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WO2018011315A1 - Biocapteur pour détecter la présence de bactéries - Google Patents

Biocapteur pour détecter la présence de bactéries Download PDF

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WO2018011315A1
WO2018011315A1 PCT/EP2017/067636 EP2017067636W WO2018011315A1 WO 2018011315 A1 WO2018011315 A1 WO 2018011315A1 EP 2017067636 W EP2017067636 W EP 2017067636W WO 2018011315 A1 WO2018011315 A1 WO 2018011315A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
aptamer
biological agent
biosensor
molecule
biosensor according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2017/067636
Other languages
English (en)
Inventor
Tatiana RABE RALAM
Arnaud VENA
Mamadou BALDE
Brice Sorli
Morgane NEDELEC
Héla BAHLOUL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Montpellier
AxLR SATT du Languedoc Roussillon SAS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Montpellier
AxLR SATT du Languedoc Roussillon SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Montpellier, AxLR SATT du Languedoc Roussillon SAS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to CA3030613A priority Critical patent/CA3030613A1/fr
Priority to AU2017297780A priority patent/AU2017297780A1/en
Priority to EP17743281.2A priority patent/EP3485279A1/fr
Priority to CN201780043723.1A priority patent/CN109564224A/zh
Priority to BR112019000617-6A priority patent/BR112019000617A2/pt
Priority to US16/317,149 priority patent/US11112408B2/en
Publication of WO2018011315A1 publication Critical patent/WO2018011315A1/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food

Definitions

  • the present invention relates to a biosensor for detecting the presence and / or measuring the concentration of at least one biological agent, in particular bacteria, as well as a method for analyzing the contamination with at least one biological agent in an environment employing said biosensor.
  • these devices require an incubation and culture time of the sample ranging from 24 to 48 hours, which delays the detection of the infection and therefore differs effective treatment of the patient with consequences that can be serious for this one.
  • these devices must be stored between 2 ° C and 8 ° C before use and can generally detect only one species of bacteria.
  • agri-food sector there are devices for detecting the presence of bacteria in food packaging, implementing a dynamic bar code, that is to say, capable of modifying in the presence of bacterial metabolites.
  • the documents US2002 / 0072079 and US2004 / 018641 disclose contamination detectors for identifying a contamination comprising: a first coded index to identify a product, a second index coded to identify a condition indicative of a contamination, an indicator of contamination associated with a first and a second bar code and means for changing the appearance of the indicator in the presence of a contamination condition, wherein the means for changing the appearance of the indicator modifies the appearance of the first and second coded index.
  • these documents do not report a color generation or a colorimetric change through the presence of a coloring molecule linked to an aptamer.
  • the devices of the state of the art do not make it possible to provide immediate information on the concentration of a biological agent in a sample, in particular they do not make it possible to determine whether the infectious dose is exceeded or not, namely if the sufficient amount of pathogen to cause disease is exceeded or not. There is therefore a need for a device to overcome the deficiencies of the bacterial detection devices of the state of the art.
  • the present invention thus aims to provide a device for detecting the presence and / or measuring the concentration of at least one biological agent that does not have the limits of the existing devices.
  • the present invention aims to provide a device for detecting the presence of at least one biological agent, and preferably several different biological agents, faster than the devices of the state of the art, or even so immediate.
  • the present invention also aims at providing a device making it possible to provide information on the concentration of at least one biological agent, and preferably several different biological agents, in a sample more rapidly than the devices of the state of the art, even immediately.
  • FIG. 1 illustrates the development of the biosensor according to the invention.
  • the biosensor - 2D dynamic barcode can detect 5 pathogens.
  • FIG. 3 illustrates the visual evolution of a 2D bar code by change of color tone before and after revelation of a target bacterium by a biosensor according to the invention (Example 4.1).
  • FIG. 4 illustrates the visual evolution of a 1D bar code by change of color tint before and after revelation of a target bacterium by a biosensor according to the invention (Example 4.2).
  • the present invention relates to a biosensor for detecting the presence and / or measuring the concentration of at least one biological agent, comprising a support on which is disposed a bar code of which at least one zone is functionalized by at least one an aptamer capable of selectively immobilizing said biological agent, said aptamer being itself bound, directly or indirectly, to a coloring molecule able either to produce color or to change color following the immobilization of the biological agent by said aptamer, optionally by flash activation as detailed further in the description.
  • the dye molecule is bound directly or not via a labile bond.
  • the operating principle of the device according to the invention is based on a colorimetric phenomenon, which makes it possible to signal the detection of the targeted biological agent in a simple, direct and immediate manner.
  • the device of the present invention is specific to at least one biological agent, that is to say that it detects only the biological agent (s) it is intended to detect, namely the targeted biological agent (s).
  • the surface of the device according to the invention comprises, according to a particular embodiment, a bar code of which at least one zone is capable of producing a color or of changing color after said zone has been brought into contact with the targeted biological agent and that it has been immobilized by the aptamers.
  • color generation or color change may be related to release by the biological agent of particular enzymes, caused by the biological agent-aptamer linkage.
  • this attack of particular enzymes may cause the breakdown of a labile bond present between the dye molecule and the aptamer.
  • this attack of particular enzymes can generate a color generation or a color change of the coloring molecule.
  • this attack of particular enzymes can be the source of these two phenomena at the same time, namely the breaking of a labile bond present between the coloring molecule and the aptamer and a color generation or a change of color. color of the coloring molecule.
  • the inventors have demonstrated that a dye-aptameric molecule linkage comprising a ⁇ -lactam unit was deteriorated as a result of release of ⁇ -lactamase following the immobilization of two types of bacteria (see FIG. implementation in Example 3) on the aptamer, causing the release of the coloring molecule and therefore allowing a color generation and the formation of a 2D bar code indicating the presence of the corresponding bacteria.
  • the surface of the device according to the invention comprises a bar code of which at least one zone is capable of releasing a coloring molecule when said zone comes into contact with the targeted biological agent and the latter is immobilized by the aptamers.
  • Another variant based on the same principle, makes it possible to replace the antibiotic molecule with another type of molecule, capable of being attacked by different enzymes.
  • the lactose / ⁇ -galactosidase pair may be mentioned, within which ⁇ -galactosidase may be secreted, in particular by E. coli.
  • a-amylase a fungal enzyme, produced in particular by Thermomyces lanuginosus, capable of attacking polysaccharides, in particular to make them fermentable.
  • the inventors have also illustrated in the examples the variant according to which the coloring molecule is not released but is capable of generating a color or a color change of said coloring molecule following the immobilization of a bacterium on the aptamer ( Examples 4 and 5).
  • Dye molecule-aptamer bond
  • the coloring molecule may, for example, be released after the biological agent has been immobilized by the aptamer.
  • the coloring molecule is connected to the aptamer, for example via a second spacer as will be detailed hereinafter, and the coloring molecule can be attached to this second spacer by means of a labile bond.
  • the coloring molecule may not be released after the biological agent has been immobilized by the aptamer but may, however, change color after the biological agent has been immobilized by aptamer.
  • the bond between the dye molecule and the aptamer may not comprise a labile bond or a spacer.
  • the coloring molecule belongs to the family of antibiotics.
  • the detection principle of this invention is based on a color change resulting from an inducible chain reaction. Indeed, in the case of a health application for the detection of nosocomial diseases and if the biological sample to be tested contains the target bacterium (s), the aptamer recognizes the biological agent and immobilizes it. .
  • the bacterium is then brought into contact with the antibiotic molecule bound to the 3 'end of the aptamer. Following this contact and if the bacterium is resistant to the antibiotic used (family of cephalosporins, penicillins for example), it produces enzymes for example ⁇ -lactamases that are able to attack the antibiotic.
  • the antibiotic used family of cephalosporins, penicillins for example
  • ⁇ -lactam antibiotics ie containing a ⁇ -lactam nucleus
  • penicillin derivatives penames
  • cephalosporin derivatives cephems
  • oxapenems oxapenems
  • monobactams carbapenems.
  • the colorimetric reaction may in particular generate luminescence, for example fluorescence.
  • the present invention thus relates, according to a particular embodiment, to a biosensor for detecting the presence and / or measuring the concentration of at least one biological agent, comprising a support on which is disposed a bar code of which at least one zone is functionalized by at least one aptamer capable of selectively immobilizing said biological agent, said aptamer being itself bound, directly or indirectly, to a coloring molecule via a labile chemical bond which is capable of breaking upon immobilization of the biological agent by said aptamer, and said coloring molecule being non-luminescent in aptamer-bound and luminescent form, preferably fluorescent, in non-aptamer-bound form.
  • biosensor as defined above, wherein the dye molecule is covalently bonded to the aptamer via a second spacer, said second spacer being linked to the dye molecule by a chemical bond labile which is capable of breaking following the immobilization of the biological agent by the aptamer, for example a labile chemical bond capable of breaking in the presence of a ⁇ -lactamase.
  • a chemical bond labile which is capable of breaking following the immobilization of the biological agent by the aptamer, for example a labile chemical bond capable of breaking in the presence of a ⁇ -lactamase.
  • the coloring molecule is an antibiotic covalently linked to the aptamer, said coloring molecule being capable of producing a color or changing color. immobilization of the biological agent by the aptamer, for example said chemical molecule comprising a chromogenic antibiotic.
  • Aptamer / biological agent for example said chemical molecule comprising a chromogenic antibiotic.
  • aptamer is intended to mean a synthetic oligonucleotide capable of selectively binding a ligand contained in the targeted biological agent (typically present on the surface of the targeted biological agent) or secreted or excreted by said targeted oligonucleotide.
  • agent that is to say the biological agent that is to be detected using the biosensor of the invention.
  • Aptamers are generally synthetic compounds, isolated in vitro from combinatorial libraries of a large number of random sequence compounds by an iterative selection method called SELEX.
  • One of the advantages of the device of the invention is that it makes it possible to detect any biological agent, as long as there is an aptamer specific to said biological agent.
  • the device is based on a specificity at the level of the biologic agent / aptamer pair.
  • the biological agent is typically selected from the group consisting of bacteria, prions, viruses, mycotoxins and peptides.
  • the biological agent is a bacterium and the aptamer is capable of selectively fixing at least one membrane protein of said bacterium, chosen for example from lipopolysaccharides (LPS) and peptidoglycans (PPG).
  • LPS lipopolysaccharides
  • PPG peptidoglycans
  • the device of the invention is particularly adapted to the detection of nosocomial infections in the hospital environment, or to the detection of bacterial contaminations in the agrifood environment, detection of pathogen in water in the distribution networks. drinking water, rivers, lakes or even swimming pools.
  • the biological agent is a bacterium selected from the group consisting of Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Salmonella gastroenteretis, Listeria monocytogenes and Legionella spp.
  • the present invention can advantageously take advantage of the presence of an antibiotic molecule in the device, generating the secretion of enzymes by the bacterium, the secretion of said enzymes allowing, directly or indirectly the generation of a color or a color change via the coloring molecule.
  • the antibiotic molecule is included in a spacer between the aptamer and the coloring molecule or "second spacer" in the context of the present invention.
  • a labile chemical bond is between the spacer and the coloring molecule.
  • the attack of the enzyme secreted from the chemical bond between the aptamer and the coloring molecule causes the release of the coloring molecule, generating a color or causing a color change.
  • the coloring molecule comprises or consists of a color-changing antibiotic molecule, or chromogenic antibiotic, following the attack of the enzymes from the target bacterium captured by the biosensor according to the invention.
  • the aptamers used in the device of the invention can be of any kind, as long as they are capable of selectively immobilizing the biological agent that it is desired to detect, that they can be fixed on the support of the device, for example via a first spacer, and that they can be linked to a coloring molecule, for example via a second spacer.
  • a labile bond may be between the dye molecule and the aptamer, in particular between the second spacer, itself comprising an antibiotic molecule, and the dye molecule.
  • a labile bond may not be between the dye molecule and the aptamer in the case where the dye molecule belongs to the family of antibiotics and is capable of generating color or cause a color change or chromogenic antibiotic.
  • the coloring molecule can be directly linked to the aptamer, without requiring the presence of a second spacer.
  • the aptamer is a strand of RNA or DNA. It can also be a peptide.
  • the aptamer is modified on its 3 'end, in particular to carry a -COOH function.
  • the aptamer is modified on its 5 'end, in particular to carry a function -NH 2 .
  • This modification makes it possible to fix the aptamer on the support of the device in an easy manner, that is to say with usual grafting techniques on a support.
  • the aptamer can thus be covalently linked to the barcode area via a first spacer.
  • said first spacer may have the formula -S- (CH 2 ) n -C (O) - where n is an integer of 2 to 6 and in which the sulfur atom is bonded covalent to the support and the C (O) group carbon atom is covalently bonded to a nitrogen atom of the aptamer.
  • the aptamer-support linkage may be carried out by silane (OH-Silane-NH 2 ), for example TPM, by a heterobifunctional linker (SH-hetero-NH 2 -Hetero), for example the SMCC or again by UV.
  • silane OH-Silane-NH 2
  • SH-hetero-NH 2 -Hetero a heterobifunctional linker
  • the choice molecule (s) must contain a head group ("head group”) having a high affinity with the hydroxyl end of the substrate thus allowing the anchoring of the molecule on its surface, and an end group (“terminal group”) that interacts with the 5 'NH 2 end of the aptamer.
  • head group a head group having a high affinity with the hydroxyl end of the substrate thus allowing the anchoring of the molecule on its surface
  • terminal group an end group that interacts with the 5 'NH 2 end of the aptamer.
  • organosilanes There are different families of molecules whose properties correspond to those previously mentioned such as organosilanes, thiols, phosphonates.
  • organosilane 3- (trimethoxysilyl) propyl methacrylate (TPM) (PubChem, D: 17318).
  • the head group of TPM "RO-Si” reacts, then, with the hydroxyl end (OH) of the substrate.
