WO2018051863A1 - 測定方法 - Google Patents

Abstract

プリズム、金属膜および捕捉体を有する測定チップを準備する。金属膜上に検体が存在する状態で、プリズム側から臨界角未満の第１の入射角で金属膜に第１の光を照射したときに、金属膜および検体を透過した第１の光が、検体中で散乱されることで得られる散乱光を検出する。金属膜上に、被測定物質が捕捉体に捕捉され、かつ検体が存在しない状態で、プリズム側から臨界角以上の第２の入射角で金属膜に第２の光を照射したときに測定チップで生じる、被測定物質の量を示すシグナルを検出する。散乱光の光量から決定される検体のヘマトクリット値に基づいて、シグナルから決定される被測定物質の量を示す測定値を補正する。

Description

測定方法

　本発明は、表面プラズモン共鳴を利用して、全血を含む検体中の被測定物質の量を測定するための測定方法に関する。

　臨床検査において、血液中のタンパク質やＤＮＡなどの微量の被測定物質を高感度かつ定量的に測定することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、血液中の被測定物質を高感度かつ定量的に測定できる方法が求められている。

　血液中の被測定物質を高感度に測定できる方法として、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）法および表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。これらの方法では、所定の条件で光を金属膜に照射すると表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が生じることを利用する（例えば特許文献１、２参照）。金属膜でＳＰＲが生じるとき、金属膜に照射された光と同一波長のプラズモン散乱光が、金属膜の近傍から放出される。

　ＳＰＦＳでは、被測定物質に特異的に結合できる捕捉体（例えば１次抗体）を金属膜上に固定化して、被測定物質を特異的に捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被測定物質を含む検体（例えば血液）を提供すると、被測定物質は反応場に結合する。次いで、蛍光物質で標識された捕捉体（例えば２次抗体）を反応場に提供すると、反応場に結合した被測定物質は蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被測定物質を標識する蛍光物質は、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光を検出することで、被測定物質の存在またはその量を検出することができる。このとき、プラズモン散乱光は、光学フィルターによりカットされる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場によって蛍光物質を励起するため、高感度で被測定物質を測定することができる。

　一方、液体中の被測定物質を測定する場合、通常、測定値は、液体の単位体積当たりの被測定物質の質量や、それに相当するシグナル量などで示される。したがって、検体として血液を用いる場合、測定値は、血液中の液体成分（血漿または血清）の単位体積当たりの被測定物質の質量や、それに相当するシグナル量などで示される。血液中の液体成分の割合は個々人で異なるため、全血（血液）の測定値を一律に液体成分の測定値に変換することはできない。このため、検体として全血を用いる場合は、その全血のヘマトクリット値（血液中の血球の体積の割合）を測定し、ヘマトクリット値を用いて全血の測定値を液体成分（血漿または血清）の測定値に変換する必要がある。

　従来のヘマトクリット値の測定方法としては、血液を遠心分離するミクロヘマトクリット法や、血液の電気伝導度からヘマトクリット値を求める電気伝導法などがある。しかし、従来のヘマトクリット値の測定方法では、遠心分離機や電気伝導度の測定装置、ヘマトクリット値の測定装置などの他の装置を新たに用意しなければならず、測定装置の製造コストおよび測定コストが増大してしまう。

　一方、特許文献１，２に記載の測定方法では、臨界角以上の入射角で金属膜に励起光を照射したときに、測定チップで発生し、検体中を透過するときに検体で散乱されたプラズモン散乱光の光量に基づいて、全血のヘマトクリット値を決定しうる。このため、特許文献１，２に記載の測定方法では、ヘマトクリット値測定用の装置を新たに用意する必要がない。

国際公開第２０１５／１２９６１５号 国際公開第２０１６／０３９１４９号

　しかしながら、プラズモン散乱光の強度（光量）は弱く、かつヘマトクリット値とプラズモン散乱光の強度との相関も弱いため、特許文献１，２に記載のヘマトクリット値の測定方法には、ヘマトクリット値を、より高精度に測定する観点から改善の余地がある。

　本発明の目的は、表面プラズモン共鳴を利用した測定方法であって、ヘマトクリット値測定用の装置を新たに用意しなくてもヘマトクリット値を高精度に測定でき、全血を含む検体中の被測定物質の量を高精度に測定できる測定方法を提供することである。

　上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る測定方法は、表面プラズモン共鳴を利用して、全血を含む検体中の被測定物質の量を測定するための測定方法であって、入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定された捕捉体とを有する測定チップを準備する工程と、前記金属膜上に前記検体が存在する状態で、前記プリズム側から臨界角未満の第１の入射角で前記金属膜に第１の光を照射したときに、前記金属膜および前記検体を透過した前記第１の光が、前記検体中で散乱されることで得られる散乱光を検出する工程と、前記金属膜上において、前記被測定物質が前記捕捉体に捕捉され、かつ前記検体が存在しない状態で、前記プリズム側から臨界角以上の第２の入射角で前記金属膜に第２の光を照射したときに前記測定チップで生じる、前記被測定物質の量を示すシグナルを検出する工程と、検出された前記散乱光の光量から決定される、前記検体のヘマトクリット値に基づいて、検出された前記シグナルから決定される、前記被測定物質の量を示す測定値を補正する工程と、を含む。

　本発明によれば、表面プラズモン共鳴を利用した測定方法において、ヘマトクリット値測定用の装置を新たに追加することなく、ヘマトクリット値を高精度に測定することができる。したがって、本発明によれば、測定装置の製造コストおよび測定コストを増大させることなく、全血を含む検体中の被測定物質の量を高精度に測定することができる。

図１は、本発明の一実施の形態に係る測定方法の一例を示すフローチャートである。 図２は、本発明の一実施の形態に係る測定方法を実施するために使用されうる測定チップおよび測定装置（ＳＰＦＳ装置）の構成の一例を示す図である。 図３Ａ、Ｂは、シミュレーションの結果を示すグラフである。 図４Ａ、Ｂは、参考実験１の結果を示すグラフである。 図５Ａ、Ｂは、参考実験１の結果を示すグラフである。 図６は、散乱光の光量と、ヘマトクリット値との相関を示すグラフである。 図７は、参考実験２の結果を示すグラフである。 図８は、参考実験３の結果を示すグラフである。 図９は、変形例に係る測定方法の一例を示すフローチャートである。

　以下、本発明の一実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。本発明に係る測定方法は、表面プラズモン共鳴を利用して、全血を含む検体中の被測定物質の量を測定するための測定方法である。ここでは、本発明に係る測定方法の代表例として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）を利用した測定方法について説明する。本実施の形態に係る測定方法では、被測定物質の量を示すシグナルとして、被測定物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光を検出する。

　図１は、実施の形態１に係る測定方法の一例を示すフローチャートである。図２は、実施の形態１に係る測定方法を実施するために使用されうる測定チップ１０および測定装置（ＳＰＦＳ装置）１００の構成の一例を示す図である。測定チップ１０およびＳＰＦＳ装置１００については、別途詳細に説明する。

　本実施の形態に係る測定方法は、測定の準備をする工程（工程Ｓ１１０）と、増強角を決定する工程（工程Ｓ１１１）と、第１の光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１１２）と、第２の光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１１３）と、１次反応を行う工程（工程Ｓ１１４）と、散乱光を検出する工程（工程Ｓ１１５）と、２次反応を行う工程（工程Ｓ１１６）と、蛍光シグナルを検出する工程（工程Ｓ１１７）と、測定値を補正する工程（工程Ｓ１１８）と、を含む。

　１）測定の準備
　まず、測定の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、測定チップ１０を準備し、ＳＰＦＳ装置１００の設置位置に配置されたチップホルダー１４２に、測定チップ１０を設置する。ここで、「設置位置」とは、測定チップ１０をＳＰＦＳ装置１００に設置するための位置である。

　（測定チップ）
　ここで、ＳＰＦＳ装置１００で使用される測定チップ１０について説明する。図２に示されるように、測定チップ１０は、プリズム２０、金属膜３０および流路蓋４０を有する。本実施の形態では、測定チップ１０の流路蓋４０は、液体を収容するための液体チップ５０と一体化されている。

　プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、後述の光出射部１１０からの出射光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２上には、金属膜３０が配置されている。出射面２３は、入射面２１でプリズム２０内に入射し、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射された反射光をプリズム２０の外部に出射させる。

　プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。

　入射面２１は、光出射部１１０からの出射光αが入射面２１で反射してＳＰＦＳ装置１００の光源に戻らないように形成される。出射光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、出射光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、出射光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、出射光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。

　ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する出射光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される出射光αの反射光の光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する出射光αの入射角を走査した場合に、測定チップ１０の上方に放出される出射光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）γの光量が最大となるときの、入射角を意味する。本明細書中、金属膜３０に対する出射光αの入射角が臨界角以上のときに、測定チップ１０上に放出される光を「プラズモン散乱光γ」という。また、金属膜３０に対する出射光αの入射角が臨界角未満のときに、測定チップ１０の上方に放出される光を「散乱光γ’」という。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０度である。

　なお、測定チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の厚み、金属膜３０の消衰係数（消光係数）、出射光αの波長などである。金属膜３０上に捕捉された被測定物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。

　プリズム２０は、出射光αに対して透明な誘電体からなる。プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０を構成する樹脂の例には、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、およびシクロオレフィン系ポリマーが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１.４～１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。

　金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した出射光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：以下「ＳＰＲ」と略記する）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）を生じさせることができる。局在場光は、金属膜３０の表面から出射光αの波長程度離れた距離まで及ぶ。金属膜３０は、成膜面２２上の全面に形成されていてもよいし、成膜面２２上の一部に形成されていてもよい。本実施の形態では、金属膜３０は、成膜面２２の全面に形成されている。

　金属膜３０には、被測定物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。金属膜３０上において、捕捉体が固定化されている領域を、特に「反応場」という。捕捉体は、金属膜３０の全面に固定化されていてもよいし、表面の一部に固定化されていてもよい。捕捉体は、被測定物質に特異的に結合する。このため、被測定物質は、捕捉体を介して金属膜３０上に固定化されうる。

　捕捉体の種類は、被測定物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体は、被測定物質に特異的に結合可能な抗体（１次抗体）またはその断片、被測定物質に特異的に結合可能な酵素などである。

　金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を生じさせるとともに、出射光αの少なくとも一部が透過することができれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、およびこれらの合金が含まれる。金属膜３０の厚みは、ＳＰＲを効率的に発生させる観点、および出射光αに対する所望の透過率を得る観点から、３０～６０ｎｍであることが好ましい。出射光αに対する金属膜３０の透過率は、例えば、５０度の入射角でＰ偏光の光を金属膜３０に照射したとき、３～３０％である。

　また、金属膜３０の厚みは、上記観点から、材料に応じて適宜設定されうる。たとえば、金属膜３０の材料が金である場合、透過率を５～３０％とするために、金属膜３０の厚みは３０～５５ｎｍであることが好ましい（後述の参考実験３参照）。また、金属膜３０の材料が銀である場合、透過率を３～２０％とするために、金属膜３０の厚みは３５～６０ｎｍであることが好ましい。さらに、金属膜３０の材料が銅である場合、透過率を５～２５％とするために、金属膜３０の厚みは３０～５５ｎｍであることが好ましい。上記材料の中でも、金属膜３０の材料は、金であることが好ましい。金は、他の金属と比較して、透過率が高く、ＳＰＲを高効率に発生でき、かつ外部環境に対する安定性（例えば、耐酸化性）が高いためである。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。

　流路蓋４０は、金属膜３０上に配置されている。金属膜３０がプリズム２０の成膜面２２の一部にのみ形成されている場合、流路蓋４０は、成膜面２２上に配置されていてもよい。本実施の形態では、流路蓋４０は、金属膜３０の上に配置されている。金属膜３０上に流路蓋４０を配置することで液体を収容するための収容部が金属膜３０上に形成される。本実施の形態では、当該収容部は、液体が流れる流路４１である。流路４１は、底面と、天面と、当該底面および当該天面を接続する一対の側面とを有する。本明細書中、流路４１のプリズム２０側の面を流路の底面といい、流路４１の、流路４１の底面と対向する面を流路の天面という。また、流路４１の底面と流路４１の天面との間隔を流路４１の高さという。

　流路蓋４０の裏面には、凹部（流路溝）が形成されている。金属膜３０（およびプリズム２０）上に流路蓋４０が配置され、当該凹部の開口部が金属膜３０により閉塞されることで、流路４１が形成される。局在場光が及ぶ領域を十分に確保する観点からは、流路４１の高さ（流路溝の深さ）は、ある程度大きいことが好ましい。流路４１内に混入する不純物の量を低減する観点からは、流路４１の高さ（流路溝の深さ）は、小さいことが好ましい。このような観点から、流路４１の高さは、０．０５～０．１５ｍｍの範囲内であることが好ましい。流路４１の両端は、流路４１内と外部とを連通させるように、流路蓋４０に形成された不図示の注入口および排気口とそれぞれ接続されている。

　流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される光（蛍光β、散乱光γ’およびプラズモン散乱光γ）に対して透明な材料からなることが好ましい。流路蓋４０の材料の例には、ガラスおよび樹脂が含まれる。当該樹脂の例には、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）が含まれる。また、上記の光に対して透明であれば、流路蓋４０の他の部分は、不透明な材料で形成されていてもよい。流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。

　なお、上記の流路蓋４０の代わりに、裏面に凹部（流路溝）が形成されていない流路蓋を使用してもよい。この場合、凹部を有さない流路蓋と、金属膜３０またはプリズム２０とは、中央部に流路となる貫通孔が形成された、厚み０．０５～０．１５ｍｍの両面テープを用いて接合される。このようにして、流路４１が形成されてもよい。

　測定チップ１０は、通常、測定のたびに交換される。また、測定チップ１０は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ～数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれない、より小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。

　なお、測定の準備をする工程（工程Ｓ１１０）では、測定チップ１０の金属膜３０上に保存試薬が存在する場合には、捕捉体が適切に被測定物質を捕捉できるように、金属膜３０上を洗浄して保存試薬を除去する。

　２）増強角の決定
　次いで、増強角を決定する（工程Ｓ１１１）。具体的には、まず、流路４１内に測定液を注入する。たとえば、後述のピペット１３１を用いて、流路４１内に測定液を提供する。測定液は、出射光αに対して透明であればよく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）やＴｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ－Ｔ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）などの緩衝液である。

　次いで、流路４１内に測定液が存在する状態で、プリズム２０を介して、捕捉体が固定化されている領域に対応する金属膜３０の裏面に、金属膜３０に対する出射光αの入射角度を走査しながら出射光αを照射するとともに、測定チップ１０で生じるプラズモン散乱光γを検出する。本実施の形態では、角度調整機構１１２により、光源ユニット１１１からの出射光αの金属膜３０への入射角を走査するとともに、受光センサー１２６でプラズモン散乱光γを検出する。これにより、金属膜３０に対する出射光αの入射角と、プラズモン散乱光γの光量との関係を含むデータが得られる。得られたデータを解析して、プラズモン散乱光γの光量が最大となるときの入射角である増強角を決定する。なお、本工程では、蛍光β成分のみを透過させ、出射光α成分（散乱光γ’およびプラズモン散乱光γ）を除去する光学フィルター１２４（後述）は、その一部または全部がプラズモン散乱光γの光路外に位置するように配置されている。これにより、出射光α成分は、受光センサー１２６に入射する。

　なお、増強角は、プリズム２０の素材および形状、金属膜３０の厚み、流路４１内の液体の屈折率などにより決まるが、流路４１内の捕捉体の種類および量、プリズム２０の形状誤差、測定チップ１０のＳＰＦＳ装置１００への設置誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、測定を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０．１度程度のオーダーで決定される。

