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WO2017046267A1 - Pharmazeutische wirkstoffe zur verwendung in der behandlung von amyotropher lateralsklerose (als) und diagnoseverfahren - Google Patents

Pharmazeutische wirkstoffe zur verwendung in der behandlung von amyotropher lateralsklerose (als) und diagnoseverfahren Download PDF

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WO2017046267A1
WO2017046267A1 PCT/EP2016/071867 EP2016071867W WO2017046267A1 WO 2017046267 A1 WO2017046267 A1 WO 2017046267A1 EP 2016071867 W EP2016071867 W EP 2016071867W WO 2017046267 A1 WO2017046267 A1 WO 2017046267A1
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WO
WIPO (PCT)
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als
antibody
ligand
lateral sclerosis
treatment
Prior art date
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PCT/EP2016/071867
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English (en)
French (fr)
Inventor
Walter Schubert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ToposNomos Ltd
Original Assignee
ToposNomos Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by ToposNomos Ltd filed Critical ToposNomos Ltd
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C07K16/2815—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD8
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity

Definitions

  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • the invention relates to drugs for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS), the treatment of ALS, methods for the diagnosis and / or therapy control of ALS, and a composition, a biochip and / or a kit for the diagnosis and / or therapy control of ALS ,
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • ALS Amyotrophic lateral sclerosis
  • Object of the present invention is to provide active ingredients for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Another object of the invention is to provide a treatment method of ALS. Another object of the invention is to provide a method for diagnosis and / or therapy control of ALS. Another object of the invention is to provide a composition, a biochip and / or a kit for the diagnosis and / or therapy control of ALS.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • a first aspect of the invention relates to an antibody and / or ligand which comprises at least one of the group CD16, CD8, STTP1, NeuN, Bax, Bcl2, CD1 1b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56 , CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, immunoglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1, RAC1, BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 and STAP2, for use in the treatment of Amyotrophic Lateral Sclerosis ( WHEN).
  • WHEN Amyotrophic Lateral Sclerosis
  • the antibody and / or ligand two, three, four, five or more from the group CD16, CD8, STTP1, NeuN, Bax, Bcl2, CD1 1b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, immunoglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1, RAC1, BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 and STAP2.
  • the antibody and / or ligand is bi-, tri-, quad-, pent-, hex-, hept-, oct-, denominated or multispecific.
  • the proteins mentioned form super-individual and individual clusters in ALS-specific cells in various combinations and can therefore be cross-linked therapeutically and thereby blocked, as a result of which the ALS-specific cells lose their functionality. This allows a particularly specific and thus low-side-effect or even side-effect-free treatment of ALS.
  • STTP1 here denotes the optionally patient-specific signal protein (signal transduction protein 1, eg kinase), which mediates the signal cascade extending from the cell surface to the cell nucleus and together with the module "CD16a and CD8" on the surface of the Cell where it is colocalized with CD16a and CD8 STTP1 can be isolated by means of the MELK and / or ICM technique known per se (multi-epitope ligand cartography or Imaging Cycler Microscopy) can be individually determined or monitored for the relevant patient.
  • signal transduction protein 1 signal transduction protein 1, eg kinase
  • STTP1 is at least one protein from the group RAC1, STAP2 and SMAD2.
  • This can block ALS-specific protein clusters which, in addition to one or more cell surface proteins (eg CD8, CD16, CD45RA) are additionally directly associated with one or more signal chain molecules from the group RAC1, STAP2 and / or SMAD2.
  • RAC1 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 as a member of the RAC subfamily regulates a variety of cellular events, including cell growth control, cytoskeletal reorganization, and activation of protein kinases.
  • Signal transducing adapter protein 2 and mothers against decapen- ticidal homologue 2 (SMP) 2 are also part of the signal transduction chain and regulate signal transduction and transcription of central signaling pathways in ALS-specific cells.
  • the antibody and / or ligand comprises or is at least one variable single-chain fragment (scFv) and / or a multivalent antibody fragment (scFv multimer).
  • Antibody fragments offer the advantage of high binding affinity and specificity for a wide range of targets and haptens.
  • Single-chain fragments can also be cross-linked or expressed as diabodies (60 kDa), triabodies (90 kDa), tetrabodies (120 kDa), etc., whereby different linker lengths between V domains are possible.
  • a particular advantage for the treatment of ALS is that molecules of 60-120 kDa increase the penetration of ALS-specific cells and have faster clearance rates than the corresponding Igs (150 kDa).
  • the antibody and / or ligand is a diabody, triabody, tetrabody, pentabody, hexabody, heptabody or octabody.
  • a second aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) comprising at least one antibody and / or ligand according to the first aspect of the invention.
  • the pharmaceutical composition may comprise a salt or solvate thereof and / or one or more of pharmaceutically acceptable carriers, diluents and excipients.
  • the pharmaceutical composition binds at least one antibody and / or ligand, the CD8, CD16 and RAC1, and / or at least one antibody and / or ligand, the CD8, CD16 and STAP2 and / or SMAD2 binds, includes.
  • super-individual ALS-specific targets CD8 / CD16 / RAC1
  • individual ALS-specific targets CD8 / CD16 / STAP2, CD8 / CD16 / SMAD2, CD8 / CD16 / STAP2 / SMAD2
  • a third aspect of the invention relates to an IgG inhibitor for use in the treatment of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS).
  • An example of this are antibodies against IgG and (optionally recombinant) streptococcal protein G.
  • a fourth aspect of the invention relates to a CD16 ectodomain shedding molecule for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • a fifth aspect of the invention relates to a lamellipodia extension and / or migration inhibitor for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • Lamellipodia are leaf-shaped thin pseudopodia on the anterior hemisphere of creeping and similarly motile cells, including ALS-specific cells.
  • a lamellipodium consists of a thin membrane duplicature that encloses a dense grid of parallel aligned bundles of actin filaments. With their plus ends (growth side), the actin bundles are anchored to the anterior chamber of the lamellipodium in the cell membrane and push them forward by continuously growing further actin bricks, while they are continuously broken down at the rear end, their minus side.
  • lamellipodia extension and / or migration inhibitors are, for example, compounds which block RAC1 and / or SIRT1 or prevent their expression.
  • the SIRT1 inhibitor nicotinamide (NAM) or SIRT1 "small interfering RNAs" suppress the lamellipodia extension via platelet-derived growth factor (PDGF).
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • a sixth aspect of the invention relates to an inhibitor of the CD16 gene (FCGR3A) and / or the NeuN gene (RBFOX3) for use in the treatment of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS).
  • a seventh aspect of the invention relates to a method for treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS), in which a patient a pharmacologically effective dose of an antibody and / or ligands according to the first aspect of the invention and / or a pharmaceutical composition according to the second aspect of the invention and / or an IgG inhibitor according to the third aspect of the invention and / or a lamellipodia extension and / or migration inhibitor according to the fourth aspect of the invention and / or a CD16 ectodomain shedding molecule according to the fifth aspect of the invention and / or an inhibitor of the CD16 gene ( FCGR3A) and / or the NeuN gene (RBFOX3) according to the sixth aspect of the invention.
  • Preferred is a systemic or intravenous administration. Also included is
  • An eighth aspect of the invention relates to a method of identifying cells indicative of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) comprising the steps of providing a sample of a patient's cell and checking whether the cell sample contains at least one cell comprising NeuN and / or CD16, wherein the patient suffers from ALS when the cell sample contains at least one cell containing NeuN and / or CD16.
  • ALS Amyotrophic Lateral Sclerosis
  • a blood sample and / or a tissue sample of the patient is provided as the cell sample.
  • the blood sample is taken between 8 and 10 o'clock in the morning, the patient should be fasting.
  • Further advantages arise when it is checked whether the cell sample contains at least one cell in addition to NeuN and / or CD16 additionally one or more of CD8, STTP1, Bax, Bcl2, CD1 1b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA , CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, immunoglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1, RAC1, BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 and STAP2.
