the blastocyst stage including the fetus and blastocyst.
  • Mammals include, but are not limited to, primates such as humans and monkeys, rodents such as mice, rats, rabbits, guinea pigs, cats, dogs, sheep, pigs, cows, horses, donkeys, goats, ferrets, etc. It is done. Muse cells used in the cell preparation of the present invention are clearly distinguished from embryonic stem cells (ES cells) and iPS cells in that they are separated from living tissues with a marker directly. “Mesenchymal tissue” refers to tissues existing in various organs such as bone, synovium, fat, blood, bone marrow, skeletal muscle, dermis, ligament, tendon, dental pulp, umbilical cord, umbilical cord blood, amniotic membrane, etc. Say.
  • Muse cells can be obtained from bone marrow, skin, adipose tissue, blood, dental pulp, umbilical cord, umbilical cord blood, amniotic membrane, and the like. For example, it is preferable to collect a mesenchymal tissue of a living body, prepare a Muse cell from this tissue, and use it.
  • Muse cells may be prepared from cultured mesenchymal cells such as fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells using the above preparation means.
  • the cell population containing Muse cells used in the cell preparation of the present invention provides cells resistant to external stress by applying external stress stimulation to mesenchymal tissue or cultured mesenchymal cells in a living body. It can also be prepared by a method comprising recovering cells that have been selectively grown to increase their abundance.
  • the external stress includes protease treatment, culture at low oxygen concentration, culture under low phosphate conditions, culture at low serum concentration, culture under low nutrient conditions, culture under exposure to heat shock, low temperature Incubation in freezing, culture in the presence of harmful substances, culture in the presence of active oxygen, culture under mechanical stimulation, culture under shaking treatment, culture under pressure treatment or physical impact Any one or a plurality of combinations may be used.
  • the treatment time with the protease is preferably 0.5 to 36 hours in total to give external stress to the cells.
  • the protease concentration may be a concentration used when peeling cells adhered to the culture vessel, separating the cell mass into single cells, or collecting single cells from the tissue.
  • the protease is preferably a serine protease, aspartic protease, cysteine protease, metalloprotease, glutamic acid protease or N-terminal threonine protease. Further, the protease is preferably trypsin, collagenase or dispase.
  • the Muse cell used may be autologous to the recipient who receives the cell transplant, or may be allogeneic.
  • a Muse cell or a cell population containing a Muse cell can be prepared from a living tissue using, for example, SSEA-3 positive or double positive of SSEA-3 and CD-105 as an index.
  • the skin contains various types of stem cells and progenitor cells.
  • Muse cells are not the same as these cells.
  • Such stem cells and progenitor cells include skin-derived progenitor cells (SKP), neural crest stem cells (NCSC), melanoblast (MB), perivascular cells (PC), endothelial progenitor cells (EP), adipose-derived stem cells (ADSC). ).
  • Muse cells can be prepared using “non-expression” of a marker unique to these cells as an index.
  • Muse cells are CD34 (EP and ADSC markers), CD117 (c-kit) (MB markers), CD146 (PC and ADSC markers), CD271 (NGFR) (NCSC markers), NG2 (PC marker), vWF factor (von Willebrand factor) (EP marker), Sox10 (NCSC marker), Snai1 (SKP marker), Slug (SKP marker), Tyrp1 (MB marker), and At least one of 11 markers selected from the group consisting of Dct (MB marker), for example 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 The non-expression of individual or eleven markers can be separated into indicators.
  • non-expression of CD117 and CD146 can be used as an index
  • non-expression of CD117, CD146, NG2, CD34, vWF and CD271 can be used as an index
  • the non-expression of 11 markers can be prepared as an index.
  • the Muse cell having the above characteristics used in the cell preparation of the present invention is as follows: (I) low or no telomerase activity; (Ii) has the ability to differentiate into cells of any germ layer of the three germ layers; It may have at least one property selected from the group consisting of (iii) showing no neoplastic growth; and (iv) having a self-renewal capability.
  • the Muse cell used in the cell preparation of the present invention has all the above properties.
  • telomerase activity is low or absent means that, for example, when telomerase activity is detected using TRAPEZE XL telomerase detection kit (Millipore), it is low or cannot be detected.
  • “Low” telomerase activity means, for example, telomerase having a telomerase activity comparable to that of somatic human fibroblasts, or 1/5 or less, preferably 1/10 or less compared to Hela cells. It means having activity.
  • the Muse cell has the ability to differentiate into three germ layers (endoderm, mesodermal, and ectoderm) in vitro and in vivo, for example, induction culture in vitro Can differentiate into hepatocytes (including cells that express hepatoblasts or hepatocyte markers), neurons, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, bone cells, adipocytes, and the like.
  • Muse cells proliferate at a growth rate of about 1.3 days, but in suspension culture, they proliferate from one cell and grow in about 14 days when they form an embryoid body-like cell mass and reach a certain size.
  • a Muse cell has self-renewal (self-replication) ability.
  • self-renewal means that differentiation from cells contained in embryoid body-like cell clusters obtained by culturing in suspension culture from one Muse cell to trioderm cells can be confirmed, Bring the cells of embryoid body-like cell mass to suspension culture with one cell again to form the next generation embryoid body-like cell mass, from which again embryos in trioderm differentiation and suspension culture This means that a clot-like cell mass can be confirmed.
  • the self-renewal may be repeated once or multiple times.
  • the cell preparation of the present invention is not limited, but the Muse cell or the cell population containing Muse cell obtained in (1) above is treated with physiological saline or an appropriate buffer (for example, phosphorous). Acid buffered saline).
  • physiological saline or an appropriate buffer for example, phosphorous. Acid buffered saline.
  • the cells may be cultured before cell transplantation and grown until a predetermined number of cells is obtained.
  • International Publication No. WO2011 / 007900 pamphlet since Muse cells do not become tumors, even if cells collected from living tissue remain undifferentiated, they may become cancerous. Is low and safe.
  • the culture of the collected Muse cells is not particularly limited, but can be performed in a normal growth medium (for example, ⁇ -minimum essential medium ( ⁇ -MEM) containing 10% calf serum).
  • a normal growth medium for example, ⁇ -minimum essential medium ( ⁇ -MEM) containing 10% calf serum.
  • a medium, additives for example, antibiotics, serum
  • Muse cells at a predetermined concentration can be prepared.
  • bone marrow fluid is collected from the human iliac bone and, for example, bone marrow mesenchymal stem cells are cultured as adherent cells from the bone marrow fluid and an effective therapeutic amount of Muse.
  • the Muse cells can be separated using the SSEA-3 antigen marker as an indicator, and autologous or other Muse cells can be prepared as cell preparations.
  • the autologous or allogeneic Muse cells are transformed into cells. It can be prepared as a formulation.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • serum albumin etc.
  • other pharmaceutically acceptable ingredients for example, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspensions, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, etc.
  • You may make it contain in a cell formulation.
  • One skilled in the art can add these factors and agents to the cell preparation at appropriate concentrations.
  • Muse cells can also be used as pharmaceutical compositions containing various additives.
  • the number of Muse cells contained in the cell preparation prepared above takes into account the sex, age, weight, condition of affected area, condition of cells to be used, etc. so that the desired effect can be obtained in the treatment of vascular disorders. Thus, it can be adjusted as appropriate.
  • the target individuals include mammals such as humans, but are not limited thereto.
  • the cell preparation of the present invention can be used a plurality of times (for example, 2 to 10 times) at appropriate intervals (for example, twice a day, once a day, once a week) until a desired therapeutic effect is obtained. 2 times, once a week, once every two weeks, once a month, once every two months, once every three months, once every six months).
  • the therapeutically effective dose is preferably, for example, a dose of 1 ⁇ 10 3 cells to 1 ⁇ 10 10 cells once per individual, 1 to 10 times.
  • the total administration amount in one individual is not limited, but is 1 ⁇ 10 3 cells to 1 ⁇ 10 11 cells, preferably 1 ⁇ 10 4 cells to 1 ⁇ 10 10 cells, more preferably 1 ⁇ 10 5 cells to 1 ⁇ 10 6. 9 cells and the like can be mentioned.
  • Muse cells used in the cell preparation of the present invention have the property of migrating to and taking engraftment into damaged organs. Therefore, in the administration of the cell preparation, the administration site of the cell preparation and the type of blood vessel (vein and artery) to be administered are not limited.
