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WO2018074682A1 - 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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WO2018074682A1
WO2018074682A1 PCT/KR2017/003448 KR2017003448W WO2018074682A1 WO 2018074682 A1 WO2018074682 A1 WO 2018074682A1 KR 2017003448 W KR2017003448 W KR 2017003448W WO 2018074682 A1 WO2018074682 A1 WO 2018074682A1
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WO
WIPO (PCT)
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peptide
seq
group
fat
amino acid
Prior art date
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Application number
PCT/KR2017/003448
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English (en)
French (fr)
Inventor
정용지
김은미
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Caregen Co Ltd
Original Assignee
Caregen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to JP2019520822A priority patent/JP6875516B2/ja
Priority to EP17861361.8A priority patent/EP3530667B1/en
Priority to RU2019115134A priority patent/RU2721426C1/ru
Priority to ES17861361T priority patent/ES2901416T3/es
Priority to US16/343,559 priority patent/US10723777B2/en
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to peptides having anti-obesity and anti-diabetic efficacy and their use.
  • Drugs that act on the central nervous system include drugs such as fenfluramine and dexfenfluramine that inhibit serotonin (5-HT) nervous system according to each mechanism, drugs such as ephedrine and caffeine through the noradrenaline nervous system, and recently serotonin and noradrenaline nervous system.
  • Drugs such as sibutramine, which simultaneously acts to inhibit obesity are commercially available.
  • orlistat which is approved as an anti-obesity agent to reduce the absorption of fat by inhibiting intestinal lipase by acting on the gastrointestinal tract and inhibiting obesity, is used as a typical drug.
  • drugs such as fenfluramine, which have been used previously, have been banned due to side effects such as primary pulmonary hypertension or heart valve lesions.
  • Other drugs also have problems such as decreased blood pressure and lactic acidosis, which can lead to heart failure and kidney disease. There is a problem that can not be used in the patient.
  • Diabetes mellitus is a type of metabolic disease, such as a lack of insulin or a lack of normal function (DeFronzo, 1988). It is characterized by high blood sugar levels that increase the level of glucose in the blood. It is a disease that produces glucose. Recently, the incidence of diabetes has exploded due to an increase in obesity rate, especially abdominal obesity.
  • the number of diabetics was estimated at 170 million worldwide in 2000, and was expected to reach 370 million in 2030, but recent analysis shows that there are already about 350 million worldwide in 2008. It is reported to have been reported to be much worse than expected (Danaei et al .. 2011). Less than 10% of obese patients have been reported as diabetic, compared with about 80% or more of patients with dysplastic diabetes (Harris et al. 1987).
  • diabetes The association between diabetes and obesity is due to the irregular secretion of adipokine and free fatty acids, resulting in fatty acid accumulation in beta cells or insulin-sensitive tissues such as kidney, liver, and heart, resulting in lipotoxicity. Because it represents. Without proper treatment for chronic hyperglycemic conditions, there are many pathological symptoms in the body, and typical blood glucose management is essential to prevent complications due to retinopathy, renal dysfunction, neuropathy, and vascular disorders.
  • Insulin produced by recombinant methods, is an essential drug for patients with type 1 diabetes and heterogeneous patients with poor glycemic control, but has advantages in controlling blood glucose, but has disadvantages such as resistance to needles, difficulty in administration, risk of hypoglycemia, and weight gain.
  • Meglitinide a type of insulin secretagogue, is a fast-acting drug that is taken before meals, and includes norborneum (lepaglinide), plastic (nateglinide), and glutfast (mitiglinide). Insulin sensitivity improvers are characterized by almost no hypoglycemia when taken alone, metformin and bigazolidinedione-based avans (logiglitazone), actose (pioglitazone), etc. There is this.
  • DPP-4 inhibitor which inhibits the action of DPP-4 (Dipeptidyl peptidase-4), an enzyme that rapidly inactivates GLP-1, is a recently developed new drug. ) Is representative.
  • the present inventors are interested in the mechanism of controlling energy metabolism in recent years in order to find an improved method for the treatment of obesity, and on the premise that this class of compounds should have higher safety (low toxicity),
  • peptides that promote lipolysis Through the development of peptides that promote lipolysis.
  • an object of the present invention is to provide a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • Another object of the present invention is to provide a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 having anti-obesity or antidiabetic activity.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing and / or treating obesity comprising at least one peptide selected from the group consisting of peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing and / or treating diabetes, comprising at least one peptide selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • the present inventors have tried to develop a number of excellent peptides having biologically effective activity, the peptide consisting of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 7 suppresses fat accumulation induced by high fat diet,
  • the present invention was completed by not only degrading the already accumulated fat to show anti-obesity effect, but also showing excellent prophylactic and / or therapeutic effects on diabetes, obesity diabetes and diabetic complications.
  • One aspect of the invention relates to a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • Another aspect of the invention relates to a peptide having anti-obesity and / or antidiabetic activity consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • the peptide may be one in which N-terminal and / or C-terminal modifications are induced to select a portion of an amino acid sequence and increase its activity.
  • N-terminal and / or C-terminal modifications can significantly improve the stability of the peptides of the present invention and, for example, increase the half-life upon in vivo administration of the peptides.
  • the N-terminal modification is an acetyl group, fluorenylmethoxycarbonyl group, formyl group, palmitoyl group, myristyl group at the N-terminus of the peptide.
  • a stearyl group, and a polyethylene glycol (PEG) may be combined with a protecting group selected from the group consisting of.
  • the protecting group serves to protect the peptide of the present invention from the attack of protein cleavage enzymes in vivo.
  • the C-terminal modification may be a combination of a hydroxyl group (-OH), an amino group (amino group, -NH2), azide (azide, -NHNH2), etc. to the C-terminal end of the peptide, but is not limited thereto. .
  • the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 inhibits fat accumulation when induced by a high fat diet, and has an effect of decomposing fat accumulated already.
  • the peptide decreases the expression of lipid generation markers, PPAR ⁇ (Pero ⁇ some proliferator-activated receptor gamma), ACC (Acetyl-CoA carboxylase) and / or aP2 (adipose-specific fatty acid-binding protein 2).
  • PPAR ⁇ Pero ⁇ some proliferator-activated receptor gamma
  • ACC Alcohol-CoA carboxylase
  • aP2 adipose-specific fatty acid-binding protein 2
  • the peptide is a lipolysis factor of pHSL (phospho-hormone-sensitive lipase), AMPK- ⁇ 1 (AMP-activated protein kinase ⁇ 1), CGI-58 (Comparative Gene Identification-58) and / or Adipose triglyceride lipase (ATGL) To increase the expression. Reduce the size and fat cell size.
  • pHSL phospho-hormone-sensitive lipase
  • AMPK- ⁇ 1 AMP-activated protein kinase ⁇ 1
  • CGI-58 Comparative Gene Identification-58
  • Adipose triglyceride lipase Adipose triglyceride lipase
  • the peptide has an effect of increasing lipolysis, inhibiting lipid production, reducing blood sugar, reducing the size of fat cells, and reducing blood cholesterol levels.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 wherein Ser of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 is replaced by Cys, and their anti-obesity and And / or antidiabetic activity is about the same.
  • Another aspect of the invention relates to a peptide complex having anti-obesity and / or anti-diabetic activity comprising two or more peptides consisting of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 7.
  • the peptide complex comprises at least one peptide consisting of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 It may further comprise one or more peptides consisting of an amino acid sequence selected from.
  • the peptide complex may be a combination of the following peptides:
  • peptide complex may be a combination of the following peptides:
  • the peptide of the present invention exhibits excellent anti-obesity and anti-diabetic activity as well as peptides consisting of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 7.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity, comprising one or more selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 as an active ingredient.
  • the peptide may be used for the prevention and / or treatment of obesity because it has an excellent function of inhibiting lipogenesis and degrading lipids.
  • the pharmaceutical composition for preventing and / or treating obesity is at least one peptide selected from the group consisting of peptides consisting of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 7 It may be to further include.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing and / or treating diabetes comprising at least one selected from the group consisting of peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 as an active ingredient.
  • the peptides can be used to prevent and / or treat diabetes by exhibiting the effect of effectively reducing elevated blood sugar in diabetic animal models.
  • the pharmaceutical composition for preventing and / or treating diabetes may include at least one peptide selected from the group consisting of peptides consisting of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 7 It may be to further include.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating obesity or diabetes may include a pharmaceutically effective amount of a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; And a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is conventionally used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, Polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include, but is not limited to, a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally, preferably parenterally, and in the case of parenteral administration, may be administered by intramuscular injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, or the like. It is not limited to this.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be 0.0001 to 1000 ug per day (microgram, 0.001 to 1000 ug, 0.01 to 1000 ug, 0.1 to 1000 ug, or 1.0 to 1000 ug, but is not limited thereto. It can be prescribed in various ways such as, the mode of administration, the age, weight, sex, morbidity of the patient, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person skilled in the art. It can be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants and / or stabilizers.
  • peptide herein refers to a linear molecule formed by binding amino acid residues to each other by peptide bonds.
  • the peptides of the present invention may be prepared by chemical synthesis methods known in the art, in particular solid-phase synthesis techniques (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54 (1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. Ed., Pierce Chem. Co .: Rockford, 111 (1984)) or liquid phase synthesis technology (US Pat. No. 5,516,891).
  • the term “stability” refers to in vivo stability as well as storage stability (eg, room temperature storage stability).