  • At least one composition which contains at least one antibody and / or ligand and / or a MELK or ICM method multi-epitope ligand cartography / imaging cycler microscopy
  • a biochip and / or a kit and / or device is used.
  • the MELK or ICM process can be carried out, for example, by means of a device known per se, as described in patent EP 0810428 B1 and in US Pat. No. 6,150,173.
  • the cell sample with the composition containing the at least one antibody and / or ligand acted by at least one part of the composition by at least one hollow body passed to the cell sample, at least once at least partially into the Retracted hollow body and at least partially passed back to the cell sample.
  • the hollow body can be formed, for example, as a pipe, hose, pipette or pipette tip and the like.
  • the process of retraction and return can be repeated basically once, twice, three times, four times, five times, six times or more frequently (N times, where N is an integer> 0), the time intervals and volume flows kept constant or varied in each round can be.
  • the process of retraction and return is preferably carried out with one and the same hollow body, that is, for example, without pipette tip change.
  • the process of retraction and return is preferably carried out with one and the same hollow body, that is, for example, without pipette tip change.
  • not only a part but the entire volume of the composition applied to the cell sample is withdrawn and redirected to the cell sample. This results in 1 ... N cycles of incubation with the same antibody and / or ligand type.
  • composition is passed onto the cell sample at an angle between 1 ° and 90 ° and / or withdrawn from the cell sample.
  • the composition is applied either at a right angle to the surface of the cell sample ("hanging drop") or
  • a ninth aspect of the invention relates to a composition and / or biochip and / or kit and / or apparatus for use in a method according to the eighth aspect of the invention.
  • the device can be, for example, a suitably adapted Toponome Imaging System (TIS), as described for example in the patent EP 810 428 B1.
  • TIS Toponome Imaging System
  • the device and / or the kit may be structurally simple and thus inexpensive tube systems with which antibody and / or ligand-containing compositions can be applied to and aspirated onto a patient's cell sample to test for the presence of ALS-specific binding patterns.
  • Figures 1a to 1f show different topographical images as more specific, abnormal
  • Figures 2a to 2f show the step process of these abnormal cells leading to the ALS specific disease
  • 3 shows different strategies for the treatment of ALS; and 4 shows a comparison between a classical incubation of a cell sample in the hanging drop and an incubation with improved diffusivity.
  • ALS Toponome Analyzes of cell surfaces of immune cells in the blood have shown that ALS has a specific abnormal topon. An essential feature is the existence of aberrant T-lymphocytes, which in addition to the CD8 receptor also express the CD16 receptor complex. Exactly the same cell forms are found in the morphologically well-preserved ALS postmortem tissue within postcapillary venules of the spinal pyramidal tract ( Figure 1 a, b; Box).
  • CD8 / CD16 complexes are required by "forward transport" for the transmigration of these cells through the endothelial cell layer via vesicle budding in the cell surface to promote transmigration as part of an abnormal "homing code” (CD16)
  • This complex is degraded after transmigration, since CD8 positive T cells in the pyramidal tract parenchyma do not have the CD16 complex, but instead can be found as single cells between the myelinated neu- tral cells.
  • Fig. 2 a, CD8 + CD16 - blue cell) Increased 3D magnification of this cell has a cell process that has penetrated deep into the surface of a morphologically intact axon (Fig.
  • This cell process expresses CD3 and CD8 ( Figure 2, arrows 1, 2.)
  • a geometrically accurate 3D calculation yields the cell extension in FIG. 2 f (arrow 3) and the axon in Fig. 2 f (marked with asterisks).
  • a similar cell process can be found starting from the same cell in Fig. 2 d (lower half): Here has the Cellular process (red) apparently permeated the intact myelin sheath (white). For comparison, Fig. 2 e shows an intact myelin sheath.
  • CD16 is necessary to control the abnormal homing aberrant CD8 cells into the pyramidal tract, and when this homing process is complete, the cells degrade (lose) the CD16 complex, then migrate as CD8 + CD16 cells between the cells
  • This process is obviously primarily autonomous, as the cells are never observed in the context of ZeH "debris," which is a sign of primary neuronal degradation, so the cells play a primary pathogenetic role supported by the fact that downregulation of CD16 leads to a halt of disease progression: when CD16 is no longer available as in Figure 1f, the endothelial homing process can no longer be performed are therefore described as a disease of the Immunzelltoponoms that by means of a highly selective "homing codes" the ALS speci fish pyramidal tract lesions (axotomy) generated. Many genetic findings and protein aggregations described in ALS have also been described in experimental axotomy, so that immunocelltoponomically-mediated axotomy explains these findings.
  • the invasive cells according to FIG. 1 c furthermore coexpress the following molecules: Bax, Bcl2, CD1b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD8, HLADR, immunoglobulin G, MHCII , MHCI, NeuN, SIRT1, RAC1, BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 and STAP2.
  • NeuN Fluor-3, Rbfox3, or Hexaribonucleotide Binding Protein-3 is a neuronal, nuclear antigen that is normally used as a biomarker for neurons
  • Nuclear coexpression of NeuN and CD49d, as well as cytoplasmic expression of immunoglobulin G (IgG) along with the CD16 bearing vesicles of Figure 1df) and cell surface expression of CD8 and CD3, indicate that this cell has abnormal differentiation status:
  • T cell CD3, CD8
  • Neuronal cell Neuronal cell in the nucleus
  • CD16 monocyte
  • B lymphocyte IgG
  • Proteins partially colocalized with specific CD8 and / or CD16 in ALS-indicative cells, in some cases with specific individuality or frequency, are given in Table 1. All of these proteins thus represent therapeutic target structures (targets) individually or in combination with CD8 and / or CD16, since switching off these proteins-for example by means of appropriate antibodies / ligands and / or genetic engineering methods-leads to a collapse of the intracellular information flow and thus to a loss of function of the aberrant cells.
  • GAK [GAK] cyclin G associated kinase
  • MAPKK6 mitogen-activated protein kinase kinase 6
  • OTUB2 OTU deubiquitinase, ubiquitin aldehyde binding 2
  • PRKAR2 [PRKAR2A] protein kinase cAMP-dependent type II regulatory sub- A unit alpha
  • RAC1 ras-related C3 botulinum toxin substrates 1 (rho family, small GTP binding protein Rad)
  • SMAD2 [SMAD2] SMAD family member 2
  • SMAD4 [SMAD4] SMAD family member 4
  • STAP2 [STAP2] signal transducing adapter family member 2
  • SIRT1 nicotinamide adenine dinucleotide-dependent protein deacetylase
  • the cell of Figure 2c, f which, as explained above, expresses a CD16 negative phenotype upon invasion of the cell of Figure 1, remains positive for NeuN.
  • the invasive cell described above can be detected as an ALS-specific cell with the abovementioned features in the blood or in tissue samples by means of spatial tomography analysis. Since their invasion behavior into the pyramidal tract is known as set forth above and since it is further known that the cell is transformed by phenotype switching (CD16-) to a NeuN positive T cell which axotomizes the neuron, the detection of cells of the CD16 / CD8 phenotype from Fig. 1 c on the process of axotomy close. It follows that cell invasion of the cell of Figure 1c must be therapeutically prevented by molecular blocking or lysis in order to prevent axotomy and stop the progression of ALS.
  • the described two-step process is a violation of basic rules of cooperation of cells of different cotyledons: These rules are based in intact systems, cells from different cotyledons follow the rule of non-injury of the mutual cell surfaces.
  • the transformed T cell-like cells (cotyledon mesenchyme) injure the surfaces of neurons (cotylus ectoderm). This leads to a physical transcellular cross-linking of the two cotyledonous functions with the consequence of the interruption of the nerve tracts to the voluntary musculature.
  • NeuN in the nucleus of the acting cells (immune cells in the circulation and after invasion into the nervous system of the pyramidal tract) means that these cells A program of aberrant neuronal stem cells follows because NeuN is expressed under physiological conditions only in neurons. Thus, NeuN can be used as a marker for the presence of ALS-causing cells, that is for the diagnosis of ALS.
