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WO2017204208A1 - Ｓｍｎタンパク質の核内構造体の発現解析方法 - Google Patents

Ｓｍｎタンパク質の核内構造体の発現解析方法 Download PDF

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WO2017204208A1
WO2017204208A1 PCT/JP2017/019165 JP2017019165W WO2017204208A1 WO 2017204208 A1 WO2017204208 A1 WO 2017204208A1 JP 2017019165 W JP2017019165 W JP 2017019165W WO 2017204208 A1 WO2017204208 A1 WO 2017204208A1
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WO
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smn protein
blood
labeling
expression
cells
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PCT/JP2017/019165
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English (en)
French (fr)
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加代子 齋藤
玲子 荒川
正行 荒川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Microbial Chemistry Research Foundation
Tokyo Womens Medical University
Original Assignee
Microbial Chemistry Research Foundation
Tokyo Womens Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to JP2018519557A priority patent/JP6671664B2/ja
Priority to EP17802794.2A priority patent/EP3467497B1/en
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    • G01N2800/2878—Muscular dystrophy

Definitions

  • the present invention relates to an expression analysis method for a nuclear structure of a survival motor neuron (SMN) protein.
  • STN survival motor neuron
  • SMA Spinal muscular atrophy
  • SMA is a muscular atrophy caused by an anterior horn cell lesion and exhibits lower motor neuron signs characterized by muscle weakness and muscle atrophy of the trunk and extremities.
  • SMA is classified from type I to type IV according to age and severity of onset, and type I develops by 6 months after birth: severe type (also called Weldnig-Hoffmann disease), type II that develops by 1 year and 6 months: Childhood-onset SMA is intermediate type (also called Dubovitz disease) and type III that develops after 1 year and 6 months: Mild type (also called Kugelberg-Wehlander disease).
  • type IV that develops after age 20 is adult-onset SMA.
  • Type I SMA accounts for about 30% of SMA and develops in less than 6 months.
  • Type II SMA is unable to stand and walk for life
  • Type III SMA gains self-sustained gait, but gradually develops symptoms such as falling or being unable to walk or stand.
  • the fundamental cure for SMA has not yet been established, and SMA is one of the intractable diseases designated by the government.
  • the causative gene for many childhood-onset SMAs is the SMN1 gene present in the long arm 5q13 of chromosome 5. Many childhood-onset SMA has a deletion or mutation of the SMN1 gene, and childhood-onset SMA is recognized as an autosomal recessive inherited disease. From the SMN1 gene, SMN protein is expressed, and it is considered that SMN protein is involved in the formation of motor neurons. Further, in the same region of chromosome 5 where the SMN1 gene is present, there is an SMN2 gene that differs from the SMN1 gene by one base in the coding region.
  • the SMN1 gene is deleted or mutated, and the SMN1 gene-derived SMN protein is decreased, while the SMN2 gene functions normally. Therefore, even in childhood-onset SMA patients, the SMN2 gene-derived SMN protein is expressed, and it is considered that the severity of symptoms varies depending on the expression level of the SMN2 gene-derived SMN protein.
  • transcript of the SMN1 gene is one type of full-length SMN1 mRNA
  • transcripts of the SMN2 gene there are two types of transcripts of the SMN2 gene, and when the amount of full-length SMN1 mRNA transcribed from the SMN1 gene is 100%, About 90% of the shortened SMN2 mRNA is 10% and exon 7 deletion is observed.
  • Abbreviated SMN2 mRNA is translated into a non-functional protein, and only full-length SMN2 mRNA is normally translated into SMN protein. Therefore, the expression level of SMN protein in childhood-onset SMA patients in which the SMN1 gene is deleted or mutated Is lower than normal, only 10% to 20% of normal.
  • SMN1 gene deletions or mutations may be observed in adult-onset SMA patients, although the number is smaller than in childhood-onset SMA patients.
  • the severity of symptoms depends on the expression level of SMN protein. The degree is considered different.
  • the SMN2 gene may be present in place of the SMN1 gene. In this case, two copies of the SMN2 gene are present on one chromosome, and the expression amount of the SMN protein derived from the SMN2 gene increases in accordance with the copy number. In SMA patients, it has been found that the greater the expression level of SMN protein derived from the SMN2 gene, the milder the symptoms. As described above, the expression level of SMN protein is closely related to SMA, and SMN protein is useful for diagnosing SMA, especially childhood-onset SMA, and for accurately determining the effects of drugs. It is considered to be a potential biomarker.
  • SMN protein itself was recognized, and in order to use SMN protein as a useful biomarker of SMA, the difference in the expression level of SMN protein was detected when comparing normal patients with patients. You need to be as sensitive as you can.
  • SMA is an autosomal recessive disorder, and when the SMN1 gene is deleted or mutated only in one of a pair of autosomes, no symptoms of muscle weakness and muscle atrophy appear, It will be a carrier. Carriers have higher expression levels of SMN protein than patients, but there is not as much difference between carriers and patients as there are differences in SMN protein expression levels between normal and patients. It is not considered. Therefore, in order to use the SMN protein as a useful biomarker of SMA, it is necessary to have such sensitivity that the difference in the expression level of the SMN protein can be detected when the carrier and the patient are compared.
  • Non-patent Document 1 quantitative analysis of SMN protein by ELISA method using peripheral blood mononuclear cells has been attempted.
  • Kobayashi et al. Reported that the ELISA method showed no significant difference in SMN protein expression levels between childhood-onset SMA patients and carriers.
  • Kobayashi et al. Even discloses that SMN protein expression levels are not a reliable indicator in the diagnosis of SMA.
  • the quantitative analysis of SMN protein by ELISA requires the use of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), and it takes time and effort to centrifuge blood samples obtained from patients. The yield of is also reduced. Therefore, in the quantification of SMN protein by ELISA using PBMC, the amount of blood collected is also increased.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Patent Document 1 does not disclose the localization of the SMN protein in cells or the nuclear structure of the SMN protein.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of analyzing a nuclear structure of an SMN protein having higher reliability as a biomarker using a blood cell sample.
  • the present inventors have selected a specific cell population from blood cells for cells that detect the expression of SMN protein, and detected the expression of SMN protein in the cell population. It was newly found that the detection sensitivity of the SMN protein expression level was enhanced and the nuclear structure of the SMN protein could be analyzed by imaging flow cytometry.
  • a method for analyzing the expression of a nuclear structure of SMN protein Labeling one or more surface antigen markers of the nucleated cells with one or more labeled antibodies in a sample containing nucleated cells derived from blood, Labeling the SMN protein in the nucleated cell, Labeling the nucleus of the nucleated cell, Among the nucleated cells, the nuclear and SMN proteins are labeled and the one or more surface antigen markers labeled with the one or more labeled antibodies or the one or more labeled with the one or more labeled antibodies.
  • SSC surface antigen markers and side scatter
  • the step of labeling the SMN protein in a nucleated cell comprises labeling the SMN protein with a first fluorescent dye, and The step of analyzing the expression of the nuclear structure of the SMN protein includes measuring the fluorescence intensity emitted by the first fluorescent dye.
  • the step of labeling the SMN protein in a nucleated cell comprises labeling the SMN protein with a first fluorescent dye, and The step of labeling the nucleus of the nucleated cell includes labeling the nucleus with a second fluorescent dye.
  • the method for analyzing the expression of a nuclear structure of an SMN protein further includes a step of subjecting a sample containing nucleated cells derived from blood to erythrocyte hemolysis.
  • a sample containing nucleated cells derived from blood is obtained from a subject.
  • the step of analyzing the expression of the nuclear structure of the SMN protein comprises quantifying the nuclear structure of the SMN protein; Comparing the result obtained by the quantification with a control selected from the following (a) to (c): (a) When the subject is an SMA patient, the control uses the blood obtained from the subject except for blood obtained from a normal person or a carrier.
  • the control uses the blood obtained from the subject except for blood obtained from the SMA patient, and the nuclear structure of the SMN protein.
  • an intranuclear structure of an SMN protein with higher reliability as a biomarker can be analyzed using a blood cell sample.
  • the expression analysis of the nuclear structure of the SMN protein can be performed with about 500 ⁇ L of blood, and the nuclear structure of the SMN protein can be detected in a test of a therapeutic drug or candidate drug for SMA. When used as a marker, it can provide a useful method, particularly when collecting blood from pediatric patients.
  • FIG. 1 shows a graph in which fluorescence intensity measured by imaging flow cytometry is plotted using a blood sample obtained from a normal person.
  • the vertical axis represents side scatter (SSC), and the horizontal axis represents the fluorescence intensity emitted by the fluorescent dye bound to the anti-CD33 antibody.
  • FIG. 2 shows a graph in which the cell population is further classified with respect to the cluster indicated by R1 in FIG. 1, and the fluorescence intensity measured by imaging flow cytometry is plotted.
  • the vertical axis represents the fluorescence intensity emitted from the fluorescent dye bound to the anti-CD19 antibody
  • the horizontal axis represents the fluorescence intensity emitted from the fluorescent dye bound to the anti-CD3 antibody.
  • FIG. 3 is a cell photograph taken by imaging flow cytometry using a blood sample obtained from an SMA patient.
  • FIG. 4 is a cell photograph taken by imaging flow cytometry using a blood sample obtained from a healthy person (control).
  • FIG. 5 is a graph showing the average number of SMN protein nuclear structures (spots) measured by imaging flow cytometry using blood samples obtained from healthy subjects and SMA patients, respectively. ⁇ represents results obtained using blood samples obtained from adults, and ⁇ represents results obtained using blood samples obtained from infants to children.
  • FIG. 6 is a graph showing the proportion of SMN protein nuclear structure (spot) positive cells measured by imaging flow cytometry using blood samples obtained from healthy subjects and SMA patients, respectively.
  • FIG. 7 is a graph showing fluorescence intensity of SMN protein nuclear structure (spot) positive cells measured by imaging flow cytometry using blood samples obtained from healthy subjects and SMA patients, respectively.