  • the term "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the aforementioned peptides.
  • the present invention relates to a peptide having anti-obesity and anti-diabetic efficacy and a composition for preventing or treating obesity or diabetes, including the same, the peptide of the present invention shows excellent efficacy on diabetes and obesity diabetes. Inhibition of insulin signal caused by fat accumulation caused by high fat diet or fat accumulation such as liver or muscle and resistance of insulin caused by this cause diabetes.
  • the peptides of the present invention are diabetes and obesity diabetes. It can be used for prophylactic or therapeutic purposes.
  • Figure 1a is a result of confirming through the oil red O staining the fat accumulated when the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 1b is a result of confirming through the oil red O staining fat accumulated when the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2a is a graph of the result confirmed through Oil red O staining to confirm the accumulated fat when the peptide complex according to an embodiment of the present invention by concentration.
  • Figure 2b is a photograph of the result confirmed through Oil red O staining to check the fat accumulated when the peptide complex according to an embodiment of the present invention by concentration.
  • Figure 3a is the result of measuring the expression level of aP2, a gene involved in adipose generation when the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3b is the result of measuring the expression level of aP2, a gene involved in apoptosis when the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is the result of measuring the expression amount of the PPAR ⁇ , ACC, aP2 genes that are important genes for lipid synthesis when the peptide complex is treated by concentration according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5a is a result of measuring the expression of the phospho-HSL protein, which is an important protein for lipid synthesis and PPAR ⁇ , which is important for lipid synthesis when the peptide complex of the present invention is treated by concentration.
  • Figure 5b is a graph of the result of measuring the expression amount of PPAR ⁇ protein, which is an important protein in lipid synthesis when the peptide complex of the present invention is treated by concentration.
  • Figure 5c is a graph of the result of measuring the expression amount of the phospho-HSL protein, which is an important protein in lipid degradation when the peptide complex of the present invention is treated by concentration.
  • Figure 6a is a result of measuring the expression of AMPK- ⁇ 1 and CGI58 genes involved in the process of digesting fat accumulated when the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6b is a result of measuring the expression of AMPK- ⁇ 1 and CGI58 genes involved in the process of digesting fat accumulated when the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6c is the result of measuring the expression of AMPK- ⁇ 1 and CGI58 genes involved in the process of digesting fat accumulated when the peptide complex according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7a is a photograph of the result of measuring the amount of expression of ATGL, a protein involved in the process of digesting fat accumulated when the peptide complex of the present invention is treated by concentration.
  • Figure 7b is a graph of the result of measuring the expression level of ATGL, a protein involved in the process of decomposition of fat accumulated when the peptide complex of the present invention is treated by concentration.
  • Figure 8a is measured using immunostaining the amount of expression of Phospho-HSL, a protein involved in the process of digesting fat accumulated when the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 according to an embodiment of the present invention The result is.
  • Figure 8b is measured using immunostaining the amount of expression of Phospho-HSL, a protein involved in the process of digesting fat accumulated when the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 according to an embodiment of the present invention The result is.
  • Figure 8c is the result of measuring the amount of expression of Phospho-HSL, a protein involved in the process of digesting fat accumulated when the peptide complex according to an embodiment of the present invention using immunostaining.
  • Figure 10a is a result of measuring the adipose tissue that is decomposed after treating the peptide complex of the present invention by concentration in obese mice experimental model.
  • Figure 10b is a result of measuring the size and value of the adipose tissue that is decomposed after treatment of the peptide complex of the present invention in an obese mouse experimental model.
  • Figure 12 is the result of measuring the weight change (a) and feed intake change (b) in obese mice when treated with the peptide complex of the present invention.
  • Figure 13 is the result of measuring the appearance of obese mice when treated with the peptide complex of the present invention.
  • 15 is a result of observing the fat cell tissue after treating the peptide complex of the present invention by preparing a fat mouse model by ingesting a greasy feed to the experimental animal model C57BL / 6 mouse model.
  • Figure 16a is a result of observing the shape of fat cells by ingesting a fat diet ingested fat model in the mouse model C57BL / 6 mice modeled after treating the peptide complex of the present invention.
  • Figure 16b is a result of observing the fat cell size by ingesting a fat diet ingested fat model in the model of the obese mouse by ingesting a greasy feed to the C57BL / 6 mouse model of the experimental animal model.
  • Figure 16c is a graph of the results obtained by observing the fat cell size of the fat cell tissue after treatment of the peptide complex of the present invention by preparing a fat mouse model by ingesting a greasy feed to the experimental animal model C57BL / 6 mouse model.
  • FIG. 17 is a phospho protein which acts on the lipolysis of adipocytes by ingesting adipose tissue after treating the peptide complex of the present invention by preparing an obese mouse model by ingesting a greasy feed into a C57BL / 6 mouse model, which is an experimental animal model. -Observation of expression of HSL
  • 19 is a result of measuring the blood glucose by collecting blood after the obese mouse model was prepared by ingesting an oily feed to a C57BL / 6 mouse model, which is an experimental animal model, after treating the peptide complex of the present invention.
  • 21 is a result of measuring the change in cholesterol by collecting blood after treating the peptide complex of the present invention in the diabetes-induced db / db mouse model.
  • Figure 22 is a result of measuring the change in blood glucose by collecting blood after treatment of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to the db / db mouse model of diabetes induced in accordance with an embodiment of the present invention.
  • Figure 23 is a result of measuring the change in blood glucose by collecting blood after treating the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 to the db / db mouse model of diabetes induced in accordance with an embodiment of the present invention.
  • 24A to 24D illustrate the results of measuring blood glucose changes after treating the peptide complex of the present invention in a diabetic patient with high blood sugar according to an embodiment of the present invention.
  • chloro trityl chloride resin CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021
  • MC methylene chloride
  • DMF dimethylformamide
  • 10 ml of dichloromethane solution was added to the reactor, 200 mmole of Fmoc-Asn (Trt) -OH (Bachem, Swiss) and 400 mmole of diisopropyl ethylamine (DIEA) were added to the mixture, followed by stirring to dissolve well. I was.
  • Arg-Asn-CTL resin was prepared by deprotection twice in the same manner as above with the deprotection solution. After sufficient washing with DMF and MC, once again Kaiser test was performed, and the following amino acid attachment experiment was performed as above. Based on the selected amino acid sequence, chain reaction was performed in the order of Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, and Fmoc-Leu-OH. The Fmoc-protector was reacted twice with a deprotection solution twice for 10 minutes and then washed well.
  • Acetylation of acetic anhydride, DIEA, and HoBt was performed for one hour, and then the prepared peptidyl resin was washed three times with DMF, MC, and methanol, and dried slowly by flowing nitrogen air. After drying, add 30 ml of fugitive solution (81.5% Trifluroacetic acid, 5% distilled water, 5% Thioanisole, 5% Phenol, 2.5% EDT, and 1% TIS). Shake occasionally at room temperature to maintain a reaction for 2 hours. The resin was filtered off and the resin was washed with a small amount of TFA solution and then combined with the mother liquor.
  • fugitive solution 81.5% Trifluroacetic acid, 5% distilled water, 5% Thioanisole, 5% Phenol, 2.5% EDT, and 1% TIS.
  • the peptide complex consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 7, respectively, was mixed in the same amount to make a peptide complex and its efficacy was evaluated.
  • Fat progenitor cells Inhibition of lipid accumulation by oil (Oil red O staining)
  • 3T3-L1 cells which are pre-adipocytes, to a confluent state, and then exchange them with differentiation media containing 10 ug / ml insulin, 0.1 uM dexamethasone, and 0.5 uM IBMX and incubate for 2 days by concentration of peptides. After that, the cells were exchanged with a medium containing 10 ug / ml insulin every 2 days, and oil red O staining was performed to confirm intracellular droplet generation after inducing differentiation for 10 days.
  • the prepared 3T3-L1 adipocytes were washed with PBS, fixed with 3.7% formalin for 1 hour, washed with 60% isopropanol, and treated with Oil Red O solution for 20 minutes at room temperature. After staining, the Oil Red O solution was removed, washed three times with distilled water, and the stained cells were observed using a phase contrast microscope, and the results are shown in FIGS. 1A and 1B.
  • 100% isopropanol was used to extract fat, and then, 200 ul was transferred to 96-well plates, and the absorbance was measured at 500 nm with an ELISA reader. The results are shown in FIG. 2.
  • 3T3-L1 fat progenitors were seeded in 6-well plates at a cell density of 3 ⁇ 10 5 cells / well. After incubation for 24 hours, peptides were treated with concentrations (0.1, 1, 10 ug / ml) and incubated in a 37 ° C. incubator for 14 days. After the cultured cells were recovered, RNA was prepared by treating RNA extraction solution (Easy Blue, Intron), and cDNA was synthesized using RT premix (Intron). PCR was performed using primers for each labeling factor (PPAR ⁇ , ACC, aP2) and PCR premix (Intron). Then, the PCR products were loaded by 5 ul of PCR products on 1% agarose gel, followed by electrophoresis, and the bands were confirmed in Gel-Doc. The results are shown in FIGS. 3A and 3B.
  • the target-specific primer sequences used for the lipogenic marker PCR are as follows:
  • the mouse osteoblasts 3T3-L1 peptide complex was treated at a concentration of 0.1 ug / ml, 1 ug / ml, 10 ug / ml and cultured for 3 days, the lipid production markers
  • the expression of PPAR ⁇ , ACC, aP2 was decreased in both the positive control TNF ⁇ 100 ng / ml treated group and the peptide complex treated group.