  • This so-called hetero-condensation reaction results in the formation of a covalent bond of O-Si-R 'type where R' represents the end group which, in fine, interacts with the 5 'NH 2 end of the aptamer .
  • Another type of agent is of hetero-bifunctional linker types. These are the most remarkable and useful protein conjugation reagents because they have two distinct reactive groups. They have the distinction of having different reactive groups at the ends.
  • N-Succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] -propionate (SPDP) or Succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) (PubChem ID: 125,175).
  • the SMCC reacts via its maleimide group which is a reactive sulfhydryl (thioi -SH) group and its NUS end which is amino-reactive (NH 2 ) thereby forming stable covalent bonds.
  • linkers Other molecules belonging to this family of "linkers” can be used provided they have the same groups at the ends, according to techniques well known to those skilled in the art. This type of grafting can be carried out using techniques known to those skilled in the art, as described in the examples detailed below.
  • the device of the invention can in particular implement couples aptamer / biological agent according to databases well known to those skilled in the art.
  • couples aptamer / biological agent according to databases well known to those skilled in the art.
  • the coloring molecule signals the detection of the targeted biological agent, for example by the release of said coloring molecule, as described above in connection with one of the particular embodiments of the invention.
  • the term "coloring molecule” means any molecule capable of either producing a color or causing a color change following a stimulus in its environment. Said stimulus is advantageously represented in the context of the present invention by the immobilization of the biological agent by the aptamer. However, the color generation or the color change can be indirectly caused by this immobilization as explained above. In other words, the present invention also includes the cases where chain reactions occur from this immobilization, at least one of which causes this generation of color or color change via the coloring molecule. The nature of the coloring molecule is detailed below.
  • color generation is meant in the context of the present invention the appearance of a color with respect to the color present in the same zone, before contacting the biological agent with the biosensor according to the invention , determined with respect to a given colorimetric system.
  • color change is meant in the context of the present invention a color change with respect to the color present in the same zone, before contacting the biological agent with the biosensor according to the invention, determined by relative to a given color system.
  • This color change also includes a change of contrast. Therefore, the coloring molecule should be chosen so that said change after the immobilization of the biological agent on the aptamers causes a colorimetric shift or minimum color shift so that it is detectable by an appropriate reading means.
  • color change includes the production of luminescence, as will be discussed below.
  • RGB model As a colorimetric system that can be used in the context of the present invention, mention may in particular be made of the RGB model.
  • the RGB model is based on three primary colors that by their mixtures will reproduce all the others (256 levels on each channel).
  • TSL ancronym of Hue, Saturation, Luminosity
  • TSV hue, saturation, value
  • colorimetric system is understood to mean not only the trichromatic spaces, since the invention also relates to detection by monochromatic or bichromatic color change, including in the shades of white to black.
  • This embodiment may in particular correspond to an application in which the bar code is a 1D or 2D bar code.
  • a second spacer is bound in 3 'of the aptamer and is also linked to a luminescent dye, more particularly photo-activatable.
  • This dye makes it possible, after its excitation according to a specific wavelength, to read the detection result.
  • the aptamer recognizes the biological agent that immobilizes .
  • the bacterium is brought into contact with the antibiotic molecule bound to the 3 'end of the aptamer.
  • the bacterium is resistant to the antibiotic used eg cephalosporin family or penicillins, it produces enzymes for example ⁇ -lactamases which attack the antibiotic, for example the ⁇ -lactam nucleus. it induces the cutting of the linkage between the end of the antibiotic and that of the dye causing the release of the dye.
  • This dye is excited at a specific wavelength by a mobile phone flash thus allowing the appearance of the luminescence of the initially colorless dye.
  • the use of a non-chromogenic antibiotic is preferred.
  • the dye molecule is a chemical molecule and is not an antibody.
  • Non-luminescent dye molecules that may especially be mentioned include chromogenic antibiotics of the cephalosporin family, for example nitrocele, and penicillins.
  • the dye molecule is non-luminescent in its aptamer-linked form and luminescent, preferably fluorescent, in its non-aptamer-bound form.
  • luminescent coloring molecule and in particular a fluorescent dye, mention may be made especially of 5-FAM, 6-FAM, ATTO type dyes, in particular ⁇ 532 or ATTO 550, ATTO 647, DY-510XL , the DY-530, the HEX, the Orange Fluorine CAL 560, and in particular the ATTO, as implemented in the examples.
  • the coloring molecule is luminescent and even more particularly fluorescent
  • the coloring molecule is not luminescent when it is still bound to the aptamer, which means that the zone of the device which is functionalized with the aptamer does not generate any colorimetric phenomenon if it is not in the presence of the targeted biological agent.
  • This operation ensures the direct and instantaneous detection of the targeted biological agent.
  • such a luminescent dye molecule has a luminescent absorption band of 600 nm to 700 nm, preferably 640 nm to 670 nm. nm, and a luminescent emission band of 600 nm to 700 nm, preferably 665 nm to 675 nm or a minimum color shift for detection.
  • a reading means can be mentioned in particular a camera or a camera or a photosensitive sensor type CCD or CMOS. This last type of sensor combines the three primary RGB colors to create a color image by additive synthesis.
  • the dye molecule as described above may be linked to the aptamer by different types of spacer as previously discussed or linked directly to the aptamer when the dye molecule comprises the antibiotic.
  • the coloring molecule can be connected to the aptamer via a second spacer.
  • this second spacer may comprise at least one labile bond so as to release the coloring molecule which can thus cause a color generation or a change of color once free.
  • the release of the coloring molecule can be triggered by various mechanisms.
  • the biological agent is a bacterium producing a ⁇ -lactamase type enzyme and that the coloring molecule comprises a nucleus sensitive to the production of this enzyme, as described above, the labile bond is between the molecule dye and antibiotic.
  • the second spacer is connected to the dye molecule by a labile bond. It is advantageously formed at least in part by an antibiotic molecule causing the formation of an enzyme precisely capable of attacking said antibiotic molecule, and in particular the ⁇ -lactam nucleus. It is this particular embodiment which is illustrated in the examples, by implementing a second spacer comprising cephalosporin.
  • an aptamer-[cephalosporin] - [ATTO] complex is formed which can be grafted onto a support to give the desired biocapor, allowing the detection of specific bacteria.
  • an aptamer-[cephalosporin] - [ATTO] complex an aptamer-cephalosporin-ATT0647 sequence is shown below in Scheme 1.
  • the labile bond is advantageously between the coloring molecule and the second spacer. It is defined in the context of the present invention as being a bond that can be broken following the attack of the spacer arm by the enzyme secreted by the biological agent and in particular the bacterium, and more particularly the ⁇ -lactam nucleus. included in the antibiotic molecule included in the second spacer arm.
  • the biological agent and for example the targeted bacterium, is brought into contact with the second spacer ensuring the connection with the dye molecule, for example linked 3 'or 5' to the aptamer.
  • the bacterium is resistant to the antibiotic molecule used, it produces enzymes capable of attacking at least one bond between the aptamer and the coloring molecule.
  • it is a bacterium producing ⁇ -lactamases by reaction to an antibiotic action, it attacks the ⁇ -lactam motif present in the cephalosporin included in the second spacer.
  • the detectable change may be manifested by color generation or color change. This manifestation may be due to the breaking of the labile bond. The coloring molecule, thus released, allows the reading of the result. Whatever the nature of the dye or the antibiotic, the chain reaction results in color changes, which can be transcribed for example on a dynamic barcode.
  • a preferred mode of release of the invention is based on the antibiotic resistance of bacteria, in particular on resistance to antibiotics ⁇ -lactam type.
  • Bacteria resistant to ⁇ -lactam antibiotics have the ability to release ⁇ -lactamase when they are in the presence of said antibiotics, which alters the structure of these antibiotics and makes them inoperative.
  • the second spacer is a divalent radical comprising a ⁇ -lactam unit, for example a cephalosporin unit.
  • the immobilization of the biological agent, and in particular of a bacterium, on the aptamers results, following a chain reaction, in the breaking of a labile bond which connects the aptamer to a coloring molecule. It is the release of this coloring molecule, which was not luminescent in its aptamer-bound form but becomes luminescent, preferably fluorescent, when released, which causes the colorimetric phenomenon, which appears only in an area. corresponding to the area functionalized by the aptamer.
  • the concentration of biological agent in the controlled sample is greater than an amount corresponding to a specific infectious dose.
  • Another advantage of the present invention is that the same reading method can be maintained between pre-immobilization and post-immobilization of the biological agent on the biosensor.
  • the device or biosensor of the present invention thus makes it possible to detect the presence and / or measure the concentration of at least one biological agent in real time, that is to say without prior incubation of the sample to be tested and without treatment. beforehand, such as lysis in the case of bacteria.
  • biological agents such as bacteria can be identified before they are incubated and / or proliferated and can be treated with the appropriate treatments.
  • the device or biosensor of the present invention has the advantage of not requiring specific storage temperature.
  • the device of the present invention is thermally stable at a temperature between -20 ° C to 80 ° C, preferably between 0 ° C and 40 ° C.
  • the device of the invention has the advantage of being implemented on a wide variety of media, whether rigid or flexible.
  • the support may be a flexible or rigid support, on which the bar code is arranged.
  • the support is a flexible support, preferably a support of paper or plastic coated with alumina, paper or plastic.
  • plastic material mention may be made especially of polypropylene or microporous polyethylene as sold under the name Teslin by PPG Industries.
  • Such supports Teslin may in particular have a thickness between 150 ⁇ and 450 ⁇ .
  • Polypropylene can be hard or semi-rigid.
  • the support is a rigid support, for example glass.
  • the support is coated with a layer of alumina on which is disposed the bar code.
  • alumina layer may be carried out by any technique known to those skilled in the art, such as that described in the examples below.
  • the thickness of the alumina layer typically varies from 500 nm to 10 ⁇ and is for example 1 ⁇ .
  • the use of the alumina layer still has the following advantages: the alumina layer has a thermal stability, so that it does not require any specific storage after its manufacture,
  • the manufacturing cost of the alumina layer is relatively low.
  • the device of the invention has the advantage of being implemented with a wide variety of bar codes, whether they are 1 or 2 dimensions.
  • one or more areas of the bar code may be functionalized with one or more different aptamers, in order to detect one or more different biological agents.
  • FIGS. 3 and 4 illustrate the use as described in Example 4 of the 1D and 2D bar code, in the case of a chromogenic antibiotic type dye molecule, the nitrocele, which changes from yellow in the absence of ⁇ - lactamase red in the presence of ⁇ -lactamase.
  • the bar code is a one-dimensional bar code composed of an assembly of parallel black and white stripes in which at least one area of at least one white strip or one black band is functionalized by at least one aptamer.
  • the entirety of at least one white band is functionalized by at least one aptamer.
  • two, three, four, or even five or more white bands may be functionalized with different aptamers, so as to detect two, three, four, or even five different biological agents or more.
  • the bar code is a 2-dimensional bar code composed of an assembly of black pixels and white pixels, in which at least one white pixel or at least one black pixel is functionalized by at least one pixel. less an aptamer.
  • This type of barcode has the advantage of containing more information, such as the identification of bacteria, the localization of infectious foci, the antibiogram corresponding to each type of bacteria and the estimate of the quantity present (superior or less than the infectious dose).
  • two, three, four, or even five or more white pixels may be functionalized with different aptamers, so as to detect two, three, four, or even five different biological agents, or more.
  • the device of the present invention can be manufactured by techniques generating low production costs.
  • the device of the present invention can be easily miniaturized and can be made to be disposable and thus destroyed after use.
  • This process comprises the following steps: preparation of the support, for example comprising the coating with a layer of alumina, followed by the possible activation of the alumina layer to allow the grafting of the aptamers, then grafting the aptamer-dye molecule complex on the support, such as activated alumina or grafting of the aptamer on the support such as activated alumina followed by the grafting of the dye molecule on the aptamer thus grafted.
  • This method can be implemented to functionalize a predetermined zone of a barcode, as illustrated in the examples detailed below, in order to prepare a biosensor according to the invention.
  • the present invention relates to a method for analyzing contamination with at least one biological agent in an environment, comprising at least the steps of:
  • biosensor placing the biosensor in the presence of the environment to be analyzed, under conditions conducive to the immobilization of the biological agent (s) possibly present in said environment by the aptamers of the biosensor,
  • environment to be analyzed is meant the medium in which it is desired to detect the presence of the targeted biological agent.
  • the device of the invention is typically implemented from body fluids such as primarily sweat, urine, saliva or blood.
  • body fluids such as primarily sweat, urine, saliva or blood.
  • the device of the invention is not necessarily invasive since it can be implemented on a sample other than blood.
  • the environment to be analyzed may therefore be a sample of body fluids of a patient such as blood, sweat, urine, or saliva.
  • a bacterial contamination in an agri-food product it may be the gaseous atmosphere contained in a food packaging or a sample taken from or in the food product, such as wine or beer.
  • the biosensor When placing the biosensor in the presence of the environment to be analyzed, it is ensured that the conditions are conducive to the immobilization of the biological agent (s) possibly present in said environment by the aptamers of the biosensor.
  • the use of the biosensor can be carried out at room temperature. Responses are typically obtained in less than 15 to 20 minutes.
  • the next step is thus to acquire the information coded by the bar code either directly by reading the bar code after reaction in the case of a colorimetric reaction or by exciting the coloring molecule at a wavelength suitable for a luminescent molecule.
  • the following step therefore consists in reading the biosensor thus coated, under illumination conditions that are conducive to the luminescence of the coloring molecule in its form not bound to the aptamer, of in order to acquire the information coded by the barcode of the biosensor thus coated.
  • the luminescence of the coloring molecule is detectable only under greater illumination than daylight or artificial indoor lighting.
  • the luminescence of the coloring molecule is typically activated by means of a flash, typically a camera or cell phone flash.
