[go: up one dir, main page]

WO2017195901A1 - 肝分泌型代謝制御因子阻害作用による肥満関連疾患治療剤 - Google Patents

肝分泌型代謝制御因子阻害作用による肥満関連疾患治療剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2017195901A1
WO2017195901A1 PCT/JP2017/018093 JP2017018093W WO2017195901A1 WO 2017195901 A1 WO2017195901 A1 WO 2017195901A1 JP 2017018093 W JP2017018093 W JP 2017018093W WO 2017195901 A1 WO2017195901 A1 WO 2017195901A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pentraxin
gene
obesity
ptx4
liver
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2017/018093
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
欣彦 泉田
亘弘 和田
紫 升田
門脇　孝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
Priority to JP2018517100A priority Critical patent/JP6959913B2/ja
Priority to US16/300,325 priority patent/US20190226002A1/en
Priority to CN201780029641.1A priority patent/CN109477088A/zh
Priority to EP17796259.4A priority patent/EP3456824A4/en
Publication of WO2017195901A1 publication Critical patent/WO2017195901A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4727—Calcium binding proteins, e.g. calmodulin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for obesity-related diseases caused by an inhibitory action on hepatic secretory metabolic control factors.
  • Non-Patent Document 1 sugar / carbohydrate assimilation is less in energy metabolism than lipid assimilation, that is, the sugar / lipid balance (Carbohydrate-lipid imbalance) is important. It has been advocated (Non-Patent Document 1). By clarifying the sugar / lipid regulation mechanism (Carbohydrate-lipid balance) by this metabolic control, it is considered that an integrated control mechanism that could not be explained in terms of various theoretical aspects of each metabolic organ will be clarified. Based on such an idea, the present inventors have clarified that the neurological metabolic information of the liver vagus nerve causes physiological lipolysis according to glycogen consumption in the liver at the time of starvation. Patent Document 2).
  • Non-patent Document 2 an unknown “glycogen sensor” that senses glycogen consumption exists as a metabolic basis in the liver that defines these control mechanisms. Furthermore, it was clarified that this metabolic control neural circuit is sent from the liver to the central nervous system via the vagus nerve, and from there, the fat tissue is stimulated through the sympathetic nerve centrifuge (non-patent literature). 2).
  • a drug screening method for treating obesity-related diseases and a pharmaceutical composition for treating obesity-related diseases are provided.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a method for screening a drug for treating an obesity-related disease wherein the ability of a candidate drug that inhibits the action of pentraxin 4 is used as an index, and the candidate drug having the ability is used to treat an obesity-related disease
  • the indicator is the ability to inhibit transcription initiation of the pentraxin 4 gene mRNA, the ability to degrade the pentraxin 4 gene mRNA, or the ability to inhibit translation of the mRNA into a protein according to (2). the method of.
  • a nucleic acid molecule in which a DNA fragment comprising a transcriptional regulatory region of the pentraxin 4 gene and a DNA fragment comprising a reporter gene are operably linked is used (2) or (3) ) Method.
  • the indicator is the ability to inhibit the function of pentraxin 4 protein.
  • the indicator is the ability to inhibit extracellular secretion of pentraxin 4 protein, the ability to inhibit migration to nerve cells, or the ability to inhibit a signal transduction function.
  • the drug to be screened is improvement of obesity by enhanced lipolysis, improvement of insulin resistance, acquisition of obesity resistance by beige adipogenesis, reduction of liver fat accumulation, reduction of liver inflammation, acquisition of antioxidant stress, or liver
  • the method according to any one of (1) to (8), wherein the obesity-related disease is non-alcoholic steatohepatitis (NASH) or diabetes.
  • a pharmaceutical composition for treating obesity-related diseases comprising a pentraxin 4 inhibitor.
  • the pharmaceutical composition according to (10), wherein the pentraxin 4 inhibitor is an RNAi mediator that specifically inhibits the expression of the pentraxin 4 gene.
  • the pharmaceutical composition according to (10), wherein the pentraxin 4 inhibitor is a vector that expresses an RNAi mediator that specifically inhibits the expression of the pentraxin 4 gene.
  • the pentraxin 4 inhibitor is an antibody that specifically binds to the pentraxin 4 protein.
  • the pharmaceutical composition according to (10), wherein the pentraxin 4 inhibitor is an antibody that recognizes the peptide described in SEQ ID NO: 4.
  • the pharmaceutical composition according to (13) or (14), wherein the antibody is a monoclonal antibody.
  • the present invention it is possible to optimize energy metabolism control by artificially correcting the sugar / lipid regulation mechanism by nervous system control. For example, according to the present invention, it is possible to improve obesity by enhancing lipolysis, improve insulin resistance, or enhance basal metabolism by enhancing heat production. Further, according to the present invention, it becomes possible to obtain effects such as acquisition of obesity resistance by beige adipocyte conversion, reduction of liver fat accumulation, reduction of liver inflammation, acquisition of antioxidant stress, or liver antifibrosis. In addition, according to the present invention, it is possible to provide a novel therapeutic agent for obesity-related diseases such as nonalcoholic steatohepatitis (NASH) and diabetes.
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • neutralization of triglycerides based on obesity can be achieved by optimizing energy metabolism control by artificially intervening in the sugar / lipid regulatory mechanism by the metabolic control neural circuit. It becomes possible to provide a novel therapeutic agent for non-alcoholic steatohepatitis that develops due to excess and obesity-related diseases such as diabetes.
  • the appearance of a liver tissue homogenate suspension of a wild type mouse is shown.
  • the suspension in the suspension supernatant is a lipid component, and the suspension precipitate is a saccharified substance such as glycogen.
  • a comparison of the content of glycogen and triglycerides in the liver tissue of wild type mice is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the appearance of the epididymal adipose tissue of wild type mice is shown.
  • the top is the control group (LacZ-i), which shows a white-like color tone.
  • Below is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i), showing a reddish brown color.
  • the scale bar is 5 mm.
  • the body weight of the wild type mouse, the weight of the epididymal adipose tissue, and the weight of the brown adipose tissue are shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the vertical axis WAT (%) in the bar graph of the weight of the epididymal adipose tissue represents the weight (%) of the epididymal adipose tissue.
  • the vertical axis BAT (%) in the bar graph of the weight of brown adipose tissue represents the weight (%) of brown adipose tissue.
  • the comparison of the expression level of messenger RNA in the white adipose tissue of a high fat diet obesity model mouse is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the comparison of the expression level of messenger RNA in the testicular fat tissue of a non-alcoholic steatohepatitis model mouse is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • a comparison of the expression levels of messenger RNA in the liver of wild-type mice for genes related to carbohydrate and lipid metabolism, genes related to inflammation, and genes related to beta-oxidation is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the vertical axis shows the ratio of the expression level of the Ptx4 inhibition group when the expression level of the control group is 1.
  • mouth is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the glucose and lipid content in the plasma of wild type mice is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • mouth is shown.
  • the left side is a control group (LacZ-i), and the right side is a Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • a photograph of PAS staining of a liver tissue section of a leptin gene-deficient model mouse is shown.
  • the left side is a control group (LacZ-i)
  • the right side is a Ptx4 inhibition group (Ptx4-i)
  • the upper side is an enlarged 40 times
  • the lower side is an enlarged 200 times photograph.
  • An asterisk indicates the central vein, and a triangle that is horizontally long and narrows to the right indicates that a lipid droplet is seen at the end.
  • the comparison of the content of glycogen and triglyceride in the liver tissue of a leptin gene-deficient model mouse is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the comparison of the expression level of messenger RNA in the liver of a leptin gene-deficient model mouse of genes related to carbohydrate and lipid metabolism, genes related to inflammation and genes related to beta-oxidation is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the vertical axis shows the ratio of the expression level of the Ptx4 inhibition group when the expression level of the control group is 1. The comparison of the expression level of messenger RNA in the liver of a leptin gene-deficient model mouse of a gene related to oxidative stress is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the vertical axis represents the ratio of the expression level of Sod2 gene to the expression level of 36b4 gene.
  • the comparison of the expression level of messenger RNA in the liver of a high fat diet obesity model mouse of the gene related to lipid metabolism, the gene related to inflammation, the gene related to beta-oxidation, and the gene related to oxidative stress is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the vertical axis of the graph for genes related to oxidative stress indicates the ratio of the expression level of the Sod2 gene to the expression level of the 36b4 gene.
  • the comparison of the blood glucose level and plasma insulin concentration in a high fat diet obesity model mouse is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i)
  • the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the content of glycogen and triglyceride in the liver tissue of a non-alcoholic steatohepatitis model mouse is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i)
  • the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • a photograph of HE staining of a liver tissue section of a non-alcoholic steatohepatitis model mouse is shown.
  • the left side is a control group (LacZ-i)
  • the right side is a Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • Ptx4 inhibition group (Ptx4-i) a decrease in the area of white areas around the portal vein (PV) (reduction in fat droplets) is observed.
  • Genes related to fibrosis genes related to oxidative stress, genes related to carbohydrate and lipid metabolism, genes related to inflammation and genes related to beta-oxidation in the liver of nonalcoholic steatohepatitis model mice
  • the comparison of the expression level of messenger RNA is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the vertical axis of the graph for genes related to oxidative stress indicates the ratio of the expression level of the Sod2 gene to the expression level of the 36b4 gene.
  • shaft of the graph about gene collagen3a relevant to fibrosis shows the ratio with respect to the expression level of 36b4 gene of the expression level of collagen3a gene.
  • a comparison of body weight change and oral food intake of leptin gene-deficient model mice is shown.
  • the horizontal axis indicates the number of days elapsed when the day of administration of the Ptx4i adenoviral vector (pAd-Ptx4i) is taken as 0 days, and the vertical axis shows the body weight when the weight on day 0 is taken as 100%. Indicates the rate of change.
  • the black circle is the control group (LacZ-i)
  • the white triangle is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the vertical axis represents the oral food intake (g) per day per mouse when 7 days have passed since the day of administration of the Ptx4i adenovirus vector (pAd-Ptx4i).
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the result of the respiratory metabolism cage analysis of a wild type mouse is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the comparison of the expression level of UCP2 gene expression messenger RNA in the rectal temperature and liver of leptin gene-deficient model mice is shown.
  • the white bar is the control group (LacZ-i), and the black bar is the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i).
  • the vertical axis indicates the ratio of the expression level of the Ptx4 inhibition group when the expression level of the control group is 1.
  • a comparison of the cumulative food intake of wild-type mice is shown.
  • a white circle is a control group (rabbit IgG antibody administration), and a black circle is an anti-pentolaxin 4 rabbit IgG polyclonal antibody administration group.
  • a comparison of the epididymal fat cell weight of wild type mice is shown.
  • the white bar is the control group (rabbit IgG antibody administration), and the black bar is the anti-pentraxin 4 rabbit IgG polyclonal antibody administration group.
  • Pentraxin 4 as a gene that defines a molecule that is regulated in liver secretion in relation to hepatic glycogen consumption, and this novel hepatic secretion-type metabolic regulator is used for intracellular signal transduction and extracellular signaling. It was found to be involved in signal transduction and cause lipolysis and brown fatification in adipose tissue as well as regulation of hepatocyte metabolism. Glycolysis, energy consumption and feeding behavior are strongly regulated by glycogen sensing mechanism by this novel hepatic metabolic regulator. Therefore, obesity-related diseases can be treated by inhibiting the function of pentraxin 4.
  • Pentraxin 4 is a member of the multifunctional protein pentraxin superfamily characterized by having a pentraxin domain containing a consensus sequence consisting of 8 amino acids conserved on the C-terminal side. Information on the human pentraxin 4 gene, including its genomic sequence, mRNA sequence and amino acid sequence encoded thereby, is registered as Gene ID: 390667 in the NCBI database. The sequence of mRNA (cDNA) registered here is shown in SEQ ID NO: 26, and the encoded amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 27.
  • the pentraxin 4 gene may be abbreviated as “Ptx4 gene” and the pentraxin 4 protein may be abbreviated as “Ptx4 protein”.
  • the obesity-related disease includes a disease that is expected to have a therapeutic effect by preferentially burning neutral fat compared to glycogen, which is a carbohydrate.
  • glycogen which is a carbohydrate.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • the treatment of obesity-related diseases in the present invention includes not only the cure of the disease but also the improvement of symptoms.
  • the improvement of obesity by increased lipolysis, the improvement of insulin resistance, and the basis by increased heat production Increased metabolism may be mentioned.
  • the treatment of obesity-related diseases in the present invention includes improvement of obesity by enhanced lipolysis, improvement of insulin resistance, acquisition of obesity resistance by beige fat cellization, reduction of liver fat accumulation. Liver inflammation reduction, antioxidant stress acquisition, and liver antifibrosis.
  • a method for screening a drug for treating obesity-related diseases is provided.
  • the ability of a candidate drug to inhibit the action of pentraxin 4 is used as an index, and a candidate drug having this ability is identified as a drug for treating an obesity-related disease.
  • inhibition of the action of pentraxin 4 may be either inhibition of expression of the pentraxin 4 gene or inhibition of the function of the pentraxin 4 protein.
  • the drug is screened using the ability to inhibit the expression of the pentraxin 4 gene as an index.
  • ability include ability to inhibit transcription initiation of pentraxin 4 gene mRNA, ability to degrade pentraxin 4 gene mRNA, ability to inhibit translation of the mRNA into protein, and the like.
  • the drug is screened using the ability to inhibit the function of pentraxin 4 protein as an index.
  • ability to inhibit the function of pentraxin 4 protein include ability to inhibit extracellular secretion of pentraxin 4 protein, ability to inhibit migration to nerve cells, ability to inhibit signal transduction function, and the like.
  • the screening method of the present invention can be appropriately performed by those skilled in the art depending on the index used for drug selection.
  • cells that express the pentraxin 4 gene in the same environment as the human body such as hepatocytes and cells that are engineered to express the pentraxin 4 gene by gene transfer, are prepared, and in the presence and absence of the candidate drug.
  • the ability of the candidate drug to inhibit the expression of the pentraxin 4 gene can be measured.
  • LPS lipopolysaccharide
  • a drug for treating an obesity-related disease can be screened by selecting a candidate drug having a pentraxin 4 inhibitory action and identifying it as a drug for treating the obesity-related disease.
  • a DNA fragment comprising a transcriptional regulatory region of the pentraxin 4 gene and a reporter gene are included. It is preferable to use a nucleic acid molecule in which DNA fragments are operably linked.
  • the base sequence of the transcriptional regulatory region of the human pentraxin 4 gene can be obtained from information registered in NCBI Gene ID: 390667.
  • the base sequence of the transcriptional regulatory region of the mouse human pentraxin 4 gene can be obtained from information registered in NCBI Gene ID: 68509.
  • the reporter gene may be any gene as long as the detection method of the expression product of the gene is known.
  • a photoprotein gene such as a luciferase gene, ⁇ -galactosidase, chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene And the like, and fluorescent protein genes such as human thistle green (HmAG) fluorescent protein gene, green fluorescent protein (GFP) gene and red fluorescent protein (DS-RED) gene.
  • HmAG human thistle green
  • GFP green fluorescent protein
  • DS-RED red fluorescent protein
  • “operably linked” means that a gene linked upstream (5 ′ side) or downstream (3 ′ side) of a transcriptional regulatory region has a transcription promoting action or a transcriptional repressing action by the transcriptional regulatory region.
  • an in vitro transcription activity evaluation system into which the nucleic acid molecule has been introduced, or cells transformed with the nucleic acid molecule can be used. Examples of such cells include mammalian cells, insect cells, yeast, E. coli, and the like, but mammalian cells are preferred.
  • in vitro transcription activity evaluation system into which the nucleic acid molecule has been introduced, or when the candidate drug is brought into contact with a cell transformed with the nucleic acid molecule the expression of the pentraxin 4 gene is inhibited based on the expression of the reporter gene Capability can be detected and evaluated.
  • detection of reporter gene expression and screening of candidate drugs techniques well known to those skilled in the art can be used.
  • the pentraxin 4 protein is more preferably immobilized.
  • any method generally known to those skilled in the art can be used.
  • the test substance is a cyclic peptide
  • the TRAP display method T. Ishizawa, T. Kawakami, P. C. Reid , H. Murakami (2013) J. Am. Chem. Soc.
  • the candidate drug can be screened by administering and evaluating the primary candidate substance obtained by such a selection method to the system for evaluating obesity-related diseases described in the present specification.
  • various types of substances such as small molecules, low molecular substances, high molecular substances, nucleic acid molecules, proteins, peptides (including cyclic peptides) can be used as candidate drugs.
  • a pharmaceutical composition for treating obesity-related diseases comprising a pentraxin 4 inhibitor.
  • the present invention also provides a method of treating or preventing an obesity related disease comprising administering a therapeutically effective amount of a pentraxin 4 inhibitor to a subject in need thereof.
  • the present invention provides the use of a pentraxin 4 inhibitor in the manufacture of a medicament for treating obesity-related diseases.
  • the pentraxin 4 inhibitor for treating an obesity related disease is provided.
  • various types of substances such as small molecules, low molecular substances, high molecular substances, nucleic acid molecules, proteins, peptides (including cyclic peptides), and the like can be used.
  • the subject to be treated or prevented is preferably a mammal such as a human or non-human mammal.
  • the pentraxin 4 inhibitor is an RNAi mediator that specifically inhibits the expression of the pentraxin 4 gene.
  • RNAi mediator means not only siRNA itself but also a longer double-stranded RNA molecule capable of introducing siRNA into a target cell.
  • RNAi mediators are well-known tools that can inhibit the expression of specific genes by RNA interference (RNAi) (Elbashir, S.M. et al., Nature 411, 494-498, 2001).
  • the siRNA typically comprises a 19-21 base pair nucleotide sequence that is homologous to a sequence specific to the target gene mRNA.
  • the double stranded RNA molecule described above typically comprises a longer nucleotide sequence having a double stranded portion corresponding to siRNA.
  • the double-stranded RNA molecule may have a hairpin structure.
  • RNAi mediators can be easily designed by those skilled in the art based on the sequence of a gene whose expression is to be suppressed.
  • the RNAi mediator can also be expressed by an appropriate vector delivered into the cell. Therefore, the pentraxin 4 inhibitor may be a vector that expresses an RNAi mediator that specifically inhibits the expression of the pentraxin 4 gene.
  • Such vectors can be readily constructed by standard procedures well known in the art (Bass, BL, Cell 101, 235-238, 2000; Tavernarakis, N. et al., Nat. Genet . 24, 180-183, 2000; Malagon, F. et al., Mol. Gen. Genet. 259, 639-644, 1998; Parrish, S. et al., Mol. Cell 6, 1077-1087, 2000) .
  • RNAi mediator base sequence 1 having pentraxin 4 inhibitory activity used in the present invention.
  • this base sequence may have mutations such as insertion, deletion or substitution of nucleotide residues as long as it has an inhibitory effect on the expression of the pentraxin 4 gene.
  • the position of such mutation is not particularly limited.
