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WO2017002853A1 - ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体及びそれらの製造方法、並びに、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体 - Google Patents

ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体及びそれらの製造方法、並びに、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体 Download PDF

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WO2017002853A1
WO2017002853A1 PCT/JP2016/069266 JP2016069266W WO2017002853A1 WO 2017002853 A1 WO2017002853 A1 WO 2017002853A1 JP 2016069266 W JP2016069266 W JP 2016069266W WO 2017002853 A1 WO2017002853 A1 WO 2017002853A1
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polyethylene glycol
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compound
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French (fr)
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数 金原
貴博 村岡
アダム マルシン ヴアブロ
知之 大嶽
義哲 姜
友輝 宇留賀
龍太郎 今村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tohoku Techno Arch Co Ltd
NOF Corp
Original Assignee
Tohoku Techno Arch Co Ltd
NOF Corp
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    • C08G2650/50—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule characterised by the polymer type containing nitrogen, e.g. polyetheramines or Jeffamines(r)

Definitions

  • the present invention relates to a hetero monodisperse polyethylene glycol, an intermediate for producing a hetero monodisperse polyethylene glycol, a production method thereof, and a hetero monodisperse polyethylene glycol conjugate. More specifically, biofunctional polymers; drugs and drug carriers in drug delivery systems; and hetero-monodispersed polyethylene glycols that are used for the modification of diagnostic materials and devices, and are particularly useful as linker materials for antibody-binding drugs .
  • an antibody-binding drug capable of actively transporting a drug to an antigen-presenting cell by binding a drug and an antibody via a linker has been put into practical use. It attracts high attention (Toxins, 2011, 3, p.848-883 (Non-patent Document 1), J. Med. Chem., 2011, 54, p.3606-3623 (Non-patent Document 2)) .
  • hetero-monodisperse polyethylene glycol One of the materials being used as a linker material for this ADC is hetero-monodisperse polyethylene glycol.
  • Hetero-type monodisperse polyethylene glycol is a mono-disperse polyethylene glycol containing as a main component a hetero-type polyethylene glycol having functional groups different from each other at both ends and having a constant molecular weight.
  • hetero-monodispersed polyethylene glycol contains only one kind of hetero-polyethylene glycol having different functional groups at both ends with high purity from the viewpoint of use and effect of the drug.
  • the functional groups include maleimide groups and iodoacetamide groups that react with thiol groups such as antibodies and drugs; carboxyl groups that react with amino groups such as antibodies and drugs, active ester groups, active carbonate groups, and aldehyde groups; antibodies And amino groups that react with carboxyl groups such as drugs, azide groups, alkynyl groups, etc. used in click reactions.
  • the hetero-type polyethylene glycol having an amino group and a carboxyl group at each end can be used as it is as a linker of the ADC, and further, it can be used after functional group conversion as a raw material. It is a compound useful as the hetero type monodisperse polyethylene glycol.
  • Patent Document 2 since the difference between a compound having a hydroxyl group at the terminal and a target compound having a carboxyl group at the terminal is only the structure of the terminal, it is difficult to separate and purify.
  • the obtained product is purified using anion exchange chromatography.
  • the method using anion exchange chromatography is a low versatility purification method and the yield is low. Since it further decreased, there was a problem in terms of convenience and yield.
  • hetero-type monodisperse polyethylene glycol when hetero-type monodisperse polyethylene glycol is produced using a mixture containing a compound having a shorter ethylene glycol chain length, the resulting hetero-type monodisperse polyethylene glycol has an ethylene glycol chain length longer than the intended main component. Contains one shorter compound as an impurity. Therefore, when such a hetero-type monodispersed polyethylene glycol is used for the production of ADC, the above-mentioned problems in the production of ADC arise. These compounds having different ethylene glycol chain lengths are difficult to separate and purify because the structures of the compounds are similar, and as described in Non-Patent Document 4, a plurality of reverse-phase chromatography is performed. It is necessary to carry out graphing and the like.
  • a hetero-type monodispersed polyethylene glycol having a protective group or leaving group at one end and a hydroxyl group at the other end It is useful to use intermediates.
  • a method for obtaining such an intermediate for example, Org. Lett. 2002, p. 2329-2332 (Non-Patent Document 5) discloses a method in which tetraethylene glycol or hexaethylene glycol is used as a raw material, and one end is selectively tosylated using silver oxide. Efficiency is improved by using silver oxide. It is described that a one-terminal tosyl body is often obtained. However, this method has a problem that a compound having a tosyl group at both ends is produced by several percent.
  • Non-patent Document 6 discloses synthesizing a single-terminal Dmtr body having an ethylene glycol chain length of 8.
  • a portion of the synthetic route is: DmtrO— (CH 2 CH 2 O) 4 —Ts + HO— (CH 2 CH 2 O) 4 —H ⁇ DmtrO— (CH 2 CH 2 O) 8 —H + DmtrO- (CH 2 CH 2 O) 12 -Dmtr [Wherein Dmtr represents a 4,4′-dimethoxytrityl group.
  • Non-Patent Document 6 when an octamer of one-terminal Dmtr body is obtained by a 1: 1 reaction between one-terminal tosyl body and tetraethylene glycol, the one-terminal tosyl body and tetraethylene glycol It is described that a 12-mer Dmtr form of both ends is produced by the 2: 1 reaction. However, when heteropolyethylene glycol having an amino group and a carboxyl group at both ends is synthesized using a mixture containing a compound having a tosyl group or a Dmtr group at both ends in this way, a compound having amino groups at both ends is synthesized.
  • a compound having a carboxyl group at both ends is generated as an impurity. Therefore, when hetero-monodispersed polyethylene glycol containing such impurities is used in the production of ADC, a compound in which two drugs are bound or a compound in which two antibodies are bound is generated, and the effectiveness as a drug is reduced. Become.
  • methods for evaluating the purity of the hetero-type monodisperse polyethylene glycol include methods using 1 H-NMR measurement, MS measurement, HPLC measurement and the like.
  • hetero-monodispersed polyethylene glycol is produced by a known production method as described above, it can be said that evaluation of purity is difficult because a plurality of impurities are contained.
  • a compound having an amino group at both ends and an amino group and a hydroxyl group at both ends a compound having an amino group at both ends and an amino group and a hydroxyl group at both ends, respectively.
  • the proton at the ⁇ -position of the hydroxyl group overlaps with the ethylene glycol chain and cannot be distinguished by 1 H-NMR measurement. Therefore, the compound containing an amino group and a hydroxyl group at both ends is contained. The amount cannot be measured, and accordingly, it becomes difficult to specify the content of the compound having an amino group at both ends.
  • both ends are important when the hetero-type monodisperse polyethylene glycol is used as a linker for ADC production.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and has a hetero-type polyethylene glycol having an amino group and a carboxyl group at both ends, respectively, and having the same ethylene glycol chain length.
  • Heteromonodisperse polyethylene glycol containing high purity as a main component, the intermediate for producing the heteromonodisperse polyethylene glycol, and the heteromonodisperse polyethylene glycol conjugate, and the heteromonodisperse polyethylene glycol and the heterotype It aims at providing the manufacturing method which can obtain easily the intermediate body for monodispersed polyethyleneglycol manufacture.
  • the present inventors combined heterogeneous polyethylene glycols having amino groups and carboxyl groups at both ends, respectively, by combining the synthesis steps in a specific order, One type of hetero-type having amino groups and carboxyl groups at both ends and having the same ethylene glycol chain length, with only simple liquid separation extraction, without using a purification method such as column chromatography It has been found that a hetero type monodisperse polyethylene glycol containing polyethylene glycol as a main component and having a particularly high purity can be obtained.
  • a hetero-monodispersed polyethylene glycol containing a compound represented by the formula (1) is derivatized, and the following formula (2): tBoc-NH- (CH 2 CH 2 O) a -CH 2 CH 2 COOH ... (2) [In the formula (2), tBoc represents a tert-butoxycarbonyl group, and a represents an integer of 6 to 40.
  • R 1 represents a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms.
  • Ts represents a tosyl group
  • R 1 represents a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms
  • a represents an integer of 6 to 40.
  • PI represents a phthalimide group
  • R 1 represents a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms
  • a represents an integer of 6 to 40.
  • the step D is a step of performing the acid hydrolysis treatment after the liquid separation extraction treatment, A washing step (w1) in which the liquid separation extraction treatment performs an acid washing treatment in which the reaction product containing the compound represented by the formula (7) is dissolved in an acidic aqueous solution and separated and washed with an organic solvent; An extraction step (e1) for separating and extracting the compound represented by the formula (7) after the washing step (w1), and
  • the acid hydrolysis treatment is a treatment for acid-hydrolyzing the compound represented by the formula (7) to obtain the hetero monodispersed polyethylene glycol containing the compound represented by the formula (1).
  • the method for producing a hetero monodisperse polyethylene glycol according to [2].
  • the step D is a step of performing the liquid separation extraction treatment after the acid hydrolysis treatment
  • the acid hydrolysis treatment is a treatment for obtaining a reaction product containing a compound represented by the formula (1) by acid hydrolysis of the compound represented by the formula (7) in the reaction product
  • the separation and extraction treatment is carried out by dissolving the reaction product containing the compound represented by the formula (1) in an acidic aqueous solution and separating and washing with an organic solvent, and dissolving in a basic aqueous solution.
  • Ts represents a tosyl group, and a represents an integer of 6 to 40.
  • a straight line connecting from the elution starting point of the chromatogram until elution end point is detected by the differential refractometer and BASEL 4 polyethylene glycol above the BASEL 4 the total peak area derived from a AreaA 4, the height from BASEL 4 vertices P 4top refractive index difference maximum peak P 4 and P 4top H, in the elution curve on P 4 from the elution starting point toward the P 4top, height from BASEL 4 to a straight line connecting the point at which the point and 3/4 is 1/4 of P 4top H and P 4 L a, the P 4 L a and BASEL 4 and intersects el
  • L represents a tosyl group or a mesyl group
  • R 2 represents a trityl group or a benzyl group
  • c represents an integer of 3 to 37.
  • 6 ⁇ b + c ⁇ 40 (F5) [In Formula (F5), b represents b in Formula (8), and c represents c in Formula (9).
  • R 2 represents a trityl group or a benzyl group, and a represents an integer of 6 to 40.
  • Ts represents a tosyl group
  • R 2 represents a trityl group or a benzyl group
  • a represents an integer of 6 to 40.
  • the functional group contained in the atomic group X in the formula (12) is one functional group selected from the group consisting of a maleimide group, an azide group, an alkynyl group, and an iodoacetamide group, and the above formula (12)
  • a hetero-monodisperse polyethylene having a high purity as a main component a hetero-polyethylene glycol having an amino group and a carboxyl group at both ends and having the same ethylene glycol chain length. It is possible to easily obtain glycol, the above-mentioned hetero monodisperse polyethylene glycol production intermediate and hetero monodisperse polyethylene glycol conjugate, and the above hetero monodisperse polyethylene glycol and hetero monodisperse polyethylene glycol production intermediate. It is possible to provide a manufacturing method that can be used.
  • FIG. 2 is a chromatogram obtained by conducting reverse phase chromatography measurement on the purified product containing compound 13 in Example 1-2 (A).
  • FIG. FIG. 2 is a chromatogram obtained by conducting reverse phase chromatography measurement on the developing solvent in Example 1-2.
  • FIG. 3 is a chromatogram obtained by conducting reverse phase chromatography measurement on the purified product containing compound 23 in Example 2-2 (A).
  • FIG. It is the chromatogram obtained by performing (B) cation exchange chromatography measurement about the refinement
  • 2 is a chromatogram obtained by derivatizing a purified product containing compound 23 in Example 2-2 and performing (C) anion exchange chromatography measurement.
  • 2 is a chromatogram obtained by derivatizing a purified product containing compound 23 in Example 2-2 and performing anion exchange chromatography measurement using a mass spectrometer as a detector.
  • 6 is a chromatogram obtained by performing (A) reverse phase chromatography measurement on Comparative Purified Product 2 in Comparative Example 2-2. It is the chromatogram obtained by performing (B) cation exchange chromatography measurement about the comparative purified product 2 in Comparative Example 2-2. It is the chromatogram obtained by performing the cation exchange chromatography measurement which used the mass spectrometer for the detector about the comparative purified product 2 in the comparative example 2-2.
  • FIG. 6 is a chromatogram obtained by derivatizing Comparative Purified Product 2 in Comparative Example 2-2 and performing (C) anion exchange chromatography measurement. It is the chromatogram obtained by performing (A) reverse phase chromatography measurement about the comparative purified product 4 in Comparative Example 4-2. It is the chromatogram obtained by performing (B) cation exchange chromatography measurement about the comparative purified product 4 in Comparative Example 4-2. It is the chromatogram obtained by performing the cation exchange chromatography measurement which used the mass spectrometer for the detector about the comparative purified product 4 in the comparative example 4-2.
  • FIG. 6 is a chromatogram obtained by derivatizing comparative purified product 4 in Comparative Example 4-2 and performing (C) anion exchange chromatography measurement.
  • FIG. 6 is a chromatogram obtained by derivatizing comparative purified product 4 in Comparative Example 4-2 and performing (C) anion exchange chromatography measurement.
  • FIG. 4 is a chromatogram obtained by derivatizing comparative purified product 4 in Comparative Example 4-2 and performing anion exchange chromatography measurement using a mass spectrometer as a detector.
  • FIG. It is the chromatogram obtained by performing (A) reverse phase chromatography measurement about the polyethyleneglycol 1 in the comparative example 5.
  • FIG. It is the chromatogram obtained by performing (B) cation exchange chromatography measurement about polyethyleneglycol 1 in the comparative example 5.
  • FIG. It is the chromatogram obtained by performing the cation exchange chromatography measurement which used the mass spectrometer for the detector about the polyethyleneglycol 1 in the comparative example 5.
  • FIG. 5 is a chromatogram obtained by performing (D) reverse phase chromatography measurement on the purified product containing compound 18 in Example 2-3.
  • FIG. 6 is a chromatogram obtained by performing (D) reverse phase chromatography measurement on Comparative Purified Product 1-1 in Comparative Example 1-3.
  • the hetero type monodisperse polyethylene glycol of the present invention has a specific chromatogram in a chromatogram when separated using (A) reverse phase chromatography, (B) cation exchange chromatography, and (C) anion exchange chromatography. It is characterized by satisfying the conditions.
  • the hetero-type monodispersed polyethylene glycol refers to a mono-dispersed polyethylene glycol containing as a main component a hetero-type polyethylene glycol having functional groups different from each other at both ends and having a constant molecular weight.
  • the main component as the main component, the following formula (1): NH 2 — (CH 2 CH 2 O) a —CH 2 CH 2 COOH (1) The compound (heterotype polyethylene glycol) represented by these is contained.
  • a represents an integer of 6 to 40, and from the viewpoint of use as a linker for ADC, a is preferably an integer of 6 to 24.
  • the hetero type monodisperse polyethylene glycol of the present invention contains a compound (hetero type polyethylene glycol) represented by the above formula (1) and having the same ethylene glycol chain length (that is, the value of a) with a high purity. Specifically, in chromatograms detected with a differential refractometer when separated using (A) reverse phase chromatography, (B) cation exchange chromatography, and (C) anion exchange chromatography. The following specific conditions are met.
  • the “chromatogram detected by a differential refractometer” means the signal intensity obtained from a differential refractometer whose vertical axis (y axis) is a detector, and the horizontal axis (x Each axis is a chromatogram showing elution time (column retention time).
  • the “elution start point” indicates the elution time when the sample that has passed through the chromatography column is first detected by the detector, and the “elution end point” indicates that the sample that has passed through the column is the last by the detector. Shows the elution time detected.
  • peaks derived from polyethylene glycol excludes peaks caused by components other than the sample such as a developing solvent, and pseudo peaks due to fluctuations in the baseline caused by the column or apparatus used. Indicates a peak. Such peaks caused by the developing solvent, etc., and pseudo peaks due to baseline fluctuations caused by the column and equipment used can be identified by injecting only the developing solvent not containing the sample into the column and measuring it. it can.
  • the “polyethylene glycol” refers to a compound having an ethylene glycol chain represented by the following formula: — (CH 2 CH 2 O) n— [n represents a positive integer].
  • a carboxyl group (COOH) a hydrogen atom, a halogen atom or other functional group is substituted for the amino group (NH 2 ) in the formula (1).
  • the other functional group is not particularly limited, but is a group represented by a hydroxyl group, a tosyl group (Ts), a mesyl group (Ms), a phthalimide group, a trityl group (Trt), a benzyl group (Bn), or TsO.
  • a tert-butoxycarbonyl group (tBoc) and the halogen atom includes a chlorine atom.
  • the hetero-type monodisperse polyethylene glycol of the present invention has a base L 1 that is a line connecting from the elution start point to the elution end point of the chromatogram detected by a differential refractometer when separated using reverse phase chromatography.
  • the total peak area derived from polyethylene glycol of the upper and AreaA 1 from BASEL 1 the height from BASEL 1 vertex P 1Top refractive index difference maximum peak P 1 and P 1top H, toward the P 1Top from the elution starting point in the elution curve on P 1, the height from BASEL 1 to a straight line connecting the point at which the point and 3/4 is 1/4 of P 1top H and P 1 L a, P 1 L a and BASEL 1 and the elution time intersect and T 1 a, in the elution curve on P 1 toward the P 1Top the elution end point, the height from BASEL 1 is P A straight line connecting a point that is 1/4 of 1 top H and a point that is 3/4 is P 1 L b, and an elution time at which P 1 L b and base L 1 intersect is T 1 b, which is above base L 1 .
  • T 1 when the peak area between the T 1 b and AreaP 1 from a of, AreaA 1 and AreaP 1 and is represented by
  • the “refractive index difference maximum peak P 1 ” is a peak including a peak derived from the compound (heteropolyethylene glycol) represented by the formula (1).
  • a peak including a peak derived from the compound represented by the formula (1) is confirmed by measuring under the same conditions except that a mass spectrometer is used instead of the differential refractometer as a detector. be able to.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a chromatogram detected by a differential refractometer when hetero type monodisperse polyethylene glycol is separated using reverse phase chromatography.
  • the area P 1 / area A 1 thus determined is 0.90 or more.
  • Table total peak area derived from the value of AreaA 1 polyethylene glycol, since the value of AreaP 1 is showing the peak area of the refractive index difference maximum peak P 1, the refractive index difference maximum peak P 1, by the formula (1) When the peak is derived only from the compound to be produced, the value of areaP 1 / areaA 1 corresponds to the content of the compound represented by the formula (1).
  • Impurities that cannot be separated by reverse phase chromatography such as a compound having a different ethylene glycol chain length from the target compound represented by the formula (1), a compound having a partially different terminal functional group, and the like, are heterogeneous. When contained in monodispersed polyethylene glycol, the content of these compounds may also be included within the value of areaP 1 / areaA 1 .
  • the value of areaP 1 / areaA 1 is preferably 0.94 or more when a is 6 to 24, and is preferably 0.90 or more when a is 25 to 40.
  • the number of production steps increases as the value of a increases in the formula (1), and therefore, it is represented by the target formula (1).
  • the content of the compound and the compound having a different ethylene glycol chain length tends to increase.
  • the hetero-monodisperse polyethylene glycol of the present invention has a base L 2 that is a straight line connecting from the elution start point to the elution end point of the chromatogram detected by a differential refractometer when separated using cation exchange chromatography.
  • the total peak area derived from polyethylene glycol above the BASEL 2 and AreaA 2 the height from BASEL 2 vertices P 2Top refractive index difference maximum peak P 2 and P 2top H, from the elution starting point P 2Top In the elution curve on P 2 heading, a straight line connecting a point where the height from base L 2 is 1/2 of P 2top H and a point where it is 1/8 is P 2 L, and P 2 L and base L 2 Doo is the elution time intersecting and T 2, when the peak area between the elution starting point on the T 2 from BASEL 2 was AreaB 2, ar eaB 2 and areaA 2 and is represented by the following formula (F2): areaB 2 / areaA 2 ⁇ 0.02 (F2) The condition represented by is satisfied.
  • the “refractive index difference maximum peak P 2 ” is a peak including a peak derived from the compound (heteropolyethylene glycol) represented by the formula (1).
  • a peak including a peak derived from the compound represented by the formula (1) is confirmed by measuring under the same conditions except that a mass spectrometer is used instead of the differential refractometer as a detector. be able to.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of a chromatogram detected by a differential refractometer when hetero type monodispersed polyethylene glycol is separated using cation exchange chromatography.
  • the area B 2 / area A 2 thus determined is 0.02 or less, preferably 0.01 or less. Since the value of areaB 2 / areaA 2 is the ratio of the peak eluted before the maximum refractive index difference peak P 2 including the peak derived from the compound represented by the formula (1), in the present invention, This mainly corresponds to the content of impurities having no amino group as a terminal functional group. Examples of the impurities having no amino group include polyethylene glycol having a carboxyl group instead of the amino group in the formula (1), and polyethylene glycol having a hydroxyl group instead of the amino group.
  • the hetero monodisperse polyethylene glycol of the present invention is a derivative of the hetero monodisperse polyethylene glycol containing the compound represented by the formula (1), and the following formula (2): tBoc-NH- (CH 2 CH 2 O) a -CH 2 CH 2 COOH ... (2) [In the formula (2), tBoc represents a tert-butoxycarbonyl group, and a represents an integer of 6 to 40.
  • a known method can be used as a method for derivatizing the hetero-monodispersed polyethylene glycol containing the compound represented by the formula (1) into a mixture containing the compound represented by the formula (2).
  • a hetero-monodispersed polyethylene glycol containing the compound represented by the formula (1) is dissolved in water, sodium hydroxide is added as a base, and then di-tert-butyl dicarbonate is added.
  • the compound represented by the formula (2) can be obtained from the compound represented by the formula (1).
  • the mixture containing the compound represented by the formula (2) is adjusted to pH 4 or lower with hydrochloric acid or the like, and then added until sodium chloride is saturated, followed by liquid separation extraction using chloroform or dichloromethane. Can be obtained.
  • the derivatization needs to be sufficiently performed until the compound represented by the formula (1) disappears. The disappearance of the compound represented by the formula (1) can be confirmed by measurement using a mass spectrometer.
  • “refractive index difference maximum peak P 3 ” is a peak including a peak derived from the compound represented by the formula (2).
  • the peak including the peak derived from the compound represented by the formula (2) is confirmed by measuring under the same conditions except that a mass spectrometer is used instead of the differential refractometer as a detector. be able to.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of a chromatogram detected by a differential refractometer when a mixture containing the compound represented by the formula (2) is separated using anion exchange chromatography.
  • the area B 3 / area A 3 thus required is 0.02 or less, preferably 0.01 or less.
  • the value of areaB 3 / areaA 3 is the ratio of the peak eluted before the maximum refractive index difference peak P 3 including the peak derived from the compound represented by the formula (2).
  • the impurity having no carboxyl group include polyethylene glycol having a group represented by t-Boc-NH instead of the carboxyl group in the formula (2), and a hydroxyl group instead of the carboxyl group.
  • examples include polyethylene glycol.
  • the hetero monodispersed polyethylene glycol of the present invention that satisfies the above specific conditions can be obtained by the method for producing a hetero monodispersed polyethylene glycol of the present invention.
  • the method for producing a hetero-monodispersed polyethylene glycol according to the present invention includes the following step A, step B, step C, and step D.
  • Step A is represented by the following formula (3): TsO— (CH 2 CH 2 O) a —H (3)
  • formula (4) In the compound represented by the following formula (4):
  • Ts represents a tosyl group
  • a represents an integer of 6 to 40.
  • R 1 represents a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples of the hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, a tert-butyl group, an isobutyl group, and a sec-butyl group. From the viewpoint of stability under basic conditions, R 1 is preferably an isopropyl group or a tert-butyl group.
  • Ts represents a tosyl group
  • R 1 represents a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms
  • a represents an integer of 6 to 40.
  • Ts in the formula (5) is derived from Ts in the formula (3)
  • R 1 in the formula (5) is derived from R 1 in the formula (4).
  • the compound represented by the formula (3) a compound obtained by a known synthesis method can be used as appropriate, and the hetero-monodispersed polyethylene glycol of the present invention satisfying the specific conditions is particularly easy. From the viewpoint of being obtained, it is preferable to use an intermediate for producing a hetero-type monodisperse polyethylene glycol, which will be described later, as a material containing the compound represented by the formula (3).
  • the Michael addition reaction can be performed in a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not react with the compound represented by the formula (3) and the compound represented by the formula (4).
  • the amount of the solvent used is usually 1 to 100 times, preferably 3 to 50 times, and most preferably 5 to 30 times the mass ratio of the compound represented by the formula (3).
  • the amount of the solvent used is less than the lower limit, the compounds represented by the formula (3) may react with each other.
  • the amount exceeds the upper limit the Michael addition reaction proceeds slowly. Tend to be.
  • the amount of the compound represented by the formula (4) is usually 2 to 50 times, preferably 5 to 5 times the molar ratio of the compound represented by the formula (3). It is 25 times.
  • the amount of the compound represented by the formula (4) is less than the lower limit, the Michael addition reaction may not be completed.
  • the amount exceeds the upper limit the formula (4) There is a possibility that a side reaction such as formation of a polymer of the represented compound may occur.
  • a base catalyst is used.
  • the base catalyst there is no problem as long as the reaction proceeds, and examples thereof include inorganic catalysts such as sodium hydroxide and potassium hydroxide.
  • inorganic catalysts such as sodium hydroxide and potassium hydroxide.
  • potassium hydroxide is preferable, and from the viewpoint of reactivity, powder is preferred. More preferred is potassium hydroxide.
  • the amount of the base catalyst used is usually 0.1 to 10 times, preferably 0.5 to 5 times the molar ratio of the compound represented by the formula (3).
  • the reaction temperature of the Michael addition reaction is usually 10 ° C. or lower, preferably 5 ° C. or lower, and most preferably 0 ° C. or lower. When the reaction temperature exceeds the upper limit, the compounds represented by the formula (3) may react with each other.
  • the reaction time for the Michael addition reaction is preferably about 0.2 to 12 hours, although it varies depending on the reaction temperature, the base catalyst and other conditions.
  • step A a reaction product containing the compound represented by the formula (5) can be obtained by such a Michael addition reaction.
  • the reaction product may be used as it is in the next step B without being purified, and after purification of the compound represented by the formula (5) by silica gel column chromatography, liquid separation extraction treatment, adsorbent treatment or the like.
  • the high-purity hetero-monodisperse polyethylene glycol of the present invention can be obtained without purification by silica gel column chromatography.
  • step B the compound represented by the formula (5) is reacted with potassium phthalimide, and the following formula (6): PI- (CH 2 CH 2 O) a —CH 2 CH 2 —COOR 1 (6) Is a step of obtaining a compound represented by the formula:
  • PI represents a phthalimide group
  • R 1 represents a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms
  • a represents an integer of 6 to 40.
  • Hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms are those derived from R 1 in the compound represented by the formula (5), the same meaning as that of R 1 in the formula (4).
  • the reaction in step B can be performed in a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not react with the compound represented by the formula (5) and potassium phthalimide, and examples thereof include organic solvents such as tetrahydrofuran, acetonitrile, chloroform, dimethylformamide (DMF), and the like. Of the mixture. Among these, tetrahydrofuran, DMF, or acetonitrile is preferable from the viewpoint of reaction rate.
  • the amount of the solvent used is usually 1 to 100 times, preferably 3 to 50 times, and most preferably 5 to 30 times the mass ratio of the compound represented by the formula (5).
  • the amount of potassium phthalimide used is usually 1.1 to 10 times, preferably 1.5 to 5 times in terms of molar ratio to the compound represented by the formula (5). If the amount of potassium phthalimide used is less than the lower limit, the reaction may not be completed. On the other hand, if it exceeds the upper limit, unreacted potassium phthalimide remains, so that it is necessary to remove it. .
  • the reaction temperature in Step B is usually 10 to 100 ° C., although it varies depending on the solvent used. Further, the reaction time in Step B is usually about 1 to 24 hours, although it varies depending on the reaction temperature conditions.
  • step B a reaction product containing the compound represented by the formula (6) can be obtained by such a reaction.
  • the reaction product may be used as it is in the next step C without being purified, and after purifying the compound represented by the formula (6) by silica gel column chromatography, liquid separation extraction treatment, adsorbent treatment or the like.
  • the high-purity hetero-monodisperse polyethylene glycol of the present invention can be obtained without purification by silica gel column chromatography.
  • step C the compound represented by the formula (6) is dephthalimidized, and the following formula (7): H 2 N— (CH 2 CH 2 O) a —CH 2 CH 2 —COOR 1 (7) Is a step of obtaining a compound represented by the formula:
  • R 1 represents a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, and a represents an integer of 6 to 40.
  • Hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms are those derived from R 1 in the compound represented by the formula (6), the same meaning as that of R 1 in the formula (4).
  • the dephthalimidization reaction can be performed in a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not react with the compound represented by the formula (6) and the compound represented by the formula (7).
  • water, methanol, ethanol, isopropanol, tetrahydrofuran examples thereof include solvents such as acetonitrile and chloroform, and mixtures thereof. Among these, methanol and ethanol are preferable.
  • the amount of the solvent used is usually 1 to 100 times, preferably 3 to 50 times, and most preferably 5 to 30 times the mass ratio of the compound represented by the formula (6). When the amount of the solvent used is less than the lower limit, deprotected phthalic acids may be precipitated and stirring may be difficult. On the other hand, when the amount exceeds the upper limit, the progress of the reaction tends to be slow. It is in.
  • the dephthalimidization reaction is performed in the presence of a base compound.
  • the base compound may be used as long as the reaction proceeds, and examples thereof include inorganic bases such as sodium hydroxide and potassium hydroxide; primary amines such as hydrazine monohydrate and ethylenediamine. Among these, From the viewpoint of suppressing side reactions, primary amines such as hydrazine monohydrate and ethylenediamine having weak basicity are preferred.