  • a flash typically a camera or cell phone flash.
  • the device of the present invention is therefore easily implemented, that is to say that it does not require any particular analysis technique: a simple control using a flash and a camera or a camera is sufficient to analyze the response of the biosensor.
  • the mode of reading of the biosensor of the invention using luminescence and preferably fluorescence, has the advantage of being discrete and confidential since only the user provided with a light source and a reading means adapted, typically a smartphone equipped with a flash and the dedicated application, is able to decrypt the information coded in the barcode of the biosensor.
  • this reading mode allows the medical staff not to alarm the patient in case of infection.
  • the analysis of the image of the barcode makes it possible to access various information, such as the presence or absence of a targeted biological agent and whether or not an infectious dose is reached according to measured luminescence intensity, as well as any other information embedded in the bar code such as the location of the detected infection, the identification of pathogens, the estimation of the amount of pathogens to determine if the infectious dose is exceeded or not or the programming of an antibiogram according to the type of bacteria identified.
  • the modified barcode itself codes for information informing about the presence of a targeted biological agent
  • - reading step followed by a comparison with the initial bar code to identify the areas of the bar code that appear modified, allowing to conclude on the presence or absence of targeted biological agents, or
  • the present invention relates to the use of a biosensor according to the invention for analyzing the contamination with at least one biological agent in an environment.
  • the biosensor of the invention is adapted to detect contamination by at least one biological agent in a patient in a hospital environment, in a foodstuff, in the agricultural or horticultural field, or in the field of water treatment.
  • the biosensor of the invention is particularly suitable for detecting bacterial contamination in a patient by analyzing his body fluids such as blood, sweat, urine, or saliva.
  • the biosensor of the invention is furthermore particularly suitable for determining the excess of an infectious dose.
  • the present invention relates to a device for analyzing the contamination with at least one biological agent in an environment, comprising at least one biosensor according to the invention.
  • Step 1 Preparing the support
  • a crucible filled with metallic aluminum was heated to evaporation of the aluminum.
  • a paper substrate was placed so as to condense the aluminum vapors on said substrate.
  • the substrate coated with an aluminum layer obtained in the previous step was placed at the anode of a generator of direct current, the cathode of the system being in platinum (inert in the middle).
  • a voltage between 80V-120V was applied and the substrate was immersed for a period of 600 s to 900 s to form a layer of alumina on the surface of the aluminum deposit.
  • the support was then cleaned by immersing it in deionized water at 70 ° C for 1 minute and then in deionized water at 20 ° C for 1 minute.
  • the alumina surface of the cleaned support was then corona treated for 30 seconds. This treatment makes it possible to improve the wettability and surface tension (adhesion) of the alumina surface and also makes it possible to protect it against corrosion.
  • Step 2 Activate the support surface
  • a conventional method of molecular self-assembly (self-as s embly monolayer), in particular described in Wu et al. (PLOS ONE 2012, 7 (11), 1-9) or in Braiek et al. (Biosensors 2012, 2, 417-426) was used to coat the outer surface of the alumina layer with the support of O-succinimide labile groups.
  • MPA (30 ⁇ l of a solution at 100 mM) was first deposited on the surface of alumina, then the support thus coated was left stirring (vortex plate shaker) for 1 hour at room temperature.
  • the alumina layer is thus grafted with -S-CH 2 CH 2 -C (O) -OH groups.
  • the alumina layer is thus grafted with -S-CH 2 CH 2 -C (O) -O-succinimide groups, the chain -S-CH 2 CH 2 -C (O) - corresponding to a first spacer.
  • the aptamers are initially fixed on the support and then the dye is grafted to the aptamers.
  • Aqueous solutions of aptamers (concentration of ⁇ / ml aptamer) were prepared.
  • an associated aptamer is used.
  • the 3 'ends of the aptamers used are preferably previously modified in -COOH groups, by a technique known to those skilled in the art.
  • the 5 'ends of the aptamers used can be modified to an NH 2 group by a technique well known to those skilled in the art.
  • a mask adapted to the dimensions of the support and having at least one aperture that coincides with the area of the support that is to be functionalized when the mask is superimposed on the support may have several openings that correspond to the different areas to be functionalized, by the same aptamer or preferably by different aptamers so as to immobilize different infectious agents.
  • a mask adapted to the dimensions of the support and having as many openings as zones to be functionalized is superimposed, and then the known medium of the human being is deposited everywhere. the occupation or the aptamer solutions in the corresponding opening or openings, and this during a same step.
  • aptamer solutions are provided as inks of the inkjet printer and the areas of the support to be functionalized are successively printed.
  • the support thus coated is then left stirring (vortex plate shaker) for 30 minutes at room temperature, then stirring is stopped and the support is placed under a hood for 30 minutes.
  • An aptamer molecule (DNA monobrin) is thus fixed by a group - NH 2 carried by one of its bases (adenine, guanine or cytosine) to a group -S-CH 2 CH 2 -C (O) -O succinimide. There is formation of an amide -C (O) -NH- bond and departure of a molecule of N-hydroxysuccinimide.
  • the deposition of the aptamer solutions can be repeated again 1 to 2 times so as to optimize the degree of grafting, then the support is left overnight at room temperature and is finally rinsed with distilled water.
  • the dye After attachment of the aptamers to the support, the dye is then grafted to the aptamers.
  • the dye is preferably provided in the form of a precursor, containing a first unit corresponding to the dye and a second unit corresponding to a second spacer, these two units being covalently bonded.
  • the compound [cephalosporin] - [ATTO] (Sigma Aldrich), in which the [cephalosporin] motif denotes the second spacer and comprises a group -NH 2 free, and the pattern [ATTO] is preferably used. ] denotes the dye.
  • Fixation of the compound [cephalosporin] - [ATTO] is carried out by first depositing, on a specific area of the support previously functionalized in aptamers, the coupling agent EDC (10 ⁇ ) which makes it possible to activate the group -COOH free from the 3 'end of aptamers.
  • the support is stirred gently on a vortex plate for about 30 minutes and 20 ⁇ of complex [cephalosporin] - [ATTO] are deposited on said zone.
  • the dye is thus attached to the aptamer by creating a peptide bond between the free -NH 2 group of the [cephalosporin] unit and the free -COOH group of the 3 'end of the aptamers.
  • the dye is first grafted onto the aptamer, then this complex is then fixed on the support.
  • This variant can be adapted from the first variant, by first making, out of the support, the coupling of the aptamer and the dye.
  • the aptamers described above whose 3 'ends are preferably modified beforehand in groups -COOH, by a technique known to those skilled in the art, are preferably used.
  • the compound [cephalosporin] - [ATTO] described above is preferably used.
  • the coupling between an aptamer and the dye [cephalosporin] - [ATTO] can be carried out by peptide coupling according to a method known to those skilled in the art.
  • the aptamer-[cephalosporin] - [ATTO] complex can then be grafted onto the surface of the support, previously functionalized in -S-CH 2 CH 2 -C (O) -O-succinimide groups by a method similar to that employed in the present invention. first variant.
  • a 2D barcode biosensor was produced using the protocol of the Example
  • the alumina supports are made.
  • the barcode pixels are printed, leaving blank the areas to be functionalized by the aptamers and the dye.
  • a biosensor capable of detecting both Escherichia coli ATCC 8739 and Staphylococcus aureus was in particular prepared using the aptamers described above and the dye [cephalosporin] - [ATTO].
  • control sample comprising only physiological saline, a sample No. 1 comprising Escherichia coli ATCC 8739 in a concentration of 10 6 cfu in physiological saline, a sample No. 2 comprising Staphylococcus aureus in a concentration of 10 4 cfu in serum physiological, or
  • the 2D barcodes of the three biosensors were photographed with a smartphone equipped with a flash (wavelength 640 nm to 670 nm).
  • the code appeared modified compared to the initial code, the zone functionalized by the aptamer specific to Staphylococcus aureus appeared colored.
  • the code also appeared modified compared to the initial code, the functionalized zones by the aptamer specific to Escherichia coli ATCC 8739 and by the aptamer specific to Staphylococcus aureus both appeared colorful.
  • Example 4 Exemplary embodiment with 1D and 2D bar code using a chromogenic antibiotic as a coloring molecule
  • FIG. 3 illustrates the visual evolution of a 2D bar code by change of color tint before and after revelation of a target bacterium by a biosensor according to the invention.
  • 2D barcode contains information for example in the present case "neg” (for negative). This is made possible because there is a contrast between the small yellow squares (dark) and the whites (light).
  • Some small squares have been functionalized by the process described above. Contact with a liquid biological sample such as saliva, plant, blood, perspiration or any preparations using such samples.
  • a liquid biological sample such as saliva, plant, blood, perspiration or any preparations using such samples.
  • the 2D barcode is functionalized to detect one or more target bacteria and is used as described above. In this case, this 2D barcode detects the absence of target bacteria.
  • a functionalized 2D Bar Code for detecting one or more target bacteria is used as described above.
  • the 2D barcode detects the presence of target bacteria.
  • small functionalized squares change colors (the dark ones can become clear or vice versa).
  • the small yellow or white squares turn red.
  • the small yellow and white squares become "Clear” and the small red squares become "Dark”.
  • the message carried by the 2D barcode has evolved. The contrast thus produced makes it possible to read "pos" for positive.
  • FIG. 4 illustrates the visual evolution of an ID bar code by change of color tint before and after revelation of a target bacterium by a biosensor according to the invention.
  • the base matrix of the ID bar code is formed of dark or light rectangles.
  • the Barcode ID contains information for example in this case "neg” (for negative). This is made possible because there is a contrast between the yellow (dark) and white (light) rectangles.
  • the biosensor is functionalized to detect one or more target bacteria is used as described above.
  • this barcode ID just detects the presence of a target bacterium. The rectangles remain yellow. Thus, this ID bar code detects the absence of target bacteria.
  • the biosensor described in this example illustrates the variant of the invention in which a coloring molecule comprises a chromogenic antibiotic, in the present invention.
  • a coloring molecule comprises a chromogenic antibiotic
  • this variant does not require the presence of a second spacer. No breakage of labile bond is produced following the attack of ⁇ -lactamase on the lactam nucleus of the antibiotic.
  • Lactamator Beta Lactamase Solution, CPC Biotech
  • Step 1 preparing the support
  • the functionalized support is a flexible plastic support, the Teslin, a hydrophobic and synthetic substrate which has the advantage of being very resistant, while being very fine.
  • OH groups are then added to the surface of the substrate using a soda bath at low concentration ( ⁇ 20%) before being rinsed with distilled water.
  • Step 2 Graft the aptamer using a linker
  • This immobilization technique is based, as previously (example 1) on the principle of self-assembled monolayers, constituted here of an organosilane, the TPM.
  • This step requires several hours of incubation (lh to 6h) and has been tested for concentrations between 10 and 50 mM. Incubation is carried out under a hood aspirant, with stirring and at room temperature. In order to eliminate the molecules that have not been grafted, rinsing with distilled water is carried out.
  • the 5 'end of the aptamer was modified with an amino group (NH 2 ) by a technique known to those skilled in the art.
  • the aptamers are then added to the sample according to the protocol followed in Example 1.
  • the sample is then rinsed with distilled water to eliminate aptamers that have not specifically bound the TPM.
  • the aptamer tested ends with a guanine base, naturally having at its end a free NH 2 group (since the aptamer being a single-stranded, the NH 2 group is not engaged with a cytosine in a hydrogen bond, as is the case in double-stranded configuration).
  • This NH 2 group is used for fixing the coloring molecule.
  • the dye molecule designates a chromogenic antibiotic of the cephalosporin class: the nitrocele.
  • the use of a chromogenic antibiotic is the variant tested here, because it eliminates the need for an additional step and simplifies color detection (visible to the naked eye).
  • Step 4 Colorimetric test and specificity
  • a first test is performed to ensure the presence of nitrocele on the surface of the functionalized substrate: a few tens of micro liters of ⁇ -lactamase solution are deposited. A red coloration is then observed on the surface of the substrate, suggesting that there has indeed been binding of the nitrocéfme to the molecular structure grafted onto the substrate.
  • a second test is performed to verify that in the absence of the molecular construction described above the nitrocele is removed during rinsing with DMSO.
  • the test is performed after two different steps (step 1 and step 2). In both cases, the addition of ⁇ -lactamase does not cause a colorimetric reaction.

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Abstract

La présente invention concerne un biocapteur pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique, comprenant un support sur lequel est disposé un code à barres dont au moins une zone est fonctionnalisée par au moins un aptamère apte à immobiliser sélectivement ledit agent biologique, ledit aptamère étant lui-même lié, directement ou non, à une molécule colorante apte soit à produire de la couleur, soit à changer de couleur suite à l'immobilisation de l'agent biologique par ledit aptamère.

Description

BIOCAPTEUR POUR DETECTER LA PRESENCE DE BACTERIES
La présente invention concerne un biocapteur pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique, en particulier de bactéries, ainsi qu'un procédé pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement mettant en œuvre ledit biocapteur.
Dans le domaine hospitalier, il existe des dispositifs permettant de détecter la présence de bactéries, basés sur la recherche de bactéries dans les échantillons d'un patient, en culture et antibiogramme, mais aussi basés sur des méthodes comme la PCR et les galeries API. On peut ainsi citer les tests rapides de détection de pathogène Singlepath® commercialisés par la société MERCK et les kits de détection de bactéries commercialisés par la société ZAYHO.
Toutefois, ces dispositifs nécessitent un temps d'incubation et de mise en culture de l'échantillon allant de 24h à 48h, ce qui retarde la détection de l'infection et diffère donc le traitement efficace du patient avec des conséquences qui peuvent être graves pour celui- ci. En outre, ces dispositifs doivent être stockés entre 2°C et 8°C avant utilisation et ne peuvent en général détecter qu'une seule espèce de bactéries.