  • the number of such mutations is not particularly limited, but for example, 1 to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, further preferably 1 or 2, more preferably One.
  • the mutation may be any one or a combination of insertion, deletion and substitution, but is preferably a substitution.
  • the pentraxin 4 inhibitor is an antibody that recognizes all or a partial peptide of the pentraxin 4 protein. More preferably, the antibody specifically binds to pentraxin 4 protein.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the antibody preferably specifically binds to the pentraxin 4 protein and inhibits the function of the protein.
  • amino acid sequences of antigen peptides for producing antibodies used in the present invention are shown in Table 2 below (amino acid sequences 1 to 3).
  • Amino acid sequence 1 includes amino acid residues 221 to 234 of mouse pentraxin 4 protein.
  • Amino acid sequence 2 includes amino acid residues 406 to 418 of mouse pentraxin 4 protein.
  • Amino acid sequence 3 includes amino acid residues of human pentraxin 4 protein corresponding to amino acid residues 406 to 418 of mouse pentraxin 4 protein.
  • Amino acid sequence 2 and amino acid sequence 3 have high homology, and an antibody prepared using an antigenic peptide having amino acid sequence 2 is highly likely to cross-react with human pentraxin 4 protein.
  • this amino acid sequence has mutations such as insertion, deletion or substitution of amino acid residues as long as an antibody having an inhibitory effect on pentraxin 4 can be produced. You may do it.
  • the position of such mutation is not particularly limited.
  • the number of such mutations is not particularly limited, but for example, 1 to several, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, further preferably 1 or 2, more preferably One.
  • the mutation may be any one or a combination of insertion, deletion and substitution, but is preferably a substitution, more preferably a conservative substitution (having similar properties for a certain amino acid residue) Substitution with other amino acid residues).
  • the pentraxin 4 inhibitor is a small molecule.
  • a small molecule can be obtained by the screening method of the present invention.
  • Pentraxin 4 inhibitor can be administered by an appropriate route such as topical, intravenous, subcutaneous, intramuscular, oral, rectal, or mucosal.
  • the therapeutically effective amount is appropriately determined by a doctor or veterinarian according to the severity of symptoms, the age of the subject, the effectiveness of the specific drug used, the route of administration, the frequency of administration, and the like.
  • the therapeutically effective amount is from about 0.001 to about 1000 mg / kg body weight, preferably about 0.01 to about 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.01 to about 1 mg / kg per day. Weight is kg.
  • Pentraxin 4 inhibitor can be administered in combination with drugs other than pentraxin 4 inhibitor for treating obesity-related diseases.
  • administering in combination (i) a drug other than the pentraxin 4 inhibitor and the pentraxin 4 inhibitor are mixed and administered in the same preparation, (ii) the pentraxin 4 inhibitor and the pentraxin 4 inhibition Either a preparation other than a drug is prepared as a separate preparation and administered simultaneously, or (iii) a drug other than the pentraxin 4 inhibitor and a drug other than the pentraxin 4 inhibitor are prepared as separate preparations and administered at different timings. But you can. The usage, dosage, administration timing, administration interval, etc. of the pentraxin 4 inhibitor and other drugs to be administered are determined according to common technical knowledge known to those skilled in the art.
  • Pentraxin 4 inhibitor can be administered with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutical composition for treating obesity related diseases comprising a pentraxin 4 inhibitor and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers such as vehicles, excipients, diluents and the like are appropriately selected by those skilled in the art depending on the administration route, the properties of the specific drug used, and the like.
  • Animal male C57BL / 6J mice (age 7) were purchased from Japan CREA, Sankyo Lab.
  • Leptin gene-deficient mouse model (Lep ob / Lep ob) were obtained from Japan CREA. Mice were housed in cages and maintained on a 12 hour light / dark cycle under normal temperature (24 ° C.) temperature control, unless otherwise specified for different temperature control conditions.
  • high fat diet (60% fat content, lard use) was fed to male C57BL / 6J mice (age 7) to create high fat diet obesity (DIO (Diet induced obesity) model mice)
  • DIO Diet induced obesity
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • CDAHFD ultra-high fat choline-deficient methionine reduced diet
  • Example A (2) Preparation of Ptx4 RNAi Adenovirus Vector In order to prepare a vector that expresses an RNAi mediator that specifically suppresses the expression of the pentraxin 4 gene, an RNAi base sequence 1 oligomer for HEK293 cell line (the base sequence is shown in Table 1). 1) is inserted into the entry vector pENTR / U6, the recombinant is mixed with the adenoviral vectors pAd-DEST and Gateway LR clone (Invitrogen), introduced into the DH5 ⁇ E. coli strain, and adenoviral recombinant DNA ( shPtx4 adenoviral vector; pAd-Ptx4i) was obtained.
  • adenoviral recombinant DNA shPtx4 adenoviral vector; pAd-Ptx4i
  • the Ptx4i adenoviral vector (pAd-Ptx4i) obtained above was subjected to transfection into HEK293 cell line, amplified, and 1-5 ⁇ 10 11 plaque-forming units (p.f) using PD-10 column (BD health care). U.) / Ml.
  • Example A Introduction of Ptx4RNAi Adenovirus Vector into Mice and Preparation of Each Tissue Sample Ptx4i adenovirus vector (pAd-Ptx4i) was transformed into 2-8 ⁇ 10 8 Plaque-forming units (pf.u.) / Body Mice were injected intravenously at a dose of At each time point, the mouse testicular adipose tissue and liver were rapidly excised and frozen in liquid nitrogen. Further, as a histological search sample, it was fixed by dipping in 4% PFA.
  • Example B analysis Example B (1) Analysis of liver fat content A 0.2 g liver tissue sample stored in liquid nitrogen was homogenized uniformly with a crushing apparatus, and the sample was weighed with a microtube. 200 mg was sampled from the homogenized tissue sample, 2 ml of chloroform / methanol (2: 1, v / v) was added thereto, and liver-containing lipid was extracted into an organic solvent at 4 ° C. for 48 hours. Thereafter, 100 ⁇ l of the obtained extract was poured into a glass tube and dried, and the organic solvent in the organic solvent extract was naturally dried and removed. The pelleted extract was dissolved in isopropanol, and lipid measurement was performed by an enzymatic method (Wako TG measurement kit). The absorbance of the reaction solution was measured, and the lipid amount (mg) per 1 g of liver tissue was calculated.
  • Example B (2) Analysis of liver glycogen content Five times the amount of 0.6N perchloric acid was added to the liver weight, homogenized uniformly with a crushing device, and 30% water was added to 0.1 g of this homogenized tissue sample. After adding 250 ⁇ l of potassium oxide solution, the mixture was boiled and stirred for 5 minutes and cooled on ice. Thereafter, 50 ⁇ l of 2% sodium sulfate and 800 ⁇ l of 66% ethanol were added and stirred. The pellet was washed again with 66% ethanol and suspended in 3 ml distilled water. The amyloglucosidase solution was added and the mixture was boiled and stirred for 30 minutes in a 55 ° C. hot tub. Glycogen in the obtained supernatant was measured by absorbance at 570 nm by the glucose oxidase (GOD) dye method. From the obtained absorbance, glycogen mass (mg) per 1 g of liver tissue was calculated.
  • GOD glucose oxidase
  • Example B Plasma Biochemical Analysis In plasma analysis, the amount of insulin in mouse plasma was measured using a mouse high sensitivity insulin measurement kit (Morinaga). Plasma triglyceride content, glucose content and free fatty acid content in mouse plasma were measured using Wako Triglyceride Test Wako, Glucose CII Test Wako and NEFA C-Test Wako (Wako Pure Chemicals), respectively.
  • Example B (4) Gene expression level analysis of tissue Measurement of RNA expression level
  • RNA expression level One piece of liver was placed in 1.5 ml of TRIzol (Invitrogen), and homogenized immediately and uniformly with a crusher. The homogenized solution is centrifuged (15000 rpm, 5 minutes), the supernatant is collected, 0.3 ml of chloroform is added, the mixture is stirred and centrifuged again (15000 rpm, 15 minutes), and the upper layer is recovered. did. 0.75 ml of isopropanol was added to the obtained upper layer and centrifuged (15000 rpm, 15 minutes) to precipitate mRNA.
  • the mRNA-containing precipitate was washed twice with 80% ethanol, dissolved in 0.5 ml of distilled water, and subjected to measurement of the amount of mRNA.
  • the mRNA was adjusted to a fixed amount, and cDNA was prepared using reverse transcriptase (High Capacity cDNA reverse transcription kit; Applied Biosystems).
  • the gene expression level was measured by quantitative RT-PCR (SYBR Green Dye; Roche Applied Science) using the prepared cDNA and the target gene primer.
  • the target genes and primer designs used for the measurement of gene expression levels are shown below (Tables 3 and 4).
  • Example B PAS staining of liver tissue 4% PFA-fixed liver tissue was deparaffinized, reacted with 1% periodic acid aqueous solution, and washed with running water for 5 minutes. The mixture was reacted for 10 minutes with a Schiff reagent, then reacted with a 0.5% aqueous bisulfite solution, and then washed with running water for 5 minutes. After nuclear staining with Mayer's hematoxylin solution, it was washed again with running water, dehydrated with 95% alcohol and then with 100% alcohol, and passed through and sealed.
  • Example B HE staining of liver tissue 4% PFA-fixed liver tissue was deparaffinized, immersed in a staining bottle containing hematoxylin solution, and allowed to react for 1 to 5 minutes. Thereafter, it was washed with running water for 5 minutes, reacted with the eosin solution for 5 to 10 minutes, and rinsed with water. Then, it was immersed in 90% ethanol, then 95% ethanol, then absolute ethanol, dehydrated, immersed in xylene, and sealed.
  • Example B (7) Phospho-Insulin Receptor ⁇ (Tyr 1361) manufactured by Cell Signaling Co., Ltd. as a primary antibody for Western blotting insulin signal proteins (p-IR, p-Akt, p-S6K, p-GS, p-Foxo).
  • (84B2) Rabbit mAb # 3023, Phospho-Akt (Ser473) Antibody # 9271, Phospho-p70S6Kinase (Thr389) Antibody # 9205, Phospho-GlycogenSyn (A64) # 9464 is obtained and used, and the program attached to the kit is used. According to tocol, it was carried out.
  • Example B (8) Respiratory Metabolism Cage Analysis Using a respiratory metabolism cage (ARCO-2000 series) manufactured by Alcosystem, respiratory respiratory cage analysis was performed in an optimal environment.
  • ARCO-2000 series respiratory metabolism cage manufactured by Alcosystem
  • Example C Results Example C (1) Improvement of sugar / lipid imbalance In the obese patient, the sugar / lipid balance breaks down, fat synthesis becomes significant compared to carbohydrates, and insulin is expressed There is a pathologic mechanism that explains the onset of resistance-based disease (Ide T. Nature cell biol 2004 Apr; 6 (4): 351-7), and this sugar / lipid imbalance (Carbohydrate-lipid imbalance) Improvement is the fundamental therapeutic foundation.
  • the present inventors paid attention to the function of the Ptx4 gene, and measured the glycogen content and the triglyceride content in the liver of C57BL / 6J mice in which the Ptx4 gene was transcription-inhibited with a Ptx4i adenovirus vector (pAd-Ptx4i). It was found that by inhibiting the function of the Ptx4 gene, the carbohydrate / lipid ratio was increased in the liver of C57BL / 6J mice, and the carbohydrate synthesis was enhanced compared to the lipid synthesis.
  • carbohydrate-based carbohydrate energy (glycogen) is first used, and then neutral fat that has been lipolyzed from adipose tissue as fatty acid-based energy is used as a substrate.
  • the function of the Ptx4 gene is inhibited, first, the neutral fat in the liver tissue or hepatocytes is used as a substrate, and then the carbohydrate energy of the carbohydrate system is used. It became clear that a paradigm shift in usage was triggered. Based on the above, it is expected that an abnormal sugar / lipid metabolism balance in which lipid synthesis is superior to carbohydrate synthesis as shown by obese patients is improved by inhibiting the function of the Ptx4 gene.
  • Example C Promotion of lipolytic action of adipose tissue and transformation into beige adipocytes
  • Adipose tissue is transformed into reddish-brown beige adipocytes (Beige) having heat-producing ability under certain conditions.
  • Beige reddish-brown beige adipocytes
  • UCP1 gene is enhanced in beige-like adipocytes, and this contributes to heat production, thereby enhancing energy combustion (Lowell, BB, et al. Nature 404, 652-660.2000). . Therefore, the inventors have observed whether such a change in adipose tissue occurs by inhibiting the function of the Ptx4 gene.
  • the color tone of the epididymal adipose tissue of the C57BL / 6J mouse in the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i) showed a reddish brown color, and the white-like color tone exhibited by the epididymal adipose tissue in the control (LacZ-i) group (this is the testis of the mouse) This is clearly different from the color tone normally found in the upper adipose tissue (FIG. 3).
  • C57BL / 6J mice in the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i) showed a decrease in body weight compared to the control group (LacZ-i) (FIG. 4).
  • C57BL / 6J mice in the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i) have about 50% reduction in the weight of epididymal tissue (which corresponds to visceral fat in humans) compared to the control group (LacZ-i).
  • Ptx4-i the control group
  • the expression gene in the adipose tissue of C57BL / 6J mice that inhibited the function of the Ptx4 gene was measured by quantitative RT-PCR, the gene expression of UCP1, which is supposed to enhance gene expression in beige-like adipocytes, was significantly increased. (P ⁇ 0.05).
  • adipose tissue which is a tissue different from the liver, and neutral fat in the adipose tissue is easily decomposed and used. It was revealed that the cells transformed into adipocytes having beige adipocyte-like properties. This is because brown adipocytes and beige fat having the property of enhancing the heat production as a result of enhancement of the signal cascade of p38, MAPK, and PGC1 ⁇ by stimulation with norepinephrine by activation of the sympathetic nervous system such as cold stimulation. A mechanism similar to the phenomenon that promotes transformation into cells (Cao, W.et al. Mol.
  • Example C (3) Improving sugar / lipid balance by controlling transcription in liver tissue (reducing SREBP1, SREBP2 expression and enhancing Gys2 expression or suppressing pygl expression), increasing anti-inflammatory liver glycogen content and neutrality Improvement in insulin resistance has been reported with a decrease in fat content (Nakagawa Y et al. Nat Med. 2006 Jan; 12 (1): 107-13.). Therefore, the inventors observed whether inhibition of the function of the Ptx4 gene causes such transcriptional control in the liver tissue that leads to enhanced insulin sensitivity in the liver.
  • SREBP-1c and SREBP-2 which are de novo fat synthesis (neutral fat / cholesterol synthesis) genes in liver tissue, are also suppressed at the transcriptional level by inhibiting the function of the Ptx4 gene.
  • Gys2 a glycogen synthesis gene in liver tissue, was found to inhibit the function of the Ptx4 gene, thereby enhancing its gene expression at the transcriptional level (FIG. 7a). It was also inferred that inhibition of the function of the Ptx4 gene increased the CPT-1a gene expression in the liver (FIG. 7c) and increased beta-oxidation.
  • a wild type mouse C57BL / 6J
  • a Ptx4i adenoviral vector pAd-Ptx4i
  • pAd-Ptx4i adenoviral vector
  • the expression of was analyzed using Western blotting.
  • the insulin signal was improved in the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i), suggesting increased insulin sensitivity in the liver, and administration of the Ptx4i adenoviral vector (pAd-Ptx4i) resulted in insulin resistance (obesity-related inflammatory
  • the effect of improving (change) was confirmed (FIG. 10).
  • Example C (4) Improvement of fatty liver by the effect of improving the sugar / lipid imbalance in an obesity model and its anti-inflammatory action
  • the wild type C57BL / 6J mouse described in (1) to (3) above From the results of analysis of the above, by inhibiting the function of the Ptx4 gene, 1) in the liver sugar / lipid balance, fatty acid predominately increases utilization ( ⁇ oxidation increases), 2) de novo adipose synthesis gene expression decreases, 3) Induction of anti-inflammatory action, 4) Reduction of oxidative stress, etc. were found, and it was confirmed whether the same action and effect as these were also exhibited in the obesity model as a therapeutic effect.
  • As obesity disease model proceeded analyzed using a high-fat diet obesity (DIO (Diet induced obesity)) mouse model, leptin gene-deficient mouse model (Lep ob / Lep ob).
  • DIO Diet induced obesity
  • a Ptx4i adenovirus vector (pAd-Ptx4i) was administered by intravenous injection to a leptin gene-deficient model mouse (Lep ob / Lep ob ).
  • PAS staining was performed as a liver histochemical analysis (FIG. 11).
  • an asterisk indicates a central vein, and a triangle that is horizontally long and narrows to the right indicates that a lipid droplet is seen ahead.
  • Ptx4i adenovirus vector (pAd-Ptx4i) was administered to a high fat diet obesity (DIO (Diet induced obesity)) model mouse under the breeding temperature condition of 19 ° C, and blood glucose as occasional using whole blood one week later Values, as well as plasma insulin concentrations, were measured using the ELISA method.
  • DIO Diet induced obesity
  • Example C Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) therapeutic agent Proof of concept
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • CDAHFD NASH model a non-alcoholic steatohepatitis model mouse
  • pAd-Ptx4i a Ptx4i adenovirus vector
  • Ptx4i adenovirus vector (pAd-Ptx4i) was administered to alcoholic steatohepatitis (NASH) model mice under the above-mentioned 19 ° C. rearing temperature condition, and histological evaluation of the liver one week after the administration was performed. went.
  • Ptx4 inhibition group Ptx4-i
  • a decrease in the area of white areas around the portal vein (PV) was observed, and the pathology of nonalcoholic steatohepatitis (NASH) was observed. Improvement of fatty liver, which is one index, was suggested (FIG. 18).
  • Sod2 superoxide dismutase 2
  • DIO Diet induced obesity
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • Ptx4 inhibition group Ptx4-i
  • nonalcoholic steatohepatitis NASH
  • the expression levels of Collagen1a and Collagen3a mRNA in the liver were confirmed, and the Ptx4 inhibition group (Ptx4-i ) Decreased in each fibrosis marker, and it was confirmed that administration of the Ptx4i adenoviral vector (pAd-Ptx4i) has a function to improve the liver fibrosis exacerbation of nonalcoholic steatohepatitis (NASH) ( (Fig. 19)
  • the fatty substrate in the liver is i) 60% free fatty acids from adipose tissue, ii) 26% de novo fat synthesis, and iii) 14% from fed glucose and fat (Kerry L et al. J Clin Invest. 2005; 115 (5): 1343-1351. doi: 10.1172 / JCI23621).
  • the inventors have found that inhibiting the function of Ptx4 gene, whether the amount of glucose and fat ingested decreases were confirmed by leptin gene-deficient mouse model (Lep ob / Lep ob).
  • PPAR ⁇ agonists and vitamin E are known as active ingredients of existing nonalcoholic steatohepatitis (NASH) therapeutic agents (Hardy T. et al. Current opinion in Gastroenterology 31 (3): 175-183 2015), no active ingredient having a mechanism that can control all three systems i) to iii), which are inflow pathways involved in the accumulation of triglycerides in the liver, has been discovered so far. Therefore, a clinical effect as a novel drug that exhibits a new effect targeting nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is expected.
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • Example C Organ protection by metabolic control in pseudo-hibernation state, disease prevention effect
  • a wild type mouse C57BL / 6J
  • pAd-Ptx4i Ptx4i adenovirus vector
  • RQ respiratory quotient
  • hibernation has been shown as a physiological condition that lowers the physiological metabolic level or lowers the body temperature.
  • Dormancy is known.
  • HP hibernation-specific protein
  • the characteristics of metabolic state in hibernation include maintaining hypothermia (Hochachk et al. Science, 231 (1986), 234-241) and protection from ischemia (KU Frerichs. Et al. J. Cereb. Blood Flow Metab ., 18 (1998), pp. 168-175), muscle atrophy protection (HJ Harlow et al. Nature, 409 (2001), p. 997), suppression of bacterial infection (VM Sharapov. Et al. Mycopathologia, 84 ( 1983), pp. 77-80), and inhibition of tumor formation (GB Kemper et al. Comp. Biochem. Physiol., 73C (1982), pp. 445-450) It has been reported to have an effect of protecting organs from diseases and diseases.
  • the pseudo-hibernation metabolic state that is thought to be caused by inhibiting the function of the Ptx4 gene has an organ-protecting effect from cirrhosis change due to nonalcoholic steatohepatitis (NASH), canceration, or complications due to diabetes. Expected to demonstrate. In addition, it reduces basal metabolism and reduces cell damage caused by radiation exposure, so it is expected to have a long-term protective response from cosmic rays and is expected to be applied to space business development (Cerri M et al. Life Sci Space Res., 90 (4) (2016) pp.445-452).
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • Example D Preparation of antibody recognizing pentraxin 4 protein
  • a peptide of amino acid sequence 2 SEQ ID NO: 4 described in Table 2 was used.
  • Anti-Pentraxin 4 rabbit IgG polyclonal antibody was prepared by the antibody production service of Genomics Inc.
  • Example D Inhibitory Effect of Pentraxin 4 Protein Function of Antibody Recognizing Pentraxin 4 Protein
  • the inhibitory effect of anti-pentraxin 4 rabbit IgG polyclonal antibody on the function of pentraxin 4 protein in vivo was examined.
  • An anti-pentraxin 4 rabbit IgG polyclonal antibody (50 ⁇ g / body) and a rabbit IgG antibody (50 ⁇ g / body) as a control were each administered intravenously to wild-type mice (C57BL / 6J) under a breeding temperature condition of 19 ° C. Thereafter, the inhibitory effect of the function of the pentraxin 4 protein by the antibody was observed for 7 days.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

