[go: up one dir, main page]

WO2018092374A1 - 核酸分子およびその用途 - Google Patents

核酸分子およびその用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2018092374A1
WO2018092374A1 PCT/JP2017/030180 JP2017030180W WO2018092374A1 WO 2018092374 A1 WO2018092374 A1 WO 2018092374A1 JP 2017030180 W JP2017030180 W JP 2017030180W WO 2018092374 A1 WO2018092374 A1 WO 2018092374A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecule
polynucleotide
modified
lysozyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2017/030180
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
行大 白鳥
あすみ 稲熊
晃尚 清水
金子　直人
嘉仁 吉田
穣 秋冨
藤田　智子
克紀 堀井
巌 和賀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NEC Solution Innovators Ltd
Original Assignee
NEC Solution Innovators Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NEC Solution Innovators Ltd filed Critical NEC Solution Innovators Ltd
Priority to JP2018551037A priority Critical patent/JP6687264B2/ja
Publication of WO2018092374A1 publication Critical patent/WO2018092374A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid molecules that bind to egg-derived lysozyme and uses thereof.
  • Eggs are a food that is frequently consumed on a daily basis, but in recent years, there has been an increase in the number of patients with egg allergies, which is regarded as a problem. Since many processed foods use eggs, it is extremely important to analyze whether or not eggs are mixed as raw materials in processed foods and their production lines.
  • Allergic allergens are generally proteins and their degradation products (peptides), and analysis methods using antibodies using these as antigens are the mainstream.
  • lysozyme which is an egg white protein is known as an allergen.
  • ELISA method As an analysis method for lysozyme, a method using an ELISA method has been reported (Non-patent Document 1).
  • an antibody is a protein and has a problem in stability, it is difficult to use the antibody for a simple test method at a low cost. Further, electrophoresis, blotting on a nitrocellulose membrane, and the like are necessary, and the operation is complicated. For this reason, in recent years, attention has been focused on nucleic acid molecules that specifically bind to antigens instead of antibodies.
  • an object of the present invention is to provide a new nucleic acid molecule that binds to egg-derived lysozyme.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule that binds to lysozyme, characterized in that it comprises any of the following polynucleotides (a) or (b).
  • (b) comprising a nucleotide sequence having 90% or more identity to the nucleotide sequence of (a)
  • the egg-derived lysozyme detection reagent of the present invention contains the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the method for detecting an egg-derived lysozyme of the present invention comprises contacting the nucleic acid molecule of the present invention or the detection reagent of the present invention with a sample, the egg-derived lysozyme in the sample, the nucleic acid molecule or the detection reagent, and Forming a complex of: A step of detecting the complex.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can bind to egg-derived lysozyme. Therefore, according to the nucleic acid molecule of the present invention, egg-derived lysozyme can be detected based on the presence or absence of binding to the allergen in the sample. Therefore, the nucleic acid molecule of the present invention can be said to be a very useful tool for detecting, for example, allergens derived from eggs in fields such as food production, food management, and food distribution.
  • FIG. 1 shows a presumed secondary structure of aptamer 1 in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing aptamer 1 binding to egg-derived lysozyme in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the binding property of aptamer 1 to an egg sample in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the binding property of aptamer 1 to lysozyme in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 5 shows the predicted secondary structures of aptamers 2 to 7 in Example 2 of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the binding property of each aptamer to egg-derived lysozyme in Example 2 of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the measurement results of the light emission amount in Example 3 of the present invention.
  • FIG. 8 is a graph showing the measurement result of the light emission amount in Example 3 of the present invention.
  • nucleic acid molecule of this invention is a nucleic acid molecule couple
  • (b) comprising a nucleotide sequence having 90% or more identity to the nucleotide sequence of (a)
  • the target is egg-derived lysozyme.
  • the eggs are, for example, chicken eggs and quail eggs.
  • the egg-derived lysozyme is, for example, chicken egg-derived lysozyme, and specifically, for example, egg white-derived lysozyme of chicken egg.
  • commercially available lysozyme can be used as lysozyme for confirming the binding ability, and specific examples include lysozyme derived from egg white of chicken eggs (120-02674, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the lysozyme may be, for example, an unmodified allergen that has not been denatured by heating or the like, or a denatured allergen that has been denatured by heating or the like.
  • the egg-derived lysozyme is hereinafter simply referred to as lysozyme.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can bind to lysozyme as described above.
  • binding to lysozyme means, for example, having a binding property to lysozyme or having a binding activity to lysozyme.
  • the binding between the nucleic acid molecule of the present invention and lysozyme can be determined by, for example, surface plasmon resonance molecular interaction (SPR) analysis.
  • SPR surface plasmon resonance molecular interaction
  • BIACORE 3000 (trade name, GE Healthcare UK Ltd.) can be used. Since the nucleic acid molecule of the present invention binds to lysozyme, it can be used, for example, for detection of lysozyme.
  • the nucleic acid molecule of the present invention has a dissociation constant indicating a binding force to lysozyme, for example, 1.04 nM or less.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is also called a DNA molecule or a DNA aptamer.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of the polynucleotide (a) or (b) or a molecule containing the polynucleotide.
  • the polynucleotide (a) may be, for example, a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 1, a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1, or a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. It may be a polynucleotide containing a partial sequence or a polynucleotide comprising the partial sequence.
  • the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 is shown below.
  • Lys391TR8m4 (SEQ ID NO: 1) GGTTAATCCCGACAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTCACCACGGCTCATTTG
  • the partial sequence is not particularly limited, and examples thereof include the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 2 to 7.
  • Lys391TR8m4_s64 (SEQ ID NO: 2) GGTTAATCCCGACAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTC Lys391TR8m4_s54 (SEQ ID NO: 3) GACAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTC Lys391TR8m4_s52 (SEQ ID NO: 4) CAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTC Lys391TR8m4_s69 (SEQ ID NO: 5) GACAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTCACCACGGCTCATTTG Lys391TR8m4_s67 (SEQ ID NO: 6) CAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTCACCACGGCTCATTTG Lys391TR8m4_s67 (S
  • the “identity” is not particularly limited as long as the polynucleotide of (b) is bound to lysozyme.
  • the identity is, for example, 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99%. % Or more.
  • the identity can be calculated with default parameters using analysis software such as BLAST and FASTA (hereinafter the same).
  • the polynucleotide in the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, the polynucleotide (c) below.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of the polynucleotide (c) or a molecule containing the polynucleotide.
  • C A polynucleotide comprising a base sequence complementary to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide comprising the base sequence of (a) and binding to egg-derived lysozyme
  • the “hybridizing polynucleotide” is not particularly limited, and is, for example, a polynucleotide that is completely or partially complementary to the base sequence of (a).
  • the hybridization can be detected by, for example, various hybridization assays.
  • the hybridization assay is not particularly limited, for example, Zanburuku (Sambrook) et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2 nd Ed) ,” [Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] and the like can also be employed.
  • the “stringent conditions” may be, for example, any of low stringent conditions, medium stringent conditions, and high stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C.
  • Medium stringent conditions are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C.
  • the degree of stringency can be set by those skilled in the art by appropriately selecting conditions such as temperature, salt concentration, probe concentration and length, ionic strength, time, and the like.
  • “Stringent conditions” are, for example, Zanburuku previously described (Sambrook) et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2 nd Ed) ,” [Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989)]] and the like.
  • the polynucleotide in the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, the polynucleotide (d) below.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of the polynucleotide (d) or a molecule containing the polynucleotide.
  • D a polynucleotide comprising a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added in the base sequence of (a), and binding to egg-derived lysozyme
  • “one or several” may be, for example, within a range in which the polynucleotide of (d) binds to egg-derived lysozyme.
  • the “one or several” in the base sequence of (a) is, for example, 1 to 10, preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5, further preferably 1 to 3, particularly preferably. Is one or two.
  • the polynucleotide in the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, the polynucleotide (e) below.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of the polynucleotide (e) or a molecule containing the polynucleotide.
  • E a polynucleotide that binds to egg-derived lysozyme, comprising a base sequence having at least 80% identity to the base sequence of (a), comprising any one of SEQ ID NOs: 2 to 7
  • identity is not particularly limited, and is the same as (b), for example.
  • the polynucleotide in the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, the polynucleotide (f) below.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of the polynucleotide (f) or a molecule containing the polynucleotide.
  • F a base sequence having 80% or more identity to at least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 7, represented by the following formulas (I) to (VII): That bind to egg-derived lysozyme capable of forming a secondary structure
  • “identity” is not particularly limited, and is the same as (b), for example.
  • “can form a secondary structure” means, for example, that the polynucleotide of (f) can form a stem structure and a loop structure in the above formula. The stem structure and loop structure will be described later.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may include, for example, one of the polynucleotide sequences (a) to (f) or a plurality of the polynucleotide sequences. In the latter case, it is preferable that a plurality of polynucleotide sequences are linked to form a single-stranded polynucleotide.
  • the sequences of the plurality of polynucleotides may be directly linked to each other or indirectly linked via a linker.
  • the polynucleotide sequences are preferably linked directly or indirectly at the respective ends.
  • the sequences of the plurality of polynucleotides may be the same or different, for example, but are preferably the same.