　３）第１の光学ブランク値の測定
　次いで、第１の光学ブランク値を測定する（工程Ｓ１１２）。ここで、第１の光学ブランク値とは、ヘマトクリット値を決定するときに使用される光学ブランク値であり、測定液が流路４１内に存在する状態で、臨界角未満の所定の第１の入射角で金属膜３０に対して出射光αを照射したときに、測定チップ１０の上方に放出される、出射光αと同じ波長の光の光量を意味する。以下、第１の入射角で金属膜３０に対して照射される出射光αを「第１の出射光α_１（特許請求の範囲では、「第１の光」と称している）」ともいう。

　本工程では、まず、臨界角未満の第１の入射角で金属膜３０に対して第１の出射光α_１を照射するとともに、測定チップ１０の上方に放出される光を検出する。詳細については後述するが、第１の入射角は、臨界角未満であればよく、ヘマトクリット値を高精度に測定し、かつＳＰＦＳ装置１００の大型化を抑制する観点からは、第１の入射角は、臨界角よりある程度（例えば、５～１０度程度）小さいことが好ましい。また、本実施の形態では、光源ユニット１１１から第１の出射光α_１を第１の入射角で金属膜３０に照射させつつ、受光センサー１２６で測定チップ１０の上方に放出される光を検出する。これにより、散乱光γ’の検出（工程Ｓ１１５）においてノイズとなる光の光量である第１の光学ブランク値が得られる。なお、本工程でも、光学フィルター１２４は、その一部または全部が光路外に位置するように配置されている。

　４）第２の光学ブランク値の測定
　次いで、第２の光学ブランク値を測定する（工程Ｓ１１３）。ここで、第２の光学ブランク値とは、被測定物質の量を決定するときに使用される光学ブランク値であり、測定液が流路４１内に存在する状態で、臨界角以上の所定の第２の入射角で金属膜３０に対して出射光αを照射したときに、測定チップ１０の上方に放出される、出射光αと同じ波長の光の光量を意味する。以下、第２の入射角で金属膜３０に対して照射される出射光αを「第２の出射光α_２（特許請求の範囲では、「第２の光」と称している）」ともいう。

　本工程では、まず、金属膜３０（成膜面２２）に対する出射光αの入射角を、第２の入射角に切り替える。第２の入射角は、臨界角以上であればよく、出射光αが照射された金属膜３０においてＳＰＲを生じさせるための角度である。本実施の形態では、光源ユニット１１１内の光源を回動させて、第１の入射角から工程Ｓ１１１において決定した増強角（第２の入射角）に切り替える。次いで、金属膜３０に対して増強角で第２の出射光α_２を照射するとともに、測定チップ１０の上方に放出される光を検出する。本実施の形態では、光源ユニット１１１から第２の出射光α_２を増強角で金属膜３０に照射させつつ、受光センサー１２６で測定チップ１０の上方に放出される光を検出する。これにより、蛍光シグナルの検出（工程Ｓ１１７）においてノイズとなる光の光量である第２の光学ブランク値が得られる。なお、本工程では、光学フィルター１２４は、光路上に配置されている。

　５）１次反応
　次いで、検体中の被測定物質と金属膜３０上の捕捉体とを反応させる（１次反応；工程Ｓ１１４）。具体的には、まず、流路４１内から測定液を除去し、流路４１内に検体を注入する。たとえば、ピペット１３１を用いて、流路４１内の測定液を吸引した後に、流路４１内に検体を提供する。これにより、検体中に被測定物質が存在する場合には、被測定物質の少なくとも一部は金属膜３０上の捕捉体により捕捉されうる。

　検体は、全血を含んでおり、必要に応じて希釈されていてもよい。後述の工程Ｓ１１５において散乱光γ’を高強度に測定する観点からは、検体の濃度は高いことが好ましい。これは、検体の濃度が高いほど検体中で散乱される光量が増え、検出される散乱光γ’の光量が増大するためである。一方で、後述の工程Ｓ１１７において蛍光βを高精度に測定する観点からは、検体の濃度はある程度低いことが好ましい。これは、検体の濃度がある程度低いことによって、検体中の不純物が捕捉体に吸着（非特異吸着）される量を減少させ、ノイズを減少させうるためである。また、捕捉体の量に対する被測定物質の量を適切な範囲内に調整することで、捕捉体で捕捉できる被測定物質の量が飽和してしまうのを抑制することができる。希釈液としては、例えば、生理食塩水が使用され得る。全血中の被測定物質の例には、トロポニン、ミオグロビンおよびクレアチンキナーゼ－ＭＢ（ＣＫ－ＭＢ）が含まれる。

　６）散乱光の検出
　次いで、検体のヘマトクリット値を示す散乱光γ’を検出する（工程Ｓ１１５）。具体的には、プリズム２０側から第１の入射角で金属膜３０に第１の出射光α_１を照射したときに、金属膜３０および検体を透過した第１の出射光α_１が、検体中で散乱することで得られる散乱光γ’を検出する。より具体的には、散乱光γ’は、検体中の血球成分により第１の出射光α_１が散乱されることで得られる。本実施の形態では、光源ユニット１１１から出射光αを第１の入射角となるように金属膜３０に照射させつつ、受光センサー１２６で散乱光γ’を検出する。これにより、検体のヘマトクリット値を示す散乱光γ’の光量を測定することができる。なお、本工程では、光学フィルター１２４は、その一部または全部が散乱光γ’の光路外に位置するように配置されている。

　本工程において、第１の出射光α_１は、工程Ｓ１１２において金属膜３０に照射される出射光αと同じ波長および光量の光である。金属膜３０に照射される第１の出射光α_１は、波長が６００～７００ｎｍであるＰ偏光の光であることが好ましい。第１の出射光α_１の波長が６００～７００ｎｍであることにより、金膜（金属膜３０）に対する第１の出射光α_１の透過率が高くなるとともに、散乱光γ’が検体中のヘモグロビンによって吸収されるのを抑制することができる。これらの結果として、受光センサー１２６により検出される散乱光γ’の光量を高めることができる。また、第１の出射光α_１がＰ偏光であることによって、さらに、金属膜３０に対する第１の出射光α_１の透過率が高くなるため、検出される散乱光γ’の光量を高めることができる。これらの結果として、ヘマトクリット値を高精度に決定することができる。

　本工程において、第１の出射光α_１が検体中で散乱されることで得られる散乱光γ’の光量を増加させ、高精度にヘマトクリット値を決定する観点からは、検体の濃度は高いことが好ましい。たとえば、検体は、希釈倍率が１～１０倍の全血であることが好ましく、希釈倍率が１～３倍の全血であることがより好ましい（後述の参考実験２参照）。本実施の形態では、検体は、希釈倍率が１～１０倍の全血である。

　また前述のとおり、ヘマトクリット値を高精度に決定する観点からは、第１の入射角は、臨界角よりもある程度小さいことが好ましい。たとえば、第１の入射角は、臨界角より５度小さい角度と同じか、またはそれより小さいことが好ましい（後述のシミュレーション参照）。さらに、第１の入射角および第２の入射角の差を小さくすることで、第１の入射角および第２の入射角の切替え時間の短縮化やＳＰＦＳ装置１００を小型化する観点からは、第１の入射角および第２の入射角の差は、小さいことが好ましい。たとえば、第１の入射角は、第１の入射角は、臨界角より５度小さい角度と同じか、またはそれより小さく、かつ臨界角より１０度小さい角度と同じか、またはそれより大きいことがより好ましい。

　なお、ここまでは、１次反応（工程Ｓ１１４）の終了後に、散乱光γ’の検出（工程Ｓ１１５）が行われる例について説明したが、１次反応の開始後かつ終了前に、散乱光γ’の検出が行われてもよい。たとえば、１次反応工程の開始後、流路４１内に検体を注入した直後に、散乱光γ’の検出を行い、その後、１次反応の反応時間が、所定の時間に達するまで、残りの１次反応を行ってもよい。１次反応において検体を流路４１内で往復送液している途中で、赤血球が沈降してしまい、正確に散乱光γ’を検出できない可能性があるが、この方法によれば、赤血球が沈降してしまう前に散乱光γ’を検出できるため好ましい。この方法は、１次反応の反応時間が長い場合や、検体の希釈率が高い場合、ヘマトクリット値が低い場合などの、赤血球が沈降しやすい場合に、特に有効である。もちろん、１次反応よりも先に散乱光γ’の検出を行う場合にも、流路４１内に検体を注入し、検体中の被測定物質と金属膜３０上の捕捉体とが接触した時点から、１次反応自体は開始される。ただ、１次反応の途中で散乱光γ’の検出を行う場合には、散乱光γ’の強度を正確に測定する観点から、散乱光γ’を検出する際には、流路４１内の流体の移動を停止させる、すなわち送液を停止することが好ましい。いずれにしても、散乱光γ’の検出と並行して１次反応を行うことができるため、合計測定時間を短縮することができるとともに、準備する検体を１種類とすることができ、手順が簡便になる。