ペントラキシン４の作用を阻害する候補薬物の能力を指標として用いる、肥満関連疾患を治療するための薬物のスクリーニング方法およびペントラキシン４阻害剤を有効成分として含む肥満関連疾患を治療するための医薬組成物が開示される。前記方法によりスクリーニングされた薬物および前記医薬組成物は、肥満関連疾患、特に非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を治療するために有用である。

Description

肝分泌型代謝制御因子阻害作用による肥満関連疾患治療剤 関連出願の参照
　本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願２０１６－０９７２３３号（出願日：２０１６年５月１３日）に基づく優先権の主張を伴うものである。この先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、肝分泌型代謝制御因子阻害作用による肥満関連疾患治療剤に関するものである。
　現代社会において、肥満およびこれと併発するメタボリックシンドロームは国民衛生上の一大問題となっている。この症候群においては、動脈硬化のリスクファクターがクラスター化することが本質的に重要な点であり、分子生物学的な病態解明と基礎的知見に立脚する新規治療戦略を構築することが急務である。メタボリックシンドロームの病態を考える上で、インスリン抵抗性の発症メカニズムを理解することが重要であるが、未だその全容は明らかになっていない。
　本発明者らは、インスリン抵抗性のメカニズムとして、エネルギー代謝において、脂質の同化に比し、糖・炭水化物同化が過少となること、つまり糖/脂質バランスの崩れ（Carbohydrate-lipid imbalance）が重要であることを提唱してきた（非特許文献１）。この代謝制御による糖/脂質調節機構（Carbohydrate-lipid 　balance）を明らかにすることで、各代謝臓器の各論的な側面では語ることのできなかった統合的な制御機構が明らかになると考えられる。このような発想のもとに、本発明者らは、飢餓時における肝臓内のグリコーゲン消費に応じて、肝臓迷走神経の神経性代謝情報が生理的な脂肪分解を引き起こすことを明らかにした（非特許文献２）。また、これらの制御機構を規定する肝臓内の代謝基盤として、グリコーゲン消費を感知する未知の“グリコーゲン・センサー”が存在することを明らかにした（非特許文献２）。さらに、この代謝制御性神経回路は、肝臓から迷走神経を介して中枢神経系へ送られ、そこから交感神経遠心路を通じて脂肪組織が刺激されて脂肪分解が生じることを明らかにした（非特許文献２）。
　しかしながら、この代謝制御性神経回路の存在自体は、既に東北大学の片桐らによって２００６年に世界に先駆けて日本から初めて報告され、注目されていたものの（非特許文献３）、肝からの代謝関連情報がどのようにして神経情報へ翻訳されるのか、このメカニズムは未解決のままであった。
Ｉｄｅ　Ｔ．　Ｎａｔｕｒｅ　ｃｅｌｌ　ｂｉｏｌ　２００４　Ａｐｒ；６（４）：３５１－７ Ｉｚｕｍｉｄａ　Ｙ．　Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎ ４：２３１６，２０１３ Ｕｎｏ　Ｋ，Ｋａｔａｇｉｒｉ　Ｈ，　ｅｔ．ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ. １６；３１２（５７８０）：１６５６－９，　２００６
　本発明者らは、肝臓の代謝パターンを神経系共通情報として翻訳するメカニズムの探求を通して、神経系代謝制御に介入しエネルギーホメオシターシスを制御する基盤となるメカニズムの解明に鋭意取り組んだ結果、肝から生合成される分子であるペントラキシン４（Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ４）を阻害することにより、肝細胞内のエネルギー基質として、糖質であるグリコーゲンと比して中性脂肪を優先的に燃焼させると同時に、脂肪組織内の脂肪分解を促進して脂肪量を減少させ、その脂肪組織を褐色脂肪組織化することができ、これらメカニズムの総和として肝臓内のβ酸化亢進と炎症抑制、酸化ストレスの軽減に繋がることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
　よって、本発明によれば、肥満関連疾患を治療するための薬物のスクリーニング方法、ならびに肥満関連疾患を治療するための医薬組成物が提供される。
　本発明は以下の発明を包含する。
（１）肥満関連疾患を治療するための薬物をスクリーニングする方法であって、ペントラキシン４の作用を阻害する候補薬物の能力を指標として用い、該能力を有する候補薬物を肥満関連疾患を治療するための薬物として特定することを特徴とする、方法。
（２）前記指標が、ペントラキシン４遺伝子の発現を阻害する能力である、（１）に記載の方法。
（３）前記指標が、ペントラキシン４遺伝子のｍＲＮＡの転写開始を阻害する能力、ペントラキシン４遺伝子のｍＲＮＡを分解する能力、または該ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する能力である、（２）に記載の方法。
（４）ペントラキシン４遺伝子の転写調節領域を含んでなるＤＮＡ断片とレポーター遺伝子を含んでなるＤＮＡ断片が作動可能なように連結された核酸分子を用いることを特徴とする、（２）または（３）に記載の方法。
（５）前記指標が、ペントラキシン４タンパク質の機能を阻害する能力である、（１）に記載の方法。
（６）前記指標が、ペントラキシン４タンパク質の細胞外分泌を阻害する能力、神経細胞への移行を阻害する能力またはシグナル伝達機能を阻害する能力である、（５）に記載の方法。
（７）ペントラキシン４タンパク質に特異的に結合する物質を一次候補物質として選抜する工程を含むことを特徴とする、（５）または（６）に記載の方法。
（８）スクリーニングされる薬物が、脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗線維化のための薬物である、（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）肥満関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または糖尿病である、（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）ペントラキシン４阻害剤を含んでなる、肥満関連疾患を治療するための医薬組成物。
（１１）ペントラキシン４阻害剤が、ペントラキシン４遺伝子の発現を特異的に阻害するＲＮＡiメディエーターである、（１０）に記載の医薬組成物。
（１２）ペントラキシン４阻害剤が、ペントラキシン４遺伝子の発現を特異的に阻害するＲＮＡiメディエーターを発現するベクターである、（１０）に記載の医薬組成物。
（１３）ペントラキシン４阻害剤が、ペントラキシン４タンパク質に特異的に結合する抗体である、（１０）に記載の医薬組成物。
（１４）ペントラキシン４阻害剤が、配列番号４に記載されたペプチドを認識する抗体である、（１０）に記載の医薬組成物。
（１５）前記抗体がモノクローナル抗体である、（１３）または（１４）に記載の医薬組成物。
（１６）脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗線維化のための、（１０）～（１５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１７）肥満関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または糖尿病である、（１０）～（１６）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１８）療法に使用するための、ペントラキシン４阻害剤。
（１９）肥満関連疾患の治療において使用するための、ペントラキシン４阻害剤。
（２０）肥満関連疾患の治療を目的とする薬剤の製造のための、ペントラキシン４阻害剤の使用。
（２１）治療上有効量のペントラキシン４阻害剤を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、肥満関連疾患を治療する方法。
　本発明によれば、神経系制御による糖/脂質調節機構を人為的に修正することにより、エネルギー代謝制御の適正化を図ることが可能となる。例えば、本発明によれば、脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、または熱産生亢進による基礎代謝の亢進が可能となる。また、本発明によれば、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗線維化などの効果を得ることが可能となる。また、本発明によれば、非アルコール性脂肪肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis：ＮＡＳＨ）や糖尿病等の肥満関連疾患に対する新規治療薬を提供することが可能となる。つまり、本発明によれば、代謝制御性神経回路による糖/脂質調節機構に対して人為的に介入することにより、エネルギー代謝制御の適正化を図ることで、肥満を基盤とした中性脂肪蓄積過多により発症する非アルコール性脂肪性肝炎、そして糖尿病などの肥満関連疾患の新規治療薬を提供することが可能となる。
野生型マウスの肝臓組織ホモジネート懸濁液の外観を示す。懸濁液上清の浮遊物が脂質成分、懸濁液の沈殿物がグリコーゲンなどの糖化物質である。 野生型マウスの肝臓組織中のグリコーゲンおよびトリグリセリドの含有量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。 野生型マウスの精巣上脂肪組織の外観を示す。上がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）であり、白色様色調を示す。下がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）であり、赤褐色を示す。スケールバーは５ｍｍである。 野生型マウスの体重、精巣上脂肪組織の重量、および褐色脂肪組織の重量を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。精巣上脂肪組織の重量の棒グラフ中の縦軸ＷＡＴ（％）は、精巣上脂肪組織の重量（％）を表す。褐色脂肪組織の重量の棒グラフ中の縦軸ＢＡＴ（％）は、褐色脂肪組織の重量（％）を表す。 高脂肪食肥満モデルマウスの白色脂肪組織中のメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。 非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスの精巣上脂肪組織中のメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。 糖質および脂質の代謝に関する遺伝子、炎症に関する遺伝子、およびベータ酸化に関連する遺伝子の、野生型マウスの肝臓におけるメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。縦軸はコントロール群の発現量を１とした場合のＰｔｘ４阻害群の発現量の比を示す。 野生型マウスの肝臓におけるメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。 野生型マウスの血漿中のグルコースおよび脂質含有量を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。 野生型マウスの肝臓におけるインスリンシグナル関連タンパク質のウェスタンブロット法による発現量の比較を示す。左側がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、右側がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。 レプチン遺伝子欠損モデルマウスの肝臓組織切片のＰＡＳ染色の写真を示す。左側がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、右側がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）であり、上側が拡大４０倍、下側が拡大２００倍の写真である。アスタリスクは中心静脈を示し、横長で右向きに細くなる三角形はその先に脂肪滴が見られることを示す。 レプチン遺伝子欠損モデルマウスの肝臓組織中のグリコーゲンおよびトリグリセリドの含有量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。 糖質および脂質の代謝に関連する遺伝子、炎症に関連する遺伝子およびベータ酸化に関連する遺伝子の、レプチン遺伝子欠損モデルマウスの肝臓におけるメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。縦軸はコントロール群の発現量を１とした場合のＰｔｘ４阻害群の発現量の比を示す。 酸化ストレスに関連する遺伝子の、レプチン遺伝子欠損モデルマウスの肝臓におけるメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。縦軸はＳｏｄ２遺伝子の発現量の３６ｂ４遺伝子の発現量に対する比を示す。 脂質代謝に関連する遺伝子、炎症に関連する遺伝子、ベータ酸化に関連する遺伝子および酸化ストレスに関連する遺伝子の、高脂肪食肥満モデルマウスの肝臓におけるメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。酸化ストレスに関連する遺伝子についてのグラフの縦軸は、Ｓｏｄ２遺伝子の発現量の３６ｂ４遺伝子の発現量に対する比を示す。 高脂肪食肥満モデルマウスにおける血糖値および血漿インスリン濃度の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。 非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスの肝臓組織中のグリコーゲンおよびトリグリセリドの含有量を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。 非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスの肝臓組織切片のＨＥ染色の写真を示す。左側がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、右側がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）において、門脈周囲(ＰＶ)に白く抜けた領域の面積の減少(脂肪滴の減少)が認められる。 繊維化に関連する遺伝子、酸化ストレスに関連する遺伝子、糖質および脂質の代謝に関連する遺伝子、炎症に関連する遺伝子およびベータ酸化に関連する遺伝子の、非アルコール性脂肪性肝炎モデルマウスの肝臓におけるメッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。酸化ストレスに関連する遺伝子についてのグラフの縦軸は、Ｓｏｄ２遺伝子の発現量の３６ｂ４遺伝子の発現量に対する比を示す。また、繊維化に関連する遺伝子ｃｏｌｌａｇｅｎ３ａについてのグラフの縦軸は、ｃｏｌｌａｇｅｎ３ａ遺伝子の発現量の３６ｂ４遺伝子の発現量に対する比を示す。 レプチン遺伝子欠損モデルマウスの体重の変化と経口摂食量の比較を示す。体重の変化のグラフにおいて、横軸はＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４i）を投与した日を０日とした場合の経過日数を示し、縦軸は０日における体重を１００％とした場合の体重の変化率を示す。体重の変化のグラフにおいて黒丸がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、白三角がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。経口摂食量のグラフにおいて、縦軸はＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４i）を投与した日から７日経過した際のマウス１匹あたり１日あたりの飼料の経口摂食量（ｇ）である。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。 野生型マウスの呼吸代謝ケージ分析の結果を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。 レプチン遺伝子欠損モデルマウスの直腸温と肝臓におけるＵＣＰ２遺伝子の発現メッセンジャーＲＮＡの発現量の比較を示す。白棒がコントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）、黒棒がＰｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）である。ＵＣＰ２遺伝子の発現メッセンジャーＲＮＡの発現量のグラフにおいて、縦軸はコントロール群の発現量を１とした場合のＰｔｘ４阻害群の発現量の比を示す。 野生型マウスの累積摂餌量の比較を示す。白丸がコントロール群（ウサギＩｇＧ抗体投与）、黒丸が抗ペントラキシン４ウサギＩｇＧポリクローナル抗体投与群である。 野生型マウスの精巣上体周囲脂肪細胞重量の比較を示す。白棒がコントロール群（ウサギＩｇＧ抗体投与）、黒棒が抗ペントラキシン４ウサギＩｇＧポリクローナル抗体投与群である。
発明の具体的説明
　本発明者らは、肝グリコーゲン消費に相関して肝分泌調節される分子を規定する遺伝子としてペントラキシン４（Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ４）を同定するとともに、この新規肝分泌型代謝調節因子が細胞内シグナル伝達および細胞外シグナル伝達に関与し、肝細胞内代謝調節のみならず、脂肪組織における脂肪分解と褐色脂肪化を引き起こすことを見出した。この新規肝分泌型代謝調節因子によるグリコーゲン・センシングメカニズムにより、脂肪分解、エネルギー消費ならびに摂食行動が強力に調節される。よって、ペントラキシン４の機能阻害により、肥満関連疾患の治療が可能となる。
　ペントラキシン４は、そのＣ末端側に保存された８アミノ酸からなる共通配列を含むペントラキシンドメインを有することを特徴とする、多機能性タンパク質ペントラキシンスーパーファミリーの一員である。ヒトのペントラキシン４遺伝子の情報は、そのゲノム配列、ｍＲＮＡ配列およびこれによりコードされるアミノ酸配列を含め、ＮＣＢＩデータベースにＧｅｎｅ　ＩＤ：３９０６６７として登録されている。ここに登録されているｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の配列を配列番号２６に、コードされるアミノ酸配列を配列番号２７に示す。本明細書では、ペントラキシン４遺伝子を「Ｐｔｘ４遺伝子」、ペントラキシン４タンパク質を「Ｐｔｘ４タンパク質」と略記する場合がある。
