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WO2017076800A1 - Verfahren und messeinrichtung zur bestimmung von blutkörperchen - Google Patents

Verfahren und messeinrichtung zur bestimmung von blutkörperchen Download PDF

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WO2017076800A1
WO2017076800A1 PCT/EP2016/076217 EP2016076217W WO2017076800A1 WO 2017076800 A1 WO2017076800 A1 WO 2017076800A1 EP 2016076217 W EP2016076217 W EP 2016076217W WO 2017076800 A1 WO2017076800 A1 WO 2017076800A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
impedance
frequency
sensor
blood cells
blood
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2016/076217
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter Simon
Dr. Marcin FRANKOWSKI
Dr. Jörg NEUKAMMER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bundesministerium fuer Wirtschaft und Energie
Physikalisch-Technische Bundesanstalt
Original Assignee
Bundesministerium fuer Wirtschaft und Energie
Physikalisch-Technische Bundesanstalt
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bundesministerium fuer Wirtschaft und Energie, Physikalisch-Technische Bundesanstalt filed Critical Bundesministerium fuer Wirtschaft und Energie
Publication of WO2017076800A1 publication Critical patent/WO2017076800A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/1031—Investigating individual particles by measuring electrical or magnetic effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/1023—Microstructural devices for non-optical measurement
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology

Definitions

  • the invention relates to a method for the determination of blood cells in a blood sample in the flow with a sensor for measuring the electrical impedance.
  • the invention further relates to a measuring device for the determination of blood cells with such a method.
  • the determination of blood cells in a blood sample with the determination of the types of blood cells contained in the blood sample comprising red and white blood cells and their subpopulations plays a major role in laboratory medicine.
  • optical and / or electrical flow cytometry is known. M. Frankowski, P. Simon, N. Bock A. El Hasni, U. Schnakenberg, J.
  • Neuclotaneous Optical and Impedance Analysis of Single Cells A Comparison of Two Microfluidic Sensors with Sheath Flow Focusing, in: Engineering Life Sciences 2015, 15, pages 286 to 296 describes a method with a combined analysis of blood samples by flow cytometry as a function of the measured electrical impedance and optical properties of microparticles and blood cells.
  • a microstructured sensor has a capacitive sensor sor Hoch, in which an AC field is built through which the blood sample is passed. Another sensor or sensor area is provided for measuring the electrical impedance of the blood sample or a reference medium without blood cells to determine from the difference signal of the two sensors caused by the blood cells impedance change.
  • the subpopulations of granulocytes, monocytes and white blood cell lymphocytes (leucocytes) can be determined from impedance events with characteristic absolute impedance magnitudes at two different frequencies.
  • the object of the present invention is therefore an improved method for the determination of blood corpuscles in a blood sample in the flow with a sensor. to create sensor for measuring the electrical impedance and a corresponding measuring device.
  • the procedure for the determination of blood corpuscles has the steps:
  • Differentiation of the different types of blood cells in a blood sample and determination of the concentration of the individual types of blood cells in the blood sample is possible by means of an electrical flow cytometry in an alternating voltage field using two different frequencies of the alternating voltage field.
  • the blood sample is not subjected to any previous hemolysis.
  • the different types of blood cells can be much better differentiated by the ratio of imaginary part to real part of the impedance of the same volume part of the blood sample at different frequencies. This is especially true for the granulocytes and monocytes, which otherwise can not be differentiated sufficiently without hemolysis using electrical flow cytometry.
  • Z11 at the first frequency is dominated by the real part, ie that the imaginary part lm (Z1) at the first frequency is substantially smaller (eg smaller than 80%) than the real part Re (Z1), then, for the real part Re (Z1), the amount of impedance at the first frequency
  • the impedance at the second frequency can be used when the imaginary part lm (Z2) dominates the real part Re (Z2) at the second frequency (e.g., greater than 80%). Then the ratio lm (Z2) / Re (Z1) can be determined by the ratio
  • a count of values can be carried out, for example, for the individual types Blood cells are characteristic value ranges. This can be used to determine the number of different types of blood cells and their concentration in the blood sample.
  • the object is also achieved by the method for the determination of blood cells in a blood sample in flow with an electrical impedance sensor in that the electrical impedance of the same volume part of the blood sample with a first frequency in the range of 1 MHz to 6 MHz and with a second frequency is carried out in the range of 6 MHz to 15 MHz.
  • the smaller first frequency range improves the selectivity for detecting the small-volume blood bodies, in particular the platelets, while the larger second frequency range is optimized for differentiating the large-volume blood cells, ie the white blood cells and their subpopulations. If the electrical impedances in these two measurement areas are correlated with each other, there is an improved differentiability of the different types of blood cells and their number or concentration in the blood sample.
  • impedance change events are counted in which the impedance change or the ratio of the imaginary part of the impedance at the second frequency to the real part of the impedance at the first frequency exceeds a predetermined threshold value, and the types of blood corpuscles and their number or concentration in the blood sample is determined as a function of the number of impedance change events.
  • the threshold may be a single limit or may include a range of values having a lower and upper limit.
  • simultaneous passage of the hemolysis-free blood sample with blood cells contained therein is effected by an AC voltage field of a first sensor and passing a comparison medium through an AC voltage field of a second sensor. Then, the impedance difference between the electrical impedance simultaneously measured with the first and second sensors is determined.
  • the types of blood cells in the AC field of the first sensor may be determined depending on the ratio of the imaginary part of the impedance difference at the second frequency to the real part of the impedance difference at the first frequency.
  • the at least one sensor Before the blood sample is passed through the at least one sensor, it is preferable to dilute the hemolysis-free blood sample with an aqueous solution.
  • the blood sample is free of hemolysis by no hemolysis is performed before passing through the at least one sensor.
  • the second frequency for measuring the electrical impedance is preferably greater than the first frequency.
  • the first frequency can advantageously be in the range of 1 MHz to 6 MHz, and particularly preferably 2.3 MHz.
  • the second frequency may advantageously be in the range of 6 MHz to 15 MHz and preferably 10.1 MHz.
  • Particularly advantageous is a differentiation of the types of blood cells, which are passed through the sensor, further depending on the amount of electrical impedance or impedance change, which was measured at a frequency.
  • the amount of the electrical impedance change is in this case proportional to the difference between the amount of the electrical impedance of the blood sample and blood cells to the amount of the electrical impedance of the reference medium or the blood sample without blood cells, which are measured in alternating voltage fields with the same frequency. It is advantageous if the impedance of the comparison medium in a second sensor is determined simultaneously or immediately thereafter with the measurement of the electrical impedance of the blood sample.
  • a comparison medium is passed through this sensor with the same sensor provided for measuring the electrical impedance of the blood sample prior to the measurement of the electrical impedance of the blood sample or after this measurement in order to determine the electrical impedance of the comparison medium ,
  • the hemolysis-free blood sample itself is advantageously suitable as a comparison medium, if it is adjusted by dilution in such a way that the distance between two blood statistically larger than the distance between two successive sensor areas. If, in a first sensor region, the impedance changes due to the presence of a blood cell, the difference to the impedance value can be formed in the second sensor, which statistically reproduces the impedance of the same blood sample without blood corpuscles.