Dans le domaine agroalimentaire, il existe des dispositifs de détection de la présence de bactéries au sein d'emballages alimentaires, mettant en œuvre un code à barres dynamique, c'est-à-dire capable de se modifier en présence de métabolites bactériens.
Ces dispositifs ne permettent toutefois de détecter la présence de bactéries que de manière indirecte et pas de manière immédiate.
Par ailleurs, les documents US2002/0072079 et US2004/018641 divulguent des détecteurs de contamination permettant d'identifier une contamination comprenant : un premier indice codé pour identifier un produit, un second indice codé pour identifier une condition indicative d'une contamination, un indicateur de contamination associé à un premier et à un deuxième code à barres et des moyens pour changer l'apparence de l'indicateur en présence d'une condition de contamination, dans lesquels les moyens pour changer l'apparence de l'indicateur modifient l'apparence du premier et du deuxième indice codé. Toutefois, ces documents ne font pas état d'une génération de couleur ou d'un changement colorimétrique par le biais de la présence d'une molécule colorante liée à un aptamère.
En outre, les dispositifs de l'état de la technique ne permettent pas de renseigner de manière immédiate sur la concentration en un agent biologique dans un échantillon, en particulier ils ne permettent pas de déterminer si la dose infectieuse est dépassée ou non, à savoir si la quantité suffisante d'agent pathogène pour provoquer une maladie est dépassée ou non. II existe donc un besoin pour un dispositif permettant de pallier les déficiences des dispositifs de détection de bactéries de l'état de la technique.
La présente invention vise ainsi à fournir un dispositif pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique ne présentant pas les limites des dispositifs existants.
En particulier, la présente invention vise à fournir un dispositif permettant de détecter la présence d'au moins un agent biologique, et de préférence plusieurs agents biologiques différents, de manière plus rapide que les dispositifs de l'état de la technique, voire de manière immédiate.
La présente invention vise également à fournir un dispositif permettant de renseigner sur la concentration en au moins un agent biologique, et de préférence en plusieurs agents biologiques différents, dans un échantillon de manière plus rapide que les dispositifs de l'état de la technique, voire de manière immédiate. Figures
La figure 1 illustre l'élaboration du biocapteur selon l'invention. Le biocapteur - code barre 2D dynamique permet de détecter 5 agents pathogènes.
La figure 2 illustre l'utilisation du biocapteur à partir de fluides corporels. Les informations reçues via l'application mobile dédiée peuvent permettre : 1. L'identification des agents pathogènes présents dans l'échantillon, 2. L'estimation de la quantité correspondante, 3. L'antibiogramme spécifique pour chaque agent pathogène, 4. La détermination de la dose infectieuse et 5. La localisation. La figure 3 illustre l'évolution visuelle d'un code à barres 2D par changement de teinte de couleur avant et après révélation d'une bactérie cible par un biocapteur selon l'invention (Example 4.1).
La figure 4 illustre l'évolution visuelle d'un code à barres 1D par changement de teinte de couleur avant et après révélation d'une bactérie cible par un biocapteur selon l'invention (Example 4.2).
Biocapteur
Selon un premier objet, la présente invention concerne un biocapteur pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique, comprenant un support sur lequel est disposé un code à barres dont au moins une zone est fonctionnalisée par au moins un aptamère apte à immobiliser sélectivement ledit agent biologique, ledit aptamère étant lui-même lié, directement ou non, à une molécule colorante apte soit à produire de la couleur, soit à changer de couleur suite à l'immobilisation de l'agent biologique par ledit aptamère, éventuellement par activation par flash comme détaillé plus loin dans la description.
Selon un mode de réalisation particulier, la molécule colorante est liée directement ou non via une liaison labile. Principe de fonctionnement
Le principe de fonctionnement du dispositif selon l'invention est basé sur un phénomène colorimétrique, qui permet de signaler la détection de l'agent biologique ciblé de manière simple, directe et immédiate.
Le dispositif de la présente invention est spécifique à au moins un agent biologique, c'est-à-dire qu'il ne détecte que le ou les agents biologiques qu'il est destiné à détecter, à savoir le ou les agents biologiques ciblés.
La surface du dispositif selon l'invention comprend selon un mode de réalisation particulier un code à barres dont au moins une zone est apte à produire une couleur ou changer de couleur après que ladite zone ait été mise en contact avec l'agent biologique ciblé et que celui-ci ait été immobilisé par les aptamères. Comme cela est détaillé ci-après, la génération de la couleur ou le changement de couleur peut être lié à la libération par l'agent biologique d'enzymes particulières, provoquées par la liaison agent biologique-aptamère.
Selon une première variante, cette attaque d'enzymes particulières peut être provoquer la rupture d'une liaison labile présente entre la molécule colorante et l'aptamère.
Selon une deuxième variante, cette attaque d'enzymes particulières peut engendrer une génération de couleur ou un changement de couleur de la molécule colorante.
Selon une troisième variante, cette attaque d'enzymes particulières peut être la source de ces deux phénomènes à la fois, à savoir la rupture d'une liaison labile présente entre la molécule colorante et l'aptamère et une génération de couleur ou un changement de couleur de la molécule colorante.
Ainsi comme illustré dans les exemples, les inventeurs ont mis en évidence qu'une liaison molécule colorante-aptamère comportant un motif β-lactame était détériorée par suite de libération de β-lactamase suite à l'immobilisation de deux types de bactéries (voir la mise en œuvre dans l'exemple 3) sur l'aptamère, provoquant la libération de la molécule colorante et par suite permettant une génération de couleur et la formation d'un code barre 2D indiquant la présence des bactéries correspondantes.
Dès lors, selon cette variante particulière, la surface du dispositif selon l'invention comprend un code à barres dont au moins une zone est apte à libérer une molécule colorante lorsque ladite zone entre en contact avec l'agent biologique ciblé et que celui-ci est immobilisé par les aptamères.
Une autre variante, basée sur le même principe, permet de remplacer la molécule antibiotique par un autre type de molécule, capable d'être attaquée par des enzymes différentes. On peut par exemple citer le couple lactose/p-galactosidase, au sein duquel la β- galactosidase peut-être sécrétée notamment par E.coli. On peut également citer l'utilisation d'a-amylase, une enzyme fongique, produite notamment par Thermomyces lanuginosus, capable d'attaquer des polysaccharides, notamment afin de les rendre fermentescibles.
Les inventeurs ont également illustré dans les exemples la variante selon laquelle la molécule colorante n'est pas libérée mais est apte à générer une couleur ou un changement de couleur de ladite molécule colorante suite à l'immobilisation d'une bactérie sur l'aptamère (exemples 4 et 5). Liaison molécule colorante-aptamère
Selon la première variante de l'invention exposée ci-dessus, la molécule colorante peut par exemple être libérée après que l'agent biologique ait été immobilisé par l'aptamère. Dans ce cas la molécule colorante est reliée à l'aptamère, par exemple via un second espaceur comme cela sera détaillé ci-après, et la molécule colorante peut être fixée à ce second espaceur par le biais d'une liaison labile.
Selon la deuxième variante de l'invention exposée ci-dessus, la molécule colorante peut ne pas être libérée après que l'agent biologique ait été immobilisé par l'aptamère mais peut toutefois changer de couleur après que l'agent biologique ait été immobilisé par l'aptamère.
Avantageusement, toujours selon cette deuxième variante, la liaison entre la molécule colorante et l'aptamère peut ne pas comprendre de liaison labile ni d'espaceur. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la molécule colorante appartient à la famille des antibiotiques.
Le principe de détection de cette invention repose sur un changement de couleur résultant d'une réaction inductible en chaîne. En effet, dans le cas d'une application santé pour la détection de maladies nosocomiales et si l'échantillon biologique à tester contient la ou les bactérie(s) cible(s), l'aptamère reconnaît l'agent biologique et l'immobilise.
La bactérie est alors mise en contact avec la molécule antibiotique liée à l'extrémité 3' de l'aptamère. Suite à ce contact et si la bactérie est résistante à l'antibiotique utilisé (famille des céphalosporines, pénicillines par exemple), celle-ci produit des enzymes par exemple β-lactamases qui sont aptes à attaquer l'antibiotique.
A titre de motifs pouvant appartenir à ces antibiotiques et susceptibles d'être attaqués par les β-lactamases, on peut citer les noyaux β-lactames.
Tous les antibiotiques β-lactames, à savoir contenant un noyau β-lactame conviennent à la mise en œuvre de l'invention. A ce titre, on peut notamment citer les dérivés de pénicilline (pénames), les dérivés de céphalosporine (céphèmes), les oxapénèmes, les monobactames et les carbapénèmes.
Selon la nature/famille de l'antibiotique et selon le mode de détection, une réaction coiorimétrique a lieu. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la réaction colorimétrique peut notamment engendrer de la luminescence, par exemple de la fluorescence.
La présente invention concerne ainsi selon un mode de réalisation particulier un biocapteur pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique, comprenant un support sur lequel est disposé un code à barres dont au moins une zone est fonctionnalisée par au moins un aptamère apte à immobiliser sélectivement ledit agent biologique, ledit aptamère étant lui-même lié, directement ou non, à une molécule colorante via une liaison chimique labile qui est apte à se rompre suite à l'immobilisation de l'agent biologique par ledit aptamère, et ladite molécule colorante étant non luminescente sous sa forme liée à l'aptamère et luminescente, de préférence fluorescente, sous sa forme non liée à l'aptamère.
Elle concerne également, selon un autre mode de réalisation particulier un biocapteur tel que défini précédemment, dans lequel la molécule colorante est liée de manière covalente à l'aptamère via un second espaceur, ledit second espaceur étant lié à la molécule colorante par une liaison chimique labile qui est apte à se rompre suite à l'immobilisation de l'agent biologique par l'aptamère, par exemple une liaison chimique labile apte à se rompre en présence d'une β-lactamase.
Elle concerne aussi, selon un autre mode de réalisation particulier, un biocapteur tel que défini précédemment, dans lequel la molécule colorante est un antibiotique lié de manière covalente à l'aptamère, ladite molécule colorante étant apte à produire une couleur ou changer de couleur suite à l'immobilisation de l'agent biologique par l'aptamère, par exemple ladite molécule chimique comprenant un antibiotique chromogène. Aptamère/agent biologique
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « aptamère » un oligonucléotide synthétique capable de fixer sélectivement un ligand contenu dans l'agent biologique ciblé (typiquement présent à la surface de l'agent biologique ciblé) ou encore sécrété ou excrété par ledit agent, c'est-à-dire l'agent biologique que l'on souhaite détecter à l'aide du biocapteur de l'invention. Les aptamères sont en général des composés synthétiques, isolés in vitro à partir de banques combinatoires d'un grand nombre de composés de séquence aléatoire par une méthode de sélection itérative appelée SELEX.
Un des avantages du dispositif de l'invention est qu'il permet de détecter tout agent biologique, du moment qu'il existe un aptamère spécifique audit agent biologique.
Il suffit en effet de faire varier l'aptamère pour cibler un agent biologique particulier. Autrement dit, le dispositif se fonde sur une spécificité au niveau du couple agent bio lo gique/ aptamère .
L'agent biologique est typiquement choisi dans le groupe constitué par les bactéries, les prions, les virus, les mycotoxines et les peptides.
Selon un mode de réalisation préféré, l'agent biologique est une bactérie et l'aptamère est apte à fixer sélectivement au moins une protéine membranaire de ladite bactérie, choisie par exemple parmi les lipopolysaccharides (LPS) et les peptidoglycanes (PPG).
Le dispositif de l'invention est particulièrement adapté à la détection d'infections nosocomiales dans le milieu hospitalier, ou encore à la détection de contaminations bactériennes dans le milieu agroalimentaire, détection d'agent pathogène dans l'eau dans les réseaux de distribution d'eau potable, les rivières, les lacs ou encore les piscines.
De préférence, l'agent biologique est une bactérie choisie dans le groupe constitué par Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Salmonella gastroenteretis, Listeria monocytogenes et Legionella spp.
Lorsque l'agent biologique est une bactérie, et comme indiqué précédemment, la présente invention peut avantageusement tirer profit de la présence d'une molécule antibiotique dans le dispositif, engendrant la sécrétion d'enzymes par la bactérie, la sécrétion desdites enzymes permettant, directement ou indirectement la génération d'une couleur ou un changement de couleur via la molécule colorante.
Conformément à la première variante décrite précédemment, la molécule antibiotique est comprise dans un espaceur entre l'aptamère et la molécule colorante ou « second espaceur » dans le cadre de la présente invention. Toujours selon cette première variante, une liaison chimique labile est comprise entre l'espaceur et la molécule colorante. Autrement dit, l'attaque de l'enzyme sécrétée de la liaison chimique entre l'aptamère et la molécule colorante, provoque la libération de la molécule colorante, générant une couleur ou provoquant un changement de couleur.
Conformément à la deuxième variante décrite précédemment, la molécule colorante comprend ou consiste en une molécule antibiotique apte à changer de couleur, ou antibiotique chromogène, suite à l'attaque des enzymes issues de la bactérie cible capturée par le biocapteur selon l'invention. Les aptamères mis en œuvre dans le dispositif de l'invention peuvent être de toute nature, du moment qu'ils sont aptes à immobiliser de façon sélective l'agent biologique que l'on souhaite détecter, qu'ils peuvent être fixés sur le support du dispositif, par exemple via un premier espaceur, et qu'ils peuvent être liés à une molécule colorante, par exemple via un second espaceur.