　７）２次反応
　次いで、金属膜３０上の捕捉体に捕捉された被測定物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ１１６）。具体的には、まず、ピペット１３１により流路４１内から検体を除去した後、流路４１内を緩衝液などで洗浄して、捕捉体に捕捉されなかった物質を除去する。次いで、ピペット１３１により蛍光標識液を流路４１内に提供する。これにより、被測定物質を蛍光物質で標識することができる。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された抗体（２次抗体）を含む緩衝液である。この後、流路４１内を緩衝液などで洗浄し、遊離の蛍光物質などを除去する。

　８）蛍光シグナルの検出
　次いで、被測定物質の量を示す蛍光β（シグナル）を検出する（工程Ｓ１１７）。具体的には、金属膜３０上において、被測定物質が捕捉体に捕捉され、かつ検体が存在しない状態（流路４１が測定液で満たされた状態）で、プリズム２０側から増強角（第２の入射角）で、プリズム２０を介して捕捉体が固定化されている領域に対応する金属膜３０の裏面に第２の出射光α_２を照射したときに、測定チップ１０で生じる、被測定物質の量を示す蛍光β（シグナル）を検出する。このとき、第２の出射光α_２は、蛍光物質を直接もしくは間接に励起させうる励起光である。本実施の形態では、光源ユニット１１１から出射光αを第２の入射角が増強角となるように金属膜３０に照射させつつ、受光センサー１２６で蛍光βを検出する。これにより、検体中の被測定物質の量を示す、蛍光βの光量である蛍光値を高強度で測定することができる。なお、本工程では、光学フィルター１２４は、光路上に配置されている。

　本明細書中、「検体が存在しない状態」とは、流路４１内から検体を除去する操作が行われた状態をいう。すなわち、流路４１内に検体が実質的に存在していなければよく、流路４１内に除去しきれなかった検体がわずかに残存していてもよい。

　本工程において、第２の出射光α_２は、工程Ｓ１１１および工程Ｓ１１３において金属膜３０に照射される出射光αと同じ波長の光である。第２の出射光α_２は、被測定物質を標識する蛍光物質を励起しうる波長の光である。第２の出射光α_２の波長および光量は、第１の出射光α_１の波長および光量と同じであってもよいし、異なっていてもよい。同じ光源の使用による測定装置の小型化の観点からは、第２の出射光α_２の波長および光量は、第１の出射光α_１の波長および光量と同じであることが好ましい。本実施の形態では、第２の出射光α_２の波長および光量は、第１の出射光α_１の波長および光量と同じである。

　９）測定値の補正
　次いで、測定値を補正する（工程Ｓ１１８）。具体的には、工程Ｓ１１５で検出された散乱光γ’の光量から決定される、検体のヘマトクリット値に基づいて、工程Ｓ１１７で検出された蛍光βから決定される、被測定物質の量を示す測定値を補正する。

　まず、散乱光γ’の光量から検体のヘマトクリット値を決定する。散乱光γ’は、検体中での散乱に起因する散乱成分（シグナル成分）と、検体以外の領域（たとえば、プリズム２０、金属膜３０および流路蓋４０）での散乱に起因するノイズ成分（第１の光学ブランク値）とを含む。したがって、工程Ｓ１１５で検出された散乱光γ’の光量から、工程Ｓ１１２で得られた第１の光学ブランク値を引くことで、検体中での散乱成分（シグナル成分）を算出することができる。次いで、当該シグナル成分と、散乱光γ’の光量およびヘマトクリット値の関係を示す検量線とに基づいて、検体のヘマトクリット値を決定することができる。

　次いで、蛍光βの光量である蛍光値から検体中の被測定物質の量（濃度）を示す測定値を決定する。蛍光値は、被測定物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分（シグナル成分）と、蛍光物質以外の要因に起因するノイズ成分（第２の光学ブランク値）とを含む。したがって、工程Ｓ１１７で得られた蛍光値から、工程Ｓ１１３で得られた第２の光学ブランク値を引くことで、検体中の被測定物質の量を示す測定値（シグナル成分）を算出することができる。

　最後に、検体中の被測定物質の量を示す測定値を、ヘマトクリット値に基づいて補正する。具体的には、上記測定値に以下の式（１）で表される変換係数ｃを掛けることで、血漿中の被測定物質の量に変換する。

　［上記式（１）において、Ｈｃｔはヘマトクリット値（０～１００％）であり、ｄｆは検体の希釈倍率である。］

　以上の手順により、血漿中の被測定物質の量（濃度）を決定することができる。

　（シミュレーション）
　ヘマトクリット値を決定するために散乱光γ’を検出するときの、金属膜３０に対する出射光αの入射角の好ましい範囲を調べるためにシミュレーションを行った。具体的には、異なる厚みを有する金属膜３０について、金属膜３０に対する出射光αの入射角と、出射光αの反射率（透過率）との関係についてシミュレーションを行った。本シミュレーションでは、出射光αの波長を６６０ｎｍ、プリズム２０の屈折率を１．５２８、金属膜３０の屈折率を０．２１４４、金属膜３０の消衰係数を３．８５、検体の屈折率を１．３３１に設定した。

　図３Ａ、Ｂは、シミュレーションの結果を示すグラフである。図３Ａは、出射光αの入射角と、出射光αの金属膜３０に対する反射率との関係を示すグラフであり、図３Ｂは、出射光αの入射角と、出射光αの金属膜３０に対する透過率との関係を示すグラフである。図３Ａにおいて、横軸は金属膜３０に対する出射光αの入射角（°）を示し、縦軸は出射光αの金属膜３０に対する反射率を示している。図３Ｂにおいて、横軸は金属膜３０に対する出射光αの入射角（°）を示し、縦軸は出射光αの金属膜３０に対する透過率を示している。図３Ａ、Ｂでは、金属膜３０の厚みが３０ｎｍのときのシミュレーション結果を、実線で示し、金属膜３０の厚みが４０ｎｍのときのシミュレーション結果を、点線で示し、金属膜３０の厚みが５０ｎｍのときのシミュレーション結果を、一点鎖線で示し、金属膜３０の厚みが６０ｎｍのときのシミュレーション結果を、二点鎖線で示している。

　図３Ａに示されるように、出射光αの金属膜３０に対する反射率は、入射角が約５５度から約６０．５度（臨界角）までの領域では、出射光αの入射角が小さくなるにつれて小さくなっている。このとき、反射率の変化量は、入射角が臨界角に近いほど大きく、入射角が臨界角から離れるほど小さいことがわかる。そして、反射率は、入射角が約５５度以下の領域では、ほとんど変化していないことがわかる。

　また、図３Ｂに示されるように、出射光αの透過率は、入射角が約５５度から約６０．５度（臨界角）までの領域では、出射光αの入射角が小さくなるにつれて大きくなっている。このとき、透過率の変化量は、入射角が臨界角に近いほど大きく、入射角が臨界角から離れるほど小さいことがわかる。そして、透過率は、入射角が約５５度以下の領域では、ほとんど変化していないことがわかる。