  • microstructured flow cytometric sensors may have planar electrodes formed in platinum, which are mounted perpendicular to the direction of flow and typically have a capacitor plate spacing of in the range of about 30 ⁇ to 10 ⁇ and preferably of about 15 ⁇ +/- 5 ⁇ .
  • a diluted standard blood serum or the aqueous solution used to dilute the blood sample can also be used as the comparison medium. Since the comparison medium generally has a constant characteristic, the electrical impedance value measured with the comparison medium and its imaginary and real part do not change over the time at the at least two frequencies or can be taken into account as a constant comparison value. This constant comparison value can be determined by averaging comprising the option of determining the median.
  • a determination of the amount of small-volume blood cells which include the type of platelets, succeeds particularly advantageous if as a characteristic measure the ratio of the imaginary part of the impedance or impedance change at the first frequency to the real part of the impedance or relative to the relative electrical impedance at the second frequency Impedance change at the first frequency is used.
  • the ratio of the imaginary part of the impedance to the real part of the impedance is thus plotted against the relative electrical impedance at the first frequency, ie the amount of the impedance or impedance change.
  • a determination of the amount of large-volume blood cells which include the type of red blood cells and leukocytes with their subpopulation of granulocytes, monocytes and lymphocytes succeeds particularly advantageous if the ratio of the imaginary part of the impedance or impedance change at the second frequency to the real part of the impedance or Impedance change at the first frequency is related to the relative electrical impedance at the second frequency.
  • the ratio of the imaginary part to the real part of the impedance or impedance change at the different frequencies is thus plotted against the relative electrical impedance at the second frequency.
  • the measuring device is set up to carry out the method described above.
  • the evaluation unit may be, for example, a programmable arithmetic unit which is suitably programmed.
  • FIG. 1 shows a sketch of a measuring device 1 for determining blood corpuscles 2 in a flow cytometric sensor 3.
  • FIG. 1 shows a sketch of a diagram of the opacity over the relative impedance amount at the second frequency with the area of the lymphocytes, monocytes and granulocytes. It can be seen that the blood sample is passed in the direction of the arrow through a microstructured channel 4.
  • the microstructured channel 4 are two sensors 5a, 5b introduced at a distance from each other, the two at a distance in a range of about 30 ⁇ to 10 ⁇ and preferably 15 ⁇ +/- 5 ⁇ in the Have channel 4 spaced electrodes 6, between which by means of an AC generator / AC generator 7, an AC field 8 is established.
  • One of the electrodes 6 of a sensor 5a, 5b is connected to the alternator 7 and the opposite electrode 6 is connected to a respective amplifier 9a, 9b.
  • the outputs of the two amplifiers 9a, 9b are supplied to the input of a differential amplifier 10, in whose output an evaluation unit 1 1 is connected.
  • the evaluation unit 11 may, for example, be a programmable arithmetic unit.
  • the evaluation unit 1 1 may have an analog-to-digital converter. It is also conceivable that between the output of the differential amplifier 10 and the evaluation unit 1 1, a separate analog-to-digital converter is turned on.
  • the evaluation unit 1 1 can also have a further multi-frequency two-phase lock-in amplifier, the ac in the form of a sine wave signal applied directly to the electrode plates 6 or generates a synchronization signal S for synchronization of the alternator 7 for generating an AC field 8 ,
  • the hemolysis-free blood sample is adjusted by dilution to the distance between the two sensors 5a, 5b, that statistically only one blood cell 2 in the blood sample in only one of the two sensors 5a, 5b connected in series.
  • the impedance change caused by the blood corpuscles 2 in the sensor 5a / 5b is detected and output at the output of the differential amplifier 10.
  • the evaluation unit 1 1 is now set up in hardware or by suitable programming as an FPGA, ASIC or microcontroller so that it detects not only the amount of electrical impedance of the sensors 5 a, 5 b but also the real part of the impedance and the imaginary part of the impedance.
  • the measuring device 1 is furthermore set up such that the sensors 5a, 5b determine the impedance of the same volume part of a blood sample with at least two different frequencies.
  • the first frequency preferably a frequency in the range of 1 MHz to 6 MHz is selected.
  • the first frequency is particularly preferably 2.3 MHz.
  • a frequency in the range of 6 MHz to 15 MHz is selected. It is preferably at 10.1 MHz.
  • FIG. 2 shows a sketch of a section of the sensor region of a sensor 5a / 5b.
  • the electrodes 6 of the sensor are preferably applied from platinum to a microstructured substrate.
  • the channel 4 is introduced, through which the blood sample is passed in the direction of the arrow.
  • the electrodes 6 cross the channel and are aligned as shown as planar electrodes perpendicular to the flow direction. You have a distance of about 30 m to 10 ⁇ and preferably at about 15 ⁇ +/- 5 ⁇ each other.
  • FIG. 3 shows a diagram of an exemplary measurement result with the measuring device 1 from FIG. 1 after passage of a hemolysis-free blood sample.
  • the first frequency is 2.3 MHz and the second frequency is 10.1 MHz.
  • the ratio of the impedance Lm (Z2) of the electric impedance at the second frequency to the real part Re (Zi) of the electric impedance at the first frequency is the amount of the relative electrical impedance
  • the relative impedance is understood to mean that this is not calibrated in ohms. The same also applies to the imaginary part and the real part of the electrical impedance, where due to the quotient calibration in a Si measuring unit is even less significant.
  • thrombocytes Plt occupy a relatively large field in addition to the noise region, but they are relatively sharp in this noise component as well as in the noise adjacent red blood cells RBC and leukocytes with their subpo- pulations of lymphocytes Ly, monocytes M and granulocytes Gn separated.
  • the platelets Plt are no longer so sharply separated from the noise signal Noise.
  • the red blood cells i. Erythrocytes RBC and sub-population of leukocytes sharply separated.
  • FIG. 5 shows a detail from the diagram of FIG. 4 in the region of the subpopulation of the leukocytes. It can be seen that the statistical distribution of the cell events for the lymphocytes Ly, the monocytes M and the granulocytes Gn are sufficiently differentiated from one another in characteristic value ranges.
  • FIG. 6 shows, for the same measurement results, an evaluation of the opacity over the amount of the relative impedance at the second frequency.
  • the opacity is the ratio of the magnitude of the impedance at the second frequency to the magnitude of the impedance at the first frequency. It becomes clear that the opacity in particular causes the monocytes M and granulocytes Gn to merge into one another and also that the distance to the lymphocytes Ly is no longer so sharp. This makes it clear that by determining the types of blood corpuscles for determining the respective concentration in the blood sample or for differentiation for another purpose, an evaluation as a function of the ratio of the imaginary part of the electrical impedance at the second frequency to the real part of the electrical impedance at the first frequency leads to better results.
  • the blood cells or cells of the blood sample when passing through the electrode pairs, produce impedance changes that are proportional to the volume of the cells, the capacity of their membrane and the conductivity of the cytoplasm. Their respective amounts depend on the selected frequency.
  • the ratio lm (Z2) / Re (Zi) from the imaginary part of the impedance (Z2) at a suitable second frequency h and the real part of the impedance Z1 at the first frequency fi is proportional to the capacity of the cell of the corpuscle per unit volume.
  • two pairs of electrodes 6 are implemented for the purpose of differential measurement.
  • the isotonic solution in which the blood cells are located is measured once with and once without a cell.
  • the difference between the two signals thus contains only the amount of impedance change caused by the cell, i. the blood cell is caused.