　本発明において、肥満関連疾患としては、糖質であるグリコーゲンと比して中性脂肪を優先的に燃焼させることにより治療効果が見込まれる疾患が挙げられ、例えば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）および糖尿病が挙げられる。また、本発明において肥満関連疾患の治療には、その疾患の根治のみならず、症状の改善も含まれ、例えば、脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、および熱産生亢進による基礎代謝の亢進が挙げられる。また、他の実施態様によれば、本発明における肥満関連疾患の治療には、脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、および肝抗線維化が挙げられる。
　本発明によれば、肥満関連疾患を治療するための薬物をスクリーニングする方法が提供される。この方法では、ペントラキシン４の作用を阻害する候補薬物の能力が指標として用いられ、この能力を有する候補薬物が肥満関連疾患を治療するための薬物として特定される。ここで、ペントラキシン４の作用の阻害は、ペントラキシン４遺伝子の発現の阻害およびペントラキシン４タンパク質の機能の阻害のいずれであってもよい。
　本発明の一つの実施態様によれば、上記の薬物は、ペントラキシン４遺伝子の発現を阻害する能力を指標としてスクリーニングされる。このような能力としては、ペントラキシン４遺伝子のｍＲＮＡの転写開始を阻害する能力、ペントラキシン４遺伝子のｍＲＮＡを分解する能力、該ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する能力などが挙げられる。
　本発明の他の実施態様によれば、上記の薬物は、ペントラキシン４タンパク質の機能を阻害する能力を指標としてスクリーニングされる。このような能力としては、ペントラキシン４タンパク質の細胞外分泌を阻害する能力、神経細胞への移行を阻害する能力、シグナル伝達機能を阻害する能力などが挙げられる。
　本発明のスクリーニング方法は、薬物選定のために使用する指標に応じて、当業者であれば適切に実施することができる。例えば、肝細胞や、遺伝子導入によりペントラキシン４遺伝子が発現するように操作された細胞など、ヒト体内と同じ環境下でペントラキシン４遺伝子を発現する細胞を用意し、候補薬物の存在下および不在下において発現試験を行い、ペントラキシン４のｍＲＮＡ量またはタンパク質量を比較することにより、候補薬物のペントラキシン４遺伝子発現阻害能を測定することができる。また、同様に、ヒト体内と同じ環境下でペントラキシン４タンパク質が作用するアッセイ系を用意し、候補薬物の存在下および不在下において試験を行い、ペントラキシン４タンパク質の機能（細胞外分泌、神経細胞への移行、シグナル伝達機能など）を比較することにより、候補薬物のペントラキシン４タンパク質機能阻害能を測定することができる。本発明の一つの実施態様によれば、Stromal cell line にリポポリサッカライド（LPS）を投与し、ペントラキシン４の転写促進（Martinez de la Torre Y et al., J. Immunol. 184 (9), 5055-5064. 2010）および／または細胞外分泌が惹起される際に流入する細胞内カルシウムイオン濃度を、カルシウムイオン蛍光標識試薬による蛍光強度の変化として測定する。このアッセイ系を用いて、ペントラキシン４阻害作用をもつ候補薬物を選抜し、肥満関連疾患を治療するための薬物として特定することにより、肥満関連疾患を治療するための薬物をスクリーニングすることができる。
　また、ペントラキシン４遺伝子の発現を阻害する能力を指標として、肥満関連疾患を治療するための薬物をスクリーニングするにあたり、たとえば、ペントラキシン４遺伝子の転写調節領域を含んでなるＤＮＡ断片とレポーター遺伝子を含んでなるＤＮＡ断片が作動可能なように連結された核酸分子を用いることが好ましい。ここで、ヒトペントラキシン４遺伝子の転写調節領域の塩基配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ　ＩＤ：３９０６６７に登録された情報より入手することができる。また、マウスヒトペントラキシン４遺伝子の転写調節領域の塩基配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ　ＩＤ：６８５０９に登録された情報より入手することができる。また、レポーター遺伝子としては、該遺伝子の発現産物の検出方法が知られているものであればよく、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子などの発光タンパク質遺伝子、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)遺伝子などの酵素遺伝子、ヒトアザミグリーン(ＨｍＡＧ)蛍光タンパク質遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子および赤色蛍光タンパク質（ＤＳ-ＲＥＤ）遺伝子などの蛍光タンパク質遺伝子などを使用することができる。この中では、発光タンパク質遺伝子を用いることがより好ましく、その中ではルシフェラーゼ遺伝子を用いることがさらにより好ましい。また、「作動可能なように連結」とは、転写調節領域の上流（５’側）又は下流（３’側）に連結された遺伝子が、当該転写調節領域による転写促進作用又は転写抑制作用を受けるように連結されていることを意味する。候補薬剤のペントラキシン４遺伝子の発現を阻害する能力を検出評価するにあたっては、前記核酸分子を導入したイン　ビトロの転写活性評価系、あるいは、前記核酸分子により形質転換された細胞を用いることができる。当該細胞としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、大腸菌などが挙げられるが、好ましくは哺乳動物細胞である。前記核酸分子を導入したイン　ビトロの転写活性評価系、あるいは、前記核酸分子により形質転換された細胞と候補薬剤とを接触させた際に、レポーター遺伝子の発現に基づきペントラキシン４遺伝子の発現を阻害する能力を検出・評価することができる。これらに関連する遺伝子操作、レポーター遺伝子発現の検出および候補薬物のスクリーニングの一般的な手法については、当業者によく知られた手法を用いることができる。
　また、候補薬物をペントラキシン４タンパク質の機能を阻害する能力を指標としてスクリーニングするにあたり、ペントラキシン４タンパク質に特異的に結合する物質を一次候補物質として選抜する工程を含むことが好ましい。ここで、ペントラキシン４タンパク質は、固定化されていることがより好ましい。このような選抜工程は当業者に一般に知られたいずれの手法をも用いることができ、たとえば、被験物質が環状ペプチドの場合、TRAP display法（T. Ishizawa,T. Kawakami, P. C. Reid, H. Murakami (2013) J. Am. Chem. Soc. 135, 5433-5440）、あるいは、特開２０１４－１２７３５２、特開２０１３－０４６６３７、ＷＯ２０１４／１１９６００、ＷＯ２０１１／０４９１５７に記載の方法に従って行ってもよい。このような選抜方法で得られた一次候補物質を、本明細書に記載された肥満関連疾患を評価する系に投与して評価することにより、候補薬物をスクリーニングすることができる。
　本発明のスクリーニング方法では、小分子、低分子物質、高分子物質、核酸分子、タンパク質、ペプチド（環状ペプチドを含む）など、様々なタイプの物質を候補薬物とすることができる。
　さらに、本発明によれば、ペントラキシン４阻害剤を含んでなる、肥満関連疾患を治療するための医薬組成物が提供される。また、本発明によれば、治療上有効な量のペントラキシン４阻害剤を、それを必要とする被検体に投与することを含んでなる、肥満関連疾患を治療または予防する方法が提供される。さらに、本発明によれば、肥満関連疾患を治療するための薬剤の製造における、ペントラキシン４阻害剤の使用が提供される。また、本発明によれば、肥満関連疾患を治療するためのペントラキシン４阻害剤が提供される。ペントラキシン４阻害剤としては、小分子、低分子物質、高分子物質、核酸分子、タンパク質、ペプチド（環状ペプチドを含む）など、様々なタイプの物質を用いることができる。
　治療または予防の対象となる被検体は、好ましくは哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物とされる。
　本発明の好ましい実施態様によれば、ペントラキシン４阻害剤は、ペントラキシン４遺伝子の発現を特異的に阻害するＲＮＡiメディエーターとされる。本明細書において、「ＲＮＡiメディエーター」とは、ｓｉＲＮＡそのものだけでなく、標的細胞中にｓｉＲＮＡを導入しうる、より長い二本鎖ＲＮＡ分子をも意味する。ＲＮＡiメディエーターは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって特定遺伝子の発現を阻害することができる、周知のツールである（Elbashir, S.M. et al., Nature 411, 494-498, 2001）。ｓｉＲＮＡは、典型的には、標的遺伝子のｍＲＮＡに特異的な配列に相同な、１９～２１塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる。上記の二本鎖ＲＮＡ分子は、典型的には、ｓｉＲＮＡに相当する二本鎖部分を有するより長いヌクレオチド配列を含んでなる。また、この二本鎖ＲＮＡ分子は、ヘアピン構造を有するものとしてもよい。このようなＲＮＡiメディエーターは、発現を抑制したい遺伝子の配列に基づいて、当業者であれば容易に設計することができる。
　さらに、前記ＲＮＡiメディエーターは、細胞中に送達された適切なベクターによって発現させることもできる。従って、ペントラキシン４阻害剤は、ペントラキシン４遺伝子の発現を特異的に阻害するＲＮＡiメディエーターを発現するベクターとしてもよい。このようなベクターは、当技術分野において周知の標準的な手順により、容易に構築することができる（Bass, B.L., Cell 101, 235-238, 2000；Tavernarakis, N. et al., Nat. Genet. 24, 180-183, 2000；Malagon, F. et al., Mol. Gen. Genet. 259, 639-644, 1998；Parrish, S. et al., Mol. Cell 6, 1077-1087, 2000）。
　本発明に用いられるペントラキシン４阻害作用をもつＲＮＡiメディエーターの塩基配列の例（ＲＮＡｉ塩基配列１）を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上述のＲＮＡｉ塩基配列１に示す塩基配列のほか、ペントラキシン４遺伝子の発現阻害作用を有する限りにおいて、この塩基配列は、ヌクレオチド残基の挿入、欠失または置換などの変異を有していてもよい。このような変異の位置は特に制限されるものではない。
また、このような変異の数は特に制限されるものではないが、例えば１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１または２個、さらに好ましくは１個とされる。さらに、この変異は、挿入、欠失および置換のいずれか一つまたは複数の組み合わせであってよいが、好ましくは置換とされる。
　本発明の他の好ましい実施態様によれば、ペントラキシン４阻害剤は、ペントラキシン４タンパク質の全部またはその部分ペプチドを認識する抗体とされる。より好ましくはペントラキシン４タンパク質に特異的に結合する抗体とされる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体とされる。また、この抗体は、ペントラキシン４タンパク質に特異的に結合するとともに、該タンパク質の機能を阻害するものであることが好ましい。
　本発明に用いられる抗体を作製するための抗原ペプチドのアミノ酸配列の例を以下の表２に示す（アミノ酸配列１～３）。アミノ酸配列１は、マウスペントラキシン４タンパク質の２２１～２３４番目のアミノ酸残基を包含する。アミノ酸配列２は、マウスペントラキシン４タンパク質の４０６～４１８番目のアミノ酸残基を包含する。アミノ酸配列３は、マウスペントラキシン４タンパク質の４０６～４１８番目のアミノ酸残基に相当するヒトペントラキシン４タンパク質のアミノ酸残基を包含する。アミノ酸配列２とアミノ酸配列３とは高い相同性をもち、アミノ酸配列２を持つ抗原ペプチドを用いて作成された抗体はヒトペントラキシン４タンパク質と交叉反応を示す可能性が高い。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上述のアミノ酸配列１～３に示すアミノ酸配列のほか、ペントラキシン４阻害作用を有する抗体を産生することができる限りにおいて、このアミノ酸配列は、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換などの変異を有していてもよい。このような変異の位置は特に制限されるものではない。また、このような変異の数は特に制限されるものではないが、例えば１～数個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１または２個、さらに好ましくは１個とされる。さらに、この変異は、挿入、欠失および置換のいずれか一つまたは複数の組み合わせであってよいが、好ましくは置換とされ、より好ましくは保存的置換（あるアミノ酸残基を類似の性質を有する他のアミノ酸残基に置換すること）とされる。
　本発明の他の好ましい実施態様によれば、ペントラキシン４阻害剤は小分子とされる。このような小分子は、本発明のスクリーニング方法によって得ることができる。
　ペントラキシン４阻害剤は、局所、静脈内、皮下、筋肉内、経口、直腸、粘膜など、適切な経路で投与することができる。また、その治療上の有効量は、症状の重篤度、被検者の年齢、用いられる具体的な薬物の有効性、投与経路、投与の頻度などに従って、医師または獣医によって適宜決定される。一般的には、前記治療上有効量は、一日当たり、約０．００１～約１０００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは約０．０１～約１０ｍｇ／体重ｋｇ、より好ましくは約０．０１～約１ｍｇ／体重ｋｇである。
　ペントラキシン４阻害剤は、肥満関連疾患を治療するためのペントラキシン４阻害剤以外の薬剤と組み合わせて投与することができる。ここで、「組み合わせて投与する」には、（ｉ）ペントラキシン４阻害剤およびのペントラキシン４阻害剤以外の薬剤を同じ製剤に混合して投与する、（ｉｉ）ペントラキシン４阻害剤およびのペントラキシン４阻害剤以外の薬剤を別々の製剤として調製し、同時に投与する、（ｉｉｉ）ペントラキシン４阻害剤およびのペントラキシン４阻害剤以外の薬剤を別々の製剤として調製し、それぞれ別々のタイミングで投与する、のいずれでもよい。投与されるペントラキシン４阻害剤および当該他の薬剤の用法、用量、投与タイミングや投与間隔等は、それぞれ、当業者に知られた技術常識により決定される。
　ペントラキシン４阻害剤は、薬学的に許容可能な担体とともに投与することができる。従って、本発明によれば、ペントラキシン４阻害剤および薬学的に許容可能な担体を含んでなる、肥満関連疾患を治療するための医薬組成物が提供される。
　薬学的に許容可能な担体、例えば、ベヒクル、賦形剤、希釈剤等は、投与経路、用いられる具体的な薬物の性質などに応じて、当業者により適宜選択される。
　以下の例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例Ａ．方法
実施例Ａ（１）動物
　オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（週齢７）はＪａｐａｎ　ＣＲＥＡ、三協ラボから購入した。レプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）は、Ｊａｐａｎ　ＣＲＥＡから入手した。マウスはケージに入れて、後に別の温度管理条件を明記する場合を除き常温（２４℃）の温度管理の下、１２時間の明暗サイクルで飼育した。
　高脂肪食肥満（ＤＩＯ(Diet induced obesity)）モデルマウス、および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウス作出目的を除くすべての実験において、飼料として、２５．６％（ｗｔ／ｗｔ）の蛋白質、３．８％の繊維質、６．９％の灰分、５０．５％炭水化物、４％の脂肪及び、９．２％の水分の組成の標準飼料を使用した。一方で、高脂肪食肥満（ＤＩＯ(Diet induced obesity)モデルマウスを作出するために、オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（週齢７）に、高脂肪飼料（６０％脂肪含有量、ラード使用）を給餌した。また、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウスを作出するために、オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（週齢７）にＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｄｉｅｔ社より販売されている超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料（ＣＤＡＨＦＤ、Ａ０６０７１３０２）を３週間給餌した。
実施例Ａ（２）Ｐｔｘ４ＲＮＡｉアデノウイルスベクターの作製
　ペントラキシン４遺伝子の発現を特異的に抑制するＲＮＡiメディエーターを発現するベクターを作製するために、ＨＥＫ２９３細胞株に対するＲＮＡｉ塩基配列１オリゴマー（その塩基配列は表１に記載されている）をエントリーベクターｐＥＮＴＲ／Ｕ６に挿入し、組換体をアデノウイルスベクター ｐＡｄ－ＤＥＳＴおよびＧａｔｅｗａｙ　ＬＲ　ｃｌｏｎａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に混合し、ＤＨ５α大腸菌株に導入し、アデノウイルス組換体ＤＮＡ（ｓｈＰｔｘ４アデノウイルスベクター;ｐＡｄ－Ｐｔｘ４ｉ）を得た。上記で得られたＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４i）をＨＥＫ２９３細胞株へトランスフェクションに供し増幅し、ＰＤ－１０　ｃｏｌｕｍｎ（ＢＤ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ）を用いて１－５ｘ１０１１ｐｌａｑｕｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ （ｐ．ｆ．ｕ．）／ｍｌに濃縮精製した。