  • IgG IgG 1 .
  • Provide molecules antibodies / ligands that bind and / or block / inhibit IgG (1/3) or block / inhibit the physiological mechanism of IgG-mediated activation of CD16.
  • An example of this is antibodies to IgG and (optionally recombinant) streptococcal protein G;
  • STTP1 denotes the optionally patient-specific signal protein (signal transduction protein 1, eg kinase), which mediates the signal cascade emanating from the cell nucleus and coupled together with the module "CD16a and CD8" on the surface of the cell or with
  • STTP1 can be individually determined or controlled with the aid of the known MELK and / or ICM technique (multi-epitope ligand cartography or imaging cycler microscopy) for the respective patient.
  • STTP1 may be, for example, one or more proteins from the group RAC1, STAP2 and / or SMAD2 and / or another protein from the signal transduction chain of ALS cells.
  • a speaking antibody for example a trispecific anti-CD16a-CD8-STTP1 antibody, can then also be prepared by known per se manufacturing method and used for the therapy of the patient in question. Since such a trispecific antibody has an extremely high selectivity for abnormal, ALS-specific cells, such treatment is particularly low in side effects;
  • shedding or ectodomain shedding molecules that cause the proteolytic separation of the extracellular CD16 domains (so-called shedding or ectodomain shedding).
  • An example of this is the administration of Adam17 (metallopeptidase domain 17), which is also called TACE (tumor necrosis factor-a-converting enzyme).
  • Adam17 is a 70 kDa enzyme belonging to the ADAM protein family of disintegrins and metalloproteases.
  • Adam17 or the respective CD16-shedding-capable molecule can optionally be coupled with a mono-, bi-, tri- or multispecific antibody (see point 2) in order to increase its specificity advantageously;
  • Administration of at least one mono-, bi-, tri- or multi-specific anti-CD16 antibody (recombinant, human, de novo etc.);
  • FCGR3A CD16 gene
  • the above-mentioned compounds (drugs) can in principle be administered individually or in any combination.
  • the compounds mentioned can be present as a pharmaceutical composition together with other pharmaceutical substances and / or auxiliaries.
  • the galenics are to be adapted or chosen in a manner known per se.
  • the drug (s) is (are) administered once or several times.
  • a pharmaceutically effective dose is administered all at once or distributed over two or more divided doses. Therapy should be checked through regular monitoring and adjusted if necessary.
  • the therapy control can be carried out, for example, with the aid of the diagnostic method described above.
  • ALS-specific surface proteins CDs
  • surface protein clusters that are cross-linked, inhibited or otherwise blocked.
  • central signaling chain molecules may optionally be cross-linked, inhibited, or otherwise blocked by ALS cells.
  • the CD8 / CD16A CD45RA cell surface proteins may optionally be blocked along with the signal chain molecule RAC1, as these are exclusively associated directly in ALS cells.
  • Such a therapy can be carried out, for example, with the aid of bi-, tri- and / or tetraspecific antibodies or by means of corresponding variable single-chain fragments (scFv) or multivalent antibody fragments (scFv multimers), that is to say by means of so-called diabodies, triabodies or tetrabodies.
  • scFv variable single-chain fragments
  • scFv multimers multivalent antibody fragments
  • Individual targets that can be therapeutically addressed as an alternative or in addition to the ALS-specific cluster described above include individual clusters of CD16 / CD8 with the molecules STAP2 and / or SMAD2 and optionally combinations of the molecules designated in Table 1 together with the CD8 / CD16 cluster or as isolated clusters without CD8 / CD16. These clusters can also be switched off with the help of optionally multispecific antibodies and / or antibody fragments.
  • 4 shows a comparison between a classical incubation of a cell sample in the hanging drop (FIGS. 4a, 4b) and an incubation with improved diffusivity (FIGS. 4c, 4d).
  • a kit or a device with a tube system is used to apply solutions containing antibodies and / or ligands to a tissue or cell sample, wherein the solution in the experiment shown in FIGS. 4c and 4d can be selected at arbitrary intervals within a tube of the tubing system was reciprocated back into the tubing and passed back to the tissue or cell sample to produce an improved interaction of the reagents in the solution with the sample to be incubated.
  • FITC does not disturb the aforementioned hinge region of the antibody because it is a comparatively small molecule. It should be emphasized, however, that instead of or in addition to FITC, other labeling and fluorescent dyes can be used as long as they do not substantially interfere with the functionality of the hinge region.
  • FIG. 4a shows in detail the resulting gray level distribution of the tag of tissue in the "hanging drop" over 30 minutes using a composition with an antibody concentration of 0.5 mg / ml
  • FIG. 4b shows the corresponding histogram of Fig. 4a.
  • FIG. 4 c shows the gray value distribution of the marking of the tissue or cell sample after a total incubation time of 30 minutes.
  • the same volume of the same composition as in FIG. 4a / FIG. 4b a total of ten times every 3 minutes over a total of 30 minutes in short pulses (Jet Flow) applied, sucked off and reapplied.
  • Jet Flow short pulses
  • 4c, 4d is achieved by activating the hinge region of the antibody.
  • a significant superiority of this form of application compared to the "classical" hanging drop method is seen with an efficiency increase of about 67% .
  • hitherto invisible subcellular protein arrangements have been identified, which are marked with arrows in FIG Identify clustering.

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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft pharmazeutische Wirkstoffe zur Verwendunginder Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS) sowie Diagnoseverfahren für ALS.

Description

Pharmazeutische Wirkstoffe zur Verwendung in der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS) und Diagnoseverfahren
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Wirkstoffe zur Verwendung in der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS), die Behandlung von ALS, Verfahren zur Diagnose und/oder Therapiekontrolle von ALS, sowie eine Zusammensetzung, einen Biochip und/oder einen Kit zur Diagnose und/oder Therapiekontrolle von ALS.
Die amyotrophe Lateralsklerose (ALS) beruht auf einer unaufhaltsam und rasch fortschreitenden irreversiblen Lähmung der Muskulatur, da bestimmte Nervenzellen, die die Muskulatur steuern, degenerieren. Es wurden bisher über 50 klinische Behandlungsstudien durchgeführt, deren Therapiekonzepte sich allerdings überwiegend als unwirksam erwiesen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Wirkstoffe zur Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS) anzugeben. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Behandlungsverfahren von ALS anzugeben. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Diagnose und/oder Therapiekontrolle von ALS anzugeben. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Zusammensetzung, einen Biochip und/oder einen Kit zur Diagnose und/oder Therapiekontrolle von ALS anzugeben.
Die Aufgaben werden erfindungsgemäß durch die in den Ansprüchen 1 bis 13 ange- gebenen Wirkstoffe und Zusammensetzungen, ein Behandlungsverfahren gemäß Anspruch 14, ein Verfahren gemäß Anspruch 15 zum Identifizieren von Zellen, welche indikativ für Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) sind, sowie durch eine Zusammensetzung, einen Biochip und/oder einen Kit zum Durchführen dieses Verfahrens zum Identifizieren von Zellen, welche indikativ für Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) sind, gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen mit zweckmäßigen Weiterbildungen der Erfindung sind in den jeweiligen Unteransprüchen angegeben, wobei vorteilhafte Aus- gestaltungen jedes Erfindungsaspekts als vorteilhafte Ausgestaltungen der jeweils anderen Erfindungsaspekte und umgekehrt anzusehen sind.
Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft einen Antikörper und/oder Ligand, welcher mindestens eines aus der Gruppe CD16, CD8, STTP1 , NeuN, Bax, Bcl2, CD1 1 b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1 , RAC1 , BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2 bindet, zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS).