  • erythrocytes represent the vast majority of blood cells and with a diameter of 7.5 ⁇ are much larger than thrombocytes with a diameter in the range 1 to 3 ⁇ , a differentiation only with the electrical impedance measurement itself is very difficult.
  • the leucocytes have a size of about 8 to 15 ⁇ a comparable size to the erythrocytes.
  • the impedance change caused by the capacity of the respective blood body is related to the change in impedance caused by the volume of the respective blood body.
  • a pulse height analysis is carried out in which the maximum values or, depending on the polar direction, the minimum values are used as relevant impedance change events in order to calculate the impedances and impedance ratios for these events.
  • the blood sample To prepare the blood sample, it is diluted appropriately with an aqueous solution to match the counts of the cells to the electronic assemblies and the data acquisition. Counting rates of 1 to 10 kHz are typical.
  • a calibration of the identification of blood particles by means of an AC frequency scan in the range of 300 kHz to 100 MHz for the blood of one species and a further, independent method can be performed.
  • Such a calibration can be carried out with the aid of the two-dimensional representation corresponding to FIGS. 3 to 5.

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Abstract

Ein Verfahren zur Bestimmung von Blutkörperchen (2) in einer Blutprobe im Durchfluss mit einem Sensor (5a, 5b) zur Messung der elektrischen Impedanz wird beschrieben. Das Verfahren hat die Schritte: Durchleiten der hämolysefreien Blutprobe mit darin enthaltenen Blutkörperchen (2) durch ein Wechselspannungsfeld (8) des Sensors (5a, 5b), Messen der elektrischen Impedanz der einzelnen Blutkörperchen (2) in der Blutprobe mit dem Sensor (5a, 5b), wobei die elektrische Impedanz mit mindestens zwei unterschiedlichen Messfrequenzen des Wechselspannungsfeldes (8) gemessen wird, und Bestimmen der Arten der im Wechselspannungsfeld (8) des Sensors (5a, 5b) befindlichen Blutkörperchen (2) in Abhängigkeit einer Korrelation der mit einer ersten Frequenz (Re(Z 1)) im Bereich von 1 MHz bis 6 MHz und mit einer zweiten Frequenz (Im(Z 2)) im Bereich von 6 MHz bis 15 MHz gemessenen elektrischen Impedanz desselben Volumenbereichs der Blutprobe.

Description

Verfahren und Messeinrichtung zur Bestimmung von Blutkörperchen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestinnnnung von Blutkörperchen in einer Blutprobe im Durchfluss mit einem Sensor zur Messung der elektrischen Impedanz.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Messvorrichtung zur Bestimmung von Blutkörperchen mit einem solchen Verfahren.
Die Bestimmung von Blutkörperchen in einer Blutprobe mit der Bestimmung der in der Blutprobe enthaltenen Arten von Blutkörperchen umfassend rote und weiße Blutkörperchen und ihre Subpopulationen spielt in der Labormedizin eine große Rolle. Hierbei besteht ein Bedarf insbesondere die Anzahl der unterschiedlichen Arten von Blutkörperchen in einer Blutprobe zu bestimmen und die verschiedenen Arten von Blutkörperchen in der Blutprobe voneinander zu differenzieren. Hierzu ist die Nutzung der optischen und/oder elektrischen Durchflusszytometrie bekannt. In M. Frankowski, P.Simon, N.Bock A. El Hasni, U. Schnakenberg, J. Neukammer: Simultaneous optical and impedance analysis of Single cells: A comparison of two microfluidic sensors with sheath flow focusing, in: Engineering Life Sciences 2015, 15, Seiten 286 bis 296 ist ein Verfahren mit einer kombinierten Analyse von Blutproben mittels Durchflusszytometrie in Abhängigkeit von der gemessenen elektrischen Impedanz und von optischen Eigenschaften von Mikropartikeln und Blutzellen beschrieben. Ein mikrostrukturierter Sensor hat einen kapazitiven Sen- sorbereich, in dem ein Wechselspannungsfeld aufgebaut wird durch das die Blutprobe durchgeleitet wird. Ein weiterer Sensor oder Sensorbereich ist zur Messung der elektrischen Impedanz der Blutprobe oder eines Vergleichsmediums ohne Blutkörperchen vorgesehen, um aus dem Differenzsignal der beiden Sensoren eine durch die Blutkörperchen verursachte Impedanzänderung zu bestimmen. Die Subpopulationen der Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten der weißen Blutkörperchen (Leukozyten) lassen sich anhand von Impedanzereignissen mit charakteristischen absoluten Impedanzgrößen bei zwei verschiedenen Frequenzen bestimmen.
J. Chen, Ch. Xue, Y. Zhao, D. Chen, M-H. Wu und J. Wang: Microfluidic Impe- dance Flow Cytometry Enabling High-Throughput Single-Cell Electrical Property Characterization, in: International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16, S. 9804-9830 beschreiben die aktuellen Entwicklungen in der Durchfluß-Impedanz- zytometrie zur Charakterisierung einzelner Zellen. Eine hinreichende Differenzierung der Bestandteile einer Blutprobe mit Hilfe der Impedanzanalyse ist bislang nur in Kombination mit weiteren unterschiedlichen Methoden möglich, wobei insbesondere die Lasertechnik eingesetzt wird. Ein Problem bei der Messung der Konzentration der Subpopulation von Leukozyten nach dem klinischen Standard-Protokoll besteht darin, dass zunächst eine Hämolyse durchgeführt werden muss. Dabei müssen die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) zuerst aufgelöst werden. Die nachfolgende Bestimmung der Konzentration von Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten kann bei bestimmten Patientengruppen zu nicht akzeptablen Ungenauigkeiten führen, da durch den Hämolyseprozess die Leukozyten ebenfalls in Mitleidenschaft gezogen werden können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung von Blutkörperchen in einer Blutprobe im Durchfluss mit einem Sen- sor zur Messung der elektrischen Impedanz sowie eine entsprechende Messvorrichtung zu schaffen.
Die Aufgabe wird durch die Verfahren mit den Merkmalen der Ansprüche 1 und 2 sowie durch die Messvorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 12 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen beschrieben.
Das Verfahren zur Bestimmung von Blutkörperchen hat die Schritte:
Durchleiten der hämolysefreien Blutprobe mit darin enthaltenen Blutkörper- chen durch ein Wechselspannungsfeld des Sensors,
Messen der elektrischen Impedanz der Blutprobe bzw. der einzelnen Blutkörperchen in der Blutprobe mit dem Sensor, wobei die elektrische Impedanz mit mindestens zwei unterschiedlichen Messfrequenzen des Wechselspannungsfeldes gemessen wird,
- Bestimmen der Arten der im Wechselspannungsfeld des Sensors befindlichen Blutkörperchen in Abhängigkeit von dem Verhältnis des Imaginärteils der Impedanz bei einer zweiten Frequenz zu dem Realteil der Impedanz bei einer ersten Frequenz, die von der zweiten Frequenz unterschiedlich ist.
Eine Differenzierung der unterschiedlichen Arten von Blutkörperchen in einer Blutprobe sowie eine Bestimmung der Konzentration der einzelnen Arten von Blutkörperchen in der Blutprobe ist mit Hilfe einer elektrischen Durchflusszyto- metrie in einem Wechselspannungsfeld unter Verwendung von zwei unterschied- liehen Frequenzen des Wechselspannungsfeldes möglich. Dabei wird die Blutprobe keiner vorhergehenden Hämolyse unterzogen.
