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WO2017019448A1 - Agents de lutte biologique modifiés et leurs utilisations - Google Patents

Agents de lutte biologique modifiés et leurs utilisations Download PDF

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WO2017019448A1
WO2017019448A1 PCT/US2016/043330 US2016043330W WO2017019448A1 WO 2017019448 A1 WO2017019448 A1 WO 2017019448A1 US 2016043330 W US2016043330 W US 2016043330W WO 2017019448 A1 WO2017019448 A1 WO 2017019448A1
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WO
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cfu
seed
modified
agents
composition
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PCT/US2016/043330
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Inventor
Philip E. Hammer
Janice C. JONES
Michael G. Koziel
Amy Elizabeth SHEKITA
Kelly S. Smith
Scott Joseph Uknes
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AgBiome Inc
Original Assignee
AgBiome Inc
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Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/27—Pseudomonas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • C12R2001/39—Pseudomonas fluorescens

Definitions

  • Pesticide resistance is the decreased susceptibility of a pest population to a control agent at doses that once killed most individuals of the species. Therefore, new products are needed with different modes of action to aid in resistance management.
  • compositions and methods for improving the ability of a population of biological agents or biocontrol agents to compete and survive in a field setting are provided.
  • the modified population of agents is able to grow, compete with other microbial strains and fungi, and provide protection for plants from pathogens.
  • modified biological control agents promote plant growth and yield.
  • modified biological agents and modified populations of such agents that are biocide-tolerant or -resistant; herbicide-tolerant or -resistant; fungicide-tolerant or -resistant; pesticide-tolerant or -resistant; or tolerant or resistant to crop protection chemicals are selected or engineered. In this manner, the protection of crops from disease-causing agents or pests is enhanced.
  • compositions of the invention include selected or engineered biological agents and modified populations of biocontrol agents.
  • modified biological agents can be used as an inoculant or as a seed coating for plants and seeds. They can also be applied as a spray application directly to the aerial parts of plants, and can be mixed with the herbicide or other chemical to which they have been modified to become tolerant.
  • the presence of the modified biological agents under field conditions enhances resistance of the plants to pathogens and promotes plant growth.
  • modified biological agents of the invention can be used with other agents to promote plant growth and yield.
  • Embodiments of the invention include:
  • biocontrol agent is modified by transforming said biocontrol agent with a gene that confers resistance to said herbicide, fungicide, pesticide, or other crop protection chemical.
  • a method for promoting plant growth comprising applying a composition comprising a modified population of biocontrol agents to the soil where said plant is growing.
  • the effective amount of the biocide is such as to selectively control an organism of interest while the crop is not significantly damaged;
  • biocontrol agent comprises the strain deposited as NRRL No. B-50897.
  • biocide is glyphosate
  • effective amount of glyphosate is such as to selectively control weeds while the crop is not significantly damaged.
  • a method for growing a plant comprising planting in an area of cultivation a coated seed composition as set forth in any one of embodiments 55-62.
  • Figure 1 provides a growth curve of the various strains in the presence of glyphosate.
  • a biological agent or biocontrol agent for purposes of the present invention is used to describe a microorganism that is used to control disease-causing plant pathogens and plant pests.
  • the biological control agents of the invention have been modified such that they are able to grow in the presence of at least one biocide.
  • a biocide is a chemical substance which can exert a controlling effect on an organism by chemical or biological means.
  • Biocides include pesticides, such as fungicides; herbicides; insecticides, other crop protection chemicals, and the like.
  • compositions of the invention include one or more isolated biocontrol agents that has been selected for resistance to biocides such as a herbicide, fungicide, pesticide, or other crop protection chemical; a recombinant biocontrol agent that has been transformed to contain a herbicide, fungicide, pesticide, or other crop protection chemical resistant gene; a modified population of biocontrol agents wherein the population is resistant to at least one herbicide, fungicide, pesticide, or other crop protection chemical; and compositions comprising these modified populations of biocontrol agents.
  • the modified population may comprise microorganisms that have been selected for herbicide, fungicide, pesticide, or other crop protection chemical resistance or have been transformed with a gene that confers resistance or tolerance to such herbicide, fungicide, pesticide, or other crop protection chemical.
  • the invention comprises substantially pure cultures, or biologically pure cultures, of such modified biocontrol agents or modified biological agents.
  • a "biologically pure bacterial culture” refers to a culture of bacteria containing no other bacterial species in quantities to be detected by normal bacteriological techniques. Stated another way, it is a culture wherein virtually all of the bacterial cells present are of the selected strain.
  • a modified biocontrol agent includes biocontrol agents that have acquired a trait due to selection pressure and recombinant biocontrol agents that have been transformed with a gene that confers resistance or tolerance to at least one herbicide, fungicide, pesticide, or other crop protection chemical.
  • the invention further encompasses a particular modified biological control agent.
  • Such agent includes AIP1620.
  • a seed, plant or area of cultivation is treated with a combination of an effective amount of the modified biocontrol agent that is resistant to glufosinate and an effective amount of glufosinate, wherein the effective amount of glufosinate is such as to selectively control weeds while the crop is not significantly damaged.
  • the effective amount of the modified biocontrol agent is sufficient to result in a statistically significant increase in plant health, yield and/or growth when compared to the plant health, yield and/or growth that occurs when the same concentration of a non-modified biocontrol agent is applied in combination with the effective amount of the glufosinate or active derivative thereof.
  • the biocontrol agent comprises an effective amount of AIP050999.