  • the number of the sequences is not particularly limited, and is, for example, 2 or more, preferably 2 to 12, more preferably 2 to 6, and further preferably 2. is there.
  • the linker is, for example, a polynucleotide, and the structural unit is, for example, a nucleotide residue.
  • the nucleotide residue include a ribonucleotide residue and a deoxyribonucleotide residue.
  • the length of the linker is not particularly limited, and is, for example, 1 to 24 bases long, preferably 12 to 24 bases long, more preferably 16 to 24 bases long, and further preferably 20 to 24 bases long. It is long.
  • the polynucleotide is preferably a single-stranded polynucleotide.
  • the single-stranded polynucleotide is preferably capable of forming a stem structure and a loop structure by, for example, self-annealing.
  • the polynucleotide is preferably capable of forming a stem loop structure, an internal loop structure, and / or a bulge structure, for example.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, double stranded.
  • one single-stranded polynucleotide is any one of the polynucleotides (a) to (f), and the other single-stranded polynucleotide is not limited.
  • the other single-stranded polynucleotide include a polynucleotide having a base sequence complementary to any one of the polynucleotides (a) to (f).
  • the nucleic acid molecule of the present invention is double-stranded, it is preferably dissociated into a single-stranded polynucleotide by denaturation or the like prior to use.
  • the dissociated single-stranded polynucleotide of any one of (a) to (f) preferably has a stem structure and a loop structure as described above, for example.
  • the stem structure and the loop structure can be formed means, for example, that the stem structure and the loop structure are actually formed, and even if the stem structure and the loop structure are not formed, the stem structure depending on the conditions. And the ability to form a loop structure.
  • a stem structure and a loop structure can be formed includes, for example, both experimental confirmation and prediction by a computer simulation.
  • the structural unit of the nucleic acid molecule of the present invention is, for example, a nucleotide residue.
  • the length of the nucleic acid molecule is not particularly limited, and the lower limit thereof is, for example, 15 base length, preferably 75 base length or 80 base length, and the upper limit thereof is, for example, 1000 base length, preferably Is 200 bases, 100 bases or 90 bases long.
  • nucleotide residue examples include deoxyribonucleotide residue and ribonucleotide residue.
  • nucleic acid molecule of the present invention examples include DNA composed only of deoxyribonucleotide residues, DNA containing one or several ribonucleotide residues, and the like. In the latter case, “1 or several” is not particularly limited, and is, for example, 1 to 3 in the polynucleotide.
  • the numerical range of numbers such as the number of bases and the number of sequences, for example, discloses all positive integers belonging to the range. That is, for example, the description “1 to 3 bases” means all disclosures of “1, 2, 3 bases” (hereinafter the same).
  • the polynucleotide includes, for example, at least one modified base.
  • the modified base is not particularly limited, and examples thereof include a base modified with a natural base (non-artificial base), and preferably has the same function as the natural base.
  • the natural base is not particularly limited, and examples thereof include a purine base having a purine skeleton and a pyrimidine base having a pyrimidine skeleton.
  • the purine base is not particularly limited, and examples thereof include adenine (a) and guanine (g).
  • the pyrimidine base is not particularly limited, and examples thereof include cytosine (c), thymine (t), uracil (u) and the like.
  • the base modification site is not particularly limited.
  • examples of the purine base modification site include the 7th and 8th positions of the purine skeleton.
  • examples of the modification site of the pyrimidine base include the 5th and 6th positions of the pyrimidine skeleton.
  • modified uracil or modified thymine when “ ⁇ O” is bonded to carbon at position 4 and a group other than “—CH 3 ” or “—H” is bonded to carbon at position 5, it is called modified uracil or modified thymine. Can do.
  • the modifying group of the modifying base is not particularly limited, and examples thereof include a methyl group, a fluoro group, an amino group, a thio group, a benzylaminocarbonyl group represented by the following formula (1), and a tryptaminocarbonyl represented by the following formula (2).
  • the modified base is not particularly limited.
  • modified adenine modified with adenine, modified thymine modified with thymine, modified guanine modified with guanine, modified cytosine modified with cytosine and modified modified with uracil examples include uracil and the like, and the modified thymine, the modified uracil and the modified cytosine are preferable.
  • modified adenine examples include 7'-deazaadenine and the like.
  • modified guanine examples include, for example, 7'-deazaguanine.
  • modified cytosine examples include 5'-methylcytosine.
  • modified thymine examples include 5'-benzylaminocarbonylthymine, 5'-tryptaminocarbonylthymine, 5'-isobutylaminocarbonylthymine and the like.
  • modified uracil examples include 5'-benzylaminocarbonyluracil (BndU), 5'-tryptaminocarbonyluracil (TrpdU), 5'-isobutylaminocarbonyluracil and the like.
  • the polynucleotide is not particularly limited, and may include, for example, only one type of the modified base, or may include two or more types of the modified base.
  • the number of the modified base is not particularly limited.
  • the number of the modified base is, for example, one or more.
  • the modified base is, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 40, particularly preferably 1 to 30, and most preferably. 1 to 20 and all the bases may be the modified bases.
  • the number of the modified bases may be, for example, the number of any one of the modified bases or the total number of the two or more modified bases.
  • the modified base in the entire length of the nucleic acid molecule containing the polynucleotide is not particularly limited, and is, for example, 1 to 80, 1 to 50, or 1 to 20, preferably in the same range as described above. It is.
  • the ratio of the modified base is not particularly limited.
  • the ratio of the modified base is, for example, 1/100 or more, preferably 1/40 or more, more preferably 1/20 or more, still more preferably 1/10 or more, particularly preferably, of the total number of bases of the polynucleotide. 1/4 or more, most preferably 1/3 or more.
  • the ratio of the modified base in the entire length of the nucleic acid molecule containing the polynucleotide is not particularly limited, and is the same as the above range.
  • the total number of bases is, for example, the total number of natural bases and modified bases in the polynucleotide.
  • the ratio of the modified base is expressed as a fraction, and the total number of bases and the number of modified bases that satisfy this are positive integers.
  • the number of the modified thymine is not particularly limited.
  • natural thymine can be substituted for the modified thymine.
  • the number of the modified thymine is, for example, one or more.
  • the modified thymine is, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 40, particularly preferably 1 to 30, and most preferably. 1 to 21 and all the thymines may be the modified thymines.
  • the ratio of the modified thymine is not particularly limited.
  • the ratio of the modified thymine is, for example, 1/100 or more, preferably 1/40 or more, more preferably 1/20 or more, further preferably 1 out of the total number of the natural thymine and the modified thymine. / 10 or more, particularly preferably 1/4 or more, and most preferably 1/3 or more.
  • the number of the modified uracil is not particularly limited.
  • natural thymine can be substituted for the modified uracil.
  • the number of the modified uracil is, for example, one or more.
  • the modified uracil is, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 40, particularly preferably 1 to 30, and most preferably. 1 to 21 and all the uracils may be the modified uracils.
  • the ratio of the modified uracil is not particularly limited.
  • the ratio of the modified uracil is, for example, 1/100 or more, preferably 1/40 or more, more preferably 1/20 or more, and further preferably 1 out of the total number of the natural thymines and the number of the modified uracils. / 10 or more, particularly preferably 1/4 or more, and most preferably 1/3 or more.
  • Examples of the number of the modified thymine and the modified uracil may be, for example, the total number of both.
  • the number of the modified cytosines is not particularly limited.
  • natural cytosine can be substituted for the modified cytosine.
  • the number of the modified cytosines is, for example, one or more.
  • the modified cytosine is, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 40, particularly preferably 1 to 30, and most preferably. 1 to 21 and all cytosines may be the modified cytosine.
  • the ratio of the modified cytosine is not particularly limited.
  • the ratio of the modified cytosine is, for example, 1/100 or more, preferably 1/40 or more, more preferably 1/20 or more, further preferably 1 out of the total number of the natural cytosine and the modified cytosine. / 10 or more, particularly preferably 1/4 or more, and most preferably 1/3 or more.
  • the modified base is the modified adenine or the modified guanine
  • cytosine and modified cytosine are referred to as “adenine” and “modified adenine” or “guanine” and It can be read as “modified guanine”.
  • natural adenine can be substituted with the modified adenine
  • natural guanine can be substituted with the modified guanine.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain a modified nucleotide.
  • the modified nucleotide may be a nucleotide having the modified base described above, a nucleotide having a modified sugar in which a sugar residue is modified, or a nucleotide having the modified base and the modified sugar.
  • the sugar residue is not particularly limited, and examples thereof include deoxyribose residue or ribose residue.
  • the modification site in the sugar residue is not particularly limited, and examples thereof include the 2'-position and the 4'-position of the sugar residue, and both of them may be modified.
  • Examples of the modifying group of the modified sugar include a methyl group, a fluoro group, an amino group, and a thio group.
  • the base when the base is a pyrimidine base, for example, the 2'-position and / or the 4'-position of the sugar residue is preferably modified.
  • Specific examples of the modified nucleotide residue include, for example, a 2′-methylated-uracil nucleotide residue and a 2′-methylated-cytosine nucleotide residue in which the deoxyribose residue or the 2 ′ position of the ribose residue is modified.
  • the number of the modified nucleotides is not particularly limited.
  • the polynucleotide for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 40, particularly The number is preferably 1 to 30, and most preferably 1 to 21.
  • the modified nucleotides in the entire length of the nucleic acid molecule including the polynucleotide are not particularly limited, and are, for example, 1 to 80, 1 to 50, and 1 to 20, preferably in the same range as described above. It is.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, one or several artificial nucleic acid monomer residues.
  • the “one or several” is not particularly limited, and for example, in the polynucleotide, for example, 1 to 80, preferably 1 to 70, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 40 Particularly preferred is 1 to 30, most preferably 1 to 21.
  • the artificial nucleic acid monomer residue include PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), ENA (2'-O, 4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acids) and the like.
  • the nucleic acid in the monomer residue is the same as described above, for example.