Eine Differenzierung der unterschiedlichen Arten von Blutkörperchen in der Blutprobe gelingt trotzdem dadurch, dass das Verhältnis des Imaginärteils der Impe- danz bei einer zweiten Frequenz zu dem Realteil der Impedanz bei einer ersten Frequenz, die von der zweiten Frequenz unterschiedlich ist, gebildet wird . Es hat sich gezeigt, dass auch bei einer hämolysefreien Blutprobe dieses Verhältnis zwischen dem Imaginärteil und dem Realteil (oder des Kehrwertes) ein charakteristisches Maß für die jeweils im Wechselspannungsfeld befindliche Art von Blutkörperchen der Blutprobe ist. Damit kann ohne eine vorhergehende Hämolyse und ohne Beeinträchtigung der Blutprobe eine sehr schnelle und genaue Bestimmung der Blutkörperchen in der Blutprobe erfolgen. Anders als mit der Opazität als Verhältnis der Impedanzbeträge bei zwei unterschiedlichen Frequenzen lassen sich die unterschiedlichen Arten von Blutkörperchen mit dem Verhältnis von Imaginärteil zu Realteil der Impedanz desselben Volumenteils der Blutprobe bei unter- schiedlichen Frequenzen wesentlich besser differenzieren. Dies gilt ganz besonders für die Granulozyten und Monozyten, die sich ohne Hämolyse mit der elektrischen Durchflusszytometrie ansonsten nicht ausreichend voneinander differenzieren lassen. Für den Fall, dass der Betrag der Impedanz |Z11 bei der ersten Frequenz von dem Realteil dominiert wird, d.h. dass der Imaginärteil lm(Z1 ) bei der ersten Frequenz wesentlich kleiner (z.B. kleiner 80%) als der Realteil Re(Z1 ) ist, dann kann für den Realteil Re(Z1 ) auch der Betrag der Impedanz bei der ersten Frequenz |Z1 | eingesetzt werden. Das heißt, dass das Verhältnis lm(Z2)/Re(Z1 ) durch das Verhält- nis lm(Z2)/|Z1 | ersetzt wird . Es gilt schließlich |Z1 |=sqrt(lm(Z1 )A2+Re(Z1 )Λ2). Wenn der Imaginärteil sehr klein ist, gilt |Z1 |=sqrt(Re(Z1 )A2)=Re(Z1 )
Das gleiche gilt sinngemäß auch für den Imäginärteil lm(Z2) bei der zweiten Frequenz, für den mit guter Näherung der Betrag |Z2| der Impedanz bei der zweiten Frequenz eingesetzt werden kann, wenn der Imaginärteil lm(Z2) den Realteil Re(Z2) bei der zweiten Frequenz dominiert (z.B. größer als 80% ist). Dann kann das Verhältnis lm(Z2)/Re(Z1 ) durch das Verhältnis |Z2|/Re(Z1 ) ermittelt werden.
Die Bestimmung der Arten der jeweils im Wechselspannungsfeld des Sensors befindlichen Blutkörperchen erfolgt im Durchfluss, während die Blutprobe durch das Wechselspannungsfeld geleitet wird. Damit kann für eine Menge der Blutprobe aus der zeitlichen Signale der elektrischen Impedanz und der hieraus zu einer Vielzahl von Zeitpunkten gebildeten Verhältnisse des Imaginärteils der Impedanz zum Realteil der Impedanz bei den unterschiedlichen Frequenzen z.B. eine Zählung von Werten erfolgen, die in für die einzelnen Arten von Blutkörperchen charakteristischen Wertebereichen liegen. Damit lassen sich die Anzahl der unterschiedlichen Arten von Blutkörperchen und ihre Konzentration in der Blutprobe ermitteln.
Dies gelingt auch unter Berücksichtigung der weißen Blutkörperchen ausschließlich durch eine Impedanzmessung ohne die bislang erforderliche Kombination mit anderen Methoden, insbesondere mit optischen Messverfahren und einer Hämo- lyse, so dass ein sehr einfaches und apparativ weniger aufwendiges Messverfahren möglich ist.
Die Aufgabe wird auch durch das Verfahren zur Bestimmung von Blutkörperchen in einer Blutprobe im Durchfluss mit einem Sensor zur Messung der elektrischen Impedanz dadurch gelöst, dass die elektrische Impedanz desselben Volumenteils der Blutprobe mit einer ersten Frequenz im Bereich von 1 MHz bis 6 MHz und mit einer zweiten Frequenz im Bereich von 6 MHz bis 15 MHz durchgeführt wird.
Es hat sich gezeigt, dass sich mit diesen beiden Frequenzbereichen ebenfalls eine verbesserte Differenzierung der unterschiedlichen Arten von Blutkörperchen in der Blutprobe realisiert werden kann. Der kleinere erste Frequenzbereich ver- bessert die Trennschärfe zur Erfassung der kleinvolumigen Blutkörper, wie insbesondere der Thrombozyten, während der größere zweite Frequenzbereich zur Differenzierung der großvolumigen Blutkörperchen, d.h. der weißen Blutkörperchen und ihrer Subpopulationen optimiert ist. Wenn die elektrischen Impedanzen in diesen zwei Messbereichen miteinander korreliert werden, ergibt sich eine ver- besserte Differenzierbarkeit der unterschiedlichen Arten von Blutkörperchen und ihrer Anzahl bzw. Konzentration in der Blutprobe. Vorteilhaft ist es, wenn Impedanzänderungs-Ereignisse gezählt werden, bei dem die Impedanzänderung oder das Verhältnis des Imaginärteils der Impedanz bei der zweiten Frequenz zu dem Realteil der Impedanz bei der ersten Frequenz ei- nen vorgegebenen Schwellwert überschreitet, und die Arten von Blutkörperchen sowie ihre Anzahl bzw. Konzentration in der Blutprobe in Abhängigkeit von der Anzahl von Impedanzänderungs-Ereignissen bestimmt wird. Der Schwellwert kann ein einziger Grenzwert sein oder einen Wertebereich mit einem unteren und oberen Grenzwert umfassen.
Vorteilhaft ist es, wenn ein gleichzeitiges Durchleiten der hämolysefreien Blutprobe mit darin enthaltenen Blutkörperchen durch ein Wechselspannungsfeld eines ersten Sensors und Durchleiten eines Vergleichsmediums durch ein Wechselspannungsfeld eines zweiten Sensors erfolgt. Dann wird die Impedanzdiffe- renz zwischen dem mit dem ersten und zweiten Sensor gleichzeitig gemessenen elektrischen Impedanz bestimmt. Die Arten der im Wechselspannungsfeld des ersten Sensors befindlichen Blutkörperchen können einen in Abhängigkeit von dem Verhältnis des Imaginärteils der Impedanzdifferenz bei der zweiten Frequenz zu dem Realteil der Impedanzdifferenz bei der ersten Frequenz bestimmt werden. Mit Hilfe der gleichzeitigen Messung der elektrischen Impedanz eines Vergleichsmediums lässt sich somit die durch die Blutkörperchen verursachten Impedanzänderungen auf zuverlässige und einfache Weise differenzieren.