  • the cell preparation of the present invention can repair and regenerate a blood vessel in which a disorder of a patient having a vascular disorder has occurred.
  • Example 1 Preparation of a mouse aneurysm model
  • the experimental protocol using mice in this example complies with the “Regulations for Animal Experiments, etc. of Tohoku University”, and experimental animals are supervised by the Animal Research Center of Tohoku University. In accordance with the regulations. More specifically, non-patent literature:-Bi Y, et al. PLoS ONE 2013. With reference to “Rabbit AAA Model via Periaortic CaCl 2 and Elastase Incubation”, it was prepared by the following procedure. Eight-week-old male SCID mice (CLEA Japan) were anesthetized by inhalation of isoflurane (induction: 4%, maintenance: 1-1.5%).
  • the abdomen was incised, and under the stereomicroscope (Leica MZ6), the region directly under the left renal vein to the aortic bifurcation was exfoliated all around.
  • the periphery of the exfoliated artery was covered with a piece of gauze (4 ⁇ 8 mm) soaked in an immersion solution (elastase: 0.5 unit / ⁇ L, CaCl 2 : physiological saline 50 ⁇ L containing 0.5 mol / L). After 20 minutes, the gauze was removed, and the portion was washed twice with physiological saline.
  • a control group (Sham group) was treated with a piece of gauze containing physiological saline.
  • the mouse thus prepared was used in the following experiment as a mouse aneurysm model.
  • Muse cells were obtained according to the method described in International Publication No. WO2011 / 007900 concerning the separation and identification of human Muse cells.
  • Commercially available mesenchymal stem cells (MSC, Lonza) were used as the source of Muse cells.
  • Muse cells used for transplantation express green fluorescent protein (GFP) in order to confirm that they have engrafted in aortic tissue, and the lentivirus-GFP gene is preliminarily placed in the Muse so that the cells are labeled with this. Introduced into cells. Muse cells labeled with GFP were separated by FACS as double positive cells of GFP and SSEA-3. The remaining cells obtained by separating Muse cells from MSC were used as non-Muse cells. GFP positive MSCs were also isolated by FACS and used as MSC group.
  • GFP green fluorescent protein
  • Example 3 Administration of each cell to mouse aneurysm model
  • the mouse aneurysm model prepared in Example 1 was divided into 4 groups. After the model was prepared, each of the 3rd day, 10th day, 17th day, Mice cells (2 ⁇ 10 4 , 200 ⁇ L) (M), non-Muse cells (2 ⁇ 10 4 , 200 ⁇ L) (N), MSC (2 ⁇ 10 4 , 200 ⁇ L) (MSC) or Vehicle (Phosphate buffer) (V) was administered into the tail vein.
  • Muse cells (2 ⁇ 10 4 cells, 200 ⁇ L) or non-Muse cells (2 ⁇ 10 4 cells, 200 ⁇ L) were administered once (M ′, N ′, respectively).
  • aneurysm non-production group was used as a Sham group (S) for comparison.
  • the number of animals in one group was 8 (11 in the 3-cell administration model in the Muse group and the non-Muse group, and 4 in the Sham group).
  • Example 4 Macroscopic observation of aneurysm
  • the animals were euthanized by the method of isoflurane oversedation and the aorta was visually observed.
  • FIG. 1 it was confirmed that in the Vehicle group, the artery was remarkably expanded and an aortic aneurysm was formed compared to the Sham group.
  • the Muse cell group the artery was hardly enlarged compared to the Vehicle group, and the appearance was similar to that of the Sham group.
  • the non-Muse cell group and the MSC group enlargement of the artery was observed although the degree was smaller than that in the Vehicle group.
  • Example 5 Measurement of aortic aneurysm diameter under a microscope
  • the aortic aneurysm diameter was measured using a digital camera for microscope (Leica MC120HD) under a stereo microscope (Leica MZ6).
  • the aneurysm diameter was evaluated by the ratio of (aneurysm diameter at dissection ⁇ aneurysm diameter before model preparation) / aneurysm diameter before model preparation).
  • FIG. 2 in the 3rd week (acute phase) after the model was prepared, the Muse cell group was statistically significantly smaller in diameter than the Vehicle group in both the three-time administration group and the single-administration group.
  • the non-Muse cell group and the MSC group there was no significant difference from the Vehicle group.
  • the Muse cell group was statistically significantly smaller in the three-time administration group and the single-administration group than the Vehicle group, but the non-Muse cell group In the MSC group and the Vehicle group, no significant difference was observed. As described above, it was shown that the diameter of the aneurysm is reduced by three or single administration of Muse cells.
  • Example 6 Time-lapse measurement of aneurysm diameter using ultrasound On 3, 10, 17, 24, 31, 38, 45, 52, and 59 days after cell administration, an ultrasonic diagnostic imaging apparatus for small animals (SonoScape S6V) was used. The aneurysm diameter was measured over time. As shown in FIG. 3, in the Muse cell administration group, the 3 times administration group and the single administration group showed a tendency that the diameter of the aneurysm was small after the 10th day. A significant difference was observed. On the other hand, there was no statistically significant difference between the non-Muse cell group or the MSC group and the vehicle group. As described above, it was shown that the diameter of the aneurysm is reduced by three or single administration of Muse cells.
  • Example 7 Histopathological evaluation of aortic elastic fibers
  • the aorta 3 or 8 weeks after model preparation was fixed with 4% paraformaldehyde (PFA), frozen sections were prepared, and observed after Elastica-Masson staining did.
  • PFA paraformaldehyde
  • FIG. 5 shows the elastic fiber (Elastin) area quantified by the ratio of the elastic fiber area and the total blood vessel wall cross-sectional area.
  • the elastic group was significantly reduced in the Vehicle group as compared to the Sham group.
  • the elastic fiber area was kept significantly larger in the three-time administration group and the single-administration group than in the Vehicle group. On the other hand, such an effect was not observed in the non-Muse cell group and the MSC group. Even at the 8th week after the cell administration, the elastic cell area was kept significantly larger in the Muse cell group than in the Vehicle group in both the 3 times administration group and the single administration group. On the other hand, such an effect was not observed in the non-Muse cell group and the MSC group. From the above, it was shown that the elastic fiber of the aorta is retained by Muse cell administration.
  • Example 8 Differentiation of Muse cells into vascular smooth muscles Differentiation of Muse cells into vascular smooth muscles was evaluated using aortic specimens at 3 weeks or 8 weeks after cell administration.
  • Mouse anti- ⁇ SMA antibody (Thermo, used at 200-fold dilution) and rabbit anti-GFP antibody (Abcam, used at 500-fold dilution) as a primary antibody, and 4% PFA-fixed aorta as a primary antibody, donkey anti-mouse IgG as a secondary antibody Staining was performed by an immunohistochemical technique using an antibody (manufactured by Life Technology, used at 500-fold dilution) or a donkey anti-rabbit IgG antibody (manufactured by Life Technology, used at 500-fold dilution).
  • vascular smooth muscles expressing ⁇ SMA stained red in cytoplasm As shown in the photograph on the left of FIG. 6, at 3 weeks after administration of Muse cells, vascular smooth muscles expressing ⁇ SMA stained red in cytoplasm, and Muse cells expressing GFP stained green in cytoplasm. As shown in Merge, cells in which both ⁇ SMA and GFP were stained were observed, and it was confirmed that the administered Muse cells differentiated into vascular smooth muscle.
  • the graph on the right side of FIG. 6 shows the number of ⁇ SMA / GFP co-positive cells per unit area in each group. In the group administered with Muse cells three times, the most common positive cells were observed at 3 weeks and 8 weeks after the administration of the cells, and co-positive cells were also observed in the single dose group. On the other hand, there were few co-positive cells in the non-Muse cell administration group and the MSC administration group.
  • Example 9 Differentiation of Muse Cells into Vascular Endothelial Cells Differentiation of Muse cells into vascular endothelial cells was evaluated using aortic specimens 3 or 8 weeks after cell administration. 4% PFA fixed aorta as primary antibody goat anti-CD31 antibody (manufactured by Santa Cruz, used at 50-fold dilution) or rabbit anti-GFP antibody (manufactured by abcam, used at 200-fold dilution), donkey anti-goat as secondary antibody IgG antibody (manufactured by Life Technology, used at 500-fold dilution) or donkey anti-rabbit IgG antibody (manufactured by Life Technology, used at 500-fold dilution) was used.