  • 3T3-L1 fat progenitors
  • peptide complexes were treated by concentration (0.1, 1, 10 ug / ml) and incubated in a 37 ° C. incubator for 14 days.
  • concentration 0.1, 1, 10 ug / ml
  • Western blots were prepared using anti-PPAR ⁇ antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA), which is a lipogenic factor, and anti-pHSL antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA), which is a lipolytic factor. Lotting was performed.
  • 3T3-L1 fat progenitors were seeded in 6-well plates at a cell density of 3 ⁇ 10 5 cells / well. After 24 hours of incubation, peptides were treated by concentration (0.1, 1, 10 ug / ml) and incubated in a 37 ° C. incubator for 14 days (positive control: 100 ng / ml TNF ⁇ (SIGMA)). After the cultured cells were recovered, RNA was prepared by treating RNA extraction solution (Easy Blue, Intron), and cDNA was synthesized using RT premix (Intron). PCR was performed using primers for each labeling factor (AMPK- ⁇ 1, CGI58) and PCR premix (Intron). Thereafter, 5 ul each of the PCR products was loaded on 1% agarose gel, followed by electrophoresis, and the bands were confirmed in Gel-Doc. The results are shown in FIG. 6.
  • the target-specific primer sequences used for the lipogenic marker PCR are as follows:
  • the peptide was treated and cultured in fat precursor cells (3T3-L1), the expression of lipolytic markers AMPK- ⁇ 1 and CGI-58 is increased in each peptide treatment group could be observed.
  • 3T3-L1 fat progenitors were seeded in 6-well plates at a cell density of 3 ⁇ 10 5 cells / well. After incubation for 24 hours, peptide complexes were treated by concentration (0.1, 1, 10 ug / ml) and incubated in a 37 ° C. incubator for 14 days (positive control: 100 ng / ml TNF ⁇ (SIGMA)). After lysing the lysate by treating the cell lysis buffer, protein quantification was performed, and Western blotting was performed using an anti-ATGL antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA).
  • 3T3-L1 fat progenitors were seeded in 6-well plates at a cell density of 3 ⁇ 10 5 cells / well. After 24 hours of incubation, each peptide or peptide complex (1 ug / ml) was treated and incubated in a 37 ° C. incubator for 14 days (positive control: 100 ng / ml TNF ⁇ (SIGMA)). After culturing the cells, the cells were fixed with 70% ethanol, and then intracellular expression of phospho-HSL, a lipolysis-inducing factor, was observed through cellular immunostaining using an anti-phospho-HSL antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA). It was.
  • SIGMA 100 ng / ml TNF ⁇
  • adipose tissue was collected from the abdomen-induced mouse animal, 100 mg / well of adipose tissue was added to a 24-well culture plate, followed by culture medium (1 ml Krebs-Ringer buffer containing 25 mM HEPES, 5.5 mM glucose, and 2% (w / v). a) bovine serum albumin).
  • culture medium (1 ml Krebs-Ringer buffer containing 25 mM HEPES, 5.5 mM glucose, and 2% (w / v). a) bovine serum albumin).
  • the peptide complex was treated at concentrations of 0.1 ug / ml, 1 ug / ml, and 10 ug / ml, and treated with TNF ⁇ 100 ng / ml as a positive control group, incubated for 48 hours, and then released from the breakdown of fat. The amount of cerol was measured.
  • Adipose tissue is divided into white fat and brown fat according to color, and subdivided into subcutaneous fat, peritoneal fat, mesenteric fat (visceral fat) and epididymal fat, depending on the region. After dissection, each fat was extracted to separate white fat, and then treated with a compound concentration in a 24-well plate at a weight of 100 mg / well, followed by culture medium (1 ml Krebs-Ringer buffer containing 25 mM HEPES, 5.5 mM glucose, and 2% After 72 hours incubation in (w / v) bovine serum albumin), the tissues were sectioned and stained with hematoxylin and eosin, and the size of fat cells was compared by microscopic observation (TS100, Nicon) at 200 times.
  • TS100 microscopic observation
  • adipose tissue was collected from the abdomen-induced mouse animal, 100 mg / well of adipose tissue was added to a 24-well culture plate, followed by culture medium (1 ml Krebs-Ringer buffer containing 25 mM HEPES, 5.5 mM glucose, and 2% (w / v)). bovine serum albumin). Peptide complexes were treated at the time of treatment, TNF ⁇ 100 ng / ml was treated as a positive control, and cultured for 48 hours, and then the expression of phospho-HSL (green fluorescent substance), which was a lipolysis factor, was confirmed.
  • culture medium (1 ml Krebs-Ringer buffer containing 25 mM HEPES, 5.5 mM glucose, and 2% (w / v)). bovine serum albumin).
  • Example 3 inhibitory effect on fat production and fat decomposition through experimental animals
  • Antiobesity efficacy experiments were performed using a diet-induced obesity-induced model DIO (Diets induced obesity) induced in normal C57BL / 6 mice, and TNF ⁇ 5 ug / ml was used as a positive control drug.
  • the control group proceeded to a normal diet rather than a high fat diet, and the experiment was carried out for 12 weeks while the high fat diet was treated with a peptide complex and treated with a positive control to confirm the weight loss.
  • TNF ⁇ and anti-obesity compounds were forcibly intraperitoneally injected for 12 weeks at 3 pm-4 pm weekly, and body weight and diet were measured immediately before the first drug administration, and then body weight and diet were measured at weekly intervals.
  • Blood glucose was measured in the tail vein after the end of the drug administration experiment using Accu-Check Active (Roche), and Cholesterol was also analyzed in the tail vein using the Cholesterol calculation Kit (BioVision). .
  • Adipose tissue is divided into white fat and brown fat according to color, and subdivided into subcutaneous fat, peritoneal fat, mesenteric fat (visceral fat) and epididymal fat, depending on the region. After dissection, each fat was extracted and observed. For histological examination, the fat was fixed in 10% neutral buffered formalin, planted in paraffin blocks, sectioned at 5 um, and stained with hematoxylin and eosin.
  • HSL a lipolytic factor
  • Phosphorylation of HSL, a lipolytic factor was performed by fluorescence staining using Anti-pHSL antibody.
  • Tissue samples were prepared and mounted with glycerine Jell mounting media, covered with a cover glass and observed under a microscope (Nicon, TS100), and tissue was taken with a digital camera built into the microscope.
  • mice fed the normal diet for 12 weeks ranged from 20.9g at the beginning of the experiment to 28.74g after 12 weeks, and the mice fed the high-fat diet had an initial weight of 20.99g at 49.5g after 12 weeks. It was confirmed. However, in the peptide complex group treated in parallel with the high fat diet, high weight loss (174.2%) occurred from the initial 21.1 g to 36.76 g after 12 weeks (235.8%). 4, Table 5 and FIG. 12). Table 4 and Table 5 show the weight measurement results in gram (g) and percent (%) after the peptide complex was treated in the obese mouse model.
  • micro-CT imaging was performed on mice that had undergone experiments for 12 weeks to confirm the fat (yellow) in the whole body, and compared with the control group who had a normal diet. It was confirmed that the amount of fat distributed throughout the body was rapidly increased in the mice of the high-fat diet control group, and in the group treated with the peptide complex with the high-fat diet, the amount of fat distributed throughout the body was rapidly increased. It was confirmed that the decrease.
  • the fat was separated by observing the size of the fat through H & E staining, it was confirmed that the fat in the peptide complex treatment group with a high fat diet compared to the high fat diet compared to the control group.
  • the amount of cholesterol of the general formula is 2.52 ug / ml
  • high-fat diet In the group treated with the peptide complex, it was confirmed that the amount of cholesterol of 2.86 ug / ml was detected.
  • Peptide complex treatment group was confirmed to lower the level of cholesterol rising during obesity.
  • mice Males of C57BL / 6 (normal rats) (Samtaco) and C57BLKS / JLepr (diabetic mice, db / db mice) (purchased from central laboratory animals) were used in the animal experiments. A combination was used as an agonist and sitagliptin was used as a positive control drug.
  • acute antidiabetic efficacy for normal mouse model and genetically probable model is antidiabetic and / or anti-obesity using GTT (Glucose Tolerance Test) method, which is a representative diabetes diagnostic test method. Efficacy combinations were evaluated.
  • mice The breeding environmental conditions of the mice were set to 22 to 24 °C, relative humidity 50 to 30%, four breeding per breeding box. Illumination of 150 to 300 Lux was provided from 8 am to 8 pm, lit 12 hours a day, 12 hours off. Feed was freely ingested using a regular diet (18% protein, 2018, manufactured by Harlan Laboratories Inc, USA), fasted at least 4 hours before the ITT experiment, and fasted 12 hours before the GTT experiment. One hour before the GTT test, the combination was forced orally administered using a disposable syringe for oral administration, respectively, and the high-fat diet was fed free for 40 minutes at the 0 hour test for the GTT test.
  • a regular diet (18% protein, 2018, manufactured by Harlan Laboratories Inc, USA
  • sitagliptin As a positive control drug was selected as sitagliptin (sitagliptin) currently used as a drug for the treatment of diabetes mellitus, was administered at a dose of 100mg / kg. Combinations selected as antidiabetic and / or anti-obesity efficacy candidates were divided into experimental groups by the dose of 100 mg / kg, and four mice were used for each experimental group.