Vor dem Durchleiten der Blutprobe durch den mindestens einen Sensor erfolgt vorzugsweise ein Verdünnen der hämolysefreien Blutprobe mit einer wässrigen Lösung. Die Blutprobe ist dabei hämolysefrei, indem keine Hämolyse vor dem Durchleiten durch den mindestens einen Sensor durchgeführt wird.
Mit Hilfe der Verdünnung mit der wässrigen Lösung kann die Blutprobe eingestellt werden, um die Zählraten der Zellen an die verfügbaren elektronischen Baugruppen und die Datenerfassung anzupassen . Die zweite Frequenz zum Messen der elektrischen Impedanz ist vorzugsweise größer als die erste Frequenz. So kann die erste Frequenz vorteilhaft im Bereich von 1 MHz bis 6 MHz liegen und besonders bevorzugt 2,3 MHz betragen. Die zweite Frequenz kann vorteilhaft im Bereich von 6 MHz bis 15 MHz liegen und bevorzugt 10,1 MHz betragen.
Eine Messung der elektrischen Impedanz mit der Durchflusszytometrie in diesen Frequenzbereichen führt zu besonders zuverlässigen und genauen Ergebnissen.
Besonders vorteilhaft ist eine Differenzierung der Arten von Blutkörperchen, die durch den Sensor durchgeleitet werden, weiterhin in Abhängigkeit des Betrages der elektrischen Impedanz oder Impedanzänderung, die bei einer Frequenz gemessen wurde. Der Betrag der elektrischen Impedanzänderung ist dabei propor- tional zu der Differenz des Betrages der elektrischen Impedanz der Blutprobe mit Blutkörperchen zu dem Betrag der elektrischen Impedanz des Vergleichsmediums bzw. der Blutprobe ohne Blutkörperchen, die in Wechselspannungsfeldern mit derselben Frequenz gemessen werden. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Impedanz des Vergleichsmediums in einem zweiten Sensor gleichzeitig bzw. unmittelbar danach mit der Messung der elektrischen Impedanz der Blutprobe bestimmt wird. Grundsätzlich ist aber auch für alle vorgenannten Ausführungsformen denkbar, dass mit demselben zur Messung der elektrischen Impedanz der Blutprobe vorgesehenen Sensor vor der Messung der elektrischen Impedanz der Blutprobe oder nach dieser Messung ein Vergleichsmedium durch diesen Sensor geleitet wird, um die elektrische Impedanz des Vergleichsmediums zu bestimmen.
Als Vergleichsmedium eignet sich vorteilhaft die hämolysefreie Blutprobe selbst, wenn diese durch Verdünnung so eingestellt ist, dass der Abstand zweier Blut- körperchen statistisch immer größer als der Abstand von zwei hintereinander liegenden Sensorbereichen ist. Wenn sich nun in einem ersten Sensorbereich die Impedanz durch die Anwesenheit eines Blutkörperchens ändert kann die Differenz zu dem Impedanzwert im zweiten Sensor gebildet werden, der statistisch die Impedanz derselben Blutprobe ohne Blutkörperchen wiedergibt. Eine solche Differenzmessung wird insbesondere mit mikrostrukturierten durchflusszytometri- schen Sensoren ermöglicht. Diese können in Platin ausgeführte planare Elektroden haben, die senkrecht zur Durchflussrichtung angebracht sind und typischerweise einen Kondensatorplattenabstand von im Bereich von etwa 30 μιτι bis 10 μιτι und bevorzugt von etwa 15 μιτι +/- 5 μιτι aufweisen.
Als Vergleichsmedium kann aber unter Umständen auch ein verdünntes Standard-Blutserum oder die zur Verdünnung der Blutprobe genutzte wässrige Lösung eingesetzt werden. Da das Vergleichsmedium in der Regel eine gleichbleibende Eigenschaft hat, ändert sich mit dem Vergleichsmedium gemessene elektrische Impedanzwert und dessen Imaginär- und Realteil bei den mindestens zwei Frequenzen über die Zeit nicht bzw. kann als konstanter Vergleichswert berücksichtigt werden. Dieser konstante Vergleichswert kann durch Mittelwertbildung umfassend die Option der Bestimmung des Medians bestimmt werden.
Eine Bestimmung der Menge kleinvolumiger Blutkörperchen, welche die Art der Thrombozyten umfassen, gelingt besonders vorteilhaft, wenn als charakteristisches Maß das auf die relative elektrische Impedanz bei der zweiten Frequenz bezogene Verhältnis des Imaginärteils der Impedanz oder Impedanzänderung bei der ersten Frequenz zu dem Realteil der Impedanz oder Impedanzänderung bei der ersten Frequenz herangezogen wird. Das Verhältnis des Imaginärteils der Impedanz zum Realteil der Impedanz wird somit auf die relative elektrische Impedanz bei der ersten Frequenz, d.h. auf den Betrag der Impedanz bzw. Impedanzänderung aufgetragen. Damit gelingt es, die kleinvolumigen Blutkörperchen charakterisierenden Messwerte schärfer von Rauschanteilen zu trennen. Eine Bestimmung der Menge großvolumiger Blutkörperchen, welche die Art der roten Blutkörperchen und der Leukozyten mit ihren Subpopulation der Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten umfassen, gelingt besonders vorteilhaft, wenn das Verhältnis des Imaginärteils der Impedanz oder Impedanzänderung bei der zweiten Frequenz zu dem Realteil der Impedanz oder Impedanzänderung bei der ersten Frequenz auf die relative elektrische Impedanz bei der zweiten Frequenz bezogen wird. Hierbei wird somit das Verhältnis des Imaginärteils zum Realteil der Impedanz oder Impedanzänderung bei den unterschiedlichen Frequenzen auf die relative elektrische Impedanz bei der zweiten Frequenz aufgetragen. Dies führt zur charakteristischen Wertebereichen, bei den sich die Subpopulationen der Arten von roten Blutkörperchen und die Erythrozyten selbst sehr gut voneinander unterscheiden lassen.
Die Messvorrichtung ist zur Durchführung des vorbeschriebenen Verfahrens ein- gerichtet. Hierzu kann die Auswerteeinheit beispielsweise eine programmierbare Recheneinheit sein, die geeignet programmiert ist.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels mit den beigefügen Zeichnungen näher erläutert.