  • 4% PFA fixed aorta as primary antibody goat anti-CD31 antibody (manufactured by Santa Cruz, used at 50-fold dilution) or rabbit anti-GFP antibody (manufactured by abcam, used at 200-fold dilution),
  • vascular endothelial cells expressing CD31 stained red in cytoplasm As shown in the left photograph of FIG. 7, at 3 weeks after administration of Muse cells, vascular endothelial cells expressing CD31 stained red in cytoplasm, and Muse cells expressing GFP stained green in cytoplasm. As shown in Merge, cells in which both CD31 and GFP were stained were observed, confirming that the administered Muse cells differentiated into vascular endothelial cells.
  • the graph on the right side of FIG. 7 shows the number of CD31 / GFP co-positive cells per unit area. In the group administered with Muse cells three times, the most common positive cells were observed at 3 weeks and 8 weeks after the administration of the cells, and co-positive cells were also observed in the single dose group. On the other hand, there were few co-positive cells in the non-Muse cell administration group and the MSC administration group.
  • Example 10 Migration of macrophages into the aorta Detection of macrophages was attempted using aortic specimens 3 or 8 weeks after cell administration.
  • Rat anti-F4 / 80 antibody (AbD, used at 100-fold dilution) was used as the primary antibody, and goat anti-rat antibody (Life Technology, used at 500-fold dilution) was used as the secondary antibody.
  • FIG. 8 cells whose cytoplasm was stained red were identified as macrophages. In the Vehicle group, more macrophages were detected at 3 and 8 weeks than at the Sham group. In the 3 times administration group of Muse cells, the number of macrophages was small at 3 and 8 weeks, suggesting that inflammatory cell infiltration accompanying vascular injury was suppressed. In other cell administration groups, a decrease in the number of macrophages was also observed, although not as much as in the three administration groups of Muse cells.
  • Example 11 Confirmation of cell division of Muse cells It was evaluated whether Muse cells engrafted in the aorta were dividing using aortic specimens 3 or 8 weeks after cell administration.
  • Rabbit anti-Ki67 antibody manufactured by Thermo, used at 100-fold dilution
  • goat anti-GFP antibody abcam, used at 1000-fold dilution
  • donkey anti-rabbit antibody manufactured by Life Technology, Used at 500-fold dilution
  • donkey anti-goat antibody Life Technology, used at 500-fold dilution
  • the nucleus of the dividing cell was stained red, and the dividing Muse cell was stained red for the nucleus and green for the cytoplasm.
  • Approximately 8.5% of the Muse cells were dividing three weeks after the administration of the cells, indicating that some of the Muse cells engrafted in the tissue were proliferating by cell division.
  • Muse cells showing division decreased to about 2.1%, and it was shown that engrafted Muse cells gradually shifted to differentiation. This suggests that during the acute phase, Muse cells migrate, proliferate, and differentiate to exert a therapeutic effect, and then gradually stop proliferating to prevent canceration at the site of injury. .
  • Example 12 Distribution of Muse cells and non-Muse cells The distribution of Muse cells or non-Muse cells at 8 weeks after cell administration was examined by real-time PCR targeting an Alu sequence specific for human DNA. The results are shown in FIG. Muse cells were also found in the lung, but most were distributed in the aortic aneurysm site (Abd Ao).
  • Example 13 Analysis of differentiation ability of Muse cells into various vascular cells and stress resistance The differentiation ability of human Muse cells into various vascular cells and stress resistance were examined by marker expression analysis by quantitative PCR. As controls, endothelial progenitor cells (EPC) known to differentiate into endothelial cells, and CD34 + progenitor cells known to differentiate into endothelial cells and vascular smooth muscle cells (hematopoietic stem cells and vascular progenitor cells). Included). Muse cells were cultured in the presence of serum (3 days after surgery) derived from severe combined immunodeficiency (SCID) mice that induced aneurysms. The results are shown in FIG.
  • EPC endothelial progenitor cells
  • CD34 + progenitor cells known to differentiate into endothelial cells and vascular smooth muscle cells (hematopoietic stem cells and vascular progenitor cells). Included). Muse cells were cultured in the presence of serum (3 days after surgery) derived from severe combined immunodeficiency
  • FOXC1 expression was highest in Muse cells (p ⁇ 0.001 for EPC and CD34 + cells, respectively).
  • Expression of KLF2 and MEF2C in Muse cells was moderate.
  • ELK1, MYH10 and CAMK2 ⁇ markers of dedifferentiated vascular smooth muscle cells, was highest in Muse cells (p ⁇ 0.001 for EPC and CD34 + cells, respectively).
  • Muse cells have the ability to differentiate into endothelial cells and vascular smooth muscle cells and are resistant to high stress.
  • Example 14 Kinetic analysis of Muse cells in an in vitro aneurysm model
  • human Muse cells and aneurysm tissue were co-cultured.
  • immunization with a gauze containing a 0.5 mol / L CaCl 2 solution containing porcine pancreatic elastase (0.5 unit / ⁇ l) based on the method described in J Vasc Surg. 2015; 62: 1054-1063
  • a model of an abdominal aneurysm was prepared by wrapping and incubating the abdominal aorta of a deficient mouse (SCID) for about 20 minutes.
  • SCID deficient mouse
  • the aneurysm tissue was cut out, incised and expanded in the vertical direction, placed on the culture dish with the lumen side of the artery facing up, and 10,000 GFP + Muse cells were added.
  • Muse cells were localized only in the intima of the surface layer of the aneurysm wall, but in the 2nd and 3rd weeks, the Muse cells became arterial tissue. It has also been observed in the inner and outer layers of the inner and outer membrane layers.
  • Muse cells (GFP-labeled) in the intima were observed as positive cells of CD31 and CD34, which are markers of vascular endothelial cells.
  • Example 15 Kinetic analysis of Muse cells in an in vivo model
  • 20000 GFP + Muse cells were administered intravenously to an aneurysm model mouse and administered. From day 3 to day 5, mice were dissected and analyzed for the dynamics of Muse cell migration using a multiphoton laser microscope.
  • FIG. As shown in FIG.
  • GFP + Muse cells were detected only in the outer membrane of the vasculature on the third day, and some of them accumulated around the “vasa vasorum” in the outer membrane ( Arrow). On day 5, GFP + Muse cells still remained in the outer membrane but proliferated towards the media and the inner membrane. From these results, unlike in vitro models, Muse cells administered intravenously enter the aneurysm tissue not through the luminal side of the blood vessel but through the adventitious "blood vessel blood vessels” And it was suggested to migrate toward the intima side (FIG. 13B).
  • the cell preparation of the present invention can be applied to a patient with vascular disorder to reconstruct and repair the tissue at the site of injury and restore its function, and can be applied to the prevention and treatment of vascular disorder.