Es hat sich als vorteilhaft gezeigt, wenn der Antikörper und/oder Ligand zwei, drei, vier, fünf oder mehr aus der Gruppe CD16, CD8, STTP1 , NeuN, Bax, Bcl2, CD1 1 b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1 , RAC1 , BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2 bindet. Mit anderen Worten ist es vorgesehen, dass der Antikörper und/oder Ligand bi-, tri-, quad-, pent-, hex-, hept-, oct-, enn- oder multispezifisch ausgebildet ist. Die genannten Proteine bilden in unterschiedlichen Kombinationen überindividuelle und individuelle Cluster in ALS-spezifischen Zellen und können daher therapeutisch quervernetzt und damit blo- ckiert werden, wodurch die ALS-spezifischen Zellen ihre Funktionalität einbüßen. Hierdurch wird eine besonders spezifische und damit nebenwirkungsarme oder sogar nebenwirkungsfreie Behandlung von ALS ermöglicht.
Weitere Vorteile ergeben sich, wenn der Antikörper und/oder Ligand zumindest CD16, CD8 und STTP1 bindet. STTP1 bezeichnet hierbei das gegebenenfalls Patienten-spezifische Signalprotein (signal transduction protein 1 , z. B. Kinase), welches die Signalkaskade, die sich von der Zelloberfläche zum Zellkern erstreckt, vermittelt und zusammen mit dem Modul„CD16a und CD8" an der Oberfläche der Zelle koppelt, wo es mit CD16a und CD8 kolokalisiert ist. STTP1 kann mit Hilfe der an sich bekannten MELK- und/oder ICM-Technik (Multi-Epitope-Ligand-Kartographie bzw. Imaging Cycler Mikroskopie) für den betreffenden Patienten individuell ermittelt bzw. überwacht werden.
Es kann weiterhin vorgesehen sein, dass STTP1 wenigstens ein Protein aus der Gruppe RAC1 , STAP2 und SMAD2 ist. Hierdurch können ALS-spezifische Protein- Cluster blockiert werden, die neben einem oder mehreren Zelloberflächenproteinen (z. B. CD8, CD16, CD45RA) zusätzlich mit einem oder mehreren Signalketten-Molekülen aus der Gruppe RAC1 , STAP2 und/oder SMAD2 direkt assoziiert sind. RAC1 (Ras-related C3 botulinum toxin Substrate 1 ) als Mitglied der RAC Subfamilie regelt eine Vielfalt von zellulären Ereignissen, einschließlich der Kontrolle des Zellwachstums, der Zytoskelett-Reorganisation und der Aktivierung von Proteinkinasen. STAP2 (Signal-transducing adaptor protein 2) und SMAD 2 (Mothers against decapentaple- gic homolog 2) sind ebenfalls Teil der Signaltransduktionskette und regulieren die Signaltransduktion und Transkription zentraler Signalwege in ALS-spezifischen Zel- len.
Weitere Vorteile ergeben sich, wenn der Antikörper und/oder Ligand rekombinant, human oder de novo hergestellt ist. Weitere Vorteile ergeben sich, indem der Antikörper und/oder Ligand wenigstens ein variables Einzelkettenfragment (scFv) und/oder ein multivalentes Antikörperfragment (scFv Multimer) umfasst oder ist. Antikörperfragmente bieten den Vorteil einer hohen Bindungsaffinität bzw. -avidität und Spezifität für ein breites Spektrum an Zielstrukturen und Haptenen. Einzelkettenfragmente können zudem als Diabodies (60 kDa), Triabodies (90 kDa), Tetrabodies (120 kDa) etc. vernetzt bzw. exprimiert werden, wobei unterschiedliche Linkerlängen zwischen V-Domänen möglich sind. Ein besonderer Vorteil für die Behandlung von ALS ist zudem, dass Moleküle von 60-120 kDa die Penetration von ALS-spezifischen Zellen erhöhen und schnellere Clearance-Raten als die korrespondierenden Igs (150 kDa) besitzen. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass der Antikörper und/oder Ligand ein Diabody, Triabody, Tetrabody, Pentabody, Hexabody, Heptabody oder Octabody ist. Dies erlaubt die Quervernetzung von zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben oder acht Zielstrukturen bzw. Zielproteinen, wobei die scFv Multi- mere besonders präzise und individuell an die gegebenenfalls patientenspezifische räumliche Anordnung der Zielepitope bestimmter kombinatorischer Proteincluster (CMPs) angepasst werden können. Die erhöhte Bindungswertigkeit von scFv-Multi- meren führt zu einer besonders hohen Avidität. Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS), welche wenigstens einen Antikörper und/oder Ligand gemäß dem ersten Erfindungsaspekt umfasst. Zusätzlich zu einem oder mehreren Antikörpern und/oder Liganden gemäß dem ersten Erfindungsaspekt kann die pharmazeutische Zusammensetzung ein Salz oder Solvat davon und/oder einen oder mehrere aus pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Verdünnungsstoffen und Exzipienten umfassen.
Dabei hat es sich als vorteilhaft gezeigt, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung wenigstens einen Antikörper und/oder Ligand, der CD8, CD16 sowie RAC1 bin- det, und/oder wenigstens einen Antikörper und/oder Ligand, der CD8, CD16 sowie STAP2 und/oder SMAD2 bindet, umfasst. Hierdurch können entweder überindividuelle ALS-spezifische Targets (CD8/CD16/RAC1 ) oder individuelle ALS-spezifische Targets (CD8/CD16/STAP2, CD8/CD16/SMAD2, CD8/CD16/STAP2/SMAD2) adressiert und deaktiviert werden. Ebenso ist es natürlich möglich, sowohl die überindividuellen als auch die individuellen ALS-spezifischen Targets gleichzeitig oder im zeitlichen Abstand zueinander zu deaktivieren.
Ein dritter Aspekt der Erfindung betrifft einen IgG-lnhibitor zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS). Ein Beispiel hierfür sind Antikör- per gegen IgG und (gegebenenfalls rekombinantes) Streptokokken Protein G. Ein vierter Aspekt der Erfindung betrifft ein CD16-Ectodomain-Shedding-Molekül zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS).
Ein fünfter Aspekt der Erfindung betrifft einen Lamellipodien-Extensions- und/oder - Migrationshemmer zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS). Lamellipodien sind blattförmig dünne Pseudopodien am Vordersaum (Leitsaum) kriechender und sich ähnlich fortbewegender Zellen, worunter auch ALS- spezifische Zellen fallen. Ein Lamellipodium besteht aus einer dünnen Membrandupli- katur, die einen dichten Rost parallel ausgerichteter Bündel aus Actinfilamenten um- schließt. Mit ihren plus-Enden (Zuwachsseite) sind die Actinbündel am Vordersaum des Lamellipodiums in der Zell-Membran verankert und schieben diese durch stetigen Anbau weiterer Actinbausteine vorwärts, während sie am rückwärtigen Ende, ihrer minus-Seite, fortwährend wieder abgebaut werden. Hieraus resultiert eine der amöboiden Bewegung ähnliche Bewegung, bei der die Zelle eine polare Achse für die Wanderungsrichtung„vorne" und„hinten" definiert hat, welche sie alternativ wechseln kann. Durch die Hemmung der Ausbildung, Extension und/oder Migration dieser Lamellipodien bzw Lamellipodien-ähnlichen Strukturen können die Bewegungen der ALS-Zellen und insbesondere das Durchdringen der Blut-Hirn-Schranke durch diese ALS-Zellen unterbunden werden, wodurch der ALS-Krankheitsausbruch oder -fort- schritt gestoppt wird. Beispiele für Lamellipodien-Extensions- und/oder -Migrationshemmer sind beispielsweise Verbindungen, die RAC1 und/oder SIRT1 blockieren bzw. ihre Expression verhindern. Der SIRT1 Inhibitor Nicotinamide (NAM) oder SIRT1 "small interfering RNAs" unterdrücken die Lamellipodien-Extension über den Platelet-derived growth factor (PDGF). Die Lamellipodien-Bildung durch RAC1 kann ebenfalls durch NAM blockiert werden.