Blockdiagramm einer Messvorrichtung zur Bestimmung von Blutkörperchen in einer Blutprobe;
Skizze eines Ausschnitts eines Sensorbereichs der Messvorrichtung aus Figur 1 ;
beispielhaftes Diagramm des Verhältnisses des Imaginärteils der elektrischen Impedanz bei der zweiten Frequenz zum Realteil der elektrischen Impedanz bei der ersten Frequenz über den relativen Impedanzbetrag bei der ersten Frequenz;
beispielhaftes Diagramm des Verhältnisses des Imaginärteils der elektrischen Impedanz bei der zweiten Frequenz zum Realteil der elektrischen Impedanz bei der ersten Frequenz über den relativen Impedanzbetrag bei der zweiten Frequenz;
Ausschnittsdarstellung des Bereichs der Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten aus dem Diagramm aus Figur 4;
Ausschnittsdarstellung eines Diagramms der Opazität über den relativen Impedanzbetrag bei der zweiten Frequenz mit dem Bereich der Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten im Vergleich zur Auswertung nach Figur 5. Figur 1 lässt eine Skizze einer Messvorrichtung 1 zur Bestimmung von Blutkörperchen 2 in einem durchflusszytometrischen Sensor 3 erkennen. Es wird deutlich, dass die Blutprobe in Pfeilrichtung durch einen mikrostrukturierten Kanal 4 geleitet wird. In dem mikrostrukturierten Kanal 4 sind mit einem Abstand voneinander zwei Sensoren 5a, 5b eingebracht, die zwei in einem Abstand in einem Bereich von etwa 30 μιτι bis 10 μιτι und bevorzugt von 15μηη +/- 5 μιτι in dem Kanal 4 voneinander platzierte Elektroden 6 haben, zwischen denen mit Hilfe eines Wechselstromgenerators/Wechselspannungsgenerators 7 ein Wechselspannungsfeld 8 aufgebaut wird. Eine der Elektroden 6 eines Sensors 5a, 5b ist mit dem Wechselstromgenerator 7 und die gegenüberliegende Elektrode 6 mit jeweils einem Verstärker 9a, 9b verbunden. Die Ausgänge der beiden Verstärker 9a, 9b werden dem Eingang eines Differenzverstärkers 10 zugeführt, in dessen Ausgang eine Auswerteeinheit 1 1 angeschlossen ist. Die Auswerteeinheit 1 1 kann bspw. eine programmierbare Recheneinheit sein. Die Auswerteeinheit 1 1 kann einen Analog-Digital-Wandler haben. Denkbar ist aber auch, dass zwischen dem Aus- gang des Differenzverstärkers 10 und der Auswerteeinheit 1 1 ein separater Analog-Digital-Wandler eingeschaltet ist. Die Auswerteeinheit 1 1 kann auch einen weiteren Mehrfrequenz-zwei Phasen-Lock-in Verstärker haben, der ein Wechselspannungssignal AC bspw. in Form eines Sinussignals auf die Elektrodenplatten 6 direkt beaufschlagt oder ein Synchronisationssignal S zur Synchronisation des Wechselstromgenerators 7 zur Erzeugung eines Wechselspannungsfeldes 8 erzeugt.
Deutlich wird, dass die hämolysefreie Blutprobe durch Verdünnung so auf den Abstand der beiden Sensoren 5a, 5b eingestellt ist, dass statistisch immer nur ein Blutkörperchen 2 in der Blutprobe nur in einem der beiden hintereinander geschalteten Sensoren 5a, 5b vorhanden ist. Damit wird durch die Differenzbildung mit dem Differenzverstärker 10 die durch das Blutkörperchen 2 im Sensor 5a/5b verursachte Impedanzänderung erfasst und am Ausgang des Differenzverstärkers 10 ausgegeben. Die Auswerteeinheit 1 1 ist nun in Hardware oder durch geeignete Programmierung als FPGA, ASIC oder MikroController so eingerichtet, dass diese nicht nur den Betrag der elektrischen Impedanz der Sensoren 5a, 5b sondern auch den Realteil der Impedanz und den Imaginärteil der Impedanz erfasst.
Die Messvorrichtung 1 ist weiterhin so eingerichtet, dass die Sensoren 5a, 5b die Impedanz desselben Volumenteils einer Blutprobe mit mindestens zwei unterschiedlichen Frequenzen bestimmt. Für die erste Frequenz wird dabei vorzugsweise eine Frequenz im Bereich von 1 MHz bis 6 MHz ausgewählt. Die erste Frequenz liegt besonders bevorzugt bei 2,3 MHz.
Für die zweite Frequenz wird eine Frequenz im Bereich von 6 MHz bis 15 MHz ausgewählt. Sie liegt bevorzugt bei 10,1 MHz.
Figur 2 lässt eine Skizze eines Ausschnitts des Sensorbereichs eines Sensors 5a/5b erkennen. Die Elektroden 6 des Sensors sind vorzugsweise aus Platin auf ein mikrostrukturiertes Substrat aufgebracht. In das Substrat ist der Kanal 4 eingebracht, durch welchen die Blutprobe in Pfeilrichtung durchgeleitet wird. Die Elektroden 6 kreuzen den Kanal und sind wie dargestellt als planare Elektroden senkrecht zur Flussrichtung ausgerichtet. Sie haben einen Abstand von etwa 30 m bis 10 μιτι und bevorzugt bei etwa 15 μιτι +/- 5 μιτι voneinander.
Figur 3 lässt ein Diagramm eines beispielhaften Messergebnisses mit der Messvorrichtung 1 aus Figur 1 nach Durchleiten einer hämolysefreien Blutprobe erkennen. Die erste Frequenz beträgt dabei 2,3 MHz und die zweite Frequenz 10,1 MHz. In dem Diagramm ist das Verhältnis des Imagniärteils lm(Z2) der elektrischen Impedanz bei der zweiten Frequenz zum Realteil Re(Zi) der elektrischen Impedanz bei der ersten Frequenz über den Betrag der relativen elektrischen Impedanz | Zi | aufgetragen. Unter der relativen Impedanz wird dabei verstanden, dass diese nicht in Ohm kalibriert ist. Dasselbe gilt auch für den Imaginärteil und Realteil der elektrischen Impedanz, wobei dort aufgrund des Quotienten eine Kalibrierung in eine Si-Messeinheit noch unerheblicher ist.
Deutlich wird, dass eine Differenzierung der einzelnen Arten von Blutkörperchen bei relativ scharfer Trennung vom Rauschen (Noise) möglich wird. Die Throm- bozyten Plt („Platelets") nehmen dabei ein relativ großes Feld neben dem Rauschbereich ein. Sie sind aber relativ scharf von diesem Rauschanteil sowie von den angrenzenden roten Blutkörperchen RBC und den Leukozyten mit ihren Subpo- pulationen der Lymphozyten Ly, Monozyten M und Granulozyten Gn getrennt.
Wenn nun wie in Figur 4 das Verhältnis des Imaginärteils der elektrischen Impe- danz bei der zweiten Frequenz zum Realteil der elektrischen Impedanz bei der ersten Frequenz (lm(Z2) / Re(Zi)) über den Betrag der relativen elektrischen Impedanz | Z21 bei der zweiten Frequenz aufgetragen wird, dann sind die Thrombozyten Plt nicht mehr so scharf vom Rauschsignal Noise getrennt. Zudem sind auch die roten Blutkörperchen, d.h. die Erythrozyten RBC und die Subpopulation der Leukozyten schärfer voneinander getrennt.
Dies wird aus Figur 5 deutlicher, die einen Ausschnitt aus dem Diagramm aus Figur 4 im Bereich der Subpopulation der Leukozyten zeigt. Erkennbar wird, dass die statistische Verteilung der Zellereignisse für die Lymphozyten Ly, die Monozy- ten M und die Granulozyten Gn ausreichend differenziert voneinander in charakteristischen Wertebereichen zu finden sind.