  • the blood glucose level increased by the high-fat diet was observed to reduce the blood glucose effect by the peptide complex treatment.
  • Diabetes-induced mouse model was confirmed to reduce the high blood sugar of diabetes.
  • the amount of cholesterol was confirmed that the amount of cholesterol is lowered in the peptide complex treatment group with a high-fat diet compared to the control of the high-fat diet.
  • Normal high fat diabetes PBS SEQ ID NO: 2 spandrel 105 78 181 30 minutes 184 227 219 60 minutes 181 250 231 120 minutes 147 301 174 240 minutes 151 247 158 300 minutes 135 200 152
  • Normal high fat diabetes PBS SEQ ID NO: 4 spandrel 115 218 222 30 minutes 159 251 249 60 minutes 125 255 229 120 minutes 121 366 215 240 minutes 112 312 180 300 minutes 119 253 165
  • the present invention relates to peptides having anti-obesity and anti-diabetic efficacy and their use.

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Abstract

본 발명의 펩타이드는 지방 축적을 억제하고, 이미 축적된 지방을 분해하여 항비만 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 혈당을 효과적으로 감소시켜 당뇨병에 대하여 우수한 효과를 나타낸다. 본 발명의 펩타이드는 지질생성 표지인자인 PPARγ, ACC 및/또는 aP2의 발현의 감소시키고, 지방분해 인자인 pHSL, AMPK-α1, CGI-58 및/또는 ATGL의 발현을 증가시키며, 지방세포의 크기 및 혈중 콜레스테롤 수치를 감소시킨다. 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약 및 의약외품에 매우 유리하게 적용될 수 있다.

Description

항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도
본 발명은 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 우리나라에서는 경제 성장과 식생활의 서구화로 인하여 음식물에서 얻는 지방분의 섭취량에 증가하였으며 운동부족 등으로 인해 비만, 당뇨병, 고지혈증, 고혈압, 동맥경화증 및 지방간과 같은 대사성 질환이 증가하고 있는 추세이다. 또한, 비만은 젊은이들에게 있어서 마른 체형을 좋아하는 미용적인 모습을 해칠 뿐만 아니라 비만이 지속됨으로써 여러 가지 질환들이 취급되고 있다.
현재 비만을 치료하는 치료제로는 크게 중추 신경계에 작용하여 식욕에 영향을 주는 약제와 위장관에 작용하여 흡수를 저해하는 약물로 나누어 볼 수 있다. 중추 신경계에 작용하는 약물로는 각각의 기전에 따라 세로토닌(5-HT) 신경계를 저해하는 펜플루라민, 덱스펜플루라민 등의 약물, 노르아드레날린 신경계를 통한 에페드린 및 카페인 등의 약물 및 최근에는 세로토닌 및 노르아드레날린 신경계에 동시 작용하여 비만을 저해하는 시부트라민 등의 약물들이 시판되고 있다. 이외에도, 위/장관에 작용하여 비만을 저해하는 약물로 장관 리파제를 저해하여 지방의 흡수를 줄여 주는 비만 치료제로 허가된 오를리스타트 등이 대표적인 약물로 사용되고 있다.
그러나 기존에 사용되어온 약물 중 펜플루라민 등의 약물은 부작용으로 원발성 폐고혈압이나 심장 판막병변을 일으켜 최근에 사용이 금지되었으며, 다른 약물들도 혈압감소나 유산산혈증 등의 문제점이 발생하여 심부전, 신장질환 등의 환자에는 사용하지 못하는 문제점이 있다.
당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환의 일종으로(DeFronzo, 1988), 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며, 고혈당으로 인하여 여러 증상 및 징후를 일으키고 소변에서 포도당을 배출하게 되는 질환이다. 최근 비만률, 특히 복부 비만의 증가로 인하여 당뇨의 발생률이 폭발적으로 증가하고 있는 추세이다.
당뇨 환자의 수는 2000년 전 세계적으로 1억 7천만 명으로 평가되었고, 2030년에 3억 7천만 명에 이를 것으로 예상되었으나, 최근 분석에 의하면 2008년에 이미 전 세계적으로 약 3억 5천만 명에 이르렀다고 보고되어 예상보다 훨씬 심각한 수준이다 (Danaei et al.. 2011). 이형 당뇨 환자의 약 80% 이상이 비만인 것에 비해, 비만 환자의 단지 10% 미만이 당뇨로 보고되고 있다 (Harris et al.. 1987).
이런 당뇨와 비만의 연관성은 아디포카인들(adipokine)과 유리지방산(free fatty acid)의 불규칙적인 분비로 인하여 지방산이 베타세포나 신장, 간, 심장 등 인슐린 민감성 조직 내에 쌓여 지방 독성(lipotoxicity)을 나타내기 때문이다. 만성적인 고혈당 상태에 적절한 치료가 되지 않으면, 신체에서 여러 병적 증상이 수반되는데, 대표적인 것이 망막병증, 신기능장애, 신경병증, 혈관 장애로 인한 합병증을 예방하기 위해서는 효과적인 혈당 관리가 필수적이다.
현재 혈당을 조절하는 방법으로는 생활습관 고정(식이요법, 운동요법) 및 약물 요법 등이 사용되고 있다. 하지만, 식이 요법이나 운동 요법은 엄격한 관리 및 실시가 곤란하며, 그 효과에 있어서도 한계가 있다. 따라서 대부분의 당뇨 환자들은 생활 습관의 교정과 더불어 인슐린, 인슐린 분비 촉진제, 인슐린 감수성 개선제, 그리고 혈당 강하제 등의 약물에 혈당조절에 의존하고 있다.
재조합 방법에 의해 생산되고 있는 인슐린은 일형 당뇨환자 및 혈당조절이 되지 않는 이형 환자에 필수적인 약물로 혈당 조절에 있어서 유리하지만, 주사침에 대한 거부감, 투여 방법의 어려움, 저혈당 위험, 그리고 체중증가 등의 단점을 가지고 있다.
인슐린 분비 촉진제의 일종인 메글리티나이드계는 약효가 매우 빠른 제제로 식전에 복용하며, 노보넘(레파글리나이드), 파스틱(나테글리나이드), 글루패스트(미티글리나이드) 등이 있다. 인슐린 감수성 개선제는 단독으로 복용 시 저혈당이 거의 없는 것이 특징이며, 바이구아나이드(biguanide)계열 약물인 메트포르민(metformin)과 치아졸리딘다이온(thiazolidinedione) 계열의 아반이다(로지글리타존), 액토스(피오글리타존) 등이 있다.
최근 개발되고 있는 약물로는 인슐린 분비를 촉진시키는 호르몬인 글루카곤 유사 펩타이드-1(Glucagon-like peptide-1)의 작용을 이용하여 개발된 GLP-1 아고니스트(agonist)가 있으며, 엑센나타이드(exenatide)와 빅토자(liraglutide)가 여기에 해당한다. 또한, GLP-1을 신속하게 불활성화시키는 효소인 DPP-4(Dipeptidyl peptidase-4)의 작용을 억제하는 DPP-4 억제제(Inhibitor)도 최근 개발된 신약이며, 자누비아(성분명: 시타글립틴(sitagliptin))가 대표적이다.
그러나 이들 약제는 간독성, 위장장애, 심혈관계 질환 및 발암성 등의 부작용들이 보고되고 있으며, 연간 치료 비용 또한 높아 당뇨병의 치료에 있어서 장애가 되고 있다. 실제로 전 당뇨병 (pre-diabetes) 및 당뇨병 관련 비용은 2007년을 기준으로 미국에서만 약 200조 원에 육박하며(Dall et al., 2010), 비만 관련 비용 또한 2008년 기준으로 미국에서만 150조 원에 육박한다(Finkelstein et al., 2009). 따라서 체중을 감소시키고, 혈당을 효과적으로 낮추어서 당뇨병 및 비만성 당뇨병의 치료에 동시에 사용할 수 있으면서 부작용이 적은 약제의 개발은 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 비만 치료를 위한 보다 개선된 방법을 찾기 위해 최근 에너지 대사를 조절하는 기전에 관심을 갖게 되고, 이쪽 계열의 화합물이 보다 높은 안전성(낮은 독성)을 가져야 한다는 전제하에, 인간이 고지방식이를 섭취하였을 때 지방으로 축적되는 시그널과 지방축적에 영향을 끼치는 단백질들의 연구를 진행하였으며, 이런 지방 축적의 단백질의 발현을 억제하고, 이미 축적된 지방을 분해시키기 위한 시그널 연구 및 관여 단백질의 연구를 통해 지방분해를 촉진하는 펩타이드를 개발하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항비만 또는 항당뇨 활성을 갖는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 포함하는 비만의 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 포함하는 당뇨의 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 다수의 우수한 펩타이드를 개발하고자 노력한 결과, 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 고지방식이에 의해 유도된 지방 축적을 억제하고, 이미 축적된 지방의 분해하여 항비만 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 당뇨병, 비만성 당뇨병 및 당뇨 합병증에 대하여 우수한 예방 및/또는 치료 효과를 나타낸다는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 항비만 및/또는 항당뇨 활성을 갖는 펩타이드에 관한 것이다.
상기 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 및/또는 C-말단 변형이 유도된 것일 수 있다. 이러한 N-말단 및/또는 C-말단 변형을 통해 본 발명의 펩타이드의 안정성을 현저하게 향상시킬 수 있으며, 예를 들어, 펩타이드의 생체 내 투여 시 반감기를 증가시킬 수 있다.