Ein sechster Aspekt der Erfindung betrifft einen Inhibitor des CD16-Gens (FCGR3A) und/oder des NeuN Gens (RBFOX3) zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS). Ein siebter Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Behandeln von Amyotropher Lateralsklerose (ALS), bei welchem einem Patienten eine pharmakologisch wirksame Dosis eines Antikörpers und/oder Liganden gemäß dem ersten Erfindungsaspekt und/oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß dem zweiten Erfin- dungsaspekt und/oder eines IgG-lnhibitors gemäß dem dritten Erfindungsaspekt und/oder eines Lamellipodien-Extensions- und/oder -Migrationshemmers gemäß dem vierten Erfindungsaspekt und/oder eines CD16-Ectodomain-Shedding-Moleküls gemäß dem fünften Erfindungsaspekt und/oder eines Inhibitors des CD16-Gens (FCGR3A) und/oder des NeuN Gens (RBFOX3) gemäß dem sechsten Erfindungsas- pekt verabreicht wird. Bevorzugt ist dabei eine systemische bzw. intravenöse Applizierung. Als mitumfasst ist zudem die Verabreichung eines Salzes, Solvats oder eines physiologisch funktionellen Derivats der genannten Wirkstoffe anzusehen.
Ein achter Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren von Zellen, welche indikativ für Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) sind, umfassend die Schritte Bereitstellen einer Zellprobe eines Patienten und Prüfen, ob die Zellprobe wenigstens eine Zelle enthält, welche NeuN und/oder CD16 umfasst, wobei der Patient unter ALS leidet, wenn die Zellprobe wenigstens eine Zelle enthält, welche NeuN und/oder CD16 enthält.
Es hat sich als vorteilhaft gezeigt, wenn als Zellprobe eine Blutprobe und/oder eine Gewebeprobe des Patienten bereitgestellt wird. Vorzugsweise wird die Blutprobe zwischen 8 und 10 Uhr morgens entnommen, wobei der Patient nüchtern sein sollte. Weitere Vorteile ergeben sich, wenn geprüft wird, ob die Zellprobe wenigstens eine Zelle enthält, welche neben NeuN und/oder CD16 zusätzlich eines oder mehrere aus CD8, STTP1 , Bax, Bcl2, CD1 1 b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1 , RAC1 , BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2 umfasst. Durch die Ermittlung der Kolokalisation und Anti-Kolokalisation können besonders präzise Aussagen über das Vorliegen oder Nicht-Vorliegen einer ALS-Erkrankung getroffen werden.
Weitere Vorteile ergeben sich, wenn zum Prüfen wenigstens eine Zusammenset- zung, welche wenigstens einen Antikörper und/oder Ligand enthält, und/oder ein MELK- bzw. ICM-Verfahren (Multi-Epitop-Ligand Kartographie/Imaging Cycler Mikroskopie) und/oder ein Biochip und/oder ein Kit und/oder eine Vorrichtung verwendet wird. Das MELK- bzw. ICM-Verfahren kann beispielsweise mit Hilfe einer an sich bekannten Vorrichtung durchgeführt werden, wie sie im Patent EP 0810428 B1 und im US-Patent 6,150,173 beschrieben ist.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird die Zellprobe mit der Zusammensetzung, welche den wenigstens einen Antikörper und/oder Ligand enthält, beaufschlagt, indem zumindest ein Teil der Zusammensetzung durch wenigs- tens einen Hohlkörper auf die Zellprobe geleitet, wenigstens einmal zumindest teilweise in den Hohlkörper zurückgezogen und zumindest teilweise wieder auf die Zellprobe geleitet wird. Auf diese Weise erfolgt nach dem ersten Aufbringen der Zusammensetzung auf die Zellprobe ein Dispergieren und Aspirieren der Zusammensetzung. Der Hohlkörper kann beispielsweise als Rohr, Schlauch, Pipette bzw. Pipetten- spitze und dergleichen ausgebildet sein. Der Vorgang des Zurückziehens und Zurückleitens kann dabei grundsätzlich einmal, zweimal, dreimal, viermal, fünfmal, sechsmal oder häufiger (N-mal, wobei N eine Ganzzahl >0 ist) wiederholt werden, wobei die Zeitintervalle und Volumenströme konstant gehalten oder in jedem Durchgang variiert werden können. Weiterhin wird der Vorgang des Zurückziehens und Zu- rückleitens vorzugsweise mit ein und demselben Hohlkörper, also beispielsweise ohne Pipettenspitzenwechsel durchgeführt. Vorzugsweise wird dabei nicht nur ein Teil, sondern das gesamte Volumen der auf die Zellprobe aufgebrachten Zusammensetzung zurückgezogen und erneut auf die Zellprobe geleitet. Hierdurch entstehen 1 ...N Zyklen der Inkubation mit demselben Antikörper- und/oder Ligand-Typ. Ohne auf die- se Theorie festgelegt werden zu wollen, wird davon ausgegangen, dass hierdurch in Analogie zu einer Taylor-Dispersion die effektive Diffusivität der Zusammensetzung erhöht und der Ausgleich von Konzentrationsgradienten nach dem Erstkontakt mit der Zellprobe gegenüber einer„ruhenden" Dauerinkubation verbessert wird, wodurch der gesamte Inkubationsvorgang ohne Qualitätsverluste zeitlich stark verkürzt werden kann. Darüber hinaus können insbesondere bei der Verwendung von Antikörpern 5 deren Scharnier-Regionen zum Zwecke der Optimierung der Bindung an Epitope der Zellprobe aktiviert werden, was zu einem verbesserten Bindungsverhalten und einer Effizienzsteigerung der Antikörper- bzw. Ligandenbindung von bis zu 70 % oder mehr beiträgt.
10 Weitere Vorteile ergeben sich, indem der Hohlkörper derart relativ zur Zellprobe angeordnet wird, dass die Zusammensetzung in einem Winkel zwischen 1 ° und 90° auf die Zellprobe geleitet und/oder von der Zellprobe zurückgezogen wird. Mit anderen Worten ist es vorgesehen, dass die Zusammensetzung entweder in einem rechten Winkel auf die Oberfläche der Zellprobe aufgegeben wird („hängender Tropfen") oder
15 in einem von einem rechten Winkel abweichenden Winkel <90° auf die Zusammensetzung aufgegeben wird. Ein solches„schräges" Aufbringen in einem Winkel von beispielsweise 1 °, 2°, 3°, 4°, 5°, 6°, 7°, 8°, 9°, 10°, 1 1 °, 12°, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 21 °, 22°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30°, 31 °, 32°, 33°, 34°, 35°, 36°, 37°, 38°, 39°, 40°, 41 °, 42°, 43°, 44°, 45°, 46°, 47°, 48°, 49°, 50°, 51 °, 52°, 53°,
20 54°, 55°, 56°, 57°, 58°, 59°, 60°, 61 °, 62°, 63°, 64°, 65°, 66°, 67°, 68°, 69°, 70°, 71 °, 72°, 73°, 74°, 75°, 76°, 77°, 78°, 79°, 80°, 81 °, 82°, 83°, 84°, 85°, 86°, 87°, 88° oder 89° führt ebenfalls zu einem verbesserten Bindungsverhalten und einer Effizienzsteigerung der Antikörper- bzw. Ligandenbindung, da ebenfalls die effektive Diffusivität der Zusammensetzung erhöht wird, so dass sich anfangs direkt benachbarte Molekü-
25 le der Zusammensetzung sich aufgrund der verschiedenen Geschwindigkeiten, mit denen sie transportiert werden, auseinander bewegen. Durch diesen Prozess kommt es zu einem Ausgleich von Konzentrationsgradienten, der um Größenordnungen schneller abläuft als bei reinen Diffusionsprozessen.
30 Ein neunter Aspekt der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung und/oder einen Biochip und/oder ein Kit und/oder eine Vorrichtung zur Verwendung in einem Verfahren gemäß dem achten Erfindungsaspekt. Die Vorrichtung kann beispielsweise ein entsprechend angepasstes Toponome Imaging System (TIS) sein, wie sie beispielsweise in der Patentschrift EP 810 428 B1 beschrieben ist. Die Vorrichtung und/oder der Kit können alternativ konstruktiv einfache und damit preisgünstige Schlauchsysteme sein, mit welchen Antikörper- und/oder Liganden enthaltende Zusammensetzungen auf eine Zellprobe eines Patienten aufgebracht und abgesaugt werden können, um auf das Vorhandensein von ALS-spezifischen Bindungsmustern zu testen.
Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen, den Figuren und der Figurenbeschreibung. Die vorstehend in der Beschreibung genannten Merkmale und Merkmalskombinationen, sowie die nachfolgend in der Figurenbeschreibung genannten und/oder in den Figuren alleine gezeigten Merkmale und Merkmalskombinationen sind nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen verwendbar, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Es sind somit auch Ausführungen von der Erfindung als umfasst und offenbart anzusehen, die in den Figuren nicht explizit gezeigt und erläutert sind, jedoch durch separierte Merkmalskombinationen aus den erläuterten Ausführungen hervorgehen und erzeugbar sind. Es sind auch Ausführungen und Merkmalskombinationen als offenbart anzusehen, die somit nicht alle Merkmale eines ursprünglich formulierten unab- hängigen Anspruchs aufweisen. Dabei zeigen:
Fig. 1 a bis 1f verschiedene Toponomabbildungen ALS spezifischer, abnormer
Zellen;
Fig. 2a bis 2f den Stufenprozess dieser abnormen Zellen, der zum ALS spezifischen Krankheitsbild führt;
Fig. 3 verschiedene Strategien zur Behandlung von ALS; und Fig. 4 ein Vergleich zwischen einer klassischen Inkubation einer Zellprobe im hängenden Tropfen und einer Inkubation mit verbesserter Diffusivität. Mechanismen der ALS im Toponom und Therapieoptionen
Synopsis des ALS-Toponoms: Analysen der Zelloberflächen von Immunzellen des Blutes haben gezeigt, dass bei ALS ein spezifisches abnormes Toponom vorkommt. Wesentliches Merkmal ist die Existenz von aberranten T-Lymphozyten, die neben dem CD8-Rezeptor auch den CD16-Rezeptorkomplex exprimieren. Exakt dieselben Zellformen finden sich im morphologisch gut erhaltenen ALS postmortem Gewebe innerhalb von postkapillären Venolen der spinalen Pyramidenbahn (Fig. 1 a, b; Box). Detaillierte 3D Toponomauflösung zeigt, dass diese Zellen den CD16-Komplex (Fig. 1 , Pfeil 1 ) exprimieren, polarisiert sind und eine„leading edge" mit CD3 positiver Membran zeigen, die durch die Endothelzellschicht des Blutgefäßes dringt (Fig. 1 c; Pfeil 2), während CD3 positive Vesikel intrazellulär zu der„leading edge" transportiert werden (Fig. 1 c; Box). Einzelne Vesikel enthalten Komplexe aus CD8/CD16 (Fig. 1 d, e, f). Diese CD8/CD16-Komplexe sind durch„forward transport" für die Transmigration dieser Zellen durch die Endothelzellschicht via„vesicle budding" in der Zell- Oberfläche erforderlich, um als Teil eines abnormen„homing codes" (Referenzcodes) die Transmigration voranzutreiben. CD16 wird auch als Fe region reeeptor lll-A bzw. Fcylll bezeichnet. Nach der Transmigration wird dieser Komplex degradiert, da CD8 positive T-Zellen im Parenchym der Pyramidenbahn den CD16-Komplex nicht aufweisen. Stattdessen finden sie sich als einzelne Zellen zwischen den myelinisierten Neu- ronen (Fig. 2 a, CD8+CD16 - blaue Zelle). Stärkere 3D-Vergrößerung dieser Zelle weist einen Zellfortsatz auf, der tief in die Oberfläche eines morphologisch intakten Axons eingedrungen ist (Fig. 2 b, Box; Fig. 2 c: Vergrößerung der Box: Stern = morphologisch intakter Axonkörper). Dieser Zellfortsatz exprimiert CD3 und CD8 (Fig. 2; Pfeile 1 , 2). Eine geometrisch exakte 3D-Berechnung ergibt den Zellfortsatz in Fig. 2 f (Pfeil 3) und das Axon in Fig. 2 f (mit Stern markiert). Ein ähnlicher Zellfortsatz findet sich ausgehend von derselben Zelle in Fig. 2 d (untere Bildhälfte): Hier hat der Zellfortsatz (rot) offensichtlich die intakte Myelinscheide (weiß) durchdrungen. Zum Vergleich hierzu zeigt Fig. 2 e eine intakte Myelinscheide.
Zusammenfassend: CD16 ist notwendig, um das abnorme„homing" aberranter CD8 Zellen in die Pyramidenbahn zu steuern. Wenn dieser homing-Prozess abgeschlossen ist, degradieren (verlieren) die Zellen den CD16-Komplex, wandern dann als CD8+CD16-Zellen zwischen den myelinisierten Neuronen, dringen durch die Myelinscheiden und axotomieren Neurone. Dieser Prozess ist offensichtlich primär autonom, da die Zellen nie im Kontext mit ZeH"debris", also Zeichen primärer neuronaler Degradation beobachtet werden. Die Zellen spielen daher eine primäre pathogenetische Rolle. Diese Interpretation wird gestützt durch die Tatsache, dass die Herunterregulierung von CD16 zu einem Stopp der Krankheitsprogression führt: wenn CD16 nicht mehr wie in Fig. 1 f zur Verfügung steht, kann der endotheliale homing-Vorgang nicht mehr ausgeführt werden. Ein Teil der (sporadischen) ALS kann daher als Krankheit des Immunzelltoponoms beschrieben werden, das mittels eines hochselektiven„homing codes" die ALS-spezifischen Pyramidenbahn-Läsionen (Axotomie) generiert. Viele genetische Befunde und Proteinaggregationen, die bei ALS beschrieben wurden, sind auch bei experimenteller Axotomie beschrieben worden, so dass die Immunzelltoponom-vermittelte Axotomie diese Befunde erklärt.
Koepressionsmuster
Die invasiven Zellen gemäß Fig 1 c koexprimieren weiterhin folgende Moleküle: Bax, Bcl2, CD1 1 b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD8, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, NeuN, SIRT1 , RAC1 , BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2.
NeuN (Fox-3, Rbfox3, oder Hexaribonucleotid Bindeprotein-3) ist ein neuronales, nukleäres Antigen, das normalerweise als Biomarker für Neurone verwendet wird Die nukleare Koexpression von NeuN und CD49d, sowie die cytoplasmatische Expression von Immunglobulin G (IgG) zusammen mit den CD16 tragenden Vesikeln aus Fig 1 d-f) und die Zelloberflächenexpression von CD8 und CD3 zeigen, dass die- se Zelle einen abnormen Differenzierungsstatus aufweist: Eine Zelle mit Merkmalen einer T Zelle (CD3, CD8), einer neuronalen Zelle (NeuN im Zellkern), eines Monozyten (CD16) und eines B Lymphocyten (IgG).
Proteine, die teilweise patientenspezifisch, das heißt mit individuell unterschiedlicher Wahrscheinlichkeit bzw. Häufigkeit mit CD8 und/oder CD16 in ALS-indikativen Zellen kolokalisiert sind, sind in Tabelle 1 angegeben. Alle diese Proteine stellen damit einzeln oder in Kombination mit CD8 und/oder CD16 therapeutische Zielstrukturen (Targets) dar, da ein Ausschalten dieser Proteine - beispielsweise durch entsprechende Antikörper/Liganden und/oder gentechnische Verfahren - zu einem Zusammenbruch des intrazellulären Informationsflusses und damit zum Funktionsverlust der aberran- ten Zellen führt.