実施例Ａ（３）Ｐｔｘ４ＲＮＡｉアデノウイルスベクターのマウスへの導入と各組織試料の調製
　Ｐｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４ｉ）を、２－８ｘ１０８Ｐｌａｑｕｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ　（ｐ．ｆ．ｕ．）／ｂｏｄｙの投与量で、マウスに静脈注射した。各タイムポイントでマウスの精巣上脂肪組織と肝を速やかに切除し液体窒素中で凍結した。また組織学的検索試料として、４％ＰＦＡに浸し固定した。
実施例Ｂ．解析
実施例Ｂ（１）肝脂肪含有量分析
　液体窒素中に保存された０．２ｇの肝臓組織試料を破砕装置で均一にホモジェナイズし、マイクロチューブにて試料を秤量した。このホモジェナイズされた組織試料から２００ｍｇサンプリングし、これに２ｍｌのクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）を添加して、肝含有脂質を４８時間４℃で有機溶媒中に抽出した。その後、得られた抽出液をガラス管中に１００μｌ注入し乾燥させ有機溶媒抽出液中の有機溶媒を自然乾燥させ除去した。ペレットとなった抽出物をイソプロパノールで溶解し、酵素法（ワコーＴＧ測定キット）による脂質測定を行った。反応液の吸光度を測定し、肝臓組織１ｇ当たりの脂質量（ｍｇ）を算出した。
実施例Ｂ（２）肝グリコーゲン含有量分析
　肝重量に対して５倍量の０．６Ｎ過塩素酸を加え、破砕装置で均一にホモジェナイズし、このホモジェナイズされた組織試料０．１ｇに３０％水酸化カリウム溶液２５０μｌを加え５分煮沸撹拌し氷冷した。その後、２％硫酸化ナトリウム５０μｌと６６％エタノール８００μｌを加え撹拌し、再度６６％エタノールでペレットを洗浄し３ｍｌ蒸留水に懸濁した。アミログルコシダーゼ溶液を加え、５５℃温浴槽で３０分煮沸撹拌した。得られた上清中のグリコーゲンを５７０ｎｍの吸光度によりグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）色素法で測定した。得られた吸光度から、肝臓組織１ｇ当たりのグリコーゲン質量（ｍｇ）を算出した。
実施例Ｂ（３）血漿生化学的解析
　血漿中解析において、マウスの血漿中のインスリン量はマウス高感度インスリン測定キット（モリナガ）を用いて測定した。マウスの血漿中の血漿中性脂肪量、グルコース量、遊離脂肪酸量は、それぞれワコー　トリグリセリドテストワコー、グルコースＣＩＩテストワコー、ＮＥＦＡ　Ｃ－テストワコー　（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて測定した。
実施例Ｂ（４）組織の遺伝子発現量解析
ＲＮＡ発現量の測定
　ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１．５ｍｌ中に肝臓１片を入れ、破砕装置で均一に、即座にホモジナイズした。このホモジナイズ溶液を遠心分離（１５０００r.p.m、５分間）して上清を採取し、０．３ｍｌのクロロホルムを添加し、攪拌後に再度遠心分離を行い（１５０００r.p.m、１５分間）、上層を回収した。得られた上層に０．７５ｍｌのイソプロパノールを加えて遠心分離（１５０００r.p.m、１５分間）を行いｍＲＮＡを沈殿させた。ｍＲＮＡ含有沈殿物を８０％エタノールで２回洗浄し、０．５ｍｌの蒸留水に溶解してｍＲＮＡ量の測定に供した。ｍＲＮＡを一定量に合わせ、逆転写酵素（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ ;Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡを作製した。作製したｃＤＮＡと標的遺伝子のプライマーを用いて定量ＲＴ－ＰＣＲ法(ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｄｙｅ; Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ)で遺伝子発現量を測定した。遺伝子発現量の測定のために使用した標的遺伝子とプライマーデザインは以下に示す（表３および表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例Ｂ（５）肝臓組織のＰＡＳ染色
　４％ＰＦＡ固定肝組織を脱パラフィン処理し、１％過ヨウ素酸水溶液にて１０％反応させ、流水で５分洗浄した。シッフ試薬にて１０分反応させ、次いで０．５％重亜硫酸水溶液にて反応させた後、流水で洗浄５分した。マイヤー・ヘマトキシリン液にて核染色して再度流水で洗浄し、９５％アルコール、次いで１００％アルコールにより脱水して透徹・封入した。
実施例Ｂ（６）肝臓組織のＨＥ染色
　４％ＰＦＡ固定肝組織を脱パラフィン処理し、ヘマトキシリン液の入った染色瓶に浸漬し、１～５分反応させた。その後５分間流水で水洗した後、エオジン溶液と５～１０分間反応させ、水でリンスした。その後、９０％エタノール、次いで９５％エタノール、次いで無水エタノールに浸漬し、脱水し、キシレンに浸漬した後、封入した。
実施例Ｂ（７）ウェスタンブロッティング
　インスリンシグナルタンパク質（ｐ－ＩＲ、p－Ａｋｔ、ｐ－Ｓ６Ｋ、ｐ－ＧＳ、ｐ－Ｆｏｘｏ）の１次抗体として、それぞれＣｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｉｎｓｕｌｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒβ（Ｔｙｒ１３６１）（８４Ｂ２）Ｒａｂｂｉｔ　ｍＡｂ＃３０２３、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）Ａｎｔｉｂｏｄｙ＃９２７１、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ７０Ｓ６Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ３８９）Ａｎｔｉｂｏｄｙ＃９２０５、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＧｌｙｃｏｇｅｎＳｙｎｔｈａｓｅ（Ｓｅｒ６４１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ＃３８９１、Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＦｏｘＯ１（Ｔｈｒ２４）／ＦｏｘＯ３ａ（Ｔｈｒ３２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ＃９４６４を入手して使用し、そのキットに添付されたプロトコールに従って、実施した。
実施例Ｂ（８）呼吸代謝ケージ分析
　アルコシステム社製の呼吸代謝ケージ（ＡＲＣＯ－２０００シリーズ）を用い、至適環境下で、呼吸代謝ケージ分析を実施した。
実施例Ｃ . 結果
実施例Ｃ（１）糖/脂質バランスの崩れ（Carbohydrate-lipid imbalance）の改善
　肥満患者において糖/脂質バランスが破綻し、糖質に比して脂肪合成が有意になり、これを発露としたインスリン抵抗性を基盤とする疾病発症を説明する病態メカニズムが存在し（Ide T. Nature cell biol 2004 Apr;6(4):351-7）、この糖/脂質バランスの崩れ（Carbohydrate-lipid imbalance）の改善が根源的な治療基盤となる。本発明者らはＰｔｘ４遺伝子の機能に着目し、Ｐｔｘ４遺伝子をＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４i）で転写阻害したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓内のグリコーゲン含有量と中性脂肪含有量を測定した結果、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓内において、糖質/脂質比率が増加し、脂質合成と比較して糖質合成が増強されることを見出した。
　まず、０．６Ｎ過塩素酸にて加熱処理した肝臓抽出液を静置すると、コントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）では上清に脂質成分が多量に浮遊していたのに対して、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）では、浮遊している脂質成分は認められなかった。また、コントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）の沈殿層にはわずかな量の白色沈殿が確認されるのみであったが、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）では沈殿層に多量の白色沈殿が存在することが確認された（図１）。次に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝臓内のグリコーゲン量と中性脂肪量を測定すると、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）では、コントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）と比較して、グリコーゲン含有量が約１．６倍に増加し、中性脂肪含量が約０．６８倍に低下することが見出された（図２）。
　この結果によると、通常の生理的な飢餓状態では、まず最初に炭水化物系の糖質エネルギー（グリコーゲン）が利用されたのち、脂肪酸系エネルギーとして脂肪組織から脂肪分解された中性脂肪が基質として利用されるが、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害した場合には、まず脂肪組織からあるいは肝細胞内の中性脂肪を基質として最初に利用したのち、炭水化物系の糖質エネルギーを利用するという、生体のエネルギー利用におけるパラダイム・シフトが惹起されることが明らかになった。以上により、肥満患者が示すような糖質合成と比較して脂質合成が優位である糖／脂質代謝バランス異常が、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより、改善されることが期待される。
実施例Ｃ（２）脂肪組織の脂肪分解作用促進とベージュ様脂肪細胞（Ｂｅｉｇｅ　ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）への形質転換
　脂肪組織は、一定の条件の下で、易熱産生能をもつ赤褐色のベージュ脂肪細胞（Ｂｅｉｇｅ－ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）へ形質転換する事が知られている。また、ベージュ様脂肪細胞ではＵＣＰ１の遺伝子発現が亢進し、これが熱産生性に寄与することで、エネルギー燃焼を亢進することが報告されている（Lowell, B.B.,et al. Nature404, 652-660.2000）。そこで、発明者らは、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、このような脂肪組織の変化が起るかどうかを観察した。
　まず、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの精巣上脂肪組織の色調は赤褐色を示し、コントロール（ＬａｃＺ－ｉ）群の精巣上脂肪組織が示す白色様色調（これはマウスの精巣上脂肪組織に通常見られる色調である）とは明らかに異なるものであった（図３）。次に、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、コントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）と比較して体重の減少が認められた（図４）。また、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、コントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）と比較して精巣上脂肪組織（これはヒトにおける内臓脂肪に相当する）の重量が約５０％減少していることが認められた（図４）。さらに、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脂肪組織の発現遺伝子を定量的ＲＴ－ＰＣＲで測定したところ、ベージュ様脂肪細胞において遺伝子発現が亢進するとされるＵＣＰ１の遺伝子発現が有意に上昇していることが明らかとなった（ｐ＜０．０５）。
　また、１９℃の飼育温度条件下の高脂肪食肥満（ＤＩＯ(Diet induced obesity)）モデルマウス、および１９℃の飼育温度条件下の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウスにおいても、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）で同様にベージュ脂肪細胞化することが確認された（図５、図６）。
　以上の結果により、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、肝臓とは異なる組織である脂肪組織において脂肪分解が促進されること、および、脂肪組織での中性脂肪が分解・利用しやすい性質をもつベージュ脂肪細胞様の性質をもつ脂肪細胞へ形質転換することが明らかになった。これは、寒冷刺激などの交感神経系に賦活化によるノルエピネフリンによる刺激によって、ｐ３８、ＭＡＰＫ、ＰＧＣ１αのシグナル・カスケードが亢進し、その結果、熱産生性を亢進させる性質を持つ褐色脂肪細胞やベージュ脂肪細胞への形質転換が促される現象（Cao, W.et al. Mol. Cell. Biol.24,3057-3067. 2004.）に類似のメカニズムが予想される。そして、肝臓内の中性脂肪合成の基質として、脂肪組織から遊離される脂肪酸とグリセロールが凡そ６０％と最も寄与度が高く（Browning JD et al. J Clin Invest. 2004 ;114(2):147-52.）、肝臓内の中性脂肪制御において重要な制御要素であるため、脂肪組織の脂肪分解制御がＰｔｘ４遺伝子の機能の阻害によりもたらされることは、この制御系への大きなインパクトを持つことが理解される。以上により、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより、肝細胞内への中性脂肪滴蓄積を阻害する効果、脂肪分解を増加させる効果、並びに抗肥満効果が発揮されることが期待される。
実施例Ｃ（３）肝臓組織内の転写制御による糖/脂質バランスの改善と（ＳＲＥＢＰ１、ＳＲＥＢＰ２発現減少とＧｙｓ２発現亢進あるいはｐｙｇｌ発現抑制）、抗炎症作用
　肝臓内のグリコーゲン含有量の増加と中性脂肪含有量の低下に伴い、インスリン抵抗性の改善が報告されている（Nakagawa Y　et al. Nat Med. 2006 Jan;12(1):107-13.）。そこで、発明者らは、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、このような肝臓内のインスリン感受性の亢進につながる肝臓組織内の転写制御が起るかどうかを観察した。
　まず、肝臓組織内でのｄｅ　ｎｏｖｏの脂肪合成系（中性脂肪・コレステロール合成系）遺伝子であるＳＲＥＢＰ－１ｃおよびＳＲＥＢＰ－２は、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、転写レベルでも抑制されることが見出された(図７ａ）。一方で、肝臓組織内でのグリコーゲン合成遺伝子であるＧｙｓ２は、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、転写レベルでその遺伝子発現が亢進されることが見出された(図７ａ）。また、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、肝臓内のＣＰＴ－１ａの遺伝子発現が増加し（図７ｃ）、ベータ酸化が亢進していることが推認された。さらに、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、上述の事象と一貫性をもって、炎症惹起性転写因子であるＩＫＫ－β、ＮＦκＢの遺伝子発現量の低下と炎症性サイトカインＩＬ－１β遺伝子発現量の低下が見出された（図７ｂ）。さらに１９℃の飼育温度条件下において、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）では酸化ストレスマーカーであるＳｏｄ２の発現も低下し、肝細胞内の酸化ストレスも減少していることが確認された。（図８）なお、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害しても、随時血漿中の血糖値、インスリン値、中性脂肪、遊離脂肪酸については特に有意変動は見られない（図９）。
　また、１９℃の飼育温度条件下において、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）にＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４i）を投与し、１週間後に解剖し、肝臓からタンパク質を抽出し、インスリンシグナル関連タンパク質の発現についてウェスタンブロット法を用いて解析を行った。Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）でインスリンシグナルの改善が見られ、肝臓におけるインスリン感受性の亢進が示唆され、Ｐｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４i）を投与することにより、インスリン抵抗性（肥満関連炎症性変化）を改善する効果が確認された（図１０）。
実施例Ｃ（４）肥満病態モデルにおける糖／脂質バランスの崩れ（Carbohydrate-lipid imbalance）の改善効果による脂肪肝改善およびその炎症抑制作用
　上述した（１）～（３）の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでの解析結果から、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより、１）肝臓での糖／脂質バランスにおいて、脂肪酸優位に利用亢進（β酸化亢進）、２）ｄｅ　ｎｏｖｏ脂肪合成系遺伝子発現の低下、３）抗炎症作用の惹起、４）酸化ストレスの減少等が見出されたが、これらと同様の作用効果が、治療効果として肥満病態モデルにおいても発揮されるか確認を行った。肥満病態モデルとして、高脂肪食肥満（ＤＩＯ(Diet induced obesity)）モデルマウス、レプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）を用いて解析を進めた。