상기 N-말단 변형은 펩타이드의 N-말단에 아세틸기(acetyl group), 플루오레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택된 보호기가 결합한 것일 수 있다. 상기 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.
상기 C-말단 변형은 펩타이드의 C-말단에 히드록시기(hydroxyl group, -OH), 아미노기(amino group, -NH2), 아자이드(azide, -NHNH2) 등이 결합한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 고지방식이에 의해 유도된 유도하였을 때 지방 축적을 억제하고, 이미 축적된 지방의 분해하는 효과를 나타낸다.
또한, 상기 펩타이드는 지질생성 표지인자인 PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), ACC(Acetyl-CoA carboxylase) 및/또는 aP2(adipose-specific fatty acid-binding protein 2)의 발현의 감소시킨다.
또한, 상기 펩타이드는 지방분해 인자인 pHSL(phospho-hormone-sensitive lipase), AMPK-α1(AMP-activated protein kinase α1), CGI-58(Comparative Gene Identification-58) 및/또는 ATGL(Adipose triglyceride lipase)의 발현을 증가시킨다. 지방세포의 크기 및 를 감소시킨다.
또한, 상기 펩타이드는 지방 분해를 증가, 지질 생성을 억제, 혈당을 감소, 지방세포의 크기 감소, 혈중 콜레스테롤 수치 감소시키는 효과가 있다.
이러한 결과는 본 발명의 펩타이드가 비만, 당뇨병 및 비만성 당뇨병 치료에 매우 우수한 효능을 가진다는 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는, 각각 서열번호 3 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 Ser가 Cys로 치환된 것으로, 펩타이드로서 이들의 항비만 및/또는 항당뇨 활성은 거의 동일하다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 2종 이상 포함하는 항비만 및/또는 항당뇨 활성을 갖는 펩타이드 복합체에 관한 것이다.
상기 펩타이드 복합체는 서열번호 2 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 1종 이상 포함하며, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 펩타이드 복합체는 하기와 같은 펩타이드의 조합인 것일 수 있다:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
(b) 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및
(c) 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
또한, 상기 펩타이드 복합체는 하기와 같은 펩타이드의 조합인 것일 수 있다:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드;
(b) 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및
(c)서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
본 발명의 펩타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 뿐만 아니라, 이들의 복합체도 우수한 항비만 및 항당뇨 활성을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 펩타이드는 지방생성을 억제하고, 지질을 분해하는 기능이 탁월하여 비만의 예방 및/또는 치료에 이용될 수 있다.
상기 비만 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 펩타이드는 당뇨병 동물 모델에서 증가된 혈당을 효과적으로 감소시키는 효능을 나타내어 당뇨병 예방 및/또는 치료에 이용될 수 있다.
상기 당뇨병 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 비만 또는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 약제학적으로 허용되는 담체;를 포함하는 것일 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥 내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약제학적 조성물의 투여량은 1일당 0.0001 내지 1000 ug(마이크로그램, 0.001 내지 1000 ug, 0.01 내지 1000 ug, 0.1 내지 1000 ug, 또는 1.0 내지 1000 ug일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 및/또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서의 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.
본 명세서의 용어 "안정성"은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다.
본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명은 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 펩타이드 및 이를 포함하는 비만 또는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 펩타이드는 당뇨병 및 비만성 당뇨병에 탁월한 효능을 보인다. 고지방식이로 인해 유발되는 지방 축적 또는 간이나 근육 등의 지방 축적으로 인해 나타나는 인슐린의 시그널 억제 및 이로 인해 유발되는 인슐린의 내성이 당뇨병의 원인이 되는데, 본 발명의 펩타이드는 이런 당뇨병 및 비만성 당뇨병 예방 또는 치료 용도로 쓰일 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 처리하였을 때 축적된 지방을 Oil red O 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 처리하였을 때 축적된 지방을 Oil red O 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 축적된 지방을 확인하기 위해 Oil red O 염색을 통해 확인한 결과 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 축적된 지방을 확인하기 위해 Oil red O 염색을 통해 확인한 결과 사진이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 처리하였을 때 지방생성에 관여하는 유전자인 aP2의 발현양을 측정한 결과이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 처리하였을 때 지방생성에 관여하는 유전자인 aP2의 발현양을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 지질 합성 시 중요한 유전자인 PPARγ, ACC, aP2 유전자의 발현양을 측정한 결과이다.
도 5a는 본 발명의 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 지질 합성 시 중요한 단백질인 PPARγ 및 지질 분해 시 중요한 단백질인 phospho-HSL 단백질의 발현양을 측정한 결과이다.
도 5b는 본 발명의 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 지질 합성 시 중요한 단백질인 PPARγ 단백질의 발현양을 측정한 결과 그래프이다.
도 5c는 본 발명의 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 지질 분해 시 중요한 단백질인 phospho-HSL 단백질의 발현양을 측정한 결과 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 처리하였을 때 축적된 지방을 분해하는 과정에 관여하는 유전자인 AMPK-α1과 CGI58의 발현양을 측정한 결과이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 처리하였을 때 축적된 지방을 분해하는 과정에 관여하는 유전자인 AMPK-α1과 CGI58의 발현양을 측정한 결과이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 복합체를 처리하였을 때 축적된 지방을 분해하는 과정에 관여하는 유전자인 AMPK-α1과 CGI58의 발현양을 측정한 결과이다.
도 7a는 본 발명의 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 축적된 지방을 분해하는 과정에 관여하는 단백질인 ATGL의 발현양을 측정한 결과 사진이다.
도 7b는 본 발명의 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 축적된 지방을 분해하는 과정에 관여하는 단백질인 ATGL의 발현양을 측정한 결과 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 처리하였을 때 축적된 지방을 분해하는 과정에 관여하는 단백질인 Phospho-HSL의 발현양을 면역염색을 이용하여 측정한 결과이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 처리하였을 때 축적된 지방을 분해하는 과정에 관여하는 단백질인 Phospho-HSL의 발현양을 면역염색을 이용하여 측정한 결과이다.
도 8c는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 복합체를 처리하였을 때 축적된 지방을 분해하는 과정에 관여하는 단백질인 Phospho-HSL의 발현양을 면역염색을 이용하여 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 글라이세롤의 생성양을 측정한 결과이다.
도 10a는 본 발명의 펩타이드 복합체를 비만생쥐 실험모델에 농도별로 처리한 후 분해되는 지방 조직을 측정한 결과이다.
도 10b는 본 발명의 펩타이드 복합체를 비만생쥐 실험모델에 처리한 후 분해되는 지방 조직의 크기 및 수치를 측정한 결과이다.
도 11은 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리하였을 때 축적된 지방을 분해하는 과정에 관여하는 단백질인 Phospho-HSL의 발현양을 면역염색을 이용하여 측정한 결과이다.
도 12는 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리하였을 때 비만생쥐에서 몸무게 변화(a) 및 사료 섭취 변화(b)를 측정한 결과이다.
도 13은 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리하였을 때 비만생쥐의 모습을 측정한 결과이다.
도 14는 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 마이크로시티 촬영을 통해 지방의 분포를 측정한 결과이다.
도 15는 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 지방세포조직을 채취하여 관찰한 결과이다.
도 16a는 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 지방세포조직을 채취하여 지방세포 모양을 관찰한 결과이다.
도 16b는 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 지방세포조직을 채취하여 지방세포 크기를 관찰한 결과이다.
도 16c는 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 지방세포조직을 채취하여 지방세포 크기를 관찰한 결과 그래프이다.
도 17은 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 지방세포조직을 채취하여 지방세포 내의 지방 분해에 작용하는 단백질인 phospho-HSL의 발현양을 관찰한 결과이다
도 18은 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 혈액을 채취하여 콜레스테롤의 양을 측정한 결과이다.
도 19는 실험동물모델인 C57BL/6 생쥐모델에 기름진 사료를 섭취시켜 비만생쥐모델을 제작하여 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 혈액을 채취하여 혈당을 측정한 결과이다.
도 20은 당뇨가 유발된 db/db 생쥐 모델에 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 혈액을 채취하여 혈당의 변화를 측정한 결과이다.
도 21은 당뇨가 유발된 db/db 생쥐 모델에 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 혈액을 채취하여 콜레스테롤의 변화를 측정한 결과이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따라 당뇨가 유발된 db/db 생쥐 모델에 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 처리한 후 혈액을 채취하여 혈당의 변화를 측정한 결과이다.
도 23는 본 발명의 일 실시예에 따라 당뇨가 유발된 db/db 생쥐 모델에 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 처리한 후 혈액을 채취하여 혈당의 변화를 측정한 결과이다.
도 24a 내지 도 24d는 본 발명의 일 실시예에 따라 혈당이 높은 당뇨병 환자에 본 발명의 펩타이드 복합체를 처리한 후 혈액을 채취하여 혈당의 변화를 측정한 결과이다.