　本シミュレーションの結果から、ヘマトクリット値を高精度に決定するためには、出射光αの入射角が変化したとしても、反射率（透過率）の変化が抑制されうる領域で、散乱光γ’を検出することが好ましいことがわかる。このような観点から、第１の入射角は、臨界角より５度小さい角度と同じか、またはそれより小さいことが好ましい。これにより、流路４１内の液体の屈折率のわずかなずれ（例えば、Δｎ＝０．００１）による臨界角の変化や、出射光αの入射角のわずかなずれ（例えば、０．１度）などに起因する、出射光αの金属膜３０の透過光量の変化を抑制することができる。結果として、検出される散乱光γ’の光量の変化を抑制し、高精度にヘマトクリット値を決定することができる。

　（参考実験１）
　散乱光γ’の光量と、プラズモン散乱光γの光量とを比較するとともに、散乱光γ’の光量およびヘマトクリット値の相関と、プラズモン散乱光γの光量およびヘマトクリット値の相関とを比較するための実験を行った。

　参考実験１では、流路４１内に測定液、血漿、ヘマトクリット値が２０％の血液、またはヘマトクリット値が４０％の血液が存在する状態で、金属膜３０に対する出射光αの入射角度を走査しながら出射光αを金属膜３０に照射するとともに、測定チップ１０の上方に放出される光を受光センサー１２６で検出して、当該光の光量を測定した。これと同時に、出射光αの反射光を受光センサー（不図示）で検出して、出射光αの反射率を決定した。

　図４Ａ、Ｂおよび図５Ａ、Ｂは、参考実験１の結果を示すグラフであり、金属膜３０に対する出射光αの入射角と、散乱光γ’の光量、プラズモン散乱光γの光量および出射光αの反射率との関係を示すグラフである。図４Ａ、Ｂおよび図５Ａ、Ｂにおいて、入射角が臨界角より小さい角度範囲（図４Ａ、Ｂおよび図５Ａ、Ｂにおける破線の左側）における光量は、散乱光γ’の光量を意味し、入射角が臨界角以上である角度範囲（図４Ａ、Ｂおよび図５Ａ、Ｂにおける破線の右側）における光量は、プラズモン散乱光γの光量を意味する。図４Ａは、流路４１内に測定液が存在する状態における測定結果であり、図４Ｂは、流路４１内に血漿が存在する状態における測定結果であり、図５Ａは、流路４１内にヘマトクリット値が２０％の血液が存在する状態における測定結果であり、図５Ｂは、流路４１内にヘマトクリット値が４０％の血液が存在する状態における測定結果である。また、図４Ａ、Ｂおよび図５Ａ、Ｂにおいて、横軸は金属膜３０に対する出射光αの入射角（°）を示し、左側の縦軸は散乱光γ’またはプラズモン散乱光γの光量（ｃｏｕｎｔ）を示し、右側の縦軸は出射光αの反射率を示している。さらに、図４Ａ、Ｂおよび図５Ａ、Ｂにおいて、散乱光γ’およびプラズモン散乱光γの光量は、白色の記号（□、◇、△および○）で示し、出射光αの反射率は、黒色の記号（■、◆、▲および●）で示している。

　出射光αの反射率を示すグラフには、入射角が６１度以上の領域において、７２度近傍を最小値とする下に凸のピークが観測される。これは、入射角が６１度以上の領域において、金属膜３０で表面プラズモン共鳴が発生していることを示している。そして、検体中に血球が存在するか否かにかかわらず、入射角が６１度以上の領域において、プラズモン散乱光γの光量はほとんど変化していない（図４Ａ、Ｂおよび図５Ａ、Ｂ参照）。

　一方、出射光αの反射率についてのグラフから明らかなように、６１度近傍を境界として、出射光αの入射角が小さくなるにつれて、反射率が小さくなり始める。これは、６１度近傍が臨界角であることを示している。検体が測定液または血漿であり、検体中に血球が存在しない場合、入射角が６１度未満の領域においては、散乱光γ’の光量は、ほとんど変化していない（図４Ａ、Ｂ参照）。これに対して、検体が血液であり、検体中に血球が存在する場合、入射角が６１度未満の領域においては、散乱光γ’の光量は増加している（図５Ａ、Ｂ参照）。これらの結果は、出射光αが、検体中を透過するときに検体中の血球成分により散乱されていることを示している。そして、図５Ａ、Ｂから明らかなように、プラズモン散乱光γの強度と比較して、検体中の血球成分に起因する散乱光γ’の強度は、より強いことがわかる。

　次いで、散乱光γ’の光量およびヘマトクリット値の相関と、プラズモン散乱光γの光量およびヘマトクリット値の相関と比較する。図６は、散乱光γ’またはプラズモン散乱光γの光量と、ヘマトクリット値との相関を示すグラフである。図６は、図４Ａ、Ｂおよび図５Ａ、Ｂにおける、金属膜３０に対する出射光αの入射角と、散乱光γ’またはプラズモン散乱光γの光量との関係を示すグラフを１つのグラフにまとめたグラフである。□は流路４１内に測定液が存在する状態における測定結果（図４Ａ）であり、◇は流路４１内に血漿が存在する状態における測定結果（図４Ｂ）であり、△は流路４１内にヘマトクリット値が２０％の血液が存在する状態における測定結果（図５Ａ）であり、○は流路４１内にヘマトクリット値が４０％の血液が存在する状態における測定結果（図５Ｂ）である。図６に示されるように、検体中のヘマトクリット値が大きいほど、入射角が６１度未満の領域における散乱光γ’の光量は大きくなっている。これに対して、検体中のヘマトクリット値が大きくなっても、入射角が６１度以上の領域におけるプラズモン散乱光γの光量はほとんど変化していない。すなわち、図６から明らかなように、プラズモン散乱光γの光量およびヘマトクリット値の相関と比較して、散乱光γ’の光量およびヘマトクリット値の相関は、より強いことがわかる。

　参考実験１の結果から、プラズモン散乱光γの強度と比較して、散乱光γ’の強度は、より高く、かつプラズモン散乱光γの光量およびヘマトクリット値の相関と比較して、散乱光γ’の光量およびヘマトクリット値の相関は、より強いことがわかる。したがって、ヘマトクリット値を決定する際に、プラズモン散乱光γではなく散乱光γ’を検出することによって、より高精度にヘマトクリット値を決定することができることがわかる。

　（参考実験２）
　ヘマトクリット値を決定するときの、検体の希釈倍率の好ましい範囲を調べるために実験を行った。参考実験２では、希釈倍率が１倍（希釈なし）、３倍または１５倍となるように希釈した、５種類のヘマトクリット値（０％、２０％、３０％、４５％および６５％）の全血を検体として使用した。流路４１内に測定液が存在する状態で、金属膜３０に入射角５２度で出射光αを照射したときに、測定チップ１０の上方に放出される散乱光γ’を検出して、第１の光学ブランク値を測定した。次いで、流路４１内に検体が存在する状態で、金属膜３０に入射角５２度で出射光αを照射したときに、測定チップ１０の上方に放出される散乱光γ’を検出して、散乱光γ’の光量を測定した。測定した散乱光γ’の光量から第１の光学ブランク値を引くことによって、検体中での散乱に起因する散乱成分（シグナル成分）を算出した。

　図７は、参考実験２の結果を示すグラフであり、検体の希釈倍率と、散乱光γ’の光量およびヘマトクリット値の相関との関係を示すグラフである。図７において、横軸はヘマトクリット値Ｈｃｔ（％）を示し、縦軸は散乱光γ’のシグナル成分（ｃоｕｎｔ）を示す。また、検体の希釈倍率が１倍（希釈なし）のときの結果は、黒い丸（●）で示し、検体の希釈倍率が３倍のときの結果は、黒い四角（■）で示し、検体の希釈倍率が１５倍のときの結果は、黒い三角（▲）で示している。

　図７に示されるように、検体の希釈倍率が小さい（検体の濃度が高い）ほど、グラフの傾きは大きくなっている。すなわち、検体の希釈倍率が小さい（検体の濃度が高い）ほど、散乱光γ’の光量およびヘマトクリット値の相関は強いことがわかる。したがって、ヘマトクリット値を決定するために散乱光γ’を検出するとき、ヘマトクリット値を高精度に決定する観点からは、検体の濃度は高いことが好ましい。たとえば、検体は、希釈倍率が１～１０倍の全血であることが好ましく、希釈倍率が１～３倍の全血であることがより好ましい。