  • the amount of the base compound used varies depending on the type of the base compound used, but is usually 1.0 to 20 times, preferably 2.0, in terms of molar ratio with respect to the compound represented by the formula (6). ⁇ 15 times the amount.
  • the reaction temperature of the dephthalimidation reaction is usually 10 to 100 ° C., although it varies depending on the basic compound and solvent used.
  • the reaction time for the dephthalimidization reaction varies depending on the reaction temperature and other conditions, but is usually preferably about 0.5 to 12 hours.
  • a reaction product containing the compound represented by the formula (7) can be obtained by such dephthalimidization reaction.
  • the reaction product may be used as it is in the next step D without being purified, and after purification of the compound represented by the formula (7) by silica gel column chromatography, liquid separation extraction treatment, adsorbent treatment, or the like.
  • the high-purity hetero-monodisperse polyethylene glycol of the present invention can be obtained without purification by silica gel column chromatography.
  • step D the reaction product containing the compound represented by the formula (7) obtained in the step C is subjected to a liquid separation extraction treatment and an acid hydrolysis treatment. It is a step of obtaining the hetero type monodisperse polyethylene glycol containing the represented compound.
  • any of the liquid separation extraction treatment and the acid hydrolysis treatment may be performed first, but when producing a compound having a short ethylene glycol chain as the compound represented by the formula (1), specifically, When a in each of the formulas (3) and (5) to (7) is an integer of 6 to 10 (hereinafter referred to as “production I” in some cases), after the separation extraction process, It is preferable to perform an acid hydrolysis treatment. On the other hand, when a compound having a long ethylene glycol chain is produced as the compound represented by the formula (1), specifically, a in the formulas (3) and (5) to (7) is 11 to When it is an integer of 40 (hereinafter referred to as “Production II” in some cases), it is preferable to perform the liquid separation extraction treatment after the acid hydrolysis treatment.
  • the acid hydrolysis treatment according to the present invention is a treatment for obtaining a compound represented by the formula (1) by acid hydrolysis of the compound represented by the formula (7).
  • the acid hydrolysis can be performed in a solvent.
  • the solvent include water, tetrahydrofuran, acetonitrile, chloroform, dichloromethane, and mixtures thereof. Among these, water or dichloromethane is preferable.
  • the amount of the solvent used is usually 0.5 to 50 times, preferably 0.8 to 40 times, most preferably 1 to 30 times in terms of mass ratio with respect to the compound represented by the formula (7). Amount. When the amount of the solvent used is less than the lower limit, the viscosity is increased and the stirring efficiency may be lowered. On the other hand, when the amount exceeds the upper limit, the progress of the reaction tends to be delayed.
  • an acid catalyst is used.
  • the acid catalyst there is no problem as long as the reaction proceeds.
  • hydrochloric acid, phosphoric acid, trifluoroacetic acid and the like can be mentioned, and among these, hydrochloric acid is preferable from the viewpoint of suppressing side reactions.
  • the amount of the acid catalyst used varies depending on the type of acid catalyst used. For example, when 1M hydrochloric acid is used, the weight ratio of the compound represented by the formula (7) is usually 0.5. ⁇ 10 times.
  • the reaction temperature for the acid hydrolysis is usually 10 to 100 ° C., although it varies depending on the acid catalyst used.
  • the reaction time for the acid hydrolysis varies depending on the reaction temperature and other conditions, but is usually preferably about 0.5 to 12 hours.
  • the separation extraction process includes a washing step (w) for separating and washing with an organic solvent, and an extraction step (e) for separating and extracting a target compound after the washing step (w). It is processing to include.
  • washing step (w) In the washing step (w), the target compound is dissolved in an acidic aqueous solution and separated and washed with an organic solvent, and the target compound is dissolved in a basic aqueous solution and separated and washed with an organic solvent.
  • a base washing process is mentioned.
  • the washing step (w) in the case of the production I, an acid washing treatment in which a reaction product containing the compound represented by the formula (7) is dissolved in an acidic aqueous solution and separated and washed with an organic solvent is performed.
  • the washing step (w1) is preferred.
  • the acid washing in which the reaction product containing the compound represented by the formula (1) obtained by the acid hydrolysis treatment is dissolved in an acidic aqueous solution and separated and washed with an organic solvent.
  • a washing step (w2) is preferred, in which the treatment and a base washing treatment in which it is dissolved in a basic aqueous solution and separated and washed with an organic solvent are performed.
  • any of the acid washing treatment and the base washing treatment may be performed first, but the solvent after the acid hydrolysis treatment is used as it is as the acidic aqueous solution. From the viewpoint of being able to perform, it is preferable to perform the base washing treatment after the acid washing treatment.
  • Examples of the organic solvent used in the washing step (w) include ethyl acetate, toluene, chloroform, dichloromethane and the like. From the viewpoint of impurity solubility, chloroform and dichloromethane are preferable.
  • the amount of the organic solvent used is usually relative to the target compound (in the case of Production I: the compound represented by Formula (7), in the case of Production II: the compound represented by Formula (1)).
  • the mass ratio is 2 to 30 times, preferably 3 to 20 times.
  • the amount of the organic solvent used is less than the lower limit, the cleaning efficiency may be reduced. On the other hand, when the amount exceeds the upper limit, improvement of the cleaning efficiency is not expected.
  • the acidic aqueous solution used for the acid washing treatment does not decompose the target compound (in the case of Production I: the compound represented by Formula (7), in the case of Production II: the compound represented by Formula (1)).
  • an acidic aqueous solution having a pH of 5 or less is preferable, and examples thereof include an aqueous hydrochloric acid solution and an aqueous ammonium chloride solution adjusted to pH 3.
  • the amount of the acidic aqueous solution used is usually relative to the target compound (in the case of Production I: the compound represented by Formula (7), in the case of Production II: the compound represented by Formula (1)).
  • the mass ratio is 2 to 30 times, preferably 3 to 20 times.
  • the amount of the acidic aqueous solution used is less than the lower limit, the target compound may be dissolved in the organic solvent. On the other hand, when the amount exceeds the upper limit, the extraction efficiency is reduced in the following extraction step. Tend to.
  • a basic aqueous solution having a pH of 8 or more is preferable as long as it does not decompose the compound represented by the formula (1).
  • the basic aqueous solution is adjusted to pH 9.
  • examples thereof include a sodium hydroxide aqueous solution and a potassium hydroxide aqueous solution.
  • the amount of the basic aqueous solution used is usually 2 to 30 times, preferably 3 to 20 times in terms of mass ratio with respect to the compound represented by the formula (1). When the amount of the basic aqueous solution used is less than the lower limit, the compound represented by the formula (1) may be dissolved in the organic solvent. On the other hand, when the amount exceeds the upper limit, Extraction efficiency decreases in the extraction process.
  • the target compound in the case of Production I: the compound represented by the formula (7), in the case of Production II: represented by the formula (1)
  • the acidic aqueous solution or the basic aqueous solution is added to the acidic aqueous solution or the basic aqueous solution.
  • the reaction product containing the compound is dissolved, and the organic solvent is added thereto and stirred, followed by liquid separation washing to remove the organic solvent, thereby dissolving and removing impurities in the organic solvent.
  • the number of times of performing the liquid separation washing is not particularly limited, and it is preferable to perform the separation liquid multiple times while confirming impurities contained in the aqueous solution by thin layer chromatography (TLC), mass spectrometry (MS) measurement, or the like.
  • TLC thin layer chromatography
  • MS mass spectrometry
  • the ratio of the organic solvent and the acidic aqueous solution is usually 0.2 to 3.0 as a ratio of organic solvent / acidic aqueous solution by mass ratio, and 0.5 to 2.0. It is preferable that In the base washing treatment, the ratio of the organic solvent to the basic aqueous solution is usually such that the value of the organic solvent / basic aqueous solution is 0.2 to 3.0 by mass ratio, and 0.5 It is preferable that it is -2.0.
  • the target compound is separated and extracted.
  • the extraction step (e) is preferably an extraction step (e1) in which the compound represented by the formula (7) is separated and extracted after the washing step (w1).
  • it is preferably an extraction step (e2) in which a hetero-monodispersed polyethylene glycol containing a compound represented by the formula (1) is separated and extracted after the washing step (w2).
  • the acid strength of the aqueous solution after the washing step (w) is adjusted as necessary and saturated with salt.
  • the target compound can be obtained in the organic solvent by adding the organic solvent to the aqueous solution and stirring, and then removing the aqueous solution.
  • the acid strength of the aqueous solution in the extraction step (e) is the target compound (in the case of Production I: the compound represented by Formula (7), in the case of Production II: the compound represented by Formula (1)). If the acid strength does not decompose), there is no problem. Further, the salt concentration at the time of saturating the aqueous solution with a salt is not a problem as long as the target compound can be extracted with the organic solvent. Examples of such an aqueous solution include an aqueous solution obtained by adding sodium chloride or potassium chloride to a hydrochloric acid aqueous solution adjusted to pH 3 so that the salt concentration is 23% or more.
  • the amount of the aqueous solution used is usually the target compound (in the case of Production I: the compound represented by Formula (7), in the case of Production II: the compound represented by Formula (1)),
  • the mass ratio is 2 to 30 times, preferably 3 to 20 times.
  • the amount of the aqueous solution used is less than the lower limit, impurities in the aqueous solution may be extracted into the organic solvent.
  • the amount exceeds the upper limit the extraction efficiency tends to decrease.
  • Examples of the organic solvent used in the extraction step (e) include ethyl acetate, toluene, chloroform, and dichloromethane.
  • the target compound in the case of Production I: the compound represented by Formula (7) above, in the case of Production II: From the viewpoint of solubility of the compound represented by the formula (1), chloroform and dichloromethane are preferable.
  • the amount of the organic solvent used is usually 2 to 30 times, preferably 3 to 20 times in terms of mass ratio with respect to the target compound. When the amount of the organic solvent used is less than the lower limit, the extraction efficiency decreases. On the other hand, when the amount exceeds the upper limit, no improvement in extraction efficiency is expected.
  • the ratio of the organic solvent to the aqueous solution is usually such that the value of organic solvent / aqueous solution is 0.2 to 3.0 by mass ratio, and 0.5 to 2.0. It is preferable that In addition, the number of times of performing the extraction step (e) is not particularly limited, and the compound represented by the formula (1) or the compound represented by the formula (7) contained in the aqueous solution by TLC, MS measurement or the like. It is preferable to carry out a plurality of times while confirming
  • the reaction product containing the compound represented by the formula (7) obtained in the step C is subjected to such liquid separation extraction treatment and acid hydrolysis treatment, whereby the formula ( The hetero-type monodispersed polyethylene glycol of the present invention containing the compound represented by 1) with high purity can be obtained.
  • the organic solvent is removed after the extraction step (e2) of the liquid separation extraction treatment.
  • the hetero-monodispersed polyethylene glycol can be obtained without purification by silica gel column chromatography or the like.
  • the intermediate for producing a hetero-monodisperse polyethylene glycol of the present invention is used for producing the hetero-monodisperse polyethylene glycol of the present invention, and as a main component, the following formula (3): TsO— (CH 2 CH 2 O) a —H (3) The compound represented by these is contained.
  • Ts represents a tosyl group
  • a represents an integer of 6 to 40.
  • the intermediate for producing a hetero-monodisperse polyethylene glycol of the present invention contains a compound represented by the formula (3) and having the same ethylene glycol chain length (that is, the value of a) in high purity.
  • (D) a chromatogram detected by a differential refractometer when separated using reverse phase chromatography satisfies the following specific conditions.
  • the intermediate for producing a monodisperse polyethylene glycol of the present invention is a straight line connecting from the elution start point to the elution end point of a chromatogram detected by a differential refractometer when separated using reverse phase chromatography.
  • BASEL 4 the total peak area derived from polyethylene glycol above the BASEL 4 and AreaA 4, the height from BASEL 4 vertices P 4top refractive index difference maximum peak P 4 and P 4top H, from the elution starting point in the elution curve on P 4 towards P 4top, and height from BASEL 4 to a straight line connecting the point at which the point and 3/4 is 1/4 of P 4top H and P 4 L a, P 4 the L a and BASEL 4 and elution time intersect and T 4 a, in the elution curve on P 4 directed from the P 4top the elution end point, or BASEL 4 Height et a straight line that connects a point where the point and 3/4 is 1/4 of P 4top H and P 4 L b, the P 4 L b and BASEL 4 and intersects elution time T 4 b and then, when the AreaP 4 peak area between T 4 a of the above T 4 b from BASEL 4, and the AreaA 4 and AreaP 4, the following formula
  • “refractive index difference maximum peak P 4 ” is a peak including a peak derived from the compound represented by the formula (3).
  • the peak including the peak derived from the compound represented by the formula (3) is confirmed by measuring under the same conditions except that a mass spectrometer is used instead of the differential refractometer as a detector. be able to.
  • FIG. 4 shows a schematic diagram of a chromatogram detected by a differential refractometer when an intermediate for producing a hetero-type monodisperse polyethylene glycol is separated using reverse phase chromatography.
  • the compounds contained in the sample solution are eluted in order from the compounds having higher hydrophilicity.
  • the straight line connecting to the elution end point from the elution starting point of time and BASEL 4, and AreaA 4 the total peak area above the BASEL 4. Then, the vertices of refractive index difference maximum peak P 4 and P 4top, the height from BASEL 4 and P 4top H.
  • the areaP 4 / areaA 4 thus required is 0.92 or more.
  • the value of areaP 4 / areaA 4 corresponds to the content of the compound represented by the formula (3).
  • Impurities that cannot be separated by reverse phase chromatography such as a compound having a different ethylene glycol chain length from the target compound represented by the formula (3), a compound having a partially different terminal functional group, and the like are present in the hetero type.
  • the content of these compounds may also be included in the value of areaP 4 / areaA 4 .
  • the value of areaP 4 / areaA 4 is preferably 0.95 or more when a is 6 to 24, and preferably 0.92 or more when a is 25 to 40.
  • the number of production steps increases as the value of “a” increases in the above formula (3).
  • the content of the compound represented by the formula and a compound having a different ethylene glycol chain length increases.
  • the value of areaP 4 / areaA 4 is less than the lower limit, the content of impurities such as a compound having a different ethylene glycol chain length or a compound having a functional group different from the combination of the formula (3) at the terminal increases.
  • the intermediate for producing a hetero monodisperse polyethylene glycol of the present invention satisfying the above specific conditions can be obtained by the method for producing an intermediate for producing hetero monodisperse polyethylene glycol of the present invention.
  • the method for producing an intermediate for producing a hetero-type monodisperse polyethylene glycol of the present invention comprises the following step a, step b, step c and step d.
  • Step a is represented by the following formula (8): HO— (CH 2 CH 2 O) b —H (8) And a compound represented by the following formula (9): LO- (CH 2 CH 2 O) c -R 2 (9) And a compound represented by the following formula (F5): 6 ⁇ b + c ⁇ 40 (F5)
  • a nucleophilic substitution reaction is performed so as to satisfy the condition represented by the following formula (10): HO— (CH 2 CH 2 O) a —R 2 (10) Is a step of obtaining a compound represented by the formula:
  • b represents an integer of 3 to 37
  • L represents a tosyl group or mesyl group
  • R 2 represents a trityl group or benzyl group
  • c represents 3 to 37 Indicates an integer.
  • the compound represented by the formula (8) and the compound represented by the formula (9) can be obtained by a known synthesis method in addition to using commercially available products.
  • R 2 represents a trityl group or a benzyl group, and a represents an integer of 6 to 40.
  • R 2 in the formula (10) is derived from R 2 in the formula (9).
  • the reaction product the following formula (13): R 2 O— (CH 2 CH 2 O) d —R 2 (13) Is contained as an impurity.
  • R 2 represents a trityl group or a benzyl group, and d represents an integer of 8 to 80.
  • R 2 in the formula (13) is derived from R 2 in the formula (9).
  • the nucleophilic substitution reaction can be performed in a solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not react with the compound represented by the formula (8) and the compound represented by the formula (9).
  • the amount of the solvent used is usually 1 to 100 times, preferably 2 to 50 times, and most preferably 3 to 30 times the mass ratio of the compound represented by the formula (9).
  • the amount of the solvent used is less than the lower limit, the compound represented by the formula (9) is bonded to both ends of the compound represented by the formula (8).
  • the above upper limit is exceeded, the progress of the nucleophilic substitution reaction tends to be slow.
  • the amount of the compound represented by the formula (8) to be used is usually 1.1 to 50 times, preferably a molar ratio with respect to the compound represented by the formula (9). Is 1.5 to 30 times, more preferably 2.0 to 20 times.
  • the amount of the compound represented by the formula (8) is less than the lower limit, the compound represented by the formula (9) is bonded to both ends of the compound represented by the formula (8).
  • the amount of the compound represented by the formula (13) tends to increase.
  • the amount exceeds the upper limit the progress of the nucleophilic substitution reaction tends to be slow.
  • the base used in the nucleophilic substitution reaction is not a problem as long as the reaction proceeds, and examples thereof include sodium metal, sodium hydride, and potassium tert-butoxide.
  • the amount of the base used is usually 1.1 to 10 times, preferably 1.2 to 5 times the molar ratio of the compound represented by the formula (9).
  • the reaction temperature of the nucleophilic substitution reaction varies depending on the solvent used, but is usually 0 to 100 ° C. When the reaction temperature is lower than the lower limit, the reaction may be slowed. On the other hand, when the reaction temperature exceeds the upper limit, the side reaction may proceed due to an excessive temperature.
  • the reaction time for the nucleophilic substitution reaction is preferably about 0.2 to 48 hours, although it varies depending on the conditions such as the reaction temperature.
  • a reaction product containing the compound represented by the formula (10) and the compound represented by the formula (13) can be obtained by such a nucleophilic substitution reaction.
  • the reaction product may be used as it is in the next step b without being purified, and after purification of the compound represented by the formula (10) by silica gel column chromatography, liquid separation extraction treatment, adsorbent treatment, or the like.
  • the compound represented by the formula (13) may be used, but is not reactive in the reaction in the step b described later, and can be purified in the step described later, and thus can be used unpurified. .
  • step b the compound represented by the formula (10) is tosylated, and the following formula (11): TsO— (CH 2 CH 2 O) a —R 2 (11) Is a step of obtaining a compound represented by the formula:
  • Ts represents a tosyl group
  • R 2 represents a trityl group or a benzyl group
  • a represents an integer of 6 to 40.
  • R 2 is derived from R 2 in the formula (10).
  • step b the reaction product obtained in the step a and p-toluenesulfonic acid chloride are reacted in the presence of a base, whereby the compound represented by the formula (11) and the formula (13) A reaction product comprising the compound represented can be obtained.
  • the reaction in step b can be performed in a solvent.
  • the solvent include water, tetrahydrofuran, acetonitrile, DMF, dichloromethane, chloroform, and mixtures thereof.
  • the amount of the solvent used is usually 1 to 100 times, preferably 2 to 50 times, and most preferably 3 to 30 times the mass ratio of the compound represented by the formula (10).
  • the amount of the solvent used is less than the lower limit, it may be difficult to control the reaction due to heat generation. On the other hand, when the amount exceeds the upper limit, the progress of the reaction tends to be slow.
  • the amount of p-toluenesulfonic acid chloride used in step b is usually 0.8 to 5 times, preferably 0.9 to 3 times in molar ratio to the compound represented by the formula (10). is there.
  • the amount of p-toluenesulfonic acid chloride used is less than the lower limit, a large amount of unreacted compound represented by the formula (10) remains, resulting in a decrease in yield.
  • the upper limit is exceeded. In this case, unreacted p-toluenesulfonic acid chloride remains and it is difficult to remove it.
  • the base used for the reaction is not problematic as long as the reaction proceeds, and examples thereof include triethylamine, sodium hydroxide, and pyridine.
  • the amount of the base used is usually 1.1 to 10 times, preferably 1.2 to 5 times the molar ratio of the compound represented by the formula (10).
  • the reaction temperature for the above reaction is usually 0 to 80 ° C., although it varies depending on the solvent used. When the reaction temperature is less than the lower limit, the progress of the reaction may be delayed, whereas when the reaction temperature exceeds the upper limit, the generated compound represented by the formula (11) may cause a side reaction. There is.
  • the reaction time for the reaction varies depending on the reaction temperature and other conditions, but is usually preferably about 0.2 to 48 hours.
  • step b a reaction product containing the compound represented by the formula (11) and the compound represented by the formula (13) can be obtained by such a reaction.
  • the reaction product may be used as it is in the next step c without being purified, and after purification of the compound represented by the formula (11) by silica gel column chromatography, liquid separation extraction treatment, adsorbent treatment or the like. Although it may be used, in the present invention, since it can be purified in the steps described later, it can be used without purification.
  • Step c is a step of obtaining a compound represented by the formula (3) by detritylating or debenzylating the compound represented by the formula (11).
  • formula (11) in the reaction product obtained in the step b when R 2 is a trityl group, detritylation is performed, and when R 2 is a benzyl group, debenzylation is performed.
  • a reaction product containing the compound represented by the formula (3) can be obtained.
  • the compound represented by the formula (13) was detritylated or debenzylated, and the following formula (14): HO— (CH 2 CH 2 O) d —H (14) Is contained as an impurity.
  • d represents an integer of 8 to 80.
  • R 2 in the formulas (11) and (13) can be detritylated by a conversion reaction under acidic conditions, catalytic hydrogenation, or the like.
  • the conversion reaction under the acidic condition for example, the reaction is performed in 1M hydrochloric acid at 60 ° C., or the reaction is performed by adding a catalytic amount of p-toluenesulfonic acid monohydrate in methanol. The method is mentioned.
  • Examples of the method by catalytic hydrogenation include a method of adding a catalytic amount of palladium / carbon in a methanol solvent under a hydrogen atmosphere.
  • R 2 in the formulas (11) and (13) is a benzyl group, it can be debenzylated by catalytic hydrogenation.
  • a catalytic amount of methanol in a methanol solvent under a hydrogen atmosphere It can be debenzylated by adding palladium / carbon.
  • a reaction product containing the compound represented by the formula (3) and the compound represented by the formula (14) can be obtained by such detritylation or debenzylation.
  • the reaction product may be used as it is in the next step d without being purified, and after purifying the compound represented by the formula (3) by silica gel column chromatography, liquid separation extraction treatment, adsorbent treatment or the like. Although it may be used, in the present invention, since it can be purified in the steps described later, it can be used without purification.
  • Step d is a step of purifying the reaction product containing the compound represented by the formula (3) obtained in the step c to obtain the hetero monodisperse polyethylene glycol production intermediate. is there.
  • the reaction product containing the compound is used for the production of conventional hetero monodisperse polyethylene glycol.
  • a composition containing a compound having a protecting group bonded to at least one of both ends, obtained by an intermediate synthesis method it has a characteristic that the polarity difference of the contained compound is large. Therefore, it can be separated and removed more easily than before by purification operations such as silica gel column chromatography, liquid separation extraction treatment, adsorbent treatment and the like.
  • a high-purity intermediate for production of the hetero-monodispersed polyethylene glycol of the present invention can be obtained by only a simple liquid separation extraction process without purification by silica gel column chromatography. Can do.
  • Examples of the liquid separation extraction treatment include a method including a washing step (w3) in which the reaction product obtained in the step c is dissolved in an organic solvent and then separated and washed with an aqueous solution at 25 ° C. or lower.
  • Examples of the organic solvent include toluene, chloroform, and dichloromethane. Among these, chloroform and dichloromethane are preferable from the viewpoint of solubility of the compound represented by the formula (3).
  • the amount of the organic solvent used is usually 2 to 30 times in mass ratio with respect to the reaction product containing the compound represented by the formula (3) and the compound represented by the formula (14). Preferably, it is 3 to 20 times.
  • the compound represented by the formula (3) When the amount of the organic solvent used is less than the lower limit, the compound represented by the formula (3) may be dissolved in the aqueous layer. On the other hand, when the amount exceeds the upper limit, the formula (14) The compound represented by may be dissolved in the organic layer.
  • the aqueous solution is not particularly limited as long as it can dissolve the compound represented by the formula (14).
  • low salt concentrations such as ion-exchanged water, sodium chloride, and potassium chloride
  • An aqueous solution of The amount of the aqueous solution used is usually 2 to 30 times by mass ratio, preferably 2 to 30 times the reaction product containing the compound represented by the formula (3) and the compound represented by the formula (14). Is 3 to 20 times.
  • the cleaning efficiency of the compound represented by the formula (14) decreases, and when the amount exceeds the upper limit, it is represented by the formula (3). May dissolve in the water layer.
  • the value of the organic solvent / aqueous solution is usually 0.2 to 3.0 by mass ratio, and 0.5 to 2.0. It is preferable that
  • the temperature of the washing step (w3) is preferably 1 to 25 ° C., more preferably 5 to 20 ° C.
  • the compound represented by the formula (14) tends to be difficult to dissolve and remove in the organic layer.
  • cleaning It is preferable to carry out several times, confirming the compound represented by said Formula (14) contained in an organic solvent by TLC, MS measurement, etc.
  • step d an intermediate for producing a hetero-monodisperse polyethylene glycol of the present invention containing the compound represented by the formula (3) with high purity can be easily obtained by such a liquid separation extraction treatment.
  • impurities generated in steps a to c can be removed by such simple purification, so that purification by silica gel column chromatography or the like is unnecessary in each step.
  • the obtained intermediate for producing a monodispersed polyethylene glycol containing a compound represented by the formula (3) can be used as it is for producing the heteromonodispersed polyethylene glycol of the present invention. However, it may be used after further purification by crystallization, adsorbent treatment, silica gel column chromatography and the like.
  • hetero-type monodisperse polyethylene glycol hetero-type monodisperse polyethylene glycol conjugate
  • the hetero-type monodispersed polyethylene glycol containing the compound represented by this can be obtained.
  • X and Y each represent an atomic group containing a functional group capable of forming a covalent bond with a functional group present in the biofunctional molecule, and the functional group and atomic group contained in the atomic group X A is different from the functional group contained in Y, and a represents an integer of 6 to 40.
  • the atomic group X is an atomic group located at the end of the polyethylene glycol chain of the hetero-type monodisperse polyethylene glycol represented by the formula (12), and forms a covalent bond with a functional group present in the biofunctional molecule.
  • X may be only the functional group (X ′), or may be composed of the functional group (X ′) and the binding site (W) to the polyethylene glycol chain.
  • X- X'-W- It is represented by In the above formula, X ′ represents a functional group capable of forming a covalent bond with a functional group present in the biofunctional molecule, and W represents a binding site or a single bond to the polyethylene glycol chain.
  • the atomic group Y is an atomic group located at the end of the polyethylene glycol chain of the hetero-type monodisperse polyethylene glycol represented by the formula (12), and can form a covalent bond with a functional group present in the biofunctional molecule.
  • Y may be composed of only the functional group (Y ′) or the functional group (Y ′) and a binding site (W ′) to the polyethylene glycol chain.
  • Y- Y'-W'- It is represented by In the above formula, Y ′ represents a functional group capable of forming a covalent bond with a functional group present in the biofunctional molecule, and W ′ represents a binding site or a single bond to the polyethylene glycol chain.
  • the binding sites W and W ′ are each independently a linker responsible for binding to a polyethylene glycol chain, and are not particularly limited as long as it is a site constituted by a covalent bond, preferably an ester bond, a urethane bond, Examples thereof include an amide bond, an ether bond, a carbonate bond, a divalent hydrocarbon group containing a secondary amino group, a single bond, and a divalent hydrocarbon group.
  • the hydrocarbon group preferably has 12 or less carbon atoms, methylene group, ethylene group, trimethylene group, propylene group, isopropylene group, tetramethylene group, butylene group, isobutylene group, pentamethylene group, hexamethylene group. Groups and the like.
  • the functional groups X ′ and Y ′ are functional groups different from each other and are biofunctional molecules (protein drugs, polypeptides, enzymes, antibodies, antibody drugs, genes, oligonucleic acids) to be modified with hetero-type monodisperse polyethylene glycol. And the like, as long as it is a functional group capable of forming a covalent bond by reacting with a functional group present in a nucleic acid compound, a nucleic acid pharmaceutical, an anticancer drug, a low molecular drug, or the like).
  • X ′ and Y ′ each independently a group (amino group, thiol group, aldehyde group, carboxyl group, etc.) present in a natural biofunctional molecule represented by a protein or the biofunctional polymer It is preferably a functional group capable of reacting with a group that can be artificially introduced into a group (maleimide group, ketone group, azide group, alkynyl group, etc.) under mild conditions and with high reaction efficiency.
  • X ′ and Y ′ include acetal group, aldehyde group, maleimide group, active ester group, active carbonate group, carboxyl group, amino group, aminooxy group, alkynyl group, and azide group. It is preferably one type of functional group selected from the group consisting of
  • X ′ and Y ′ are each independently an acetal group, an aldehyde group, an active ester group, an active carbonate group, a carboxyl group when the functional group present in the target biofunctional molecule is an amino group.
  • the functional group present in the target biofunctional molecule is a thiol group, it is preferably a maleimide group, a vinyl sulfone group, an iodoacetamide group, an allyl group, or a vinyl group
  • the functional group present in the target biofunctional molecule is an aldehyde group or a ketone group, it is preferably an amino group or an aminooxy group, and the functional group present in the target biofunctional molecule is a carboxyl group.
  • the group is preferably an amino group, an aminooxy group, or a thiol group.
  • the group is a maleimide group, it is preferably a thiol group, and when the functional group present in the target biofunctional molecule is an azide group, it is preferably an alkynyl group.
  • the functional group present in the functional molecule is an alkynyl group, it is preferably an azide group.
  • X ′ in the atomic group X and Y ′ in the atomic group Y is one functional group selected from the group consisting of a maleimide group, an azide group, an alkynyl group, and an iodoacetamide group.
  • Y ′ is preferably one functional group selected from the group consisting of a carboxyl group or an active ester group.
  • the maleimide group in the present invention includes the binding site (W, W ′) and the following formula (15):
  • R 3 is preferably a hydrogen atom or a methyl group, and more preferably a hydrogen atom.
  • the atomic group X and the atomic group Y include, for example, the following formula:
  • R 3 has the same meaning as R 3 in the formula (15) in.