Tabelle 1
Protein Offizielles Offizieller Name
Symbol
BMX [BMX] BMX non-receptor tyrosine kinase
GAK [GAK] cyclin G associated kinase
JNK2 [MAPK9] mitogen-activated protein kinase 9
MAPKK6 [MAP2K6] mitogen-activated protein kinase kinase 6
OTUB2 [OTUB2] OTU deubiquitinase, ubiquitin aldehyde binding 2
PRKAR2 [PRKAR2A] protein kinase cAMP-dependent type II regulatory sub- A unit alpha
RAC1 [RAC1 ] ras-related C3 botulinum toxin Substrate 1 (rho family, small GTP binding protein Rad )
SMAD2 [SMAD2] SMAD family member 2 SMAD4 [SMAD4] SMAD family member 4
STAP2 [STAP2] Signal transducing adaptor family member 2
SIRT1 [SIRT1 ] nicotinamide adenine dinucleotide-dependent protein deacetylase
Die Zelle aus Fig. 2 c,f), die wie oben begründet nach Invasion der Zelle aus Fig. 1 einen CD16 negativen Phänotyp exprimiert, bleibt positiv für NeuN. Bedeutung: Die oben beschriebene invasive Zelle ist als ALS-spezifische Zelle mit den oben genannten Merkmalen im Blut oder in Gewebeproben durch räumliche To- ponomanalyse detektierbar. Da deren Invasionsverhalten in die Pyramidenbahn wie oben dargelegt bekannt ist und da ferner bekannt ist, dass die Zelle offenbar durch Phänotyp switching (CD16-) zu einer NeuN positiven T Zelle transformiert, die Neuro- ne axotomiert, läßt die Detektion von Zellen des CD16/CD8 Phänotyps aus Fig. 1 c auf den Prozess der Axotomie schliessen. Daraus folgt, dass die Zellinvasion der Zelle aus Fig 1 c durch molekulare Blockierung oder Lyse therapeutisch verhindert werden muss, um die Axotomie zu verhindern und das Fortschreiten der ALS zu stoppen.
Der beschriebene Zwei-Stufenprozess (Homing aberranter„NeuN" positiver Blutzellen in die Pyramidenbahn, deren Transformation in„NeuN" positive T Zellen, die die Oberflächen von Nervenzellen verletzen) stellt eine Verletzung grundlegender Regeln der Kooperation von Zellen verschiedener Keimblätter dar: Diese Regeln beruhen in intakten Systemen darauf, dass Zellen aus verschiedenen Keimblättern die Regel der Nicht-Verletzung der gegenseitigen Zelloberflächen befolgen. Im Fall der ALS verletzen die transformierten T-Zell-artigen Zellen (Keimblatt Mesenchym) die Oberflächen von Neuronen (Keimblatt Ektoderm). Dadurch kommt es zu einer physischen transzellulären Vernetzung der beiden Keimblattfunktionen mit der Folge der Unterbre- chung der Nervenbahnen zu der Willkürmuskulatur. Die Tatsache der Expression von „NeuN" im Zellkern der agierenden Zellen (Immunzellen in der Zirkulation und nach Invasion in das Nervensystem der Pyramidenbahn) bedeutet, dass diese Zellen ei- nem Programm aberranter neuronaler Stammzellen folgen, da NeuN unter physiologischen Bedingungen nur in Neuronen exprimiert wird. Damit kann NeuN als Marker für das Vorliegen ALS-verursachender Zellen, das heißt zur Diagnose der ALS verwendet werden.
Um das molekulare„Programm" dieser aberranten Zellen zu blockieren, das heißt als Therapiemaßnahme zum Behandeln eines Patienten, der unter ALS leidet, bieten sich verschiedene molekulare Verfahren an, die Zellen in der Blutzirkulation, die das Leitprotein CD16 exprimieren, bereits vor deren transendothelialer Invasion therapeu- tisch zu modifizieren. Weitere Therapiemöglichkeiten, die einzeln oder in beliebiger Kombination durchgeführt werden können, sind in Fig. 3 gezeigt und umfassen:
1 . Gabe von Molekülen (Antikörper/Liganden), die IgG (1/3) binden und/oder blockieren/inhibieren bzw. den physiologischen Mechanismus der IgG-vermittel- ten Aktivierung von CD16 blockieren/inhibieren. Ein Beispiel hierfür sind Antikörper gegen IgG und (gegebenenfalls rekombinantes) Streptokokken Protein G;
2. Therapeutische Blockierung (z. B. durch Quervernetzung/cross-linking) des ALS-spezifischen Clusters CD16a+CD8+STTP1 , beispielsweise mittels wenigstens eines bi-, tri- oder multispezifischen Antikörpers (rekombinant, human, de novo etc.). STTP1 bezeichnet hierbei das gegebenenfalls Patientenspezifische Signalprotein (signal transduction protein 1 , z. B. Kinase), welches die vom Zellkern ausgehende Signalkaskade vermittelt und zusammen mit dem Modul„CD16a und CD8" an der Oberfläche der Zelle gekoppelt bzw. mit
CD16a und CD8 und kolokalisiert ist. STTP1 kann mit Hilfe der an sich bekannten MELK- und/oder ICM-Technik (Multi-Epitope-Ligand-Kartographie bzw. Imaging Cycler Mikroskopie) für den betreffenden Patienten individuell ermittelt bzw. kontrolliert werden. STTP1 kann beispielsweise ein oder mehre- re Proteine aus der Gruppe RAC1 , STAP2 und/oder SMAD2 und/oder ein anderes Protein aus der Signaltransduktionskette von ALS-Zellen sein. Ein ent- sprechender Antikörper, beispielsweise ein trispezifischer Anti-CD16a-CD8- STTP1 -Antikörper, kann dann ebenfalls über an sich bekannte Herstellungsverfahren hergestellt und zur Therapie des betreffenden Patienten verwendet werden. Da ein solcher trispezifischer Antikörper eine extrem hohe Selektivität für abnorme, ALS-spezifische Zellen aufweist, ist eine solche Behandlung besonders nebenwirkungsarm;
Gabe von Molekülen, die die proteolytische Abtrennung der extrazellulären CD16-Domänen (Ektodomänen) bewirken (sog. Shedding, bzw. Ectodomain- Shedding). Ein Beispiel hierfür ist die Gabe von Adam17 (Metallopeptidase Domäne 17), das auch TACE (tumor necrosis factor-a-converting enzyme) genannt wird. Adam17 ist ein 70-kDa Enzym, das zur ADAM Proteinfamilie von Disintegrinen und Metalloproteasen gehört. Adam17 bzw. das jeweilige CD16- Shedding-fähige Molekül kann optional mit einem mono-, bi-, tri- oder multispezifischen Antikörper (siehe Punkt 2) gekoppelt sein bzw. werden, um seine Spezifität vorteilhaft zu erhöhen;
Gabe wenigstens eines mono-, bi-, tri- oder multi-spezifischen Anti-CD16 Antikörpers (rekombinant, human, de novo etc.);
Gabe wenigstens eines mono-, bi-, tri- oder multi-spezifischen Anti-NeuN Antikörpers (rekombinant, human, de novo etc.) und/oder
Gabe von Molekülen, die das CD16-Gen (FCGR3A) und/oder das NeuN Gen blockieren.