　（参考実験３）
　金属膜３０の厚みの好ましい範囲を調べるために実験を行った。本実験では、種々の厚み（１０～８０ｎｍ）を有する金属膜３０について、波長６６０ｎｍの出射光αを、入射角を変えながらで金属膜３０に照射したときに、測定チップ１０の出射面２３から出射される出射光αの反射光を受光センサー（不図示）にて検出し、出射光αの反射光の光量が最小となる共鳴角度での反射光の光量に基づいて、表面プラズモン共鳴の発生効率を算出した。金属膜３０としては金膜を用いた。

　図８は、参考実験３の結果を示すグラフである。図８において、横軸は金属膜３０の厚み（ｎｍ）を示し、縦軸は共鳴角度での反射光の光量に基づいて算出した表面プラズモン共鳴の発生効率を示す。

　図８に示されるように、表面プラズモン共鳴の発生効率は、金属膜３０の厚みが４０ｎｍ近傍のときに最大となっている。したがって、金属膜３０が金膜である場合には金属膜３０の厚みが、例えば、３０～５５ｎｍのときに、被測定物質の量を示すシグナルを高強度に検出でき、被測定物質の量を示す測定値を高精度に決定することができることがわかる。

　また、金属膜３０の厚みが３０～５５ｎｍのとき、出射光αの金属膜３０に対する透過率は、５～３０％となる（図３Ｂ参照）。すなわち、金属膜３０に対する出射光αの高い透過率によって、散乱光γ’を高強度に検出することもできる。このような観点からも、ヘマトクリット値を高精度に決定することができ、検体中の被測定物質の量を高精度に決定することができる。

　（ＳＰＦＳ装置）
　次いで、本実施の形態に係る測定方法を実施するためのＳＰＦＳ装置の一例について説明する。図２は、ＳＰＦＳ装置１００の構成の一例を示す構成図である。ＳＰＦＳ装置１００は、光出射部１１０、光検出部１２０、送液部１３０、搬送部１４０および制御処理部（処理部）１５０を有する。ＳＰＦＳ装置１００は、搬送部１４０のチップホルダー（ホルダー）１４２に前述の測定チップ１０を装着した状態で使用される。

　光出射部１１０は、出射光α（第１の出射光α_１および第２の出射光α_２）を出射する。上記の工程Ｓ１１２および工程Ｓ１１５では、光出射部１１０は、第１の入射角で金属膜３０に入射するように出射光αを出射する。また、上記の工程Ｓ１１３および工程Ｓ１１７では、光出射部１１０は、第２の入射角で金属膜３０に入射するように出射光αを出射する。すなわち、第１の入射角は、ヘマトクリット値を決定するために、金属膜３０に照射される第１の出射光α_１の入射角である。一方で、第２の入射角は、被測定物質の量を示す測定値を決定するために、金属膜３０に照射される第２の出射光α_２の入射角である。第１の入射角は臨界角未満であり、第２の入射角は臨界角以上である。

　散乱光γ’を検出するときには、光出射部１１０は、第１の入射角で金属膜３０に対するＰ波を入射面２１に向けて出射する。このときの第１の出射光α_１は、成膜面２２を通過してプリズム２０の上方に出射される。また、蛍光βまたはプラズモン散乱光γを検出するときには、光出射部１１０は、金属膜３０で表面プラズモン共鳴が発生するように、第２の入射角で金属膜３０に対するＰ波を入射面２１に向けて出射する。このときの第２の出射光α_２は、プリズム２０を介して金属膜３０に表面プラズモン共鳴が生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる。

　光出射部１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。

　光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の光を、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。

　光源の種類は、特に限定されず、例えばレーザーダイオード（ＬＤ）である。光源の他の例には、発光ダイオードや水銀灯などのレーザー光源が含まれる。光源から出射される出射光αの波長は、例えば、４００ｎｍ～１０００ｎｍの範囲内である。光源から出射される出射光αがビームでない場合、出射光αは、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される出射光αが単色光でない場合は、出射光αは、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される出射光αが直線偏光でない場合は、出射光αは、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。

　ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。

　コリメーターは、光源から出射された出射光αをコリメートする。

　バンドパスフィルターは、光源から出射された出射光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源から出射された出射光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。

　直線偏光フィルターは、光源から出射された出射光αを直線偏光の光にする。

　半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように光の偏光方向を調整する。

　スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、光源から出射された出射光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。

　ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、出射光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。

　温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源から出射された出射光αの波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源から出射された出射光αの波長およびエネルギーを一定に制御する。

　角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））に対する出射光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて、第１の入射角または第２の入射角で出射光αを照射するために、光源から出射された出射光αの光軸とチップホルダー１４２とを相対的に回転させる。たとえば、角度調整機構１１２は、金属膜３０上において出射光αの光軸と直交する軸（図２の紙面に対して垂直な軸）を中心として光源ユニット１１１を回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。特に、回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端において、光源から出射された出射光αの２つの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。

　光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１からの出射光αの出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

　光検出部１２０は、金属膜３０上に、光出射部１１０がプリズム２０を介して金属膜３０に照射したときに、測定チップ１０から放出される光（例えば、蛍光β、散乱光γ’またはプラズモン散乱光γ）を検出する。本実施の形態では、光検出部１２０は、検出した蛍光βの光量、散乱光γ’の光量およびプラズモン散乱光γの光量を示す信号を制御処理部１５０に出力する。光検出部１２０は、受光光学系ユニット１２１、位置切替え機構１２２およびセンサー制御部１２７を含む。

　受光光学系ユニット１２１は、測定チップ１０の金属膜３０の法線上に配置される。受光光学系ユニット１２１は、第１のレンズ１２３、光学フィルター１２４、第２のレンズ１２５および受光センサー１２６を含む。受光光学系ユニット１２１の光軸は、光出射部１１０からの出射光αの光軸と合致しないように配置されている。これにより、蛍光β、散乱光γ’またはプラズモン散乱光γを検出するときに、出射光αが直接受光センサー１２６に入射するのを防ぐことができる。結果として、高いＳ／Ｎ比で蛍光β、散乱光γ’またはプラズモン散乱光γを検出することができる。

　位置切替え機構１２２は、光学フィルター１２４が受光光学系ユニット１２１における光路上に位置するか、または光学フィルター１２４の一部または全部が光路外に位置するように光学フィルター１２４の位置を切り替える。具体的には、受光センサー１２６が蛍光βを検出するときには、光学フィルター１２４を受光光学系ユニット１２１の光路上に配置し、受光センサー１２６が散乱光γ’およびプラズモン散乱光γを検出するときには、光学フィルター１２４の一部または全部を受光光学系ユニット１２１の光路外に配置する。

　第１のレンズ１２３は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光（シグナル）を集光する。第２のレンズ１２５は、例えば、結像レンズであり、第１のレンズ１２３で集光された光を受光センサー１２６の受光面に結像させる。両レンズの間において、光は、略平行の光束となっている。

　光学フィルター１２４は、第１のレンズ１２３および第２のレンズ１２５の間に配置されている。光学フィルター１２４は、蛍光検出時においては、光学フィルター１２４に入射する光のうち、蛍光成分のみを透過させ、励起光成分（プラズモン散乱光γ）を除去する。これにより、蛍光成分のみを受光センサー１２６に導き、高いＳ／Ｎ比で蛍光βを検出することができる。光学フィルター１２４の種類の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１２４の例には、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルターと、所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターとが含まれる。

　受光センサー１２６は、蛍光β、散乱光γ’およびプラズモン散乱光γを検出する。蛍光β、散乱光γ’およびプラズモン散乱光γを同一の受光センサー１２６で受光することによって、ＳＰＦＳ装置１００の大型化を防ぐとともに、低コスト化を実現することができる。受光センサー１２６は、出射光αの光軸と重なる位置とは異なる位置に配置されている。出射光αの光軸と重なる位置とは異なる位置で散乱光γ’を検出することによって、検体中で散乱されずに測定チップ１０上に放出された出射光αを検出することなく、高いＳ／Ｎ比で散乱光γ’を検出することができる。受光センサー１２６は、微量の被測定物質からの微弱な蛍光βを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー１２６は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、シリコンフォトダイオード（ＳｉＰＤ）などである。