  • the active ester group in the present invention includes the binding site (W, W ′) and the following formula (16):
  • R 4 is preferably a phenyl group, a 3-pyridyl group, a succinimide group, a 2-benzothiazole group, or a 1-benzotriazole group, more preferably a succinimide group or a 1-benzotriazole group, Most preferred is a succinimide group.
  • X ′ in atomic group X is an active ester group
  • Y ′ in atomic group Y is an active ester group
  • examples of atomic group X and atomic group Y include the following formula:
  • R 4 has the same meaning as R 3 in the formula (16).
  • the alkynyl group in the present invention includes the bonding sites (W, W ′) and the following formulas (17) to (20):
  • the R 5 preferably saturated hydrocarbon group or a hydrogen atom having not more than 8 carbon atoms, more preferably a hydrogen atom.
  • atomic group X and atomic group Y include, for example, the following formula (21) To (23):
  • f represents an integer of 2 ⁇ 5
  • R 5 are the same as R 5 in the formula (17) in.
  • g represents an integer of 1 to 6.
  • atomic group X and atomic group Y are represented by the following formula:
  • atomic group X and atomic group Y are represented by the following formula:
  • a known synthesis method can be used as appropriate. For example, as a method for introducing a maleimide group, 3-maleimidopropionic acid, maleimidobutyric acid or the like is reacted with a condensing agent such as 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride, and then the formula (1 ) Containing the compound represented by formula (1) as a main component, or a method comprising reacting the compound represented by formula (1) as a main component in the presence of a base such as triethylamine.
  • a condensing agent such as 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride
  • Examples include a method of reacting N-succinimidyl 3-maleimidopropionate and N-succinimidyl maleimide butyrate with the hetero-type monodispersed polyethylene glycol of the invention. Further, for example, as a method for introducing an active ester group, 1- (3-dimethylaminopropyl) is used for the hetero-monodispersed polyethylene glycol of the present invention containing the compound represented by the formula (1) as a main component. And a method of reacting N-hydroxysuccinimide in the presence of a condensing agent such as 3-ethylcarbodiimide hydrochloride.
  • a condensing agent such as 3-ethylcarbodiimide hydrochloride.
  • the hetero-monodisperse polyethylene glycol of the present invention containing the compound represented by the formula (1) as a main component is added in the presence of a base such as triethylamine.
  • a base such as triethylamine.
  • a method of reacting (iodoacetic acid) anhydride and the like can be mentioned.
  • propargyl chloroformate is present in the presence of a base such as triethylamine with respect to the hetero type monodisperse polyethylene glycol of the present invention containing the compound represented by the formula (1) as a main component.
  • hetero-type monodispersed polyethylene glycol containing the compound represented by the formula (12) as a main component can be obtained.
  • the hetero-monodispersed polyethylene glycol obtained using the hetero-monodispersed polyethylene glycol containing the compound represented by the formula (1) of the present invention is represented by the formula (12) and has an ethylene glycol chain length (that is, A compound (heteropolyethylene glycol) having the same value (a) can be contained with high purity.
  • a hetero-monodispersed polyethylene glycol conjugate obtained by binding the compound (heteropolyethylene glycol) and a biofunctional molecule can be obtained.
  • generation of a compound having a drug introduced at both ends or a compound having a targeting molecule introduced at both ends is sufficiently suppressed. Can do.
  • biofunctional molecule examples include protein drugs, polypeptides, enzymes, antibodies, antibody drugs, genes, nucleic acid compounds including genes such as oligonucleic acids, other drugs such as nucleic acid drugs, anticancer drugs, and low molecular weight drugs.
  • the compound represented by the formula (1) or one terminal of the compound represented by the formula (12), that is, the above-mentioned A targeting molecule such as an antibody or a peptide ligand is introduced into the amino group or carboxyl group in the formula (1) and the atomic group X in the formula (12), and the other end, that is, in the formula (1)
  • medical agent and a targeting molecule may be reverse.
  • Compound 2 was synthesized according to the reaction route shown in the above formula. That is, tetraethylene glycol 1 (200 mL, 1.15 mol) was placed in a two-necked eggplant flask, and azeotropic dehydration was performed twice using toluene (50 mL ⁇ 2 times). The eggplant flask was purged with nitrogen, pyridine (18 mL, 0.22 mol) and trityl chloride (TrtCl, 40 g, 0.144 mol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours.
  • pyridine 18 mL, 0.22 mol
  • TrtCl trityl chloride
  • Compound 4 was synthesized according to the reaction route shown in the above formula. That is, a reaction product containing the above compound 2 (compound 2: 62.8 g, less than 0.144 mol) and 200 mL of tetrahydrofuran (THF) were placed in an eggplant flask and cooled to 0 ° C. Aqueous sodium hydroxide (20.0 g, 0.50 mol / 60 mL) was added, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 20 minutes. Tosyl chloride (TsCl) / THF solution (30.0 g, 0.157 mol / 60 mL) was added dropwise to the reaction mixture over 30 minutes, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 4 hours.
  • TsCl tetrahydrofuran
  • the aqueous layer was extracted by adding 50 mL of diethyl ether.
  • the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain a reaction product containing Compound 5 as a pale yellow transparent liquid. Further, it was confirmed by ESI-MS measurement that the obtained reaction products contained the above compounds 3 and 6.
  • Compound 7 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, a reaction product (Compound 5: 77.8 g, less than 0.144 mol) containing Compound 5 obtained in Synthesis Example I-2 and 200 mL of THF were placed in an eggplant flask and cooled to 0 ° C. Aqueous sodium hydroxide (20.0 g, 0.50 mol / 60 mL) was added, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 20 minutes. A TsCl / THF solution (29.5 g, 0.157 mol / 60 mL) was added dropwise to the reaction mixture over 30 minutes, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 1.5 hours.
  • a reaction product (Compound 5: 77.8 g, less than 0.144 mol) containing Compound 5 obtained in Synthesis Example I-2 and 200 mL of THF were placed in an eggplant flask and cooled to 0 ° C. Aqueous sodium hydroxide (20.0 g
  • Compound 8 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, first, a reaction product (compound 7: 85.6 g, less than 0.144 mol) containing compound 7 obtained in Synthesis Example I-3 in an eggplant flask, methanol 200 mL, palladium carbon (Pd / C) 2 g The inside of the eggplant flask was replaced with hydrogen and stirred at room temperature for 18 hours. After 18 hours, disappearance of Compound 7 was confirmed using TLC (ethyl acetate), and Pd / C was removed by Celite filtration. 130 mL of ion exchange water was added to the filtrate, and the generated solid (triphenylmethane) was removed by filtration.
  • Compound 10 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, a purified product containing Compound 8 obtained in Synthesis Example I above (Compound 8: 1.0 g, 1.91 mmol), tert-butyl acrylate (R 1 in Formula (4) is tert- A compound that was a butyl group, 1.82 mL, 19.1 mmol) and toluene (25 mL) were added. After cooling to 0 ° C., potassium hydroxide (powder, 53 mg, 0.9 mmol) was added and stirred at 0 ° C. for 1 hour.
  • tert-butyl acrylate R 1 in Formula (4) is tert- A compound that was a butyl group, 1.82 mL, 19.1 mmol
  • toluene 25 mL
  • Compound 11 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, a reaction product (compound 10: 1.06 g, 1.60 mmol) containing Compound 10 obtained in Synthesis Example II-1 and 25 mL of acetonitrile (MeCN) were placed in an eggplant flask. The eggplant flask was purged with nitrogen, potassium phthalimide (PIK, 520 mg, 2.80 mmol) was added, and the mixture was stirred at 80 ° C. for 8 hours. After 8 hours, disappearance of Compound 10 was confirmed by ESI-MS and 1 H-NMR (CDCl 3 ), and the reaction solution was concentrated under reduced pressure.
  • a reaction product compound 10: 1.06 g, 1.60 mmol
  • MeCN acetonitrile
  • Compound 12 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, the reaction product containing Compound 11 obtained in Synthesis Example II-2 (Compound 11: 510 mg, 0.80 mmol), ethanol 10 mL, and hydrazine monohydrate (334 mg, 6.70 mmol) in an eggplant flask. ) And stirred at 85 ° C. for 45 minutes. After 45 minutes, the disappearance of compound 11 was confirmed by ESI-MS, and cooled to room temperature.
  • Example 2-1 Synthesis of Compound 23 wherein a in Formula (1) is 12 [Synthesis Example III] Synthesis of Compound 18 wherein a in Formula (3) is 12 [Synthesis Example III-1] Synthesis of Compound 14 wherein c in Formula (9) is 8, L is a mesyl group, and R 2 is a trityl group
  • Compound 14 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. Specifically, a reaction product containing Compound 5 synthesized in Synthesis Example I-2 (Compound 5: 72.7 g, less than 0.119 mol) and toluene (350 mL) were placed in an eggplant flask, and the eggplant flask was purged with nitrogen. Triethylamine (19.8 mL, 0.143 mol) was added. Methanesulfonyl chloride (10.1 mL, 0.131 mol) was added dropwise at 0 ° C., and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. After 2 hours, disappearance of Compound 5 was confirmed by ESI-MS measurement, and 1M HClaq.
  • Compound 15 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, sodium hydride (6.58 g) was placed in a two-necked eggplant flask and purged with nitrogen. The extract was washed twice with dehydrated hexane (50 mL ⁇ 2 times), 200 mL of MeCN was added, and the mixture was cooled to 0 ° C. 50 mL of MeCN was mixed with tetraethylene glycol 1 (a compound in which b is 4 in formula (8), 180 g, 0.927 mol) azeotropically dehydrated three times with 50 mL of toluene, and dropped into a dropping funnel over 30 minutes. did.
  • sodium hydride (6.58 g) was placed in a two-necked eggplant flask and purged with nitrogen. The extract was washed twice with dehydrated hexane (50 mL ⁇ 2 times), 200 mL of MeCN was added, and the mixture was cooled to 0
  • This toluene solution was washed twice with 100 mL of saturated aqueous ammonium chloride solution and three times with 100 mL of saturated brine. Sodium sulfate was added to the organic layer, dried and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain a reaction product containing Compound 15 as a pale yellow transparent liquid. Further, it was confirmed by ESI-MS measurement that the obtained reaction products contained the above compounds 3, 6 and 16.
  • Compound 17 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, the reaction product containing Compound 15 obtained in Synthesis Example III-2 (Compound 15: 57.3 g, less than 72.7 mmol) and dichloromethane (280 mL) and dichloromethane (280 mL) were placed in an eggplant flask, and the inside of the eggplant flask was purged with nitrogen. Triethylamine (10.1 mL, 72.7 mmol), 4-dimethylaminopyridine (DMAP, 888 mg, 7.27 mmol) and TsCl (12.5 g, 65.5 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 4.5 hours.
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • TsCl 12.5 g, 65.5 mmol
  • Compound 18 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, first, a reaction product containing Compound 17 obtained in Synthesis Example III-3 (Compound 17: 69.1 g, less than 73.3 mmol) and methanol (550 mL) were placed in an eggplant flask, and then TsOH ⁇ H 2 O (6.97 g, 36.7 mmol) and hexane (200 mL) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. After 30 minutes, the hexane layer was removed, hexane (200 mL) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes.
  • Compound 20 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, a purified product containing compound 18 obtained in Synthesis Example III above (compound 18: 4.96 g, 7.08 mmol), tert-butyl acrylate (R 1 in formula (4) is tert- A compound that is a butyl group, 3.09 mL, 21.2 mmol) and toluene (100 mL) were added. Potassium hydroxide (powder, 199 mg, 3.54 mmol) was added at 0 ° C., and the mixture was stirred at 0 ° C. for 1 hour.
  • tert-butyl acrylate R 1 in formula (4) is tert- A compound that is a butyl group, 3.09 mL, 21.2 mmol
  • toluene 100 mL
  • Compound 21 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, the reaction product containing Compound 20 obtained in Synthesis Example IV-1 (Compound 20: 5.43 g, 6.55 mmol) and acetonitrile (45 mL) were placed in an eggplant flask and purged with nitrogen. Phthalimide potassium salt (1.58 g, 8.52 mmol) was added and stirred at 80 ° C. for 18 hours. After 18 hours, it was confirmed by 1 H-NMR that compound 20 had disappeared, and the reaction solution was concentrated under reduced pressure. 50 mL of dichloromethane was added to the residue, and the insoluble material was filtered off.
  • Phthalimide potassium salt (1.58 g, 8.52 mmol) was added and stirred at 80 ° C. for 18 hours. After 18 hours, it was confirmed by 1 H-NMR that compound 20 had disappeared, and the reaction solution was concentrated under reduced pressure. 50 mL of dichloromethane was added to the residue, and the insoluble material was
  • the filtrate was washed once with 50 mL of 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution and once with 50 mL of saturated brine. Sodium sulfate was added to the organic layer, dried and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain a reaction product containing Compound 21 as a pale yellow transparent liquid.
  • Compound 22 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, the reaction product containing compound 21 obtained in Synthesis Example IV-2 (Compound 21: 4.26 g, 5.30 mmol), hydrazine monohydrate (3.86 mL, 79.5 mmol) in an eggplant flask. ) And ethanol (60 mL) were added, and the mixture was stirred at 85 ° C. for 1 hour. After 1 hour, disappearance of Compound 21 was confirmed by ESI-MS, and the mixture was cooled to room temperature.
  • Compound 23 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, first, a reaction product containing Compound 22 obtained in Synthesis Example IV-3 (Compound 22: 3.13 g, 4.65 mmol) and 1M aqueous hydrochloric acid solution (3 mL) were placed in an eggplant flask at 60 ° C. Stir for 2 hours. After 2 hours, it was confirmed by ESI-MS measurement that Compound 22 had disappeared, and then cooled to room temperature.
  • reaction solution was diluted with 5 mL of ion-exchanged water and washed 3 times with 10 mL of dichloromethane.
  • the aqueous layer was adjusted to pH 9 by adding a 2M aqueous sodium hydroxide solution and a 0.1M aqueous sodium hydroxide solution.
  • This aqueous solution was washed with 10 mL of dichloromethane three times, and 2 g of sodium chloride was added to the aqueous layer for saturation.
  • This aqueous solution was extracted 3 times with 10 mL of chloroform, and sodium sulfate was added to the organic layer, followed by drying and filtration.
  • Compound 24 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, a purified product containing Compound 8 obtained in Synthesis Example I-4 (Compound 8: 10.0 g, 19.1 mmol) was placed in an eggplant flask, and potassium hydroxide (1.6 g, 1 .5 eq.) In water (10 mL) was added. Acrylonitrile (14.6 mL, 12 eq.) was placed in a dropping funnel and dropped at 0 ° C., followed by stirring at 0 ° C. for 3 hours. After 3 hours, the consumption of Compound 8 was confirmed by ESI-MS measurement, and 1.6 mL of 85% phosphoric acid was added to adjust the pH to be lower than 6.
  • This solution was diluted with 100 mL of toluene, and then washed twice with 100 mL of ion-exchanged water and once with 100 mL of saturated saline. Sodium sulfate was added to the organic layer, dried and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain a reaction product containing a colorless transparent liquid compound 24.
  • Compound 25 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, a reaction product (compound 24: 2.62 g, 4.54 mmol) containing the above compound 24 and acetonitrile (20 mL) were placed in an eggplant flask and purged with nitrogen. Phthalimide potassium salt (1.2 g, 1.2 eq.) was added, and the mixture was stirred at 80 ° C. for 4.5 hours. After 4.5 hours, disappearance of the Ts group peak was confirmed by 1 H-NMR measurement to confirm the disappearance of compound 24, and the mixture was allowed to cool to room temperature. The reaction solution was concentrated under reduced pressure, 20 mL of dichloromethane was added to the residue, and the solid content was removed by filtration.
  • the filtrate was washed once with 20 mL of 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution and once with 10 mL of saturated brine. Sodium sulfate was added to the organic layer, dried and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain a reaction product containing Compound 25 as a colorless and transparent liquid.
  • compound 26 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, a reaction product containing the compound 25 (compound 25: 1.03 g, 1.87 mmol) and ethanol (15 mL) were placed in an eggplant flask. Hydrazine monohydrate (1.4 mL, 15 eq.) was added, and the mixture was stirred at 85 ° C. for 45 minutes. After 45 minutes, disappearance of compound 25 was confirmed by ESI-MS measurement. In order to dissolve the precipitated white solid, 7.5 mL of 12% potassium carbonate aqueous solution was added, and then the mixed solution was concentrated under reduced pressure and azeotropically dehydrated twice with 10 mL of toluene.
  • the residue was dissolved in 20 mL of ion exchange water, and 35% hydrochloric acid was added to adjust the pH to 3.
  • the precipitated solid was filtered, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and azeotropically dehydrated twice with 10 mL of toluene.
  • the residue was dissolved in 20 mL of dichloromethane, added with sodium sulfate, dried and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain a reaction product containing Compound 26 as a pale yellow transparent liquid.
  • the compound 13 was synthesize
  • Example 1-2 The purified product containing compound 13 obtained in Example 1-1 was subjected to (A) reverse phase chromatography measurement, (B) cation exchange chromatography measurement, and (C) anion exchange chromatography measurement.
  • the obtained chromatogram is shown in FIG.
  • the vertical axis of the chromatogram indicates the signal intensity obtained from the detector
  • the horizontal axis indicates the elution time (column retention time).
  • the elution time at the start of elution is 9.10 minutes
  • the elution time at the end of elution is 15.58 minutes
  • the elution time of P 1top is 11.98 minutes
  • T 1 a is 11.58 minutes
  • T 1 b is 12.34 minutes.
  • the area P 1 was calculated to be 4025.419
  • the area A 1 was calculated to be 4288.511
  • the value of area P 1 / area A 1 was 0.94.
  • Table 1 The results are shown in Table 1.
  • FIG. 6 shows a chromatogram obtained by injecting only a developing solvent not containing a sample and measuring under the same conditions. This confirms that the peak detected before the elution time of 8.25 minutes in the above measurement is a peak caused by the developing solvent, etc., or a pseudo peak due to baseline fluctuations caused by the column or device used. did.
  • the obtained chromatogram is shown in FIG.
  • the elution time at the elution start point was 3.95 minutes
  • the elution time at the elution end point was 6.24 minutes
  • the elution time for P 2top was 5.38 minutes
  • T 2 was 5.15 minutes.
  • the area B 2 was calculated to be 21.651
  • the area A 2 was calculated to be 6610.714
  • the value of area B 2 / area A 2 was 0.00.
  • Table 1 The results are shown in Table 1.
  • FIG. 8 shows the chromatogram obtained by measurement under the conditions of 0.01 mg / g and injection amount of 5 ⁇ L. From this, it was confirmed that the peak detected at the elution time of 4.60 minutes in the above measurement was a peak due to the developing solvent or the like, or a pseudo peak due to baseline fluctuations due to the column or apparatus used.
  • the obtained chromatogram is shown in FIG.
  • the elution time at the elution start point was 9.60 minutes
  • the elution time at the elution end point was 11.64 minutes
  • the elution time of P 3top was 10.42 minutes
  • T 3 was 10.11 minutes.
  • the area B 3 was calculated to be 46.036
  • the area A 3 was calculated to be 1158.267
  • the value of area B 3 / areaA 3 was 0.00.
  • Table 1 The results are shown in Table 1.
  • FIG. 10 shows the chromatogram obtained by measurement under the conditions of 0.01 mg / g and injection amount of 5 ⁇ L. As a result, the peaks detected during the elution time of 3.90 to 8.00 minutes in the above measurement are peaks due to the developing solvent, etc., and pseudo peaks due to fluctuations in the baseline due to the column and apparatus used. I confirmed that there was.
  • Example 2-2 The purified product containing compound 23 obtained in Example 2-1 was subjected to (A) reverse phase chromatography measurement, (B) cation exchange chromatography measurement, and (C) anion exchange chromatography measurement.
  • the elution time at the elution start point is 8.50 minutes
  • the elution time at the elution end point is 25.67 minutes
  • the elution time of P 1top is 19.30 minutes
  • T 1 a is 18.93 minutes
  • T 1 b is It was 20.19 minutes.
  • the area P 1 was calculated to be 11053.332
  • the area A 1 was calculated to be 116599.09
  • the value of area P 1 / area A 1 was 0.95.
  • Table 1 The results are shown in Table 1.
  • the peak detected before the elution time of 7.10 minutes in the above measurement is the peak caused by the developing solvent or the column used. It was confirmed that this was a pseudo peak due to baseline fluctuations caused by the device.
  • the chromatogram which detected the sample with the mass spectrometer similarly to Example 1-2 is shown in FIG. As a result, it was confirmed that the peak detected at the elution time of 3.90 to 5.20 minutes was a peak caused by the developing solvent or the like, or a pseudo peak due to baseline fluctuation caused by the column or apparatus used. It was.
  • Comparative Example 1-2 For the comparative purified product 1-2 obtained in Comparative Example 1-1, (A) Reversed phase chromatography measurement, (B) Cation exchange chromatography measurement, (C) Anion, as in Example 1-2 Exchange chromatography measurements were taken.
  • Comparative Example 2-2 Comparative purified product 2 obtained in Comparative Example 2-1 was subjected to (A) reverse phase chromatography measurement, (B) cation exchange chromatography measurement, and (C) anion exchange chromatography in the same manner as in Example 1-2. Graphical measurements were taken.
  • FIG. 18 shows a chromatogram obtained by detecting the same sample with a mass spectrometer in the same manner as in Example 1-2. From this, it was confirmed that the peak detected at the elution time of 4.08 minutes in the above measurement was derived from a compound having a hydroxyl group instead of the amino group of compound 13.
  • Comparative Example 3-2 Comparative purified product 3 obtained in Comparative Example 3-1 was subjected to (A) reverse phase chromatography measurement, (B) cation exchange chromatography measurement, and (C) anion exchange chromatography in the same manner as in Example 2-2. Graphical measurements were taken.
  • Comparative Example 4-2 For the comparative purified product 4 obtained in Comparative Example 4-1, in the same manner as in Example 1-2, (A) reverse phase chromatography measurement, (B) cation exchange chromatography measurement, (C) anion exchange chromatography. Graphical measurements were taken.
  • Example 1-2 a chromatogram obtained by detecting the same sample with a mass spectrometer is shown in FIG. From this, it was confirmed that the peak detected at the elution time of 4.60 minutes in the above measurement was a peak due to the developing solvent or the like, or a pseudo peak due to baseline fluctuations due to the column or apparatus used. .
  • FIG. 24 shows a chromatogram obtained by detecting the same sample with a mass spectrometer in the same manner as in Example 1-2. From this, the peak detected in the above measurement at an elution time of 4.30 to 5.70 minutes is a peak due to the developing solvent or the like, or a pseudo peak due to fluctuations in the baseline due to the column or apparatus used, It was confirmed that the peak detected at an elution time of 3.83 minutes was derived from a compound in which a compound having a hydroxyl group was derivatized instead of the carboxyl group of compound 13.
  • Example 5 (Comparative Example 5) Instead of the purified product containing compound 13 obtained in Example 1-1, polyethylene glycol 1 containing commercially available compound 13 (trade name: Amino-dPEGR8-acid manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (A) Reversed phase chromatography measurement, (B) Cation exchange chromatography measurement, and (C) Anion exchange chromatography measurement were carried out in the same manner as Example 1-2 except that was used.
  • A Reversed phase chromatography measurement
  • B Cation exchange chromatography measurement
  • C Anion exchange chromatography measurement
  • FIG. 27 shows a chromatogram obtained by detecting the same sample with a mass spectrometer in the same manner as in Example 1-2. From this, it was confirmed that the peak detected at the elution time of 4.60 minutes in the above measurement was a peak due to the developing solvent or the like, or a pseudo peak due to baseline fluctuations due to the column or apparatus used. .
  • FIG. 29 shows a chromatogram obtained by detecting the same sample with a mass spectrometer in the same manner as in Example 1-2.
  • the peak detected at the elution time of 4.30 to 5.30 minutes in the above measurement is a peak due to the developing solvent, etc., or a pseudo peak due to baseline fluctuations due to the column or apparatus used. was confirmed.
  • FIG. 32 shows a chromatogram obtained by detecting the same sample with a mass spectrometer in the same manner as in Example 2-2. From this, it was confirmed that the peak detected at the elution time of 4.60 minutes in the above measurement was a peak due to the developing solvent or the like, or a pseudo peak due to baseline fluctuations due to the column or apparatus used. .
  • FIG. 34 shows a chromatogram obtained by detecting the same sample with a mass spectrometer in the same manner as in Example 2-2.
  • the peak detected at the elution time of 4.30 to 5.10 minutes in the above measurement is a peak due to the developing solvent, etc., or a pseudo peak due to baseline fluctuations due to the column or apparatus used. was confirmed.
  • the samples used in Comparative Examples 1-2 to 6 are represented by area B 2 / area A 2 . It was confirmed that the value was larger than 0.02 and a compound having no amino group was mixed as an impurity.
  • the samples used in Comparative Examples 4-2 to 5 (the purified product obtained in Comparative Example 4-1 and the commercially available polyethylene glycol 1) had an area B 3 / area A 3 value of greater than 0.02 and a carboxyl group. It was confirmed that a compound that does not have a mixture of impurities.
  • Example 1-3 The purified product containing compound 8 obtained in Synthesis Example I-4 of Example 1-1 was subjected to (D) reverse phase chromatography measurement.
  • the obtained chromatogram is shown in FIG.
  • the elution time at the elution start point is 15.00 minutes
  • the elution time at the elution end point is 32.38 minutes
  • the elution time of P 4 top is 27.57 minutes
  • T 4 a is 27.13 minutes
  • T 4 b Was 28.63 minutes.
  • is a 16481.986 was calculated areaP 4
  • it is a 17,130.905 was calculated areaA 4
  • the value of areaP 4 / areaA 4 was 0.96.
  • FIG. 36 shows a chromatogram obtained by injecting only a developing solvent not containing a sample and measuring under the same conditions. From this, it was confirmed that the peak detected before the elution time of 10.50 minutes in the above measurement is a peak caused by the developing solvent or the like, or a pseudo peak due to baseline fluctuations caused by the column or apparatus used. did.
  • Example 2-3 The purified product containing compound 18 obtained in Synthesis Example III-4 of Example 2-1 was subjected to (D) reverse phase chromatography measurement.
  • the peak detected before the elution time of 10.50 minutes in the above measurement is the peak caused by the developing solvent or the column used. It was confirmed that this was a pseudo peak due to baseline fluctuations caused by the device.
  • Comparative Example 1-3 Comparative purified product 1-1 obtained in Comparative Example 1-1 was subjected to (D) reverse phase chromatography measurement in the same manner as in Example 1-3.
  • Compound 27 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, first, a purified product (compound 13: 1.00 g, 2.26 mmol) containing compound 13 obtained in Example 1-1 was dissolved in 10 mL of acetonitrile, and 3-maleimidopropionic acid-N-succinimidyl was dissolved therein. (0.56 g, 2.49 mmol) and triethylamine (0.275 g, 2.72 mmol) were added and stirred at room temperature for 3 hours. After 3 hours, consumption of Compound 13 was confirmed by ESI-MS measurement, and the reaction solution was concentrated under reduced pressure.
  • reaction product was dissolved in 5 mL of DMF, and 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (0.47 g, 2.45 mmol) and N-hydroxysuccinimide (0.23 g, 2. 45 mmol) was added and stirred at room temperature for 18 hours. After 18 hours, consumption of the maleimide compound was confirmed by ESI-MS measurement, 15 mL of ethyl acetate was added, and the organic layer was washed twice with 10 mL of 1M hydrochloric acid and twice with 10 mL of saturated saline. Sodium sulfate was added to the organic layer, dried and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain a purified product containing a colorless transparent liquid compound 27.
  • Compound 28 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, a purified product containing compound 23 obtained in Example 2-1 (compound 23: 1.00 g, 1.62 mmol), triethylamine (0.18 g, 1.78 mmol) and dichloromethane (8 mL) were placed in an eggplant flask. And dissolved. The mixture was cooled to 0 ° C. and di (iodoacetic acid) anhydride (0.63 g, 1.78 mmol) dissolved in dichloromethane (2 mL) was added dropwise over 10 minutes. After completion of the dropwise addition, the reaction mixture was warmed to room temperature and reacted for 18 hours under light shielding.
  • Compound 29 was synthesized according to the reaction pathway shown in the above formula. That is, a purified product containing compound 23 obtained in Example 2-1 (compound 23: 1.00 g, 1.62 mmol), triethylamine (0.18 g, 1.78 mmol) and dichloromethane (8 mL) were placed in an eggplant flask. And dissolved. The mixture was cooled to 0 ° C. and dissolved in dichloromethane (2 mL) (1R, 8S, 9s) -Biccyclo [6.1.0] non-4-yn-9-ylmethyl N-succinimidyl carbonate (0.52 g, 1.78 mmol) was added dropwise over 10 minutes.
  • Dispersed polyethylene glycol can be provided.
  • the hetero-monodispersed polyethylene glycol of the present invention has a feature that the content of a compound having a different ethylene glycol chain length or a compound having a different terminal functional group is small. Therefore, when used as an ADC linker material, There are few problems in ADC production and pharmaceutical application due to compounds with different glycol chain lengths, and there are 2 compounds and antibodies that are bound by two drugs at the time of ADC production due to compounds with different terminal functional groups. It is possible to sufficiently suppress the formation of by-products that are not effective as a drug, such as two bonded compounds, or a drug or a compound to which no antibody is bound.
  • the method for producing the hetero-type monodispersed polyethylene glycol of the present invention is industrialized because the above-described high-purity hetero-type monodispersed polyethylene glycol can be produced only by separation extraction without using silica gel column chromatography or the like. It is a manufacturing method particularly suitable for the above.