  • ⁇ represents results obtained using blood samples obtained from adults, and ⁇ represents results obtained using blood samples obtained from infants to children.
  • FIG. 8 is a graph showing the fluorescence intensity of the nuclear structure (spot) of the SMN protein measured by imaging flow cytometry using blood samples obtained from healthy subjects and SMA patients, respectively.
  • ⁇ represents results obtained using blood samples obtained from adults, and ⁇ represents results obtained using blood samples obtained from infants to children.
  • a sample derived from blood obtained from a subject is used.
  • a blood sample is most suitable as a sample because it is less invasive to a patient.
  • the subject is, for example, a childhood-onset SMA patient, an adult-onset SMA patient, a carrier, or a person who is neither an SMA patient nor a carrier (normal person, healthy person), and is not particularly limited.
  • Childhood-onset SMA patients include type I SMA patients, type II SMA patients, and type III SMA patients.
  • a sample derived from blood obtained from a subject used in the method of the present invention may be any sample containing nucleated cells derived from blood.
  • the sample used in the method of the present invention may be a sample obtained by collecting blood obtained from a subject in a blood collection tube as it is, or from a subject as long as it is treated so as to contain blood-derived nucleated cells.
  • the obtained blood may be processed in any way.
  • a sample containing nucleated cells derived from blood used in the method of the present invention blood obtained from a subject is centrifuged and separated as peripheral blood mononuclear cells (PBMC), or red blood cells in blood Those containing nucleated cells obtained by hemolysis and then precipitated by centrifugation can be used, but are not limited thereto.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • a technique conventionally known in the technical field of the present invention can be used to process blood obtained from a subject to obtain a sample containing nucleated cells derived from blood.
  • a method for obtaining a sample containing nucleated cells derived from blood by processing blood obtained from a subject a method that has good cell yield and that does not damage cells as much as possible is preferable.
  • the amount of blood collected from the subject can be reduced, and the stress applied to the blood cells is also small.
  • the method of the present invention it is preferable to obtain a sample containing nucleated cells derived from blood by processing blood obtained from a subject using a hemolysis method.
  • a hemolysis method it is advantageous to use a hemolysis method because the amount of blood collected from a child patient or the like can be reduced.
  • the blood obtained from the subject Prior to the step of labeling one or more surface antigen markers of nucleated cells with one or more labeled antibodies in a sample containing nucleated cells derived from blood, the blood obtained from the subject is subjected to hemolysis.
  • the hemolysis method may be used after the labeling step.
  • the sample containing blood-derived nucleated cells includes those obtained by separating blood-derived nucleated cells by a conventionally known technique as described above and then lymphoblastizing the cells. Samples may be used.
  • lymphoblastization a technique conventionally known in the technical field of the present invention can be used.
  • One embodiment of the method of the present invention includes the step of centrifuging blood to provide a sample containing nucleated cells derived from blood. Centrifugation of blood can be performed, for example, at about 1400 to about 3200 rpm (190-1000 ⁇ g) for about 5 to about 20 minutes. If the step of centrifuging blood to prepare a sample containing nucleated cells derived from blood includes the separation of nucleated cells by hemolysis, centrifugation after hemolysis with a hemolyzing agent is about 1400 to about 2300 rpm, Preferably it is performed for 5 to about 8 minutes.
  • centrifugation after hemolysis with a hemolyzing agent is performed at about 1400 to about 2300 rpm. (190-510 xg), preferably for about 5 to about 8 minutes.
  • the step of preparing a sample containing nucleated cells derived from blood by centrifuging blood includes separation of PBMC, blood is collected in a heparin tube and overlaid with ficoll solution, or the blood is BD vacutainer (registered trademark) After placing in the CPT TM mononuclear cell collection tube, centrifugation is preferably performed at about 2000 to about 3200 rpm (390 to 1000 x g) for about 15 to about 20 minutes.
  • the step of preparing a sample containing nucleated cells derived from blood by centrifuging blood can be performed using a technique conventionally known in the technical field of the present invention.
  • the amount of blood derived from the subject used in the method of the present invention is not particularly limited as long as the expression analysis of the nuclear structure of the SMN protein is possible, and is not particularly limited, for example, about 0.5 mL or more, preferably about 1 mL or more, about 3 mL or less, preferably about 2 mL or less.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • a blood volume of at least 4 mL is required. Therefore, one embodiment of the present invention is advantageous in that it requires less blood volume.
  • the sample used for the method of this invention should just contain the nucleated cell derived from blood.
  • whole blood peripheral blood
  • whole blood contains a diverse and so-called heterogeneous cell population.
  • human blood cell fraction constantly changes, it is preferable to minimize the influence of fluctuations in the blood cell fraction on the blood SMN protein expression level. Therefore, in the method for analyzing the expression of the nuclear structure of the SMN protein of the present invention, one or more surface antigen markers of nucleated cells are used in a sample containing nucleated cells derived from blood, and one or more labeled antibodies are used. And labeling.
  • nucleated cells in the blood are classified into a plurality of clusters (cell population), for example, 2 to 4 clusters, and the SMN protein expression level for each cluster Can be measured. It is also possible to classify cell populations based on side scatter (SSC) in conjunction with surface antigen markers. Thereby, the influence on the blood SMN protein expression level by the fluctuation
  • the method for analyzing the expression of the nuclear structure of the SMN protein of the present invention includes a step of labeling the SMN protein in the nucleated cell and a step of labeling the nucleus of the nucleated cell. The three steps including the step of labeling one or more surface antigen markers of nucleated cells with one or more labeled antibodies in a sample containing nucleated cells derived from can be performed in any order.
  • the surface antigen marker that can be used in the method of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include CD45, CD66, CD14, CD3, CD19, CD33, CD123, CD34, CD11c, CD25, and HLA-DR. Can be mentioned.
  • the surface antigen markers may be used alone or in combination of two or more.
  • CD45 is generally known as a panblood cell marker
  • CD66 is a neutrophil marker
  • CD3 is a T cell marker
  • CD19 is a B cell marker
  • CD14 is a monocyte marker.
  • One embodiment of the method of the invention may comprise selecting a cell population of monocytes or a cell population comprising monocytes.
  • Cell populations containing monocytes include monocytes>95%,>90%,>85%,>80%,>75%,>70%,>65%,>60%,>55%,> 50% May be included.
  • the normal population and the SMA patient are analyzed. A significant difference is also observed in the fluorescence intensity of the nuclear structure (spot) of the SMN protein, which is more preferable.
  • One embodiment of the method of the invention may comprise sorting a cell population of B cells or a cell population comprising B cells.
  • Cell populations containing B cells include 95% or more, 90% or more, 85% or more, 80% or more, 75% or more, 70% or more, 65% or more, 60% or more, 55% or more, 50% or more May be included.
  • One embodiment of the method of the invention may comprise sorting a cell population of T cells or a cell population comprising T cells. Cell populations containing T cells are 95% or more, 90% or more, 85% or more, 80% or more, 75% or more, 70% or more, 65% or more, 60% or more, 55% or more, 50% or more May be included.
  • One embodiment of the method of the invention may comprise selecting a cell population of granulocytes or a cell population comprising granulocytes.
  • Cell populations containing granulocytes are granulocytes of 95% or more, 90% or more, 85% or more, 80% or more, 75% or more, 70% or more, 65% or more, 60% or more, 55% or more, 50% or more May be included.
  • the method for analyzing the expression of an SMN protein nuclear structure of the present invention includes a step of labeling an SMN protein in a nucleated cell in a sample.
  • the SMN protein is a protein expressed by the SMN gene that is a causative gene of SMA, and is considered to be involved in the formation of motor neurons.
  • the SMN gene includes the SMN1 gene and the SMN2 gene. Both are present in the long arm 5q13 of chromosome 5, and the SMN2 gene differs from the SMN1 gene by one base in the coding region.
  • SMN1 mRNA transcribed from the SMN1 gene, which is translated into normal SMN protein is 100%
  • the transcript of the SMN2 gene is approximately 10% of full-length SMN2 mRNA, and exon 7 deletion is observed.
  • Abbreviated SMN2 mRNA produces a non-functional protein and does not help in the formation of motor neurons.
  • a technique conventionally known in the technical field of the present invention can be used to label the SMN protein in a sample containing blood-derived nucleated cells.
  • the labeling of the SMN protein is not limited as long as it can label the normal SMN protein translated from the full-length SMN1 mRNA and the full-length SMN2 mRNA, but also labels the non-functional protein translated from the truncated SMN2 mRNA. It does not matter.
  • labeling reagents include, but are not limited to, enzymes, dyes, fluorescent dyes, biotin, radioactive substances, various peptides, and amino acid linkers.
  • the labeling reagent is a fluorescent dye, and examples thereof include fluorescein, rhodamine, coumarin, imidazole derivatives, indole derivatives, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7, APC, PE, DyLight, AlexaFluor and the like.
  • the anti-SMN antibody used as the primary antibody or the anti-SMN antibody bound to the labeling reagent used in the method of the present invention may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and a commercially available product can be used.
  • commercially available anti-SMN antibodies include Milli-Mark TM manufactured by Millipore, antibodies provided by BD, Abcam, and Sigma-Aldrich.
  • the method for analyzing the expression of the nuclear structure of the SMN protein of the present invention includes a step of labeling the nucleus of a nucleated cell in a sample.
  • a method of labeling nuclei techniques conventionally known in the technical field of the present invention can be used.
  • labeling with a fluorescent dye labeling with an antibody that recognizes a cell nucleus-specific protein, and the like can be mentioned.
  • a fluorescent dye when used to label the nucleus of a nucleated cell in a sample containing nucleated cells derived from blood, for example, as a reagent, Hoechst 33342, Hoechst 33258, 4, 6-diamino- Examples include 2-phenylindole (DAPI), propidium iodide (PI), fluorescently labeled antihistone antibody, and fluorescently labeled antilamin antibody.
  • DAPI 2-phenylindole
  • PI propidium iodide
  • fluorescently labeled antihistone antibody fluorescently labeled antilamin antibody.