Figur 6 zeigt für dieselben Messergebnisse eine Auswertung der Opazität über den Betrag der relativen Impedanz bei der zweiten Frequenz. Die Opazität ist das Verhältnis des Betrages der Impedanz bei der zweiten Frequenz zum Betrag der Impedanz bei der ersten Frequenz. Deutlich wird, dass durch die Opazität insbesondere die Monozyten M und Granulozyten Gn ineinander übergehen und auch der Abstand zu den Lymphozyten Ly nicht mehr so scharf ist. Damit wird deutlich, dass durch die Bestimmung der Arten der Blutkörperchen zur Ermittlung der je- weiligen Konzentration in der Blutprobe oder zur Differenzierung für einen anderen Zweck eine Auswertung in Abhängigkeit von dem Verhältnis des Imaginärteils der elektrischen Impedanz bei der zweiten Frequenz zum Realteil der elektrischen Impedanz bei der ersten Frequenz zu besseren Ergebnissen führt. Mit einer solchen elektrischen Durchflusszytometrie ohne Durchführung einer vorhergehenden Hämolyse kann somit eine Konzentrationsbestimmung erfolgen. Bei dem AC-lmpedanz Zähl verfahren erzeugen die Blutkörperchen bzw. Zellen der Blutprobe beim Durchtritt durch die Elektrodenpaare Impedanzänderungen, die proportional zum Volumen der Zellen, zur Kapazität ihrer Membran und zur Leitfähigkeit des Zytoplasmas ist. Ihre jeweiligen Beträge sind abhängig von der ge- wählten Frequenz. Das Verhältnis lm(Z2) / Re(Zi) aus dem Imaginärteil der Impedanz (Z2) bei geeigneter zweiter Frequenz h und dem Realteil der Impedanz Z1 bei der ersten Frequenz fi ist proportional zur Kapazität der Zelle des Blutkörperchens pro Volumeneinheit. Diese Messgrößen oder Parameter dienen dann als Grundlage zur Differenzierung der verschiedenen Zellpopulationen.
Zur Verbesserung des Signal-zu-Rauschverhältnisses und der Auflösung des Sensors 5a, 5b werden wie in Figur 1 dargestellt zwei Elektrodenpaare 6 zur dif- ferenziellen Messung implementiert. Bei dem Durchgang der Blutkörperchen durch diese beiden Messzonen der Sensoren 5a, 5b wird die isotone Lösung, in der sich die Blutzellen befinden, einmal mit und einmal ohne Zelle gemessen. Die Differenz beider Signale enthält damit ausschließlich den Betrag zur Impedanzänderung, die durch die Zelle, d.h. das Blutkörperchen hervorgerufen wird .
Da Erythrozyten den überwiegenden Teil der Blutzellen darstellen und mit einem Durchmesser von 7,5 μιτι wesentlich größer als Thrombozyten mit einem Durchmesser im Bereich 1 bis 3 μιτι sind, ist eine Differenzierung ausschließlich mit der elektrischen Impedanzmessung an sich sehr schwierig. Auch die Leukozyten haben mit einer Größe von etwa 8 bis 15 μιτι eine mit den Erythrozyten vergleichbare Größe.
Nunmehr wird ohne eine zur Zerstörung der Erythrozyten führende Hämolyse und ohne eine immunologische Färbung von weißen Blutzellen mit fluoreszenzmarkieren (monoklonalen) Antikörpern eine Differenzierung mit einer elektrischen AC-Durchflusszytometrie möglich, wenn diese in dem genannten Frequenzbe- reich der beiden Frequenzen und/oder mit Hilfe des Verhältnisses lm(Z2) / Re(Zi) durchgeführt wird. Durch den Frequenzbereich von 6 MHz bis 15 MHz gelingt eine verbesserte Differenzierung der weißen Blutkörperchen (Leukozyten) zu den roten Blutkörperchen (Erythrozyten). Dieser Frequenzbereich ist zur Differenzierung der großvo- lumigen Blutkörper geeignet. Mit Hilfe des Frequenzbereichs von 1 MHz bis 6 MHz gelingt eine Trennung der kleinvolumigen Blutkörper, wie Thrombozyten.
Durch das Verhältnis des Imaginärteils zum Realteil wird die durch die Kapazität des jeweiligen Blutkörpers verursachte Impedanzänderung auf die durch das Vo- lumen des jeweiligen Blutkörpers verursachte Impedanzänderung bezogen. Bei der Auswertung der Impedanzwerte wird vorzugsweise zunächst eine Pulshöhenanalyse durchgeführt, bei der die Maximalwerte bzw. je nach Polrichtung die Minimalwerte als relevante Impedanzänderungsereignisse herangezogen werden, um für diese Ereignisse die Impedanzen und Impedanzverhältnisse zu be- rechnen.
Zur Präparation der Blutprobe wird diese mit einer wässrigen Lösung geeignet verdünnt, um die Zählraten der Zellen an die elektronischen Baugruppen und die Datenerfassung anzupassen. Dabei sind Zählraten von 1 bis 10 kHz typisch.
Weiterhin kann eine Kalibrierung der Identifikation von Blutpartikeln mittels eines AC-Frequenzscans im Bereich von 300 kHz bis 100 MHz für das Blut einer Spezies und einem weiteren, unabhängigen Verfahren durchgeführt werden. Damit ergibt sich für eine rein auf der oben beschriebenen durchflusszytometrischen AC-Methode beruhende, mittels geeignet abgeleiteter Impedanzwerte hinreichend genaue Identifikation und Zählung der Blutkörperchen. Eine solche Kalibrierung kann mit Hilfe der zweidimensionalen Darstellung entsprechend der Figuren 3 bis 5 vorgenommen werden.

Claims

Patentansprüche:
1 . Verfahren zur Bestimmung von Blutkörperchen (2) in einer Blutprobe im
Durchfluss mit einem Sensor (5a, 5b) zur Messung der elektrischen Impe- danz,
gekennzeichnet durch:
- Durchleiten der hämolysefreien Blutprobe mit darin enthaltenen Blutkörperchen (2) durch ein Wechselspannungsfeld (8) des Sensors (5a, 5b),
- Messen der elektrischen Impedanz der einzelnen Blutkörperchen (2) in der Blutprobe mit dem Sensor (5a, 5b), wobei die elektrische Impedanz mit mindestens zwei unterschiedlichen Messfrequenzen des Wechselspannungsfeldes (8) gemessen wird, und
- Bestimmen der Arten der im Wechselspannungsfeld (8) des Sensors (5a, 5b) befindlichen Blutkörperchen (2) in Abhängigkeit von dem Verhältnis des Imaginärteils der Impedanz bei einer zweiten Frequenz (lm(Z2)) zu dem Realteil der Impedanz bei einer ersten Frequenz (Re(Zi)), die von der zweiten Frequenz unterschiedlich ist.
2. Verfahren zur Bestimmung von Blutkörperchen (2) in einer Blutprobe im
Durchfluss mit einem Sensor (5a, 5b) zur Messung der elektrischen Impedanz, gekennzeichnet durch:
- Durchleiten der hämolysefreien Blutprobe mit darin enthaltenen Blutkörperchen (2) durch ein Wechselspannungsfeld (8) des Sensors (5a, 5b),
- Messen der elektrischen Impedanz der einzelnen Blutkörperchen in der Blutprobe mit dem Sensor (5a, 5b), wobei die elektrische Impedanz mit mindestens zwei unterschiedlichen Messfrequenzen des Wechselspannungsfeldes (8) gemessen wird, und - Bestimmen der Arten der im Wechselspannungsfeld (8) des Sensors (5a, 5b) befindlichen Blutkörperchen (2) in Abhängigkeit einer Korrelation der mit einer ersten Frequenz (Re(Zi)) im Bereich von 1 MHz bis 6 MHz und mit einer zweiten Frequenz (lm(Z2)) im Bereich von 6 MHz bis 15 MHz gemessenen elektrischen Impedanz desselben Volumenbereichs der Blutprobe.
Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch :
- Zählen von Impedanzänderungs-Ereignissen, bei denen die Impedanzänderung oder das Verhältnis (lm(Z2)/Re(Zi)) des Imaginärteils der Impedanz bei der ersten Frequenz zu dem Realteil der Impedanz bei der zweiten Frequenz einen vorgegebenen Schwellwert überschreitet, und
- Bestimmen der Anzahl von Arten (Untergruppen) von Blutkörperchen (2) und der Anzahl von Impedanzänderungs-Ereignissen zur Ableitung der relativen Konzentrationen der jeweiligen Arten (Untergruppen).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch :
- Durchleiten der hämolysefreien Blutprobe mit darin enthaltenen Blutkörperchen (2) durch ein Wechselspannungsfeld (8) eines ersten Sensors (5a) und
- Durchleiten eines Vergleichsmediums durch ein Wechselspannungsfeld (8) eines zweiten Sensors (5b),
- Bestimmen der Impedanzdifferenz zwischen der mit dem ersten und zweiten Sensor (5a, 5b) gleichzeitig gemessenen elektrischen Impedanz (Im(Zi), Re(Zi), lm(Z2), Re(Z2), | Zi | , | Z2 | ) und
- Bestimmen der Arten der im Wechselspannungsfeld (8) des ersten Sensors (5a) befindlichen Blutkörperchen (2) in Abhängigkeit von dem Verhältnis (lm(AZ2)/Re(AZi)) des Imaginärteils der Impedanzdifferenz bei der ersten Frequenz zu dem Realteil der Impedanzdifferenz bei der zweiten Frequenz. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Verdünnen der hamolysenfreie Blutprobe mit einer wässrigen Lösung ohne Durchführung einer Hämolyse vor dem Durchleiten durch den mindestens einen Sensor (5a, 5b).
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Frequenz zum Messen der elektrischen Impedanz kleiner als die zweite Frequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Frequenz im Bereich von 1 MHz bis 6 MHz liegt und bevorzugt 2,3 MHz beträgt.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Frequenz im Bereich von 6 MHz bis 15 MHz liegt und bevorzugt 10,1 MHz beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zählrate der Blutkörperchen (2) durch den Sensor (5a, 5b) im Bereich von 1 kHz bis 10 kHz liegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Differenzierung der Arten von Blutkörperchen (2), die durch den Sensor (5a, 5b) durchgeleitet werden, in Abhängigkeit des Betrages der elektrischen Impedanz bei einer Frequenz, wobei der Betrag der elektrischen Impedanz proportional zu der Differenz der elektrischen Impedanz der Blutprobe zu der elektrischen Impedanz des Vergleichsmediums ist, die in Wechselspannungsfeldern (8) mit derselben Frequenz gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch Bestimmen der Meng großvolumiger Blutkörperchen (2), welche die Art der Thrombozyten (Plt) umfassen, aus dem auf den Betrag der elektrischen Impedanz (Zi) bei der ersten Frequenz bezogenen Verhältnisses (lm(Z2)/Re(Zi);
lm(AZ2)/Re(AZi)) des Imaginärteils der Impedanz oder Impedanzänderung bei der zweiten Frequenz zu dem Realteil der Impedanz oder Impedanzänderung bei der ersten Frequenz.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 1 1 , gekennzeichnet durch Bestimmen der Menge großvolumiger Blutkörperchen (2), welche die Art der roten Blutkörperchen (RBC) und die Leukozyten mit ihren Subpopulationen der Granulozyten (Gn), Monozyten (M) und Lymphozyten (Ly) umfassen, aus dem auf den Betrag der elektrischen Impedanz (Z2) oder Impedanzänderung (AZ2; AZi) bei der zweiten Frequenz bezogenen Verhältnis (lm(Z2)(Re(Zi); lm(AZ2)/Re(AZi)) des Imaginärteils der Impedanz oder Impedanzänderung bei der zweiten Frequenz zu dem Realteil der Impedanz oder Impedanzänderung bei der ersten Frequenz.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Ermitteln des Realteils der Impedanz oder Impedanzänderung
(Re(Zi); Re(AZi)) bei der ersten Frequenz als Betrag der Impedanz oder Impedanzänderung (|Zi |; AZi) bei der ersten Frequenz, wenn der Imaginärteil (Im(Zi)) im Vergleich zum Realteil (Re(Zi )) bei der ersten Frequenz vernachlässigbar klein ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Ermitteln des Imaginärteils der Impedanz oder Impedanzänderung (lm(Z2); lm(AZ2)) bei der zweiten Frequenz als Betrag der Impedanz oder Impedanzänderung (|Z2|; ΔΖ2) bei der zweiten Frequenz, wenn der Realteil (Re(Z2)) im Vergleich zum Imaginärteil (lm(Z2 )) bei der zweiten Frequenz vernachlässigbar klein ist.
15. Messvornchtung (1 ) zur Bestinnnnung von Blutkörperchen (2) in einer Blutprobe im Durchfluss mit dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Messvorrichtung (1 ) mindestens einen Sensor (5a, 5b) zur Messung der elektrischen Impedanz (Z) einer durch den Sensor (5a, 5b) geleiteten Blutprobe mit einem Wechselspannungsfeld (8) und eine
Auswerteeinheit (1 1 ) hat, die mit dem mindestens einen Sensor (5a, 5b) verbunden und zur Bestimmung der Arten der im Wechselspannungsfeld (8) des Sensors (5a, 5b) befindlichen Blutkörperchen (2) in Abhängigkeit von dem Verhältnis (lm(Z2)/Re(Zi); lm(AZ2)/Re(AZi)) des Imaginärteils der Impedanz bei einer zweiten Frequenz zu dem Realteil der Impedanz bei einer ersten Frequenz, die von der zweiten Frequenz unterschiedlich ist, eingerichtet ist.
Messvorrichtung (1 ) nach Anspruch 15, gekennzeichnet durch einen ersten Sensor (5a) zum Durchleiten der hämolysefreien Blutprobe und einem zweiten Sensor (5b) zum Durchleiten eines Vergleichsmediums, wobei die Auswerteeinheit (1 1 ) zur Bestimmung der Impedanzdifferenz (ΔΖ) zwischen dem mit dem ersten und zweiten Sensor (5a, 5b) gleichzeitig gemessenen elektrischen Impedanzen (Z) und Bestimmen der Arten der im Wechselspannungsfeld (8) des ersten Sensors (5a) befindlichen Blutkörperchen (2) in Abhängigkeit von dem Verhältnis (lm(AZ2)/Re(AZi)) des Imaginärteils der Impedanzdifferenz bei der ersten Frequenz zu dem Realteil der Impedanzdifferenz bei der zweiten Frequenz eingerichtet ist.
Messvorrichtung (1 ) nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteeinheit (1 1 ) zur Differenzierung der Arten von Blutkörperchen (2), die durch den Sensor (5a, 5b) durchgeleitet werden, in Abhängigkeit des Betrages der elektrischen Impedanz (Z) bei einer Frequenz eingerichtet ist.
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