　まず、レプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）にＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４i）を静脈注射により投与した。肝臓組織化学的解析としてＰＡＳ染色を行った（図１１）。図１１において、アスタリスクは中心静脈を示し、横長で右向きに細くなる三角形はその先に脂肪滴が見られることを示す。コントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）のレプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）では、門脈・中心静脈を中心に多数の大きな脂肪滴が貯留しているのが確認されたが、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）のレプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）では、著しく脂肪滴数が減少し、さらに脂肪滴径の低下が確認された（図１１）。また、コントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）のレプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）では、ＰＡＳ染色されるグリコーゲンを代表とする糖鎖をもつ各種多糖類が増加することが確認されたが、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）のレプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）では、より著しく青紫色に強染色されたＰＡＳ陽性細胞数が増加した（図１１）。これを定量化すると、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの解析と同様に、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより、肝臓内グリコーゲン量の増加と、中性脂肪含量の低下が確認された（図１２）。
　これらにより、レプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）においても、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより、糖／脂質バランスの崩れ（Carbohydrate-lipid imbalance）の改善効果が発揮されることが見出された。
　次に、レプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）の脂肪肝組織内においてもｄｅ　ｎｏｖｏの脂肪合成系遺伝子（ＳＲＥＢＰ－１ｃおよびＳＲＥＢＰ－２）の遺伝子発現は、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより、転写レベルでも抑制され、一方で、脂肪肝組織内でのグリコーゲン合成遺伝子であるＧｙｓ２は、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、転写レベルでその遺伝子発現が亢進されることが見出された(図１３ａ）。また、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、脂肪肝組織内のＣＰＴ－１ａの遺伝子発現が増加し（図１３ｃ）、ベータ酸化が亢進していることが推認された。さらに、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、炎症惹起性転写因子であるＩＫＫ－β、ＮＦκＢの遺伝子発現量の低下と炎症性サイトカインＩＬ－１β遺伝子発現量の低下が見出された（図１３ｂ）。さらに１９℃の飼育温度条件下において、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）では酸化ストレスマーカーであるＳｏｄ２の発現も低下し、肝細胞内の酸化ストレスも減少していることが確認された（図１４）。
　また、１９℃の飼育温度条件下の高脂肪食肥満（ＤＩＯ(Diet induced obesity)）モデルマウスにおいても同様な遺伝子発現が肝臓内で確認され、肥満モデルにおけるＰｔｘ４遺伝子の阻害効果が一貫して確認された（図１５）。
　また、１９℃の飼育温度条件下の高脂肪食肥満（ＤＩＯ(Diet induced obesity)）モデルマウスに、Ｐｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４i）を投与し、１週間後の全血を用いた随時血糖値、更に血漿インスリン濃度をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。その結果、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）では血糖値の顕著な低下及び、血中のインスリン値の低下傾向が観察された（図１６）。
実施例Ｃ（５）非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）治療剤のＰｒｏｏｆ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｐｔ
　これらにより、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、中性脂肪蓄積に伴う非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の発症予防、治療効果が発揮されることが期待された。そこで、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料（ＣＤＡＨＦＤ）を３週間給餌し、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウス（ＣＤＡＨＦＤ　ＮＡＳＨモデル）を作出した。その後Ｐｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４i）を投与し、１週間後の肝臓中の中性脂肪(Triglyceride)及びグリコーゲン含有量を測定した。飼育温度条件はすべて１９℃であった。その結果、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウス（ＣＤＡＨＦＤ　ＮＡＳＨモデル）において、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）では、肝臓中グリコーゲン含有量の増加傾向及び、中性脂肪含有量の低下傾向が観察された（図１７）。
　また、上述した１９℃の飼育温度条件下におけるアルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウスに、Ｐｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４i）を投与し、その投与１週間後における肝臓の組織学的評価を行った。その結果、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）において、門脈周囲（ＰＶ）に白く抜けた領域の面積の減少(脂肪滴の減少)が認められ、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の病態の一つの指標である脂肪肝の改善が示唆された（図１８）。
　次に、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することによる、各モデルマウスにおける抗酸化作用を検討することを目的として、肝臓における高酸化ストレスの指標の一つであるスーパーオキシドジスムターゼ２（Ｓｏｄ２）のｍＲＮＡ発現量を検討した。その結果、野生型マウス、高脂肪食肥満（ＤＩＯ(Diet induced obesity)）モデルマウス、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルマウス（ＣＤＡＨＦＤ　ＮＡＳＨモデル）の各群において、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）では、Ｓｏｄ２ｍＲＮＡ発現量の有意な低下及び、低下傾向が観察された（図８、図１５および図１９）。このことからＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４i）の投与によって、肝臓内での非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルにおける酸化ストレスが軽減し、ｍＲＮＡ発現量の低下に結びついたことが示唆された。
　さらに、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することによる、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の肝線維化に対する効果として、肝臓内のCollagen1a, Collagen3a ｍＲＮＡ発現量を確認したところ、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）では各線維化マーカーの減少が認められ、Ｐｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４i）の投与により非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の肝線維化増悪を改善させる働きがあることが確認された（図１９）
　以上の結果はＦＤＡ（米国食品医薬局）の定める非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）治療剤のＰｒｏｏｆ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｐｔにおけるＰｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓである、（ｉ）肝脂肪含量の低下、および（ｉｉ）細胞障害マーカー（炎症・酸化ストレスマーカー・線維化マーカー）発現量の低減のすべての基準をクリアする治療成績を示している。
　肝臓内の含有脂肪の基質は、ｉ）脂肪組織からの遊離脂肪酸が６０％、ｉｉ）ｄｅ　ｎｏｖｏ脂肪合成が２６％、それからｉｉｉ）摂食されるグルコースや脂肪からが１４％である(Kerry L. et al. J Clin Invest. 2005;115(5):1343-1351. doi:10.1172/JCI23621)。そこで、発明者らは、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、摂食されるグルコースや脂肪の量が減少するかどうかをレプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）で確認した。
　その結果、レプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）において、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、経口摂食量の低下と体重の減少が確認された（図２０）。
　以上の結果により、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することによる摂食量の低下と体重の減少効果が、病態としての肥満に対しても有効であることが明らかになった。既存の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）治療薬の有効成分としては、ＰＰＡＲγアゴニストやビタミンＥ等が知られているが（Hardy T. et al. Current opinion in Gastroenterology 31(3): 175-183. 2015）、肝臓内の中性脂肪蓄積に関与する流入経路であるｉ）～ｉｉｉ）の三系統とも制御可能なメカニズムをもつ有効成分は、現在までに発見されていない。したがって、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）をターゲットにした新しい効果を発揮する新規薬剤としての臨床的効果が期待される。
実施例Ｃ（６）疑似冬眠状態における代謝制御による臓器保護、疾病予防効果
　１９℃の飼育温度条件下において、野生型マウス(Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ)にＰｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４i）を投与し、その後２４時間の酸素消費量（ＶＯ２）及び呼吸商（ＲＱ）を呼吸代謝ケージを用いて測定した。得られた結果からグラフを作成し、曲線下面積(Area Under the Curve: AUC)を求めた。その結果、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）の野生型マウスにて（Ｃ５７ＢＬ６/Ｊ）、酸素消費量（ＶＯ２）が有意に低下し生体代謝反応を低下させるとともに、呼吸商（ＲＱ）が低下することが確認された（図２１）。
　また、Ｐｔｘ４阻害群（Ｐｔｘ４－ｉ）のレプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）では、コントロール群（ＬａｃＺ－ｉ）のレプチン遺伝子欠損モデルマウス（Ｌｅｐｏｂ／Ｌｅｐｏｂ）と比較して、直腸温（深部体温）が約０．９℃低下することが観察され、肝臓のＵＣＰ２遺伝子発現が低下することが認められた（図２２）。
　この現象を説明できるメカニズムは詳細には明らかにされていないが、生理的な代謝レベルを低下させること、あるいは体温を低下させる生理的な条件として明らかになっているものとしては冬眠（Ｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ）、休眠（Ｔｏｒｐｏｒ）が知られている。また、肝臓から分泌される分子が直接脳に働きかけ冬眠を引き起こすｈｉｂｅｒｎａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＰ）が報告されている（Kondo N et al. Cell. 2006 Apr 7;125(1):161-72.）。
　冬眠により惹起される所見と、本発明においてＰｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより惹起される所見との共通点として、基礎代謝を低下させること、体温が低下すること、および脂肪酸系エネルギーの優位性が挙げられる。この一致した生理学的所見は、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することで、生体は疑似冬眠代謝状態に移行すると推認され、Ｐｔｘ４遺伝子がコードする遺伝子産物であるペントラキシン４（Ｐｔｘ４）タンパク質の本質的な生理作用を説明する切り口として重要であると考えられる。
　また、冬眠における代謝状態の特徴として、低体温の維持(Hochachk et al. Science, 231 (1986), 234-241)、虚血からの防護（K.U. Frerichs. et al. J. Cereb. Blood Flow Metab., 18 (1998), pp. 168-175）、筋萎縮保護（H.J. Harlow　et al. Nature, 409 (2001), p. 997）、細菌感染の抑制（V.M. Sharapov. et al. Mycopathologia, 84 (1983), pp. 77-80）、腫瘍形成の抑制（G.B. Kemper et al. Comp. Biochem. Physiol., 73C (1982), pp. 445-450）等の、種々の有害事象から惹起される傷害や疾病から臓器を保護する効果を持つことが報告されている。
　したがって、Ｐｔｘ４遺伝子の機能を阻害することにより引き起こされると考えられる疑似冬眠代謝状態は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などによる肝硬変化や癌化、あるいは糖尿病による合併症などから臓器保護効果を発揮することが期待される。さらに、基礎代謝を軽減し、放射線暴露による細胞障害も軽減することから、長期間にわたる宇宙線からの防御反応を期待され宇宙事業開発への応用も期待される（Cerri M et al. Life Sci Space Res., 90(4)(2016) pp.445-452）。
実施例Ｄ（１）ペントラキシン４タンパク質を認識する抗体の調製
　ペントラキシン４タンパク質を認識する抗体を調製するために、表２に記載されたアミノ酸配列２（配列番号４）のペプチドを用いて、ユーロフィンジェノミクス株式会社の抗体作製サービスにより、抗ペントラキシン４ウサギＩｇＧポリクローナル抗体を調製した。
実施例Ｄ（２）ペントラキシン４タンパク質を認識する抗体のペントラキシン４タンパク質の機能の阻害効果
　生体内における、抗ペントラキシン４ウサギＩｇＧポリクローナル抗体の、ペントラキシン４タンパク質の機能の阻害効果について検討した。抗ペントラキシン４ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（５０μｇ／ｂｏｄｙ）およびコントロールとしてのウサギＩｇＧ抗体（５０μｇ／ｂｏｄｙ）を、それぞれ、１９℃の飼育温度条件下において、野生型マウス(Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ)に静脈注射により投与し、その後７日間、当該抗体によるペントラキシン４タンパク質の機能の阻害効果を観察した。その結果、抗ペントラキシン４ウサギＩｇＧポリクローナル抗体投与群において、投与後から累積摂餌量低下が観察された（図２３）。また、抗ペントラキシン４ウサギＩｇＧポリクローナル抗体投与群において、鼠径部脂肪細胞重量と比較して精巣上体周囲脂肪細胞重量の強い低下傾向が惹起され、インスリン抵抗性が改善されたことが示された（図２４）。これらの結果から、当該抗体の投与により、Ｐｔｘ４ｉアデノウイルスベクター（ｐＡｄ－Ｐｔｘ４i）を投与した場合に観察された結果と同様の、食欲の減少および精巣上体周囲脂肪細胞重量の強い低下傾向が認められ、ペントラキシン４タンパク質の機能の阻害効果が確認された。以上のことから、ペントラキシン４タンパク質を認識する抗体の投与により、肥満関連疾患の病態改善効果が発揮されることが示された。