Comme exposé précédemment, une liaison labile peut être comprise entre la molécule colorante et l'aptamère, en particulier entre le second espaceur, lui-même comprenant une molécule antibiotique, et la molécule colorante. Alternativement, une telle liaison labile peut ne pas être comprise entre la molécule colorante et l'aptamère dans le cas où la molécule colorante appartient à la famille des antibiotiques et est apte à générer de la couleur ou provoquer un changement de couleur ou antibiotique chromogène. Dans ce dernier cas, la molécule colorante peut être directement liée à l'aptamère, sans nécessiter la présence d'un un second espaceur
Partant des aptamères décrits dans la littérature et dans les bases de données, l'homme du métier sera capable de les modifier pour permettre leur fixation sur le support du dispositif et leur liaison avec une molécule colorante, ce grâce à des techniques classiques de fonctionnalisation de surface et de couplage covalent, et notamment via un second espaceur.
De préférence, l'aptamère est un brin d'ARN ou d'ADN. Il peut également être un peptide.
Selon un mode de réalisation particulier, l'aptamère est modifié sur son extrémité 3', en particulier pour porter une fonction -COOH. Selon un autre mode de réalisation particulier, l'aptamère est modifié sur son extrémité 5', en particulier pour porter une fonction -NH2.
Cette modification permet de fixer l'aptamère sur le support du dispositif de manière aisée, c'est-à-dire avec des techniques usuelles de greffage sur un support.
L'aptamère peut ainsi être lié de manière covalente à la zone du code à barres via un premier espaceur.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit premier espaceur peut avoir la formule -S-(CH2) n-C(0)- où n est un entier compris de 2 à 6 et dans lequel l'atome de soufre est lié de manière covalente au support et l'atome de carbone du groupe C(O) est lié de manière covalente à un atome d'azote de l'aptamère.
Selon d'autres modes de réalisation particuliers, la liaison aptamère-support peut être effectuée par silane (OH-Silane-NH2) par exemple le TPM, par un linker hétérobifonctionnel (SH-Hétero bifonctionnel-NH2) par exemple le SMCC ou encore par UV. A ce titre, une réalisation de film de silane sur un support avec liaisons OH a été décrite dans M.Zain et al « Effect of surface treatments on the durability of green polyurethane adhesive bonded aluminium alloy » International Journal of Adhésion & Adhesives 55 (2014) 43-55 pouvant être mise à profit dans le cadre la présente invention. On cite également l'article Y.Guo et al « Potent antigen-specific immune response induced by infusion of spleen cells coupled with succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl cyclohexane)-l- carboxylate (SMCC) conjugated antigens » International Immunopharmacology 31 (2016) 158-168 qui divulgue un exemple illustrant la liaison d'une cellule via un SH et une protéine via un NH2.
L'utilisation de molécules appartenant à la famille des silanes repose sur Γ autoassemblage spontané de ces molécules sur des surfaces par adsorption s 'organisant ainsi en monocouches moléculaires ordonnées. Cet assemblage de molécules crée une organisation moléculaire stable et résistante. Dans le cadre de la présente invention, la ou les molécules choisie(s) doit (doivent) contenir un head group (« groupe de tête »), possédant une forte affinité avec l'extrémité hydroxyle du substrat permettant ainsi l'ancrage de la molécule à sa surface, et un end group (« groupe terminal ») qui interagit avec l'extrémité 5' NH2 de l'aptamère.
Il existe différentes familles de molécules dont les propriétés correspondent à celles précédemment citées telles que les organosilanes, les thiols, les phosphonates. A titre d'exemple d'organosilane on cite le 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TPM) (PubChem lD : 17318).
Le head group du TPM « RO-Si » réagit, alors, avec l'extrémité hydroxyle (OH) du substrat. Cette réaction dite d'hétéro-condensation aboutit à la formation d'une liaison covalente de type O-Si-R' où R' représente le end group qui, in fine, interagit avec l'extrémité 5' NH2 de l'aptamère.
Un autre type d'agents sont de types « linkers » hétéro-bifonctionnels. Ce sont des réactifs de conjugaison de protéines les plus remarquables et les plus utiles car ils ont deux groupes réactifs distincts. Ils ont la particularité de posséder des groupes réactifs différents aux extrémités.
Par exemple, le N-Succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP) ou le Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC) (PubChem ID : 125 175 ). Le SMCC réagit par l'intermédiaire de son groupe maléimide qui est un groupe suifhydryle (thioi; -SH) réactif et par son extrémité NUS qui est réactif à Famine (NH2) formant ainsi des liaisons covalentes stables.
D'autres molécules appartenant à cette famille de « linkers » peuvent être utilisées à condition de posséder les mêmes groupements aux extrémités, selon des techniques bien connues de l'homme de l'art. Ce type de greffage peut être réalisé en utilisant des techniques connues de l'homme du métier, telles que décrites dans les exemples détaillés ci-après.
Ainsi le dispositif de l'invention peut en particulier mettre en œuvre les couples aptamère/agent biologique selon des banques de données bien connues de l'homme de l'art. A titre illustratif et non limitatif, on peut citer les couples particuliers suivants, récapitulés dans le tableau ci-après :
Souche de bactérie Aptamère
Escherichia coli 5 'CGC GTC CCC CGC CGG GCG CGC GCC AGG ATC GAC 3' ATCC 8739 (SEQ ID NO : 1) 5'CTT CTG CCC GCC TCC TTC CTA GCC GGA TCG CGC TGG CCA
Escherichia coli
GAT GAT ATA AAG GGG TCA GCC CCC CAG GAG ACG AGA TAG
0157 H7
GCG GAC ACT 3' (SEQ ID NO : 2)
Staphylococcus 5'TCC CTA CGG CGC TAA CGC CAC CGT GCT ACA ACT CGG ATT aureus 3' (SEQ ID NO : 3)
Escherichia coli 5' GTC TGC GAG CGG GGC GCG GGC CCG GCG GGG GAT GCG 3' 0157 H7 (SEQ ID NO 4)
Molécule colorante
Dans le dispositif de l'invention, la molécule colorante signale la détection de l'agent biologique ciblé, par exemple par la libération de ladite molécule colorante, comme exposé précédemment en lien avec l'un des modes de réalisation particuliers de l'invention.
Dans la cadre de la présente invention, on entend par « molécule colorante » toute molécule capable soit de produire une couleur, soit de provoquer un changement de couleur suite à un stimulus dans son environnement. Ledit stimulus est avantageusement représenté dans le cadre de la présente invention par l'immobilisation de l'agent biologique par l'aptamère. Toutefois, la génération de couleur ou le changement de couleur peut être indirectement provoqué par cette immobilisation comme exposé ci-dessus. Autrement dit, la présente invention comprend également les cas où des réactions en chaîne se produisent à partir de cette immobilisation, dont au moins l'une d'entre elles provoque cette génération de couleur ou changement de couleur via la molécule colorante. La nature de la molécule colorante est détaillée ci-après.
Par « génération de couleur », on entend dans le cadre de la présente invention l'apparition d'une couleur par rapport à la couleur présente dans la même zone, avant mise en contact de l'agent biologique avec le biocapteur selon l'invention, déterminée par rapport à un système colorimétrique donné.
Par « changement de couleur », on entend dans la cadre de la présente invention un changement de couleur par rapport à la couleur présente dans la même zone, avant mise en contact de l'agent biologique avec le biocapteur selon l'invention, déterminée par rapport à un système colorimétrique donné. Ce changement de couleur inclut également un changement de contraste. Dès lors, la molécule colorante devra être choisie de sorte que ledit changement après l'immobilisation de l'agent biologique sur les aptamères provoque un déplacement colorimétrique ou shift colorimétrique minimum pour qu'il soit détectable par un moyen de lecture approprié.
La terminologie « changement de couleur » comprend la production de luminescence, comme il sera exposé ci-après.
Au titre de système colorimétrique pouvant être utilisé dans le cadre de la présente invention, on peut notamment citer le modèle RGB. Le modèle RVB repose sur trois couleurs primaires qui par leurs mélanges vont restituer toutes les autres (256 niveaux sur chaque canal). On peut également citer le modèle TSL (acronyme de Teinte, Saturation, Luminosité) ou encore TSV (teinte, saturation, valeur) qui et un dérivé de RVB. Ces deux derniers permettent une meilleure appréhension ou contrôle de la luminosité.
Tout type d'appareil conçu pour détecter ces générations de couleur et/ou changement de couleur peut être utilisé, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Il est par ailleurs à noter que dans le cadre de la présente invention, on entend par système colorimétrique, pas seulement les espaces trichromatiques car l'invention concerne aussi la détection par changement de teinte monochromatique ou bichromatique, y compris dans les nuances du blanc au noir. Ce mode de réalisation peut en particulier correspondre à une application dans laquelle le code à barres est un code à barres 1D ou 2D.
La description suivante illustre l'« activation par flash » telle qu'utilisée dans le cadre de la présente invention selon le mode de réalisation où la molécule colorante est luminescente, et plus particulièrement fluorescente. Cette étape intervient au moment de la lecture du résultat.
Selon ce mode de réalisation, un second espaceur est lié en 3 'de i'aptamère et est également lie à un colorant luminescent, plus particulièrement photo-activable. Ce colorant permet, après son excitation selon une longueur d'onde spécifique, de lire le résultat de détection. En effet, dans le cas d'une application santé pour la détection de maladies nosocomiales et si l'échantillon biologique à tester contient la ou les bactérie(s) cible(s), I'aptamère reconnaît l'agent biologique qu'il immobilise. La bactérie est mise en contact avec la molécule antibiotique liée à l'extrémité 3' de I'aptamère.
Suite à ce contact et si la bactérie est résistante à l'antibiotique utilisé par exemple famille des céphalosporines ou pénicillines, celle-ci produit des enzymes par exemple β-lactamases qui attaquent l'antibiotique par exemple le noyau β- lactame. Cela induit la coupure de la liaison iabile entre l'extrémité de l'antibiotique et celle du colorant provoquant ainsi la libération du colorant. Ce colorant est excité à une longueur d'onde spécifique par un flash de téléphone portable permettant ainsi l'apparition de la luminescence du colorant initialement incolore. Dans ce mode de réalisation, on préfère l'utilisation d'un antibiotique non chromogène.
Selon un mode de réalisation particulier, la molécule colorante est une molécule chimique et n'est pas un anticorps.
A titre de molécule colorante non luminescente on peut notamment citer les antibiotiques chromogènes de la famille des céphalosporines, par exemple la nitrocéfme, et des pénicillines.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la molécule colorante est non luminescente sous sa forme liée à l'aptamère et luminescente, de préférence fluorescente, sous sa forme non liée à l'aptamère.
A titre de molécule colorante luminescente, et en particulier fluorescente, on peut notamment citer le 5-FAM, le 6-FAM, les colorants de type ATTO, notamment ΓΑΤΤΟ 532 ou l'ATTO 550, l'ATTO 647, le DY-510XL, le DY-530, le HEX, le CAL Fluor Orange 560, et en particulier l'ATTO, tel que mis en œuvre dans les exemples.
Toujours selon ce mode de réalisation particulier pour lequel la molécule colorante est luminescente et encore plus particulièrement fluorescente, la molécule colorante n'est pas luminescente lorsqu'elle est encore liée à l'aptamère, ce qui signifie que la zone du dispositif qui est fonctionnalisée avec l'aptamère ne génère aucun phénomène colorimétrique si elle n'est pas en présence de l'agent biologique ciblé.
En revanche, lorsqu'elle est activée suite à l'immobilisation de l'agent biologique, ou plus particulièrement libérée suite à l'immobilisation de l'agent biologique, elle devient luminescente et génère un phénomène colorimétrique que l'on peut visualiser par un moyen de lecture approprié.
Ce fonctionnement assure la détection directe et instantanée de l'agent biologique ciblé.
De préférence, une telle molécule colorante luminescente possède une bande d'absorption luminescente comprise de 600 nm à 700 nm, de préférence de 640 nm à 670 nm, et une bande d'émission luminescente comprise de 600 nm à 700 nm, de préférence de 665 nm à 675 nm ou un shift colorimétrique minimal pour une détection.
A titre de moyen de lecture on peut en particulier citer une caméra ou un appareil photo ou encore un capteur photosensible de type CCD ou CMOS. Ce dernier type de capteur combine les trois couleurs primaire RGB pour créer par synthèse additive une image couleur.
La molécule colorante telle que décrite précédemment peut être liée à l'aptamère par différents types d'espaceurs comme exposé précédemment ou encore lié directement à l'aptamère lorsque la molécule colorante comprend l'antibiotique.
Ainsi, la molécule colorante peut être reliée à l'aptamère par l'intermédiaire d'un second espaceur.
Par ailleurs, comme cela a également été indiqué précédemment, ce second espaceur peut comprendre au moins une liaison labile de sorte à pouvoir libérer la molécule colorante qui peut ainsi occasionner une génération de couleur ou un changement de couleur une fois libre.
La libération de la molécule colorante peut être déclenchée selon divers mécanismes.
Selon le mode de réalisation dans lequel l'agent biologique est une bactérie produisant une enzyme de type β-lactamase et que la molécule colorante comprend un noyau sensible à la production de cette enzyme, comme décrit précédemment, la liaison labile se situe entre la molécule colorante et l'antibiotique.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, lorsque l'agent biologique est une bactérie, le second espaceur, est relié à la molécule colorante par une liaison labile. Il est avantageusement formé au moins en partie par une molécule antibiotique provoquant la formation d'une enzyme précisément susceptible d'attaquer ladite molécule antibiotique, et notamment le noyau β-lactame. C'est ce mode de réalisation particulier qui est illustré dans les exemples, par mise en œuvre d'un second espaceur comprenant de la céphalosporine. Ainsi, un complexe aptamère-[céphalosporine]-[ATTO] est formé, pouvant être greffé sur un support pour donner le biocapeur recherché, permettant la détection de bactéries spécifiques. A titre d'illustration d'un tel complexe aptamère-[céphalosporine]-[ATTO], on représente ci-après dans le schéma 1 un enchaînement aptamère-céphalosporine-ATT0647.