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Abstract

生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む、大動脈瘤などの血管障害を予防及び／又は治療するための細胞製剤。

Description

血管障害の予防又は治療剤
  本発明は、再生医療における細胞製剤に関する。より具体的には、障害が生じた血管の修復及び再生に有効な多能性幹細胞を含有する細胞製剤に関する。
  動脈瘤は動脈壁の弱くなった部分が膨らむ病態で、動脈が内膜・中膜・外膜の３層構造を保ったまま拡大する真性動脈瘤と、動脈壁の中膜が裂け動脈解離を来した後に拡大する解離性動脈瘤が知られている。これらの障害は直接死に繋がる危険のある疾患である。特に、大動脈瘤は、動脈硬化や高血圧による血管壁の障害が原因で生じると長年考えられてきたが、近年の研究により、血管壁、特に中膜、外膜に引き起こされる炎症、酸化ストレスなどもその要因であると考えられている（例えば、非特許文献１～３）。
  上記要因により、動脈壁へリンパ球、単球／マクロファージを中心とした炎症細胞が浸潤し、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMPｓ：Matrix metalloproteinases）などの各種タンパク質分解酵素が活性化される結果、中膜、外膜のエラスチン線維やコラーゲン線維からなる細胞外基質の分解・断裂が起こり、また同時に血管内皮細胞の減少及び機能障害、平滑筋細胞のアポトーシスなどにより大動脈壁の菲薄化・脆弱化を来し、不可逆的に拡張し瘤化するものと考えられている（例えば、非特許文献４～７）。
  また、大動脈解離も、動脈硬化や高血圧等によって生じた動脈壁の劣化を一因として大動脈壁内膜に亀裂を生じることにより、その裂け目に血流が流れ込み、中膜のレベルで真腔と偽腔の２腔に解離することにより生じる。慢性期には大動脈壁の脆弱性や背景とする動脈硬化の様々なリスク因子から，多くの症例で瘤化を来す。
  大動脈瘤は、動脈の破裂や解離が生じるまでは症状が現れず、定期健康診断や別の目的で行われた健診や画像診断で見いだされることが多い。通常、大動脈瘤の直径が約５センチメートル以上である場合は、動脈瘤を修復するため、手術により人工血管で置換されるか、ステントグラフト内挿術（鼠径部の小さな切開創から大動脈へ折り畳み式のグラフトを挿入する方法）を行うなどの治療が行われている。
  しかし、真性動脈瘤や解離性動脈瘤は早期に発見することは難しく、また、大動脈瘤も直径が約５センチメートル未満の場合破裂することはめったにないため、このような初期の病態の場合には、降圧剤を使用して心拍数と血圧を下げ、また禁煙する等により動脈瘤の進行や破裂のリスクを低減するための予防的な治療がなされているに過ぎない。
　したがって、真性動脈瘤や解離性動脈瘤、及びそれに繋がる血管障害の初期段階での血管再生等の根本的な治療が望まれている。
  近年、大動脈瘤においては、血管再生による根治を目的として、各種細胞による動脈瘤の治療が行われている。例えば、非特許文献８では、ラット異種移植モデルにおける血管平滑筋細胞を用いた血管内治療が開示され、経カテーテル的投与８週間で動脈瘤の縮小効果が見られたことが示されている。また、非特許文献９では、ラットエラスターゼ・モデルにおける組換えトロポエラスチン遺伝子を含むアデノウイルス・ベクターを用いた治療が開示され、エラスチン線維増生を伴う動脈瘤径の縮小が見られたことが示されている。さらに、非特許文献１０では、ラット異種移植モデルにおける内皮細胞を用いた治療が開示され、経カテーテル的投与８週間で動脈瘤の縮小効果が見られたことが示されている。しかしながら、これらはいずれも血管細胞の移植や遺伝子治療に関するものであり、その効果も十分なものではない。
  また、近年、自己増殖能と多分化能を有する間葉系幹細胞（MSC:mesenchymal stem cells）が、血管内皮細胞に分化するのみならず、血管内皮細胞成長因子（VEGF：vascular endothelial growth factor）を分泌することが見いだされ（例えば、非特許文献１１～１３）、間葉系幹細胞（MSC）を用いた再生医療による動脈瘤の治療も試みられている（例えば、非特許文献１４～１７）。しかしながら、MSCによる動脈瘤の再生医療による治療効果は、現在、まだ十分なものではなく、特に、少ない投与量で、障害部位の血管中膜等に当該MSCが侵入し、定着し、さらに当該障害部位で血管細胞に分化して、動脈瘤の血管再生による根本的な予防・治療を行うことができる方法が望まれている。
  一方、本発明者らの一人である出澤の研究により、間葉系細胞画分に存在し、遺伝子導入やサイトカイン等による誘導操作なしに得られる、ＳＳＥＡ－３（Ｓｔａｇｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ－３）を表面抗原として発現している多能性幹細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ；Ｍｕｓｅ細胞）が間葉系細胞画分の有する多能性を担っており、組織再生を目指した疾患治療に応用できる可能性があることが分かってきた（例えば、特許文献１；非特許文献１８～２０）。しかしながら、血管障害の予防及び／又は治療にＭｕｓｅ細胞を使用し、期待される治療効果が得られることを明らかにした例はない。
特許第5185443号明細書
Petersen E, et al. J Vasc Endovasc Surg 2000:457-461. Crowther M, et al. J Vasc Surg 2000:575-583. Freestone T, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1995:1145-1151. Traub O, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998:677-685. Visse R, et al. Circ Res 2003:827-39. Kazi M, et al. J Vasc Surg 2003:1283-1292. Fontain V, et al. Am J Pathol 2004:2077-2087. Allaire E, et al. Annals of Surgery 2004: 239(3): 417-427. Xiong J, et al. J Vasc Surg 2008: 48(4): 965-973 Franck G, et al. Circulation 2013: 127:1877-1887 Nagaya, N, et .al. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2004: 287(6), 2670-2676. Nagaya N, et. al. Circulation, 2005: 112, 1128-1135. Kagiwada H, et. al. J Tissue Eng Regen Med, 2008: 2(4), 184-189. Schneider F, et al. Eur J Vasc Endovasc Surg, 2013: 45(6):666-672 Hashizume R, et al. J Vasc Surg, 2011: 54(6):1743-1752 Fu X M, et al. J Transl Med, 2013: 11: 175. Yamawaki A, et al. Eur J Cardiothorac Surg, 2014: 45(5):e156-165. Kuroda Y et al. Proc Natl Acad Sci USA，2010: 107: 8639-8643. Wakao S et al. Proc Natl Acad Sci USA，2011: 108: 9875-9880. Kuroda Y et al. Nat Protc, 2013: 8: 1391-1415.
  本発明は、血管障害の予防及び／又は治療のための細胞製剤を提供することを目的とする。
  本発明者らは、ヒト細胞を拒絶しない免疫不全マウスの血管障害モデルにおいて、ヒトＭｕｓｅ細胞を血管等から投与、あるいは対象の血管障害部位及びその周辺に直接投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞が傷害された血管に集積・生着して障害血管を再建及び修復し、血管障害の改善又は回復をもたらすことを見出し、それにより、Ｍｕｓｅ細胞が大動脈瘤をはじめとした血管障害の治療や予防に好適に使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
  すなわち、本発明は、以下の通りである。
  ［１］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、血管障害を予防及び／又は治療するための細胞製剤。
　［２］血管障害が、動脈瘤である、［１］に記載の細胞製剤。
　［３］動脈瘤が、大動脈瘤である、［２］に記載の細胞製剤。
　［４］大動脈瘤が、腹部大動脈瘤又は胸部大動脈瘤である、［３］に記載の細胞製剤。
　［５］動脈瘤が、内臓器動脈瘤、末梢動脈瘤、脳動脈瘤又は冠動脈瘤である、［２］に記載の細胞製剤。
　［６］動脈瘤が、紡錘状動脈瘤又は嚢状動脈瘤である、［２］に記載の細胞製剤。
　［７］動脈瘤が、真性動脈瘤、解離性動脈瘤又は仮性動脈瘤である、［２］に記載の細胞製剤。