Claims (21)

  1. 　肥満関連疾患を治療するための薬物をスクリーニングする方法であって、ペントラキシン４の作用を阻害する候補薬物の能力を指標として用い、該能力を有する候補薬物を肥満関連疾患を治療するための薬物として特定することを特徴とする、方法。
  2. 　前記指標が、ペントラキシン４遺伝子の発現を阻害する能力である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記指標が、ペントラキシン４遺伝子のｍＲＮＡの転写開始を阻害する能力、ペントラキシン４遺伝子のｍＲＮＡを分解する能力、または該ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する能力である、請求項２に記載の方法。
  4. 　ペントラキシン４遺伝子の転写調節領域を含んでなるＤＮＡ断片とレポーター遺伝子を含んでなるＤＮＡ断片が作動可能なように連結された核酸分子を用いることを特徴とする、請求項２または３に記載の方法。
  5. 　前記指標が、ペントラキシン４タンパク質の機能を阻害する能力である、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記指標が、ペントラキシン４タンパク質の細胞外分泌を阻害する能力、神経細胞への移行を阻害する能力またはシグナル伝達機能を阻害する能力である、請求項５に記載の方法。
  7. 　ペントラキシン４タンパク質に特異的に結合する物質を一次候補物質として選抜する工程を含むことを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
  8. 　スクリーニングされる薬物が、脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗線維化のための薬物である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　肥満関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または糖尿病である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　ペントラキシン４阻害剤を含んでなる、肥満関連疾患を治療するための医薬組成物。
  11. 　ペントラキシン４阻害剤が、ペントラキシン４遺伝子の発現を特異的に阻害するＲＮＡiメディエーターである、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 　ペントラキシン４阻害剤が、ペントラキシン４遺伝子の発現を特異的に阻害するＲＮＡiメディエーターを発現するベクターである、請求項１０に記載の医薬組成物。
  13. 　ペントラキシン４阻害剤が、ペントラキシン４タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項１０に記載の医薬組成物。
  14. 　ペントラキシン４阻害剤が、配列番号４に記載されたペプチドを認識する抗体である、請求項１０に記載の医薬組成物。
  15. 　前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
  16. 　脂肪分解亢進による肥満の改善、インスリン抵抗性の改善、ベージュ脂肪細胞化による耐肥満性の獲得、肝脂肪蓄積低減、肝炎症低減、抗酸化ストレス獲得、または肝抗線維化のための、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  17. 　肥満関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または糖尿病である、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  18. 　療法に使用するための、ペントラキシン４阻害剤。
  19. 　肥満関連疾患の治療において使用するための、ペントラキシン４阻害剤。
  20. 　肥満関連疾患の治療を目的とする薬剤の製造のための、ペントラキシン４阻害剤の使用。
  21. 　治療上有効量のペントラキシン４阻害剤を、それを必要とする被験体に投与することを含んでなる、肥満関連疾患を治療する方法。
PCT/JP2017/018093 2016-05-13 2017-05-12 肝分泌型代謝制御因子阻害作用による肥満関連疾患治療剤 Ceased WO2017195901A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018517100A JP6959913B2 (ja) 2016-05-13 2017-05-12 肝分泌型代謝制御因子阻害作用による肥満関連疾患治療剤
US16/300,325 US20190226002A1 (en) 2016-05-13 2017-05-12 Obesity-related disease therapeutic agent by hepatic secretory metabolic regulator inhibitory action
CN201780029641.1A CN109477088A (zh) 2016-05-13 2017-05-12 通过肝分泌代谢调节剂抑制作用的肥胖相关疾病的治疗剂
EP17796259.4A EP3456824A4 (en) 2016-05-13 2017-05-12 THERAPEUTIC AGENT FOR OBESITY-RELATED ILLNESS BY INHIBITORY ACTION OF METABOLIC HEPATIC SECRETION REGULATOR