Figure imgf000017_0001
Aptamère Céphalosporine ATTO 647
Schéma 1
Au sens de la présente invention, la liaison labile est avantageusement comprise entre la molécule colorante et le second espaceur. Elle se définit dans le cadre de la présente invention comme étant une liaison susceptible d'être rompue suite à l'attaque du bras espaceur par l'enzyme sécrétée par l'agent biologique et notamment la bactérie, et plus particulièrement du noyau β-lactame compris dans la molécule antibiotique comprise dans le second bras espaceur.
Comme décrit précédemment, dans le cadre de ce mode de réalisation particulier, lors de l'immobilisation de ladite bactérie sur les aptamères, l'agent biologique, et par exemple la bactérie ciblée, est mis en contact avec le second espaceur assurant la liaison avec la molécule colorante, par exemple lié en 3' ou en 5 'à l'aptamère.
Suite à ce contact, si la bactérie est résistante à la molécule antibiotique utilisée, celle-ci produit des enzymes susceptibles d'attaquer au moins une liaison entre l'aptamère et la molécule colorante. Lorsque comme dans l'exemples, il s'agit d'une bactérie produisant des β-lactamases par réaction à une action antibiotique, celle-ci vient attaquer le motif β- lactame présent dans la céphalosporine comprise dans le second espaceur.
Selon la nature de l'antibiotique, le changement détectable pourra se manifester par une génération de couleur ou un changement de couleur. Cette manifestation peut être due à la rupture de la liaison labile. La molécule colorante, ainsi libéré, permet la lecture du résultat. Quelle que soit la nature du colorant ou de l'antibiotique, la réaction en chaîne se solde par des changements de couleur, qui peuvent se retranscrire par exemple sur un code-barres dynamique.
Ainsi, dans le cas de la détection de bactéries responsables d'infections nosocomiales, un mode de libération préféré de l'invention se base sur la résistance aux antibiotiques des bactéries, en particulier sur la résistance aux antibiotiques de type β-lactame.
Les bactéries résistantes aux antibiotiques de type β-lactame ont la capacité de libérer des β-lactamase lorsqu'elles sont en présence desdits antibiotiques, ce qui altère la structure de ces antibiotiques et les rend inopérants.
De préférence, le second espaceur est un radical divalent comprenant un motif β-lactame, par exemple un motif céphalosporine.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'immobilisation de l'agent biologique, et notamment d'une bactérie, sur les aptamères entraîne suite à une réaction en chaîne, la rupture d'une liaison labile qui relie l'aptamère à une molécule colorante. C'est la libération de cette molécule colorante, qui n'était pas luminescente sous sa forme liée à l'aptamère mais devient luminescente, de préférence fluorescente, lorsqu'elle est libérée, qui provoque le phénomène colorimétrique, qui apparaît uniquement dans une zone correspondant à la zone fonctionnalisée par l'aptamère.
L'apparition de cette luminescence modifie donc l'information codée par le code à barres et la lecture du code à barres ainsi modifié à l'aide d'un moyen de lecture approprié permet alors de lire l'information modifiée par rapport à l'information codée par le code à barres initial, traduisant la détection de l'agent biologique. Détection/Application
Tout type de détection peut être envisagé.
Comme type d'application, on peut citer l'identification des bactéries, la localisation des foyers infectieux, l'antibiogramme correspondant à chaque type de bactéries ou encore l'estimation de la quantité présente (supérieure ou inférieure à la dose infectieuse).
Selon un mode de réalisation, il est en outre possible de mesurer à l'aide d'un moyen de lecture approprié l'intensité de la génération de couleur ou du changement de couleur, par exemple de la luminescence, générée par la molécule colorante, et par comparaison avec une valeur de référence prédéterminée, on peut déterminer si la concentration d'agent biologique dans l'échantillon contrôlé est supérieure à une quantité correspondant à une dose infectieuse spécifique.
Un autre avantage de la présente invention est que la même méthode de lecture peut être conservée entre la pré-immobilisation et la post-immobilisation de l'agent biologique sur le biocapteur.
Le dispositif ou biocapteur de la présente invention permet donc de détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique en temps réel, c'est- à-dire sans incubation préalable de l'échantillon à contrôler et sans traitement préalable, comme par exemple une lyse dans le cas de bactéries.
Avec un dispositif de détection rapide, les agents biologiques tels que les bactéries peuvent être identifiés avant qu'ils n'incubent et/ou prolifèrent et peuvent être traités avec les traitements appropriés.
En outre, le dispositif ou biocapteur de la présente invention présente l'avantage de ne pas nécessiter de stockage spécifique en matière de température. En d'autres termes, le dispositif de la présente invention est stable thermiquement à une température comprise entre -20°C à 80°C de préférence entre 0°C et 40°C.
Support
Le dispositif de l'invention présente l'avantage de pouvoir être mis en œuvre sur une grande variété de supports, qu'ils soient rigides ou souples.
Le support peut être un support souple ou rigide, sur lequel est disposé le code à barres.
Selon un mode de réalisation, le support est un support souple, de préférence un support de type papier ou plastique revêtu d'alumine, du papier ou du plastique.
A titre de matériau plastique on peut notamment citer le polypropylène ou le polyéthylène microporeux tel que vendu sous le nom Teslin par la société PPG industries.
De tels supports en Teslin peuvent notamment présenter une épaisseur comprise entre 150μιη et 450μιη.
Le polypropylène peut être dur ou semi-rigide.
Selon un autre mode de réalisation, le support est un support rigide, par exemple en verre. De préférence, le support est revêtu d'une couche d'alumine sur laquelle est disposé le code à barres.
Le dépôt d'une couche d'alumine peut être réalisé par toute technique connue de l'homme du métier, telle que celle décrite dans les exemples ci-après.
L'épaisseur de la couche d'alumine varie typiquement de 500 nm à 10 μιη et est par exemple de 1 μιη.
L'utilisation de la couche d'alumine présente plusieurs avantages :
- Tout d'abord une augmentation de la surface d'échange, grâce à l'adaptation de la taille des pores selon le type d'application,
- mais aussi une meilleure adhérence de la fonctionnalisation chimique pour la fixation des ligands (Aptamères). Cela est dû à la présence de liaisons hydroxydes libres (-OH) au niveau de cette surface, qui va faciliter l'immobilisation des aptamères. Ainsi, le taux de liaison hydroxydes disponible peut atteindre environ 80% pour le biocapteur.
L'utilisation de la couche d'alumine présente encore les avantages suivants : - La couche d'alumine a une stabilité thermique, de sorte qu'elle ne nécessite aucun stockage spécifique après sa fabrication,
- elle est biocompatible, c'est-à-dire qu'elle ne dégrade pas le matériel biologique avec lequel on l'utilise, et enfin,
- le coût de fabrication de la couche d'alumine est relativement faible.
Code à barres
Le dispositif de l'invention présente l'avantage de pouvoir être mis en œuvre avec une grande variété de code à barres, qu'ils soient à 1 ou 2 dimensions.
En outre, une ou plusieurs zones du code à barres peuvent être fonctionnalisées avec un seul ou plusieurs aptamères différents, afin de pouvoir détecter un seul ou plusieurs agents biologiques différents.
Les figures 3 et 4 illustrent l'utilisation telle que décrite dans l'exemple 4 de code à barres 1D et 2D, dans le cas d'une molécule colorante de type antibiotique chromogène, la nitrocéfme, qui passe du jaune en absence de β-lactamase au rouge en présence de β-lactamase. Comme illustré dans cet exemple c'est la présence de contrastes entre les bandes ou les pixels qui permet de porter le message porté par le code barre et conclue à la présence ou l'absence de la bactérie cible. Selon un mode de réalisation, le code à barres est un code à barres à 1 dimension, composé d'un assemblage de bandes noires et de bandes blanches parallèles, dans lesquelles au moins une zone d'au moins une bande blanche ou d'une bande noire est fonctionnalisée par au moins un aptamère.
De préférence, la totalité d'au moins une bande blanche est fonctionnalisée par au moins un aptamère.
Selon des variantes de ce mode de réalisation, deux, trois, quatre, voire cinq bandes blanches ou plus peuvent être fonctionnalisées avec des aptamères différents, de manière à détecter deux, trois, quatre, voire cinq agents biologiques différents ou plus.
Selon un autre mode de réalisation, le code à barres est un code à barres à 2 dimensions, composé d'un assemblage de pixels noirs et de pixels blancs, dans lesquels au moins un pixel blanc ou au moins un pixel noir est fonctionnalisé par au moins un aptamère.
Ce type de code à barres présente l'avantage de contenir davantage d'informations, tel que l'identification des bactéries, la localisation des foyers infectieux, l'antibiogramme correspondant à chaque type de bactéries et l'estimation de la quantité présente (supérieure ou inférieure à la dose infectieuse).
Selon des variantes de ce mode de réalisation, deux, trois, quatre, voire cinq pixels blancs ou plus peuvent être fonctionnalisés avec des aptamères différents, de manière à détecter deux, trois, quatre, voire cinq agents biologiques différents, ou plus.
Procédé de fabrication du biocapteur
Le dispositif de la présente invention peut être fabriqué par des techniques engendrant de faibles coûts de production.
Le dispositif de la présente invention peut être aisément miniaturisé et il peut être réalisé de manière à être à usage unique et donc détruit après utilisation.
Un procédé de fonctionnalisation de support adapté à la fabrication d'un biocapteur selon l'invention est décrit dans les exemples détaillés ci-après.
Ce procédé comprend les étapes suivantes : préparation du support, par exemple comprenant le revêtement par une couche d'alumine, suivie de l'éventuelle activation de la couche d'alumine pour permettre le greffage des aptamères, puis greffage du complexe aptamère-molécule colorante sur le support, tel que l'alumine activée ou bien greffage de l'aptamère sur le support tel que l'alumine activée suivi du greffage de la molécule colorante sur l'aptamère ainsi greffé.
Ces étapes de modification de surface (revêtement, activation, fonctionnalisation, greffage, couplage, etc.) utilisent des techniques connues de l'homme du métier.
Ce procédé peut être mis en œuvre pour fonctionnaliser une zone prédéterminée d'un code à barres, tel qu'illustré dans les exemples détaillés ci-après, afin de préparer un biocapteur selon l'invention. Procédé pour analyser une contamination
Selon un autre objet, la présente invention concerne un procédé pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement, comprenant au moins les étapes consistant à :
disposer d'un biocapteur selon l'invention,
- mettre en présence le biocapteur avec l'environnement à analyser, dans des conditions propices à l'immobilisation du ou des agents biologiques éventuellement présents dans ledit environnement par les aptamères du biocapteur,
lire le biocapteur ainsi revêtu, par exemple dans des conditions d'illumination propices à la luminescence de la molécule colorante sous sa forme non liée à l'aptamère, de manière à acquérir l'information codée par le code à barres du biocapteur ainsi revêtu, et
générer à partir de l'information acquise une information concernant la présence éventuelle d'au moins un agent biologique dans l'environnement.
Par « environnement à analyser », on entend le milieu dans lequel on souhaite détecter la présence de l'agent biologique ciblé.
Dans le cas de la détection d'une contamination bactérienne chez un patient, le dispositif de l'invention est typiquement mis en œuvre à partir de fluides corporels tels que prioritairement la sueur, l'urine, la salive ou encore le sang. Le dispositif de l'invention n'est donc pas nécessairement invasif puisqu'il peut être mis en œuvre sur un échantillon autre que du sang. L'environnement à analyser peut donc être un échantillon de fluides corporels d'un patient tels que le sang, la sueur, l'urine, ou la salive.
Dans le cas de la détection d'une contamination bactérienne dans un produit agroalimentaire, il peut s'agir de l'atmosphère gazeuse contenue dans un emballage alimentaire ou bien d'un échantillon prélevé sur ou dans le produit alimentaire, tel que le vin ou la bière.
Lors de la mise en présence du biocapteur avec l'environnement à analyser, on s'assure que les conditions sont propices à l'immobilisation du ou des agents biologiques éventuellement présents dans ledit environnement par les aptamères du biocapteur.
L'utilisation du biocapteur peut être réalisée à température ambiante. Les réponses sont typiquement obtenues en moins de 15 à 20 minutes.
Lors de la mise en présence du biocapteur et de l'environnement à analyser, si celui-ci contient des agents biologiques ciblés par ledit biocapteur, ceux-ci sont immobilisés sur les aptamères spécifiques à ces agents biologiques, ce qui provoque une génération de couleur ou un changement de couleur, par exemple du fait de réactions en chaînes qui se soldent par la libération de molécules colorantes, dans les zones correspondant aux zones de fonctionnalisation par les aptamères. L'étape suivante consiste donc à acquérir l'information codée par le code à barres soit directement en lisant le code à barre après réaction dans le cas d'une réaction colorimétrique soit en excitant la molécule colorante à une longueur d'onde adaptée pour une molécule luminescente.
Ainsi, dans le cas particulier d'une molécule colorante luminescente l'étape suivante consiste donc à lire le biocapteur ainsi revêtu, dans des conditions d'illumination propices à la luminescence de la molécule colorante sous sa forme non liée à l'aptamère, de manière à acquérir l'information codée par le code à barres du biocapteur ainsi revêtu.
L'homme du métier sera capable d'adapter les conditions d'illumination pour activer la luminescence de la molécule colorante.
Selon un mode de réalisation préféré, la luminescence de la molécule colorante n'est décelable que sous une illumination plus importante que la lumière du jour ou l'éclairage artificiel d'intérieur. Selon ce mode, la luminescence de la molécule colorante est typiquement activée au moyen d'un flash, typiquement un flash d'appareil photo ou de téléphone portable. L'homme du métier sera capable d'adapter la molécule colorante en fonction de la longueur d'onde du flash pour tirer profit de sa luminescence.
Outre les conditions de luminescence, il est également nécessaire de recueillir l'image du code à barres, typiquement au moyen d'une caméra ou d'un appareil photo, typiquement de l'appareil photo d'un téléphone portable (smartphone).