  • the fluorescent dye that labels the SMN protein may be referred to as a first fluorescent dye
  • the fluorescent dye that labels the nucleus may be referred to as a second fluorescent dye.
  • the step of labeling the SMN protein in the nucleated cell comprises labeling the SMN protein with a first fluorescent dye, such as AlexaFluor 488, and Preferably, the step of labeling the nucleus of the nucleated cell comprises labeling the nucleus with a second fluorescent dye, such as Hoechst 33342.
  • a first fluorescent dye such as AlexaFluor 488
  • a second fluorescent dye such as Hoechst 33342.
  • the nucleus and the SMN protein of nucleated cells are labeled and one or more surface antigen markers labeled with one or more labeled antibodies or 1 Selecting a cell population from a plurality of cell populations classified based on one or more surface antigen markers labeled with one or more labeled antibodies and side scatter (SSC).
  • the cell population labeled with nuclear and SMN protein is 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% or more of intact cells (live cells). , 65% or more, 60% or more, 55% or more or 50% or more.
  • a cell population labeled with nuclei and SMN proteins in nucleated cells is labeled with a fluorescent dye as described in Example 1 herein below.
  • a fluorescent dye as described in Example 1 herein below.
  • Such cells are recognized as intact cells.
  • cells that maintain the cell morphology and maintain the aspect ratio (aspect ratio) and the surface area by microscopic observation are recognized as intact cells.
  • Discrimination of intact cells or cell populations containing intact cells has different criteria depending on the method of labeling nuclei in nucleated cells and SMN proteins, but the nuclei in nucleated cells and the This can be appropriately performed based on the detection result of the SMN protein.
  • the method for analyzing the expression of the nuclear structure of the SMN protein of the present invention includes the step of analyzing the expression of the nuclear structure of the SMN protein based on the label for the SMN protein for the cell population selected as described above.
  • the step of selecting the cell population and the step of analyzing the expression of the nuclear structure of the SMN protein are performed by imaging flow cytometry using an objective lens of 40 times or more.
  • the method of the present invention based on one or more surface antigen markers labeled with one or more labeled antibodies or the surface antigen markers and side scatter (SSC), a desired
  • the expression analysis of the nuclear structure of the SMN protein can be performed by focusing on a cell population mainly containing the blood cell component (desired blood cell fraction). Therefore, the method of the present invention can be widely used in the functional analysis of SMN protein, and can greatly contribute to the diagnostic technique and therapeutic technique of SMA.
  • the magnification of the objective lens to be used is preferably 50 times or more, more preferably 60 times or more, and the upper limit thereof is arbitrary as long as it is within a range where expression analysis of the nuclear structure of the SMN protein is possible.
  • the nuclear structure of the SMN protein observed in the form of spots is simply referred to as a “spot”.
  • spot in view of the fact that the nuclear structure of the SMN protein was observed in the form of spots, in this specification, the nuclear structure of the SMN protein observed in the form of spots is simply referred to as a “spot”.
  • the definition of the spot is, for example, 1) in the nucleus, 2) the size is 0.34 to 3.07 ⁇ m 2 , 3) the fluorescence intensity is 5 times more than the background, and 4) the aspect ratio is 0.5 to One that is 1.0.
  • spot for example, 1) it is in the nucleus, 2) the size is 0.34 to 8.54 ⁇ m 2 , and 3) it shows 5.5 times or more fluorescence intensity compared to the background 4) Those having an aspect ratio of 0.4 to 1.0 can be mentioned.
  • the step of analyzing the expression of the nuclear structure of the SMN protein based on the label for the SMN protein comprises quantifying the nuclear structure of the SMN protein.
  • the method of the present invention can be applied to the nuclear structure of the SMN protein between, for example, an SMA patient, a carrier, and a normal person, specifically, between an SMA patient and a carrier or between an SMA patient and a normal person.
  • a step of comparing the quantitative results may be included. Comparison shows that there is a difference in the quantification results (expression level or localization) of SMN protein between SMA patients and carriers, and between SMA patients and normal individuals. Each can be classified.
  • the expression analysis method for the nuclear structure of the SMN protein of the present invention can also be used in a method for screening a drug for treating SMA.
  • operations usually performed when detecting protein expression in cells such as a step of washing cells with a reagent such as a phosphate buffer, can be appropriately performed.
  • a sample containing blood-derived nucleated cells is obtained from the subject, and the expression analysis of the nuclear structure of the SMN protein is performed.
  • the process comprises quantifying the nuclear structure of the SMN protein;
  • a step of comparing the result obtained by the quantification with a control may be included.
  • the control can be selected from the following (a) to (c): (a) When the subject is an SMA patient, the control uses the blood obtained from the subject except for blood obtained from a normal person or a carrier.
  • the control uses the blood obtained from the subject except for blood obtained from the SMA patient, and the nuclear structure of the SMN protein.
  • “measured in the same way” means that, in comparing the quantification result (expression level or localization) of the nuclear structure of the SMN protein, the quantification of the nuclear structure of the SMN protein is substantially performed. Changes that do not affect are understood to be allowed, and for example, it does not mean that the process is completely consistent up to the step of washing the cells. Quantification of the nuclear structure of the SMN protein can be appropriately performed using techniques conventionally known in the technical field of the present invention, such as a calibration curve method. In addition, it can be said that one embodiment of the present invention relates to a method for diagnosing SMA by including a comparison step as described above and a step of diagnosing a subject based on the comparison result.
  • an embodiment of the present invention includes a comparison step as described above, and a step of selecting a SMA therapeutic agent or a treatment candidate drug based on the comparison result, whereby the SMA therapeutic agent or treatment It can also be said that it relates to a screening method for candidate drugs.
  • Example 1 Expression analysis of nuclear structure of SMN protein Sample Preparation Samples were prepared according to the following staining protocol. Unless otherwise stated, all procedures were performed at room temperature. (1) 1.5 mL of peripheral blood obtained from the subject was transferred to a 15 mL conical tube. (2) 30 ⁇ L of Fc receptor blocking reagent (Clear Back, MTG-001, MBL) was added to peripheral blood in a conical tube and incubated for 15 minutes in the dark. (3) 5 ⁇ L of monoclonal antibodies (obtained from BioLegend, respectively) against surface antigens (CD19, CD33, CD3) were added to the peripheral blood in the conical tube after incubation according to Tables 1 and 2 below. Incubated for minutes.
  • the cells were resuspended with 1 mL of a saponin-containing cell membrane permeation reagent (BD Phosflow TM ; 557885 (also referred to as BD Phosflow TM Perm / Wash Buffer I)) and incubated for 20 minutes in the dark. (10) Centrifugation was performed in the same manner as in (6) above. (11) The cells were washed with 2 mL of cell membrane permeation reagent (BD Phosflow TM ; 557885). (12) The cells were resuspended with about 100 ⁇ L of cell membrane permeation reagent (BD Phosflow TM ; 557885).
  • BD Phosflow TM saponin-containing cell membrane permeation reagent
  • the cells were resuspended in 50 ⁇ L of diluted Hoechst 33342 (0.25 ⁇ g / mL PBS) prepared by diluting Hoechst 33342 (molecular probe®). (19) Incubated for 15 minutes in the dark. (20) 500 ⁇ L of PBS ( ⁇ ) was added and centrifuged as in (16) above. (21) The cells were resuspended with 90 ⁇ L of PBS ( ⁇ ) and divided into three tubes so that each tube contained 30 ⁇ L of the cell suspension.
  • Imaging flow cytometry Imaging flow cytometry (ImageStream (registered trademark) x Mark II imaging flow cytometer, Amnis). The magnification of the objective lens was 60 times, and a total of 50,000 or more cells were subjected to imaging flow cytometry.
  • Normal (healthy) 2 adult women (38-51 years old), 8 children (1-7 years old) including men and women
  • SMA patients 1 adult male (21 years old), 19 infants including males and females (2 months to 8 years old)
  • FIG. 1 is a graph plotting fluorescence intensity measured by imaging flow cytometry using a blood sample obtained from a normal person, but also when measured using a blood sample obtained from a patient. Similarly, the nucleated cell group was divided into 3 groups. FIG. 1 shows the results obtained from one sample, and the nucleated cell group was similarly divided into three groups for each sample.
  • V Cell populations mainly containing R1 lymphocytes are expanded with cell surface antigens CD3 and CD19 expression and divided into two groups: a cell population mainly containing CD3 positive T cells and a cell population mainly containing CD19 positive B cells. It was.
  • R2 represents a cell population mainly containing CD3 positive T cells
  • R3 represents a cell population mainly containing CD19 positive B cells.
  • R2 CD3-positive T cells predominantly containing cell population (SSC low, CD33 -, CD3 +)
  • R3 CD19-positive B cells mainly comprising cell population (SSC low, CD33 -, CD19 +)
  • R4 Cell group mainly containing monocytes (SSC intermediate , CD33 ++ )
  • R5 Cell group mainly containing neutrophils (SSC intermediate , CD33 intermediate )
  • FIGS. 3 and 4 are cytophotographs of cell groups mainly containing monocytes in blood samples obtained from SMA patients and healthy subjects (controls), respectively, and the SMN protein is shown in green fluorescence.
  • the “spot” here means a nuclear structure of the SMN protein observed in a spot shape.
  • the definition of “spot” is 1) in the nucleus, 2 ) The size is 0.34 to 3.07 ⁇ m 2 , 3) it is 5 times more intense than the background, and 4) the aspect ratio is 0.5 to 1.0.
  • (I) Average value of the number of spots The average value of the number of spots in the cell group exhibiting a predetermined fluorescence intensity was calculated as follows. (Intranuclear aiming adjustment) The following operations were performed in order to carry out analysis in the nucleus more accurately. 1) The focus and contrast parameters in the channel detecting Hoechst 33342 stained in the nucleus were developed and limited to the cell group at the peak of both parameters. 2) Using the fluorescence intensity of Hoechst 33342 as an index from the above cell group, more than 1000 cells having the same fluorescence intensity were selected. This was defined as the number of aiming adjusted cells.