  • Example 1 Production of glyphosate resistant mutants of AIP0069.
  • glyphosate may inhibit the growth of desirable biological control or plant growth promoting bacteria.
  • examples include the herbicides glufosinate (glutamine synthase inhibitor), sulfonylurea and imidazolinone herbicides (branched chain aminio acid synthesis inhibitors) and the antibiotics streptomycin, oxytetracycline and kasugamycin.
  • Bacteria were inoculated into 50 ml of broth medium consisting of 11.3 g
  • Rhizoctonia solani infested rice grain was produced as described previously (K. A. Holmes and D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophthora parasitica var. nicotianae as a biocontrol for Phytophthora parasitica on Catharanthus roseus. Plant Disease 78: 193-199.) Infested rice was pulverized in a blender and screened through a #10 sieve (2 mm opening). The pulverized grain was mixed with germination medium at the rate of 2 g per liter.
  • Impatiens seeds were planted into the infested germination medium in size 402 plug trays, treated with 0.3 ml of resuspended bacteria per plug and grown under standard greenhouse production conditions. There were 2 replicates for each experimental treatment with 20 plugs per replicate. The number of healthy seedlings was assessed after two weeks.
  • Table 1 demonstrate that the glyphosate resistant variants AIP0404 and AIP1620 retain full antifungal activity, compared to the progenitor strain, AIP0069.
  • the biocontrol strain can be used to control Fusarium head blight, Asian Soybean Rust, Rhizoctonia, Botrytis, Pythium, turf diseases, and the like.
  • a suitable gene is amplified by PCR or made synthetically using techniques well known in the art.
  • the open reading frame is cloned into the plasmid vector pKK223-3
  • the tacl promoter provides strong constitutive expression of genes in Pseudomonas.
  • Genomic DNA sequences from strain AIP0069 are incorporated on each side of the promoter - gene - terminator cassette to direct homologous recombination into the AIP0069 chromosome. The resulting plasmid is mobilized from E. coli to Pseudomonas fluorescens
  • AIP0069 by conjugation, a technique well known in the art, and selection on defined medium containing 100 mM glyphosate.
  • the plasmid contains the narrow host range colEl origin of replication and thus cannot replicate in Pseudomonas. Glyphosate resistant colonies will be obtained when the promoter - gene - terminator cassette integrates into the Pseudomonas chromosome by homologous recombination.
  • Single crossover events where the entire plasmid is integrated into the chromosome
  • double crossover events where only the desired promoter - gene - terminator cassette is integrated
  • a double crossover event is selected for use.
  • AIP1620 starter cultures were inoculated using colonies from Luria agar plates and grown in 0.1X NBY broth (0.8 g of Difco Nutrient Broth powder and 0.5 g of yeast extract powder per liter of deionized water) and grown at 28C, 250 rpm.
  • Production cultures were grown in a broth containing, per liter of deionized water: 11.3 g Na 2 HP0 4 7H 2 0, 3.0 g KH 2 P0 4 , 1.0 g NH 4 C1, 10 g monosodium glutamate, 3.0 g molasses, 0.49 g MgS0 4 7H 2 0, 50 mg ZnS0 4 7H 2 0, 5 mg FeS0 4 7H 2 0 and sufficient hydrochloric acid to adjust the pH to approximately 6.2.
  • Fifty ml of production broth was placed in a 250 ml baffled culture flask, inoculated with 0.5 ml of starter culture and incubated at 28C, 250 rpm.
  • the production cultures were inoculated at various times and then harvested simultaneously to yield cultures with incubation times of 15, 24, 33, and 43 hours. Forty ml of each culture was harvested by centrifugation. The spent culture broth was discarded and the cells were re-suspended in autoclaved deionized water to 40 ml final volume.
  • Fungal inoculum was prepared using the rice grain method described by Holmes and Benson (K.A. Holmes and D.M. Benson, 1994. Evaluation of Phytophthora parasitica var. nicotianae for biocontrol of Phytophthora parasitica on Catharanthus roseus. Plant Disease, 78: 193-199.). Infested rice grains were pulverized in a blender and screened through a #10 sieve. This inoculum was mixed into Fafard superfine germinating mix at the rate of 1.0 g per liter.
  • the inoculated germination mix was placed in 392 greenhouse plug trays
  • AIP1620 cell paste was mixed with 20 g of synthetic calcium silicate (MicroCel E, Imerys Filtration Minerals, Lompoc, CA) using a food processor.
  • the resulting material contained 2.7 x 10 10 colony forming units per gram (CFU/g) of AIP1620, as determined by dilution plating.
  • This material was dried at 40C to a water activity of less than 0.30 at which time it contained 1.4 x 10 9 CFU/g of AIP1620.
  • the dried powder formulation was stored in vacuum sealed mylar pouches at 22C. After 85 days the powder contained 1.1 x 10 6 CFU/g of AIP1620 and retained antifungal activity against Rhizoctonia solani as determined by a greenhouse seed germination assay.
  • the inoculated mix was divided and formulated AIP1620 was added at the rate of 5 g per liter. On the same day, a subsample of each formulation was dilution plated to determine the CFU/g of AIP1620. Impatiens seed were planted into the inoculated and treated mixes. The seeds were germinated under standard greenhouse conditions. After 10 to 14 days the assays were scored by counting the number of healthy seedlings in each treatment. Results are summarized in Table 8 below.
  • Formulation F 18 days 8.0 x 10 5 16.7 1.5
  • Production cultures were grown in a broth containing, per liter of deionized water: 11.3 g Na 2 HP0 4 7H 2 0, 3.0 g KH 2 PO 4 , 1.0 g H 4 CI, 10 g monosodium glutamate, 3.0 g molasses, 0.49 g MgS0 4 7H 2 0, 50 mg ZnS0 4 7H 2 0, 5 mg FeS0 4 7H 2 0 and sufficient hydrochloric acid to adjust the pH to approximately 6.2.
  • Fifty ml of production broth was placed in a 250 ml baffled culture flask, inoculated with 0.5 ml of starter culture and incubated at 28C, 250 rpm.
  • Botrytis cinerea was grown on potato dextrose broth for 1 to 2 weeks without shaking. The resulting mycelial mat was removed from the broth and homogenized in autoclaved deionized water to produce liquid inoculum.
  • AIP1620 starter cultures were inoculated using colonies from Luria agar plates and grown in 0.1X NBY broth (0.8 g of Difco Nutrient Broth powder and 0.5 g of yeast extract powder per liter of deionized water) and grown at 28C, 250 rpm.
  • the inoculated germination mix was placed in 392 greenhouse plug trays
  • Ureidinospores of Phakopsora pachyrhizi are harvested by vacuum suction from leaves infected with the fungus that manifest erupted pustules.
  • the spores are re-suspended in water at 10 A 5/mL and inoculated onto detached soybean leaves as an aerosol using an airbrush using techniques known in the art (Twizeyimana, M., and Hartman, G. L. 2010. Culturing Phakopsora pachyrhizi on detached leaves and urediniospore survival at different temperatures and relative humidities. Plant Disease 94: 1453-1460).