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Abstract

下記式（１）：　ＮＨ２－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ　・・・（１） ［式（１）中、ａは６～４０の整数を示す。］ で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールにおいて、（Ａ）逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの示差屈折率計で検出されるクロマトグラム、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの示差屈折率計で検出されるクロマトグラム、及び、（Ｃ）前記式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを誘導体化して陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの示差屈折率計で検出されるクロマトグラムが、いずれも特定の関係式を満たすヘテロ型単分散ポリエチレングリコール。

Description

ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体及びそれらの製造方法、並びに、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体
　本発明は、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体及びそれらの製造方法、並びに、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体に関する。より詳しくは、生体機能性高分子；ドラッグデリバリーシステムにおける薬物や薬物キャリア；診断用材料やデバイス等の修飾に用いられ、特に、抗体結合医薬用のリンカー材料として有用なヘテロ型単分散ポリエチレングリコールに関する。
　近年、医薬品分野においては、リンカーを介して薬剤と抗体とを結合させ、抗原提示細胞に薬物を能動的に運搬することが可能な抗体結合医薬（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）が実用化されて高い注目を集めている（Ｔｏｘｉｎｓ、２０１１年、３、ｐ．８４８－８８３（非特許文献１）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０１１年、５４、ｐ．３６０６－３６２３（非特許文献２））。
　このＡＤＣのリンカー材料として利用が進められているものの１つが、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールである。ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、両末端に互いに異なる官能基を有するヘテロ型ポリエチレングリコールを主成分として含有し、かつ、分子量が一定である単分散ポリエチレングリコールである。
　前記ＡＤＣでは、前記ヘテロ型ポリエチレングリコールをリンカーとして、その各末端に抗体と薬剤とを区別して結合させるため、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール中に、両末端に互いに同じ官能基を有する化合物（ホモ型ポリエチレングリコール等）が不純物として存在すると、抗体が２つ結合した化合物又は薬剤が２つ結合した化合物が生成する。抗体が２つ結合した化合物は薬剤が結合していないためにＡＤＣとしての効果が奏されず、薬剤が２つ結合した化合物は抗体が結合していないために抗原提示細胞以外の箇所に運搬されて副作用を引き起こす原因となる。また、目的の官能基を有するヘテロ型ポリエチレングリコールと異なる組み合わせで官能基を有する他のヘテロ型化合物が不純物として存在する場合も、目的とする抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成するため、上記と同様の問題が生じる。したがって、薬剤の使用、効果の観点から、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールとしては、両末端に互いに異なる官能基を有するヘテロ型ポリエチレングリコールを１種のみ、高純度で含有することが重要といえる。
　また近年、前記ＡＤＣの効果を向上させることを目的として、抗体に対して複数個の薬剤を結合させたＡＤＣを使用することが試みられている。このＡＤＣを製造する際は、通常、薬剤の結合個数を質量分析計やＨＰＬＣを用いて確認するため、リンカー材料として用いる前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール中にエチレングリコール鎖長の異なる化合物が不純物として存在すると、その確認が困難になるという製造上の問題が生じる。その他にも、前記エチレングリコール鎖長の異なる化合物が不純物として存在すると、前記ＡＤＣ製造時に添加する抗体や薬剤の当量が不明確となるために高価な抗体や薬剤を過剰に使用する必要が生じるという問題や、前記エチレングリコール鎖長の異なる化合物は医薬品申請の際に主たる薬剤とは別の化合物として取り扱われるために、化合物の同定や各種試験の実施、許容量の評価等が更に必要になるという問題がある。したがって、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールとしては、互いにエチレングリコール鎖長が同じポリエチレングリコールを１種のみ、高純度で含有することも重要といえる。
　このように、ＡＤＣのリンカー材料として用いるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールとしては、主成分として、両末端に互いに異なる官能基を有するヘテロ型ポリエチレングリコールであって前記ヘテロ型ポリエチレングリコール間でエチレングリコール鎖長が互いに同じである化合物を、特に高純度で含有することが望まれていた。
　また、前記官能基としては、抗体や薬物等のチオール基と反応するマレイミド基、ヨードアセトアミド基；抗体や薬物等のアミノ基と反応するカルボキシル基、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基；抗体や薬物等のカルボキシル基と反応するアミノ基；クリック反応で使用されるアジド基、アルキニル基等が用いられている。これらの中でも、アミノ基及びカルボキシル基をそれぞれ末端に有するヘテロ型ポリエチレングリコールは、前記ＡＤＣのリンカーとしてそのまま使用可能であり、更にこれを原料として官能基変換して使用することが可能であるため、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールとして有用な化合物である。
　前記へテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法としては、末端官能基化工程と、Ｗｌｉｌｌｉａｍｓｏｎエーテル合成によるエチレングリコール鎖長の延長工程とを含む方法が挙げられる。例えば、米国特許第５６７２６６２号明細書（特許文献１）及び日本国特表２００７－５３８１１１号公報（特許文献２）には、モノメトキシポリエチレングリコールの末端にカルボキシル基を導入する方法が開示されている。特許文献１では、モノメトキシポリエチレングリコールとアクリロニトリルとをマイケル付加反応させ、濃塩酸条件下でニトリルをアミドに変換し、水酸化カリウム水溶液条件下でアミドを加水分解することでカルボキシル基を導入している。しかしながら、このような強酸、強塩基条件下では、マイケル付加反応の逆反応によってカルボキシル基ではなく水酸基を有する化合物が生成したり、エチレングリコール鎖の切断によってエチレングリコール鎖長が短い化合物等が生成するため、純度や収率が不十分であった。なお、かかる純度については、特許文献２の比較例に追試を行った結果が記載されており、末端にメトキシ基のない化合物が生成されることが確認されている。他方、特許文献２では、モノメトキシポリエチレングリコールとｔｅｒｔ－ブチルアクリレートとをマイケル付加反応させ、トリフリルオロ酢酸条件下でカルボキシル基を導入している。しかしながら、同文献に開示されている手法では、ｔｅｒｔ－ブチルアクリレートの導入率が７０％以下と低く、末端が水酸基である化合物が残存するという問題を有していた。
　また、特許文献１～２に記載の方法では、モノメトキシポリエチレングリコールを原料として用いているが、上記反応を用いた場合、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得る場合にも同様に、エチレングリコール鎖長が短い化合物や、末端にカルボキシル基ではなく水酸基を有する化合物が不純物として生成する。このような不純物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣの製造に用いると、エチレングリコール鎖長の短い化合物によって上記のＡＤＣ製造上の問題が生じたり、末端に水酸基を有する化合物によって抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成して薬剤としての有効性が低下する原因となる。
　また、例えば、末端に水酸基を有する化合物と末端にカルボキシル基を有する目的の化合物との違いは該末端の構造のみであるため、分離精製をすることが困難である。特許文献２では、得られた生成物を陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製しているが、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた方法は汎用性が低い精製方法であること、及び、収率が更に低下することから、簡便性及び収率の点で問題を有していた。
　さらに、エチレングリコール鎖長が５以上であるヘテロ型ポリエチレングリコールを含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを製造する場合、一般的にＷｉｌｌｉａｍｓｏｎエーテル合成によるエチレングリコール鎖長の延長反応が必要である。これは、エチレングリコール鎖長が４以下のトリエチレングリコールやテトラエチレングリコールは蒸留精製が可能であるため、純度が９８％以上の原料を入手可能であるが、エチレングリコール鎖長が５以上の化合物は蒸留精製が行えず、高純度品を安価に入手することが困難なためである。このＷｉｌｌｉａｍｓｏｎエーテル合成によるエチレングリコール鎖長の延長反応時には、副反応によって副生成物が生成することが知られている。例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９７年、５３、ｐ．１０９３９－１０９５２（非特許文献３）に記載されているように、エチレングリコールの脱離によって目的化合物よりもエチレングリコール鎖長が１つ短い化合物や、Ｅ２脱離によってエチレングリコール鎖長及び末端官能基の異なる化合物が生成する。実際に、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００９年、４８、ｐ．１２４８－１２５２（非特許文献４）では、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎエーテル合成時にエチレングリコールの脱離によって目的化合物よりもエチレングリコール鎖長が１つ短い化合物が３％生成することが記載されている。このようにエチレングリコール鎖長が１つ短い化合物を含有する混合物を用いてヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを製造すると、得られるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、目的とする主成分よりもエチレングリコール鎖長が１つ短い化合物を不純物として含有する。そのため、かかるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣの製造に用いると、上記のＡＤＣ製造上の問題が生じる。これらのエチレングリコール鎖長が異なる化合物同士は、化合物の構造が類似しているために分離精製をすることが困難であり、非特許文献４に記載されているように、複数回の逆相クロマトグラフィー等を実施することが必要である。
　また、両末端の官能基が互いに異なる前記ヘテロ型ポリエチレングリコールを製造するためには、片末端に保護基や脱離基を有し、他方の片末端に水酸基を有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を用いることが有用である。このような中間体を得る方法としては、例えば、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、２００２年、４、ｐ．２３２９－２３３２（非特許文献５）では、テトラエチレングリコールやヘキサエチレングリコールを原料とし、酸化銀を用いて片末端を選択的にトシル化する方法が開示されており、酸化銀を用いることによって効率よく片末端トシル体を得られることが記載されている。しかしながら、この方法では、両末端にトシル基を有する化合物が数％生成するという問題を有していた。
　さらに、Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．、２０１４年、５、ｐ．６９４－６９７（非特許文献６）では、エチレングリコール鎖長が８の片末端Ｄｍｔｒ体を合成することが開示されている。前記合成経路の一部は次式：
ＤmtrＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４－Ts　＋　HO－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４－Ｈ
　→　ＤmtrＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）８－Ｈ　
　　　　　　　＋　ＤmtrＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１２－Ｄmtr
［式中、Ｄｍｔｒは４，４’－ジメトキシトリチル基を示す。］
で表され、非特許文献６には、片末端トシル体とテトラエチレングリコールとの１：１の反応によって８量体の片末端Ｄｍｔｒ体が得られる際に、片末端トシル体とテトラエチレングリコールとの２：１の反応によって１２量体の両末端Ｄｍｔｒ体が生成することが記載されている。しかしながら、このように両末端にトシル基やＤｍｔｒ基を有する化合物を含む混合物を用いて両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基とを有するヘテロ型ポリエチレングリコールを合成すると、両末端にアミノ基を有する化合物又は両末端にカルボキシル基を有する化合物が不純物として生成する。そのため、かかる不純物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣの製造に用いると、薬剤が２つ結合した化合物又は抗体が２つ結合した化合物が生成し、薬剤としての有効性が低下する原因となる。
　他方、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの純度の評価方法としては、１Ｈ－ＮＭＲ測定、ＭＳ測定、ＨＰＬＣ測定等を用いた方法が挙げられる。しかしながら、上記のように公知の製造方法によってヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを製造した場合には複数の不純物が含有されるため、純度の評価は困難であるといえる。
　例えば、両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基とを有するヘテロ型ポリエチレングリコールを主成分として含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール中に、両末端にアミノ基を有する化合物と両末端にそれぞれアミノ基と水酸基とを有する化合物の２つが混在していた場合、１Ｈ－ＮＭＲ測定では水酸基のα位のプロトンがエチレングリコール鎖と重なって区別できないため、両末端にそれぞれアミノ基と水酸基とを有する化合物の含有量を測定することができず、それに伴い、両末端にアミノ基を有する化合物の含有量を特定することも困難となる。また、ＭＳ測定では、複数の不純物を同定することが可能であるが、化合物の構造によってイオン化の効率が異なるため、定量性が低いという問題がある。不純物の標準化合物を合成して検量線を作成することによって定量することも可能ではあるが、エチレングリコール鎖長の異なる化合物や、末端官能基の組み合わせが異なる化合物の全てを合成して定量することは困難である。さらに、ＨＰＬＣ測定では、全ての不純物を分離することができれば定量することも可能であるが、エチレングリコール鎖長の異なる化合物や末端官能基の組み合わせが異なる化合物が複数存在する場合には当該分離は困難である。
　このように、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの純度を評価することは困難であり、従来の評価方法では、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールについて、ＡＤＣ製造用のリンカーとして用いる際に重要となる、両末端の官能基の組み合わせが目的の化合物と異なる化合物の含有量や、エチレングリコール鎖長が目的の化合物と異なる化合物の含有量を、正確に測定することが困難であるという問題を有していた。
米国特許第５６７２６６２号明細書 日本国特表２００７－５３８１１１号公報
Ｔｏｘｉｎｓ、２０１１年、３、ｐ．８４８－８８３ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０１１年、５４、ｐ．３６０６－３６２３ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９７年、５３、ｐ．１０９３９－１０９５２ Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００９年、４８、ｐ．１２４８－１２５２ Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、２００２年、４、ｐ．２３２９－２３３２ Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．、２０１４年、５、ｐ．６９４－６９７
　本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基とを有しており、エチレングリコール鎖長が互いに同じであるヘテロ型ポリエチレングリコールを、主成分として高純度で含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体、及びヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体、並びに、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール及び前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を容易に得ることができる製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基とを有するヘテロ型ポリエチレングリコールの合成において、合成工程を特定の順序で組み合わせることにより、カラムクロマトグラフィー等の精製方法を用いなくとも、簡便な分液抽出のみで、両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基とを有し、かつ、エチレングリコール鎖長が互いに同じである１種のヘテロ型ポリエチレングリコールを主成分として特に高純度で含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールが得られることを見い出した。さらに、前記ヘテロ型ポリエチレングリコールを製造するための中間体を、合成工程を特定の順序で組み合わせて合成することにより、カラムクロマトグラフィー等の精製方法を用いなくとも、簡便な分液抽出のみで、前記中間体を高純度で得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、下記の［１］～［９］を提供する。
　［１］　下記式（１）：
　　ＮＨ２－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ　　・・・（１）
［式（１）中、ａは６～４０の整数を示す。］
で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールにおいて、
　（Ａ）逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ１とし、ｂａｓｅＬ１から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ１とし、屈折率差最大ピークＰ１の頂点Ｐ１ｔｏｐのｂａｓｅＬ１からの高さをＰ１ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ１ｔｏｐに向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ１Ｌａとし、Ｐ１ＬａとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ａとし、Ｐ１ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ１Ｌｂとし、Ｐ１ＬｂとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ｂとし、ｂａｓｅＬ１から上のＴ１ａからＴ１ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ１としたとき、ａｒｅａＡ１とａｒｅａＰ１とが、下記式（Ｆ１）：
　　　　ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１≧０．９０　　・・・（Ｆ１）
で表される条件を満たし、
　（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ２とし、ｂａｓｅＬ２から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ２とし、屈折率差最大ピークＰ２の頂点Ｐ２ｔｏｐのｂａｓｅＬ２からの高さをＰ２ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ２ｔｏｐに向かうＰ２上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ２からの高さがＰ２ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ２Ｌとし、Ｐ２ＬとｂａｓｅＬ２とが交わる溶出時間をＴ２とし、ｂａｓｅＬ２から上の溶出開始点からＴ２の間のピーク面積をａｒｅａＢ２としたとき、ａｒｅａＢ２とａｒｅａＡ２とが、下記式（Ｆ２）：
　ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２≦０．０２　　・・・（Ｆ２）
で表される条件を満たし、かつ、
　（Ｃ）前記式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを誘導体化し、下記式（２）：
　ｔＢｏｃ－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ
　　・・・（２）
［式（２）中、ｔＢｏｃはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
で表される化合物を含有する混合物を陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ３とし、ｂａｓｅＬ３から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ３とし、屈折率差最大ピークＰ３の頂点Ｐ３ｔｏｐのｂａｓｅＬ３からの高さをＰ３ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ３ｔｏｐに向かうＰ３上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ３からの高さがＰ３ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ３Ｌとし、Ｐ３ＬとｂａｓｅＬ３とが交わる溶出時間をＴ３とし、ｂａｓｅＬ３から上の溶出開始点からＴ３の間のピーク面積をａｒｅａＢ３としたとき、ａｒｅａＢ３とａｒｅａＡ３とが、下記式（Ｆ３）：
　ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３≦０．０２　　・・・（Ｆ３）
で表される条件を満たす、
ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール。
　［２］　［１］に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法であり、
　下記式（３）で表される化合物に下記式（４）で表される化合物を５℃以下の温度条件でマイケル付加反応させ、下記式（５）で表される化合物を得る工程Ａと、
　ＴｓＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－Ｈ　　・・・（３）
［式（３）中、Ｔｓはトシル基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
［式（４）中、Ｒ１は炭素数１～６の炭化水素基を示す。］
　ＴｓＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯＲ１　　・・・（５）
［式（５）中、Ｔｓはトシル基を示し、Ｒ１は炭素数１～６の炭化水素基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
　前記式（５）で表される化合物をフタルイミドカリウムと反応させ、下記式（６）で表される化合物を得る工程Ｂと、
　ＰＩ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯＲ１　　・・・（６）
［式（６）中、ＰＩはフタルイミド基を示し、Ｒ１は炭素数１～６の炭化水素基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
　前記式（６）で表される化合物を脱フタルイミド化し、下記式（７）で表される化合物を得る工程Ｃと、
　Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯＲ１　　・・・（７）
［式（７）中、Ｒ１は炭素数１～６の炭化水素基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
　前記工程Ｃで得られた前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物に分液抽出処理及び酸加水分解処理を施して前記式（１）で表される化合物を含有する前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得る工程Ｄと、
を含むヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
　［３］　前記式（３）及び（５）～（７）中のａが、それぞれ６～１０の整数であり、
　前記工程Ｄが、前記分液抽出処理の後に前記酸加水分解処理を施す工程であり、
　前記分液抽出処理が、前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物に、酸性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する酸洗浄処理を施す洗浄工程（ｗ１）と、前記洗浄工程（ｗ１）の後に前記式（７）で表される化合物を分液抽出する抽出工程（ｅ１）と、を含む処理であり、かつ、
　前記酸加水分解処理が、前記式（７）で表される化合物を酸加水分解して前記式（１）で表される化合物を含有する前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得る処理である、
［２］に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
　［４］　前記式（３）及び（５）～（７）中のａが、それぞれ１１～４０の整数であり、
　前記工程Ｄが、前記酸加水分解処理の後に前記分液抽出処理を施す工程であり、
　前記酸加水分解処理が、前記反応生成物中の式（７）で表される化合物を酸加水分解して前記式（１）で表される化合物を含有する反応生成物を得る処理であり、かつ、
　前記分液抽出処理が、前記式（１）で表される化合物を含有する反応生成物に、酸性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する酸洗浄処理、及び、塩基性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する塩基洗浄処理を施す洗浄工程（ｗ２）と、前記洗浄工程（ｗ２）の後に前記式（１）で表される化合物を含有する前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを分液抽出する抽出工程（ｅ２）と、を含む処理である、
［２］に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
　［５］　下記式（３）：
　　　　ＴｓＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－Ｈ　　・・・（３）
［式（３）中、Ｔｓはトシル基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体において、
　（Ｄ）逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ４とし、ｂａｓｅＬ４から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ４とし、屈折率差最大ピークＰ４の頂点Ｐ４ｔｏｐのｂａｓｅＬ４からの高さをＰ４ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ４ｔｏｐに向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ４Ｌａとし、Ｐ４ＬａとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ａとし、Ｐ４ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ４Ｌｂとし、Ｐ４ＬｂとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ｂとし、ｂａｓｅＬ４から上のＴ４ａからＴ４ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ４としたとき、ａｒｅａＡ４とａｒｅａＰ４とが、下記式（Ｆ４）：
　　　　ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４≧０．９２　　・・・（Ｆ４）
で表される条件を満たす、
ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体。
　［６］　［５］に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法であり、
　下記式（８）で表される化合物と下記式（９）で表される化合物とを下記式（Ｆ５）で表される条件を満たすように求核置換反応させ、下記式（１０）で表される化合物を得る工程ａと、
　　　　ＨＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｂ－Ｈ　　・・・（８）
［式（８）中、ｂは３～３７の整数を示す。］
　　　　ＬＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｃ－Ｒ２　　・・・（９）
［式（９）中、Ｌはトシル基又はメシル基を示し、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ｃは３～３７の整数を示す。］
　　　　６≦ｂ＋ｃ≦４０　　・・・（Ｆ５）
［式（Ｆ５）中、ｂは式（８）中のｂを示し、ｃは式（９）中のｃを示す。］
　　　　ＨＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－Ｒ２　　・・・（１０）
［式（１０）中、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
　前記式（１０）で表される化合物をトシル化し、下記式（１１）で表される化合物を得る工程ｂと、
　　　　ＴｓＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－Ｒ２　　・・・（１１）
［式（１１）中、Ｔｓはトシル基を示し、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
　前記式（１１）で表される化合物を脱トリチル化又は脱ベンジル化し、前記式（３）で表される化合物を得る工程ｃと、
　前記工程ｃで得られた前記式（３）で表される化合物を含有する反応生成物を精製して前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得る工程ｄと、
を含むヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法。
　［７］　［１］に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを用いて得られ、かつ、下記式（１２）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール。
　　　　Ｘ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｙ　　・・・（１２）
［式（１２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ、生体機能性分子に存在する官能基と共有結合を形成し得る官能基を含む原子団を示し、原子団Ｘに含まれる官能基と原子団Ｙに含まれる官能基とは互いに異なり、ａは６～４０の整数を示す。］
　［８］　前記式（１２）中の原子団Ｘに含まれる官能基がマレイミド基、アジド基、アルキニル基及びヨードアセトアミド基からなる群から選択される１種の官能基であり、かつ、前記式（１２）中の原子団Ｙに含まれる官能基がカルボキシル基又は活性エステル基からなる群から選択される１種の官能基である［７］に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール。
　［９］　［１］に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、又は、［７］～［８］のいずれか一項に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを用いて得られ、前記式（１）で表される化合物又は前記式（１２）で表される化合物に、生体機能性分子が結合されてなるヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体。
　本発明によれば、両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基とを有しており、エチレングリコール鎖長が互いに同じであるヘテロ型ポリエチレングリコールを、主成分として高純度で含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体及びヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体、並びに、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール及び前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を容易に得ることができる製造方法を提供することが可能となる。
本発明に係る（Ａ）逆相クロマトグラフィーを用いて得られるクロマトグラムの模式図である。 本発明に係る（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて得られるクロマトグラムの模式図である。 本発明に係る（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて得られるクロマトグラムの模式図である。 本発明に係る（Ｄ）逆相クロマトグラフィーを用いて得られるクロマトグラムの模式図である。 実施例１－２で化合物１３を含有する精製物について（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 実施例１－２で展開溶媒について逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 実施例１－２で化合物１３を含有する精製物について（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 実施例１－２で化合物１３を含有する精製物について検出器に質量分析計を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 実施例１－２で化合物１３を含有する精製物を誘導体化し、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 実施例１－２で化合物１３を含有する精製物を誘導体化し、検出器に質量分析計を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 実施例２－２で化合物２３を含有する精製物について（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 実施例２－２で化合物２３を含有する精製物について（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 実施例２－２で化合物２３を含有する精製物について検出器に質量分析計を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 実施例２－２で化合物２３を含有する精製物を誘導体化し、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 実施例２－２で化合物２３を含有する精製物を誘導体化し、検出器に質量分析計を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例２－２で比較精製物２について（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例２－２で比較精製物２について（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例２－２で比較精製物２について検出器に質量分析計を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例２－２で比較精製物２を誘導体化し、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例４－２で比較精製物４について（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例４－２で比較精製物４について（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例４－２で比較精製物４について検出器に質量分析計を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例４－２で比較精製物４を誘導体化し、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例４－２で比較精製物４を誘導体化し、検出器に質量分析計を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例５でポリエチレングリコール１について（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例５でポリエチレングリコール１について（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例５でポリエチレングリコール１について検出器に質量分析計を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例５でポリエチレングリコール１を誘導体化し、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例５でポリエチレングリコール１を誘導体化し、検出器に質量分析計を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例６でポリエチレングリコール２について（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例６でポリエチレングリコール２について（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例６でポリエチレングリコール２について検出器に質量分析計を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例６でポリエチレングリコール２を誘導体化し、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例６でポリエチレングリコール２を誘導体化し、検出器に質量分析計を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 実施例１－３で化合物８を含有する精製物について（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 実施例１－３で展開溶媒について逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 実施例２－３で化合物１８を含有する精製物について（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。 比較例１－３で比較精製物１－１について（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
　以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、（Ａ）逆相クロマトグラフィー、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー、及び（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときのクロマトグラムにおいて、特定の条件を満たすことを特徴とするものである。
　＜ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール＞
　本発明において、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールとは、両末端に互いに異なる官能基を有するヘテロ型ポリエチレングリコールを主成分として含有し、かつ、分子量が一定である単分散ポリエチレングリコールを指す。本発明においては、前記主成分として、下記式（１）：
　　　　ＮＨ２－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ　　・・・（１）
で表される化合物（ヘテロ型ポリエチレングリコール）を含有する。
　前記式（１）において、ａは６～４０の整数を表し、ＡＤＣ用のリンカーとして使用する観点からは、ａとしては６～２４の整数であることが好ましい。本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、前記式（１）で表され、エチレングリコール鎖長（すなわちａの値）が互いに同じである化合物（ヘテロ型ポリエチレングリコール）を高純度で含有しており、具体的には、（Ａ）逆相クロマトグラフィー、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー、及び（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの示差屈折率計で検出されるクロマトグラムにおいて、下記の特定の条件を満たす。
　なお、以下、本発明において、「示差屈折率計で検出されるクロマトグラム」とは、縦軸（ｙ軸）が検出器である示差屈折率計から得られた信号強度を、横軸（ｘ軸）が溶出時間（カラム保持時間）を、それぞれ示すクロマトグラムである。また、「溶出開始点」とは、クロマトグラフィーのカラムを通過した試料が検出器によって最初に検出される溶出時間を示し、「溶出終了点」とは、カラムを通過した試料が検出器によって最後に検出される溶出時間を示す。
　さらに、前記クロマトグラムにおいて、「ポリエチレングリコール由来のピーク」とは、展開溶媒等の試料以外の成分に起因するピーク、並びに、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークを除いたピークのことを示す。このような展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークは、試料を含まない展開溶媒のみをカラムにインジェクションして測定することにより特定することができる。
　なお、本発明において、前記「ポリエチレングリコール」とは、次式：－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－［ｎは正の整数を示す］で表されるエチレングリコール鎖を有する化合物のことを示し、例えば、前記式（１）で表される化合物の他、前記式（１）中のアミノ基（ＮＨ２）に代えてカルボキシル基（ＣＯＯＨ）、水素原子、ハロゲン原子又は他の官能基を有する化合物；前記式（１）中のカルボキシル基に代えてアミノ基、水素原子、ハロゲン原子又は他の官能基を有する化合物；前記式（１）中のａが６～４０以外の整数である化合物等の、後述する中間体や不純物等が挙げられる。なお、前記他の官能基としては、特に制限されないが、水酸基、トシル基（Ｔｓ）、メシル基（Ｍｓ）、フタルイミド基、トリチル基（Ｔｒｔ）、ベンジル基（Ｂｎ）、ＴｓＯで表される基、ＭｓＯで表される基、ＴｒｔＯで表される基、ＢｎＯで表される基、ＣＯＯＲで表される基［Ｒは炭化水素基を示す。］、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（ｔＢｏｃ）が挙げられ、前記ハロゲン原子としては、塩素原子が挙げられる。