  • (Ii) Ratio of spot positive cells The ratio of spot positive cells in a cell group exhibiting a predetermined fluorescence intensity was calculated as follows. (Intranuclear aiming adjustment) The following operations were performed in order to carry out analysis in the nucleus more accurately. 1) The focus and contrast parameters in the channel detecting Hoechst 33342 stained in the nucleus were developed and limited to the cell group at the peak of both parameters. 2) Using the fluorescence intensity of Hoechst 33342 as an index from the above cell group, more than 1000 cells having the same fluorescence intensity were selected. This was defined as the number of aiming adjusted cells.
  • the average value of the number of spots, the ratio of spot positive cells, the fluorescence intensity of the spot positive cells, and the fluorescence intensity of the spots were compared at a significance level of 0.01 for normal human blood cells and blood cells derived from SMA patients. Significant differences were observed. Furthermore, when comparing the fluorescence intensity of the spot positive cells with the fluorescence intensity of the spots, the relative ratio of normal human blood cells / blood cells derived from SMA patients is 1.35 ( 7255/5364), but according to the fluorescence intensity of the spot, the relative ratio of normal human blood cells / blood cells from SMA patients is 2.04. Therefore, it was suggested that the detection sensitivity could be further increased based on the result of the fluorescence intensity of the spot.
  • the method for analyzing the expression of the nuclear structure of the SMN protein of the present invention not only detects the expression of the nuclear structure of the SMN protein with higher reliability as a biomarker, but also in normal subjects and SMA patients. Differences can be measured with higher detection sensitivity.
  • SMA is still one of the intractable diseases designated by the country, with no fundamental cure established.
  • the present invention is extremely useful for use in the evaluation of methods that can be therapeutic methods for SMA.
  • the method of the present invention can be used for the evaluation of therapeutic agents or therapeutic candidates for SMA, and can be used for screening therapeutic agents or therapeutic candidates for SMA.
  • the present invention is also useful for use in the diagnosis of SMA.
  • the present invention can be widely used in the functional analysis of SMN protein, and can greatly contribute to the diagnostic technique and therapeutic technique of SMA. Therefore, according to the present invention, significant progress is expected in the diagnostic technique and therapeutic technique for SMA, which is one of intractable diseases.
  • the present invention is not limited to SMA, and can be expected to be applied to a technique for diagnosing or improving a disease or symptom caused by a decrease in the expression level of SMN protein.

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Abstract

本発明は、バイオマーカーとしての信頼性がより高いSMNタンパク質の核内構造体を解析できる方法を提供することを目的とする。　本発明の方法は、SMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法であって、　血液由来の有核細胞を含むサンプル中、前記有核細胞の１種以上の表面抗原マーカーを、１種以上の標識抗体を用いて標識する工程、　前記有核細胞内のSMNタンパク質を標識する工程、　前記有核細胞の核を標識する工程、　前記有核細胞のうち、核及びSMNタンパク質が標識され、かつ前記標識抗体により標識された表面抗原マーカー等に基づき分類された複数の細胞集団から１つの細胞集団を選別する工程、及び　前記選別した細胞集団について、SMNタンパク質に対する標識に基づいてSMNタンパク質の核内構造体の発現解析をする工程 を含み、所定の倍率の対物レンズを使用するイメージングフローサイトメトリーを行うことを含む。

Description

ＳＭＮタンパク質の核内構造体の発現解析方法
　本発明は、サバイバルモーターニューロン（SMN）タンパク質の核内構造体の発現解析方法に関する。
　脊髄性筋萎縮症（SMA）は、脊髄前角細胞の病変によって引き起こされる筋萎縮症であり、体幹や四肢の筋力低下及び筋萎縮を特徴とする下位運動ニューロン徴候を示す。SMAは、発症年齢と重症度によってI型からIV型に分類され、生後６ヶ月までに発症するI型：重症型（ウェルドニッヒ・ホフマン病とも言う）、１歳６ヶ月までに発症するII型：中間型（デュボヴィッツ病とも言う）、及び１歳６ヶ月以降に発症するIII型：軽症型（クーゲルベルグ・ウェランダー病とも言う）が、小児期発症SMAである。一方、２０歳以降に発症するIV型は、成人発症SMAである。
　I型SMAは、SMAの約30％を占めており、６ヶ月以下で発症する。その症状は極めて深刻で、生涯座位保持不可能であり、人工呼吸を使わずに２歳以上生存できることは稀である。II型SMAは、生涯起立及び歩行は不可能であり、III型SMAは、自立歩行を獲得するものの、次第に転びやすい、歩けない又は立てないという症状が現れる。しかしながら、依然としてSMAの根本治療法は確立しておらず、SMAは国が指定する難病のうちの１つである。
　多くの小児期発症SMAの原因遺伝子は、５番染色体長腕5q13に存在するSMN１遺伝子である。多くの小児期発症SMAでは、SMN１遺伝子の欠失又は変異が認められ、小児期発症SMAは常染色体劣性遺伝性疾患として認識されている。SMN１遺伝子からは、SMNタンパク質が発現され、SMNタンパク質が運動ニューロンの形成等に関与していると考えられている。
　また、SMN１遺伝子が存在する５番染色体の同領域には、SMN１遺伝子とコーディング領域の塩基が１つだけ異なるSMN2遺伝子が存在している。小児期発症SMA患者では、SMN１遺伝子が欠失又は変異し、SMN１遺伝子由来のSMNタンパク質が低下している一方で、SMN2遺伝子は正常に機能している。そのため、小児期発症SMA患者においても、SMN2遺伝子由来のSMNタンパク質は発現しており、このSMN2遺伝子由来のSMNタンパク質の発現量に応じて、症状の重症度が異なると考えられている。
　しかしながら、SMN１遺伝子の転写産物は全長SMN1mRNAの１種類であるのに対し、SMN2遺伝子の転写産物は２種類存在し、SMN１遺伝子から転写される全長SMN1mRNAの量を100％とすると、全長SMN2mRNAがおよそ10％であり、エクソン７の欠失が認められる短縮型SMN2mRNAがおよそ90%である。短縮型SMN2mRNAは非機能的なタンパク質に翻訳され、全長SMN2mRNAのみが正常にSMNタンパク質に翻訳されるため、SMN１遺伝子が欠失又は変異している小児期発症SMA患者においては、SMNタンパク質の発現量が正常者に比べて低く、正常者の10％～20％ほどしかない。そのため、SMN１遺伝子が欠失又は変異することにより、筋力低下及び筋萎縮が生じることとなる。
　小児期発症SMA患者よりも数は少ないが、成人発症SMA患者においても、上記のようなSMN１遺伝子の欠失又は変異が認められる場合があり、やはりSMNタンパク質の発現量に応じて、症状の重症度が異なると考えられている。
　SMN１遺伝子が欠失しているSMA患者において、SMN2遺伝子は、SMN１遺伝子に置き換わって存在することがある。この場合、SMN2遺伝子は１つの染色体上に２コピー存在することとなり、SMN2遺伝子由来のSMNタンパク質の発現量もコピー数に応じて多くなる。SMA患者において、SMN2遺伝子由来のSMNタンパク質の発現量が増えれば増えるほど、症状は軽くなることがわかっている。