Le dispositif de la présente invention est donc facilement mis en œuvre, c'est-à- dire qu'il ne requiert aucune technique d'analyse particulière : un simple contrôle à l'aide d'un flash et d'une caméra ou d'un appareil photo est suffisant pour analyser la réponse du biocapteur.
Le mode de lecture du biocapteur de l'invention, utilisant la luminescence et de préférence la fluorescence, présente l'avantage d'être discret et confidentiel puisque seul l'utilisateur muni d'une source lumineuse et d'un moyen de lecture adaptés, typiquement un smartphone équipé d'un flash et de l'application dédiée, est apte à décrypter l'information codée dans le code à barres du biocapteur.
Dans le domaine médical, par exemple dans le cas de la détection d'une contamination bactérienne chez un patient, ce mode de lecture permet au personnel médical de ne pas alarmer le patient en cas d'infection.
Comme déjà décrit plus haut, l'analyse de l'image du code à barres permet d'accéder à diverses informations, telles que la présence ou non d'un agent biologique ciblé et l'atteinte ou non d'une dose infectieuse en fonction de l'intensité de la luminescence mesurée, ainsi que toute autre information intégrée dans le code à barres telles que la localisation de l'infection détectée, l'identification des agents pathogènes, l'estimation de la quantité des agents pathogènes pour déterminer si la dose infectieuse est dépassée ou non ou la programmation d'un antibiogramme en fonction du type de bactéries identifiées.
Ainsi, plusieurs modes de lecture du code à barres peuvent être envisagés, selon les modes de réalisation de l'invention :
- étape de lecture où le code à barres modifié code lui-même pour une information renseignant sur la présence d'un agent biologique ciblé, - étape de lecture suivie d'une comparaison avec le code à barres initial pour identifier les zones du code à barres qui apparaissent modifiées, permettant de conclure sur la présence ou non d'agents biologiques ciblés, ou
- étape de lecture suivie d'une étape de mesure du contraste des zones du code à barres qui apparaissent modifiées et comparaison avec des valeurs d'étalonnage, permettant de conclure sur la concentration en agents biologiques ciblés.
Selon un autre objet, la présente invention concerne l'utilisation d'un biocapteur selon l'invention pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement.
Le biocapteur de l'invention est adapté pour détecter la contamination par au moins un agent biologique chez un patient dans un milieu hospitalier, dans une denrée alimentaire, dans le domaine agricole ou horticole, ou dans le domaine du traitement de l'eau.
Le biocapteur de l'invention est particulièrement adapté à la détection de la contamination bactérienne chez un patient, par analyse de ses fluides corporels tels que son sang, sa sueur, son urine, ou sa salive.
Le biocapteur de l'invention est en outre particulièrement adapté à la détermination du dépassement d'une dose infectieuse.
Selon un autre objet, la présente invention concerne un dispositif pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement, comprenant au moins un biocapteur selon l'invention.
La présente invention est en outre illustrée, sans y être limitée, par les exemples ci-après. EXEMPLES
Exemple 1 - Protocole général de fixation des aptamères et du colorant
Matériel
- Agitateur et plaque (Vortex)
- Balance de précision
- Plaque chauffante
- Machine de traitement de surface Corona Réactifs
- acide 3-mercaptopropionique (MPA), Sigma Aldrich
- N-hydroxysuccinimide (NHS), Sigma Aldrich
- l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), Sigma Aldrich
- eau déionisée et eau distillée, IES
- [céphalosporine]-[ATTO], Sigma Aldrich (référence : C0682000 - 97875)
Etape 1 - Préparation du support
• Evaporation thermique d'aluminium sous vide
Un creuset rempli d'aluminium métallique a été chauffé jusqu'à évaporation de l'aluminium. En regard du creuset, un substrat de papier a été placé de manière à condenser les vapeurs d'aluminium sur ledit substrat.
Une couche d'aluminium d'épaisseur d'environ 1 μιη a été obtenue.
• Anodisation
Dans une cuve remplie d'acide phosphorique 15%, à une température de 0°C - 5°C, le substrat revêtu d'une couche d'aluminium obtenu à l'étape précédente a été placé à l'anode d'un générateur de courant continu, la cathode du système étant en platine (inerte au milieu).
Une tension comprise entre 80V - 120V a été appliquée et le substrat a été immergé pendant une durée comprise de 600 s à 900 s pour former une couche d'alumine en surface du dépôt d'aluminium. Pour 600 s : épaisseur = 425 nm - 450 nm et taille des pores = 81 nm - 96 nm. Pour 900 s : épaisseur = 800 nm - 950 nm et taille des pores = 81 nm - 96nm. • Nettoyage du support
Le support a ensuite été nettoyé en le plongeant dans de l'eau déionisée à 70°C pendant 1 minute, puis dans de l'eau déionisée à 20°C pendant 1 minute. · Traitement de surface (effet Corona)
La surface d'alumine du support nettoyé a ensuite été traitée par effet Corona pendant 30 secondes. Ce traitement permet d'améliorer la mouillabilité et la tension de surface (adhérence) de la surface d'alumine et permet en outre de la protéger contre la corrosion.
Etape 2 : Activation de la surface du support
Il est nécessaire d'activer la surface externe de la couche d'alumine du support pour préparer le greffage des aptamères.
Une méthode classique d'auto-assemblage moléculaire (self-as s embly monolayer), notamment décrite dans Wu et al. (PLOS ONE 2012, 7(11), 1-9) ou dans Braiek et al. (Biosensors 2012, 2, 417-426) a été utilisée pour revêtir la surface externe de la couche d'alumine du support de groupements labiles -O-succinimide.
Pour cela, du MPA (30 μΐ d'une solution à lOOmM) a d'abord été déposé sur la surface d'alumine, puis le support ainsi revêtu a été laissé en agitation (agitateur plaque vortex) pendant 1 heure à température ambiante.
La couche d'alumine, initialement greffée de groupements -OH, se retrouve ainsi greffée de groupements -S-CH2CH2-C(0)-OH.
Après lavage à l'eau distillée de la surface ainsi fonctionnalisée, 30 μΐ d'un mélange de EDC/NHS (solution à lOOmM en EDC et à 50mM en NHS, préalablement préparée et agitée pendant 1 heure) a été déposé sur la surface, puis le support ainsi revêtu a été laissé en agitation (agitateur plaque vortex) pendant 1 heure à température ambiante.
La couche d'alumine se retrouve ainsi greffée de groupements -S-CH2CH2-C(0)-0-succinimide, la chaîne -S-CH2CH2-C(0)- correspondant à un premier espaceur. Etape 3
Première variante : Fixation successive des aptamères et du colorant
Selon une première variante, dite « linéaire », on fixe dans un premier temps les aptamères sur le support, puis le colorant est greffé aux aptamères.
Des solutions aqueuses d'aptamères (concentration de Ιμιηοΐ/ml en aptamère) ont été préparées.
En fonction du type de bactérie que l'on souhaite détecter, on utilise un aptamère associé.
Le tableau ci-après indique un aptamère (monobrin d'ADN) associé :
Figure imgf000028_0001
Les extrémités 3 ' des aptamères mis en œuvre sont de préférence préalablement modifiées en groupements -COOH, par une technique connue de l'homme du métier.
Alternativement les extrémités 5' des aptamères mis en œuvre peuvent être modifiés en groupement NH2 par une technique bien connue de l'homme du métier.
Pour fonctionnaliser une zone spécifique de la surface du support, on peut utiliser un masque adapté aux dimensions du support et présentant au moins une ouverture qui coïncide à la zone du support que l'on souhaite fonctionnaliser lorsque le masque est superposé sur le support. Ce masque peut présenter plusieurs ouvertures qui correspondent aux différentes zones à fonctionnaliser, par un même aptamère ou de préférence par des aptamères différents de manière à pouvoir immobiliser différents agents infectieux. Ainsi, lorsque l'on souhaite fonctionnaliser une ou plusieurs zones avec un ou plusieurs aptamères, on superpose un masque adapté aux dimensions du support et présentant autant d'ouvertures que de zones à fonctionnaliser, puis on dépose partout moyen connu de l'homme du métier la ou les solutions d'aptamères dans la ou les ouvertures correspondantes, et ce lors d'une même étape.
Alternativement à l'utilisation d'un masque, d'autres techniques connues de l'homme du métier peuvent également être utilisées, comme l'impression jet d'encre. On fournit pour cela des solutions d'aptamères comme encres de l'imprimante à jet d'encre et on imprime successivement les zones du support à fonctionnaliser.
Quelle que soit la technique employée, après le dépôt d'un ou plusieurs aptamères, le support ainsi revêtu est ensuite laissé en agitation (agitateur plaque vortex) pendant 30 minutes à température ambiante, puis l'agitation est arrêtée et le support est placé sous une hotte aspirante pendant 30 minutes.
Une molécule d'aptamère (monobrin d'ADN) se fixe ainsi par un groupement - NH2 porté par une de ses bases (adénine, guanine ou cytosine) à un groupement -S-CH2CH2-C(0)-0-succinimide. Il y a formation d'une liaison amide -C(O)- NH- et départ d'une molécule de N-hydroxysuccinimide.
Le dépôt des solutions d'aptamères peut être répété encore 1 à 2 fois de manière à optimiser le taux de greffage, puis le support est laissé toute une nuit à température ambiante et est enfin rincé à l'eau distillée.
Après la fixation des aptamères sur le support, le colorant est ensuite greffé aux aptamères.
Le colorant est de préférence fourni sous la forme d'un précurseur, contenant un premier motif correspondant au colorant et un second motif correspondant à un deuxième espaceur, ces deux motifs étant liés de manière covalente.
A titre de précurseur de colorant, on utilise de préférence le composé [céphalosporine]-[ATTO] (Sigma Aldrich), dans lequel le motif [céphalosporine] désigne le deuxième espaceur et comporte un groupement -NH2 libre, et le motif [ATTO] désigne le colorant.
La fixation du composé [céphalosporine] -[ATTO] est réalisée en déposant d'abord, sur une zone spécifique du support préalablement fonctionnalisée en aptamères, de l'agent de couplage EDC (10 μί) qui permet d'activer le groupement -COOH libre de l'extrémité 3' des aptamères. Le support est mis en agitation faible sur plaque vortex pendant environ 30 minutes et 20 μΐ de complexe [céphalosporine]-[ATTO] sont déposés sur ladite zone.
Le colorant est ainsi fixé sur l'aptamère par création d'une liaison peptidique entre le groupement -NH2 libre du motif [céphalosporine] et le groupement -COOH libre de l'extrémité 3' des aptamères.
Deuxième variante : Fixation en une étape de l'aptamère et du colorant
Selon une deuxième variante, dite « convergente », on greffe d'abord le colorant sur l'aptamère, puis ce complexe est ensuite fixé sur le support.
Cette variante peut être adaptée de la première variante, en réalisant d'abord, hors du support, le couplage de l'aptamère et du colorant.
A titre d'aptamère, on utilise de préférence les aptamères décrits ci-dessus, dont les extrémités 3' sont préférentiellement préalablement modifiées en groupements -COOH, par une technique connue de l'homme du métier.
A titre de colorant, on utilise de préférence le composé [céphalosporine] - [ATTO] décrit ci-dessus.
Le couplage entre un aptamère et le colorant [céphalosporine] -[ATTO] peut être réalisé par couplage peptidique selon une méthode connue de l'homme du métier.
Le complexe aptamère- [céphalosporine] -[ATTO] peut ensuite être greffée sur la surface du support, préalablement fonctionnalisée en groupements -S-CH2CH2-C(0)-0- succinimide par une méthode similaire à celle employée dans la première variante.
Exemple 2 - Réalisation d'un biocapteur code-barres 2D
Un biocapteur code-barres 2D a été réalisé en utilisant le protocole de l'Exemple
1.
En premier lieu, les supports d'alumine sont réalisés.
Puis, les pixels du code-barres sont imprimés, en laissant vierges les zones destinées à être fonctionnalisées par les aptamères et le colorant.
Enfin, les aptamères ont été greffés sur les zones spécifiques prédéterminées.
Un biocapteur capable de détecter à la fois Escherichia coli ATCC 8739 et Staphylococcus aureus a notamment été préparé en utilisant les aptamères décrits ci-dessus et le colorant [céphalosporine] -[ATTO]. Exemple 3 - Mise en œuyre d'un biocapteur code-barres 2D
Quatre biocapteurs code-barres 2D identiques, fabriqués à l'Exemple 2 et capables de détecter Escherichia coli ATCC 8739 et Staphylococcus aureus, ont été testés en appliquant sur chacun des codes-barres 2D :
un échantillon témoin comprenant uniquement du sérum physiologique, un échantillon n°l comprenant Escherichia coli ATCC 8739 selon une concentration de 106 cfu dans du sérum physiologique, - un échantillon n°2 comprenant Staphylococcus aureus selon une concentration de 104 cfu dans du sérum physiologique, ou
un échantillon n°3 comprenant Escherichia coli ATCC 8739 selon une concentration de 106 cfu et la Staphylococcus aureus selon une concentration de 104 cfu du sérum physiologique. Après application des échantillons, à l'œil nu, aucune différence de code n'était décelable.
Les codes-barres 2D des trois biocapteurs ont été pris en photo avec un smartphone équipé d'un flash (longueur d'ondes de 640 nm à 670 nm).
Sur la photo du code-barres de l'échantillon témoin, aucune différence n'a été identifiée avec le code initial.
En revanche, sur la photo du code-barres de l'échantillon n°l, le code est apparu modifié par rapport au code initial, la zone fonctionnalisée par l'aptamère spécifique à Escherichia coli ATCC 8739 est apparue colorée.
De même, sur la photo du code-barres de l'échantillon n°2, le code est apparu modifié par rapport au code initial, la zone fonctionnalisée par l'aptamère spécifique à Staphylococcus aureus est apparue colorée.