　センサー制御部１２７は、受光センサー１２６の出力値の検出や、当該出力値による受光センサー１２６の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１２６の感度の変更などを制御する。センサー制御部１２７は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

　送液部１３０は、チップホルダー１４２に保持された測定チップ１０の流路４１内に、液体チップ５０内の液体を供給する。また、送液部１３０は、測定チップ１０の流路４１内から液体を除去する。送液部１３０は、ピペット１３１およびピペット制御部１３５を含む。

　ピペット１３１は、シリンジポンプ１３２と、シリンジポンプ１３２に接続されたノズルユニット１３３と、ノズルユニット１３３の先端に装着されたピペットチップ１３４とを有する。シリンジポンプ１３２内のプランジャーの往復運動によって、ピペットチップ１３４における液体の吸引および排出が定量的に行われる。

　ピペット制御部１３５は、シリンジポンプ１３２の駆動装置、およびノズルユニット１３３の移動装置を含む。シリンジポンプ１３２の駆動装置は、シリンジポンプ１３２のプランジャーを往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ノズルユニット１３３の移動装置は、例えば、ノズルユニット１３３を、垂直方向に自在に動かす。ノズルユニット１３３の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。

　ピペット制御部１３５は、シリンジポンプ１３２を駆動して、液体チップ５０から各種液体をピペットチップ１３４内に吸引させる。そして、ピペット制御部１３５は、ノズルユニット１３３を移動させて、測定チップ１０の流路４１内にピペットチップ１３４を挿入させるとともに、シリンジポンプ１３２を駆動して、ピペットチップ１３４内の液体を流路４１内に注入させる。また、液体の導入後、ピペット制御部１３５は、シリンジポンプ１３２を駆動して、流路４１内の液体をピペットチップ１３４内に吸引させる。このように流路４１内の液体を順次交換することによって、反応場において捕捉体と被測定物質を反応させたり（１次反応）、被測定物質と蛍光物質で標識された捕捉体とを反応させたりする（２次反応）。また、送液部１３０は、上記のように液体チップ５０内の液体を吸引したり、吐出したりすることで、検体を分注したり、希釈したりすることもできる。

　搬送部１４０は、測定チップ１０を搬送し、固定する。搬送部１４０は、搬送ステージ１４１およびチップホルダー１４２を含む。

　搬送ステージ１４１は、チップホルダー１４２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１４１は、出射光αや、出射光αの反射光、蛍光β、散乱光γ’、プラズモン散乱光γなどの光の光路を妨げない形状である。搬送ステージ１４１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。

　チップホルダー１４２は、搬送ステージ１４１に固定されており、測定チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１４２の形状は、測定チップ１０を保持することができ、かつ出射光αや出射光αの反射光、蛍光β、散乱光γ’、プラズモン散乱光γなどの光の光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１４２には、上記の光が通過するための開口が設けられている。

　また、チップホルダー１４２には、ヒーターやペルチェ素子などの温度調整機構（不図示）が接続されている。１次反応や２次反応などの、流路４１内での反応は、温度によって反応効率が変動することがある。このため、チップホルダー１４２を介して温度調整機構により流路４１内の温度を一定に保つことにより、反応効率を一定に制御し、被測定物質の測定精度を高めることが好ましい。

　制御処理部１５０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、位置切替え機構１２２、センサー制御部１２７、ピペット制御部１３５および搬送ステージ１４１を制御する。制御処理部１５０は、光検出部１２０（受光センサー１２６）の検出結果を処理する処理部としても機能する。本実施の形態では、制御処理部１５０は、散乱光γ’の検出結果に基づいて、検体のヘマトクリット値を決定するとともに、蛍光βの検出結果に基づいて、検体中の被測定物質の量を示す測定値を決定する。これとともに、制御処理部１５０は、ヘマトクリット値に基づいて測定値を補正して、血漿または血清中の被測定物質の量（濃度）を決定する。また、制御処理部１５０には、上記の処理の際に使用される特定の情報（例えば、種々の変換係数、希釈倍率、検量線に関するデータ）などがあらかじめ記録されていてもよい。本実施の形態では、制御処理部１５０には、ヘマトクリット値を用いて測定値を補正（換算）するための換算係数があらかじめ記録されている。制御処理部１５０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。

　（ＳＰＦＳ装置における光路）
　図２に示されるように、出射光αは、入射面２１からプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した出射光αが、金属膜３０に第１の入射角で入射するとき、出射光α（第１の出射光α_１）が金属膜３０、流路４１内の液体および流路蓋４０を通ったときに、検体で散乱されることによって得られる散乱光γ’が、測定チップ１０の上方に放出される。最後に、散乱光γ’は、受光センサー１２６に到達する。なお、特に図示していないが、出射光α（第１の出射光α_１）の一部は、金属膜３０で反射されて反射光となり、当該反射光は、出射面２３でプリズム２０外に出射する。

　一方、プリズム２０内に入射した出射光αが、金属膜３０にＳＰＲが生じる全反射角度である第２の入射角で入射するとき、金属膜３０上では局在場光が発生する。この局在場光により、金属膜３０上に存在する被測定物質を標識する蛍光物質が励起され、蛍光βが放出される。ＳＰＦＳ装置１００は、蛍光物質から放出された蛍光βを検出する。なお、特に図示していないが、金属膜３０での出射光α（第２の出射光α_２）の反射光は、出射面２３でプリズム２０外に出射する。

　（効果）
　本実施の形態に係る測定方法では、検体のヘマトクリット値を決定するために、臨界角未満の第１の入射角で金属膜３０に第１の出射光α_１を照射したときに、第１の出射光α_１が検体中で散乱されることで得られる散乱光γ’を検出する。プラズモン散乱光γと比較して、散乱光γ’は、強度が高く、かつヘマトクリット値との相関も高い。したがって、本実施の形態に係る測定方法では、検体のヘマトクリット値を決定するためにプラズモン散乱光γを検出する場合と比較して、ヘマトクリット値を、より高精度に決定することができる。これにより、本実施の形態に係る測定方法では、検体のヘマトクリット値を高精度に決定できるとともに、血漿中の被測定物質の量（濃度）を高精度に決定することができる。また、本実施の形態に係る測定方法では、ヘマトクリット値測定用の装置を新たに追加することなく、ヘマトクリット値を高精度に測定することができるため、測定装置の製造コストおよび測定コストを増大させることがない。

　［変形例］
　本発明に係る測定方法は、上記実施の形態に係る測定方法に限定されず、必要に応じて、各工程の順番を入れ替えてもよい。図９は、変形例に係る測定方法の一例を示すフローチャートである。たとえば、図９に示されるように、蛍光シグナルを検出する工程（工程Ｓ１１７）の後に、第１の光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１１２）と散乱光γ’を検出する工程（工程Ｓ１１５）とを行ってもよい。

　蛍光βを検出した後に、ヘマトクリット値を決定するための上記工程Ｓ１１２および工程Ｓ１１５を行う方法は、検体として、希釈倍率が大きい全血、例えば、希釈倍率が１０倍以上の全血を使用する場合に、特に有効な手段となる。

　上記実施の形態では、１次反応を行う工程で使用される検体と散乱光γ’の検出を行う工程で使用される検体とは、同一である。このため、希釈倍率が大きい検体を１次反応で使用する場合には、散乱光γ’の検出精度が低下してしまう。これに対して、変形例に係る測定方法では、１次反応（工程Ｓ１１４）において、検体として希釈倍率が１０倍以上の全血を使用する場合でも、散乱光γ’を検出する工程（工程Ｓ１１５）では、上記検体よりも希釈倍率がより小さい（濃度が高い）検体を別途準備し、使用することが可能となる。これにより、希釈倍率が大きい（濃度が低い）検体を使用して、被測定物質の量を示す測定値を高精度に取得できるとともに、希釈倍率が小さい（濃度が高い）検体を使用して、高精度にヘマトクリット値を取得することができる。結果として、血漿中の被測定物質の量（濃度）をより高精度に決定することができる。