　以上のように、SMNタンパク質の発現量は、SMAと密接に関連しており、SMNタンパク質は、SMA、特には小児期発症SMAの診断のためや、薬剤の効果を的確に判断するための有用なバイオマーカーとなる可能性があると考えられている。しかしながら、SMA患者においても、SMNタンパク質の発現自体は認められ、SMNタンパク質をSMAの有用なバイオマーカーとして利用するためには、正常者と患者とを比較した場合のSMNタンパク質発現レベルの差異を検出できるほどの鋭敏さが必要となる。
　また、SMAは常染色体劣性遺伝性疾患であり、１対の常染色体のうちの一方においてのみSMN１遺伝子が欠失又は変異している場合には、何ら筋力低下及び筋萎縮の症状は現れず、保因者ということになる。保因者においては、患者よりもSMNタンパク質の発現量は高いものの、保因者と患者との間では、正常者と患者との間のSMNタンパク質の発現量の差ほど大きな差があるわけではないと考えられる。従って、SMNタンパク質をSMAの有用なバイオマーカーとして利用するためには、保因者と患者とを比較した場合のSMNタンパク質発現レベルの差異を検出できるほどの更なる鋭敏さが必要となる。
　実際に、末梢血単核球細胞を用いた、ELISA法によるSMNタンパク質の定量解析が試みられている（非特許文献１）。しかしながら、Kobayashiらは、小児期発症SMA患者と保因者との間において、ELISA法ではSMNタンパク質発現レベルに有意差が認められないという結果が得られたことを報告している。更に、Kobayashiらは、SMNタンパク質発現レベルは、SMAの診断において信頼性のある指標とはならないとさえ開示している。
　また、ELISA法によるSMNタンパク質の定量解析においては、末梢血単核球細胞（PBMC）を用いることを必要とし、患者らから得られた血液サンプルを遠心分離するなどの手間がかかる上に、細胞の収率も低下する。そのため、PBMCを用いるELISA法によるSMNタンパク質の定量では、必要とされる採血量も増大する。
　このような状況において、本発明者らはSMNタンパク質の発現を検出する方法を見出し、SMNタンパク質を小児期発症SMAの有用なバイオマーカーとして利用し得ることを報告した（特許文献１）。
　しかしながら、特許文献１には、SMNタンパク質の細胞内での局在化や、SMNタンパク質の核内構造体については明らかにされていない。
国際公開第2015/152410号
Dione T. Kobayashi et al., Plos one, November 2012, Vol.7, Issue 11, e50763, Evaluation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Processing and Analysis for Survival Motor Neuron Protein
　本発明は、血液細胞サンプルを用いて、バイオマーカーとしての信頼性がより高いSMNタンパク質の核内構造体を解析できる方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、SMNタンパク質の発現を検出する細胞について、血液細胞中から特定の細胞集団を選別して、その細胞集団においてSMNタンパク質の発現を検出することで、SMNタンパク質発現レベルの検出感度を高めるとともに、イメージングフローサイトメトリーによりSMNタンパク質の核内構造体の解析が可能であることを新たに見出した。
　本発明の一態様において、
　SMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法であって、
　血液由来の有核細胞を含むサンプル中、前記有核細胞の１種以上の表面抗原マーカーを、１種以上の標識抗体を用いて標識する工程、
　前記有核細胞内のSMNタンパク質を標識する工程、
　前記有核細胞の核を標識する工程、
　前記有核細胞のうち、核及びSMNタンパク質が標識され、かつ前記１種以上の標識抗体により標識された前記１種以上の表面抗原マーカー又は前記１種以上の標識抗体により標識された前記１種以上の表面抗原マーカーと側方散乱（SSC）とに基づき分類された複数の細胞集団から１つの細胞集団を選別する工程、及び
　前記選別した細胞集団について、SMNタンパク質に対する標識に基づいてSMNタンパク質の核内構造体の発現解析をする工程
を含み、前記細胞集団を選別する工程及び前記SMNタンパク質の核内構造体の発現解析をする工程を、４０倍以上の対物レンズを使用するイメージングフローサイトメトリーにより行う、前記方法が提供される。
　本発明の一態様では、SMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法において、有核細胞内のSMNタンパク質を標識する工程が、SMNタンパク質を第１の蛍光色素により標識することを含み、かつ、SMNタンパク質の核内構造体の発現解析をする工程が、第１の蛍光色素が発する蛍光強度を測定することを含む。
　本発明の一態様では、SMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法において、有核細胞内のSMNタンパク質を標識する工程が、SMNタンパク質を第１の蛍光色素により標識することを含み、かつ、有核細胞の核を標識する工程が、核を第２の蛍光色素により標識することを含む。
　本発明の一態様では、SMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法において、血液由来の有核細胞を含むサンプルを赤血球溶血処理に付す工程を更に含む。
　本発明の一態様では、SMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法において、血液由来の有核細胞を含むサンプルが被験者から得られたものであり、
　SMNタンパク質の核内構造体の発現解析をする工程が、SMNタンパク質の核内構造体を定量することを含み、
　前記定量により得られた結果を、以下の(a)～(c)より選択されるコントロールと比較する工程を含む：
　(a) 前記被験者がSMA患者である場合には、前記コントロールは、正常者又は保因者から得られる血液を用いること以外は、前記被験者から得られた血液を用いてSMNタンパク質の核内構造体を定量した方法と同様にして得られた結果であり、
　(b) 前記被験者が正常者又は保因者である場合には、前記コントロールは、SMA患者から得られる血液を用いること以外は、前記被験者から得られた血液を用いてSMNタンパク質の核内構造体を定量した方法と同様にして得られた結果であり、又は
　(c) 前記被験者がSMAの治療薬又は治療候補薬を投与された者である場合には、前記コントロールは、前記SMAの治療薬又は治療候補薬の投与前の前記被験者から得られた血液を用いること以外は、前記投与後の前記被験者から得られた血液を用いてSMNタンパク質の核内構造体を定量した方法と同様にして得られた結果である。
　本発明の一態様によれば、血液細胞サンプルを用いて、バイオマーカーとしての信頼性がより高いSMNタンパク質の核内構造体を解析することができる。
　また、ひいては、本発明の一態様によれば、SMA患者と正常者又は保因者との間において、SMNタンパク質の核内構造体の発現における差異を検出できる方法を提供することができる。
　更に、本発明の一態様によれば、血液約500μLでSMNタンパク質の核内構造体の発現解析が可能であり、SMAの治療薬又は治療候補薬の試験においてSMNタンパク質の核内構造体をバイオマーカーとする際、特に、小児の患者から血液を採取する際に有益な方法を提供することができる。
図１は、正常者から得られた血液サンプルを用いて、イメージングフローサイトメトリーにより測定した蛍光強度をプロットしたグラフを表す。縦軸は、側方散乱（SSC）を表し、横軸は、抗CD33抗体に結合した蛍光色素の発する蛍光強度を表す。 図２は、図１においてＲ１で示されるクラスターについて、更に細胞集団を分類したものであり、イメージングフローサイトメトリーにより測定した蛍光強度をプロットしたグラフを表す。縦軸は、抗CD19抗体に結合した蛍光色素の発する蛍光強度を表し、横軸は、抗CD3抗体に結合した蛍光色素の発する蛍光強度を表す。 図３は、SMA患者から得られた血液サンプルを用いて、イメージングフローサイトメトリーにより撮影した細胞写真である。 図４は、健常者（コントロール）から得られた血液サンプルを用いて、イメージングフローサイトメトリーにより撮影した細胞写真である。 図５は、健常者及びSMA患者からそれぞれ得られた血液サンプルを用いて、イメージングフローサイトメトリーにより測定したSMNタンパク質の核内構造体（スポット）数の平均値を示したグラフである。△は成人から得られた血液サンプルを用いて得た結果を表し、○は乳児～小児から得られた血液サンプルを用いて得た結果を表す。 図６は、健常者及びSMA患者からそれぞれ得られた血液サンプルを用いて、イメージングフローサイトメトリーにより測定したSMNタンパク質の核内構造体（スポット）陽性細胞の割合を示したグラフである。△は成人から得られた血液サンプルを用いて得た結果を表し、○は乳児～小児から得られた血液サンプルを用いて得た結果を表す。 図７は、健常者及びSMA患者からそれぞれ得られた血液サンプルを用いて、イメージングフローサイトメトリーにより測定したSMNタンパク質の核内構造体（スポット）陽性細胞の蛍光強度を示したグラフである。△は成人から得られた血液サンプルを用いて得た結果を表し、○は乳児～小児から得られた血液サンプルを用いて得た結果を表す。 図８は、健常者及びSMA患者からそれぞれ得られた血液サンプルを用いて、イメージングフローサイトメトリーにより測定したSMNタンパク質の核内構造体（スポット）の蛍光強度を示したグラフである。△は成人から得られた血液サンプルを用いて得た結果を表し、○は乳児～小児から得られた血液サンプルを用いて得た結果を表す。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　本発明のSMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法では、被験者から得た血液に由来するサンプルが用いられる。血液サンプルは、患者への侵襲が少なく、試料として最も適している。被検者は、例えば、小児期発症SMA患者、成人発症SMA患者、保因者、又はSMA患者でも保因者でもない者（正常者、健常者）であり、特に限定されるものではない。小児期発症SMA患者には、I型SMA患者、II型SMA患者及びIII型SMA患者が含まれる。
　本発明の方法に用いられる、被験者から得た血液に由来するサンプルは、血液由来の有核細胞を含むものであればよい。本発明の方法に用いられるサンプルは、被験者から得た血液を採血管に採取したものをそのまま使用してもよいし、血液由来の有核細胞を含むように処理したものである限り、被験者から得た血液をどのように処理したものであってもよい。例えば、本発明の方法に用いられる血液由来の有核細胞を含むサンプルとして、被験者から得た血液を遠心分離し、末梢血単核球細胞（PBMC）として分離したものや、血液中の赤血球を溶血させ、次いで遠心分離により沈殿させて得た有核細胞を含むものを使用することができるが、これらに限定されるものではない。
　本発明の方法において、被験者から得た血液を処理して血液由来の有核細胞を含むサンプルを得るために、本発明の技術分野において従来知られている技術を用いることができる。
　本発明の方法において、被験者から得た血液を処理して血液由来の有核細胞を含むサンプルを得る方法としては、細胞の収率が良く、できるだけ細胞を傷つけない方法が好ましい。例えば、血液中の赤血球を溶血させ、次いで遠心分離により沈殿させた有核細胞を分離する方法（溶血法）では、被験者からの採血量が少なくてすみ、かつ血液細胞に対して与えるストレスも小さい。そのため、本発明の方法において、溶血法を用いて、被験者から得た血液を処理して血液由来の有核細胞を含むサンプルを得ることが好ましい。特に、SMAの治療薬又は治療候補薬の試験においてSMNタンパク質をバイオマーカーとして利用する際に、溶血法を用いれば、小児の患者等からの採血量が少なくてすむため有利である。