　［８］動脈瘤が、動脈硬化性動脈瘤、炎症性動脈瘤又は感染性動脈瘤である、［２］に記載の細胞製剤。
  ［９］前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、上記［１］～［８］のいずれかに記載の細胞製剤：
　（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
　（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
　（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
　（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
  ［１０］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞の有効量を、予防または治療を必要とする対象に投与する工程を含む、血管障害を予防及び／又は治療する方法。
  ［１１］血管障害を予防及び／又は治療するために使用される、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む細胞製剤。
  本発明では、血管障害を患っている対象に対し、Ｍｕｓｅ細胞を血管等から投与あるいは対象の血管障害部位及びその周辺に直接投与することにより、障害を有する血管を再建及び修復し、血管障害の機能を改善又は回復させることができる。本発明の細胞製剤は血管障害の急性期だけでなく、慢性期においても効果を発揮することができるので、長期にわたって治療効果を持続させることができる。
　Ｍｕｓｅ細胞は、障害を受けた血管へ効率的に遊走して生着することができ、生着した部位で血管細胞等の構成細胞へと自発的に分化するので移植に先立って治療対象細胞への分化誘導が不要である。また、非腫瘍形成性であり安全性にも優れる。さらに、Ｍｕｓｅ細胞は免疫拒絶を受けないことから、ドナーから製造された他家製剤による治療も可能である。従って、上記に示す優れた性能を有するＭｕｓｅ細胞によって、血管障害を有する患者の治療に対する容易に実行可能な手段を提供することができる。
図１は８週間後の各群のマウスから摘出された大動脈瘤の写真である。スケールバーは３ｍｍを示す。 図２は顕微鏡測定により３週間後及び８週間後の各群の大動脈瘤直径を測定した結果を示すグラフである。＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。 図３は各群のマウスの大動脈瘤の直径を超音波測定法により測定した結果を示すグラフである。縦軸は大動脈瘤径(mm)を示す。 図４は３週間後の各群のマウスの大動脈瘤組織のElastica-Masson染色の結果を示す顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍを示す。 図５は３週間後及び８週間後の各群において、弾性線維（Ｅｌａｓｔｉｎ）面積を、弾性線維面積と総血管壁断面積の比で定量化した結果を示すグラフである。＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。 図６の左図はＭｕｓｅ細胞投与３週間後におけるalpha-smooth muscle actin（αＳＭＡ）／ＧＦＰの免疫染色結果を示す顕微鏡写真（スケールバーは５０μｍを示す）であり、図６の右図は３週間後及び８週間後の各群のαＳＭＡ／ＧＦＰ両陽性細胞の単位面積当たりの数を示すグラフである。 図７の左図はＭｕｓｅ細胞投与３週間後におけるＣＤ３１／ＧＦＰの免疫染色結果を示す顕微鏡写真（スケールバーは５０μｍを示す）であり、図７の右図は３週間後及び８週間後の各群のＣＤ３１／ＧＦＰ両陽性細胞の単位面積当たりの数を示すグラフである。 図８の左図はＭｕｓｅ細胞投与３週間後におけるＦ４/８０の免疫染色結果を示す顕微鏡写真であり、図８の右図は３週間後及び８週間後の各群のＦ４/８０陽性細胞の単位面積当たりの数を示すグラフである。 図９の左図はＭｕｓｅ細胞投与３週間後におけるＫｉ６７／ＧＦＰの免疫染色結果を示す顕微鏡写真（スケールバーは５０μｍを示す）であり、図９の右図は３週間後及び８週間後のＭｕｓｅ細胞投与群のＫｉ６７陽性細胞の割合を示すグラフである。 図１０は８週間後のＭｕｓｅ細胞投与群及び非Ｍｕｓｅ細胞投与群の各臓器におけるＡｌｕ配列の検出結果を示すグラフである。非Ｍｕｓｅ細胞投与群の大動脈由来のＡｌｕ配列検出濃度を1としてその他の臓器及びＭｕｓｅ細胞投与群のそれぞれの値との比を表している。 図１１はヒトＭｕｓｅ細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、ＣＤ３４＋前駆細胞における、初期内皮細胞マーカー（Ａ～Ｃ）、脱分化平滑筋細胞マーカー（Ｄ～Ｆ）およびストレス耐性関連マーカー（Ｇ～Ｉ）の定量ＰＣＲによる発現解析の結果を示す図である。それぞれβアクチンの発現量で標準化した相対的発現量を示す。 図１２Ａは、Ｍｕｓｅ細胞と共培養されたマウス動脈瘤の代表的な多光子レーザー顕微鏡像を示す（写真）。左のカラムは、腔側から外側へ２０μｍごとにキャプチャーされた各軸方向の像（破線１～４）の位置を示す動脈サンプルの３次元再構成イメージを示す。スケールバーは１００μｍを示す。 図１２Ｂは、ＣＤ３１またはＣＤ３４で染色された凍結切片の代表的な矢状断面を示す（写真）。矢頭はＧＦＰと両陽性の細胞を示す。スケールバーは５０μｍを示す。 図１３Ａは、Ｍｕｓｅ細胞を投与したインビボ動脈瘤モデルにおいて、３日目及び５日目に得られた動脈瘤の代表的な多光子レーザー顕微鏡像を示す（写真）。左のカラムは、腔側から外側へ２０μｍごとにキャプチャーされた各軸方向の像（破線１～４）の位置を示す動脈サンプルの３次元再構成イメージを示す。スケールバーは１００μｍを示す。 図１３Ｂは、Ｍｕｓｅ細胞による動脈瘤治療の模式図を示す。
  本発明は、ＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む、血管障害を予防及び／又は治療するための細胞製剤に関する。本発明を以下に詳細に説明する。
１．適用疾患
  本発明のＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む細胞製剤は、血管障害の予防及び／又は治療に使用される。
  本発明において、「血管障害」とは、動脈硬化や高血圧により、又は血管壁、特に中膜、外膜に引き起こされた炎症、酸化ストレスなどにより生じ、また、まれに、刺傷、動脈壁への細菌や真菌の感染症などにより生じる血管の障害が挙げられ、具体的には、例えば、血管障害により動脈壁の弱くなった部分が膨らむ動脈瘤が挙げられる。
  また、本発明において、「血管障害」は、上記原因により動脈壁が弱くなり結果的に動脈瘤に至るものであるが、動脈瘤に至る前の初期段階の血管障害も含まれる。
  本発明において、動脈瘤とは、その発生部位による分類により、胸部大動脈瘤、腹部大動脈瘤、内臓器動脈瘤、末梢動脈瘤、脳動脈瘤、冠動脈瘤などが挙げられ、その形による分類により、紡錘状動脈瘤、嚢状動脈瘤などが挙げられ、その血管壁の状態による分類により、真性動脈瘤、解離性動脈瘤、仮性動脈瘤などが挙げられ、原因による分類により、動脈硬化性動脈瘤、炎症性動脈瘤、感染性動脈瘤などが挙げられる。
２．細胞製剤
（１）多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）
  本発明の細胞製剤に使用される多能性幹細胞は、本発明者らの一人である出澤が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞である。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ｏｇｕｒａ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．，Ｎｏｖ  ２０，２０１３（Ｅｐｕｂ）（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎ  Ｊａｎ  １７，２０１４））や皮膚の真皮結合組織等から得ることができるほか、広く組織や臓器の結合組織に存在することが知られている。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ－３（Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ－３）」陽性細胞、好ましくはＳＳＥＡ－３陽性かつＣＤ－１０５陽性の二重陽性細胞として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ－３単独又はＳＳＥＡ－３及びＣＤ－１０５の発現を指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｍｕｓｅ細胞が様々な外的ストレスに対する耐性が高いことを利用して、蛋白質分解酵素処理や、低酸素条件、低リン酸条件、低血清濃度、低栄養条件、熱ショックへの暴露、有害物質存在下、活性酸素存在下、機械的刺激下、圧力処理下など各種外的ストレス条件下での培養によりＭｕｓｅ細胞を選択的に濃縮することができる。なお、本明細書においては、血管障害を治療するための細胞製剤として、ＳＳＥＡ－３を指標として用いて、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から調製された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ－３陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Ｍｕｓｅ細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に含まれる細胞であって、「ＳＳＥＡ－３陽性細胞」以外の細胞を指すことがある。
  Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるＳＳＥＡ－３又はＳＳＥＡ－３及びＣＤ－１０５を指標として生体組織（例えば、間葉系組織）から調製することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、生体の組織から直接マーカーを持って分離される点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やｉＰＳ細胞と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯、臍帯血、羊膜などの組織及び各種臓器に存在する組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄や皮膚、脂肪組織、血液、歯髄、臍帯、臍帯血、羊膜などから得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を調製し、利用することが好ましい。また、上記調製手段を用いて、線維芽細胞や骨髄間葉系幹細胞などの培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を調製してもよい。
　また、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に外的ストレス刺激を与えることにより、該外的ストレスに耐性の細胞を選択的に増殖させてその存在比率を高めた細胞を回収することを含む方法によっても調製することができる。
　前記外的ストレスは、プロテアーゼ処理、低酸素濃度での培養、低リン酸条件下での培養、低血清濃度での培養、低栄養条件での培養、熱ショックへの暴露下での培養、低温での培養、凍結処理、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養、振とう処理下での培養、圧力処理下での培養又は物理的衝撃のいずれか又は複数の組み合わせであってもよい。
　前記プロテアーゼによる処理時間は、細胞に外的ストレスを与えるために合計０．５～３６時間行うことが好ましい。また、プロテアーゼ濃度は、培養容器に接着した細胞を剥がすとき、細胞塊を単一細胞にばらばらにするとき、又は組織から単一細胞を回収するときに用いられる濃度であればよい。
　前記プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ又はＮ末端スレオニンプロテアーゼであることが好ましい。更に、前記プロテアーゼがトリプシン、コラゲナーゼ又はジスパーゼであることが好ましい。
  なお、本発明の細胞製剤においては、使用されるＭｕｓｅ細胞は、細胞移植を受けるレシピエントに対して自家であってもよく、又は他家であってもよい。
  上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ－３陽性又はＳＳＥＡ－３及びＣＤ－１０５の二重陽性を指標にして生体組織から調製することができるが、ヒト成人皮膚には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と同じではない。このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を調製することができる。より具体的には、Ｍｕｓｅ細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に調製することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に調製することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に調製することができる。
  また、本発明の細胞製剤に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下： 
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。好ましくは、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。
　ここで、上記（ｉ）について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥ  ＸＬ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。
　上記（ｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、三胚葉（内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系）に分化する能力を有し、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、肝細胞（肝芽細胞又は肝細胞マーカーを発現する細胞を含む）、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、ｉｎ  ｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで傷害を受けた臓器（心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に遊走及び生着し、組織に応じた細胞に分化する能力を有する。
　上記（ｉｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、増殖速度約１．３日で増殖するが、浮遊培養では１細胞から増殖し、胚様体様細胞塊を作り一定の大きさになると１４日間程度で増殖が止まる、という性質を有するが、これらの胚様体様細胞塊を接着培養に移行すると、再び細胞増殖が開始され、細胞塊から増殖した細胞が約１．３日の増殖速度で広がっていく。さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。
　また、上記（ｉｖ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、１個のＭｕｓｅ細胞から浮遊培養で培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞から３胚葉性の細胞への分化が確認できると同時に、胚様体様細胞塊の細胞を再び１細胞で浮遊培養に持っていくことにより、次の世代の胚様体様細胞塊を形成させ、そこから再び３胚葉性の分化と浮遊培養での胚様体様細胞塊が確認できることをいう。セルフリニューアルは１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。
（２）細胞製剤の調製及び使用
  本発明の細胞製剤は、限定されないが、上記（１）で得られたＭｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。この場合、自家又は他家の組織から分離したＭｕｓｅ細胞数が少ない場合には、細胞移植前に細胞を培養して、所定の細胞数が得られるまで増殖させてもよい。なお、すでに報告されているように（国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレット）、Ｍｕｓｅ細胞は、腫瘍化しないため、生体組織から回収した細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。また、回収したＭｕｓｅ細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地（例えば、１０％仔牛血清を含むα－最少必須培地（α－ＭＥＭ）など）において行うことができる。より詳しくは、上記国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレットを参照して、Ｍｕｓｅ細胞の培養及び増殖において、適宜、培地、添加物（例えば、抗生物質、血清）等を選択し、所定濃度のＭｕｓｅ細胞を含む溶液を調製することができる。ヒト対象に本発明の細胞製剤を投与する場合には、ヒトの腸骨から骨髄液を採取し、例えば、骨髄液からの接着細胞として骨髄間葉系幹細胞を培養して有効な治療量のＭｕｓｅ細胞が得られる細胞量に達するまで増やした後、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ－３の抗原マーカーを指標として分離し、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。あるいは、例えば、骨髄液から得られた骨髄間葉系幹細胞を外的ストレス条件下で培養して有効な治療量に達するまでＭｕｓｅ細胞を増殖、濃縮した後、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。
  また、Ｍｕｓｅ細胞の細胞製剤への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を細胞製剤に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で細胞製剤に添加することができる。このように、Ｍｕｓｅ細胞は、各種添加物を含む医薬組成物として使用することも可能である。