　＜（Ａ）逆相クロマトグラフィー＞
　本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ１とし、ｂａｓｅＬ１から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ１とし、屈折率差最大ピークＰ１の頂点Ｐ１ｔｏｐのｂａｓｅＬ１からの高さをＰ１ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ１ｔｏｐに向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ１Ｌａとし、Ｐ１ＬａとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ａとし、Ｐ１ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ１Ｌｂとし、Ｐ１ＬｂとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ｂとし、ｂａｓｅＬ１から上のＴ１ａからＴ１ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ１としたとき、ａｒｅａＡ１とａｒｅａＰ１とが、下記式（Ｆ１）：
　　　　ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１≧０．９０　　・・・（Ｆ１）
で表される条件を満たす。
　前記クロマトグラムにおいて、「屈折率差最大ピークＰ１」は、前記式（１）で表される化合物（ヘテロ型ポリエチレングリコール）に由来するピークを含むピークである。前記式（１）で表される化合物に由来するピークを含むピークであることは、検出器として前記示差屈折率計に代えて質量分析計を用いること以外は同一条件で測定することで確認することができる。
　図１に、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの模式図を示す。逆相カラムに試料溶液を注入して展開すると、試料溶液中に含まれる化合物が親水性の高い化合物から順に溶出される。このときの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ１とし、ｂａｓｅＬ１から上の全ピーク面積をａｒｅａＡ１とする。次に、屈折率差最大ピークＰ１の頂点をＰ１ｔｏｐとし、そのｂａｓｅＬ１からの高さをＰ１ｔｏｐＨとする。溶出開始点からＰ１ｔｏｐに向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点を結んだ直線をＰ１Ｌａとし、Ｐ１ＬａとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ａとする。さらに、Ｐ１ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点を結んだ直線をＰ１Ｌｂとし、Ｐ１ＬｂとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ｂとする。ｂａｓｅＬ１から上のＴ１ａからＴ１ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ１とする。
　本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールにおいては、このように求められるａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１が、０．９０以上である。ａｒｅａＡ１の値はポリエチレングリコール由来の全ピーク面積を、ａｒｅａＰ１の値は屈折率差最大ピークＰ１のピーク面積を示すことから、屈折率差最大ピークＰ１が、前記式（１）で表される化合物のみに由来するピークである場合、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は、前記式（１）で表される化合物の含有量に相当する。なお、目的とする前記式（１）で表される化合物とエチレングリコール鎖長が１つ異なる化合物や、末端の官能基が一部異なる化合物等、逆相クロマトグラフィーで分離できない不純物が前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール中に含有されている場合には、これらの化合物の含有量もａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値内に含まれる場合がある。
　ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値としては、ａが６～２４であるときは０．９４以上が好ましく、ａが２５～４０であるときは０．９０以上が好ましい。なお、本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールにおいては、前記式（１）中、ａの値が増加するに伴って製造工程数が増加するため、目的とする前記式（１）で表される化合物とエチレングリコール鎖長の異なる化合物の含有量が増加する傾向にある。ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値が前記下限未満である場合には、前記式（１）で表される化合物とエチレングリコール鎖長が異なる化合物や末端に前記式（１）の組み合わせと異なる官能基を有する化合物等の不純物の含有量が多くなることから、かかるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣのリンカー材料として用いると、薬剤の結合個数の確認が困難になる、薬剤添加量が不明確になる、医薬品申請の際に余分な評価が必要になるといった問題が生じたり、抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成し、薬剤としての有効性が低下する原因となる。
　本発明において、前記逆相クロマトグラフィーの測定条件は、下記の条件：
　機器：東ソー（株）社製　ビルドＧＰＣシステム　ＨＬＣ－８２２０
　検出器：東ソー（株）社製　ＲＩ－８０２０
　カラム：東ソー（株）社製　ＴＳＫｇｅｌ　ＯＤＳ－８０Ｔｓ　（粒子径　５μｍ、カラムサイズ　４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
　流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
　サンプル量：０．２ｍｇ／ｇ、４０μＬ
であり、さらに、前記式（１）で表される化合物のａが６～１０の場合は、
　展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝２５／７５
　カラム温度：４０℃
であり、前記式（１）で表される化合物のａが１１～２０の場合は、
展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝３０／７０
カラム温度：４０℃
であり、前記式（１）で表される化合物のａが２１～４０の場合は、
　展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝５０／５０
　カラム温度：４５℃
で測定する。
　＜（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー＞
　本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ２とし、ｂａｓｅＬ２から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ２とし、屈折率差最大ピークＰ２の頂点Ｐ２ｔｏｐのｂａｓｅＬ２からの高さをＰ２ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ２ｔｏｐに向かうＰ２上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ２からの高さがＰ２ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ２Ｌとし、Ｐ２ＬとｂａｓｅＬ２とが交わる溶出時間をＴ２とし、ｂａｓｅＬ２から上の溶出開始点からＴ２の間のピーク面積をａｒｅａＢ２としたとき、ａｒｅａＢ２とａｒｅａＡ２とが、下記式（Ｆ２）：
　　　　ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２≦０．０２　　・・・（Ｆ２）
で表される条件を満たす。
　前記クロマトグラムにおいて、「屈折率差最大ピークＰ２」は、前記式（１）で表される化合物（ヘテロ型ポリエチレングリコール）に由来するピークを含むピークである。前記式（１）で表される化合物に由来するピークを含むピークであることは、検出器として前記示差屈折率計に代えて質量分析計を用いること以外は同一条件で測定することで確認することができる。
　図２に、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの模式図を示す。陽イオン交換カラムに試料溶液を注入して展開すると、試料溶液中に含まれる化合物のうち、アミノ基を有さない化合物が先に溶出され、次にアミノ基を有する化合物が溶出される。このときの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ２とし、ｂａｓｅＬ２から上の全ピーク面積をａｒｅａＡ２とする。次に、屈折率差最大ピークＰ２の頂点をＰ２ｔｏｐとし、ｂａｓｅＬ２からの高さをＰ２ｔｏｐＨとする。溶出開始点からＰ２ｔｏｐに向かうＰ２上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ２からの高さがＰ２ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ２Ｌとし、Ｐ２ＬとｂａｓｅＬ２とが交わる溶出時間をＴ２とする。ｂａｓｅＬ２から上の溶出開始点からＴ２の間のピーク面積をａｒｅａＢ２とする。
　本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールにおいては、このように求められるａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２が、０．０２以下であり、好ましくは０．０１以下である。ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は、前記式（１）で表される化合物に由来するピークを含む屈折率差最大ピークＰ２よりも前に溶出されるピークの割合であることから、本発明では、主に末端官能基としてアミノ基を有さない不純物の含有量に相当する。前記アミノ基を有さない不純物としては、例えば、前記式（１）中のアミノ基に代えてカルボキシル基を有するポリエチレングリコールや、同アミノ基に代えて水酸基を有するポリエチレングリコールが挙げられる。ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値が前記上限を超える場合には、アミノ基を有さない不純物の含有量が多くなることから、かかるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣのリンカー材料として用いると、抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成し、薬剤としての有効性が低下する原因となる。
　本発明において、前記陽イオン交換クロマトグラフィーの測定条件としては、下記の条件：
　機器：東ソー（株）社製　ビルドＧＰＣシステム　ＨＬＣ－８２２０
　検出器：東ソー（株）社製　ＲＩ－８０２０
　カラム：東ソー（株）社製　ＴＳＫｇｅｌ　ＳＰ－２ＳＷ　（粒子径　５μｍ、カラムサイズ　４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
　展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝１０／９０
　流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
　カラム温度：３０℃
　サンプル量：０．２ｍｇ／ｇ、２０μＬ
が挙げられる。
　＜（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー＞
　本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、前記式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを誘導体化し、下記式（２）：
　ｔＢｏｃ－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ
　　　・・・（２）
［式（２）中、ｔＢｏｃはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
で表される化合物を含有する混合物とし、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ３とし、ｂａｓｅＬ３から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ３とし、屈折率差最大ピークＰ３の頂点Ｐ３ｔｏｐのｂａｓｅＬ３からの高さをＰ３ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ３ｔｏｐに向かうＰ３上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ３からの高さがＰ３ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ３Ｌとし、Ｐ３ＬとｂａｓｅＬ３とが交わる溶出時間をＴ３とし、ｂａｓｅＬ３から上の溶出開始点からＴ３の間のピーク面積をａｒｅａＢ３としたとき、ａｒｅａＢ３とａｒｅａＡ３とが、下記式（Ｆ３）：
　ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３≦０．０２　　・・・（Ｆ３）
で表される条件を満たす。
　前記式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを、前記式（２）で表される化合物を含有する混合物に誘導体化する方法としては、公知の方法を使用可能であるが、例えば、前記式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを水に溶解させ、塩基として水酸化ナトリウムを加え、次いで、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチルを加えて反応させることで、前記式（１）で表される化合物から前記式（２）で表される化合物を得ることができる。前記式（２）で表される化合物を含有する混合物は、反応後、例えば、塩酸等によってｐＨを４以下に調整後、塩化ナトリウムを飽和するまで加え、クロロホルム又はジクロロメタンを用いて分液抽出することにより得ることができる。なお、本発明において、前記誘導体化は前記式（１）で表される化合物が消失するまで十分に行うことが必要である。前記式（１）で表される化合物の消失は、質量分析計を用いた測定により確認することができる。
　前記クロマトグラムにおいて、「屈折率差最大ピークＰ３」は、前記式（２）で表される化合物に由来するピークを含むピークである。前記式（２）で表される化合物に由来するピークを含むピークであることは、検出器として前記示差屈折率計に代えて質量分析計を用いること以外は同一条件で測定することで確認することができる。
　図３に、前記式（２）で表される化合物を含有する混合物を陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの模式図を示す。陰イオン交換カラムに試料溶液を注入して展開すると、試料溶液中に含まれる化合物のうち、カルボキシル基を有さない化合物が先に溶出され、次にカルボキシル基を有する化合物が溶出される。このときの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ３とし、ｂａｓｅＬ３から上の全ピーク面積をａｒｅａＡ３とする。次に、屈折率差最大ピークＰ３の頂点をＰ３ｔｏｐとし、ｂａｓｅＬ３からの高さをＰ３ｔｏｐＨとする。溶出開始点からＰ３ｔｏｐに向かうＰ３上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ３からの高さがＰ３ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ３Ｌとし、Ｐ３ＬとｂａｓｅＬ３とが交わる溶出時間をＴ３とする。ｂａｓｅＬ３から上の溶出開始点からＴ３の間のピーク面積をａｒｅａＢ３とする。
　本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、このように求められるａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３が０．０２以下であり、好ましくは０．０１以下である。ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は、前記式（２）で表される化合物に由来するピークを含む屈折率差最大ピークＰ３よりも前に溶出されるピークの割合であることから、本発明では、主に末端官能基としてカルボキシル基を有さない不純物の含有量に相当する。前記カルボキシル基を有さない不純物としては、例えば、前記式（２）中のカルボキシル基に代えてｔ－Ｂｏｃ－ＮＨで表される基を有するポリエチレングリコールや、同カルボキシル基に代えて水酸基を有するポリエチレングリコールが挙げられる。ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値が前記上限を超える場合には、カルボキシル基を有さない不純物の含有量が高くなることから、かかるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣのリンカー材料として用いると、抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成し、薬剤としての有効性が低下する原因となる。
　本発明において、前記陰イオン交換クロマトグラフィーの測定条件としては、下記の条件：
　機器：東ソー（株）社製　ビルドＧＰＣシステム　ＨＬＣ－８２２０
　検出器：東ソー（株）社製　ＲＩ－８０２０
　カラム：東ソー（株）社製　ＴＳＫｇｅｌ　ＤＥＡＥ－２ＳＷ　（粒子径　５μｍ、カラムサイズ　４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
　展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝１０／９０
　流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
　カラム温度：３０℃
　サンプル量：０．２ｍｇ／ｇ、３０μＬ
が挙げられる。
　＜ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法＞
　前記特定の条件を満たす本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法により得ることができる。本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法は、下記の工程Ａ、工程Ｂ、工程Ｃ及び工程Ｄを含むことを特徴とするものである。
　〔工程Ａ〕
　本発明に係る工程Ａは、下記式（３）：
　ＴｓＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－Ｈ　　・・・（３）
で表される化合物に、下記式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
で表される化合物を５℃以下の温度条件でマイケル付加反応させ、下記式（５）：
　ＴｓＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯＲ１　　・・・（５）
で表される化合物を得る工程である。
　前記式（３）中、Ｔｓはトシル基を表し、ａは６～４０の整数を示す。また、前記式（４）中、Ｒ１は炭素数１～６の炭化水素基を示す。前記炭素数１～６の炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基が挙げられる。塩基性条件下での安定性から、Ｒ１としては、イソプロピル基又はｔｅｒｔ－ブチル基であることが好ましい。また、前記式（５）中、Ｔｓはトシル基を示し、Ｒ１は炭素数１～６の炭化水素基を示し、ａは６～４０の整数を示す。前記式（５）中のＴｓは前記式（３）中のＴｓに由来するものであり、前記式（５）中のＲ１は前記式（４）中のＲ１に由来するものである。
　また、前記式（３）で表される化合物としては、適宜公知の合成方法で得られたものを用いることができるが、前記特定の条件を満たす本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを特に容易に得られるという観点から、後述するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を前記式（３）で表される化合物を含有する材料として用いることが好ましい。
　前記マイケル付加反応は、溶媒中で反応を行うことができる。前記溶媒としては、前記式（３）で表される化合物及び前記式（４）で表される化合物と反応しない溶媒であれば特に限定されず、例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、クロロホルム、ジクロロメタン、トルエン等の有機溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。前記溶媒の使用量としては、前記式（３）で表される化合物に対して、通常、質量比で１～１００倍、好ましくは３～５０倍、最も好ましくは５～３０倍量である。前記溶媒の使用量が前記下限未満である場合には、前記式（３）で表される化合物同士が反応する恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、マイケル付加反応の進行が遅くなる傾向にある。
　前記マイケル付加反応において、前記式（４）で表される化合物の使用量としては、前記式（３）で表される化合物に対して、通常、モル比で２～５０倍、好ましくは５～２５倍である。前記式（４）で表される化合物の使用量が前記下限未満である場合には、マイケル付加反応が完結しない可能性があり、他方、前記上限を超える場合には、前記式（４）で表される化合物の重合体が生成するといった副反応が生じる恐れがある。
　前記マイケル付加反応においては、塩基触媒を用いる。前記塩基触媒としては、反応が進行すれば問題ないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の無機触媒が挙げられ、これらの中でも、水酸化カリウムが好ましく、反応性の観点からは、パウダー状の水酸化カリウムがより好ましい。前記塩基触媒の使用量としては、前記式（３）で表される化合物に対して、通常、モル比で０．１～１０倍、好ましくは０．５～５倍量である。
　前記マイケル付加反応の反応温度としては、通常１０℃以下であり、好ましくは５℃以下、最も好ましくは０℃以下である。前記反応温度が前記上限を超える場合には、前記式（３）で表される化合物同士が反応する恐れがある。また、前記マイケル付加反応の反応時間としては、前記反応温度、前記塩基触媒等の条件により異なるが、通常０．２～１２時間程度であることが好ましい。
　工程Ａにおいては、このようなマイケル付加反応により、前記式（５）で表される化合物を含有する反応生成物を得ることができる。前記反応生成物は、そのまま未精製で次の工程Ｂに用いてもよく、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや分液抽出処理及び吸着剤処理等によって前記式（５）で表される化合物を精製してから用いてもよいが、本発明においては、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製をしなくとも高純度の本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。
　〔工程Ｂ〕
　本発明に係る工程Ｂは、前記式（５）で表される化合物をフタルイミドカリウムと反応させ、下記式（６）：
　ＰＩ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯＲ１　　・・・（６）
で表される化合物を得る工程である。
　前記式（６）中、ＰＩはフタルイミド基を示し、Ｒ１は炭素数１～６の炭化水素基を示し、ａは６～４０の整数を示す。前記炭素数１～６の炭化水素基は、前記式（５）で表される化合物中のＲ１に由来するものであり、前記式（４）中のＲ１と同義である。
　工程Ｂにおける反応は、溶媒中で行うことができる。前記溶媒としては、前記式（５）で表される化合物及びフタルイミドカリウムと反応しない溶媒であれば特に限定されず、例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、クロロホルム、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。これらの中でも、反応速度の観点からは、テトラヒドロフラン、ＤＭＦ又はアセトニトリルが好ましい。前記溶媒の使用量としては、前記式（５）で表される化合物に対して、通常、質量比で１～１００倍、好ましくは３～５０倍、最も好ましくは５～３０倍量である。
　工程Ｂにおいて、前記フタルイミドカリウムの使用量としては、前記式（５）で表される化合物に対して、通常、モル比で１．１～１０倍、好ましくは１．５～５倍である。フタルイミドカリウムの使用量が前記下限未満である場合には反応が完結しない可能性があり、他方、前記上限を超える場合には、未反応のフタルイミドカリウムが残存するため、これを除去する必要が生じる。
　また、工程Ｂにおける反応温度としては、使用する溶媒により異なるが、通常、１０～１００℃である。さらに、工程Ｂにおける反応時間としては、前記反応温度の条件により異なるが、通常１～２４時間程度が好ましい。
　工程Ｂにおいては、このような反応により、前記式（６）で表される化合物を含有する反応生成物を得ることができる。前記反応生成物は、そのまま未精製で次の工程Ｃに用いてもよく、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや分液抽出処理及び吸着剤処理等によって前記式（６）で表される化合物を精製してから用いてもよいが、本発明においては、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製をしなくとも高純度の本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。
　〔工程Ｃ〕
　本発明に係る工程Ｃは、前記式（６）で表される化合物を脱フタルイミド化し、下記式（７）： 
　Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯＲ１　　・・・（７）
で表される化合物を得る工程である。
　前記式（７）中、Ｒ１は炭素数１～６の炭化水素基を示し、ａは６～４０の整数を示す。前記炭素数１～６の炭化水素基は、前記式（６）で表される化合物中のＲ１に由来するものであり、前記式（４）中のＲ１と同義である。
　前記脱フタルイミド化反応は、溶媒中で反応を行うことができる。前記溶媒としては、前記式（６）で表される化合物及び前記式（７）で表される化合物と反応しない溶媒であれば特に限定されず、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、クロロホルム等の溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。これらの中でも、好ましくはメタノール、エタノールである。前記溶媒の使用量としては、前記式（６）で表される化合物に対して、通常、質量比で１～１００倍、好ましくは３～５０倍、最も好ましくは５～３０倍量である。前記溶媒の使用量が前記下限未満である場合には、脱保護されたフタル酸類が析出して撹拌が困難となる恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には反応の進行が遅くなる傾向にある。
　前記脱フタルイミド化反応は塩基化合物存在下で行う。前記塩基化合物としては、反応が進行すれば問題ないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の無機塩基；ヒドラジン・１水和物やエチレンジアミン等の１級アミン類が挙げられ、これらの中でも、副反応を抑制する観点からは、塩基性の弱いヒドラジン・１水和物やエチレンジアミン等の１級アミン類が好ましい。前記塩基化合物の使用量としては、使用する塩基化合物の種類により異なるが、前記式（６）で表される化合物に対して、通常、モル比で１．０～２０倍、好ましくは２．０～１５倍量である。
　前記脱フタルイミド化反応の反応温度としては、使用する塩基化合物や溶媒により異なるが、通常１０～１００℃である。また、前記脱フタルイミド化反応の反応時間としては、前記反応温度等の条件により異なるが、通常０．５～１２時間程度が好ましい。
　工程Ｃにおいては、このような脱フタルイミド化反応により、前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物を得ることができる。前記反応生成物は、そのまま未精製で次の工程Ｄに用いてもよく、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや分液抽出処理及び吸着剤処理等によって前記式（７）で表される化合物を精製してから用いてもよいが、本発明においては、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製をしなくとも高純度の本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。
　〔工程Ｄ〕
　本発明に係る工程Ｄは、前記工程Ｃで得られた前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物に分液抽出処理及び酸加水分解処理を施して前記式（１）で表される化合物を含有する前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得る工程である。
　前記分液抽出処理及び前記酸加水分解処理としてはいずれが先であってもよいが、前記式（１）で表される化合物として、エチレングリコール鎖の短い化合物を製造する場合、具体的には、前記式（３）及び（５）～（７）中のａがそれぞれ６～１０の整数である場合（以下、場合により「製造Ｉ」という。）には、前記分液抽出処理の後に前記酸加水分解処理を施すことが好ましい。他方、前記式（１）で表される化合物として、エチレングリコール鎖の長い化合物を製造する場合、具体的には、前記式（３）及び（５）～（７）中のａがそれぞれ１１～４０の整数である場合（以下、場合により「製造ＩＩ」という。）には、前記酸加水分解処理の後に前記分液抽出処理を施すことが好ましい。
　・酸加水分解処理
　本発明に係る酸加水分解処理は、前記式（７）で表される化合物を酸加水分解して前記式（１）で表される化合物を得る処理である。前記酸加水分解は、溶媒中で反応を行うことができる。前記溶媒としては、例えば、水、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、クロロホルム、ジクロロメタン等の溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。これらの中でも、水又はジクロロメタンが好ましい。前記溶媒の使用量としては、前記式（７）で表される化合物に対して、通常、質量比で０．５～５０倍、好ましくは０．８～４０倍、最も好ましくは１～３０倍量である。前記溶媒の使用量が前記下限未満である場合には粘度が高くなって撹拌効率が低下する恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には反応の進行が遅くなる傾向にある。
　前記酸加水分解においては、酸触媒を用いる。前記酸触媒としては、反応が進行すれば問題ないが、例えば、塩酸、リン酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられ、これらの中でも、副反応を抑制する観点からは、塩酸が好ましい。前記酸触媒の使用量としては、使用する酸触媒の種類により異なるが、例えば、１Ｍ塩酸を使用する場合、前記式（７）で表される化合物に対して、通常、重量比で０．５～１０倍である。
　前記酸加水分解の反応温度としては、使用する酸触媒により異なるが、通常１０～１００℃である。また、前記酸加水分解の反応時間としては、反応温度等の条件により異なるが、通常０．５～１２時間程度であることが好ましい。
　・分液抽出処理
　前記分液抽出処理は、有機溶媒で分液洗浄する洗浄工程（ｗ）と、前記洗浄工程（ｗ）の後に目的の化合物を分液抽出する抽出工程（ｅ）と、を含む処理である。
　（洗浄工程）
　前記洗浄工程（ｗ）としては、目的の化合物を酸性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する酸洗浄処理、及び、目的の化合物を塩基性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する塩基洗浄処理が挙げられる。前記洗浄工程（ｗ）としては、前記製造Ｉの場合、前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物を酸性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する酸洗浄処理を施す洗浄工程（ｗ１）であることが好ましい。他方、前記製造ＩＩの場合、前記酸加水分解処理で得られた前記式（１）で表される化合物を含有する反応生成物に、酸性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する酸洗浄処理、及び、塩基性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する塩基洗浄処理を施す洗浄工程（ｗ２）であることが好ましい。また、洗浄工程（ｗ２）において、前記酸洗浄処理及び前記塩基洗浄処理としてはいずれの処理が先であってもよいが、前記酸加水分解処理の後の溶媒をそのまま前記酸性水溶液として用いることができるという観点から、前記酸洗浄処理の後に前記塩基洗浄処理を施すことが好ましい。
　前記洗浄工程（ｗ）に用いる有機溶媒としては、酢酸エチル、トルエン、クロロホルム、ジクロロメタン等が挙げられ、不純物の溶解性の観点からは、クロロホルム、ジクロロメタンが好ましい。前記有機溶媒の使用量としては、目的の化合物（製造Ｉの場合：前記式（７）で表される化合物、製造ＩＩの場合：前記式（１）で表される化合物）に対して、通常、質量比で２～３０倍、好ましくは３～２０倍である。前記有機溶媒の使用量が前記下限未満である場合には洗浄効率が低下する恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、洗浄効率の向上が見込まれない。
　前記酸洗浄処理に用いる酸性水溶液としては、目的の化合物（製造Ｉの場合：前記式（７）で表される化合物、製造ＩＩの場合：前記式（１）で表される化合物）を分解しない酸強度であれば問題ないが、ｐＨ　５以下の酸性水溶液であることが好ましく、例えば、ｐＨ　３に調整した塩酸水溶液や塩化アンモニウム水溶液等が挙げられる。前記酸性水溶液の使用量としては、目的の化合物（製造Ｉの場合：前記式（７）で表される化合物、製造ＩＩの場合：前記式（１）で表される化合物）に対して、通常、質量比で２～３０倍、好ましくは３～２０倍である。前記酸性水溶液の使用量が前記下限未満である場合には、前記目的の化合物が前記有機溶媒中に溶け込む恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、下記の抽出工程において抽出効率が低下する傾向にある。
　前記塩基洗浄処理に用いる塩基性水溶液としては、前記式（１）で表される化合物を分解しない塩基性であれば問題なく、ｐＨ　８以上の塩基性水溶液が好ましく、例えば、ｐＨ　９に調整した水酸化ナトリウム水溶液や水酸化カリウム水溶液等が挙げられる。前記塩基性水溶液の使用量としては、前記式（１）で表される化合物に対して、通常、質量比で２～３０倍、好ましくは３～２０倍である。前記塩基性水溶液の使用量が前記下限未満である場合には、前記式（１）で表される化合物が前記有機溶媒中に溶け込む恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、下記の抽出工程において抽出効率が低下する。
　前記洗浄工程（ｗ）においては、前記酸性水溶液又は前記塩基性水溶液に目的の化合物（製造Ｉの場合：前記式（７）で表される化合物、製造ＩＩの場合：前記式（１）で表される化合物）を含有する反応生成物を溶解させ、ここに前記有機溶媒を添加して攪拌した後に有機溶媒を除去する分液洗浄を行うことにより、前記有機溶媒中に不純物を溶解させて除去する。前記分液洗浄を行う回数としては、特に限定はなく、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）や質量分析（ＭＳ）測定等によって水溶液中に含まれる不純物を確認しながら複数回行うことが好ましい。
　前記酸洗浄処理において、前記有機溶媒と前記酸性水溶液との比率としては、通常、質量比で有機溶媒／酸性水溶液の値が、０．２～３．０であり、０．５～２．０であることが好ましい。また、前記塩基洗浄処理において、前記有機溶媒と前記塩基性水溶液との比率としては、通常、質量比で有機溶媒／塩基性水溶液の値が、０．２～３．０であり、０．５～２．０であることが好ましい。
　（抽出工程）
　前記抽出工程（ｅ）では、目的の化合物を分液抽出する。前記抽出工程（ｅ）としては、前記製造Ｉの場合、前記洗浄工程（ｗ１）の後に前記式（７）で表される化合物を分液抽出する抽出工程（ｅ１）であることが好ましく、他方、前記製造ＩＩの場合、前記洗浄工程（ｗ２）の後に前記式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを分液抽出する抽出工程（ｅ２）であることが好ましい。
　前記抽出工程（ｅ）においては、前記洗浄工程（ｗ）後の水溶液の酸強度を必要に応じ調整し、塩で飽和させる。次いで、この水溶液に有機溶媒を添加して攪拌した後水溶液を除去することにより、前記有機溶媒中に目的の化合物を得ることができる。
　前記抽出工程（ｅ）における前記水溶液の酸強度としては、目的の化合物（製造Ｉの場合：前記式（７）で表される化合物、製造ＩＩの場合：前記式（１）で表される化合物）を分解しない酸強度であれば問題ない。また、前記水溶液を塩で飽和させる際の塩濃度としては、前記目的の化合物を前記有機溶媒で抽出可能な塩濃度であれば問題ない。このような水溶液としては、例えば、ｐＨ　３に調整した塩酸水溶液に塩濃度が２３％以上となるように塩化ナトリウムや塩化カリウムを加えた水溶液が挙げられる。前記水溶液の使用量としては、目的の化合物（製造Ｉの場合：前記式（７）で表される化合物、製造ＩＩの場合：前記式（１）で表される化合物）に対して、通常、質量比で２～３０倍、好ましくは３～２０倍である。前記水溶液の使用量が前記下限未満である場合には水溶液中の不純物が有機溶媒中に抽出される恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、抽出効率が低下する傾向にある。
　前記抽出工程（ｅ）に用いる有機溶媒としては、酢酸エチル、トルエン、クロロホルム、ジクロロメタンが挙げられ、目的の化合物（製造Ｉの場合：前記式（７）で表される化合物、製造ＩＩの場合：前記式（１）で表される化合物）の溶解性の観点からは、クロロホルム、ジクロロメタンが好ましい。前記有機溶媒の使用量としては、前記目的の化合物に対して、通常、質量比で２～３０倍、好ましくは３～２０倍である。前記有機溶媒の使用量が前記下限未満である場合には抽出効率が低下し、他方、前記上限を超える場合には、抽出効率の向上が見込まれない。
　前記抽出工程（ｅ）において、前記有機溶媒と前記水溶液との比率としては、通常、質量比で有機溶媒／水溶液の値が、０．２～３．０であり、０．５～２．０であることが好ましい。また、抽出工程（ｅ）を行う回数としては、特に限定はなく、ＴＬＣやＭＳ測定等によって水溶液中に含まれる前記式（１）で表される化合物又は前記式（７）で表される化合物を確認しながら複数回行うことが好ましい。
　工程Ｄにおいては、前記工程Ｃで得られた前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物に、このような分液抽出処理及び酸加水分解処理を施すことにより、前記式（１）で表される化合物を高純度で含有する本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。なお、前記製造Ｉの場合には、前記加水分解処理の後に水を、前記製造ＩＩの場合には、前記分液抽出処理の抽出工程（ｅ２）の後に有機溶媒を、それぞれ除去することにより、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等による精製をしなくとも、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。
　＜ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体＞
　本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、前記本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造に用いられるものであり、主成分として、下記式（３）：
　　　　ＴｓＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－Ｈ　　・・・（３）
で表される化合物を含有する。
　前記式（３）において、Ｔｓはトシル基を示し、ａは６～４０の整数を示す。本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、前記式（３）で表され、エチレングリコール鎖長（すなわちａの値）が互いに同じである化合物を高純度で含有しており、具体的には、（Ｄ）逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの示差屈折率計で検出されるクロマトグラムにおいて、下記の特定の条件を満たす。
　＜（Ｄ）逆相クロマトグラフィー＞
　本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ４とし、ｂａｓｅＬ４から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ４とし、屈折率差最大ピークＰ４の頂点Ｐ４ｔｏｐのｂａｓｅＬ４からの高さをＰ４ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ４ｔｏｐに向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ４Ｌａとし、Ｐ４ＬａとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ａとし、Ｐ４ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ４Ｌｂとし、Ｐ４ＬｂとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ｂとし、ｂａｓｅＬ４から上のＴ４ａからＴ４ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ４としたとき、ａｒｅａＡ４とａｒｅａＰ４とが、下記式（Ｆ４）：
　　　　ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４≧０．９２　　・・・（Ｆ４）
で表される条件を満たす。
　前記クロマトグラムにおいて、「屈折率差最大ピークＰ４」は、前記式（３）で表される化合物に由来するピークを含むピークである。前記式（３）で表される化合物に由来するピークを含むピークであることは、検出器として前記示差屈折率計に代えて質量分析計を用いること以外は同一条件で測定することで確認することができる。
　図４に、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの模式図を示す。逆相カラムに試料溶液を注入して展開すると、試料溶液中に含まれる化合物が親水性の高い化合物から順に溶出される。このときの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ４とし、ｂａｓｅＬ４から上の全ピーク面積をａｒｅａＡ４とする。次に、屈折率差最大ピークＰ４の頂点をＰ４ｔｏｐとし、ｂａｓｅＬ４からの高さをＰ４ｔｏｐＨとする。溶出開始点からＰ４ｔｏｐに向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点を結んだ直線をＰ４Ｌａとし、Ｐ４ＬａとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ａとする。さらに、Ｐ４ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ４Ｌｂとし、Ｐ４ＬｂとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ｂとする。ｂａｓｅＬ４から上のＴ４ａからＴ４ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ４とする。