血液由来の有核細胞を含むサンプル中、有核細胞の１種以上の表面抗原マーカーを、１種以上の標識抗体を用いて標識する工程の前に、被験者から得た血液を溶血法を用いて処理してもよいし、当該標識工程の後に、溶血法を用いてもよい。
　また、本発明の方法において、血液由来の有核細胞を含むサンプルとして、上記の通り従来知られている技術により血液由来の有核細胞を分離した後、細胞をリンパ芽球化したものを含むサンプルを使用してもよい。リンパ芽球化の処理についても、本発明の技術分野において従来知られている技術を用いることができる。
　本発明の方法の一実施態様では、血液を遠心分離して血液由来の有核細胞を含むサンプルを準備する工程を含む。血液の遠心分離は、例えば、約1400～約3200rpm（190～1000 x g）で、約5～約20分間行うことができる。
　血液を遠心分離して血液由来の有核細胞を含むサンプルを準備する工程が、溶血法による有核細胞の分離を含む場合、溶血剤による溶血後の遠心分離は約1400～約2300rpmで、約5～約8分間行うことが好ましい。有核細胞の１種以上の表面抗原マーカーを、１種以上の標識抗体を用いて標識する工程の後に溶血法を用いる場合も同様に、溶血剤による溶血後の遠心分離は約1400～約2300rpm（190～510 x g）で、約5～約8分間行うことが好ましい。
　血液を遠心分離して血液由来の有核細胞を含むサンプルを準備する工程が、PBMCの分離を含む場合、ヘパリン管に採血してフィコール液と重層した後、若しくは血液をBDバキュテイナ（登録商標）CPTTM単核球分離用採血管に入れた後、遠心分離は約2000～約3200rpm（390～1000 x g）で、約15～約20分間行うことが好ましい。
　血液を遠心分離して血液由来の有核細胞を含むサンプルを準備する工程は、本発明の技術分野において従来知られている技術を用いて行うことができる。
　本発明の方法において用いられる、被験者由来の血液の量は、SMNタンパク質の核内構造体の発現解析が可能な量であればよく、特に限定されないが、例えば、約0.5mL以上、好ましくは約1mL以上であり、約3mL以下、好ましくは約2mL以下である。なお、従来の、末梢血単核球細胞（PBMC）を用いた、ELISA法によるSMNタンパク質の定量解析では、少なくとも4mLの血液量が必要とされる。従って、本発明の一実施態様では、必要とされる血液量が少ない点で有利である。
　上述したとおり、本発明の方法に用いられるサンプルは、血液由来の有核細胞を含むものであればよい。しかしながら、全血（末梢血）中にはあらゆる有核細胞が含まれるため、全血は、多様性に富む、いわば不均一な細胞集団を含むものと言える。また、ヒトの血液細胞分画は常に変動するものであるため、血液細胞分画の揺らぎによる血中SMNタンパク質発現量への影響を最小限に抑えることが好ましい。
　そこで、本発明のSMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法は、血液由来の有核細胞を含むサンプル中、有核細胞の１種以上の表面抗原マーカーを、１種以上の標識抗体を用いて標識する工程を含む。このように標識抗体を用いて表面抗原マーカーを標識することにより、血液中の有核細胞を複数のクラスター（細胞集団）、例えば２～４つのクラスター、に分類し、クラスターごとにSMNタンパク質発現量を測定することができる。また、表面抗原マーカーと併せて側方散乱（SSC）に基づいて、細胞集団を分類することもできる。これにより、血液細胞分画の揺らぎによる血中SMNタンパク質発現量への影響を低減することができる。
　なお、本発明のSMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法は、有核細胞内のSMNタンパク質を標識する工程と、有核細胞の核を標識する工程とを含むが、両工程と、血液由来の有核細胞を含むサンプル中、有核細胞の１種以上の表面抗原マーカーを、１種以上の標識抗体を用いて標識する工程とを合わせた３つの工程は、順不同で行い得る。
　本発明の方法において用いることのできる表面抗原マーカーは、特に限定されるものではないが、例えば、CD45、CD66、CD14、CD3、CD19、CD33、CD123、CD34、CD11c、CD25、HLA-DR等が挙げられる。本発明の方法において、表面抗原マーカーは、単独でも、２種以上を一緒に用いてもよい。このような表面抗原マーカーのうち、CD45は汎血球マーカー、CD66は好中球マーカー、CD3はT細胞マーカー、CD19はB細胞マーカー、CD14は単球マーカーとして一般に知られている。
　本発明の方法の一実施態様では、単球の細胞集団又は単球を含む細胞集団を選別することを含み得る。単球を含む細胞集団は、単球を95％以上、90%以上、85%以上、80%以上、75%以上、70%以上、65%以上、60%以上、55%以上、50%以上含み得る。本発明の方法において、単球を含む細胞集団を選別し、当該細胞集団について、SMNタンパク質に対する標識に基づいてSMNタンパク質の核内構造体の発現解析をする場合、正常者とSMA患者の間で、SMNタンパク質の核内構造体（スポット）の蛍光強度についても有意差が認められるため、より好ましい。
　本発明の方法の一実施態様では、B細胞の細胞集団又はB細胞を含む細胞集団を選別することを含み得る。B細胞を含む細胞集団は、B細胞を95％以上、90%以上、85%以上、80%以上、75%以上、70%以上、65%以上、60%以上、55%以上、50%以上含み得る。
　本発明の方法の一実施態様では、T細胞の細胞集団又はT細胞を含む細胞集団を選別することを含み得る。T細胞を含む細胞集団は、T細胞を95％以上、90%以上、85%以上、80%以上、75%以上、70%以上、65%以上、60%以上、55%以上、50%以上含み得る。
　本発明の方法の一実施態様では、顆粒球の細胞集団又は顆粒球を含む細胞集団を選別することを含み得る。顆粒球を含む細胞集団は、顆粒球を95％以上、90%以上、85%以上、80%以上、75%以上、70%以上、65%以上、60%以上、55%以上、50%以上含み得る。
　本発明のSMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法は、サンプル中の有核細胞内のSMNタンパク質を標識する工程を含む。
　SMNタンパク質は、SMAの原因遺伝子であるSMN遺伝子により発現されるタンパク質であり、運動ニューロンの形成等に関与していると考えられている。SMN遺伝子には、SMN１遺伝子とSMN2遺伝子が存在する。両者ともに５番染色体長腕5q13に存在しており、SMN2遺伝子は、SMN１遺伝子とコーディング領域の塩基が１つだけ異なっている。しかしながら、正常なSMNタンパク質に翻訳される、SMN１遺伝子から転写される全長SMN1mRNAの量を100％とすると、SMN2遺伝子の転写産物は、全長SMN2mRNAがおよそ10％であり、エクソン７の欠失が認められる短縮型SMN2mRNAがおよそ90%である。短縮型SMN2mRNAからは非機能的なタンパク質が生成され、運動ニューロンの形成には役立たない。
　本発明の方法において、血液由来の有核細胞を含むサンプル中のSMNタンパク質を標識するために、本発明の技術分野において従来知られている技術を用いることができる。ここで、SMNタンパク質の標識は、全長SMN1mRNA及び全長SMN2mRNAから翻訳される正常なSMNタンパク質を標識できるものであればよいが、短縮型SMN2mRNAから翻訳される非機能的なタンパク質をも標識するものであっても構わない。
　本発明の方法において用いられるSMNタンパク質を標識する方法としては、例えば、標識試薬と結合した抗SMN抗体を使用することや、標識試薬の結合していない一次抗体としての抗SMN抗体を使用後、標識試薬と結合した二次抗体を使用することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。標識試薬には、例えば、酵素、色素、蛍光色素、ビオチン、放射性物質、各種ペプチド、アミノ酸リンカーが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、標識試薬は蛍光色素であり、例えば、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、イミダゾール誘導体、インドール誘導体、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、APC、PE、DyLight、AlexaFluor等が挙げられる。
　本発明の方法において用いられる、標識試薬と結合した抗SMN抗体または一次抗体として用いる抗SMN抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよく、市販品を利用することができる。例えば、抗SMN抗体の市販品としては、Millipore社のMilli-MarkTMや、BD社、Abcam社、Sigma-Aldrich社から提供される抗体等が挙げられる。
　本発明のSMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法は、サンプル中の有核細胞の核を標識する工程を含む。核を標識する方法としては、本発明の技術分野において従来知られている技術を用いることができる。例えば、核を標識する方法として、蛍光色素による標識、細胞核特異的蛋白質を認識する抗体による標識等が挙げられる。
　本発明の方法において、血液由来の有核細胞を含むサンプル中の有核細胞の核を標識するために蛍光色素を用いる場合、例えば、試薬として、Hoechst 33342、Hoechst 33258、4, 6-diamino-2-phenylindole(DAPI)、Propidium iodide(PI)、蛍光標識抗ヒストン抗体、蛍光標識抗ラミン抗体等が挙げられる。
　本明細書において、SMNタンパク質を標識する蛍光色素を第１の蛍光色素と言い、核を標識する蛍光色素を第２の蛍光色素と言う場合がある。
　本発明のSMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法において、有核細胞内のSMNタンパク質を標識する工程が、SMNタンパク質を第１の蛍光色素、例えばAlexaFluor 488、により標識することを含み、かつ、有核細胞の核を標識する工程が、核を第２の蛍光色素、例えばHoechst 33342、により標識することを含むことが好ましい。
　本発明のSMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法は、有核細胞のうち、核及びSMNタンパク質が標識され、かつ１種以上の標識抗体により標識された１種以上の表面抗原マーカー又は１種以上の標識抗体により標識された１種以上の表面抗原マーカーと側方散乱（SSC）とに基づき分類された複数の細胞集団から１つの細胞集団を選別する工程を含む。
ここで、核及びSMNタンパク質が標識されている細胞集団は、インタクトな細胞（生細胞）を100％、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上、75％以上、70％以上、65％以上、60％以上、55％以上又は50％以上含む集団である。