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Abstract

La présente invention concerne des procédés pour améliorer la capacité d'une population d'agents biologiques à rivaliser et survivre en plein champ. La population d'agents modifiée, améliorée peut se développer, rivaliser avec d'autres souches microbiennes et champignons et fournir une protection destinée aux plantes contre les pathogènes. Des agents biologiques modifiés et des populations modifiées de tels agents qui sont tolérants ou résistants aux herbicides sont sélectionnés ou modifiés. Ainsi, la protection contre les agents pathogènes est améliorée. De telles populations modifiées peuvent être ajoutées aux sols pour prévenir des pathogènes fongiques et les maladies associées, ce qui favorise ainsi la croissance des plantes. Par conséquent, la présente invention est utile pour améliorer la compétitivité d'agents biologiques modifiés, en particulier par rapport à d'autres agents microbiens qui ne sont pas résistants aux herbicides. Les compositions de l'invention comprennent des agents biologiques résistants aux herbicides sélectionnés ou modifiés et des populations modifiées d'agents de lutte biologique. Ces agents biologiques modifiés peuvent être utilisés comme inoculant ou enrobage de semences pour les plantes et les semences.
PCT/US2016/043330 2015-07-24 2016-07-21 Agents de lutte biologique modifiés et leurs utilisations Ceased WO2017019448A1 (fr)

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US14/808,473 US9877486B2 (en) 2014-01-31 2015-07-24 Methods of growing plants using modified biological control agents

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