　本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体においては、このように求められるａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４が、０．９２以上である。ａｒｅａＡ４の値はポリエチレングリコール由来の全ピーク面積を、ａｒｅａＰ４の値は屈折率差最大ピークＰ４のピーク面積を示すことから、屈折率差最大ピークＰ４が、前記式（３）で表される化合物のみに由来するピークである場合、ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４の値は、前記式（３）で表される化合物の含有量に相当する。なお、目的とする前記式（３）で表される化合物とエチレングリコール鎖長が１つ異なる化合物や、末端の官能基が一部異なる化合物等、逆相クロマトグラフィーで分離できない不純物が前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体に含有されている場合には、これらの化合物の含有量もａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４の値内に含まれる可能性がある。
　ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４の値としては、ａが６～２４であるときは０．９５以上が好ましく、２５～４０であるときは０．９２以上が好ましい。なお、本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体においては、前記式（３）中、ａの値が増加するに伴って製造工程数が増加するため、目的とする前記式（３）で表される化合物とエチレングリコール鎖長の異なる化合物の含有量が増加する傾向にある。ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４の値が前記下限未満である場合には、エチレングリコール鎖長が異なる化合物や末端に前記式（３）の組み合わせと異なる官能基を有する化合物等の不純物の含有量が多くなることから、かかるヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を用いて合成したヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣのリンカー材料として用いると、薬剤の結合個数の確認が困難になる、薬剤添加量が不明確になる、医薬品申請の際に余分な評価が必要になるといった問題が生じたり、抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成し、薬剤としての有効性が低下する原因となる。
　本発明において、前記逆相クロマトグラフィーの測定条件は、下記の条件：
　機器：東ソー（株）社製　ビルドＧＰＣシステム　ＨＬＣ－８２２０
　検出器：東ソー（株）社製　ＲＩ－８０２０
　カラム：東ソー（株）社製　ＴＳＫｇｅｌ　ＯＤＳ－８０Ｔｓ　（粒子径　５μｍ、カラムサイズ　４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
　流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
　サンプル量：０．２ｍｇ／ｇ、４０μＬ
であり、さらに、前記式（３）で表される化合物のａが６～１０の場合は、
　展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝５０／５０
　カラム温度：４０℃
であり、前記式（３）で表される化合物のａが１１～２０の場合は、
　展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝６０／４０
　カラム温度：４０℃
であり、前記式（３）で表される化合物のａが２１～４０の場合は、
　展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝６５／３５
　カラム温度：４５℃
で測定する。
　＜ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法＞
　前記特定の条件を満たす本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法により得ることができる。本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法は、下記の工程ａ、工程ｂ、工程ｃ及び工程ｄを含むことを特徴とするものである。
　〔工程ａ〕
　本発明に係る工程ａは、下記式（８）：
　　　　ＨＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｂ－Ｈ　　・・・（８）
で表される化合物と下記式（９）：
　　　　ＬＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｃ－Ｒ２　　・・・（９）
で表される化合物とを下記式（Ｆ５）：
　　　　６≦ｂ＋ｃ≦４０　　・・・（Ｆ５）
で表される条件を満たすように求核置換反応させ、下記式（１０）：
　　　　ＨＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－Ｒ２　　・・・（１０）
で表される化合物を得る工程である。
　前記式（８）中、ｂは３～３７の整数を示し、前記式（９）中、Ｌはトシル基又はメシル基を示し、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ｃは３～３７の整数を示す。また、式（８）中のｂ及び式（９）中のｃは、ｂ＋ｃ＝６～４０であり、前記式（Ｆ５）で表される条件を満たす。
　前記式（８）で表される化合物及び式（９）で表される化合物は、市販品を利用できる他、公知の合成方法により得ることができる。また、前記式（９）で表される化合物としては、本工程ａにより得られる前記式（１０）で表される化合物をトシル化又はメシル化した化合物や、後述する工程ｂにより得られる式（１１）で表される化合物を利用することで、エチレングリコール鎖長の長い、すなわち前記式（１０）中のａの数が大きい化合物を合成することが可能である。
　前記式（８）で表される化合物と前記式（９）で表される化合物とを塩基存在下で求核置換反応させることにより、前記式（１０）で表される化合物を含む反応生成物を得ることができる。前記式（１０）中、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ａは６～４０の整数を示す。また、前記式（１０）中のＲ２は前記式（９）中のＲ２に由来するものである。なお、前記反応生成物中には、下記式（１３）：
　　　　Ｒ２Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｄ－Ｒ２　　・・・（１３）
で表される化合物を不純物として含有する。前記式（１３）中、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ｄは８～８０の整数を示す。また、前記式（１３）中のＲ２は前記式（９）中のＲ２に由来するものである。
　前記求核置換反応は、溶媒中で反応を行うことができる。前記溶媒としては、前記式（８）で表される化合物及び前記式（９）で表される化合物と反応しない溶媒であれば特に限定されず、例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ジクロロメタン、クロロホルム等の非プロトン性極性溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。前記溶媒の使用量としては、前記式（９）で表される化合物に対して、通常、質量比で１～１００倍、好ましくは２～５０倍、最も好ましくは３～３０倍量である。前記溶媒の使用量が前記下限未満である場合には、前記式（８）で表される化合物の両末端に前記式（９）で表される化合物が結合した、前記式（１３）で表される化合物の生成量が多くなる傾向にあり、他方、前記上限を超える場合には、求核置換反応の進行が遅くなる傾向にある。
　前記求核置換反応において、前記式（８）で表される化合物の使用量としては、前記式（９）で表される化合物に対して、通常、モル比で１．１～５０倍、好ましくは１．５～３０倍、更に好ましくは２．０～２０倍である。前記式（８）で表される化合物の使用量が前記下限未満である場合には、前記式（８）で表される化合物の両末端に前記式（９）で表される化合物が結合した、前記式（１３）で表される化合物の生成量が多くなる傾向にあり、他方、前記上限を超える場合には、求核置換反応の進行が遅くなる傾向にある。
　前記求核置換反応に用いる塩基としては、反応が進行すれば問題ないが、例えば、金属ナトリウム、水素化ナトリウム、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシドが挙げられる。前記塩基の使用量としては、前記式（９）で表される化合物に対して、通常、モル比で１．１～１０倍、好ましくは１．２～５倍量である。
　前記求核置換反応の反応温度としては、使用する溶媒等により異なるが、通常０～１００℃である。前記反応温度が前記下限未満である場合には、反応の進行が遅くなる恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、過剰な温度によって副反応が進行する恐れがある。また、前記求核置換反応の反応時間としては、前記反応温度等の条件により異なるが、通常０．２～４８時間程度が好ましい。
　工程ａにおいては、このような求核置換反応により、前記式（１０）で表される化合物及び前記式（１３）で表される化合物を含有する反応生成物を得ることができる。前記反応生成物は、そのまま未精製で次の工程ｂに用いてもよく、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや分液抽出処理及び吸着剤処理等によって前記式（１０）で表される化合物を精製してから用いてもよいが、前記式（１３）で表される化合物は、後述する工程ｂにおける反応において反応性がなく、また、後述する工程で精製が可能であるため、未精製で用いることができる。
　〔工程ｂ〕
　本発明に係る工程ｂは、前記式（１０）で表される化合物をトシル化し、下記式（１１）：
　　　　ＴｓＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－Ｒ２　　・・・（１１）
で表される化合物を得る工程である。前記式（１１）中、Ｔｓはトシル基を示し、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ａは６～４０の整数を示す。前記Ｒ２は、前記式（１０）中のＲ２に由来するものである。
　工程ｂにおいては、前記工程ａで得られた反応生成物とｐ－トルエンスルホン酸クロライドとを塩基存在下で反応させることにより、前記式（１１）で表される化合物と前記式（１３）で表される化合物とを含む反応生成物を得ることができる。
　工程ｂにおける反応は、溶媒中で反応を行うことができる。前記溶媒としては、例えば、水、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ジクロロメタン、クロロホルム、及びこれらの混合物が挙げられる。前記溶媒の使用量としては、前記式（１０）で表される化合物に対して、通常、質量比で１～１００倍、好ましくは２～５０倍、最も好ましくは３～３０倍量である。前記溶媒の使用量が前記下限未満である場合には、反応を制御することが発熱により困難になる恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、反応の進行が遅くなる傾向にある。
　工程ｂにおけるｐ－トルエンスルホン酸クロライドの使用量としては、前記式（１０）で表される化合物に対して、通常、モル比で０．８～５倍、好ましくは０．９～３倍である。ｐ－トルエンスルホン酸クロライドの使用量が前記下限未満である場合には、未反応の前記式（１０）で表される化合物が多く残存するため収率が低下し、他方、前記上限を超える場合には、未反応のｐ－トルエンスルホン酸クロライドが残存し、これを除去することが困難となる。
　前記反応に用いる塩基としては、反応が進行すれば問題ないが、例えば、トリエチルアミン、水酸化ナトリウム、ピリジンが挙げられる。前記塩基の使用量としては前記式（１０）で表される化合物に対して、通常、モル比で１．１～１０倍、好ましくは１．２～５倍量である。
　前記反応の反応温度としては、使用する溶媒等により異なるが、通常０～８０℃である。前記反応温度が前記下限未満である場合には反応の進行が遅くなる恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、生成した前記式（１１）で表される化合物が副反応を起こす恐れがある。また、前記反応の反応時間としては、反応温度等の条件により異なるが、通常０．２～４８時間程度が好ましい。
　工程ｂにおいては、このような反応により、前記式（１１）で表される化合物と前記式（１３）で表される化合物とを含む反応生成物を得ることができる。前記反応生成物は、そのまま未精製で次の工程ｃに用いてもよく、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや分液抽出処理及び吸着剤処理等によって前記式（１１）で表される化合物を精製してから用いてもよいが、本発明においては、後述する工程で精製が可能であるため、未精製で用いることができる。
　〔工程ｃ〕
　本発明に係る工程ｃは、前記式（１１）で表される化合物を脱トリチル化又は脱ベンジル化し、前記式（３）で表される化合物を得る工程である。前記工程ｂで得られた反応生成物中の式（１１）中、Ｒ２がトリチル基である場合には脱トリチル化を、Ｒ２がベンジル基である場合には脱ベンジル化をすることにより、前記式（３）で表される化合物を含む反応生成物を得ることができる。なお、前記反応生成物中には、前記式（１３）で表される化合物が脱トリチル化又は脱ベンジル化された、下記式（１４）：
　　　　ＨＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｄ－Ｈ　　・・・（１４）
で表される化合物を不純物として含有する。前記式（１４）中、ｄは８～８０の整数を示す。
　前記脱トリチル化及び脱ベンジル化の方法としては、公知の方法が利用可能であり、例えば、ＧＲＥＥＮＥ　ＷＵＴＳ著、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｓｎｔｈｅｓｉｓに記載されている方法が有効である。また、前記式（１１）及び（１３）中のＲ２がトリチル基である場合は、酸性条件下での変換反応、接触水素添加等により脱トリチル化させることが可能である。前記酸性条件下での変換反応としては、例えば、１Ｍ塩酸中、６０℃で反応を行う、又は、メタノール中、触媒量のｐ－トルエンスルホン酸・１水和物を添加することで反応を行うといった方法が挙げられる。また、前記接触水素添加による方法としては、メタノール溶媒中、水素雰囲気下、触媒量のパラジウム／炭素を加える方法が挙げられる。他方、前記式（１１）及び（１３）中のＲ２がベンジル基である場合は、接触水素添加により脱ベンジル化させることが可能であり、例えば、メタノール溶媒中、水素雰囲気下、触媒量のパラジウム／炭素を加えることで脱ベンジル化させることができる。
　工程ｃにおいては、このような脱トリチル化又は脱ベンジル化により、前記式（３）で表される化合物及び前記式（１４）で表される化合物を含有する反応生成物を得ることができる。前記反応生成物は、そのまま未精製で次の工程ｄに用いてもよく、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや分液抽出処理及び吸着剤処理等によって前記式（３）で表される化合物を精製してから用いてもよいが、本発明においては、後述する工程で精製が可能であるため、未精製で用いることができる。
　〔工程ｄ〕
　本発明に係る工程ｄは、前記工程ｃで得られた前記式（３）で表される化合物を含有する反応生成物を精製して前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得る工程である。
　前記工程ｃで不純物として生成した前記式（１４）で表される化合物は、両末端がいずれも水酸基であることから、これを含有する反応生成物は、従来のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の合成方法で得られる、両末端の少なくともいずれかに保護基が結合している化合物を含有する組成物と比較して、含まれる化合物の極性差が大きいという特性を有する。したがって、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、分液抽出処理、吸着剤処理等の精製操作によって従来よりも容易に分離除去することが可能である。特に、本発明の製造方法によれば、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製をしなくとも、簡便な分液抽出処理のみで、高純度の本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得ることができる。
　前記分液抽出処理としては、前記工程ｃで得られた反応生成物を有機溶媒に溶解させた後に、２５℃以下において水溶液で分液洗浄する洗浄工程（ｗ３）を含む方法が挙げられる。前記有機溶媒としては、トルエン、クロロホルム、ジクロロメタンが挙げられ、これらの中でも、前記式（３）で表される化合物の溶解性の観点から、クロロホルム、ジクロロメタンが好ましい。前記有機溶媒の使用量としては、前記式（３）で表される化合物と前記式（１４）で表される化合物とを含む前記反応生成物に対して、通常、質量比で２～３０倍、好ましくは３～２０倍である。前記有機溶媒の使用量が前記下限未満である場合には、前記式（３）で表される化合物が水層に溶け込む恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、前記式（１４）で表される化合物が有機層に溶け込む恐れがある。
　前記洗浄工程（ｗ３）において、前記水溶液としては、前記式（１４）で表される化合物を溶解可能であれば特に限定されず、例えば、イオン交換水、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の低塩濃度の水溶液が挙げられる。前記水溶液の使用量としては、前記式（３）で表される化合物と前記式（１４）で表される化合物とを含む反応生成物に対して、通常、質量比で２～３０倍、好ましくは３～２０倍である。前記水溶液の使用量が前記下限未満である場合には、前記式（１４）で表される化合物の洗浄効率が低下し、他方、前記上限を超える場合には、前記式（３）で表される化合物が水層に溶け込む恐れがある。
　前記洗浄工程（ｗ３）において、前記有機溶媒と前記水溶液との比率としては、通常、質量比で有機溶媒／水溶液の値が、０．２～３．０であり、０．５～２．０であることが好ましい。
　前記洗浄工程（ｗ３）の温度としては、１～２５℃であることが好ましく、５～２０℃であることが更に好ましい。前記温度が前記上限を超える場合には、前記式（１４）で表される化合物が有機層に溶解して除去することが困難になる傾向にある。また、前記分液洗浄を行う回数としては、特に限定はなく、ＴＬＣやＭＳ測定等によって有機溶媒中に含まれる前記式（１４）で表される化合物を確認しながら複数回行うことが好ましい。
　工程ｄにおいては、このような分液抽出処理により、前記式（３）で表される化合物を高純度で含有する本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を容易に得ることができる。本発明によれば、このように簡便な精製によって工程ａ～工程ｃで生成する不純物を除去することが可能であるため、各工程において、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等による精製が不要である。なお、得られた前記式（３）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、そのまま上記本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造に用いることが可能であるが、更に晶析、吸着剤処理、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等の処理により精製をして用いてもよい。
　＜ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体＞
　本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを用いることにより、下記式（１２）：
　　　　Ｘ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｙ　　・・・（１２）
で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。
　前記式（１２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ、生体機能性分子に存在する官能基と共有結合を形成し得る官能基を含む原子団を示し、原子団Ｘに含まれる官能基と原子団Ｙに含まれる官能基とは互いに異なり、ａは６～４０の整数を示す。
　前記原子団Ｘは、前記式（１２）で表されるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールのポリエチレングリコール鎖末端に位置する原子団であって、生体機能性分子に存在する官能基と共有結合を形成し得る官能基（Ｘ’）を含む。Ｘは、前記官能基（Ｘ’）のみであっても、前記官能基（Ｘ’）と前記ポリエチレングリコール鎖への結合部位（Ｗ）とからなるものであってもよく、次式：
　　　　Ｘ－　＝Ｘ’－Ｗ－
で表される。前記式中、Ｘ’は生体機能性分子に存在する官能基と共有結合を形成し得る官能基を示し、Ｗはポリエチレングリコール鎖への結合部位又は単結合を示す。
　原子団Ｙは、前記式（１２）で表されるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールのポリエチレングリコール鎖末端に位置する原子団であって、生体機能性分子に存在する官能基と共有結合を形成し得る官能基（Ｙ’）を含む。Ｙは、前記官能基（Ｙ’）のみであっても、前記官能基（Ｙ’）と前記ポリエチレングリコール鎖への結合部位（Ｗ’）とからなるものであってもよく、次式：
　　　　Ｙ－　＝Ｙ’－Ｗ’－
で表される。前記式中、Ｙ’は生体機能性分子に存在する官能基と共有結合を形成し得る官能基を示し、Ｗ’はポリエチレングリコール鎖への結合部位又は単結合を示す。
　結合部位Ｗ及びＷ’としては、それぞれ独立に、ポリエチレングリコール鎖との結合を担うリンカーであり、共有結合によって構成される部位であれば特に制限は無いが、好ましくは、エステル結合、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、カーボネート結合、２級アミノ基を含んだ二価の炭化水素基、単結合、及び、二価の炭化水素基が挙げられる。前記炭化水素基としては、炭素数が１２以下であることが好ましく、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、ブチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基等が挙げられる。
　官能基Ｘ’及びＹ’は、互いに異なる官能基であり、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールによる修飾の対象となる生体機能性分子（タンパク薬剤、ポリペプチド、酵素、抗体、抗体医薬、遺伝子、オリゴ核酸等を含む核酸化合物、核酸医薬、抗がん剤、低分子薬物等のその他薬剤）に存在する官能基と反応して共有結合を形成し得る官能基であれば特に制限されない。中でも、Ｘ’及びＹ’としては、それぞれ独立に、タンパク質に代表される天然の生体機能性分子に存在する基（アミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基等）や前記生体機能性高分子に人工的に導入可能な基（マレイミド基、ケトン基、アジド基、アルキニル基等）に温和な条件で、かつ、高い反応効率で反応可能な官能基であることが好ましく、より具体的には、アセタール基、アルデヒド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、ヨードアセトアミド基、活性エステル基、活性カーボネート基、カルボキシル基、アミノ基、アミノオキシ基、チオール基、アリル基、ビニル基、アルキニル基、アジド基が好ましい。さらに、反応効率等を考慮すると、Ｘ’及びＹ’としては、アセタール基、アルデヒド基、マレイミド基、活性エステル基、活性カーボネート基、カルボキシル基、アミノ基、アミノオキシ基、アルキニル基、アジド基からなる群から選択される１種の官能基であることが好ましい。
　また、Ｘ’及びＹ’としては、それぞれ独立に、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がアミノ基である場合には、アセタール基、アルデヒド基、活性エステル基、活性カーボネート基、カルボキシル基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がチオール基である場合には、マレイミド基、ビニルスルホン基、ヨードアセトアミド基、アリル基、ビニル基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がアルデヒド基、ケトン基である場合には、アミノ基、アミノオキシ基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がカルボキシル基である場合には、アミノ基、アミノオキシ基、チオール基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がマレイミド基である場合には、チオール基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がアジド基である場合にはアルキニル基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がアルキニル基である場合にはアジド基であることが好ましい。
　原子団Ｘ中のＸ’と原子団Ｙ中のＹ’との好ましい組み合わせとしては、Ｘ’がマレイミド基、アジド基、アルキニル基及びヨードアセトアミド基からなる群から選択される１つの官能基であり、Ｙ’がカルボキシル基又は活性エステル基からなる群から選択される１つの官能基であることが好ましい。
　本発明におけるマレイミド基とは、結合部位（Ｗ、Ｗ’）も含めて次式（１５）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
で表される基であり、チオール基等の求核性基と反応する基である。前記式（１５）中、Ｒ３としては、水素原子又はメチル基が好ましく、水素原子がより好ましい。本発明における原子団Ｘ中のＸ’がマレイミド基である場合、或いは、原子団Ｙ中のＹ’がマレイミド基である場合の原子団Ｘ及び原子団Ｙとしては、例えば、次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
で表される原子団が挙げられる。前記式中、ｅは２～５の整数を示し、Ｒ３は前記式（１５）中のＲ３と同義である。
　本発明における活性エステル基とは、結合部位（Ｗ、Ｗ’）も含めて次式（１６）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
で表される基であり、アミノ基等の求核性基と反応する。前記式（１６）中、Ｒ４としては、フェニル基、３－ピリジル基、スクシンイミド基、２－ベンゾチアゾール基、又は１－ベンゾトリアゾール基が好ましく、スクシンイミド基又は１－ベンゾトリアゾール基がより好ましく、スクシンイミド基が最も好ましい。本発明における原子団Ｘ中のＸ’が活性エステル基である場合、或いは、原子団Ｙ中のＹ’が活性エステル基である場合の原子団Ｘ及び原子団Ｙとしては、例えば、次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
で表される原子団が挙げられる。前記式中、Ｒ４は前記式（１６）中のＲ３と同義である。
　本発明におけるアルキニル基とは、結合部位（Ｗ、Ｗ’）も含めて次式（１７）～（２０）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
のうちのいずれかで表される基であり、アジド基等と反応する。前記式（１７）中、Ｒ５としては、炭素数８以下の飽和炭化水素基又は水素原子が好ましく、水素原子がより好ましい。本発明における原子団Ｘ中のＸ’がアルキニル基である場合、或いは、原子団Ｙ中のＹ’がアルキニル基である場合の原子団Ｘ及び原子団Ｙとしては、例えば、次式（２１）～（２３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
で表される原子団が挙げられる。前記式（２１）中、ｆは２～５の整数を示し、Ｒ５は前記式（１７）中のＲ５と同義である。また、前記式（２３）中、ｇは１～６の整数を示す。
　本発明における原子団Ｘ中のＸ’がヨードアセトアミド基である場合、或いは、原子団Ｙ中のＹ’がヨードアセトアミド基である場合の原子団Ｘ及び原子団Ｙとしては、次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
で表される原子団が挙げられる。
　本発明における原子団Ｘ中のＸ’がカルボキシル基である場合、或いは、原子団Ｙ中のＹ’がカルボキシル基である場合の原子団Ｘ及び原子団Ｙとしては、次式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
で表される原子団が挙げられる。
　前記式（１２）で表される化合物を得る方法としては、適宜公知の合成方法を利用することができる。例えば、マレイミド基を導入する方法としては、３－マレイミドプロピオン酸やマレイミド酪酸等を１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩等の縮合剤と反応させた後、式（１）で表される化合物を主成分として含有する本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールと反応させる方法や、トリエチルアミン等の塩基存在下、式（１）で表される化合物を主成分として含有する本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールに対して３－マレイミドプロピオン酸Ｎ－スクシンイミジルやマレイミド酪酸Ｎ－スクシンイミジルを反応させる方法が挙げられる。また、例えば、活性エステル基を導入する方法としては、式（１）で表される化合物を主成分として含有する本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールに対して、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩等の縮合剤存在下、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドを反応させる方法が挙げられる。さらに、例えば、ヨードアセトアミド基を導入する方法としては、式（１）で表される化合物を主成分として含有する本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールに対して、トリエチルアミン等の塩基存在下、二（ヨード酢酸）無水物等を反応させる方法が挙げられる。また、例えば、アルキレン基を導入する方法としては、式（１）で表される化合物を主成分として含有する本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールに対して、トリエチルアミン等の塩基存在下、Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ　ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ、（１Ｒ，８Ｓ，９Ｓ）－Ｂｉｃｙｃｌｏ［６．１．０］ｎｏｎ－４－ｙｎ－９－ｙｌｍｅｔｈｙｌ　Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｃａｒｂｏｎａｔｅ、Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ等を反応させる方法が挙げられる。
　このようにして、前記式（１２）で表される化合物を主成分として含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。本発明の式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを用いて得られたヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、前記式（１２）で表され、エチレングリコール鎖長（すなわちａの値）が互いに同じである化合物（ヘテロ型ポリエチレングリコール）を高純度で含有することができる。
　また、本発明の式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、又は、式（１２）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを用いることにより、これらの化合物（ヘテロ型ポリエチレングリコール）と生体機能性分子とが結合されてなるヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体を得ることができる。本発明においては、上記の本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを用いることにより、両末端に薬剤が導入された化合物や、両末端にターゲッティング分子が導入された化合物の生成を十分に抑制することができる。
　前記生体機能性分子としては、タンパク薬剤、ポリペプチド、酵素、抗体、抗体医薬、遺伝子、オリゴ核酸等を含む核酸化合物、核酸医薬、抗がん剤、低分子薬物等のその他薬剤が挙げられる。
　前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体を得る方法としては、例えば、先ず、前記式（１）で表される化合物、又は、前記式（１２）で表される化合物の一方の末端、すなわち、前記式（１）中のアミノ基又はカルボキシル基、前記式（１２）中の原子団Ｘに対して抗体やペプチドリガンド等のターゲティング分子を導入し、もう一方の末端、すなわち、前記式（１）中のアミノ基又はカルボキシル基、前記式（１２）中の原子団Ｙに対して抗がん剤やタンパク薬剤といった薬剤を結合する方法が挙げられる。なお、薬剤及びターゲッティング分子を導入する末端は逆であってもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、各合成例において、核磁気共鳴（１Ｈ－ＮＭＲ）測定には日本電子社製　ＪＭＴＣ－４００を用い、質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）測定にはＷａｔｅｒｓ（株）社製Ｑｕａｔｔｒｏ　ｍｉｃｒｏ　タンデム型質量分析計を用いた。
　＜ポリエチレングリコールの合成＞
　（実施例１－１）
　式（１）中のａが８である化合物１３の合成
　〔合成例Ｉ〕
　式（３）中のａが８である化合物８の合成
　〔合成例Ｉ－１〕
　式（９）中のｃが４であり、Ｌがトシル基であり、Ｒ ２ がトリチル基である化合物４の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　先ず、前記式に示す反応経路のとおり、化合物２を合成した。すなわち、二口ナスフラスコにテトラエチレングリコール１（２００ｍＬ、１．１５ｍｏｌ）を入れ、トルエン（５０ｍＬ×２回）を用いて共沸脱水を２回行った。ナスフラスコ内を窒素パージし、ピリジン（１８ｍＬ、０．２２ｍｏｌ）及びトリチルクロリド（ＴｒｔＣｌ、４０ｇ、０．１４４ｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。３時間後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１（体積比））を用いてＴｒｔＣｌの消失を確認し、イオン交換水　２００ｍＬを加えた。得られた混合液にトルエン　１００ｍＬを加えた後に分液し、有機層をイオン交換水／飽和食塩水の混合溶液　１００ｍＬ（イオン交換水：飽和食塩水＝４：１（体積比））で１回、１Ｍ　塩酸水溶液　５０ｍＬで１回、飽和食塩水　５０ｍＬで４回洗浄した。得られた有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過し、ろ液にトルエン（５０ｍＬ×３回）を加えて共沸脱水を３回行い、淡黄色透明液体の化合物２を含有する反応生成物を得た。また、ＥＳＩ－ＭＳ測定により、得られた反応生成物中には上記化合物３も含まれていることを確認した。
　収量：６３．３ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物２　４５４．５［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物３　６９６．９［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　次いで、前記式に示す反応経路のとおり、化合物４を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記化合物２を含有する反応生成物（化合物２：　６２．８ｇ、０．１４４ｍｏｌ未満）及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２００ｍＬを入れ、０℃に冷却した。水酸化ナトリウム水溶液（２０．０ｇ、０．５０ｍｏｌ／６０ｍＬ）を加え、０℃で２０分間撹拌した。反応混合液にトシルクロリド（ＴｓＣｌ）／ＴＨＦ溶液（３０．０ｇ、０．１５７ｍｏｌ／６０ｍＬ）を３０分かけて滴下し、０℃で４時間撹拌した。４時間後、ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１（体積比））を用いて化合物２の消失を確認した後、未反応のＴｓＣｌを消失させるため、室温で１５時間撹拌した。１５時間後、ＴＬＣでＴｓＣｌの消失を確認し、イオン交換水　３０ｍＬとジエチルエーテル　５０ｍＬを加えた。混合液を飽和重曹水　５０ｍＬで１回、飽和食塩水　５０ｍＬで３回洗浄した。有機層に活性炭　０．５ｇと硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物４を含有する反応生成物を得た。また、ＥＳＩ－ＭＳ測定により、得られた反応生成物中には上記化合物３も含まれていることを確認した。
　収量：８１．８ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物４　６０８．７［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物３　６９６．８［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
　〔合成例Ｉ－２（工程ａ）〕
　式（１０）中のａが８であり、Ｒ ２ がトリチル基である化合物５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物５を合成した。すなわち、二口ナスフラスコに水素化ナトリウム（８．１ｇ）を入れ、窒素置換した。脱水ヘキサン（５０ｍＬ×２回）で２回洗浄し、ＴＨＦ　１８０ｍＬを加えて０℃に冷却した。ここにトルエン　５０ｍＬで３回共沸脱水したテトラエチレングリコール１（式（８）中のｂが４である化合物、２００ｍＬ、１．１５ｍｏｌ）を滴下ロートに入れ、３０分かけて滴下した。滴下終了後、トルエン　５０ｍＬで３回共沸脱水した上記合成例Ｉ－１で得られた化合物４を含有する反応生成物（化合物４：　８１．３ｇ、０．１４４ｍｏｌ未満）にＴＨＦ　１００ｍＬを混合し、同じ滴下ロートに入れ、１５分かけて滴下した。滴下終了後、反応混合液を４０℃に昇温し、１９時間撹拌した。１９時間後、ＴＬＣ（酢酸エチル）を用いて化合物４が消失したことを確認し、室温へと放冷した。反応混合液にイオン交換水　２００ｍＬ及び飽和食塩水　２００ｍＬを加え、分液した。水層にジエチルエーテル　５０ｍＬを加えて抽出した。分液した有機層を混合し、イオン交換水／飽和食塩水の混合溶液　５０ｍＬ（イオン交換水：飽和食塩水＝１：１（体積比））で１回、飽和食塩水　５０ｍＬで５回洗浄した。有機層に活性炭　０．５ｇと硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物５を含有する反応生成物を得た。また、ＥＳＩ－ＭＳ測定により、得られた反応生成物中には上記化合物３及び６も含まれていることを確認した。
　収量：７８．８ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物５　６３０．８［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物３　６９６．８［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物６　１０４８．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
　〔合成例Ｉ－３（工程ｂ）〕
　式（１１）中のａが８であり、Ｒ ２ がトリチル基である化合物７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物７を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例Ｉ－２で得られた化合物５を含有する反応生成物（化合物５：　７７．８ｇ、０．１４４ｍｏｌ未満）及びＴＨＦ　２００ｍＬを入れ、０℃に冷却した。水酸化ナトリウム水溶液（２０．０ｇ、０．５０ｍｏｌ／６０ｍＬ）を加え、０℃で２０分間撹拌した。反応混合液にＴｓＣｌ／ＴＨＦ溶液（２９．５ｇ、０．１５７ｍｏｌ／６０ｍＬ）を３０分かけて滴下し、０℃で１．５時間撹拌した。１．５時間後、ＴＬＣ（酢酸エチル）を用いて化合物５が消失したことを確認した。過剰のＴｓＣｌを失活させるため、さらに室温で１２．５時間撹拌した。１２．５時間後、ＴＬＣでＴｓＣｌの消失を確認し、イオン交換水　５０ｍＬ及びジエチルエーテル　５０ｍＬを加えた。混合液を飽和重曹水　５０ｍＬで１回、飽和食塩水　５０ｍＬで３回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の上記化合物７を含有する反応生成物を得た。また、ＥＳＩ－ＭＳ測定により、得られた反応生成物中には上記化合物３及び６も含まれていることを確認した。
　収量：８６．１ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物７　７８５．２［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物３　６９７．０［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物６　１０４８．７［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
　〔合成例Ｉ－４（工程ｃ～ｄ）〕
　式（３）中のａが８である化合物８の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物８を合成した。すなわち、先ず、ナスフラスコに上記合成例Ｉ－３で得られた化合物７を含有する反応生成物（化合物７：　８５．６ｇ、０．１４４ｍｏｌ未満）、メタノール　２００ｍＬ、パラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ）　２ｇを入れ、ナスフラスコ内を水素置換して室温で１８時間撹拌した。１８時間後、ＴＬＣ（酢酸エチル）を用いて化合物７の消失を確認し、Ｐｄ／Ｃをセライトろ過により除去した。ろ液にイオン交換水　１３０ｍＬを加え、生成した固体（トリフェニルメタン）をろ過して除去した。ろ液にトリフェニルメタンが残存していたため、ヘキサン　１００ｍＬで５回洗浄し、トリフェニルメタンを除去した。メタノール／イオン交換水層を減圧濃縮し、化合物８を含む粗生成物を得た。ＥＳＩ－ＭＳ測定の結果、得られた粗生成物中には上記化合物１及び９も含まれていることを確認した。
　次いで、上記粗生成物にジクロロメタン　１２０ｍＬを加え、２０℃の条件下、イオン交換水　１００ｍＬで３回、飽和食塩水　１００ｍＬで２回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物８を含有する精製物を得た。
精製物
　収量：５２．０ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物８　５４２．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：　７．８０（ｄ，２Ｈ），　７．３５（ｄ，２Ｈ），　４．１６（ｔ，２Ｈ），　３．６５（ｍ，３０Ｈ），　２．７３（ｔ，１Ｈ），　２．４５（ｓ，　３Ｈ）
粗生成物
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物８　５４２．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物１　２１２．７［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物９　５６４．５［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
　〔合成例ＩＩ〕
　式（１）中のａが８である化合物１３の合成
　〔合成例ＩＩ－１（工程Ａ）〕
　式（５）中のａが８であり、Ｒ １ がｔｅｒｔ－ブチル基である化合物１０の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物１０を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例Ｉで得られた化合物８を含有する精製物（化合物８：　１．０ｇ、１．９１ｍｍｏｌ）、アクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル（式（４）中のＲ１がｔｅｒｔ－ブチル基である化合物、１．８２ｍＬ、１９．１ｍｍｏｌ）及びトルエン（２５ｍＬ）を入れた。０℃まで冷却した後、水酸化カリウム（ｐｏｗｄｅｒ、５３ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１時間攪拌した。１時間後、ＥＳＩ－ＭＳにより化合物８の消失を確認し、混合液にイオン交換水　２０ｍＬを加え分液した。有機層を飽和食塩水　２０ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１０を含有する反応生成物を得た。