서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
합성예 1: 펩타이드 합성
클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Asn(Trt)-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dichloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Asn-CTL 레진(Resin)을 제조하였다. 새로운 반응기에 10ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Arg-Asn-CTL 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, 및 Fmoc-Leu-OH 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를 넣어 한시간 동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P2O5 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한 뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5%, 티오아니졸(Thioanisole) 5%, 페놀(Phenol) 5%, EDT 2.5% 및 TIS 1%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 NH2-Leu-Lys-Thr-Arg-Asn-COOH의 펩타이드(서열번호 1)을 0.85 g 합성(수율: 92%)하였다. NH2-Lys-Gly-Ala-Cys(Ser)-Thr-Gly-Trp-Met-Ala-COOH(서열번호 2)를 0.78 g 합성하였으며(수율: 82%), NH2-Ala-Cys(Ser)Thr-Leu-Pro-His-Pro-Trp-Phe-Cys(Ser)-COOH(서열번호 3)를 0.92 g 합성하였다(수율: 85%). NH2-Cys(Ser)-Asp-Leu-Arg-Arg-Leu-Glu-Met-Tyr-Cys(Ser)-COOH(서열번호 4)를 0.76 g 합성하였다(수율: 88%) 분자량 측정기를 이용하여 측정 시 서열번호 1의 펩타이드의 분자량 630.7 (이론값: 630.7), 서열번호 2의 펩타이드의 분자량 924.5(이론값: 924.1), 서열번호 3의 펩타이드의 분자량 1236 (이론값: 1236.5), 서열번호 4의 펩타이드의 분자량 1301.5(이론값: 1301.5)를 얻을 수 있었다.
서열번호 아미노산 서열 분석값(질량분석기)
분석치 이론치
1 LKTRN 630.7 630.7
2 KGACTGWMA 924.5 924.1(908.0)
3 KGASTGWMA
4 ACYLPHPWFC 1236 1236.5 (1269.4)
5 ASYLPHPWFS
6 CDLRRLEMYC 1301.5 1301.5
7 SDLRRLEMYS
한편, 각각 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 동량 섞어 펩타이드 복합체를 만들고 이에 대한 효능을 평가하였다.
실시예 1: 지질생성 억제 활성 평가
1-1. 지방전구세포를 이용한 지질 축적 억제(Oil red O staining)
지방전구세포(pre-adipocyte)인 3T3-L1 세포를 Confluent 상태까지 배양한 후 10 ug/ml 인슐린, 0.1 uM 덱사메타손 및 0.5 uM IBMX가 포함된 분화배지로 교환 및 펩타이드를 농도별로 처리하여 2일간 배양하였으며, 그 후 매 2일 마다 10 ug/ml 인슐린이 포함된 배지로 교환하였으며, 10일간 분화를 유도한 후 세포 내 방울(droplet) 생성을 확인하기 위하여 Oil Red O 염색을 실시하였다.
준비된 3T3-L1 지방전구세포를 PBS로 세척한 후 3.7% 포르말린으로 1시간 동안 고정하고 60% 이소프로파놀을 이용하여 세척한 다음 Oil Red O 용액을 처리하여 실온에서 20분간 염색하였다. 염색 후 Oil Red O 용액을 제거하고 증류수로 3회 세척한 다음 염색된 세포를 위상차 현미경을 이용하여 관찰하여, 그 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다. 또한, 정량적 분석을 위하여 100% 이소프로파놀을 이용하여 지방을 추출한 후 96웰 플레이트에 200 ul씩 옮겨서 ELISA 리더로 500nm에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 1a 및 도 1b에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 처리하였을 때 세포 내 지방 축적 정도가 감소하는 것을 Oil Red O 염색을 통해 확인할 수 있었다.
또한, 도 2에서 확인할 수 있듯이, 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 세포 내 지방 축적 정도가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
1-2. 지질생성에 관여하는 유전자들의 발현억제
3 X 105 세포/웰의 세포 밀도로 6웰 플레이트에 3T3-L1(지방 전구세포)를 시딩하였다. 24시간 배양한 후 펩타이드를 농도 별(0.1, 1, 10 ug/ml)로 처리하고 14일간 37℃ 배양기에서 배양하였다. 배양 완료된 세포를 회수한 후 RNA 추출 용액(Easy Blue, Intron)을 처리하여 RNA를 준비한 후 RT 프리믹스(Intron)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 각 표지 인자(PPARγ, ACC, aP2)에 대한 프라이머와 PCR 프리믹스(Intron)를 사용하여 PCR 진행하였다. 그 다음 1% 아가로오스 겔에 PCR 산물을 5 ul씩 로딩하여 전기영동한 후 Gel-Doc에서 밴드를 확인하고, 그 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.
지질생성 표지인자 PCR에 이용된 타겟-특이적 프라이머 서열은 다음과 같다:
서열번호 프라이머 서열(5'-3') 어닐링 온도()
8 PPARγ_F TTTTCAAGGGTGCCAGTTTC 60
9 PPARγ_R AATCCTTGGCCCTCTGAGAT 60
10 ACC_F ACCTTACTGCCATCCCATGTGCTA 60
11 ACC_R GTGCCTGATGATCGCACGAACAAA 60
12 aP2_F CATCAGCGTAAATGGGGATT 60
13 aP2_R ACACATTCCACCACCAGCTT 60
도 3a 및 도 3b에서 확인할 수 있듯이, 마우스 골모세포주 3T3-L1에 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 처리하고 3일간 배양한 결과, 지질생성 표지 인자인 aP2의 발현이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.
또한, 도 4에서 확인할 수 있듯이, 마우스 골모세포주 3T3-L1에 펩타이드 복합체를 0.1 ug/ml, 1 ug/ml, 10 ug/ml의 농도로 처리하고 3일간 배양한 결과, 지질생성 표지 인자인 PPARγ, ACC, aP2의 발현이 양성 대조군 TNFα 100 ng/ml 처리군과 펩타이드 복합체 처리군에서 모두 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.
1-3. 지방전구세포를 이용한 지질생성 및 분해 유도 단백질 발현 관찰
3 X 105 세포/웰의 세포 밀도로 6웰 플레이트에 3T3-L1(지방 전구세포)를 시딩하였다. 24시간 배양한 후 펩타이드 복합체를 농도별(0.1, 1, 10 ug/ml)로 처리하고 14일간 37℃ 배양기에서 배양하였다. 세포 용해 버퍼를 처리하여 용해물을 확보 후 단백질 정량하고 지방생성 인자인 항-PPARγ 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)와 지방분해 인자인 항-pHSL 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
도 5에서 확인할 수 있듯이, 지방 생성 표지 인자인 PPARγ 단백질의 발현이 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 농도 의존적으로 모두 감소되는 것을 관찰할 수 있었으며, 지방 분해 표지 인자인 pHSL 단백질의 발현양을 관찰하였을 때 펩타이드 복합체 처리군에서 모두 증가되는 것을 관찰할 수 있었다.
실시예 2: 지질분해 활성 평가
2-1. 지질분해에 관여하는 유전자들의 발현증가
3 X 105 세포/웰의 세포 밀도로 6웰 플레이트에 3T3-L1(지방 전구세포)을 시딩하였다. 24시간 배양한 후 펩타이드를 농도별(0.1, 1, 10 ug/ml)로 처리하고 14일간 37℃ 배양기에서 배양하였다(양성 대조군: 100 ng/ml TNFα(SIGMA)). 배양 완료된 세포를 회수한 후 RNA 추출 용액(Easy Blue, Intron)을 처리하여 RNA를 준비한 후 RT 프리믹스(Intron)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 각 표지 인자(AMPK-α1, CGI58)에 대한 프라이머와 PCR 프리믹스(Intron)를 사용하여 PCR 진행하였다. 그 다음, 1% 아가로오스 겔에 PCR 산물을 5 ul씩 로딩하여 전기영동한 후 Gel-Doc에서 밴드를 확인하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
지질생성 표지인자 PCR에 이용된 타겟-특이적 프라이머 서열은 다음과 같다:
서열번호 프라이머 서열(5'-3') 어닐링 온도()
14 AMPK-1_F TGACCGGACATAAAGTGGCTGTGA 60
15 AMPK-1_R TGATGATGTGAGGGTGCCTGAACA 60
16 CGI58_F TGTGCAGGACTCTTACTTGGCAGT 60
17 CGI58_R GTTTCTTTGGGCAGACCGGTTTCT 60
도 6a 및 도 6b에서 확인할 수 있듯이, 지방전구세포(3T3-L1)에 펩타이드를 처리하고 배양한 결과, 지질분해 표지 인자인 AMPK-α1과 CGI-58의 발현이 각 펩타이드 처리군에서 모두 증가되는 것을 관찰할 수 있었다.
또한, 도 6c에서 확인할 수 있듯이, 펩타이드 복합체를 처리한 경우, AMPK-α1 과 CGI-58의 발현이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었고 양성 대조군인 TNFα 100 ng/ml 처리군과 비교하였을 때에도 지방 분해 인자들의 발현증가가 높게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다.
2-2. 지방전구세포를 이용한 지질분해 유도 단백질 발현 관찰
3 X 105 세포/웰의 세포 밀도로 6웰 플레이트에 3T3-L1(지방 전구세포)를 시딩하였다. 24시간 배양한 후 펩타이드 복합체를 농도별(0.1, 1, 10 ug/ml)로 처리하고 14일간 37℃ 배양기에서 배양하였다(양성 대조군: 100 ng/ml TNFα(SIGMA)). 세포 용해 버퍼를 처리하여 용해물을 확보 후 단백질 정량하고 지방분해 인자인 항-ATGL 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
도 7에서 확인할 수 있듯이, 지방 분해 인자인 ATGL의 발현이 펩타이드 복합체에 의해 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
2-3. 지방전구세포를 이용한 지질분해 유도 단백질 발현 형광 현미경 관찰
3X105 세포/웰의 세포 밀도로 6웰 플레이트에 3T3-L1(지방 전구세포)를 시딩하였다. 24시간 배양한 후 각 펩타이드 또는 펩타이드 복합체(1 ug/ml)를 처리하고 14일간 37℃ 배양기에서 배양하였다(양성 대조군: 100 ng/ml TNFα(SIGMA)). 배양이 완료된 세포를 70% 에탄올을 이용하여 세포를 고정한 후 항-phospho-HSL 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하여 세포 면역 염색법을 통해 지방 분해 유도 인자인 phospho-HSL의 세포내 발현을 관찰하였다.