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016097233 2016-05-13
JP2016-097233 2016-05-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017195901A1 true WO2017195901A1 (ja) 2017-11-16

Family

ID=60267315

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/018093 Ceased WO2017195901A1 (ja) 2016-05-13 2017-05-12 肝分泌型代謝制御因子阻害作用による肥満関連疾患治療剤

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20190226002A1 (ja)
EP (1) EP3456824A4 (ja)
JP (1) JP6959913B2 (ja)
CN (1) CN109477088A (ja)
WO (1) WO2017195901A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021066053A1 (ja) * 2019-09-30 2021-04-08 国立大学法人筑波大学 冬眠様状態を誘発する方法およびそのための装置

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007517021A (ja) * 2003-12-23 2007-06-28 デフィアンテ・ファルマセウティカ・ソシエダデ・ポル・クオタス・デ・レスポンサビリダデ・リミターダ 長いペントラキシンｐｔｘ３の阻害剤を含む医薬
WO2011049157A1 (ja) 2009-10-22 2011-04-28 ペプチドリーム株式会社 ペプチド翻訳合成におけるrapidディスプレイ法
JP2014127352A (ja) 2012-12-26 2014-07-07 Toyota Motor Corp 密閉型電池の製造方法
WO2014119600A1 (ja) 2013-01-30 2014-08-07 ペプチドリーム株式会社 Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｄｉｓｐｌａｙ法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2009006709A (es) * 2006-12-20 2009-07-02 Xoma Technology Ltd Tratamiento de enfermedades relacionadas con il-1beta.

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007517021A (ja) * 2003-12-23 2007-06-28 デフィアンテ・ファルマセウティカ・ソシエダデ・ポル・クオタス・デ・レスポンサビリダデ・リミターダ 長いペントラキシンｐｔｘ３の阻害剤を含む医薬
WO2011049157A1 (ja) 2009-10-22 2011-04-28 ペプチドリーム株式会社 ペプチド翻訳合成におけるrapidディスプレイ法
JP2013046637A (ja) 2009-10-22 2013-03-07 Peptidream Inc ペプチド翻訳合成におけるｒａｐｉｄディスプレイ法
JP2014127352A (ja) 2012-12-26 2014-07-07 Toyota Motor Corp 密閉型電池の製造方法
WO2014119600A1 (ja) 2013-01-30 2014-08-07 ペプチドリーム株式会社 Ｆｌｅｘｉｂｌｅ Ｄｉｓｐｌａｙ法

Non-Patent Citations (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"NCBI database", Database accession no. 390667
BASS, B.L., CELL, vol. 101, 2000, pages 235 - 238
BROWNING JD ET AL., J. CLIN. INVEST., vol. 114, no. 2, 2004, pages 147 - 52
CAO, W. ET AL., MOL. CELL. BIOL., vol. 24, 2004, pages 3057 - 3067
CERRI M ET AL., LIFE SCI SPACE RES., vol. 90, no. 4, 2016, pages 445 - 452
ELBASHIR, S.M. ET AL., NATURE, vol. 411, 2001, pages 494 - 498
G.B. KEMPER ET AL., COMP. BIOCHEM. PHYSIOL., vol. 73C, 1982, pages 445 - 450
GARLANDA, CECILIA ET AL.: "Pentraxins at the crossroads between innate immunity, inflammation, matrix deposition , and female fertility", ANNUAL REVIEW OF IMMUNOLOGY, vol. 23, 2005, pages 337 - 366, XP002400270 *
H.J. HARLOWET, NATURE, vol. 409, 2001, pages 997
HARDY T. ET AL., CURRENT OPINION IN GASTROENTEROLOGY, vol. 31, no. 3, 2015, pages 175 - 183
HOCHACHK ET AL., SCIENCE, vol. 231, 1986, pages 234 - 241
HUI CHU. SANG ET AL.: "The association between pentraxin 3 and insulin resistance in obese children at baseline and after physical activity intervention", CLINICA CHIMICA ACTA, vol. 413, 2012, pages 1430 - 1437, XP028430966 *
IDE T., NATURE CELL BIOL, vol. 6, no. 4, April 2004 (2004-04-01), pages 351 - 7
IZUMIDA Y., NATURE COMMUN, vol. 4, 2013, pages 2316
K.U. FRERICHS. ET AL., J. CEREB. BLOOD FLOW METAB., vol. 18, 1998, pages 168 - 175
KERRY L. ET AL., J CLIN INVEST., vol. 115, no. 5, 2005, pages 1343 - 1351
KONDO N ET AL., CELL, vol. 125, no. 1, 7 April 2006 (2006-04-07), pages 161 - 72
LOWELL, B.B. ET AL., NATURE, vol. 404, 2000, pages 652 - 660
MALAGON, F. ET AL., MOL. GEN. GENET., vol. 259, 1998, pages 639 - 644
MARTINEZ DE LA TORRE Y ET AL., J. IMMUNOL., vol. 184, no. 9, 2010, pages 5055 - 5064
MARTINEZ DE LA TORRE. YENY ET AL.: "Evolution of the pentraxin family: The new entry PTX4", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 184, 2010, pages 5055 - 5064, XP055558727 *
NAKAGAWA Y ET AL., NAT MED., vol. 12, no. 1, January 2006 (2006-01-01), pages 107 - 13
NATURE CELL BIOL., vol. 6, no. 4, April 2004 (2004-04-01), pages 351 - 7
PARRISH, S. ET AL., MOL. CELL, vol. 6, 2000, pages 1077 - 1087
See also references of EP3456824A4
T. ISHIZAWA; T. KAWAKAMI; P. C. REID; H. MURAKAMI, J. AM. CHEM. SOC., vol. 135, 2013, pages 5433 - 5440
TAVERNARAKIS, N. ET AL., NAT. GENET., vol. 24, 2000, pages 180 - 183
TSUNEO OGAWA ET AL.: "Metabolic syndrome and pentraxin 3", JOURNAL OF ANALYTICAL BIOSCIENCE, vol. 33, no. 4, 2010, JP, pages 339 - 346, XP009513031 *
UNO K; KATAGIRI H ET AL., SCIENCE., vol. 16. 312, no. 5780, 2006, pages 1659 - 9
V.M. SHARAPOV. ET AL., MYCOPATHOLOGIA, vol. 84, 1983, pages 77 - 80

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021066053A1 (ja) * 2019-09-30 2021-04-08 国立大学法人筑波大学 冬眠様状態を誘発する方法およびそのための装置
JPWO2021066053A1 (ja) * 2019-09-30 2021-12-09 国立大学法人 筑波大学 冬眠様状態を誘発する方法およびそのための装置
JP7105429B2 (ja) 2019-09-30 2022-07-25 国立大学法人 筑波大学 冬眠様状態を誘発する方法およびそのための装置
JP2022165960A (ja) * 2019-09-30 2022-11-01 国立大学法人 筑波大学 冬眠様状態を誘発する方法およびそのための装置
JP7653664B2 (ja) 2019-09-30 2025-03-31 国立大学法人 筑波大学 冬眠様状態を誘発する方法およびそのための装置

Also Published As

Publication number Publication date
US20190226002A1 (en) 2019-07-25
JPWO2017195901A1 (ja) 2019-04-18
JP6959913B2 (ja) 2021-11-05
EP3456824A4 (en) 2020-03-11
EP3456824A1 (en) 2019-03-20
CN109477088A (zh) 2019-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. Local hyperthermia therapy induces browning of white fat and treats obesity
Breit et al. The GDF15-GFRAL pathway in health and metabolic disease: friend or foe?
Yang et al. AhR activation attenuates calcium oxalate nephrocalcinosis by diminishing M1 macrophage polarization and promoting M2 macrophage polarization
Yuan et al. Exercise‐induced α‐ketoglutaric acid stimulates muscle hypertrophy and fat loss through OXGR1‐dependent adrenal activation
Morgantini et al. Liver macrophages regulate systemic metabolism through non-inflammatory factors
Zhang et al. ARRB1 inhibits non-alcoholic steatohepatitis progression by promoting GDF15 maturation
Vergoni et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes
Wang et al. Metabolic triggered inflammation in osteoarthritis
Wang et al. Adult type 3 adenylyl cyclase–deficient mice are obese
Cai et al. The effect of HMGA1 in LPS-induced myocardial inflammation
Menon et al. The contribution of visceral fat to improved insulin signaling in Ames dwarf mice
Shaker et al. Vaspin gene in rat adipose tissue: relation to obesity-induced insulin resistance
Kim et al. GPx7 ameliorates non-alcoholic steatohepatitis by regulating oxidative stress
Li et al. JNK downregulation improves olanzapine-induced insulin resistance by suppressing IRS1Ser307 phosphorylation and reducing inflammation
Bi et al. Role for sterol regulatory element binding protein-1c activation in mediating skeletal muscle insulin resistance via repression of rat insulin receptor substrate-1 transcription
Wang et al. Galectin-3 is involved in inflammation and fibrosis in arteriogenic erectile dysfunction via the TLR4/MyD88/NF-κB pathway
Wang et al. Fibroblast growth factor 21 improves diabetic cardiomyopathy by inhibiting ferroptosis via ferritin pathway
Guo et al. A novel NEDD4L-TXNIP-CHOP axis in the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis
Chiu et al. Fluoxetine ameliorates high-fat diet-induced metabolic abnormalities partially via reduced adipose triglyceride lipase-mediated adipocyte lipolysis
Mendes et al. Knocking down amygdalar PTP1B in diet-induced obese rats improves insulin signaling/action, decreases adiposity and may alter anxiety behavior
Chen et al. Adipocyte secreted NRG4 ameliorates age-associated metabolic dysfunction
He et al. Identification of novel biomarker hsa_circ_0003914 for rheumatoid arthritis from plasma exosomes
Wang et al. YTHDF3 suppresses declines in corneal epithelial wound healing through upregulating the Wnt/β-catenin signaling pathway and THBS2 expression in diabetic corneas
Cai et al. The deubiquitinase USP28 maintains the expression of PPARγ and its inactivation protects mice from diet-induced MASH and hepatocarcinoma
Miyazaki et al. Decreased insulin-like growth factor-1 expression in response to mechanical loading is associated with skeletal muscle anabolic resistance in cancer cachexia

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018517100

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17796259

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017796259

Country of ref document: EP

Effective date: 20181213