　収量：１．０６ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物１０　６７０．６［Ｍ＋ＮＨ４］＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：　７．８０（ｄ，２Ｈ），　７．３４（ｄ，２Ｈ），　４．１６（ｔ，２Ｈ），　３．６４（ｍ，３２Ｈ），　２．５０（ｔ，２Ｈ），　２．４５（ｓ，３Ｈ），　１．４５（ｓ，９Ｈ）。
　〔合成例ＩＩ－２（工程Ｂ）〕
　式（６）中のａが８であり、Ｒ １ がｔｅｒｔ－ブチル基である化合物１１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物１１を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例ＩＩ－１で得られた化合物１０を含有する反応生成物（化合物１０：　１．０６ｇ、１．６０ｍｍｏｌ）及びアセトニトリル（ＭｅＣＮ）　２５ｍＬを入れた。ナスフラスコ内を窒素パージし、フタルイミドカリウム塩（ＰＩＫ、５２０ｍｇ、２．８０ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で８時間撹拌した。８時間後、ＥＳＩ－ＭＳ及び１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により化合物１０の消失を確認し、反応溶液を減圧濃縮した。ジクロロメタン　７ｍＬを加え固形分をろ過した後に、ろ液を０．１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液　７ｍＬで１回、飽和食塩水　１０ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１１を含有する反応生成物を得た。
　収量：９６５ｍｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物１１　９４５．７［Ｍ＋ＮＨ４］＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：　７．８５（ｄｄ，２Ｈ），　７．７１（ｄｄ，２Ｈ），　３．９０（ｔ，２Ｈ），　３．６３（ｍ，３２Ｈ），　２．５０（ｔ，２Ｈ），　１．４５（ｓ，９Ｈ）。
　〔合成例ＩＩ－３（工程Ｃ～Ｄ（分液抽出処理））〕
　式（７）中のａが８であり、Ｒ １ がｔｅｒｔ－ブチル基である化合物１２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物１２を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例ＩＩ－２で得られた化合物１１を含有する反応生成物（化合物１１：　５１０ｍｇ，０．８０ｍｍｏｌ）、エタノール　１０ｍＬ、及びヒドラジン・１水和物（３３４ｍｇ、６．７０ｍｍｏｌ）を入れ、８５℃で４５分間撹拌した。４５分後、ＥＳＩ－ＭＳにより化合物１１の消失を確認し、室温まで冷却した。析出した白色固体を溶解させるため、１２％炭酸カリウム水溶液　５ｍＬを加えた後に、この混合溶液を減圧濃縮してトルエン　５ｍＬで２回共沸脱水し、固体の化合物１２を含有する反応生成物を得た。
　次いで、得られた反応生成物にイオン交換水　３ｍｌを加え濃塩酸　０．６ｍＬを滴下し、ｐＨ　３に調整し、固形分をろ過した。ろ液をジクロロメタンで３回洗浄し、水層にＮａＣｌ　２ｇを加え飽和させた。この水溶液をジクロロメタンで５回抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１２を含有する精製物を得た。
　収量：４００ｍｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物１２　４９８．４［Ｍ＋Ｈ］＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：　７．９７（ｓ，２Ｈ），　３．９４（ｔ，２Ｈ），　３．６６（ｍ，３０Ｈ），　３．１９（ｔ，２Ｈ），　２．５０（ｔ，２Ｈ），　１．４５（ｓ，９Ｈ）。
　〔合成例ＩＩ－４（工程Ｄ（酸加水分解処理））〕
　式（１）中のａが８である化合物１３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物１３を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例ＩＩ－３で得られた化合物１２を含有する精製物（化合物１２：　４００ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）及び１Ｍ　塩酸水溶液　５０２μＬを入れ、６０℃で５時間攪拌した。５時間後、ＥＳＩ－ＭＳにより化合物１２の消失を確認し、１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液を加え反応液をｐＨ　５に調整した。水分をトルエン（５ｍＬ）で２回共沸脱水して得られた固形分にジクロロメタン　１０ｍＬを加え、ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色固体の化合物１３を含有する精製物を得た。
　収量：３２０ｍｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物１３　４４２．４［Ｍ＋Ｈ］＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）：　３．６０（ｍ，３２Ｈ），　３．１２（ｔ，２Ｈ），　２．５１（ｔ，２Ｈ）。
　（実施例２－１）
　式（１）中のａが１２である化合物２３の合成
　〔合成例ＩＩＩ〕
　式（３）中のａが１２である化合物１８の合成
　〔合成例ＩＩＩ－１〕
　式（９）中のｃが８であり、Ｌがメシル基であり、Ｒ ２ がトリチル基である化合物１４の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　先ず、前記式に示す反応経路のとおり、化合物１４を合成した。すなわち、ナスフラスコに合成例Ｉ－２で合成した化合物５を含有する反応生成物（化合物５：　７２．７ｇ、０．１１９ｍｏｌ未満）及びトルエン（３５０ｍＬ）を入れ、ナスフラスコ内を窒素パージし、トリエチルアミン（１９．８ｍＬ、０．１４３ｍｏｌ）を加えた。０℃で塩化メタンスルホニル（１０．１ｍＬ、０．１３１ｍｏｌ）を滴下し、室温で２時間攪拌した。２時間後、ＥＳＩ－ＭＳ測定により化合物５の消失を確認し、１Ｍ　ＨＣｌａｑ．　１００ｍＬを加え、分液した。有機層を１Ｍ　塩酸水溶液　１００ｍＬで１回、飽和重曹水　１００ｍＬで２回、飽和食塩水　１００ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１４を含有する反応生成物を得た。また、ＥＳＩ－ＭＳ測定により、得られた反応生成物中には上記化合物３及び６も含まれていることを確認した。
　収量：８０．１ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物１４　７０８．３［Ｍ＋ＮＨ４］＋、化合物３　６９６．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物６　１０４８．５［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
　〔合成例ＩＩＩ－２（工程ａ）〕
　式（１０）中のａが１２であり、Ｒ ２ がトリチル基である化合物１５の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物１５を合成した。すなわち、二口ナスフラスコに水素化ナトリウム（６．５８ｇ）を入れ、窒素置換した。脱水ヘキサン（５０ｍＬ×２回）で２回洗浄し、ＭｅＣＮ　２００ｍＬを加えて０℃に冷却した。トルエン　５０ｍＬで３回共沸脱水したテトラエチレングリコール１（式（８）中のｂが４である化合物、１８０ｇ、０．９２７ｍｏｌ）にＭｅＣＮ　５０ｍＬを混合し、滴下ロートに入れて３０分かけて滴下した。滴下終了後、トルエン　５０ｍＬで３回共沸脱水した上記合成例ＩＩＩ－１で得られた化合物１４を含有する反応生成物（化合物１４：８０．１ｇ、０．１１６ｍｏｌ未満）にＭｅＣＮ　５０ｍＬを混合し、同じ滴下ロートに入れて１５分かけて滴下した。滴下終了後、反応混合液を８０℃に昇温し、３時間撹拌した。３時間後、１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により化合物１４が消失したことを確認し、室温へと放冷した。反応混合液を減圧濃縮し、残渣にトルエン　２００ｍＬを加えた。このトルエン溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液　１００ｍＬで２回、飽和食塩水　１００ｍＬで３回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１５を含有する反応生成物を得た。また、ＥＳＩ－ＭＳ測定により、得られた反応生成物中には上記化合物３、６及び１６も含まれていることを確認した。
　収量：８５．４ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物１５　８０６．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物３　６９６．６［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物６　１０４８．１［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物１６　１４００．９［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
　〔合成例ＩＩＩ－３（工程ｂ）〕
　式（１１）中のａが１２であり、Ｒ ２ がトリチル基である化合物１７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物１７を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例ＩＩＩ－２で得られた化合物１５を含有する反応生成物（化合物１５：５７．３ｇ、７２．７ｍｍｏｌ未満）及びジクロロメタン（２８０ｍＬ）を入れ、ナスフラスコ内を窒素パージし、トリエチルアミン（１０．１ｍＬ、７２．７ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、８８８ｍｇ、７．２７ｍｍｏｌ）、ＴｓＣｌ（１２．５ｇ、６５．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で４．５時間攪拌した。４．５時間後、１Ｈ－ＮＭＲによりＴｓＣｌの消失を確認し、１Ｍ　塩酸水溶液　１５０ｍＬを加え、分液した。有機層を１Ｍ　塩酸水溶液　１５０ｍＬで１回、飽和重曹水　１５０ｍＬで２回、飽和食塩水　１５０ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１７を含有する反応生成物を得た。また、ＥＳＩ－ＭＳ測定により、得られた反応生成物中には上記化合物３、６及び１６も含まれていることを確認した。
　収量：６９．１ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物１７　９６０．３［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物３　６９６．３［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物６　１０４８．２［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物１６　１４００．８［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
　〔合成例ＩＩＩ－４（工程ｃ～ｄ）〕
　式（３）中のａが１２である化合物１８の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物１８を合成した。すなわち、先ず、ナスフラスコに上記合成例ＩＩＩ－３で得られた化合物１７を含有する反応生成物（化合物１７：　６９．１ｇ、７３．３ｍｍｏｌ未満）及びメタノール（５５０ｍＬ）を入れた後、ＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（６．９７ｇ、３６．７ｍｍｏｌ）、ヘキサン（２００ｍＬ）を加え、室温で３０分攪拌した。３０分後、ヘキサン層を除去した後にヘキサン（２００ｍＬ）を加え、室温で３０分攪拌した。同様の操作を６回行った後、ＥＳＩ－ＭＳにより化合物１７の消失を確認し、０℃で飽和重曹水　２００ｍＬを加えた。この混合溶液をヘキサン　２００ｍＬで２回洗浄し、トリチルメチルエーテルを除去した。メタノール溶液を減圧濃縮し、化合物１８を含む粗生成物を得た。ＭＳ測定の結果、得られた粗生成物中には上記化合物１、９及び１９も含まれていることを確認した。
　次いで、上記粗生成物にジクロロメタン　２００ｍＬを加え、２０℃の条件下、イオン交換水　２００ｍＬで３回、飽和食塩水　２００ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１８を含有する精製物を得た。
精製物
　収量：５２．０ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物１８　７１８．３［Ｍ＋ＮＨ４］＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：　７．８０（ｄ，２Ｈ），　７．３４（ｄ，２Ｈ），　４．１６（ｔ，２Ｈ），　３．６５（ｍ，４６Ｈ），　２．６５（ｔ，１Ｈ），　２．４５（ｓ，３Ｈ）
粗生成物
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物１８　７１８．３［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物１　２１２．３［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物９　５６４．５［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　化合物１９　９１６．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
　〔合成例ＩＶ〕
　式（１）中のａが１２である化合物２３の合成
　〔合成例ＩＶ－１（工程Ａ）〕
　式（５）中のａが１２であり、Ｒ １ がｔｅｒｔ－ブチル基である化合物２０の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物２０を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例ＩＩＩで得られた化合物１８を含有する精製物（化合物１８：　４．９６ｇ、７．０８ｍｍｏｌ）、アクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル（式（４）中のＲ１がｔｅｒｔ－ブチル基である化合物、３．０９ｍＬ、２１．２ｍｍｏｌ）及びトルエン（１００ｍＬ）を入れた。０℃で水酸化カリウム（ｐｏｗｄｅｒ、１９９ｍｇ、３．５４ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１時間攪拌した。１時間後、ＥＳＩ－ＭＳにより化合物１８の消失を確認し、飽和塩化アンモニウム水溶液　５０ｍＬを加えた。この混合溶液を分液後、有機層を飽和食塩水　５０ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、無色透明液体の化合物２０を含有する反応生成物を得た。
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物２０　８４７．０　［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　４３２．６［Ｍ＋２ＮＨ４］２＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：　７．８０（ｄ，２Ｈ），　７．３４（ｄ，２Ｈ），　４．１６（ｔ，２Ｈ），　３．６４（ｍ，４８Ｈ），　２．４９（ｔ，２Ｈ），　２．４５（ｓ，３Ｈ），　１．４５（ｓ，９Ｈ）。
　〔合成例ＩＶ－２（工程Ｂ）〕
　式（６）中のａが１２であり、Ｒ １ がｔｅｒｔ－ブチル基である化合物２１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物２１を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例ＩＶ－１で得られた化合物２０を含有する反応生成物（化合物２０：　５．４３ｇ、６．５５ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（４５ｍＬ）を入れ、窒素置換した。フタルイミドカリウム塩（１．５８ｇ、８．５２ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１８時間攪拌した。１８時間後、１Ｈ－ＮＭＲにより化合物２０が消失したことを確認し、反応溶液を減圧濃縮した。残渣にジクロロメタン　５０ｍＬを加え、不溶物をろ過した。ろ液を０．１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液　５０ｍＬで１回、飽和食塩水　５０ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物２１を含有する反応生成物を得た。
　収量：４．２６ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物２１　８２１．８［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　４２０．０［Ｍ＋２ＮＨ４］２＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：　７．８４（ｄｄ，２Ｈ），　７．７７（ｄｄ，２Ｈ），　３．９０（ｔ，２Ｈ），　３．６４（ｍ，４８Ｈ），　２．５０（ｔ，２Ｈ），　１．４５（ｓ，９Ｈ）。
　〔合成例ＩＶ－３（工程Ｃ）〕
　式（７）中のａが１２であり、Ｒ １ がｔｅｒｔ－ブチル基である化合物２２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物２２を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例ＩＶ－２で得られた化合物２１を含有する反応生成物（化合物２１：　４．２６ｇ、５．３０ｍｍｏｌ）、ヒドラジン・１水和物（３．８６ｍＬ、７９．５ｍｍｏｌ）及びエタノール（６０ｍＬ）を入れ、８５℃で１時間攪拌した。１時間後、ＥＳＩ－ＭＳにより化合物２１の消失を確認し、室温まで冷却した。析出した白色固体を溶解させるため１２％炭酸カリウム水溶液　５ｍＬを加えた後に、この混合溶液を減圧濃縮してトルエン　１０ｍＬで２回共沸脱水した。残渣をイオン交換水　２０ｍＬに溶解させ、３５％塩酸を加えてｐＨ　３とした。析出した固体をろ過し、ろ液に塩化ナトリウム　６ｇを加えて飽和させた。この水溶液をジクロロメタン　２０ｍＬで２回抽出した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物２２を含有する反応生成物を得た。
　収量：３．１３ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物２２　６７４．８［Ｍ＋Ｈ］＋、　３４６．４［Ｍ＋Ｈ＋ＮＨ４］２＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：　７．９５（ｓ，２Ｈ），　３．９４（ｔ，２Ｈ），　３．６６（ｍ，４６Ｈ），　３．１８（ｔ，２Ｈ），　２．５０（ｔ，２Ｈ），　１．４５（ｓ，９Ｈ）。
　〔合成例ＩＶ－４（工程Ｄ）〕
　式（１）中のａが１２である化合物２３の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物２３を合成した。すなわち、先ず、ナスフラスコに上記合成例ＩＶ－３で得られた化合物２２を含有する反応生成物（化合物２２：　３．１３ｇ、４．６５ｍｍｏｌ）及び１Ｍ　塩酸水溶液（３ｍＬ）を入れ、６０℃で２時間攪拌した。２時間後、ＥＳＩ－ＭＳ測定により化合物２２が消失したことを確認し、室温まで冷却した。
　次いで、反応溶液をイオン交換水　５ｍＬで希釈し、ジクロロメタン　１０ｍＬで３回洗浄した。水層に２Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液及び０．１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨ　９とした。この水溶液をジクロロメタン　１０ｍＬで３回洗浄し、水層に塩化ナトリウム　２ｇを加えて飽和させた。この水溶液をクロロホルム　１０ｍＬで３回抽出し、有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物２３を含有する反応生成物を２．３２ｇ得た。得られた反応生成物（１．９６ｇ）に酢酸エチル　１０ｍＬを加えて攪拌した。固体をろ過し、３時間減圧乾燥させて白色固体の化合物２３を含有する精製物を得た。
　収量：１．８２ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物２３　６１８．５［Ｍ＋Ｈ］＋、　３１８．３［Ｍ＋Ｈ＋ＮＨ４］２＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）：　３．６１（ｍ，４８Ｈ），　３．１２（ｔ，２Ｈ），　２．５６（ｔ，２Ｈ）。
　（比較例１－１）
　合成例Ｉ－４における粗生成物（比較精製物１－１）をそのまま用いたこと以外は合成例ＩＩと同様にして固体状の精製物１－２を得た。
　（比較例２－１）
　先ず、上記合成例ＩＩ－３と同様にして固体状の化合物１２を含有する反応生成物を得た。次いで、これにイオン交換水　３ｍｌを加え濃塩酸　０．６ｍＬを滴下し、ｐＨ　３に調整し、固形分をろ過した後、ろ液に塩化ナトリウム　２ｇを加えて飽和させた。この水溶液をジクロロメタンで５回抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物を含有する比較精製物を得た。上記合成例ＩＩ－３で得られた化合物１２を含有する精製物に代えてこの精製物を用いたこと以外は合成例ＩＩ－４と同様にして固体状の比較精製物２を得た。
　（比較例３－１）
　先ず、上記合成例ＩＶ－４と同様にしてナスフラスコに上記合成例ＩＶ－３で得られた化合物２２を含有する反応生成物（化合物２２：　３．１３ｇ、４．６５ｍｍｏｌ）及び１Ｍ　塩酸水溶液（３ｍＬ）を入れ、６０℃で２時間攪拌した。２時間後、ＥＳＩ－ＭＳ測定により化合物２２が消失したことを確認し、室温まで冷却した。次いで、得られた反応溶液をそのまま減圧濃縮して固体状の比較精製物３を得た。
　（比較例４－１）
　アクリロニトリルを用いたヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　先ず、前記式に示す反応経路のとおり、化合物２４を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例Ｉ－４で得られた化合物８を含有する精製物（化合物８：　１０．０ｇ、１９．１ｍｍｏｌ）を入れ、０℃にて水酸化カリウム（１．６ｇ、１．５ｅｑ．）の水溶液（１０ｍＬ）を加えた。アクリロニトリル（１４．６ｍＬ、１２ｅｑ．）を滴下ロートに入れ、０℃にて滴下した後、０℃で３時間攪拌した。３時間後、ＥＳＩ－ＭＳ測定により化合物８の消費を確認し、８５％リン酸を１．６ｍＬ加えてｐＨが６より小さくなるように調整した。この溶液をトルエン　１００ｍＬで希釈した後、イオン交換水　１００ｍＬで２回、飽和食塩水　１００ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、無色透明液体の化合物２４を含有する反応生成物を得た。
　収量：１０．８ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物２４　５９５．５［Ｍ＋ＮＨ４］＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：　７．８０（ｄ，２Ｈ），　７．３４（ｄ，２Ｈ），　４．１６（ｔ，２Ｈ），　３．６４（ｍ，３２Ｈ），　２．６２（ｔ，２Ｈ），　２．３５（ｓ，３Ｈ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　次いで、前記式に示す反応経路のとおり、化合物２５を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記化合物２４を含有する反応生成物（化合物２４：　２．６２ｇ、４．５４ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（２０ｍＬ）を入れ、窒素置換した。フタルイミドカリウム塩（１．２ｇ、１．２ｅｑ．）を加え、８０℃にて４．５時間攪拌した。４．５時間後、１Ｈ－ＮＭＲ測定によりＴｓ基のピークの消失を確認して化合物２４の消失を確認し、室温まで放冷した。反応溶液を減圧濃縮した後、残渣にジクロロメタン　２０ｍＬを加え、固形分をろ過により除去した。ろ液を０．１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液　２０ｍＬで１回、飽和食塩水　１０ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、無色透明液体の化合物２５を含有する反応生成物を得た。
　収量：２．１ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物２５　５７０．６［Ｍ＋ＮＨ４］＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：　７．８４（ｄｄ，２Ｈ），　７．７１（ｄｄ，２Ｈ），　３．９０（ｔ，２Ｈ），　３．６４（ｍ，３２Ｈ），　２．６３（ｔ，２Ｈ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　次いで、前記式に示す反応経路のとおり、化合物２６を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記化合物２５を含有する反応生成物（化合物２５：　１．０３ｇ、１．８７ｍｍｏｌ）、エタノール（１５ｍＬ）を入れた。ヒドラジン・１水和物（１．４ｍＬ、１５ｅｑ．）を加え、８５℃で４５分間攪拌した。４５分後、ＥＳＩ－ＭＳ測定により化合物２５の消失を確認した。析出した白色固体を溶解させるため１２％炭酸カリウム水溶液　７．５ｍＬを加えた後に、この混合溶液を減圧濃縮してトルエン　１０ｍＬで２回共沸脱水した。残渣をイオン交換水　２０ｍＬに溶解させ、３５％塩酸を加えてｐＨ　３とした。析出した固体をろ過し、ろ液を減圧濃縮してトルエン　１０ｍＬで２回共沸脱水した。残渣をジクロロメタン　２０ｍＬに溶解し、硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物２６を含有する反応生成物を得た。
　収量：７３６ｍｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物２６　４２３．４［Ｍ＋Ｈ］＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：　７．９６（ｓ，２Ｈ），　３．６９（ｍ，３２Ｈ），　３．２０（ｔ，２Ｈ），　２．６６（ｔ，２Ｈ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　次いで、前記式に示す反応経路のとおり、化合物１３を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記化合物２６を含有する反応生成物（化合物２６：　６２９ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）、３５％塩酸（６ｍＬ）、及びギ酸（６ｍＬ）を加え、１００℃にて１．５時間攪拌した。１．５時間後、ＥＳＩ－ＭＳ測定により化合物２６の消失を確認し、室温まで放冷した。反応溶液を減圧濃縮し、トルエン　１０ｍＬで２回共沸脱水して淡黄色透明液体の化合物１３を含有する比較精製物４を得た。また、ＥＳＩ－ＭＳ測定により、得られた組成物中には［Ｍ＋Ｈ］＋が３７０．３の化合物が確認され、この化合物は化合物１３が分解されて生成した、末端にアミノ基及び水酸基を有する化合物であることを確認した。
　収量：５１２ｍｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物１３　４４２．４［Ｍ＋Ｈ］＋、　ＮＨ２－ＥＧ８－ＯＨ　３７０．３［Ｍ＋Ｈ］＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）：　３．５６（ｍ，３２Ｈ），　３．０８（ｔ，２Ｈ），　２．５３（ｔ，２Ｈ）。
　＜カラムクロマトグラフィー測定＞
　（実施例１－２）
　実施例１－１で得られた化合物１３を含有する精製物について、（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
　（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
　逆相クロマトグラフィー測定は、機器に東ソー（株）社製　ビルドＧＰＣシステム　ＨＬＣ－８２２０を、検出器（示差屈折率計）に東ソー（株）社製　ＲＩ－８０２０を、カラムに東ソー（株）社製　ＴＳＫｇｅｌ　ＯＤＳ－８０Ｔｓ　（粒子径　５μｍ、カラムサイズ　４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝２５／７５を、それぞれ用い、流速　０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度　４０℃、サンプル濃度　０．２ｍｇ／ｇ、注入量　４０μＬの条件で行った。
　得られたクロマトグラムを図５に示す。なお、以下、クロマトグラムの縦軸は検出器から得られた信号強度を、横軸は溶出時間（カラム保持時間）を示す。溶出開始点の溶出時間は９．１０分、溶出終了点の溶出時間は１５．５８分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１１．９８分であり、Ｔ１ａは１１．５８分、Ｔ１ｂは１２．３４分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ４０２５．４１９であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ４２８８．５１１であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９４であった。結果を表１に示す。
　なお、サンプルを含まない展開溶媒のみをインジェクションし、同一条件で測定して得られたクロマトグラムを図６に示す。これより、上記測定で溶出時間８．２５分より前に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることを確認した。
　（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
　陽イオン交換クロマトグラフィーの測定条件は、機器に東ソー（株）社製　ビルドＧＰＣシステム　ＨＬＣ－８２２０を、検出器（示差屈折率計）に東ソー（株）社製　ＲＩ－８０２０を、カラムに東ソー（株）社製　ＴＳＫｇｅｌ　ＳＰ－２ＳＷ　（粒子径　５μｍ、カラムサイズ　４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝１０／９０を、それぞれ用い、流速　０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度　３０℃、サンプル濃度　０．２ｍｇ／ｇ、注入量　２０μＬの条件で行った。
　得られたクロマトグラムを図７に示す。溶出開始点の溶出時間は３．９５分、溶出終了点の溶出時間は６．２４分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．３８分であり、Ｔ２は５．１５分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ２１．６５１であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ６６１０．７１４であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．００であった。結果を表１に示す。
　なお、同サンプルを、機器にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５を、検出器（質量分析計）にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ｑｕａｔｔｒｏ　ｍｉｃｒｏ　タンデム型質量分析計を、カラムに東ソー（株）社製　ＴＳＫｇｅｌ　ＳＰ－２ＳＷ　（粒子径　５μｍ、カラムサイズ　４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５０ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝１０／９０を、それぞれ用い、流速　０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度　３０℃、サンプル濃度　０．０１ｍｇ／ｇ、注入量　５μＬの条件で測定し、得られたクロマトグラムを図８に示す。これより、上記測定で溶出時間４．６０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることを確認した。
　（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
　（誘導体化）
　実施例１－１で得られた化合物１３を含有する精製物（化合物１３：　６０ｍｇ）をイオン交換水　１ｍＬに溶解した。水酸化ナトリウム（１６．３ｍｇ、３ｅｑ．）、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（０．０８６ｍＬ、２．８ｅｑ．）を加え、室温で１８時間攪拌した。１８時間後、ＥＳＩ－ＭＳ測定により化合物１３の消費を確認し、１Ｍ　塩酸水溶液を加えてｐＨ　３とした。この水溶液に塩化ナトリウム　３００ｍｇを加えて飽和させた。この水溶液をジクロロメタン　２ｍＬで２回抽出し、有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、無色透明液体の前記式（２）中のａが８である化合物を含有する混合物を得た（収量：４５ｍｇ）。これを下記の陰イオン交換クロマトグラフィーの試料に用いた。
　（陰イオン交換クロマトグラフィー）
　陰イオン交換クロマトグラフィーの測定条件は、機器に東ソー（株）社製　ビルドＧＰＣシステム　ＨＬＣ－８２２０を、検出器（示差屈折率計）に東ソー（株）社製　ＲＩ－８０２０を、カラムに東ソー（株）社製　ＴＳＫｇｅｌ　ＤＥＡＥ－２ＳＷ　（粒子径　５μｍ、カラムサイズ　４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５０ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝１０／９０を、それぞれ用い、流速　０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度　３０℃、サンプル濃度　０．２ｍｇ／ｇ、注入量　３０μＬの条件で行った。
　得られたクロマトグラムを図９に示す。溶出開始点の溶出時間は９．６０分、溶出終了点の溶出時間は１１．６４分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は１０．４２分であり、Ｔ３は１０．１１分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ４６．０３６であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ１１５８．２６７であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．００であった。結果を表１に示す。
　なお、同サンプルを、機器にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５を、検出器（質量分析計）にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ｑｕａｔｔｒｏ　ｍｉｃｒｏ　タンデム型質量分析計を、カラムに東ソー（株）社製　ＴＳＫｇｅｌ　ＤＥＡＥ－２ＳＷ　（粒子径　５μｍ、カラムサイズ　４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５０ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝１０／９０を、それぞれ用い、流速　０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度　３０℃、サンプル濃度　０．０１ｍｇ／ｇ、注入量　５μＬの条件で測定し、得られたクロマトグラムを図１０に示す。これより、上記測定で溶出時間３．９０～８．００分の間に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることを確認した。
　（実施例２－２）
　実施例２－１で得られた化合物２３を含有する精製物について、（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
　展開溶媒を５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝３０／７０に変更したこと以外は、実施例１－２と同様にして測定を行った。得られたクロマトグラムを図１１に示す。溶出開始点の溶出時間は８．５０分、溶出終了点の溶出時間は２５．６７分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１９．３０分であり、Ｔ１ａは１８．９３分、Ｔ１ｂは２０．１９分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ１１０５３．３３２であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ１１６５９．０２９であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９５であった。結果を表１に示す。
　なお、サンプルを含まない展開溶媒のみをインジェクションし、同一条件で測定した結果、上記測定で溶出時間７．１０分より前に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
　（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
　実施例１－２と同様にして測定を行った。得られたクロマトグラムを図１２に示す。溶出開始点の溶出時間は４．９３分、溶出終了点の溶出時間は５．９０分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．２８分であり、Ｔ２は５．１０分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ５２．５６１であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ１１３７２．５１０であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．００であった。結果を表１に示す。
　なお、実施例１－２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図１３に示す。これより、上記測定で溶出時間４．６０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
　（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
　実施例１－２と同様にして誘導体化及び測定を行った。得られたクロマトグラムを図１４に示す。溶出開始点の溶出時間は８．０２分、溶出終了点の溶出時間は９．５６分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は８．４７分であり、Ｔ３は８．１８分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ６０．６７５であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ１２４８４．５３５であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．００であった。結果を表１に示す。
　なお、実施例１－２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図１５に示す。これより、溶出時間３．９０～５．２０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
　（比較例１－２）
　比較例１－１で得られた比較精製物１－２について、実施例１－２と同様にして（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
　（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
　溶出開始点の溶出時間は９．１０分、溶出終了点の溶出時間は２４．２３分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１９．３１分であり、Ｔ１ａは１８．９４分、Ｔ１ｂは２０．２０分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ１１０００．１９０であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ１２０８８．１２１であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９１であった。結果を表１に示す。
　なお、上記測定では溶出時間２３．６１分にピークが検出されたが、同サンプルを、機器にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５を、検出器（質量分析計）にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ｑｕａｔｔｒｏ　ｍｉｃｒｏ　タンデム型質量分析計を、カラムに東ソー（株）社製　ＴＳＫｇｅｌ　ＯＤＳ－８０Ｔｓ　（粒子径　５μｍ、カラムサイズ　４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝１０／９０を、それぞれ用い、流速　０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度　４０℃、サンプル濃度　０．０１ｍｇ／ｇ、注入量　５μＬの条件で測定した結果、上記の溶出時間２３．６１分に検出されたピークは化合物９の両末端がカルボン酸である化合物に由来するピークであることが確認された。
（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
　溶出開始点の溶出時間は３．４２分、溶出終了点の溶出時間は６．４６分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．４０分であり、Ｔ２は５．１４分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ４４２．０５０であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ１１０５１．２５１であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．０４であった。結果を表１に示す。
　なお、上記測定では溶出時間３．９７分にピークが検出されたが、実施例１－２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出した結果、上記の溶出時間３．９７分に検出されたピークは、化合物９の両末端がカルボン酸である化合物に由来するピークであることが確認された。
　（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
　溶出開始点の溶出時間は９．５５分、溶出終了点の溶出時間は１１．９９分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は１０．３７分であり、Ｔ３は１０．４０分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ５０．４１４であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ１１７０９．５４４であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．００であった。結果を表１に示す。
　（比較例２－２）
　比較例２－１で得られた比較精製物２について、実施例１－２と同様にして（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
　（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
　得られたクロマトグラムを図１６に示す。溶出開始点の溶出時間は９．１４分、溶出終了点の溶出時間は１５．６５分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１１．９０分であり、Ｔ１ａは１１．６２分、Ｔ１ｂは１２．４５分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ１１２３９．８７９であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ１２１７８．５０７であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９２であった。結果を表１に示す。
　なお、比較例１－２と同様に同サンプルを質量分析計により検出した結果、上記の溶出時間１５．１９分に検出されたピークは、化合物１３のアミノ基に代えて水酸基を有する化合物に由来するピークであることが確認された。
　（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