  上記で調製される細胞製剤中に含有するＭｕｓｅ細胞数は、血管障害の治療において所望の効果が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。なお、対象とする個体はヒトなどの哺乳動物を含むがこれに限定されない。また、本発明の細胞製剤は、所望の治療効果が得られるまで、複数回（例えば、２～１０回）、適宜、間隔（例えば、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回）をおいて投与されてもよい。したがって、対象の状態にもよるが、治療上有効量としては、例えば、一個体あたり一回につき１×１０３細胞～１×１０１０細胞で１～１０回の投与量が好ましい。一個体における投与総量としては、限定されないが、１×１０３細胞～１×１０１１細胞、好ましくは１×１０４細胞～１×１０１０細胞、さらに好ましくは１×１０５細胞～１×１０９細胞などが挙げられる。
　本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、傷害を受けた臓器へと遊走し、生着する性質を有する。したがって、細胞製剤の投与において、細胞製剤の投与部位、投与される血管の種類（静脈及び動脈）は限定されない。
  本発明の細胞製剤は、血管障害を有する患者の障害が生じた血管の修復及び再生することができる。
  以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１：マウス動脈瘤モデルの作製
　本実施例におけるマウスを用いた実験プロトコールは、「国立大学法人東北大学動物実験等に関する規定」を遵守し、実験動物は、東北大学動物実験センターの監督下において該規定に沿って作製された。より具体的には、非特許文献：- Bi Y, et al. PLoS ONE 2013．“Rabbit AAA Model via Periaortic CaCl2 and Elastase Incubation”を参照し、以下の手順により作製した。
　８週齢の雄性ＳＣＩＤマウス（日本クレア）をイソフルランの吸入により麻酔（誘導時：4%、維持時：1-1.5%）した。腹部を切開し、実体顕微鏡（Leica MZ6）下で、左腎静脈直下から大動脈分岐部までを全周性に剥離した。１～２本の腰動脈分岐を認める場合には10-0ナイロン糸で結紮し切離した。剥離した動脈の周囲を浸漬溶液（エラスターゼ：0.5ユニット／μL、CaCl2：０．５ｍｏｌ／Ｌを含む生理食塩水５０μＬ）に浸漬したガーゼ片(4x8mm)で覆った。２０分後にガーゼを取り除きその部分を生理食塩水で２度洗浄した。対照群（Ｓｈａｍ群）には生理食塩水を含ませたガーゼ片により処置した。このようにして作製されたマウスをマウス動脈瘤モデルとして以下の実験に使用した。
実施例２：ヒトＭｕｓｅ細胞の調製
　ヒトＭｕｓｅ細胞の分離及び同定に関する国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に記載された方法に準じて、Ｍｕｓｅ細胞を得た。Ｍｕｓｅ細胞のソースとしては市販の間葉系幹細胞（ＭＳＣ、Lonza社）を用いた。移植に使用されるＭｕｓｅ細胞は、大動脈組織に生着したことを確認するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現し、細胞がこれにより標識されるように、予めレンチウイルス－ＧＦＰ遺伝子をＭｕｓｅ細胞に導入した。ＧＦＰで標識されたＭｕｓｅ細胞をＧＦＰとＳＳＥＡ－３の二重の陽性細胞としてＦＡＣＳにて分離した。またＭＳＣからＭｕｓｅ細胞を分離した残りの細胞を非Ｍｕｓｅ細胞として使用した。また、ＧＦＰ陽性ＭＳＣもＦＡＣＳにて単離し、ＭＳＣ群として使用した。
実施例３：マウス動脈瘤モデルへの各細胞投与
　実施例１で作製したマウス動脈瘤モデルを４群に分け、モデル作製後、３日目、１０日目、１７日目の３回にわたり、各群のマウスにＭｕｓｅ細胞（２×１０４個、２００μＬ）（M）、非Ｍｕｓｅ細胞（２×１０４個、２００μＬ）（N）、ＭＳＣ（２×１０４個、２００μＬ）（MSC）あるいはＶｅｈｉｃｌｅ（リン酸緩衝液）（V）を尾静脈内に投与した。またモデル作製後、３日目のみにＭｕｓｅ細胞（２×１０４個、２００μＬ）あるいは非Ｍｕｓｅ細胞（２×１０４個、２００μＬ）を単回投与する群（それぞれ、M’、N’）を設けた。さらに、動脈瘤非作製群をＳｈａｍ群（S）として用い比較した。一群の動物数は８匹とした(Ｍｕｓｅ群及び非Ｍｕｓｅ群の３回細胞投与モデルでは１１匹、Ｓｈａｍ群は４匹)。
実施例４：動脈瘤の肉眼的観察
　動脈瘤作製後８週の時点で動物をイソフルラン過鎮静の方法により安楽死させ、大動脈を肉眼的に観察した。図１に示す通り、Ｖｅｈｉｃｌｅ群ではＳｈａｍ群に比べて顕著に動脈が拡大しており大動脈瘤が形成されていることが確認された。Ｍｕｓｅ細胞群ではＶｅｈｉｃｌｅ群に比べて動脈はほとんど拡大しておらず、外観はＳｈａｍ群と類似していた。非Ｍｕｓｅ細胞群やＭＳＣ群ではＶｅｈｉｃｌｅ群よりも程度が軽いものの動脈の拡大が認められた。
実施例５：顕微鏡下での大動脈瘤径の測定
　実体顕微鏡（Leica MZ6）下に顕微鏡用デジタルカメラ(Leica MC120HD)を用いて大動脈瘤径を測定した。動脈瘤径は（解剖時の瘤径－モデル作製前の瘤径）／モデル作製前の瘤径）の比により評価した。図２に示すように、モデル作製後３週目（急性期）にはＭｕｓｅ細胞群は３回投与群、単回投与群ともＶｅｈｉｃｌｅ群に比べて統計学的に有意に瘤径が小さかった。一方、非Ｍｕｓｅ細胞群やＭＳＣ群ではＶｅｈｉｃｌｅ群との間に有意な差は認められなかった。モデル作製後８週目（慢性期）においても同様にＭｕｓｅ細胞群は３回投与群、単回投与群ともＶｅｈｉｃｌｅ群に比べて統計学的に有意に瘤径が小さかったが、非Ｍｕｓｅ細胞群やＭＳＣ群ではＶｅｈｉｃｌｅ群との間に有意な差は認められなかった。以上のように、Ｍｕｓｅ細胞の３回あるいは単回投与によって、動脈瘤径が縮小することが示された。
実施例６：超音波による動脈瘤径の経時的測定
　細胞投与後３、１０、１７、２４、３１、３８、４５、５２及び５９日に、小動物用超音波画像診断装置（SonoScape S6V）を用いて動脈瘤径を経時的に測定した。図３に示すように、Ｍｕｓｅ細胞投与群の３回投与群、単回投与群は１０日以降に動脈瘤径が小さい傾向を示し、２４日目および５２日目にはＶｅｈｉｃｌｅ群に比べて統計学的有意差が認められた。一方、非Ｍｕｓｅ細胞群やＭＳＣ群ではＶｅｈｉｃｌｅ群との間に統計学的な有意差は認められなかった。以上のように、Ｍｕｓｅ細胞の３回あるいは単回投与によって、動脈瘤径が縮小することが示された。
実施例７：大動脈弾性線維の病理組織学的評価
　モデル作製後３週あるいは８週の大動脈を４％パラホルムアルデヒド（Paraformaldehyde :ＰＦＡ）によって固定し、凍結切片を作製した後、Ｅｌａｓｔｉｃａ－Ｍａｓｓｏｎ染色後に観察した。図４に示すように、細胞投与後３週においてＭｕｓｅ細胞群では非Ｍｕｓｅ群やＭＳＣ群、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と比べて波状の弾性線維構造が保持される傾向にあった。弾性線維（Ｅｌａｓｔｉｎ）面積を、弾性線維面積と総血管壁断面積の比で定量化したものを図５に示す。細胞投与後３週目にはＶｅｈｉｃｌｅ群ではＳｈａｍ群と比べて有意に弾性線維面積の減少が認められた。Ｍｕｓｅ細胞群では３回投与群、単回投与群ともＶｅｈｉｃｌｅ群に比べて有意に弾性線維面積が大きく保たれていた。一方、非Ｍｕｓｅ細胞群やＭＳＣ群ではこのような効果は認められなかった。細胞投与後８週目においても、Ｍｕｓｅ細胞群では３回投与群、単回投与群ともＶｅｈｉｃｌｅ群に比べて有意に弾性線維面積が大きく保たれていた。一方、非Ｍｕｓｅ細胞群やＭＳＣ群ではこのような効果は認められなかった。以上のことから、Ｍｕｓｅ細胞投与によって大動脈の弾性線維が保持されることが示された。
実施例８：Ｍｕｓｅ細胞の血管平滑筋への分化
　細胞投与後３週あるいは８週の大動脈標本を用いてＭｕｓｅ細胞の血管平滑筋への分化を評価した。４％ＰＦＡ固定した大動脈を一次抗体としてマウス抗αＳＭＡ抗体（Thermo社製、２００倍希釈で使用）及びウサギ抗ＧＦＰ抗体（abcam社製、５００倍希釈で使用）、二次抗体としてロバ抗マウスＩｇＧ抗体（ライフテクノロジー社製、５００倍希釈で使用）あるいはロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（ライフテクノロジー社製、５００倍希釈で使用）を用いて免疫組織化学の手法で染色した。図６左の写真に示すように、Ｍｕｓｅ細胞投与後３週において、αＳＭＡを発現する血管平滑筋は細胞質が赤色に、ＧＦＰを発現するＭｕｓｅ細胞は細胞質が緑色に染色された。Ｍｅｒｇｅに示すようにαＳＭＡとＧＦＰの両方が染色される細胞が観察され、投与したMuse細胞が血管平滑筋に分化したことが確認された。図６右のグラフには各群における単位面積あたりのαＳＭＡ／ＧＦＰ共陽細胞数を示す。Ｍｕｓｅ細胞の３回投与群では細胞投与後３週および８週に共陽性細胞が最も多く観察され、単回投与群においても共陽性細胞が認められた。一方、非Ｍｕｓｅ細胞投与群やＭＳＣ投与群では共陽性細胞はわずかであった。
実施例９：Ｍｕｓｅ細胞の血管内皮細胞への分化