도 8a 내지 도 8c에서 확인할 수 있듯이, 각 펩타이드(도 8a 및 도 8b) 및 펩타이드 복합체(도 8c)에 의해 지방 분해유도 인자인 phospho-HSL의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
2-4. 지방분해 산물인 글라이세롤의 양 측정
비만유도 생쥐 동물의 복부에서 지방 조직을 채취 후 24웰 배양 플레이트에 웰당 100mg씩 지방 조직을 넣은 후 배양 배지(1 ml Krebs-Ringer buffer containing 25 mM HEPES, 5.5 mM glucose, and 2% (w/v) bovine serum albumin)에 배양하였다. 배양 시 펩타이드 복합체를 0.1 ug/ml, 1 ug/ml, 10 ug/ml의 농도로 처리하였고, 양성대조군으로 TNFα 100 ng/ml을 처리하여, 48시간 동안 배양한 후 지방이 분해되면서 나온 글라이세롤의 양을 측정하였다.
도 9에서 확인할 수 있듯이, 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 지방이 분해되면서 나온 글라이세롤의 양이 펩타이드 복합체 처리농도 의존적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 양성 대조군인 TNFα 처리군에 비해 많은 양의 글라이세롤양이 검출되는 것을 확인하였다.
2-5. 비만 마우스 분리 지방조직에 대한 분해효과 확인
지방 조직은 색깔에 따라 백색지방(White Fat), 갈색지방(Brown Fat)으로 나뉘고, 부위에 따라 피하 지방, 복막 지방, 장간막 지방(내장지방) 및 부고환 지방으로 나뉜다. 해부 후 각 지방을 적출하여 백색지방을 분리 후 각 100 mg/웰의 무게로 24웰 플레이트에 복합제 농도별 처리 후 배양 배지(1 ml Krebs-Ringer buffer containing 25 mM HEPES, 5.5 mM glucose, and 2 % (w/v) bovine serum albumin)에서 72시간 배양 후 조직을 절편하여 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고 200배에서 현미경(TS100, Nicon) 관찰을 하여 지방 세포의 크기를 비교하였다.
도 10a에서 확인할 수 있듯이, 펩타이드 복합체를 농도별로 처리하였을 때 대조군에 비해 지방 세포의 크기를 비교한 결과, 지방세포의 크기가 작아지는 것을 확인하였다.
또한, 도 10b에서 확인할 수 있듯이, 염색 후 지방세포의 크기를 측정하기 위해 프로그램을 사용하여 지방 세포의 크기를 측정한 결과 펩타이드 복합체 처리군에서 뚜렷한 세포막 구획을 가지는 지방조직 내의 세포크기의 감소가 관찰되었다.
2-6. 지방조직에 대한 지방분해 인자 관찰
비만유도 생쥐 동물의 복부에서 지방 조직을 채취 후 24웰 배양 플레이트에 웰당 100mg씩 지방 조직을 넣은 후 배양 배지(1ml Krebs-Ringer buffer containing 25 mM HEPES, 5.5 mM glucose, and 2% (w/v) bovine serum albumin)에 배양하였다. 배양 시 펩타이드 복합체를 처리하였고, 양성대조군으로 TNFα 100 ng/ml을 처리하여, 48시간 동안 배양한 후 지방분해인자인 phospho-HSL(녹색형광물질)의 발현을 확인하였다.
도 11에서 확인할 수 있듯이, 지방조직에서의 지방 분해 인자인 phospho-HSL의 발현을 확인한 결과, 펩타이드 복합체를 처리하였을 때 지방 분해 인자인 phospho-HSL의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 실험동물을 통한 지방 생성억제 및 지방 분해 촉진 효과
정상 C57BL/6 마우스에 고지방식이를 하여 유도한 비만유도모델 DIO(Diets induced obesity)를 이용하여 항비만 효능 실험을 수행하였고, 양성 대조군 약물로서 TNFα 5 ug/ml를 사용하였다. 대조군은 고지방식이가 아닌 일반식이로 진행하였고, 실험은 고지방식이를 12주 동안 진행하면서, 펩타이드 복합체를 처리하고 양성대조군을 처리하여 체중의 감소를 확인하였다.
TNFα 및 항비만 효능 화합물은 12주간 매주 오후 3시-4시에 84일간 강제로 복강주사하였고 체중과 식이량은 처음 약물 투여 직전에 측정하였으며, 이후에 일주일 간격으로 체중과 식이량을 측정하였다.
혈당은 약물투약 실험 종료 후 꼬리 정맥에서 채혈 후 아큐첵 액티브(Accu-Check Active)(Roche)를 이용하여 측정하였고 Cholesterol 또한 꼬리 정맥에서 채혈된 혈청을 Cholesterol calculation Kit(BioVision)을 이용하여 분석을 수행하였다.
지방 조직은 색깔에 따라 백색지방(White Fat), 갈색지방(Brown Fat)으로 나뉘고, 부위에 따라 피하 지방, 복막 지방, 장간막 지방(내장지방) 및 부고환 지방으로 나뉜다. 해부 후 각 지방을 적출하여 관찰하였으며, 조직학적 검사를 위하여 지방을 10% 중성 완충 포르말린에 고정한 후 파라핀 블록에 심어서 5 um으로 섹션하여 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(eosin) 염색을 하였다.
지질분해 인자인 HSL 의 인산화 정도를 Anti-pHSL 항체를 이용한 형광 염색을 진행하였다. 조직 샘플 제작 후 글리세린 젤 마운팅 미디어(glycerine Jell mounting Media)로 마운팅하였고 커버 글라스를 덮어 현미경(Nicon, TS100)으로 관찰하였으며 현미경에 내장되어 있는 디지털 카메라로 조직을 촬영하였다.
일반식이를 12주 동안 한 생쥐의 체중은 실험 초기 20.9g에서 12주 후 28.74g의 체중을 보였고, 고지방식이를 한 생쥐는 초기 20.99g의 체중이 12주 후 49.5g까지 체중의 증가가 있는 것을 확인하였다. 그러나 고지방식이와 병행하면서 처리한 펩타이드 복합체 군에서는 초기 21.1g에서 12주 후 36.76g으로 고지방식이만 진행된 대조군(235.8%)에 비해 높은 체중 감소(174.2%)가 일어나는 것을 확인할 수 있었다(표 4, 표 5 및 도 12). 표 4 및 표 5는 비만생쥐모델에 펩타이드 복합체를 처리한 후 몸무게 측정 결과를 그람(g)과 퍼센트(%)로 나타낸 것이다.
week General diet(control) High fat diet(control) H.F+P/C H.F+P.Complex
0 20.09 20.99 22.41 21.10
1 20.75 22.32 23.00 21.26
2 21.99 25.25 26.12 23.72
3 18.23 27.35 27.45 24.36
4 23.26 30.20 30.51 25.29
5 23.16 32.76 32.76 28.65
6 23.28 36.78 33.49 28.79
7 24.71 38.31 35.14 30.37
8 25.84 40.12 37.15 31.53
9 25.59 42.14 38.97 32.59
10 28.13 43.02 40.39 33.78
11 27.90 45.70 41.35 35.33
12 28.74 49.50 43.91 36.76
week General diet(control) High fat diet(control) H.F+P/C H.F+P.Complex
0 100 100 100 100
1 103.3 106.3 102.6 100.8
2 109.5 120.3 116.6 112.4
3 90.7 130.3 122.5 115.5
4 115.8 143.9 136.1 119.9
5 115.3 156.1 146.2 135.8
6 115.9 175.2 149.4 136.4
7 123.0 182.5 156.8 143.9
8 128.6 191.1 165.8 149.4
9 127.4 200.8 173.9 154.5
10 140.0 205.0 180.2 160.1
11 138.9 217.7 184.5 167.4
12 143.1 235.8 195.9 174.2
도 13에서 확인할 수 있듯이, 12주 동안 실험이 완료된 동물의 사진을 측정한 결과, 펩타이드 복합체 처리군이 고지방식이만을 한 군에 비해 생쥐의 몸이 정상 생쥐(일반식)와 유사한 몸의 크기로 유지되는 것을 관찰할 수 있었다.
Total Volume(mm^3) Total Fat(mm^3) Visceral Fat(mm^3) Subcutaneous Fat(mm^3)
Control (general diet) 4958.25 702.72 380.09 322.63
HFD(2weeks) 6530.09 2084.98 1411.14 673.84
HFD(10weeks) 12464.91 8014.03 5821.27 2192.76
HDF(10weeks)+complex(8weeks) 6012.12 1391.75 871.15 520.60
HDF(10weeks)+ P.C(8weeks) 8240.67 4165.80 2833.72 1332.08
도 14 및 표 6에서 확인할 수 있듯이, 12주 동안 실험을 진행한 생쥐에 마이크로-CT 촬영을 하여 몸 전체에 분포되어 있는 지방(노란색을 띄고 있음)을 확인한 결과, 일반식이를 진행한 대조군에 비해 고지방식이를 한 대조군의 생쥐에서 몸 전체에 분포된 지방의 양이 급격히 증가되어 있음을 확인할 수 있었으며, 펩타이드 복합체를 고지방식이와 함께 처리한 군에서는 몸전체에 분포되어 있는 지방의 양이 급격히 감소되어 있음을 확인할 수 있었다.