  • the artificial nucleic acid monomer residue in the entire length of the nucleic acid molecule containing the polynucleotide is not particularly limited, and is, for example, 1 to 80, 1 to 50, or 1 to 20, preferably the above-mentioned Similar to range.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is preferably nuclease resistant, for example.
  • the nucleic acid molecule of the present invention preferably has, for example, the modified nucleotide residue and / or the artificial nucleic acid monomer residue for nuclease resistance. Since the nucleic acid molecule of the present invention is nuclease resistant, for example, tens of kDa PEG (polyethylene glycol) or deoxythymidine may be bound to the 5 'end or 3' end.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may further have an additional sequence, for example.
  • the additional sequence is preferably bound to, for example, at least one of the 5 'end and the 3' end of the nucleic acid molecule, and more preferably the 3 'end.
  • the additional sequence is not particularly limited.
  • the length of the additional sequence is not particularly limited, and is, for example, 1 to 200 bases long, preferably 1 to 50 bases long, more preferably 1 to 25 bases long, and further preferably 18 to 24 bases long. It is.
  • the structural unit of the additional sequence is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • the additional sequence is not particularly limited, and examples thereof include polynucleotides such as DNA consisting of deoxyribonucleotide residues and DNA containing ribonucleotide residues. Specific examples of the additional sequence include poly dT and poly dA.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be used, for example, immobilized on a carrier.
  • a carrier In the nucleic acid molecule of the present invention, for example, either the 5 'end or the 3' end can be immobilized.
  • the nucleic acid molecule may be immobilized directly or indirectly on the carrier. In the latter case, the nucleic acid molecule of the present invention is immobilized on the carrier, for example, via the additional sequence.
  • the carrier include beads, plates, filters, columns, substrates, containers and the like.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may further have a labeling substance, and specifically, the labeling substance may be bound to the nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule to which the labeling substance is bound can also be referred to as a nucleic acid sensor of the present invention, for example.
  • the labeling substance may be bound to, for example, at least one of the 5 'end and the 3' end of the nucleic acid molecule.
  • the labeling with the labeling substance may be, for example, binding or chemical modification.
  • the labeling substance is not particularly limited, and examples thereof include enzymes, fluorescent substances, dyes, isotopes, drugs, toxins, and antibiotics.
  • Examples of the enzyme include luciferase and SA-Lucia luciferase.
  • Examples of the fluorescent substance include pyrene, TAMRA, fluorescein, Cy3 dye, Cy5 dye, FAM dye, rhodamine dye, Texas red dye, JOE, MAX, HEX, TYE and the like, and the dye includes, for example, And Alexa dyes such as Alexa 488 and Alexa 647.
  • the labeling substance may be linked directly to the nucleic acid molecule or indirectly via a linker, for example.
  • the linker is not particularly limited and is, for example, a polynucleotide linker.
  • the method for producing the nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited, and can be synthesized by, for example, a known method such as a nucleic acid synthesis method using chemical synthesis or a genetic engineering technique.
  • the nucleic acid molecule of the present invention exhibits binding to lysozyme as described above. For this reason, the use of the nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited as long as it uses binding to lysozyme.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be used in various methods in place of, for example, an antibody against lysozyme.
  • lysozyme can be detected.
  • the method for detecting lysozyme is not particularly limited, and can be performed by detecting the binding between lysozyme and the nucleic acid molecule.
  • the detection reagent of the present invention is a detection reagent for egg-derived lysozyme, and includes the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection reagent of this invention should just contain the nucleic acid molecule of the said this invention, and another structure is not restrict
  • egg-derived lysozyme can be detected as described above.
  • the detection reagent of the present invention can be said to be a binder to egg-derived lysozyme, for example.
  • the detection reagent of the present invention may further have a labeling substance, for example, and the labeling substance may be bound to the nucleic acid molecule.
  • the labeling substance for example, the description in the nucleic acid molecule of the present invention can be used.
  • the detection reagent of the present invention may have, for example, a carrier, and the nucleic acid molecule may be immobilized on the carrier.
  • the carrier for example, the description in the nucleic acid molecule of the present invention can be incorporated.
  • the detection kit of the present invention includes the nucleic acid molecule of the present invention or the detection reagent of the present invention.
  • the detection kit of the present invention may further include other components, for example.
  • the constituent element include a buffer solution for preparing the sample, an instruction manual, and the like.
  • the detection kit of the present invention is, for example, A kit containing a nucleic acid sensor and an allergen-labeled carrier (lysozyme-labeled carrier) can be obtained.
  • the description of the nucleic acid molecule of the present invention can be used, and the nucleic acid molecule of the present invention and the detection method of the present invention described later can also be used for the method of use. .
  • the method for detecting an egg-derived lysozyme of the present invention comprises contacting the nucleic acid molecule of the present invention or the detection reagent of the present invention with a sample, and then egg-derived lysozyme in the sample. And a step of forming a complex with the nucleic acid molecule or the detection reagent, and a step of detecting the complex.
  • the detection method of the present invention is characterized by using the nucleic acid molecule of the present invention or the detection reagent, and the other steps and conditions are not particularly limited.
  • the use of the nucleic acid molecule of the present invention will be described as an example, but the nucleic acid molecule of the present invention can be read as the detection reagent of the present invention.
  • the nucleic acid molecule of the present invention specifically binds to lysozyme, for example, by detecting the binding of lysozyme and the nucleic acid molecule or the detection reagent, lysozyme in a sample is detected. It can be detected specifically. Specifically, for example, since the amount of lysozyme in a sample can be analyzed, it can be said that qualitative analysis or quantitative analysis is also possible.
  • the sample is not particularly limited.
  • the sample include foods, food materials, food additives, and the like.
  • Examples of the sample include a deposit in a food processing shop or a cooking place, a cleaning liquid after cleaning, and the like.
  • the sample may be, for example, a liquid sample or a solid sample.
  • the sample is preferably a liquid sample because it is easy to contact with the nucleic acid molecule and is easy to handle.
  • a mixed solution, an extract, a dissolved solution, and the like may be prepared using a solvent and used.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, and buffer solution.
  • the detection method of the present invention will be described with reference to an example of a method for detecting lysozyme using the nucleic acid sensor of the present invention labeled with a labeling substance as the nucleic acid molecule of the present invention.
  • this invention is not restrict
  • the detection step further includes, for example, a step of analyzing the presence or amount of lysozyme in the sample based on the detection result of the complex.
  • the method for contacting the sample and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • the contact between the sample and the nucleic acid molecule is preferably performed in a liquid, for example.
  • the liquid is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, and buffer solution.
  • the contact condition between the sample and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • the contact temperature is, for example, 4 to 37 ° C., preferably 18 to 25 ° C.
  • the contact time is, for example, 10 to 120 minutes, preferably 30 to 60 minutes.
  • the nucleic acid molecule may be, for example, an immobilized nucleic acid molecule (solid phase carrier) immobilized on a carrier or an unfixed free nucleic acid molecule.
  • the sample is contacted in a container.
  • the carrier is not particularly limited, and examples thereof include a plate, a filter, a column, a substrate, a bead, and a container. Examples of the container include a microplate and a tube.
  • the nucleic acid molecule is immobilized as described above, for example.
  • the detection step is a step of detecting the binding between the lysozyme in the sample and the nucleic acid molecule as described above.
  • the presence or absence of binding between the two for example, the presence or absence of lysozyme in the sample can be analyzed (qualitative), and by detecting the degree of binding (binding amount) between the two, for example, the sample
  • the amount of lysozyme can be analyzed (quantified).
  • the method for detecting the binding between lysozyme and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • a conventionally known method for detecting binding between substances can be adopted, and specific examples thereof include the SPR described above.
  • a method using a nucleic acid sensor in which a luciferase that is a labeling substance is bound to the nucleic acid molecule and an egg-derived lysozyme labeling carrier will be described below.
  • the nucleic acid sensor and the sample are mixed.
  • the nucleic acid molecule in the nucleic acid sensor binds to the target egg-derived lysozyme.
  • the nucleic acid molecule in the nucleic acid sensor is in an unbound state with the target.
  • the lysozyme labeled carrier is removed.
  • the carrier include beads.
  • the nucleic acid molecule in the nucleic acid sensor cannot bind to the egg-derived lysozyme in the lysozyme-labeled carrier. Therefore, when a luciferase substrate is added to the fraction from which the lysozyme-labeled carrier has been removed to perform a luminescence reaction, luminescence is generated by the luciferase catalytic reaction in the nucleic acid sensor.
  • the nucleic acid molecule in the nucleic acid sensor binds to egg-derived lysozyme in the lysozyme-labeled carrier. For this reason, by removing the lysozyme labeled carrier, the nucleic acid sensor is also removed while bound to the lysozyme labeled carrier. For this reason, when the luciferase substrate is added to the fraction from which the lysozyme-labeled carrier has been removed and the luminescence reaction is performed, luminescence due to the luciferase catalytic reaction occurs because the nucleic acid sensor does not exist. Absent.
  • the presence or absence of egg-derived lysozyme in the sample can be analyzed (qualitative analysis) based on the presence or absence of luminescence.
  • the amount of egg-derived lysozyme in the sample and the amount of the nucleic acid sensor remaining in the fraction after removing the lysozyme-labeled carrier have a correlation, depending on the intensity of luminescence,
  • the amount of egg-derived lysozyme can also be analyzed (quantitative analysis).
  • egg-derived lysozyme that is an allergen can be detected.
  • Example 1 About the aptamer of this invention, the binding property with respect to the egg white origin lysozyme of a chicken egg was confirmed by SPR analysis.