　細胞投与後３週あるいは８週の大動脈標本を用いてＭｕｓｅ細胞の血管内皮細胞への分化を評価した。４％ＰＦＡ固定した大動脈を一次抗体としてヤギ抗ＣＤ３１抗体（Santa Cruz社製、５０倍希釈で使用）あるいはウサギ抗GFP抗体（abcam社製、２００倍希釈で使用）、二次抗体としてロバ抗ヤギIgG抗体（ライフテクノロジー社製、５００倍希釈で使用）あるいはロバ抗ウサギIgG抗体（ライフテクノロジー社製、５００倍希釈で使用）を使用した。図７左の写真に示すように、Ｍｕｓｅ細胞投与後３週において、ＣＤ３１を発現する血管内皮細胞は細胞質が赤色に、ＧＦＰを発現するＭｕｓｅ細胞は細胞質が緑色に染色された。Ｍｅｒｇｅに示すようにＣＤ３１とＧＦＰの両方が染色される細胞が観察され、投与したＭｕｓｅ細胞が血管内皮細胞に分化したことが確認された。図７右のグラフには単位面積あたりのＣＤ３１／ＧＦＰ共陽細胞数を示す。Ｍｕｓｅ細胞の３回投与群では細胞投与後３週および８週に共陽性細胞が最も多く観察され、単回投与群においても共陽性細胞が認められた。一方、非Ｍｕｓｅ細胞投与群やＭＳＣ投与群では共陽性細胞はわずかであった。
実施例１０：大動脈へのマクロファージの遊走
　細胞投与後３週あるいは８週の大動脈標本を用いてマクロファージの検出を試みた。一次抗体としてラット抗Ｆ４／８０抗体（AbD社製、１００倍希釈で使用）、二次抗体としてはヤギ抗ラット抗体（ライフテクノロジー社製、５００倍希釈で使用）を使用した。図８に示すように細胞質が赤く染色される細胞をマクロファージと同定した。Ｖｅｈｉｃｌｅ群では３週および８週ともＳｈａｍ群に比べて多くのマクロファージが検出された。Ｍｕｓｅ細胞の３回投与群では３週および８週ともにマクロファージの数が少なく、血管傷害に伴う炎症性細胞浸潤が抑制されていることが示唆された。その他の細胞投与群においても、Ｍｕｓｅ細胞の３回投与群ほどではないがマクロファージ数の減少が認められた。
実施例１１：Ｍｕｓｅ細胞の細胞分裂の確認
　細胞投与後３週あるいは８週の大動脈標本を用いて大動脈に生着したＭｕｓｅ細胞が分裂しているかどうかを評価した。一次抗体としてウサギ抗Ｋｉ６７抗体（Thermo社製、１００倍希釈で使用）およびヤギ抗ＧＦＰ抗体（abcam社製、１０００倍希釈で使用）、二次抗体としてはロバ抗ウサギ抗体（ライフテクノロジー社製、５００倍希釈で使用）およびロバ抗ヤギ抗体（ライフテクノロジー社製、５００倍希釈で使用）を使用した。図９に示すように、細胞分裂している細胞は核が赤色に染色され、分裂しているＭｕｓｅ細胞は核が赤に、細胞質が緑色に染色された。細胞投与後３週には約８．５％のＭｕｓｅ細胞が分裂しており、組織に生着したＭｕｓｅ細胞の一部が細胞分裂により増殖していることが示された。一方、投与後８週には分裂を示すＭｕｓｅ細胞は約２．１％に減少しており、生着したＭｕｓｅ細胞は次第に分化にシフトすることが示された。このことは、急性期にはＭｕｓｅ細胞が遊走・増殖・分化して治療効果を発揮し、その後徐々に増殖が終了し、障害部位で癌化を生じないように働いていることが示唆された。
実施例１２：Ｍｕｓｅ細胞及び非Ｍｕｓｅ細胞の分布
　細胞投与後８週におけるＭｕｓｅ細胞又は非Ｍｕｓｅ細胞の分布を、ヒトＤＮＡに特異的なＡｌｕ配列を標的としたリアルタイムＰＣＲによって調べた。結果を図１０に示す。Ｍｕｓｅ細胞は肺にも見られたものの、大部分は大動脈瘤部位（Abd Ao）に分布していた。
実施例１３：Ｍｕｓｅ細胞の各種血管細胞への分化能およびストレス耐性の解析
　ヒトＭｕｓｅ細胞の各種血管細胞への分化能と、ストレス耐性について、定量ＰＣＲによるマーカー発現解析で調べた。対照として、内皮細胞に分化することが知られている内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、ならびに内皮細胞および血管平滑筋細胞に分化することが知られているＣＤ３４＋前駆細胞（造血幹細胞と血管前駆細胞を含む）を用いた。なお、Ｍｕｓｅ細胞は、動脈瘤を誘発した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス由来の血清（術後３日目）の存在下で培養した。
　結果を図１１に示す。
　上皮マーカーとしては、ＦＯＸＣ１の発現がＭｕｓｅ細胞において最も高かった（ＥＰＣおよびＣＤ３４＋細胞に対してそれぞれｐ＜０．００１）。一方、ＫＬＦ２の発現はＣＤ３４＋細胞で最も高く（ＥＰＣに対してｐ＜０．０１、Ｍｕｓｅに対してｐ＝０．３４）、ＭＥＦ２Ｃの発現もＣＤ３４＋細胞で最も高かった（ＥＰＣに対してｐ＜０．０１、Ｍｕｓｅに対してｐ＜０．００１）。Ｍｕｓｅ細胞におけるＫＬＦ２とＭＥＦ２Ｃの発現は中程度であった。
　脱分化血管平滑筋細胞のマーカーであるＥＬＫ１、ＭＹＨ１０およびＣＡＭＫ２δの発現はＭｕｓｅ細胞において最も高かった（ＥＰＣおよびＣＤ３４＋細胞に対してそれぞれｐ＜０．００１）。
　ストレス耐性に関わる因子であるＨＳＰＡ８、ＰＤＩＡ３およびＭＤＨ１の発現はＭｕｓｅ細胞において顕著に高かった（ＥＰＣおよびＣＤ３４＋細胞に対してそれぞれｐ＜０．００１）。
　これらの結果から、Ｍｕｓｅ細胞は内皮細胞および血管平滑筋細胞に分化する能力を有し、かつ高ストレス耐性であることが分かった。
実施例１４：インビトロ動脈瘤モデルでのＭｕｓｅ細胞の動態解析
　Ｍｕｓｅ細胞が動脈瘤の微小環境下で分化能を有するかを調べるため、ヒトＭｕｓｅ細胞と動脈瘤組織を共培養した。具体的には、J Vasc Surg. 2015;62:1054-1063に記載された方法に基づき、ブタ膵臓エラスターゼ（0.5unit/μl）を含む0.5 mol/LのＣａＣｌ２溶液を含ませたガーゼで免疫不全マウス(ＳＣＩＤ)の腹部大動脈を約２０分間包んでインキュベートすることで、腹部動脈瘤のモデルを作製した。動脈瘤組織を切り出して縦方向に切開・展開し動脈の内腔側を上に向けて培養皿に置き、１００００個のＧＦＰ＋Ｍｕｓｅ細胞を添加した。その結果、図１２Ａに示すように、７日目にはＭｕｓｅ細胞は動脈瘤壁の表層の内膜にしか局在しなかったが、２週目および３週目においては、Ｍｕｓｅ細胞は動脈組織内に侵入し、中膜と外膜層内層にも確認された。７日目の免疫染色においては、図１２Ｂに示すように、内膜におけるＭｕｓｅ細胞(ＧＦＰ標識されている)は血管内皮細胞のマーカーである、ＣＤ３１およびＣＤ３４陽性細胞として観察された。
実施例１５：インビボモデルでのＭｕｓｅ細胞の動態解析
　Ｍｕｓｅ細胞が動脈瘤組織に遊走し、結合するかどうかを調べるため、動脈瘤モデルマウスに２００００個のＧＦＰ＋Ｍｕｓｅ細胞を静脈から投与し、投与から３日目と５日目にマウスを解剖し、多光子レーザー顕微鏡にてＭｕｓｅ細胞遊走の動態を解析した。
　その結果、Ｍｕｓｅ細胞がまず動脈瘤の内腔側に生着し、徐々に中膜・外膜層まで深く浸透していく結果となった実施例１４のインビトロ共培養実験とは異なり、図１３Ａに示すように、３日目ではＧＦＰ＋Ｍｕｓｅ細胞は血管系の外膜でしか検出されず、その一部は、外膜にある「血管の栄養血管（vasa vasorum）」の周りに集積した（矢印）。５日目には、ＧＦＰ＋Ｍｕｓｅ細胞はまだ外膜にとどまっていたが、中膜及び内膜に向かって増殖した。これらの結果から、インビトロのモデルとは異なり、静脈から投与されたＭｕｓｅ細胞は血管の内腔側からではなく、外膜の「血管の栄養血管」を介して動脈瘤組織に侵入し、中膜および内膜側に向かって遊走することが示唆された（図１３Ｂ）。
  本発明の細胞製剤は、血管障害を有する患者に投与することにより、傷害部位において組織を再建及び修復し、機能を回復させることができ、血管障害の予防や治療に応用することができる。

Claims (11)

  1. 生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、血管障害を予防及び／又は治療するための細胞製剤。
  2. 血管障害が、動脈瘤である、請求項１に記載の細胞製剤。
  3. 動脈瘤が、大動脈瘤である、請求項２に記載の細胞製剤。
  4. 大動脈瘤が、腹部大動脈瘤又は胸部大動脈瘤である、請求項３に記載の細胞製剤。
  5. 動脈瘤が、内臓器動脈瘤、末梢動脈瘤、脳動脈瘤又は冠動脈瘤である、請求項２に記載の細胞製剤。
  6. 動脈瘤が、紡錘状動脈瘤又は嚢状動脈瘤である、請求項２に記載の細胞製剤。
  7. 動脈瘤が、真性動脈瘤、解離性動脈瘤又は仮性動脈瘤である、請求項２に記載の細胞製剤。
  8. 動脈瘤が、動脈硬化性動脈瘤、炎症性動脈瘤又は感染性動脈瘤である、請求項２に記載の細胞製剤。
  9. 前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、請求項１～８のいずれかに記載の細胞製剤：
    （ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
    （ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
    （ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
    （ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
  10. 生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞の有効量を、予防または治療を必要とする対象に投与する工程を含む、血管障害を予防及び／又は治療する方法。
  11. 血管障害を予防及び／又は治療するために使用される、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に由来するＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む細胞製剤。
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