　本発明の方法の一実施態様では、有核細胞中の核及びSMNタンパク質が標識されている細胞集団は、本明細書の下記実施例１に記載の通り核及びSMNタンパク質を蛍光色素により標識し、その蛍光強度を下記実施例１に記載の通り検出した場合、核の蛍光強度が約1×105以上であり、かつSMNタンパク質の蛍光強度が約1×103以上である細胞を含む集団である。このような細胞は、インタクトな細胞であると認められる。また、顕微鏡観察にて細胞の形態を保っており、かつアスペクト比（縦横比）と表面積を保っている細胞は、インタクトな細胞であると認められる。インタクトな細胞の判別又はインタクトな細胞を含む細胞集団の判別は、有核細胞中の核及びSMNタンパク質の標識方法によってその基準が異なるが、使用される標識試薬に基づく有核細胞中の核及びSMNタンパク質の検出結果に基づき適宜行うことができる。
　本発明のSMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法は、前述のとおり選別した細胞集団について、SMNタンパク質に対する標識に基づいてSMNタンパク質の核内構造体の発現解析をする工程を含む。
　本発明の方法において、前記細胞集団を選別する工程及び前記SMNタンパク質の核内構造体の発現解析をする工程を、４０倍以上の対物レンズを使用するイメージングフローサイトメトリーにより行う。このようなイメージングフローサイトメトリーにより、本発明の方法においては、１種以上の標識抗体により標識された１種以上の表面抗原マーカー又は当該表面抗原マーカーと側方散乱（SSC）とに基づき、所望の血球成分を主に含む細胞集団（所望の血液細胞分画）に焦点を当てて、SMNタンパク質の核内構造体の発現解析を行うことができる。そのため、本発明の方法は、SMNタンパク質の機能解析においても広く利用でき、SMAの診断技術及び治療技術に多大な貢献をもたらし得る。
　用いる対物レンズの倍率としては、５０倍以上が好ましく、６０倍以上がより好ましく、その上限は、SMNタンパク質の核内構造体の発現解析が可能な範囲内である限り任意であるが、例えば、２００倍以下、１５０倍以下、１００倍以下、８０倍以下であり得る。
　イメージンングフローサイトメトリーは、市販の装置を使用して、メーカーの取扱説明書に従って適宜行うことができる。
　なお、本発明において、SMNタンパク質の核内構造体がスポット状に観測されたことに鑑みて、本明細書において、スポット状に観測されたSMNタンパク質の核内構造体を単に「スポット」と呼ぶことがある。スポットの定義としては、例えば、１）核内にあり、２）大きさが0.34～3.07μm2であり、３）バックグラウンドと比較し5倍以上の蛍光強度を示し、４）縦横比0.5～1.0であるものが挙げられる。また、スポットの別の定義としては、例えば、１）核内にあり、２）大きさが0.34～8.54μm2であり、３）バックグラウンドと比較し5.5倍以上の蛍光強度を示し、４）縦横比0.4～1.0であるものが挙げられる。
　本発明のSMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法において、SMNタンパク質に対する標識に基づいてSMNタンパク質の核内構造体の発現解析をする工程は、SMNタンパク質の核内構造体を定量することを含んでもよい。また、本発明の方法は、例えば、SMA患者、保因者、及び正常者間、具体的にはSMA患者と保因者間又はSMA患者と正常者間で、SMNタンパク質の核内構造体の定量結果を比較する工程を含んでもよい。比較により、SMA患者と保因者、SMA患者と正常者の間でSMNタンパク質の定量結果（発現量又は局在化）に差異が認められることで、SMA患者、保因者、及び正常者をそれぞれ分類することができる。
　また、本発明のSMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法は、SMAを治療するための薬剤をスクリーニングする方法において用いることもできる。
　本発明の方法において、リン酸緩衝液等の試薬で細胞を洗浄する工程等、通常、細胞におけるタンパク質発現を検出する際に行われる操作を適宜行うことができる。
　また、本発明のSMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法においては、血液由来の有核細胞を含むサンプルが被験者から得られたものであり、SMNタンパク質の核内構造体の発現解析をする工程が、SMNタンパク質の核内構造体を定量することを含み、
　前記定量により得られた結果を、コントロールと比較する工程を含んでもよい。ここで、コントロールとは、以下の(a)～(c)より選択され得る：
　(a) 前記被験者がSMA患者である場合には、前記コントロールは、正常者又は保因者から得られる血液を用いること以外は、前記被験者から得られた血液を用いてSMNタンパク質の核内構造体を定量した方法と同様にして得られた結果であり、
　(b) 前記被験者が正常者又は保因者である場合には、前記コントロールは、SMA患者から得られる血液を用いること以外は、前記被験者から得られた血液を用いてSMNタンパク質の核内構造体を定量した方法と同様にして得られた結果であり、又は
　(c) 前記被験者がSMAの治療薬又は治療候補薬を投与された者である場合には、前記コントロールは、前記SMAの治療薬又は治療候補薬の投与前の前記被験者から得られた血液を用いること以外は、前記投与後の前記被験者から得られた血液を用いてSMNタンパク質の核内構造体を定量した方法と同様にして得られた結果である。
　ここで、「同様にして測定した」とは、SMNタンパク質の核内構造体の定量結果（発現量又は局在化）を比較する上で、SMNタンパク質の核内構造体の定量に実質的に影響を与えない程度の変更は許されるものと解され、例えば、細胞を洗浄する工程などまで完全に一致することは意味しない。
　SMNタンパク質の核内構造体を定量することは、検量線法など、本発明の技術分野において従来知られている技術を用いて適宜行うことができる。
　なお、本発明の一実施態様は、上記のような比較の工程を含み、かつ比較の結果に基づいて被験者を診断する工程を含むことで、SMAを診断する方法に関すると言うこともできる。また、本発明の一実施態様は、上記のような比較の工程を含み、かつ比較の結果に基づいてSMAの治療薬又は治療候補薬を選択する工程を含むことで、SMAの治療薬又は治療候補薬のスクリーニング方法に関すると言うこともできる。
　以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：SMNタンパク質の核内構造体の発現解析
１．サンプルの調製
　以下の染色プロトコールに従って、サンプルを調製した。なお、特に記載のない限り、全ての手順は室温で行った。
（１）被験者から得た末梢血1.5mLを、15mLコニカルチューブに移した。
（２）コニカルチューブ内の末梢血中に、30μLのFc受容体ブロッキング試薬（Clear Back, MTG-001, MBL）を添加し、暗所にて15分間インキュベートした。
（３）インキュベート後のコニカルチューブ内末梢血中に、表面抗原（CD19、CD33、CD3）に対するモノクローナル抗体（それぞれBioLegend社より入手）5μLを、下記表１及び２に従って添加し、暗所にて30分間インキュベートした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
AF：アレクサフルオロ
R-PE：R-フィコエリスリン
PE-Cy5：R-フィコエリスリン－シアニン5
Hoechst：Hoechst 33342
BV：ブリリアントバイオレット
（４）37℃の水浴で温めた溶血・固定液（BD PhosflowTM Lyse/Fix Buffer）10mLを各チューブに加えた（8～10回逆さにしてよく混合した）。
（５）37℃の水浴で10分間インキュベートした。
（６）300 x gで5分間遠心分離した。
（７）＜50μLとなるまで上清を除去した。
（８）15mLのPBS(-)で細胞を再懸濁し、上記（６）と同様に遠心分離し、上清を除去した。
（９）1mLのサポニン含有細胞膜透過試薬（BD PhosflowTM；557885（BD PhosflowTM Perm/Wash Buffer I とも言う））で細胞を再懸濁し、暗所にて20分間インキュベートした。
（１０）上記（６）と同様に遠心分離した。
（１１）2mLの細胞膜透過試薬（BD PhosflowTM；557885）で細胞を洗浄した。
（１２）およそ100μLの細胞膜透過試薬（BD PhosflowTM；557885）で細胞を再懸濁した。
（１３）1.5mLマイクロチューブ中に95μLのPBS(-)を準備し、その中に上記１２で調製した細胞懸濁液を5μL添加し、２０倍希釈して染色用チューブとした。同様に２０倍希釈し、コントロール用チューブとした。各チューブ中、細胞懸濁液の濃度は、1 x 106 細胞／約50μLであった。
（１４－１）染色用チューブに対して、1μLのAF488結合抗ヒトSMNモノクローナル抗体（2B1）、AF647結合抗ヒトGemin3（EPR11283）、AF750結合抗ヒトZNF259（EPR7595）で染色を行った。
（１４－２）コントロール用チューブに対して、上記（１４－１）と並行して、AF488結合アイソタイプコントロール、AF647結合アイソタイプコントロール、AF750結合アイソタイプコントロールで染色を行った。
（１５）暗所にて45分間インキュベートした。
（１６）500μLの細胞膜透過試薬（BD PhosflowTM；557885）を添加し、300 x gで5分間遠心分離した。
（１７）500μLの細胞膜透過試薬（BD PhosflowTM；557885）で細胞を再懸濁し、上記（１６）と同様に遠心分離した。
（１８）Hoechst 33342（molecular probe（登録商標））を希釈して調製した50μLの希釈Hoechst 33342（0.25μg/mL PBS）で細胞を再懸濁した。
（１９）暗所にて15分間インキュベートした。
（２０）500μLのPBS(-)を添加し、上記（１６）と同様に遠心分離した。
（２１）90μLのPBS(-)で細胞を再懸濁し、各チューブが30μLの細胞懸濁液を含むよう３つのチューブに分けた。
２．イメージングフローサイトメトリー
　上記のとおり得られたサンプルについて、イメージングフローサイトメトリー（ImageStream（登録商標）x Mark II イメージングフローサイトメーター、Amnis）によりSMNタンパク質の核内構造体の発現解析を行った。対物レンズの倍率は６０倍を用い、計50000個以上の細胞をイメージングフローサイトメトリーに供した。
　なお、上記のとおり得られたサンプルとして、以下の被験者から得たものを用いた。
　正常者（健常者）：成人女性２名（38～51歳）、男女を含む小児８名（1～7歳）
　SMA患者：成人男性１名（21歳）、男女を含む乳児～小児19名（2ヶ月～8歳）
（１）細胞集団の分画
（i）全分画を含む画像データより、明視野における焦点のパラメータを利用し、焦点距離が正しい細胞群を選択した。
（ii）前方散乱光(FSC)による細胞の大きさと、細胞径の縦横比で展開し、凝集した状態の細胞を除外した。
（iii）Hoechst33342により標識された核DNAの蛍光強度を指標として、有核細胞を選択した（デブリス、埃、赤血球などの除外）。
（iv）側方散乱光(SSC)による細胞の内部構造と、細胞表面抗原CD33発現で展開し、有核細胞群を3群に分けた。結果を図１に示す。図１において、R1はリンパ球、R4は単球、R5は好中球を主として含む細胞集団を表す。なお、図１は、正常者から得られた血液サンプルを用いて、イメージングフローサイトメトリーにより測定した蛍光強度をプロットしたグラフであるが、患者から得られた血液サンプルを用いて測定した場合にも同様に有核細胞群が3群に分けられた。また、図１は１サンプルから得られた結果を示すものであるが、各サンプルについても同様に、有核細胞群が3群に分けられた。