  • Aptamer Aptamer 1 of the following polynucleotide was synthesized as an aptamer of Examples.
  • T is all deoxyribonucleotide residues having 5′-tryptaminocarbonyluracil (TrpdU) in which 5-position of thymine is substituted in place of natural thymine (T)
  • C Were all deoxyribonucleotide residues having 5′-methylcytosine substituted in position 5 of cytosine in place of natural cytosine (C).
  • Aptamer 1 Lys391TR8m4 (SEQ ID NO: 1) GGTTAATCCCGACAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTCACCACGGCTCATTTG
  • the estimated secondary structure of aptamer 1 is shown in FIG. However, it is not limited to this.
  • the aptamer was added with polydeoxyadenine (poly dA) having a length of 20 bases at the 3 'end and used as a poly dA added aptamer in SPR described later.
  • poly dA polydeoxyadenine
  • the poly dA-added aptamer used was heat-denatured at 95 ° C. for 5 minutes.
  • the composition of the SB1T buffer was 40 mmol / L HEPES, 125 mmol / L NaCl, 5 mmol / L KCl, 1 mmol / L MgCl 2 and 0.01% Tween (registered trademark) 20, and the pH was 7.5.
  • each sample was prepared from the materials shown below for confirmation of the cross-reaction of the aptamer.
  • the preparation of the gliadin sample, the gluten sample, and the ⁇ -casein sample was performed in the same manner as the preparation of the lysozyme sample.
  • a milk sample, a raw peanut sample, and a roasted peanut sample were performed in the same manner as the preparation of the egg sample.
  • Gliadin (101778, manufactured by MP Biomedicals) Wheat-derived gluten (073-00575, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Milk-derived ⁇ -casein (C6780-19, manufactured by SIGMA) Milk (made by Ashigara Dairy Co., Ltd.) Raw peanuts (made by Indian curry shop Earl Tee) Roasted peanut (KFV Fruit)
  • a ProteON dedicated sensor chip a chip (trade name: ProteOn NLC Sensor Chip, BioRad) on which streptavidin was immobilized was set in the ProteON XPR36.
  • 1 ⁇ mol / L of biotinylated poly dT was injected into the flow cell of the sensor chip using ultrapure water (DDW) and allowed to bind until the signal intensity (RU: Resonance Unit) was about 900 RU.
  • the biotinylated poly dT was prepared by biotinylating the 5 ′ end of 20 base deoxythymidine.
  • FIG. 2 is a graph showing the binding property of aptamer 1 to egg white-derived lysozyme, in which the horizontal axis represents each sample and the vertical axis represents signal intensity (RU).
  • lysozyme sample, egg sample, gliadin sample, gluten sample, ⁇ -casein sample, milk sample, raw peanut sample, and roasted peanut sample are shown in order from the left.
  • the concentration (ppm) in each sample indicates the concentration of each protein for lysozyme sample, gliadin sample, gluten sample, and ⁇ -casein sample, and for egg sample, milk sample, raw peanut sample, and roast peanut sample, The concentration of total protein contained in the sample is shown.
  • FIG. 1 shows the concentration of total protein contained in the sample.
  • aptamer 1 showed binding properties to lysozyme samples and egg samples. Since aptamer 1 selectively binds to egg white-derived lysozyme, it can be said that the ability of aptamer 1 to bind to an egg sample showed binding to egg white-derived lysozyme contained in the egg sample. On the other hand, aptamer 1 has a signal intensity of 0.02 or less and exhibits no binding to gliadin samples, gluten samples, ⁇ -casein samples, milk samples, raw peanut samples, and roasted peanut samples. It was.
  • binding analysis was performed in the same manner except that the egg sample was used and the protein concentration in the sample was changed to 0.37, 1.1, 3.3, 10 and 30 ppm.
  • FIG. 3 is a graph showing the binding property of aptamer 1 to an egg sample, the horizontal axis indicates the protein concentration (ppm) in the egg sample, and the vertical axis indicates the signal intensity (RU).
  • the signal intensity of the aptamer 1 increased as the protein concentration in the egg sample increased. From this result, it was found that the lysozyme concentration in the egg sample can be quantitatively analyzed by measuring the signal intensity using the aptamer of the present invention.
  • the binding analysis was performed in the same manner except that the concentration of lysozyme in the sample was 3.125, 6.25, 12.5, and 25 nmol / L, The signal intensity at a predetermined time after the start of sample injection was determined.
  • FIG. 4 is a graph showing the binding property of aptamer 1 to lysozyme, the horizontal axis indicates the elapsed time (seconds) after the start of injection of the sample, and the vertical axis indicates the signal intensity (RU). As shown in FIG. 4, the signal intensity of the aptamer 1 increased as the concentration of lysozyme increased.
  • aptamer 1 has a dissociation constant (KD) for lysozyme of 1.04 ⁇ 10 ⁇ 9 mol / L, and has excellent binding properties.
  • KD dissociation constant
  • Example 2 About the miniaturized aptamer of this invention, the binding property with respect to an egg white origin lysozyme was confirmed by SPR analysis.
  • the following polynucleotide aptamers 2 to 7 were synthesized as miniaturized aptamers of the examples.
  • the aptamers 2 to 7 are aptamers obtained by downsizing the aptamer 1 (SEQ ID NO: 1) of Example 1.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1
  • T is all deoxyribonucleotide residues having 5′-benzylaminocarbonyluracil (BndU) substituted at the 5-position of thymine in place of natural thymine (T)
  • BndU deoxyribonucleotide residues having 5′-methylcytosine substituted in position 5 of cytosine in place of natural cytosine (C).
  • the estimated secondary structure of aptamers 2 to 7 is shown in FIG. However, it is not limited to this.
  • the aptamer 1 of Example 1 and the miniaturized aptamers 2 to 7 were used.
  • the lysozyme sample prepared in Example 1 25 nmol / L or 100 nmol / L
  • ⁇ casein sample 100 nmol / L or 400 nmol / L
  • FIG. 6 is a graph showing aptamer binding to lysozyme (25 nmol / L or 100 nmol / L), gliadin (4 ⁇ mol / L), and ⁇ -casein (100 nmol / L or 400 nmol / L).
  • the results of the miniaturized aptamer 2, the miniaturized aptamer 3, the miniaturized aptamer 4, the miniaturized aptamer 5, the miniaturized aptamer 6, and the aptamer 1 are shown.
  • (B) shows the results of the miniaturized aptamer 4 and the miniaturized aptamer 7. Show.
  • the horizontal axis represents each sample, and the vertical axis represents signal intensity (RU).
  • Each graph shows a miniaturized aptamer 2, a miniaturized aptamer 3, a miniaturized aptamer 4, a miniaturized aptamer 5, a miniaturized aptamer 6, and an aptamer 1 in order from the left in (A), and in FIG.
  • the miniaturized aptamer 4 and the miniaturized aptamer 7 are shown in order.
  • miniaturized aptamers 2 to 7 in which the aptamer 1 was miniaturized exhibited high binding ability to lysozyme derived from egg white (25 nmol / L or 100 nmol / L).
  • the miniaturized aptamers 2 to 7 each had a signal intensity of 0.00 or less and showed no binding to gliadin and ⁇ -casein. From these results, it was found that the miniaturized aptamers 2 to 7 bind with high specificity to lysozyme.
  • Example 3 A nucleic acid sensor in which a labeling substance luciferase was bound to the aptamer of the present invention was prepared, and the binding property of the nucleic acid sensor to egg white-derived lysozyme was confirmed. The confirmation of the binding was performed using target solid-phased beads in which the target egg white-derived lysozyme was solid-phased and the nucleic acid sensor.
  • the nucleic acid molecule in the nucleic acid sensor cannot bind to lysozyme immobilized on the target immobilized beads. For this reason, when a luminescence reaction is performed on the fraction from which the target solid-phased beads have been removed, luminescence is generated by the catalytic reaction of luciferase in the nucleic acid sensor.
  • the reaction solution when the nucleic acid sensor is not bound to the target, the nucleic acid molecule in the nucleic acid sensor is bound to lysozyme immobilized on the target immobilized beads.
  • the nucleic acid sensor is also removed while bound to the target-immobilized beads.
  • the luminescence due to the luciferase catalytic reaction is not caused by the absence of the nucleic acid sensor. Does not occur. Therefore, egg white-derived lysozyme can be detected by detecting luminescence by luciferase using the nucleic acid sensor and the target solid-phased beads.
  • the nucleic acid sensor uses the fluorescent substance SA-Lucia (trademark) luciferase (Invitrogen, cat # rep-strlc), and according to the instructions for use, the 5 ′ end of the aptamer 1 (Lys391TR8m4) of Example 1 described above. Was prepared by labeling.
  • Example 1 As the sample, the lysozyme sample of Example 1 was used.
  • the target solid-phased beads were prepared using NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs (manufactured by GE Healthcare) using the lysozyme sample as a target.
  • the binding property of the nucleic acid sensor to egg white lysozyme was confirmed as follows. First, a filter plate (manufactured by Millipore, cat # MSGVN2250) was set on a 96-well U-bottom plate, and the target solid-phased beads were added to each well of the U-bottom plate to 20 ⁇ L / well. .
  • Infinite M1000 Pro (TECAN) was used according to the instruction manual.
  • QuantiLuc (trade name, manufactured by Invitrogen, cat # rep-qlc1) was used as a substrate.
  • FIG. 7 shows the measurement results of light emission.
  • FIG. 7 is a graph showing the measurement results of the luminescence amount for the lysozyme sample.
  • the horizontal axis indicates the concentration of the lysozyme sample
  • the vertical axis indicates the light emission amount (RLU).
  • RLU light emission amount
  • the detection limit (LOD) of the nucleic acid sensor for egg white-derived lysozyme was 0.039 ppm. From this, it was found that the nucleic acid sensor can detect a small amount of lysozyme derived from egg white.
  • Example 1 the egg sample prepared in Example 1 and the milk sample, raw peanut sample, and gluten sample prepared in Example 1 (final concentration 0) were confirmed to confirm the cross reaction. 1.56, 3.14, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ppm), and the same measurement was performed.
  • FIG. 8 is a graph showing the measurement results of the amount of luminescence when eggs, milk, raw peanuts, and gluten are used as samples.
  • the horizontal axis indicates the concentration of each sample, and the vertical axis indicates the light emission amount (RLU).
  • RLU light emission amount
  • the nucleic acid sensor can specifically detect the egg sample, specifically, egg white-derived lysozyme in the egg sample.
  • the detection limit (LOD) of the nucleic acid sensor in the egg sample was 3.125 ppm. From this, it was found that the nucleic acid sensor can sufficiently detect the egg white-derived lysozyme in the egg sample.
  • Example 4 About the aptamer of this invention, cross-reactivity with respect to various foodstuffs was confirmed.
  • binding properties were analyzed in the same manner as in Example 3 except that the following measurement conditions were used.
  • the aptamer 1 did not show binding properties to any of the above samples.
  • the aptamer of the present invention specifically binds to egg-derived lysozyme, and it can be detected by measurement, and according to the aptamer of the present invention, the intensity of luminescence of the egg-derived lysozyme in the sample It was found that the amount could be analyzed.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can bind to egg-derived lysozyme. Therefore, according to the nucleic acid molecule of the present invention, egg-derived lysozyme can be detected based on the presence or absence of binding to the allergen in the sample. For this reason, the nucleic acid molecule of the present invention can be said to be an extremely useful tool for detecting, for example, allergens derived from eggs in fields such as food production, food management, and food distribution.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