　得られたクロマトグラムを図１７に示す。溶出開始点の溶出時間は３．３９分、溶出終了点の溶出時間は６．４４分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．３７分であり、Ｔ２は５．１７分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ５８３．１１５であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ１０１４６．６８６であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．０６であった。結果を表１に示す。
　また、実施例１－２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図１８に示す。これより、上記測定で溶出時間４．０８分に検出されたピークは、化合物１３のアミノ基に代えて水酸基を有する化合物に由来するピークであることが確認された。
　（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
　得られたクロマトグラムを図１９に示す。溶出開始点の溶出時間は９．５４分、溶出終了点の溶出時間は１２．１２分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は１０．４０分であり、Ｔ３は１０．００分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ１２０．７３１であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ１１００６．３３５であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．０１であった。結果を表１に示す。
　（比較例３－２）
　比較例３－１で得られた比較精製物３について、実施例２－２と同様にして（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
　（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
　溶出開始点の溶出時間は８．５０分、溶出終了点の溶出時間は２５．６９分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１９．３１分であり、Ｔ１ａは１８．９４分、Ｔ１ｂは２０．１９分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ１０３１９．２５６であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ１１２１６．５８３であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９２であった。結果を表１に示す。
　（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
　溶出開始点の溶出時間は３．１３分、溶出終了点の溶出時間は５．９２分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．３０分であり、Ｔ２は５．１１分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ４３．７６９であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ１００９４．２２４であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．０４であった。結果を表１に示す。
　なお、上記測定では溶出時間３．９８分にピークが検出されたが、実施例１－２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出した結果、上記の溶出時間３．９８分に検出されたピークは、化合物２３のアミノ基に代えて水酸基を有する化合物に由来するピークであることが確認された。
　（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
　溶出開始点の溶出時間は３．３９分、溶出終了点の溶出時間は９．５９分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は８．４８分であり、Ｔ３は８．１８分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ１１６．２１６であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ１１６３９．９０７であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．０１であった。結果を表１に示す。
　（比較例４－２）
　比較例４－１で得られた比較精製物４について、実施例１－２と同様にして（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
　（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
　得られたクロマトグラムを図２０に示す。溶出開始点の溶出時間は９．０３分、溶出終了点の溶出時間は１８．２４分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１１．７８分であり、Ｔ１ａは１１．４４分、Ｔ１ｂは１２．３０分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ３２５５．８６９であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ３４６０．４１３であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９４であった。結果を表１に示す。
　なお、比較例１－２と同様に同サンプルを質量分析計により検出した結果、ピークＰ１の前方に重なるピークとして、化合物１３のカルボキシル基に代えて水酸基を有する化合物に由来するピークが確認された。
　（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
　得られたクロマトグラムを図２１に示す。溶出開始点の溶出時間は３．５６分、溶出終了点の溶出時間は１３．７０分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．３４分であり、Ｔ２は５．１６分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ３６４．４２９であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ８１１３．２２４であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．０４であった。結果を表１に示す。
　また、実施例１－２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図２２に示す。これより、上記測定で溶出時間４．６０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
　（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
　得られたクロマトグラムを図２３に示す。溶出開始点の溶出時間は３．５０分、溶出終了点の溶出時間は１１．２７分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は１０．４１分であり、Ｔ３は１０．０８分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ４４９．５３２であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ９５７２．４０５であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．０５であった。結果を表１に示す。
　また、実施例１－２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図２４に示す。これより、上記測定で溶出時間４．３０～５．７０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであり、溶出時間３．８３分に検出されたピークは、化合物１３のカルボキシル基に代えて水酸基を有する化合物が誘導体化された化合物に由来するピークであることが確認された。
　（比較例５）
　実施例１－１で得られた化合物１３を含有する精製物に代えて、市販の化合物１３を含有するポリエチレングリコール１（和光純薬工業（株）社製、商品名：Ａｍｉｎｏ－ｄＰＥＧＲ８－ａｃｉｄ）を用いたこと以外は実施例１－２と同様にして（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
　（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
　得られたクロマトグラムを図２５に示す。溶出開始点の溶出時間は９．４５分、溶出終了点の溶出時間は１７．８０分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１１．６８分であり、Ｔ１ａは１１．４３分、Ｔ１ｂは１２．２７分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ４７１９．５３３であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ５０４４．８４４であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９４であった。結果を表１に示す。
　（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
　得られたクロマトグラムを図２６に示す。溶出開始点の溶出時間は３．５６分、溶出終了点の溶出時間は５．９７分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．３４分であり、Ｔ２は５．１７分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ６３１．３９１であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ１０５９０．３９５であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．０６であった。結果を表１に示す。
　また、実施例１－２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図２７に示す。これより、上記測定で溶出時間４．６０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
　（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
　得られたクロマトグラムを図２８に示す。溶出開始点の溶出時間は３．７２分、溶出終了点の溶出時間は１１．３５分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は１０．４０分であり、Ｔ３は１０．４０分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ５１１．８８２であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ８３７８．７８１であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．０６であった。結果を表１に示す。
　また、実施例１－２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図２９に示す。これより、上記測定で溶出時間４．３０～５．３０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
　（比較例６）
　実施例２－１で得られた化合物２３を含有する精製物に代えて、市販の化合物２３を含有するポリエチレングリコール２（和光純薬工業（株）社製、商品名：Ａｍｉｎｏ－ｄＰＥＧＲ１２－ａｃｉｄ）を用いたこと以外は実施例２－２と同様にして（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
　（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
　得られたクロマトグラムを図３０に示す。溶出開始点の溶出時間は８．９０分、溶出終了点の溶出時間は２５．３６分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１９．１１分であり、Ｔ１ａは１８．７２分、Ｔ１ｂは２０．１８分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ１７９７７．８７５であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ１８７５１．０６８であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９６であった。結果を表１に示す。
　（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
　得られたクロマトグラムを図３１に示す。溶出開始点の溶出時間は３．２９分、溶出終了点の溶出時間は２５．３６分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．２８分であり、Ｔ２は５．０９分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ６００．１９９であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ９１１１．８４９であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．０７であった。結果を表１に示す。
　また、実施例２－２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図３２に示す。これより、上記測定で溶出時間４．６０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
　（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
　得られたクロマトグラムを図３３に示す。溶出開始点の溶出時間は７．９０分、溶出終了点の溶出時間は９．４６分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は８．５０分であり、Ｔ３は８．２２分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ９２．９０３であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ１１１６８．９３２であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．０１であった。結果を表１に示す。
　また、実施例２－２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図３４に示す。これより、上記測定で溶出時間４．３０～５．１０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
  
　上記の結果から、比較例１－２～比較例６に用いたサンプル（比較例１－１～４－１で得られた精製物及び市販のポリエチレングリコール１～２）はａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値が０．０２よりも大きく、アミノ基を有さない化合物が不純物として混在していることが確認された。また、比較例４－２～５に用いたサンプル（比較例４－１で得られた精製物及び市販のポリエチレングリコール１）はａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値が０．０２よりも大きく、カルボキシル基を有さない化合物が不純物として混在していることが確認された。
　（実施例１－３）
　実施例１－１の合成例Ｉ－４で得られた化合物８を含有する精製物について、（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定を行った。
　（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定
　逆相クロマトグラフィー測定は、機器に東ソー（株）社製　ビルドＧＰＣシステム　ＨＬＣ－８２２０を、検出器（示差屈折率計）に東ソー（株）社製　ＲＩ－８０２０を、カラムに東ソー（株）社製　ＴＳＫｇｅｌ　ＯＤＳ－８０Ｔｓ　（粒子径　５μｍ、カラムサイズ　４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝５０／５０をそれぞれ用い、流速　０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度　４０℃、サンプル濃度　０．２ｍｇ／ｇ、注入量　４０μＬの条件で行った。
　得られたクロマトグラムを図３５に示す。溶出開始点の溶出時間は１５．００分、溶出終了点の溶出時間は３２．３８分、Ｐ４ｔｏｐの溶出時間は２７．５７分であり、Ｔ４ａは２７．１３分、Ｔ４ｂは２８．６３分であった。ａｒｅａＰ４を算出したところ１６４８１．９８６であり、ａｒｅａＡ４を算出したところ１７１３０．９０５であり、ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４の値は０．９６であった。
　なお、サンプルを含まない展開溶媒のみをインジェクションし、同一条件で測定して得られたクロマトグラムを図３６に示す。これより、上記測定で溶出時間１０．５０分より前に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることを確認した。
　（実施例２－３）
　実施例２－１の合成例ＩＩＩ－４で得られた化合物１８を含有する精製物について、（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定を行った。
　（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定
　展開溶媒を５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝６０／４０に変更したこと以外は、実施例１－３と同様にして測定を行った。得られたクロマトグラムを図３７に示す。溶出開始点の溶出時間は１２．０１分、溶出終了点の溶出時間は１６．３４分、Ｐ４ｔｏｐの溶出時間は１５．２４分であり、Ｔ４ａは１４．９６分、Ｔ４ｂは１５．７８分であった。ａｒｅａＰ４を算出したところ１０８９８．６７２であり、ａｒｅａＡ４を算出したところ１１４２７．９２１であり、ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４の値は０．９５であった。
　また、サンプルを含まない展開溶液のみをインジェクションし、同一条件で測定した結果、上記測定で溶出時間１０．５０分より前に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
　（比較例１－３）
　比較例１－１で得られた比較精製物１－１について、実施例１－３と同様にして（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定を行った。
　（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定
　得られたクロマトグラムを図３８に示す。溶出開始点の溶出時間は８．２０分、溶出終了点の溶出時間は３２．０２分、Ｐ４ｔｏｐの溶出時間は２７．５９分であり、Ｔ４ａは２７．１６分、Ｔ４ｂは２８．６６分であった。ａｒｅａＰ４を算出したところ１６６７７．１７８であり、ａｒｅａＡ４を算出したところ１８３０１．７７５であり、ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４の値は０．９１であった。
　なお、同サンプルを、機器にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５を、検出器（質量分析計）にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ｑｕａｔｔｒｏ　ｍｉｃｒｏ　タンデム型質量分析計を、カラムに東ソー（株）社製　ＴＳＫｇｅｌ　ＯＤＳ－８０Ｔｓ　（粒子径５　μｍ、カラムサイズ　４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５ｍＭ酢酸アンモニウム　メタノール／蒸留水＝１０／９０を、それぞれ用い、流速　０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度　４０℃、サンプル濃度　０．０１ｍｇ／ｇ、注入量　５μＬの条件で測定した。これにより、上記測定で溶出時間８．５２分に検出されたピークは化合物９に由来するピークであることが確認された。
　（実施例３）
　式（１２）中のａが８であり、原子団Ｘがマレイミド基を含む原子団であり、原子団Ｙが活性エステル基を含む原子団である化合物２７の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物２７を合成した。すなわち、先ず、実施例１－１で得られた化合物１３を含有する精製物（化合物１３：　１．００ｇ、２．２６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル　１０ｍＬに溶解し、ここに３－マレイミドプロピオン酸－Ｎ－スクシンイミジル（０．５６ｇ、２．４９ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．２７５ｇ、２．７２ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間攪拌した。３時間後、ＥＳＩ－ＭＳ測定により化合物１３の消費を確認し、反応溶液を減圧濃縮した。残渣に０．１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液　１０ｍＬを加え、ジクロロメタン　１０ｍＬで３回抽出した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、無色透明液体のマレイミド化体を含有する反応生成物を１．２１ｇを得た。
　次いで、前記反応生成物をＤＭＦ　５ｍＬに溶解し、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（０．４７ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（０．２３ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間攪拌した。１８時間後、ＥＳＩ－ＭＳ測定によってマレイミド化体の消費を確認し、酢酸エチル　１５ｍＬを加え、１Ｍ　塩酸　１０ｍＬで２回、飽和食塩水　１０ｍＬで２回有機層を洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、無色透明液体の化合物２７を含有する精製物を得た。
　収量：１．２０ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物２７　７０７．４　［Ｍ＋ＮＨ４］＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：　６．６７　（ｓ，２Ｈ），　３．８０（ｍ，４Ｈ），　３．６０（ｍ，２８Ｈ），　３．４９（ｔ，２Ｈ），　３．３７（ｍ，２Ｈ），　２．８６（ｔ，２Ｈ），　２．８０（ｓ，４Ｈ），　２．４６（ｔ，２Ｈ）。
　（実施例４）
　式（１２）中のａが１２であり、原子団Ｘがヨードアセトアミド基を含む原子団であり、原子団Ｙがカルボキシル基を含む原子団である化合物２８の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物２８を合成した。すなわち、ナスフラスコに実施例２－１で得られた化合物２３を含有する精製物（化合物２３：　１．００ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．１８ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（８ｍＬ）を入れ、溶解させた。混合液を０℃に冷却し、ジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解した、二（ヨード酢酸）無水物（０．６３ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。滴下終了後、反応混合液を室温まで昇温し、遮光下で１８時間反応させた。ＥＳＩ－ＭＳ測定により化合物２３が消失したことを確認し、反応混合液を飽和重曹水　５ｍＬで１回、飽和食塩水　５ｍＬで２回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物２８を含有する精製物を得た。
　収量：１．１６ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物２８　８０３．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　４１０．５［Ｍ＋２ＮＨ４］２＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：　８．０７（ｓ，１Ｈ），　７．２３（ｂｒ　ｓ，１Ｈ），　３．７９（ｔ，２Ｈ），　３．７４（ｓ，２Ｈ），　３．６１（ｍ，４６Ｈ），　３．４８（ｍ，２Ｈ），　２．５６（ｔ，２Ｈ）。
　（実施例５）
　式（１２）中のａが１２であり、原子団Ｘがアルキニル基を含む原子団であり、原子団Ｙがカルボキシル基を含む原子団である化合物２９の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　前記式に示す反応経路のとおり、化合物２９を合成した。すなわち、ナスフラスコに実施例２－１で得られた化合物２３を含有する精製物（化合物２３：　１．００ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．１８ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（８ｍＬ）を入れ、溶解させた。混合液を０℃に冷却し、ジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解した（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－Ｂｉｃｙｃｌｏ［６．１．０］ｎｏｎ－４－ｙｎ－９－ｙｌｍｅｔｈｙｌ　Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｃａｒｂｏｎａｔｅ（０．５２ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。滴下終了後、反応混合液を室温まで昇温し、５時間反応させた。ＥＳＩ－ＭＳ測定により（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－Ｂｉｃｙｃｌｏ［６．１．０］ｎｏｎ－４－ｙｎ－９－ｙｌｍｅｔｈｙｌ　Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｃａｒｂｏｎａｔｅが消失したことを確認し、反応混合液を１Ｍ　塩酸　５ｍＬで２回、飽和食塩水で２回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、白色透明液体の化合物２９を含有する精製物を得た。
　収量：１．１６ｇ
　ＭＳ（ＥＳＩ＋）：　化合物２９　８１１．６［Ｍ＋ＮＨ４］＋、　４１４．８［Ｍ＋２ＮＨ４］２＋
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：　５．２４（ｂｒ　ｓ，１Ｈ），　４．１４（ｄ，２Ｈ），　３．７９（ｔ，２Ｈ），　３．６５（ｍ，４４Ｈ），　３．５６（ｔ，２Ｈ），　３．３３（ｍ，２Ｈ），　２．５６（ｔ，２Ｈ），　２．２５（ｍ，６Ｈ），　１．６０（ｍ，２Ｈ），　１．３５（ｍ，１Ｈ），　０．９５（ｍ，２Ｈ）。
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。
　なお、本願は、２０１５年６月３０日付で出願された日本国特許出願（２０１５－１３１７４４）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
　以上説明したように、本発明によれば、両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基を有し、エチレングリコール鎖長が互いに同じである化合物を、主成分として、特に高純度で含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを提供することが可能となる。このように、本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、エチレングリコール鎖長の異なる化合物や末端官能基が異なる化合物の含有量が少ないという特徴を有するため、ＡＤＣのリンカー材料として用いた場合、エチレングリコール鎖長の異なる化合物に起因するＡＤＣ製造上の問題や医薬品申請上の問題が少なく、また、末端官能基が異なる化合物に起因する、ＡＤＣ製造時の薬剤が２つ結合した化合物や抗体が２つ結合した化合物、更には薬剤又は抗体が結合していない化合物といった薬剤として有効性のない副生成物の生成を十分に抑制することができる。
　さらに、本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等を用いず、分液抽出のみで上記の高純度なヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを製造可能であることから、工業化に特に適した製造方法である。

Claims (9)

  1. 　下記式（１）：
    ＮＨ２－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ　 ・・・（１）
    ［式（１）中、ａは６～４０の整数を示す。］
    で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールにおいて、
    　（Ａ）逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ１とし、ｂａｓｅＬ１から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ１とし、屈折率差最大ピークＰ１の頂点Ｐ１ｔｏｐのｂａｓｅＬ１からの高さをＰ１ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ１ｔｏｐに向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ１Ｌａとし、Ｐ１ＬａとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ａとし、Ｐ１ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ１Ｌｂとし、Ｐ１ＬｂとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ｂとし、ｂａｓｅＬ１から上のＴ１ａからＴ１ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ１としたとき、ａｒｅａＡ１とａｒｅａＰ１とが、下記式（Ｆ１）：
    　　　　ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１≧０．９０　　・・・（Ｆ１）
    で表される条件を満たし、
    　（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ２とし、ｂａｓｅＬ２から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ２とし、屈折率差最大ピークＰ２の頂点Ｐ２ｔｏｐのｂａｓｅＬ２からの高さをＰ２ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ２ｔｏｐに向かうＰ２上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ２からの高さがＰ２ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ２Ｌとし、Ｐ２ＬとｂａｓｅＬ２とが交わる溶出時間をＴ２とし、ｂａｓｅＬ２から上の溶出開始点からＴ２の間のピーク面積をａｒｅａＢ２としたとき、ａｒｅａＢ２とａｒｅａＡ２とが、下記式（Ｆ２）：
    　　　　ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２≦０．０２　　・・・（Ｆ２）
    で表される条件を満たし、かつ、
    　（Ｃ）前記式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを誘導体化し、下記式（２）：
     ｔＢｏｃ－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ
    　　・・・（２）
    ［式（２）中、ｔＢｏｃはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
    で表される化合物を含有する混合物を陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ３とし、ｂａｓｅＬ３から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ３とし、屈折率差最大ピークＰ３の頂点Ｐ３ｔｏｐのｂａｓｅＬ３からの高さをＰ３ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ３ｔｏｐに向かうＰ３上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ３からの高さがＰ３ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ３Ｌとし、Ｐ３ＬとｂａｓｅＬ３とが交わる溶出時間をＴ３とし、ｂａｓｅＬ３から上の溶出開始点からＴ３の間のピーク面積をａｒｅａＢ３としたとき、ａｒｅａＢ３とａｒｅａＡ３とが、下記式（Ｆ３）：
    　　　　ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３≦０．０２　　・・・（Ｆ３）
    で表される条件を満たす、
    ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール。
  2. 　請求項１に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法であり、
    　下記式（３）で表される化合物に下記式（４）で表される化合物を５℃以下の温度条件でマイケル付加反応させ、下記式（５）で表される化合物を得る工程Ａと、
    　　　　ＴｓＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－Ｈ　　・・・（３）
    ［式（３）中、Ｔｓはトシル基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（４）中、Ｒ１は炭素数１～６の炭化水素基を示す。］
    　ＴｓＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯＲ１
    　　・・・（５）
    ［式（５）中、Ｔｓはトシル基を示し、Ｒ１は炭素数１～６の炭化水素基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
    　前記式（５）で表される化合物をフタルイミドカリウムと反応させ、下記式（６）で表される化合物を得る工程Ｂと、
    　ＰＩ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯＲ１
    　　・・・（６）
    ［式（６）中、ＰＩはフタルイミド基を示し、Ｒ１は炭素数１～６の炭化水素基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
    　前記式（６）で表される化合物を脱フタルイミド化し、下記式（７）で表される化合物を得る工程Ｃと、
    　Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯＲ１
    　　・・・（７）
    ［式（７）中、Ｒ１は炭素数１～６の炭化水素基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
    　前記工程Ｃで得られた前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物に分液抽出処理及び酸加水分解処理を施して前記式（１）で表される化合物を含有する前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得る工程Ｄと、
    を含む、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
  3. 　前記式（３）及び（５）～（７）中のａが、それぞれ６～１０の整数であり、
    　前記工程Ｄが、前記分液抽出処理の後に前記酸加水分解処理を施す工程であり、
    　前記分液抽出処理が、前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物に、酸性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する酸洗浄処理を施す洗浄工程（ｗ１）と、前記洗浄工程（ｗ１）の後に前記式（７）で表される化合物を分液抽出する抽出工程（ｅ１）と、を含む処理であり、かつ、
    　前記酸加水分解処理が、前記式（７）で表される化合物を酸加水分解して前記式（１）で表される化合物を含有する前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得る処理である、
    請求項２に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
  4. 　前記式（３）及び（５）～（７）中のａが、それぞれ１１～４０の整数であり、
    　前記工程Ｄが、前記酸加水分解処理の後に前記分液抽出処理を施す工程であり、
    　前記酸加水分解処理が、前記反応生成物中の式（７）で表される化合物を酸加水分解して前記式（１）で表される化合物を含有する反応生成物を得る処理であり、かつ、
    　前記分液抽出処理が、前記式（１）で表される化合物を含有する反応生成物に、酸性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する酸洗浄処理及び塩基性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する塩基洗浄処理を施す洗浄工程（ｗ２）と、前記洗浄工程（ｗ２）の後に前記式（１）で表される化合物を含有する前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを分液抽出する抽出工程（ｅ２）と、を含む処理である、
    請求項２に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
  5. 　下記式（３）：
    　　　　ＴｓＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－Ｈ　　・・・（３）
    ［式（３）中、Ｔｓはトシル基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
    で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体において、
    　（Ｄ）逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ４とし、ｂａｓｅＬ４から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ４とし、屈折率差最大ピークＰ４の頂点Ｐ４ｔｏｐのｂａｓｅＬ４からの高さをＰ４ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ４ｔｏｐに向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ４Ｌａとし、Ｐ４ＬａとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ａとし、Ｐ４ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ４Ｌｂとし、Ｐ４ＬｂとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ｂとし、ｂａｓｅＬ４から上のＴ４ａからＴ４ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ４としたとき、ａｒｅａＡ４とａｒｅａＰ４とが、下記式（Ｆ４）：
    　　　　ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４≧０．９２　　・・・（Ｆ４）
    で表される条件を満たす、
    ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体。
  6. 　請求項５に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法であり、
    　下記式（８）で表される化合物と下記式（９）で表される化合物とを下記式（Ｆ５）で表される条件を満たすように求核置換反応させ、下記式（１０）で表される化合物を得る工程ａと、
    　　　　ＨＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｂ－Ｈ　　・・・（８）
    ［式（８）中、ｂは３～３７の整数を示す。］
    　　　　ＬＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｃ－Ｒ２　　・・・（９）
    ［式（９）中、Ｌはトシル基又はメシル基を示し、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ｃは３～３７の整数を示す。］
    　　　　６≦ｂ＋ｃ≦４０　　・・・（Ｆ５）
    ［式（Ｆ５）中、ｂは式（８）中のｂを示し、ｃは式（９）中のｃを示す。］
    　　　　ＨＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－Ｒ２　　・・・（１０）
    ［式（１０）中、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
    　前記式（１０）で表される化合物をトシル化し、下記式（１１）で表される化合物を得る工程ｂと、
    　　　　ＴｓＯ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－Ｒ２　　・・・（１１）
    ［式（１１）中、Ｔｓはトシル基を示し、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ａは６～４０の整数を示す。］
    　前記式（１１）で表される化合物を脱トリチル化又は脱ベンジル化し、前記式（３）で表される化合物を得る工程ｃと、
    　前記工程ｃで得られた前記式（３）で表される化合物を含有する反応生成物を精製して前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得る工程ｄと、
    を含む、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法。
  7. 　請求項１に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを用いて得られ、かつ、下記式（１２）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール。
    　Ｘ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｙ　　・・・（１２）
    ［式（１２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ、生体機能性分子に存在する官能基と共有結合を形成し得る官能基を含む原子団を示し、原子団Ｘに含まれる官能基と原子団Ｙに含まれる官能基とは互いに異なり、ａは６～４０の整数を示す。］
  8. 　前記式（１２）中の原子団Ｘに含まれる官能基がマレイミド基、アジド基、アルキニル基及びヨードアセトアミド基からなる群から選択される１種の官能基であり、かつ、前記式（１２）中の原子団Ｙに含まれる官能基がカルボキシル基又は活性エステル基からなる群から選択される１種の官能基である請求項７に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール。
  9. 　請求項１に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、又は、請求項７～８のいずれか一項に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを用いて得られ、前記式（１）で表される化合物又は前記式（１２）で表される化合物に、生体機能性分子が結合されてなるヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体。
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