도 15에서 확인할 수 있듯이, 위의 마이크로-CT 촬영이 끝낸 생쥐를 해부하여 몸 전체에 분포되어 있는 지방조직을 채취하여 지방조직의 양을 관찰한 결과, 일반식이를 진행한 대조군에 비해 고지방식이를 한 대조군의 생쥐에서 지방의 양이 많은 것을 확인할 수 있었고, 고지방식이와 함께 펩타이드 복합체를 처리한 군에서 지방의 양이 급격히 감소되어 있는 것을 확인하였다.
도 16a에서 확인할 수 있듯이, 지방을 분리하여 H&E 염색을 통해 지방의 크기를 관찰한 결과, 고지방식이 대조군에 비해 고지방식이와 함께 펩타이드 복합체 처리군에서 지방의 크기가 작아지는 것을 확인할 수 있었다.
도 16b 및 도 16c에서 확인할 수 있듯이, 지방의 크기를 프로그램을 통해 분석한 결과, 일반식의 대조군 지방의 크기를 100%로 계산하였을 때, 고지방식이의 대조군의 지방의 크기는 127%로 지방의 크기가 커져 있는 것을 확인하였으며, 고지방식이에 펩타이드 복합체를 같이 처리한 군의 지방의 크기는 97%로 감소한 것을 확인하였다.
도 17에서 확인할 수 있듯이, 지방을 분리하여 지방 조직 내에 발현되어 있는 지방 분해 인자인 Phospho-HSL 의 발현양을 확인한 결과, 고지방식이와 함께 펩타이드 복합체를 처리한 군에서 phospho-HSL의 발현이 증가되어 있는 것을 확인하였다.
도 18에서 확인할 수 있듯이, 실험이 끝난 생쥐의 혈액 속의 콜레스테롤의 양을 확인한 결과, 일반식의 콜레스테롤 양은 2.52 ug/ml, 고지방식이의 대조군의 콜레스테롤의 양은 3.5 ug/ml, 고지방식이와 함께 펩타이드 복합체 처리한 군에서는 2.86 ug/ml의 콜레스테롤의 양이 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 펩타이드 복합체 처리군에서 비만 시 올라가는 콜레스테롤의 수치를 낮춰 주는 것을 확인할 수 있었다.
도 19에서 확인할 수 있듯이, 실험이 끝난 생쥐의 혈액속의 혈당의 수치를 확인한 결과, 일반식을 진행한 대조군의 생쥐의 혈당은 174mg/dL, 고지방식이의 대조군의 혈당은 235mg/dL로 혈당 수치가 올라가는 것을 확인할 수 있었으며, 고지방식이와 함께 펩타이드 복합체를 처리한 군에서의 혈당의 수치는 183mg/dL 로 일반식 대조군과 유사한 혈당의 수치가 감소되어 있는 것을 확인하였다.
실시예 4: 혈당 조절
본 동물실험에는 C57BL/6(정상 쥐)(㈜샘타코)와 C57BLKS/JLepr(당뇨모델 마우스, db/db 마우스)(㈜중앙실험동물에서 구입) 수컷을 사용하였고, 항당뇨 및/또는 항비만 효능 물질로는 복합제를 사용하였고 양성대조군 약물로는 시타클립틴(sitagliptin)을 사용하였다.
본 실시예에서는 정상 마우스 모델과 유전적으로 당뇨의 가능성이 있는 모델에 대한 급성 항당뇨 효능(단회 투여)을 대표적인 당뇨병 진단 검사 방법인 GTT(Glucose Tolerance Test) 방법을 사용하여 항당뇨 및/또는 항비만 효능 복합제에 대해 평가하였다.
마우스의 사육 환경 조건은 22 내지 24℃, 상대습도 50 내지 30%로 설정하였고, 사육상자당 4마리씩 사육하였다. 오전 8시부터 오후 8시까지 150 내지 300 룩스(Lux)의 조명을 주었고, 하루에 12시간 점등, 12시간 소등하였다. 사료는 일반식이(18% 단백질, 2018, Harlan Laboratories Inc, USA 제조)를 사용하여 자유 섭취시켰고, ITT 실험 진행 전 4시간 이상 절식시켰고, GTT 실험 진행 12시간 전부터 절식시켰다. GTT 실험 1시간 전에 복합제를 각각 경구투여용 일회용 주사기를 이용하여 강제 경구투여하였고, GTT 실험을 위하여 실험 0시간째에 고지방식이를 40분간 자유식이 하였다. 고지방 자유식이 40분 후에 각각 혈액 내 글루코스 레벨 검사를 위하여 0분, 30분, 60분, 90분, 120분 및 180분 간격으로 꼬리 정맥에서 채혈하였고 아큐첵 액티브(Accu-Chek active)(Roche)를 이용하여 혈당 수준을 측정하였다. 한편, 양성대조군 약물로는 현재 당뇨 치료제로 사용되고 있는 시타클립틴(sitagliptin)으로 선정하였으며, 100mg/kg의 투여량으로 투여하였다. 항당뇨 및/또는 항비만 효능 후보물질로 선정한 복합제를 100mg/kg의 투여량 별로 실험군을 나누었고, 각 실험군당 4수의 마우스를 사용하였다.
도 20에서 확인할 수 있듯이, 고지방식이에 의해 증가된 혈당의 수치가 펩타이드 복합체 처리에 의해 혈당감소 효과를 관찰하였다. 당뇨병 유발 생쥐모델에서 당뇨병의 높은 혈당이 감소되는 것을 확인하였다.
또한, 도 21에서 확인할 수 있듯이, 콜레스테롤의 양이 고지방식이의 대조군에 비해 고지방식이와 함께 펩타이드 복합체 처리군에서 콜레스테롤의 양이 낮아지는 것을 확인하였다.
또한, DB/DB 당뇨병이 유도된 생쥐에 16시간 공복을 준 후 30분간 식이를 준 후, 펩타이드를 섭취하도록 하고 시간별로 혈당의 수치를 측정하여, 도 22, 도 23, 표 7 및 표 8에 타내었다.
Normal high fat diabetes
PBS SEQ ID NO: 2
공복 105 78 181
30분 184 227 219
60분 181 250 231
120분 147 301 174
240분 151 247 158
300분 135 200 152
Normal high fat diabetes
PBS SEQ ID NO: 4
공복 115 218 222
30분 159 251 249
60분 125 255 229
120분 121 366 215
240분 112 312 180
300분 119 253 165
도 22, 도 23, 표 7 및 표 8에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 처리한 군에서 고혈당의 수치가 시간 의존적으로 낮아지는 것을 관찰하였다.
실시예 5: 임상 실험을 통한 혈당 감소 효과 관찰
공복혈당 170mg/dL 이상 45 내지 65세 대상으로 간이 임상 실험 진행 공복 혈당 기준으로 식후 30분 복합제제 섭취하여 30, 60, 90, 120, 150, 180분 간격으로 채혈하였고 아큐첵 액티브(Accu-Chek active)(Roche)를 이용하여 혈당 수준을 측정하여, 도 24a 내지 도 24d에 나타내었다.
도 24a 내지 도 24d에서 확인할 수 있듯이, 실험결과 복합제제에 의한 혈당 감소가 각각의 실험자에서 모두 관찰되었다.
본 발명은 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

Claims (15)

  1. 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 항비만 또는 항당뇨 활성을 갖는 것인, 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 N-말단에 아세틸기(acetyl group), 플루오?레닐메톡시카르보닐기(fluoreonylmethoxycarbonyl group), 포르밀기(formyl group), 팔미토일기(palmitoyl group), 미리스틸기(myristyl group), 스테아릴기(stearyl group) 및 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)로 이루어진 군으로부터 선택된 보호기가 결합된 것인, 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 C-말단에 히드록시기(hydroxyl group, -OH), 아미노기(amino group, -NH2) 또는 아자이드(azide, -NHNH2)가 결합된 것인, 펩타이드.
  5. 제2항에 있어서, 상기 펩타이드는 PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma), ACC(Acetyl-CoA carboxylase) 및 aP2(adipose-specific fatty acid-binding protein 2)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 지질생성 표지인자의 발현을 감소시키는 것인, 펩타이드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 pHSL(phospho-hormone-sensitive lipase), AMPK-α1(AMP-activated protein kinase α1), CGI-58(Comparative Gene Identification-58) 및 ATGL(Adipose triglyceride lipase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 지방분해 인자의 발현을 증가시키는 것인, 펩타이드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 지방 분해를 증가시키는 것인, 펩타이드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 지질 생성을 억제시키는 것인, 펩타이드.
  9. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 혈당을 감소시키는 것인, 펩타이드.
  10. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 지방세포의 크기를 감소시키는 것인, 펩타이드.
  11. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 혈중 콜레스테롤을 감소시키는 것인, 펩타이드.
  12. 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 추가로 포함하는 것인, 비만 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  14. 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 추가로 포함하는 것인, 당뇨병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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