卵由来リゾチームに結合する新たな核酸分子を提供する。　下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む核酸分子を、卵由来リゾチームに結合する核酸分子とする。 （ａ）配列番号１の塩基配列または配列番号１の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド （ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、卵由来リゾチームに結合するポリヌクレオチド

Description

核酸分子およびその用途
　本発明は、卵由来リゾチームに結合する核酸分子およびその用途に関する。
　卵は、日常的に頻繁に摂取される食品であるが、近年、卵アレルギーの患者が増加しており、問題視されている。加工食品等は、卵を使用するものが多く存在するため、加工食品やその製造ライン等においては、原料として卵が混入しているか否かを分析することは、極めて重要である。
　アレルギーのアレルゲンは、一般的に、タンパク質やその分解物（ペプチド）であり、これらを抗原とする抗体を使用した分析方法が、主流である。卵に関しても、例えば、卵白タンパク質であるリゾチームがアレルゲンとして知られている。リゾチームに対する分析方法として、ＥＬＩＳＡ法を用いた方法が報告されている（非特許文献１）。
　しかし、抗体は、タンパク質であり、安定性に問題があるため、低コストで簡易な検査法に抗体を用いることが難しい。また、電気泳動やニトロセルロース膜へのブロッティング等が必要であり、操作が煩雑である。このため、近年、抗体に代えて、抗原と特異的に結合する核酸分子が注目されている。
Immunol　Lett　Vol.　17　pp21-28　(1988)
　そこで、本発明の目的は、卵由来リゾチームに結合する新たな核酸分子を提供することにある。
　本発明の核酸分子は、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、リゾチームに結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１の塩基配列または配列番号１の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、卵由来リゾチームに結合するポリヌクレオチド
　本発明の卵由来リゾチームの検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。
　本発明の卵由来リゾチームの検出方法は、前記本発明の核酸分子、または前記本発明の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中の卵由来リゾチームと、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、
前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。
　本発明の核酸分子は、卵由来リゾチームに結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、試料中のアレルゲンとの結合の有無によって、卵由来リゾチームを検出できる。したがって、本発明の核酸分子は、例えば、食品製造、食品管理、食品の流通等の分野において、例えば、卵に由来するアレルゲンの検出に、極めて有用なツールといえる。
図１は、本発明の実施例１における、アプタマー１の推定二次構造である。 図２は、本発明の実施例１における、卵由来リゾチームに対するアプタマー１の結合性を示すグラフである。 図３は、本発明の実施例１における、卵試料に対するアプタマー１の結合性を示すグラフである。 図４は、本発明の実施例１における、リゾチームに対するアプタマー１の結合性を示すグラフである。 図５は、本発明の実施例２における、アプタマー２～７の推定二次構造である。 図６は、本発明の実施例２における、卵由来リゾチームに対する各アプタマーの結合性を示すグラフである。 図７は、本発明の実施例３における、発光量の測定結果を示すグラフである。 図８は、本発明の実施例３における、発光量の測定結果を示すグラフである。
（１）核酸分子
　本発明の核酸分子は、前述のように、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、卵由来リゾチームに結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１の塩基配列または配列番号１の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、卵由来リゾチームに結合するポリヌクレオチド
　本発明において、ターゲットは、卵由来リゾチームである。前記卵は、例えば、鶏卵、ウズラの卵である。卵由来リゾチームは、例えば、鶏卵由来リゾチームであり、具体的には、例えば、鶏卵の卵白由来リゾチームである。本発明の核酸について、例えば、結合能を確認するためのリゾチームとして、市販のリゾチームが使用でき、具体例として、鶏卵の卵白由来のリゾチーム（120-02674、和光純薬社製）が例示できる。リゾチームは、例えば、加熱等による変性が生じていない未変性アレルゲンでもよいし、加熱等による変性が生じた変性アレルゲンでもよい。本発明において、以下、卵由来リゾチームは、単にリゾチームともいう。
　本発明の核酸分子は、前述のように、リゾチームに結合可能である。本発明において、「リゾチームに結合する」とは、例えば、リゾチームに対する結合性を有している、または、リゾチームに対する結合活性を有しているともいう。本発明の核酸分子とリゾチームとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（商品名、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　ＵＫ　Ｌｔｄ．）が使用できる。本発明の核酸分子は、リゾチームに結合することから、例えば、リゾチームの検出に使用できる。
　本発明の核酸分子は、リゾチームに対する結合力を示す解離定数が、例えば、１．０４ｎＭ以下である。
　本発明の核酸分子は、ＤＮＡ分子、またはＤＮＡアプタマーともいう。本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
　前記（ａ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチドでもよいし、前記配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよく、また、前記配列番号１の塩基配列の部分配列を含むポリヌクレオチドでもよいし、前記部分配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記配列番号１のポリヌクレオチドを以下に示す。
Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４（配列番号１）
GGTTAATCCCGACAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTCACCACGGCTCATTTG
　前記部分配列は、特に制限されないが、例えば、配列番号２～７の塩基配列があげられる。
Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４＿ｓ６４（配列番号２）
GGTTAATCCCGACAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTC
Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４＿ｓ５４（配列番号３）
GACAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTC
Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４＿ｓ５２（配列番号４）
CAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTC
Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４＿ｓ６９（配列番号５）
GACAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTCACCACGGCTCATTTG
Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４＿ｓ６７（配列番号６）
CAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTCACCACGGCTCATTTG
Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４＿ｓ４１（配列番号７）
AGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTC
　前記（ｂ）において、「同一性」は、特に制限されず、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、リゾチームに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
　本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｃ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、卵由来リゾチームに結合するポリヌクレオチド
　前記（ｃ）において、「ハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、特に制限されず、例えば、前記（ａ）の塩基配列に対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ．）」〔Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
　前記（ｃ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ．）」〔Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
　本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｄ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｄ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｄ）前記（ａ）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、卵由来リゾチームに結合するポリヌクレオチド
　前記（ｄ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｄ）のポリヌクレオチドが、卵由来リゾチームに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）の塩基配列において、例えば、１～１０個、好ましくは１～７個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個、特に好ましくは１または２個である。
　本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｅ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｅ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｅ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、配列番号２～７のいずれかの塩基配列を含む、卵由来リゾチームに結合するポリヌクレオチド
　前記（ｅ）において、「同一性」は、特に制限されず、例えば、前記（ｂ）と同様である。
　本発明の核酸分子における前記ポリヌクレオチドは、例えば、下記（ｆ）のポリヌクレオチドでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記（ｆ）のポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
（ｆ）配列番号１～７からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、それぞれ、下記式（Ｉ）～（ＶＩＩ）で表される二次構造を形成可能である、卵由来リゾチームに結合するポリヌクレオチド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　前記（ｆ）において、「同一性」は、特に制限されず、例えば、前記（ｂ）と同様である。また、前記（ｆ）において、「二次構造を形成可能」とは、例えば、前記（ｆ）のポリヌクレオチドが、前記式におけるステム構造およびループ構造を形成可能であることをいう。ステム構造およびループ構造については、後述する。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）～（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドの配列を１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドの配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよいが、好ましくは同じである。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上であり、好ましくは２～１２であり、より好ましくは２～６であり、さらに好ましくは２である。
　前記リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドがあげられ、その構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１～２４塩基長であり、好ましくは１２～２４塩基長であり、より好ましくは１６～２４塩基長であり、さらに好ましくは２０～２４塩基長である。
　本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
　本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）～（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドであり、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）～（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）～（ｆ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
　本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
　本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記核酸分子の長さは、特に制限されず、その下限は、例えば、１５塩基長であり、好ましくは７５塩基長または８０塩基長であり、その上限は、例えば、１０００塩基長であり、好ましくは２００塩基長、１００塩基長または９０塩基長である。
　前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～３個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１～３塩基」との記載は、「１、２、３塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
　前記ポリヌクレオチドは、例えば、少なくとも１個の修飾塩基を含む。前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、天然塩基（非人工塩基）が修飾された塩基があげられ、前記天然塩基と同様の機能を有することが好ましい。前記天然塩基は、特に制限されず、例えば、プリン骨格を有するプリン塩基、ピリミジン骨格を有するピリミジン塩基等があげられる。前記プリン塩基は、特に制限されず、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）があげられる。前記ピリミジン塩基は、特に制限されず、例えば、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等があげられる。前記塩基の修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位および８位があげられる。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位および６位があげられる。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「－ＣＨ３」または「－Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシルまたは修飾チミンということができる。
　前記修飾塩基の修飾基は、特に制限されず、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基、下記式（１）のベンジルアミノカルボニル基（benzylaminocarbonyl）、下記式（２）のトリプタミノカルボニル基（tryptaminocarbonyl）およびイソブチルアミノカルボニル基（isobutylaminocarbonyl）等があげられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、アデニンが修飾された修飾アデニン、チミンが修飾された修飾チミン、グアニンが修飾された修飾グアニン、シトシンが修飾された修飾シトシンおよびウラシルが修飾された修飾ウラシル等があげられ、前記修飾チミン、前記修飾ウラシルおよび前記修飾シトシンが好ましい。
　前記修飾アデニンの具体例としては、例えば、７’－デアザアデニン等があげられる。
　前記修飾グアニンの具体例としては、例えば、７’－デアザグアニン等があげられる。
　前記修飾シトシンの具体例としては、例えば、５’－メチルシトシン等があげられる。
　前記修飾チミンの具体例としては、例えば、５’－ベンジルアミノカルボニルチミン、５’－トリプタミノカルボニルチミン、５’－イソブチルアミノカルボニルチミン等があげられる。
　前記修飾ウラシルの具体例としては、例えば、５’－ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）、５’－トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）および５’－イソブチルアミノカルボニルウラシル等があげられる。
　前記ポリヌクレオチドは、特に制限されず、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。
　前記修飾塩基の個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の個数は、例えば、１個以上である。前記修飾塩基は、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～８０個、好ましくは１～７０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～４０個、特に好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２０個であり、また、全ての塩基が、前記修飾塩基でもよい。前記修飾塩基の個数は、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基の個数であってもよいし、２種類以上の前記修飾塩基の個数の合計であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾塩基も、特に制限されず、例えば、１～８０個、１～５０個、１～２０個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