Quant à la photo du code-barres de l'échantillon n°3, le code est également apparu modifié par rapport au code initial, les zones fonctionnalisées par l'aptamère spécifique à Escherichia coli ATCC 8739 et par l'aptamère spécifique à Staphylococcus aureus ont toutes les deux apparues colorées. La comparaison du code pris en photo par le smartphone avec un code de référence, de préférence enregistré dans le smartphone, a donc permis de déterminer la présence ou non d'une bactérie dans l'échantillon, ainsi que le type de bactérie.
La mesure du contraste de la couleur qui apparaît sur la photo du code, comparée à des valeurs d'étalonnage préalablement enregistrées, a en outre permis de déterminer la concentration de bactéries dans chacun des échantillons n°l, n°2 et n°3.
Example 4 - Exemple de réalisation avec code à barre 1D et 2D par utilisation d'un antibiotique chromogène à titre de molécule colorante
Dans cet exemple, c'est le biocapteur tel que réalisé dans l'exemple 5 ci-après, qui est utilisé.
4.1. Réalisation d'un code à barres 2D
La figure 3 illustre l'évolution visuelle d'un code à barres 2D par changement de teinte de couleur avant et après révélation d'une bactérie cible par un biocapteur selon l'invention.
On fait les observations suivantes :
- en (a), la matrice base du Code barre 2D. Elle est formée de petits carrés.
- en (b), Code barre 2D renferme une information par exemple dans le cas présent « neg » (pour négatif). Ceci est rendu possible car il y a un contraste entre les petits carrés jaunes (foncés) et les blancs (clairs).
Certains petits carrés (blancs ou jaunes) ont été fonctionnalisés par le processus décrit plus haut. Mise en contact avec un échantillon biologique liquide tel que la salive, l'usine, le sang, la transpiration ou toutes préparations utilisant de tels échantillons.
- en (c), le Code barre 2D est fonctionnalisé pour détecter une ou plusieurs bactéries cibles et est utilisé comme décrit précédemment. Dans le cas présent, ce code barre 2D détecte l'absence de bactéries cibles.
- en (d), un Code barre 2D fonctionnalisé pour détecter une ou plusieurs bactéries cibles est utilisé comme décrit précédemment. Dans le cas présent le Code barre 2D détecte la présence de bactéries cibles. A savoir les petits carrés fonctionnalisés changent de teintes (les foncés peuvent devenir clairs ou vice versa). Dans le cas présent, les petits carrés jaunes ou blancs deviennent rouges. De ce fait, les petits carrés jaunes et blancs deviennent les « Clairs » et les petits carrés rouges deviennent les « Foncés ». Par conséquent, le message porté par le code barre 2D a évolué. Le contraste ainsi produit permet de lire « pos » pour positif.
4.2. Réalisation d'un code à barres ID
La figure 4 illustre l'évolution visuelle d'un code à barres ID par changement de teinte de couleur avant et après révélation d'une bactérie cible par un biocapteur selon l'invention.
On fait les observations suivantes :
- en (a), à savoir avant mise en contact de la bactérie avec le biocapteur, la matrice base du Code barre ID est formée de rectangles foncés ou clairs.
- en (b), le Code barre ID renferme une information par exemple dans le cas présent « neg » (pour négatif). Ceci est rendu possible car il y a un contraste entre les rectangles jaunes (foncés) et les blancs (clairs).
Certains rectangles (blancs ou jaunes) ont été fonctionnalisés par le processus décrit précédemment.
- en (c) le biocapteur est fonctionnalisé pour détecter une ou plusieurs bactéries cibles est utilisé comme décrit précédemment. Dans le cas présent, ce code barre ID détecte juste la présence d'une bactérie cible. Les rectangles restent jaunes. Ainsi, ce code barre ID détecte l'absence de bactéries cibles.
- en (d) le biocapteur fonctionnalisé et utilisé et réagit positivement. A savoir les rectangles fonctionnalisés ont changé de teintes (les foncés peuvent devenir clairs et vice versa).
Dans le cas présent, les rectangles jaunes ou blancs deviennent rouges. De ce fait, les rectangles jaunes et blancs deviennent les « Clairs » et les rectangles rouges deviennent les « Foncés ». Par conséquent, le message porté par le code barre ID a évolué. Le contraste ainsi produit permet de lire « pos » pour positif. Exemple 5 - Mise en œuyre d'un biocapteur plastique souple
Le biocapteur décrit dans cet exemple illustre la variante de l'invention dans laquelle une molécule colorante comprend un antibiotique chromogène, dans le présent exemple de la classe des céphalosporines : la nitrocéfïne, cette variante ne nécessitant pas la présence d'un second espaceur. Aucune rupture de liaison labile n'est produite suite à l'attaque de la β-lactamase sur le noyau lactame de l'antibiotique.
Matériel
- Agitateur et plaque (Vortex)
- Balance de précision
- Plaque chauffante
- Machine de traitement de surface Corona Réactifs
le 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TPM)), Sigma Aldrich Hydroxyde de soude (NaOH), Sigma Aldrich
eau déionisée et eau distillée, IES
Nitrocéphine, Sigma Aldrich
Aptamère E coli 0157 :H7 modifié à son extrémité 5' par NH2 Diméthyl sulfoxide (DMSO), Sigma Aldrich
Lactamator : Solution de Beta lactamases, CPC Biotech
Etape 1 : préparation du support
Dans un exemple, le support fonctionnalisé est un support plastique souple, le Teslin, un substrat hydrophobe et synthétique qui possède l'avantage d'être très résistant, tout en étant très fin.
Comme précédemment (exemple 1), un pré-traitement corona est réalisé pendant
5 minutes.
Des groupements OH sont ensuite ajoutés à la surface du substrat grâce à un bain de soude à basse concentration (<20%) avant d'être rincé à l'eau distillée.
Etape 2 : Greffage de l'aptamère à l'aide d'un linker
Cette technique d'immobilisation repose, comme précédemment (exemple 1) sur le principe des Self-Assembled Monolayers, constituées ici d'un organosilane, le TPM.
Cette étape nécessite plusieurs heures d'incubation (lh à 6h) et a été testé pour des concentrations comprises entre 10 et 50 mM. L'incubation est réalisée sous hotte aspirante, sous agitation et à température ambiante. Afin d'éliminer les molécules n'ayant pas été greffées, un rinçage à l'eau distillée est effectué.
S'ensuit la fixation de l'aptamère sur le TPM. L'extrémité 5' de l'aptamère a été modifiée avec un groupement aminé (NH2) par une technique connue de l'homme du métier. Les aptamères sont ensuite ajoutés à l'échantillon conformément au protocole suivi dans l'exemple 1.
L'échantillon est ensuite rincé à l'eau distillée afin d'éliminer les aptamères n'ayant pas lié le TPM de façon spécifique.
Etape 3 : Fixation du colorant
L'aptamère testé (SEQ ID NO 4) se termine par une base guanine, possédant naturellement à son extrémité un groupement NH2 libre (car l'aptamère étant simple brin, le groupement NH2 n'est pas engagé avec une cytosine dans une liaison hydrogène, comme c'est le cas en configuration double brin).
Ce groupement NH2 est utilisé pour la fixation de la molécule colorante. Dans cet exemple, la molécule colorante désigne un antibiotique chromogène de la classe des céphalosporines : la nitrocéfme. L'utilisation d'un antibiotique chromogène est la variante testée ici, car elle permet de s'affranchir d'une étape supplémentaire et simplifie la détection de couleur (visible à l'œil nu).
Différentes concentrations de nitrocéfme ont été testées à ce jour (5 à 30 mM).
Après une incubation (30 minutes à 3heures), l'échantillon est rincé avec du DMSO. A l'issue de cette étape, une coloration jaune apparaît sur le support. Etape 4 : Test colorimétrique et spécificité
Un premier test est réalisé afin de s'assurer de la présence de nitrocéfme à la surface du substrat fonctionnalisé : quelques dizaines de micro litres de solution β-lactamase sont déposés. Une coloration rouge est alors observée à la surface du substrat, suggérant qu'il y a bel et bien eu liaison de la nitrocéfme à la construction moléculaire greffée sur le substrat.
Un second test est réalisé afin de vérifier qu'en l'absence de la construction moléculaire décrite ci-dessus la nitrocéfme est éliminée lors du rinçage au DMSO. Le test est réalisé après deux étapes différentes (étape 1 et étape 2). Dans les deux cas, l'ajout de β-lactamase ne provoque pas de réaction colorimétrique.

Claims

REVENDICATIONS
1. Biocapteur pour détecter la présence et/ou mesurer la concentration d'au moins un agent biologique, comprenant un support sur lequel est disposé un code à barres dont au moins une zone est fonctionnalisée par au moins un aptamère apte à immobiliser sélectivement ledit agent biologique, ledit aptamère étant lui-même lié, directement ou non, à une molécule colorante apte soit à produire de la couleur, soit à changer de couleur suite à l'immobilisation de l'agent biologique par ledit aptamère.
2. Biocapteur selon la revendication précédente, dans lequel la molécule colorante est liée directement ou non via une liaison labile.
3. Biocapteur selon la revendication l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le support est un support souple ou rigide, sur lequel est disposé le code à barres.
4. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le support est en verre, en papier ou en plastique, par exemple du polypropylène ou du polyéthylène microporeux.
5. Biocapteur selon la revendication précédente, dans lequel une couche d'alumine est disposée sur le support.
6. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le code à barres est un code à barres à 1 dimension, composé d'un assemblage de bandes noires et de bandes blanches parallèles, dans lesquelles au moins une zone d'au moins une bande blanche ou d'une bande noire est fonctionnalisée par au moins un aptamère.
7. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le code à barres est un code à barres à 2 dimensions, composé d'un assemblage de pixels noirs et de pixels blancs, dans lesquels au moins un pixel blanc ou au moins un pixel noir est fonctionnalisé par au moins un aptamère.
8. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'aptamère apte à immobiliser sélectivement ledit agent biologique est un brin d' AR , un brin d'ADN ou un peptide, et en particulier un brin d'ARN ou d'ADN, dont l'extrémité 3' est modifiée pour porter une fonction -COOH ou encore dont l'extrémité 5' est modifiée pour porter une fonction -NH2.
9. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'aptamère est lié de manière covalente à la zone du code à barres via un premier espaceur, de préférence un espaceur de formule -S-(CH2)n-C(0)- où n est un entier compris de 2 à 6 et dans lequel l'atome de soufre est lié de manière covalente au support et l'atome de carbone du groupe C(O) est lié de manière covalente à un atome d'azote de l'aptamère ou est lié par une liaison silane (OH-Silane-NH2), par exemple le TPM, par un linker hétérobifonctionnel (SH-linker hétérbifonctionnel -NH2) par exemple le SMCC ou encore par UV.
10. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'agent biologique est choisi dans le groupe constitué par les bactéries, les prions et les virus, les mycotoxines et les peptides.
11. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'agent biologique est une bactérie et l'aptamère est apte à fixer sélectivement au moins une protéine membranaire de ladite bactérie, choisis par exemple parmi les lipopolysaccharides (LPS) et les peptidoglycanes (PPG).
12. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'agent biologique est une bactérie choisie dans le groupe constitué par Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Streptococcus pneumoniae, Treponema pallidum, Salmonella gastroenteretis, Listeria monocytogenes et Legionella spp.
13. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ladite molécule colorante est non luminescente et peut être choisie parmi un antibiotique chromogène tel que les céphalosporines ou les pénicillines ou est luminescente et en particulier fluorescente, et peut être choisie parmi le 5-FAM, le 6-FAM, les colorants de type ATTO, notamment l'ATTO 532 ou l'ATTO 550, l'ATTO 647, le DY-510XL, le DY-530, le HEX, le CAL Fluor Orange 560, et est en particulier l'ATTO.
14. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel ladite molécule colorante est non luminescente sous sa forme liée à l'aptamère et luminescente, de préférence fluorescente, sous sa forme non liée à l'aptamère.
15. Biocapteur selon la revendication précédente, dans lequel la molécule colorante possède une bande d'absorption luminescente comprise de 600 nm à 700 nm, de préférence de 640 nm à 670 nm, et une bande d'émission luminescente comprise de 600 nm à 700 nm, de préférence de 665 nm à 675 nm ou un shift colorimétrique minimal pour une détection.
16. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la molécule colorante est liée de manière covalente à l'aptamère via un second espaceur, ledit second espaceur étant lié à la molécule colorante par une liaison chimique labile qui est apte à se rompre suite à l'immobilisation de l'agent biologique par l'aptamère, par exemple une liaison chimique labile apte à se rompre en présence d'une β-lactamase.
17. Biocapteur selon la revendication précédente, dans lequel le second espaceur est un radical divalent comprenant un motif β-lactame, par exemple un motif céphalosporine.
18. Biocapteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la molécule colorante est un antibiotique lié de manière covalente à l'aptamère, ladite molécule colorante étant apte à produire une couleur ou changer de couleur suite à l'immobilisation de l'agent biologique par l'aptamère, par exemple ladite molécule chimique comprenant un antibiotique chromogène.
19. Procédé pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement, comprenant au moins les étapes consistant à :
disposer d'un biocapteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, mettre en présence le biocapteur avec l'environnement à analyser, dans des conditions propices à l'immobilisation du ou des agents biologiques éventuellement présents dans ledit environnement par les aptamères du biocapteur,
lire le biocapteur ainsi revêtu, par exemple dans des conditions d'illumination propices à la luminescence de la molécule colorante sous sa forme non liée à l'aptamère, de manière à acquérir l'information codée par le code à barres du biocapteur ainsi revêtu, et
générer à partir de l'information acquise une information concernant la présence éventuelle d'au moins un agent biologique dans l'environnement.
20. Utilisation d'un biocapteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement.
21. Dispositif pour analyser la contamination par au moins un agent biologique dans un environnement, comprenant au moins un biocapteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 18.
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