　上記実施の形態に係る測定方法では、上記変形例に係る測定方法と比較して、１次反応を行う工程において流路４１内に提供される検体を利用してヘマトクリット値を測定することができるため、被測定物質の測定時間をより短くすることができる。また、上記実施の形態に係る測定方法では、第１の光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１１２）の後に、２次反応の工程（工程Ｓ１１６）と蛍光シグナルの検出工程（工程Ｓ１１７）とを行うため、第１の光学ブランク値に蛍光シグナルが混ざることがなく、より高精度にヘマトクリット値を測定することができる。

　なお、本実施の形態では、増強角を決定する工程（工程Ｓ１１１）、第１の光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１１２）、第２の光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１１３）および１次反応を行う工程（工程Ｓ１１４）をこの順番に行う態様について説明した。しかし、本発明に係る測定方法では、この順番に限定されない。たとえば、１次反応を行った後に増強角を決定してもよいし、１次反応を行った後に第１の光学ブランク値および第２の光学ブランク値を測定してもよい。

　また、第１の光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１１２）を行った後に増強角を決定する工程（工程Ｓ１１１）を行ってもよい。しかしながら、光学フィルター１２４の位置を切替える回数を少なくし、被測定物質の測定時間を短くする観点からは、増強角を決定する工程（工程Ｓ１１１）と、第１の光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１１２）とを行った後に、第２の光学ブランク値を測定する工程（工程Ｓ１１３）を行うことが好ましい。

　また、上記変形例では、１次反応を行う工程（工程Ｓ１１４）の後に、２次反応を行う工程（工程Ｓ１１６）を行った（２工程方式）。しかしながら、被測定物質を蛍光物質で標識するタイミングは、特に限定されない。たとえば、測定チップ１０の流路４１内に検体を導入する前に、検体に標識液を添加して被測定物質を予め蛍光物質で標識しておいてもよい。また、測定チップ１０の流路４１内に検体と標識液を同時に注入してもよい。前者の場合は、測定チップ１０の流路４１内に検体を注入することで、蛍光物質で標識されている被測定物質が捕捉体により捕捉される。後者の場合は、被測定物質が蛍光物質で標識されるとともに、被測定物質が捕捉体により捕捉される。いずれの場合も、測定チップ１０の流路４１内に検体を導入することで、１次反応および２次反応の両方を完了することができる（１工程方式）。

　なお、上記実施の形態では、ＳＰＦＳ法を利用し、シグナルとして蛍光物質からの蛍光βを検出する態様について説明したが、本発明はこの態様に限定されない。たとえば、ＳＰＲ法を利用し、測定値として出射光αの反射光を検出してもよい。

　また、上記実施の形態では、増強角を決定する工程（工程Ｓ１１１）を含む測定方法について説明したが、本発明に係る測定方法は、増強角を決定する工程を含まなくてもよい。この場合、増強角は、測定チップ１０の設計や流路４１内に提供される液体の屈折率などの因子に基づいてあらかじめ算出されていてもよい。

　さらに、上記実施の形態では、同一の光源から散乱光γ’を検出するときの第１の出射光α_１（第１の光）と、蛍光βを検出するときの第２の出射光α_２（第２の光）とを金属膜３０に照射する態様について説明した。しかし、本発明に係る測定方法はこの態様に限定されず、散乱光γ’を検出するときの第１の出射光α_１（第１の光）と、蛍光βを検出するときの第２の出射光α_２（第２の光）とを金属膜３０に照射するときに、異なる光源から照射してもよい。ＳＰＦＳ装置１００の大型化を防ぐとともに、低コスト化を実現する観点からは、同一の光源を使用することがより好ましい。

　本出願は、２０１６年９月１４日出願の特願２０１６－１７９３９６に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。

　本発明に係る被測定物質の測定方法は、被測定物質を高い信頼性で検出することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。

　１０　測定チップ
　２０　プリズム
　２１　入射面
　２２　成膜面
　２３　出射面
　３０　金属膜
　４０　流路蓋
　４１　流路
　５０　液体チップ
　１００　ＳＰＦＳ装置
　１１０　光出射部
　１１１　光源ユニット
　１１２　角度調整機構
　１１３　光源制御部
　１２０　光検出部
　１２１　受光光学系ユニット
　１２２　位置切替え機構
　１２３　第１のレンズ
　１２４　光学フィルター
　１２５　第２のレンズ
　１２６　受光センサー
　１２７　センサー制御部
　１３０　送液部
　１３１　ピペット
　１３２　シリンジポンプ
　１３３　ノズルユニット
　１３４　ピペットチップ
　１３５　ピペット制御部
　１４０　搬送部
　１４１　搬送ステージ
　１４２　チップホルダー
　１５０　制御処理部（処理部）
　α　出射光
　α_１　第１の出射光
　α_２　第２の出射光
　β　蛍光
　γ　プラズモン散乱光
　γ’　散乱光
 

Claims (14)

1. 　表面プラズモン共鳴を利用して、全血を含む検体中の被測定物質の量を測定するための測定方法であって、
   　入射面および成膜面を有するプリズムと、前記成膜面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定された捕捉体とを有する測定チップを準備する工程と、
   　前記金属膜上に前記検体が存在する状態で、前記プリズム側から臨界角未満の第１の入射角で前記金属膜に第１の光を照射したときに、前記金属膜および前記検体を透過した前記第１の光が、前記検体中で散乱されることで得られる散乱光を検出する工程と、
   　前記金属膜上において、前記被測定物質が前記捕捉体に捕捉され、かつ前記検体が存在しない状態で、前記プリズム側から臨界角以上の第２の入射角で前記金属膜に第２の光を照射したときに前記測定チップで生じる、前記被測定物質の量を示すシグナルを検出する工程と、
   　検出された前記散乱光の光量から決定される、前記検体のヘマトクリット値に基づいて、検出された前記シグナルから決定される、前記被測定物質の量を示す測定値を補正する工程と、
   　を含む、測定方法。
2. 　前記第１の入射角は、臨界角より５度小さい角度と同じか、またはそれより小さい、請求項１に記載の測定方法。
3. 　前記第１の入射角は、臨界角より１０度小さい角度と同じか、またはそれより大きい、請求項２に記載の測定方法。
4. 　入射角を走査しながら前記プリズム側から光を照射したときに、前記測定チップで生じるプラズモン散乱光を検出し、前記プラズモン散乱光の光量が最大となるときの入射角である増強角を決定する工程をさらに含み、
   　前記シグナルを検出する工程では、前記増強角で前記金属膜に前記第２の光を照射する、
   　請求項１～３のいずれか一項に記載の測定方法。
5. 　５０度の入射角でＰ偏光の光を前記金属膜に照射したときの、前記金属膜の光透過率は、３～３０％である、請求項１～４のいずれか一項に記載の測定方法。
6. 　前記金属膜の厚みは、３０～６０ｎｍである、請求項５に記載の測定方法。
7. 　前記検体は、希釈倍率が１～１０倍の全血である、請求項１～６のいずれか一項に記載の測定方法。
8. 　前記検体は、希釈倍率が１～３倍の全血である、請求項７に記載の測定方法。
9. 　前記第１の光は、波長が６００～７００ｎｍであるＰ偏光の光である、請求項１～８のいずれか一項に記載の測定方法。
10. 　同一の光源から前記第１の光および前記第２の光を前記金属膜に照射する、請求項１～９のいずれか一項に記載の測定方法。
11. 　前記光源を回動させることにより、前記第１の入射角および前記第２の入射角を切り替える、請求項１０に記載の測定方法。
12. 　同一の受光センサーで前記散乱光および前記プラズモン散乱光を検出する、請求項４に記載の測定方法。
13. 　前記散乱光を検出する工程では、前記第１の光の光軸と重なる位置とは異なる位置で前記散乱光を検出する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の測定方法。
14. 　前記シグナルは、前記被測定物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の測定方法。

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