　前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾塩基の割合は、特に制限されない。前記修飾塩基の割合は、前記ポリヌクレオチドの全塩基数のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾塩基の割合も、特に制限されず、前述の範囲と同様である。ここで、前記全塩基数は、例えば、前記ポリヌクレオチドにおける天然塩基の個数と前記修飾塩基の個数の合計である。前記修飾塩基の割合を分数で示すが、これを満たす全塩基数と修飾塩基数とは、それぞれ正の整数である。
　前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾チミンの場合、前記修飾チミンの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然チミンは、前記修飾チミンに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの個数は、例えば、１個以上である。前記修飾チミンは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～８０個、好ましくは１～７０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～４０個、特に好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２１個であり、また、全てのチミンが、前記修飾チミンでもよい。
　前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾チミンの割合は、特に制限されない。前記修飾チミンの割合は、前記天然チミンの個数と前記修飾チミンの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。
　前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾ウラシルの場合、前記修飾ウラシルの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然チミンは、前記修飾ウラシルに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾ウラシルの個数は、例えば、１個以上である。前記修飾ウラシルは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～８０個、好ましくは１～７０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～４０個、特に好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２１個であり、また、全てのウラシルが、前記修飾ウラシルでもよい。
　前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾ウラシルの割合は、特に制限されない。前記修飾ウラシルの割合は、前記天然チミンの個数と前記修飾ウラシルの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。
　前記修飾チミンと前記修飾ウラシルの個数の例示は、例えば、両者をあわせた個数であってもよい。
　前記ポリヌクレオチドにおける前記修飾塩基が、前記修飾シトシンの場合、前記修飾シトシンの個数は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然シトシンは、前記修飾シトシンに置換できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾シトシンの個数は、例えば、１個以上である。前記修飾シトシンは、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～８０個、好ましくは１～７０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～４０個、特に好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２１個であり、であり、また、全てのシトシンが、前記修飾シトシンでもよい。
　前記ポリヌクレオチドにおいて、前記修飾シトシンの割合は、特に制限されない。前記修飾シトシンの割合は、前記天然シトシンの個数と前記修飾シトシンの個数との合計のうち、例えば、１／１００以上、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上、さらに好ましくは１／１０以上、特に好ましくは１／４以上、最も好ましくは１／３以上である。
　前記修飾塩基が、前記修飾アデニンまたは前記修飾グアニンの場合、前記修飾シトシンの個数および割合の説明において、「シトシン」および「修飾シトシン」を、それぞれ「アデニン」および「修飾アデニン」または「グアニン」および「修飾グアニン」に読み替えて援用できる。前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、天然アデニンは、前記修飾アデニンに置換でき、例えば、天然グアニンは、前記修飾グアニンに置換できる。
　本発明の核酸分子は、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖残基が修飾された修飾糖を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基および前記修飾糖を有するヌクレオチドでもよい。
　前記糖残基は、特に制限されず、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位または４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
　前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基の２’位が修飾された、２’－メチル化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－メチル化－シトシンヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－アミノ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－アミノ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－チオ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－チオ化－シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
　前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～８０個、好ましくは１～７０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～４０個、特に好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２１個である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１～８０個、１～５０個、１～２０個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
　本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～８０個、好ましくは１～７０個、より好ましくは１～５０個、さらに好ましくは１～４０個、特に好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２１個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。また、前記ポリヌクレオチドを含む前記核酸分子の全長における前記人工核酸モノマー残基も、特に制限されず、例えば、１～８０個、１～５０個、１～２０個であり、好ましくは、前述の範囲と同様である。
　本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
　本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１～２００塩基長であり、好ましくは１～５０塩基長であり、より好ましくは１～２５塩基長、さらに好ましくは１８～２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
　本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することができる。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記付加配列を介して、前記担体に固定化する。前記担体は、例えば、ビーズ、プレート、フィルター、カラム、基板、容器等があげられる。
　本発明の核酸分子は、例えば、さらに標識物質を有してもよく、具体的には、前記核酸分子に前記標識物質が結合してもよい。前記標識物質が結合した前記核酸分子は、例えば、本発明の核酸センサということもできる。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合させてもよい。前記標識物質による標識化は、例えば、結合でもよいし、化学修飾でもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、酵素、蛍光物質、色素、同位体、薬物、毒素および抗生物質等があげられる。前記酵素は、例えば、ルシフェラーゼ、ＳＡ－Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、間接的に連結してもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、ポリヌクレオチドのリンカー等である。
　本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法、遺伝子工学的手法等の公知の方法等により合成できる。
　本発明の核酸分子は、前述のように、リゾチームに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、リゾチームへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、リゾチームに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
　本発明の核酸分子によれば、リゾチームを検出できる。リゾチームの検出方法は、特に制限されず、リゾチームと前記核酸分子との結合を検出することによって行える。
（２）検出試薬およびキット
　本発明の検出試薬は、前述のように、卵由来リゾチームの検出試薬であって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出試薬を使用すれば、前述のように、例えば、卵由来リゾチームの検出等を行うことができる。本発明の検出試薬は、例えば、卵由来リゾチームへの結合剤ともいえる。
　本発明の検出試薬は、例えば、さらに、標識物質を有し、前記標識物質が、前記核酸分子に結合されてもよい。前記標識物質は、例えば、前記本発明の核酸分子における説明を援用できる。また、本発明の検出試薬は、例えば、担体を有し、前記担体に前記核酸分子が固定化されてもよい。前記担体は、例えば、前記本発明の核酸分子における説明を援用できる。
　本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子または前記本発明の検出試薬を含む。本発明の検出キットは、例えば、さらに、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記試料を調製するための緩衝液、使用説明書等があげられる。また、後述する本発明の検出方法に示す、前記核酸分子に標識物質であるルシフェラーゼを結合させた核酸センサと、アレルゲン標識化担体とを用いる方法の場合、本発明の検出キットは、例えば、前記核酸センサと、アレルゲン標識化担体（リゾチーム標識化担体）を含むキットとすることができる。
　本発明の検出試薬および検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の説明を援用でき、また、その使用方法についても、前記本発明の核酸分子および後述する前記本発明の検出方法を援用できる。
（３）検出方法
　本発明の卵由来リゾチームの検出方法は、前述のように、前記本発明の核酸分子、または前記本発明の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中の卵由来リゾチームと、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子または前記検出試薬を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。以下、本発明の核酸分子の使用を例にあげて説明するが、本発明の核酸分子は、本発明の検出試薬と読み替え可能である。
　本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、リゾチームに特異的に結合することから、例えば、リゾチームと、前記核酸分子または前記検出試薬との結合を検出することによって、試料中のリゾチームを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のリゾチームの量を分析可能であることから、定性分析または定量分析も可能といえる。
　本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、食品、食品原料、食品添加物等があげられる。また、前記試料は、例えば、食品加工場または調理場等における付着物、洗浄後の洗浄液等があげられる。
　前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
　本発明の検出方法について、本発明の核酸分子として、標識物質で標識化された本発明の核酸センサを使用し、リゾチームを検出する方法を例にあげて説明する。なお、本発明は、これらの例示には制限されない。
　前記検出工程は、例えば、さらに、前記複合体の検出結果に基づいて、前記試料中のリゾチームの有無または量を分析する工程を含む。
　前記複合体形成工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
　前記複合体形成工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４～３７℃であり、好ましくは１８～２５℃であり、接触時間は、例えば、１０～１２０分であり、好ましくは３０～６０分である。
　前記複合体形成工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子（固相担体）でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前者の場合、前記担体は、特に制限されず、例えば、プレート、フィルター、カラム、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
　前記検出工程は、前述のように、前記試料中のリゾチームと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のリゾチームの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のリゾチームの量を分析（定量）できる。
　リゾチームと前記核酸分子との結合の検出方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ等があげられる。
　そして、リゾチームと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にリゾチームは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にリゾチームが存在すると判断できる。また、予め、リゾチームの濃度と結合量との相関関係を求めておき、前記相関関係に基づいて、前記結合量から、前記試料中のリゾチームの濃度を分析することもできる。
　リゾチームと前記核酸分子との結合の検出について、一例として、前記核酸分子に標識物質であるルシフェラーゼを結合させた核酸センサと、卵由来リゾチーム標識化担体とを用いる方法を、以下に示す。
　まず、前記核酸センサと前記試料とを混合する。これにより、前記試料中に卵由来リゾチームが存在する場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、ターゲットである卵由来リゾチームと結合する。他方、前記試料中に卵由来リゾチームが存在しない場合、前記核酸センサにおける核酸分子は、ターゲットと未結合の状態となる。
　つぎに、前記混合物を、前記卵由来リゾチーム標識化担体に接触させた後、前記リゾチーム標識化担体を除去する。前記担体は、例えば、ビーズがあげられる。前記混合物において、前記核酸センサが卵由来リゾチームと結合している場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、前記リゾチーム標識化担体における卵由来リゾチームとは結合できない。このため、前記リゾチーム標識化担体を除去した画分に対して、ルシフェラーゼの基質を添加して発光反応を行った場合、前記核酸センサにおけるルシフェラーゼの触媒反応によって、発光が生じる。他方、前記混合物において、前記核酸センサが卵由来リゾチームと結合していない場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、前記リゾチーム標識化担体における卵由来リゾチームと結合する。このため、前記リゾチーム標識化担体の除去により、前記核酸センサも、前記リゾチーム標識化担体に結合した状態で除去されることになる。このため、前記リゾチーム標識化担体を除去した画分に対して、ルシフェラーゼの基質を添加して発光反応を行った場合、前記核酸センサが存在していないことから、ルシフェラーゼの触媒反応による発光は生じない。このため、発光の有無によって、試料中の卵由来リゾチームの有無を分析（定性分析）することができる。また、試料中の卵由来リゾチームの量と、前記リゾチーム標識化担体を除去した後の前記画分に残存する前記核酸センサの量とは、相関関係を有するため、発光の強弱によって、試料中の卵由来リゾチームの量も分析（定量分析）することができる。
　本発明によれば、前述のように、アレルゲンである卵由来リゾチームを検出できる。また、本発明によれば、前記アレルゲンである卵由来リゾチームの検出により、例えば、間接的に、卵または卵白の有無を検出することも可能である。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
［実施例１］
　本発明のアプタマーについて、鶏卵の卵白由来リゾチームに対する結合性を、ＳＰＲ解析により確認した。
（１）アプタマー
　下記ポリヌクレオチドのアプタマー１を、実施例のアプタマーとして合成した。下記ポリヌクレオチドにおいて、「Ｔ」は、全て、天然チミン（Ｔ）に代えて、チミンの５位が置換された５’－トリプタミノカルボニルウラシル（ＴｒｐｄＵ）を有するデオキシリボヌクレオチド残基とし、「Ｃ」は、全て、天然シトシン（Ｃ）に代えて、シトシンの５位が置換された５’－メチルシトシンを有するデオキシリボヌクレオチド残基とした。