（v）R1のリンパ球を主として含む細胞集団について、細胞表面抗原CD3およびCD19発現で展開し、CD3陽性T細胞を主として含む細胞集団と、CD19陽性B細胞を主として含む細胞集団の2群に分けた。結果を図２に示す。図２において、R2がCD3陽性T細胞を主として含む細胞集団を表し、R3がCD19陽性B細胞を主として含む細胞集団を表す。
　以上の解析により、末梢血中の有核細胞が以下の4群に分画された。なお、患者から得られた血液サンプルを用いて測定した場合にも同様である。また、図２は１サンプルから得られた結果を示すものであるが、各サンプルについても同様に、最終的に末梢血中の有核細胞群が以下の4群に分けられた。
　R2：CD3陽性T細胞を主として含む細胞群 (SSClow, CD33-, CD3+)
　R3：CD19陽性B細胞を主として含む細胞群 (SSClow, CD33-, CD19+)
　R4：単球を主として含む細胞群 (SSCintermediate, CD33++)
　R5：好中球を主として含む細胞群 (SSCintermediate, CD33intermediate)
（２）単球を主として含む細胞群におけるSMNタンパク質の核内構造体（スポット）の解析
　前述のとおりの方法でイメージングフローサイトメトリーを行い、撮影した細胞写真を図３及び４に示す。図３及び４は、SMA患者及び健常者（コントロール）からそれぞれ得られた血液サンプル中の、単球を主として含む細胞群を対象とした細胞写真であり、SMNタンパク質は緑色の蛍光で示される。この細胞写真から明らかなように、細胞全体における蛍光強度、核における蛍光強度、スポットの数、スポットにおける蛍光強度のいずれにおいても、SMA患者よりも健常者（コントロール）の方が大きいことが観測された。
　なお、ここで言う「スポット」とは、スポット状に観測されたSMNタンパク質の核内構造体を意味するものであり、本実施例では「スポット」の定義を、１）核内にあり、２）大きさが0.34～3.07μm2であり、３）バックグラウンドと比較し5倍以上の強度を示し、４）縦横比0.5～1.0であるものとした。
（i）スポット数の平均値
　所定の蛍光強度を示す細胞群中のスポット数の平均値を以下のとおり算出した。
（核内照準調整）
　核内の解析をより正確に行うために、以下の操作を行った。
1) 核内を染色したHoechst 33342を検出するチャンネルにおける焦点およびコントラストのパラメータで展開し、両パラメータのピーク部分の細胞群に限定した。
2) 上記の細胞群よりHoechst 33342の蛍光強度を指標とし、同程度に蛍光強度を示す細胞群を1000細胞以上選択した。これを照準調整細胞数とした。
（アイソタイプコントロール由来データの減算）
　特異的抗体（抗SMN抗体）で染色した試料の数値より、非特異的抗体（アイソタイプコントロール）で染色した試料の数値を減じたものを解析値として評価に用いた。
（スポット数の平均値の算出）
　スポット数／照準調整細胞数によりMeanを求め、以下の式によりスポット数の平均値を算出した。結果を図５に示す。図５のグラフ中、0.426及び0.295の数値は、それぞれ、試験した全ての正常者由来血液サンプル及びSMA患者由来血液サンプルにおいて算出したスポット数の平均値（算術平均）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
（ii）スポット陽性細胞の割合
　所定の蛍光強度を示す細胞群中のスポット陽性細胞の割合を以下のとおり算出した。
（核内照準調整）
　核内の解析をより正確に行うために、以下の操作を行った。
1) 核内を染色したHoechst 33342を検出するチャンネルにおける焦点およびコントラストのパラメータで展開し、両パラメータのピーク部分の細胞群に限定した。
2) 上記の細胞群よりHoechst 33342の蛍光強度を指標とし、同程度に蛍光強度を示す細胞群を1000細胞以上選択した。これを照準調整細胞数とした。
（アイソタイプコントロール由来データの減算）
　特異的抗体（抗SMN抗体）で染色した試料の数値より、非特異的抗体（アイソタイプコントロール）で染色した試料の数値を減じたものを解析値として評価に用いた。
（スポット陽性細胞の割合の算出）
　スポット数／照準調整細胞数×100により割合（％）を求め、以下の式によりスポット陽性細胞の割合を算出した。結果を図６に示す。図６のグラフ中、35.6及び26.1の数値は、それぞれ、試験した全ての正常者由来血液サンプル及びSMA患者由来血液サンプルにおいて算出したスポット陽性細胞の割合の平均値（算術平均）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
（iii）スポット陽性細胞の蛍光強度
　スポット陽性細胞に限定したSMNタンパク質の発現の解析を行った。
　非特異的抗体（アイソタイプコントロール）で染色した試料における非特異的スポット検出が僅少に抑えられたため（＜200細胞）、非特異的抗体（アイソタイプコントロール）で染色した試料におけるスポット陽性細胞の蛍光強度の算出は不可能だった。そのため、アイソタイプコントロールによるバックグラウンドの減算は不必要であると考え、特異的抗体（抗SMN抗体）により算出されたデータを評価に用いた。結果を図７に示す。図７のグラフ中、7255及び5364の数値は、それぞれ、試験した全ての正常者由来血液サンプル及びSMA患者由来血液サンプルにおいて算出したスポット陽性細胞の蛍光強度の平均値（算術平均）である。
（iv）スポットの蛍光強度
　スポットそのものの蛍光強度、即ち、SMNタンパク質の核内構造体の発現の解析を行った。
　非特異的抗体（アイソタイプコントロール）で染色した試料における非特異的スポット検出が僅少に抑えられたため（＜200細胞）、非特異的抗体（アイソタイプコントロール）で染色した試料におけるスポット陽性細胞中のスポットの蛍光強度の算出は不可能だった。そのため、アイソタイプコントロールによるバックグラウンドの減算は不必要であると考え、特異的抗体（抗SMN抗体）により算出されたデータを評価に用いた。結果を図８に示す。図８のグラフ中、332.7及び162.7の数値は、それぞれ、試験した全ての正常者由来血液サンプル及びSMA患者由来血液サンプルにおいて算出したスポットの蛍光強度の平均値（算術平均）である。
　以上の結果から、スポット数の平均値、スポット陽性細胞の割合、スポット陽性細胞の蛍光強度、及びスポットの蛍光強度のいずれにおいても、正常ヒト血液細胞とSMA患者由来血液細胞に関して、有意水準0.01において有意差が認められた。更に、スポット陽性細胞の蛍光強度と、スポットの蛍光強度の結果を比較すると、スポット陽性細胞の蛍光強度の結果によれば、正常ヒト血液細胞／SMA患者由来血液細胞の相対的な比は1.35（7255/5364）であるが、スポットの蛍光強度の結果によれば、正常ヒト血液細胞／SMA患者由来血液細胞の相対的な比は2.04である。従って、スポットの蛍光強度の結果に基づけばより検出感度が高められることが示唆された。即ち、本発明のSMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法は、バイオマーカーとしての信頼性がより高いSMNタンパク質の核内構造体の発現を単に検出するばかりでなく、正常者とSMA患者における差異をより高い検出感度で測定することができる。
　SMAは、依然として根本治療法が確立しておらず、国が指定する難病のうちの１つである。本発明は、SMAの治療法となり得る方法の評価のための利用に極めて有用である。例えば、本発明の方法を、SMAの治療薬又は治療候補薬の評価に用いることができ、SMAの治療薬又は治療候補薬のスクリーニングに用いることができる。
　また、本発明は、SMAの診断における利用にも有益である。更には、本発明は、SMNタンパク質の機能解析においても広く利用でき、SMAの診断技術及び治療技術に多大な貢献をもたらし得る。
　従って、本発明により、難病のうちの１つであるSMAの診断技術及び治療技術の格段の進展が見込まれる。
　更にまた、本発明は、SMAに限らず、SMNタンパク質の発現量低下により引き起こされる疾患や症状を診断又は改善するための技術への応用も期待できる。

Claims (5)

  1. 　SMNタンパク質の核内構造体の発現解析方法であって、
    　血液由来の有核細胞を含むサンプル中、前記有核細胞の１種以上の表面抗原マーカーを、１種以上の標識抗体を用いて標識する工程、
    　前記有核細胞内のSMNタンパク質を標識する工程、
    　前記有核細胞の核を標識する工程、
    　前記有核細胞のうち、核及びSMNタンパク質が標識され、かつ前記１種以上の標識抗体により標識された前記１種以上の表面抗原マーカー又は前記１種以上の標識抗体により標識された前記１種以上の表面抗原マーカーと側方散乱（SSC）とに基づき分類された複数の細胞集団から１つの細胞集団を選別する工程、及び
    　前記選別した細胞集団について、SMNタンパク質に対する標識に基づいてSMNタンパク質の核内構造体の発現解析をする工程
    を含み、前記細胞集団を選別する工程及び前記SMNタンパク質の核内構造体の発現解析をする工程を、４０倍以上の対物レンズを使用するイメージングフローサイトメトリーにより行う、前記方法。
  2. 　前記SMNタンパク質を標識する工程が、SMNタンパク質を第１の蛍光色素により標識することを含み、かつ、前記SMNタンパク質の核内構造体の発現解析をする工程が、前記第１の蛍光色素が発する蛍光強度を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記SMNタンパク質を標識する工程が、SMNタンパク質を第１の蛍光色素により標識することを含み、かつ、前記核を標識する工程が、核を第２の蛍光色素により標識することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記血液由来の有核細胞を含むサンプルを赤血球溶血処理に付す工程を更に含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記血液由来の有核細胞を含むサンプルが被験者から得られたものであり、
    　前記SMNタンパク質の核内構造体の発現解析をする工程が、SMNタンパク質の核内構造体を定量することを含み、
    　前記定量により得られた結果を、以下の(a)～(c)より選択されるコントロールと比較する工程を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法：
    　(a) 前記被験者がSMA患者である場合には、前記コントロールは、正常者又は保因者から得られる血液を用いること以外は、前記被験者から得られた血液を用いてSMNタンパク質の核内構造体を定量した方法と同様にして得られた結果であり、
    　(b) 前記被験者が正常者又は保因者である場合には、前記コントロールは、SMA患者から得られる血液を用いること以外は、前記被験者から得られた血液を用いてSMNタンパク質の核内構造体を定量した方法と同様にして得られた結果であり、又は
    　(c) 前記被験者がSMAの治療薬又は治療候補薬を投与された者である場合には、前記コントロールは、前記SMAの治療薬又は治療候補薬の投与前の前記被験者から得られた血液を用いること以外は、前記投与後の前記被験者から得られた血液を用いてSMNタンパク質の核内構造体を定量した方法と同様にして得られた結果である。
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