アプタマー１：Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４（配列番号１）
GGTTAATCCCGACAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTCACCACGGCTCATTTG
　アプタマー１の推定二次構造を、図１に示す。ただし、これには限定されない。
　前記アプタマーは、その３’末端に、２０塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。前記ポリｄＡ付加アプタマーは、９５℃、５分の条件で熱変性させたものを使用した。
（２）試料
　鶏卵の卵白由来のリゾチーム（120-02674、和光純薬社製）を、ＳＢ１Ｔバッファーに懸濁し、一晩溶解させた後、遠心（１２，０００ｒｐｍ、１５分、室温）し分離した。前記分離した上清を、未変性リゾチームを含む抽出液として得た。これをリゾチーム試料とした。また、鶏卵の全卵を、フードプロセッサで破砕後、ＳＢ１Ｔバッファーに懸濁し、一晩溶解させた後、遠心（３０００ｇ、２０分、室温）し分離し、前記分離した上清を、０．８ｍｍのフィルターでろ過し、得られた抽出液を、卵試料として使用した。前記ＳＢ１Ｔバッファーの組成は、４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２および０．０１％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．５とした。
　以下の結合性試験において、前記アプタマーの交差反応の確認のため、以下に示す材料から、それぞれの試料を調製した。グリアジン試料、グルテン試料、αカゼイン試料の調製は、前記リゾチーム試料の調製と同様にして行った。牛乳試料、生ピーナッツ試料、およびローストピーナッツ試料は、前記卵試料の調製と同様にして行った。
グリアジン（101778、MP Biomedicals社製）
小麦由来グルテン（073-00575、和光純薬社製）
牛乳由来αカゼイン（C6780-19、SIGMA社製）
牛乳（足柄乳業株式会社製）
生ピーナッツ（インドカレーの店アールティー社製）
ローストピーナッツ（KFVフルーツ社製）
（３）ＳＰＲによる結合性の解析
　結合性の解析には、ProteON　XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。
　まず、前記ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名　ProteOn　NLC　Sensor　Chip、BioRad社）を、前記ProteON　XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、１μｍｏｌ／Ｌのビオチン化ポリｄＴをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｕｎｉｔ）が約９００ＲＵになるまで結合させた。前記ビオチン化ポリｄＴは、２０塩基長のデオキシチミジンの５’末端をビオチン化して調製した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＢ１Ｔバッファーを用いて、１μｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＡ付加アプタマーを、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が約８００ＲＵになるまで結合させた。続いて、所定のタンパク質濃度（５００ｐｐｍまたは１００ｐｐｍ）の前記試料を、それぞれ、前記バッファーを用いて、流速２５μＬ／ｍｉｎで２４０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、前記バッファーを流して、洗浄を行った。前記試料のインジェクション後、シグナル強度を測定し、前記試料のインジェクション開始を０秒として、２９５～３１５秒におけるシグナル強度（ＲＵ）の平均値（ＲＵ２９５－３１５）を求めた。そして、前記ビオチン化ポリｄＴに前記ポリｄＡ付加アプタマーを結合させた時におけるＲＵ値（ＲＵｉｍｍｏｂ）とＲＵ２９５－３１５との比（ＲＵ２９５－３１５／ＲＵｉｍｍｏｂ）を算出した。
　これらの結果を図２に示す。図２は、卵白由来リゾチームに対するアプタマー１の結合性を示すグラフであり、横軸は、各試料を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。横軸において、左から順に、リゾチーム試料、卵試料、グリアジン試料、グルテン試料、αカゼイン試料、牛乳試料、生ピーナッツ試料、およびローストピーナッツ試料を示す。各試料における濃度（ｐｐｍ）は、リゾチーム試料、グリアジン試料、グルテン試料、およびαカゼイン試料については、各タンパク質の濃度を示し、卵試料、牛乳試料、生ピーナッツ試料、およびローストピーナッツ試料については、各試料に含まれる全タンパク質の濃度を示す。図２に示すように、アプタマー１は、リゾチーム試料および卵試料に対して、結合性を示した。アプタマー１は、卵白由来リゾチームに対して選択的に結合するため、卵試料に対する結合性を示したことは、前記卵試料に含まれる卵白由来リゾチームに対して結合性を示したといえる。一方、アプタマー１は、グリアジン試料、グルテン試料、αカゼイン試料、牛乳試料、生ピーナッツ試料、およびローストピーナッツ試料に対しては、いずれも、シグナル強度が０．０２以下であり、結合性を示さなかった。
　つぎに、前記卵試料を使用し、前記試料におけるタンパク質濃度を、０．３７、１．１、３．３、１０、および３０ｐｐｍとした以外は同様にして、結合性の解析を行った。
　この結果を図３に示す。図３は、卵試料に対するアプタマー１の結合性を示すグラフであり、横軸は、卵試料におけるタンパク質濃度（ｐｐｍ）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図３に示すように、アプタマー１は、前記卵試料におけるタンパク質濃度が増加するにつれて、シグナル強度が増加した。この結果から、本発明のアプタマーを用い、シグナル強度を測定することで、前記卵試料におけるリゾチーム濃度を定量分析できることがわかった。
　つぎに、前記リゾチーム試料を使用し、前記試料におけるリゾチームの濃度を、３．１２５、６．２５、１２．５、および２５ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は同様にして、結合性の解析を行い、前記試料のインジェクション開始後の所定時間におけるシグナル強度を求めた。
　この結果を図４に示す。図４は、リゾチームに対するアプタマー１の結合性を示すグラフであり、横軸は、前記試料のインジェクション開始後の経過時間（秒）を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。図４に示すように、アプタマー１は、リゾチームの濃度が増加するにつれて、シグナル強度が増加した。
　さらに、前記図４のＳＰＲ解析の結果から、動態パラメータを算出した。この結果、アプタマー１は、リゾチームに対する解離定数（ＫＤ）が、１．０４×１０－９ｍｏｌ／Ｌであり、優れた結合性であることがわかった。
［実施例２］
　本発明の小型化アプタマーについて、卵白由来リゾチームに対する結合性を、ＳＰＲ解析により確認した。
　下記ポリヌクレオチドのアプタマー２～７を、実施例の小型化アプタマーとして合成した。前記アプタマー２～７は、前記実施例１のアプタマー１（配列番号１）を小型化したアプタマーである。下記ポリヌクレオチドにおいて、「Ｔ」は、全て、天然チミン（Ｔ）に代えて、チミンの５位が置換された５’－ベンジルアミノカルボニルウラシル（ＢｎｄＵ）を有するデオキシリボヌクレオチド残基とし、「Ｃ」は、全て、天然シトシン（Ｃ）に代えて、シトシンの５位が置換された５’－メチルシトシンを有するデオキシリボヌクレオチド残基とした。
アプタマー２：Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４＿ｓ６４（配列番号２）
GGTTAATCCCGACAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTC
アプタマー３：Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４＿ｓ５４（配列番号３）
GACAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTC
アプタマー４：Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４＿ｓ５２（配列番号４）
CAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTC
アプタマー５：Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４＿ｓ６９（配列番号５）
GACAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTCACCACGGCTCATTTG
アプタマー６：Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４＿ｓ６７（配列番号６）
CAAGCCCGTTAAGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTCACCACGGCTCATTTG
Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４＿ｓ４１（配列番号７）
AGGGTTAACACGACATTTCGCTGTTGTAACAGGTCATAGTC
　アプタマー２～７の推定二次構造を、図５に示す。ただし、これには限定されない。
　アプタマーとして、前記実施例１の前記アプタマー１、および前記小型化アプタマー２～７を使用し、試料として、前記実施例１で調製したリゾチーム試料（２５ｎｍｏｌ／Ｌまたは１００ｎｍｏｌ／Ｌ）、グリアジン試料（４μｍｏｌ／Ｌ）、およびαカゼイン試料（１００ｎｍｏｌ／Ｌまたは４００ｎｍｏｌ／Ｌ）を使用した以外は、実施例１と同様にして、ＳＰＲによる結合性の解析を行った。
　この結果を図６に示す。図６は、リゾチーム（２５ｎｍｏｌ／Ｌまたは１００ｎｍｏｌ／Ｌ）、グリアジン（４μｍｏｌ／Ｌ）、およびαカゼイン（１００ｎｍｏｌ／Ｌまたは４００ｎｍｏｌ／Ｌ）に対するアプタマーの結合性を示すグラフであり、（Ａ）は、小型化アプタマー２、小型化アプタマー３、小型化アプタマー４、小型化アプタマー５、小型化アプタマー６、およびアプタマー１の結果を示し、（Ｂ）は、小型化アプタマー４および小型化アプタマー７の結果を示す。横軸は、各試料を示し、縦軸は、シグナル強度（ＲＵ）を示す。各グラフは、（Ａ）において、左から順に、小型化アプタマー２、小型化アプタマー３、小型化アプタマー４、小型化アプタマー５、小型化アプタマー６、およびアプタマー１を示し、（Ｂ）において、左から順に、小型化アプタマー４および小型化アプタマー７を示す。
　図６に示すように、アプタマー１を小型化した小型化アプタマー２～７は、いずれも、卵白由来のリゾチーム（２５ｎｍｏｌ／Ｌまたは１００ｎｍｏｌ／Ｌ）に対して、高い結合性を示した。また、小型化アプタマー２～７は、グリアジンおよびαカゼインに対しては、いずれも、シグナル強度が０．００以下であり、結合性を示さなかった。これらの結果から、小型化アプタマー２～７は、リゾチームに対して優れた特異性で結合することがわかった。
［実施例３］
　本発明のアプタマーに標識物質ルシフェラーゼを結合させた核酸センサを作製し、前記核酸センサの卵白由来リゾチームに対する結合性を確認した。前記結合性の確認は、ターゲットである卵白由来リゾチームが固相化されたターゲット固相化ビーズと、前記核酸センサとを用いて行った。
　前述のように、反応液において、前記核酸センサが前記ターゲットと結合している場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、前記ターゲット固相化ビーズに固相化されたリゾチームとは結合できない。このため、前記ターゲット固相化ビーズを除去した画分に対して発光反応を行った場合、前記核酸センサにおけるルシフェラーゼの触媒反応によって、発光が生じる。他方、前記反応液において、前記核酸センサが前記ターゲットと結合していない場合、前記核酸センサにおける前記核酸分子は、前記ターゲット固相化ビーズに固相化されたリゾチームと結合する。このため、前記ターゲット固相化ビーズの除去により、前記核酸センサも、前記ターゲット固相化ビーズに結合した状態で除去されることになる。このため、前記ターゲット固相化ビーズを除去した画分に対して、ルシフェラーゼの基質を添加して発光反応を行った場合、前記核酸センサが存在していないことから、ルシフェラーゼの触媒反応による発光は生じない。このため、前記核酸センサと前記ターゲット固相化ビーズとを用いて、ルシフェラーゼによる発光を検出することで、卵白由来リゾチームを検出することができる。
　前記核酸センサは、蛍光物質ＳＡ－Ｌｕｃｉａ（商標）ルシフェラーゼ（Invitrogen社製、cat#rep-strlc）を使用し、その使用説明書にしたがって、前記実施例１のアプタマー１（Ｌｙｓ３９１ＴＲ８ｍ４）の５’末端を標識化することにより、調製した。
　試料として、前記実施例１の前記リゾチーム試料を使用した。
　前記ターゲット固相化ビーズは、ターゲットとして前記リゾチーム試料を使用し、NHS-activated　Sepharose　4　Fast　Flow　Lab　Packs（GE　Healthcare社製）を使用し、その使用説明書にしたがって調製した。
　そして、前記核酸センサおよび前記ターゲット固相化ビーズを用い、前記核酸センサの卵白リゾチームに対する結合性を、以下に示すようにして確認した。まず、９６ウェルのＵ底プレートに、フィルタープレート（millipore社製、cat#MSGVN2250）をセットし、前記Ｕ底プレートの各ウェルに、２０μＬ／ウェルとなるように前記ターゲット固相化ビーズを加えた。前記各ウェルに、４０μＬの前記リゾチーム試料（終濃度　０、０．０２、０．０４、０．０８、０．１６、０．３１、０．６３、１．３、２．５、３、１００ｐｐｍ）と、４０μＬの前記核酸センサ（６２５倍希釈）とを加え、５分間、室温の条件で混合し、前記リゾチーム試料、前記ターゲット固相化ビーズおよび前記核酸センサを反応させた。その後、前記Ｕ底プレートを、３０００ｇ、２分、室温の条件で遠心分離し、前記ターゲット固相化ビーズを遠心除去した。前記遠心分離によって、前記フィルタープレートを通過した反応液を、前記各ウェルから回収し、発光量の測定に供した。前記発光量の測定には、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００　Ｐｒｏ（ＴＥＣＡＮ社）を、その使用説明書にしたがって使用した。前記発光量の測定において、基質として、ＱｕａｎｔｉＬｕｃ（商品名、Invitrogen社製、cat#rep-qlc1）を使用した。
　発光量の測定結果を図７に示す。図７は、前記リゾチーム試料に関する発光量の測定結果を示すグラフである。図７において、横軸は、前記リゾチーム試料の濃度を示し、縦軸は、発光量（ＲＬＵ）を示す。図７に示すように、ルシフェラーゼの触媒反応による発光がみられ、前記リゾチーム試料のタンパク質濃度が増加するにつれて、発光量が増加した。
　さらに、前記図７の測定結果から、３σ法により、前記核酸センサの卵白由来リゾチームに対する検出限界を算出した（ｎ＝３）。この結果、前記核酸センサの卵白由来リゾチームに対する検出限界（ＬＯＤ）は、０．０３９ｐｐｍであった。このことから、前記核酸センサは、微量の卵白由来リゾチームを検出可能であることがわかった。
　つぎに、前記リゾチーム試料に代えて、前記実施例１で調製した卵試料、ならびに、交差反応の確認のため、前記実施例１で調製した牛乳試料、生ピーナッツ試料、およびグルテン試料（終濃度　０、１．５６、３．１４、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｐｐｍ）を使用して、同様の測定を行った。
　図８は、卵、牛乳、生ピーナッツ、およびグルテンを試料とした場合における、発光量の測定結果を示すグラフである。図８において、横軸は、各試料の濃度を示し、縦軸は、発光量（ＲＬＵ）を示す。図８に示すように、前記卵試料の場合、ルシフェラーゼの触媒反応による発光がみられ、前記試料のタンパク質濃度の増加に伴い、発光量が増加した。一方、前記牛乳試料、生ピーナッツ試料、およびグルテン試料の場合は、いずれも、発光量は変化しなかった。このことから、前記核酸センサは、前記卵試料、具体的には前記卵試料中の卵白由来リゾチームを特異的に検出できることがわかった。
　さらに、前記図８の測定結果から、３σ法により、前記卵試料における前記核酸センサの検出限界を算出した（ｎ＝３）。この結果、前記卵試料における前記核酸センサの検出限界（ＬＯＤ）は、３．１２５ｐｐｍであった。このことから、前記核酸センサは、前記卵試料における前記卵白由来リゾチームを、十分に検出可能であることがわかった。
［実施例４］
　本発明のアプタマーについて、各種食材に対する交差反応性を確認した。
　前記アプタマーの交差反応の確認のため、以下の測定条件とした以外は、実施例３と同様にして結合性の解析を行った。馬鈴薯でんぷん、鮭、あわ、キヌア、豚肉、キウイ、クミン、うこん、ひよこ豆、乾燥大豆、小豆、鯖、きび、山芋、りんご、ポピーシード、グァーガム、もやし、そば、大正金時、いか、小麦、そらまめ、バナナ、ブラックペッパー、黒米、にんにく、ゼラチン、虎豆、たこ、ライ麦、白ごま、ココナッツ、ホワイトペッパー、インゲン豆、オクラ、豚レバー、アーモンド、ブラックタイガー、大麦、ズワイガニ、スキムミルク、コーヒー豆、唐辛子、ささげ、さやえんどう、シラス、カシューナッツ、白米粉、大麦麦芽、ホタテ貝柱、トマト、ココア、わさび、大福豆、さやいんげん、さんま、マカダミアナッツ、精米、えん麦（オーツ麦）、生たらこ、玉ねぎ、緑茶、しょうが、うずら豆、ジャガイモ、カツオ、ピスタチオ、発芽玄米、はと麦、生すじこ、ほうれん草、岩のり、カレー、赤エンドウ、パセリ、たら、クルミ、もち米、コーンフラワー、牛肉、マッシュルーム、ひじき、シナモン、青えんどう、ブルーベリー、あさり、黒ゴマ、ひえ、アマランサス、鶏肉、オレンジ、わかめ、コリアンダー、紫花豆、生大豆、およびしじみを使用し、それぞれの試料を調製した。１００ｐｐｍの前記試料に１０ｐｐｍの前記リゾチーム試料をスパイクインしたものを、前記ターゲット固相化ビーズおよび前記核酸センサとの前記反応に使用した。そして、前記反応による発光量と、１０ｐｐｍの前記リゾチーム試料を測定した場合の発光量とを比較し、Ｓ／Ｎ比が、２以下となる場合、結合性ありと判定した。
　この結果、アプタマー１は、上記いずれの試料に対しても、結合性を示さなかった。
　以上の結果から、本発明のアプタマーは、卵由来リゾチームに特異的に結合し、それを測定により検出できること、および、本発明のアプタマーによれば、発光の強弱によって、試料中の卵由来リゾチームの量を分析できることがわかった。
　以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
　この出願は、２０１６年１１月２１日に出願された日本出願特願２０１６－２２６３４８を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
　本発明の核酸分子は、卵由来リゾチームに結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、試料中のアレルゲンとの結合の有無によって、卵由来リゾチームを検出できる。このため、本発明の核酸分子は、例えば、食品製造、食品管理、食品の流通等の分野において、例えば、卵に由来するアレルゲンの検出に、極めて有用なツールといえる。

Claims (17)

  1. 下記（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、卵由来リゾチームに結合する核酸分子。
    （ａ）配列番号１の塩基配列または配列番号１の塩基配列の部分配列からなるポリヌクレオチド
    （ｂ）前記（ａ）の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、卵由来リゾチームに結合するポリヌクレオチド
  2. 前記配列番号１の塩基配列の部分配列が、配列番号２～７からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列である、請求項１記載の核酸分子。
  3. 前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のチミンが、修飾塩基であり、前記チミンの修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、請求項１または２記載の核酸分子。
  4. 前記ポリヌクレオチドにおいて、チミンの全塩基数のうち、２０分の１以上が、修飾塩基であり、前記チミンの修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  5. 前記ポリヌクレオチドにおいて、全チミンが、修飾塩基であり、前記チミンの修飾塩基が、修飾チミンおよび修飾ウラシルの少なくとも一方である、請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  6. 前記ポリヌクレオチドにおいて、少なくとも１個のシトシンが、修飾塩基である、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  7. 前記ポリヌクレオチドにおいて、シトシンの全塩基数のうち、２０分の１以上が、修飾塩基である、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  8. 前記ポリヌクレオチドにおいて、全シトシンが、修飾塩基である、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  9. 前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  10. 下記（ｅ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子。
    （ｅ）前記（ａ）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、配列番号２～７のいずれかの塩基配列を含む、卵由来リゾチームに結合するポリヌクレオチド
  11. 下記（ｆ）のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸分子。
    （ｆ）配列番号１～７からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、それぞれ、式（Ｉ）～（ＶＩＩ）で表される二次構造を形成可能である、卵由来リゾチームに結合するポリヌクレオチド
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
      
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
      
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
      
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
      
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
      
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
      
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
      
  12. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、卵由来リゾチームの検出試薬。
  13. さらに、標識物質を有し、
    前記標識物質が、前記核酸分子に結合されている、請求項１２記載の検出試薬。
  14. 前記標識物質が、酵素である、請求項１３記載の検出試薬。
  15. 前記酵素が、ルシフェラーゼである、請求項１４記載の検出試薬。
  16. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項１２から１５のいずれか一項に記載の検出試薬と、試料とを接触させ、前記試料中の卵由来リゾチームと、前記核酸分子または前記検出試薬との複合体を形成させる工程、および、
    前記複合体を検出する工程を含むことを特徴とする、卵由来リゾチームの検出方法。
  17. 前記検出が、定性分析または定量分析である、請求項１６記載の検出方法。
PCT/JP2017/030180 2016-11-21 2017-08-23 核酸分子およびその用途 Ceased WO2018092374A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018551037A JP6687264B2 (ja) 2016-11-21 2017-08-23 核酸分子およびその用途

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016226348 2016-11-21
JP2016-226348 2016-11-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018092374A1 true WO2018092374A1 (ja) 2018-05-24

Family

ID=62146278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/030180 Ceased WO2018092374A1 (ja) 2016-11-21 2017-08-23 核酸分子およびその用途

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6687264B2 (ja)
WO (1) WO2018092374A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016117701A1 (ja) * 2015-01-22 2016-07-28 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 ターゲット分析用具およびターゲット分析方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016117701A1 (ja) * 2015-01-22 2016-07-28 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 ターゲット分析用具およびターゲット分析方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAYRAMOGLU, GULAY ET AL.: "Lysozyme specific aptamer immobilized MCM-41 silicate for single-step purification and quartz crystal microbalance (QCM) -based determination of lysozyme from chicken egg white", MICROPOROUS AND MESOPOROUS MATERIALS, vol. 207, 2015, pages 95 - 104, XP029142016, ISSN: 1387-1811, DOI: doi:10.1016/j.micromeso.2015.01.009 *
POTTY, AJISH S.R. ET AL.: "Biophysical characterization of DNA and RNA aptamer interactions with hen egg lysozyme", INT. J. BIOL. MACROMOL., vol. 48, 2011, pages 392 - 397, XP028186149, ISSN: 0141-8130, DOI: doi:10.1016/j.ijbiomac.2010.12.007 *
TRAN, DINH T. ET AL.: "Selection and characterization of DNA aptamers for egg white lysozyme", MOLECULES, vol. 15, 2010, pages 1127 - 1140, XP055229152, ISSN: 1420-3049, DOI: doi:10.3390/molecules15031127 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2018092374A1 (ja) 2019-06-27
JP6687264B2 (ja) 2020-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pinto et al. Label-free detection of gliadin food allergen mediated by real-time apta-PCR
JP6687618B2 (ja) 組換えタンパク質調製物中の残留宿主細胞タンパク質の検出
Hong et al. Fluorescence detection of milk allergen β-lactoglobulin based on aptamers and WS 2 nanosheets
JP6212136B2 (ja) ピーナッツに結合する核酸分子およびその用途
CN114127282A (zh) 适体的筛选方法和使用适体的免疫分析方法
CN104911186A (zh) 一种特异性识别黄曲霉素b1的单链dna寡核苷酸适配子
JP6687264B2 (ja) 核酸分子およびその用途
EP2588608B1 (en) Psa binding aptamer and method for diagnosis of prostate cancer
JP6399611B2 (ja) エビアレルゲンに結合する核酸分子およびその用途
JP6347498B2 (ja) 卵アレルゲンに結合する核酸分子およびその用途
JP6414907B2 (ja) そばアレルゲンに結合する核酸分子およびその用途
WO2018097220A1 (ja) 核酸分子およびその用途
JP2018171035A (ja) 核酸分子およびその用途
WO2018092915A1 (ja) 核酸分子およびその用途
JP6598315B2 (ja) 小麦アレルゲンに結合する核酸分子およびその用途
Zhu et al. Screening, identification, and application of aptamers against allergens in food matrices
JP7343138B2 (ja) ターゲットの分析方法および分析キット
CN113287011A (zh) 适体选择方法
JP2020165819A (ja) 小麦アレルゲンの分析キットおよび分析方法
JP7405400B2 (ja) 核酸分子およびその用途
JP2018170985A (ja) 核酸分子およびその用途
CN108474023A (zh) 靶标分析方法和用于该方法的靶标分析试剂盒
JP6963221B2 (ja) 核酸分子およびその用途
CN121320355A (zh) 一种特异性识别鬼笔环肽的适配体、筛选方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17871493

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018551037

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17871493

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1