Gabe von Lamellipodien-Extensions- und/oder -Migrationshemmern, um die Migration der ALS-Zellen und die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke zu unterbinden. Die oben genannten Verbindungen (Arzneimittel) können grundsätzlich einzeln oder in beliebiger Kombination verabreicht werden. Weiterhin können die genannten Verbindungen als pharmazeutische Zusammensetzung zusammen mit weiteren pharmazeutischen Stoffen und/oder Hilfsmitteln vorliegen. Die Galenik ist in an sich bekann- ter Weise anzupassen bzw. zu wählen. Weiterhin kann vorgesehen sein, dass das oder die Arzneimittel einmal oder mehrmals verabreicht wird bzw. werden. Ebenso kann vorgesehen sein, dass eine pharmazeutisch wirksame Dosis auf einmal oder auf zwei oder mehr Teildosen verteilt verabreicht wird. Die Therapie sollte durch regelmäßige Kontrolle überprüft und gegebenenfalls angepasst werden. Die Therapie- kontrolle kann beispielsweise mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Diagnose-Verfahrens durchgeführt werden. Bei erfolgreicher Therapie können üblicherweise signifikant weniger oder vorzugsweise keine abnormen ALS-spezifischen Zellen (siehe oben) mehr in der Zellprobe des betreffenden Patienten festgestellt werden. Generell ergeben sich damit zahlreiche ALS-spezifische überindividuelle und/oder individuelle thereutische Optionen. Eine überindividuelle Therapie kann auf die ALS- spezifischen Oberflächenproteine (CDs) bzw. Oberflächenproteincluster gerichtet sein, die quervernetzt, inhibiert oder anderweitig blockiert werden. Zusätzlich können gegebenenfalls zentrale Signal ketten-Moleküle von ALS-Zellen quervernetzt, inhibiert oder anderweitig blockiert werden. Beispielsweise können die Zelloberflächenproteine CD8/CD16A CD45RA gegebenenfalls zusammen mit dem Signalketten-Molekül RAC1 blockiert werden, da diese ausschließlich in ALS-Zellen direkt assoziiert vorkommen. Eine solche Therapie kann beispielsweise mit Hilfe von bi-, tri- und/oder tetraspezifischen Antikörpern bzw. durch entsprechende variable Einzelkettenfragmen- ten (scFv) oder multivalente Antikörperfragmente (scFv Multimere), das heißt durch sogenannte Diabodies, Triabodies oder Tetrabodies erfolgen.
Als individuelle Targets, die alternativ oder zusätzlich zu dem vorstehend bezeichneten ALS spezifischen Cluster therapeutisch adressiert werden können, umfassen in- dividuelle Cluster von CD16/CD8 mit den Molekülen STAP2 und/oder SMAD2 sowie gegebenenfalls Kombinationen der in Tabelle 1 bezeichneten Moleküle zusammen mit dem CD8/CD16 Cluster oder auch als isolierte Cluster ohne CD8/CD16. Auch diese Cluster können mit Hilfe von gegebenenfalls multispezifischen Antikörpern und/oder Antikörperfragmenten ausgeschaltet werden. Fig. 4 zeigt einen Vergleich zwischen einer klassischen Inkubation einer Zellprobe im hängenden Tropfen (Fig. 4a, 4b) und einer Inkubation mit verbesserter Diffusivität (Fig. 4c, Fig. 4d). Hierzu wird ein Kit oder eine Vorrichtung mit einem Schlauchsystem benutzt, um Antikörper und/oder Liganden enthaltende Lösungen auf eine Gewebe- oder Zellprobe aufzubringen, wobei die Lösung bei dem in Fig. 4c und 4d gezeig- ten Versuch in frei zu wählenden zeitlichen Intervallen innerhalb eines Schlauches des Schlauchsystems hin- und herbewegt bzw. wieder in den Schlauch aufgezogen und zurück auf die Gewebe- oder Zellprobe geleitet wurde, um eine verbesserte Interaktion der in der Lösung befindlichen Reagenzien mit der zu inkubierenden Probe zu erzeugen.
Die Gesamtzeit der Inkubation betrug in beiden Fällen 30 Minuten, wobei die Inkubationen jeweils bei Raumtemperatur durchgeführt wurden. Um die Physiologie von Antikörpern biologisch voll auszunutzen, das heißt um deren Scharnier-Region(en) zum Zwecke der Optimierung der Bindung an Epitope von Proteinen zu aktivieren, wurden ein einzelner Antikörpertyp und der Fluoreszenzfarbstoff FITC konjugiert. FITC stört die zuvor genannte Scharnierregion des Antikörpers nicht, weil es ein vergleichsweise kleines Molekül ist. Es ist aber zu betonen, dass anstelle von oder zusätzlich zu FITC auch anderweitige Markierung und Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden können, solange sie die Funktionalität der Scharnierregion nicht wesentlich stören.
Fig. 4a zeigt im Einzelnen die resultierende Grauwertverteilung der Markierung des Gewebes im„hängenden Tropfen" über 30 Minuten, wobei eine Zusammensetzung mit einer Antikörperkonzentration von 0,5 mg/ml verwendet wurde. Fig. 4b zeigt das entsprechende Histogramm zu Fig. 4a. Analog zeigt Fig. 4c die Grauwertverteilung der Markierung der Gewebe- bzw. Zellprobe nach 30 Minuten Gesamtinkubationszeit. Dabei wurde das gleiche Volumen der gleichen Zusammensetzung wie bei Fig. 4a/Fig. 4b insgesamt zehnmal alle 3 Minuten über insgesamt 30 Minuten in kurzen Pulsen (Jet Flow) aufgetragen, abge- saugt und wieder aufgetragen. Hierdurch wird die in Fig. 4c, 4d erkennbare Bindungsoptimierung durch Aktivierung der Scharnierregion des Antikörpers erreicht. Man erkennt eine signifikante Überlegenheit dieser Form des Aufbringens gegenüber der„klassischen" Methode des hängenden Tropfens mit einer Effizienzsteigerung von etwa 67%. Darüber hinaus wurden bislang nicht sichtbare subzelluläre Proteinanord- nungen erkennbar, die in Fig. 4c mit Pfeilen gekennzeichnet sind und eine pathologische Clusterung kennzeichnen.
Die in den Unterlagen angegebenen Parameterwerte zur Definition von Prozess- und Messbedingungen für die Charakterisierung von spezifischen Eigenschaften des Er- findungsgegenstands sind auch im Rahmen von Abweichungen - beispielsweise aufgrund von Messfehlern, Systemfehlern, Einwaagefehlern, DIN-Toleranzen und dergleichen - als vom Rahmen der Erfindung mitumfasst anzusehen.

Claims

Patentansprüche
1 . Antikörper und/oder Ligand, welcher mindestens eines aus der Gruppe CD16, CD8, STTP1 , NeuN, Bax, Bcl2, CD1 1 b, CD138, CD16A, CD29, CD2,
CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1 , RAC1 , BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2 bindet, zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS).
2. Antikörper und/oder Ligand nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS), welcher zwei, drei, vier, fünf oder mehr aus der Gruppe CD16, CD8, STTP1 , NeuN, Bax, Bcl2, CD1 1 b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1 , RAC1 , BMX,
GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2 bindet.
3. Antikörper und/oder Ligand nach Anspruch 2 zur Verwendung bei der Behand- lung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS), welcher zumindest CD16, CD8 und STTP1 bindet.
4. Antikörper und/oder Ligand nach Anspruch 3 zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS), bei welchem STTP1 wenigstens ein Protein aus der Gruppe RAC1 , STAP2 und SMAD2 ist.
5. Antikörper und/oder Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS), wobei der Antikörper und/oder Ligand rekombinant, human oder de novo hergestellt ist. Antikörper und/oder Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS), wobei der Antikörper und/oder Ligand wenigstens ein variables Einzelkettenfragment (scFv) und/oder ein multivalentes Antikörperfragment (scFv Multimer) umfasst oder ist.
Antikörper und/oder Ligand nach Anspruch 6 zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS), wobei der Antikörper und/oder Ligand ein Diabody, Triabody, Tetrabody, Pentabody, Hexabody, Heptabody oder Octabody ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS), welche wenigstens einen Antikörper und/oder Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS), welche wenigstens einen Antikörper und/oder Ligand, der CD8, CD16 sowie RAC1 bindet, und/oder wenigstens einen Antikörper und/oder Ligand, der CD8, CD16 sowie STAP2 und/oder SMAD2 bindet, umfasst.
IgG-lnhibitor zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS).
Lamellipodien-Extensions- und/oder -Migrationshemmer zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS).
CD16-Ectodomain-Shedding-Molekül zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS).
13. Inhibitor des CD16-Gens (FCGR3A) und/oder des NeuN Gens (RBFOX3) zur Verwendung bei der Behandlung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS).
14. Verfahren zum Behandeln von Amyotropher Lateralsklerose (ALS), bei wel- ehern einem Patienten eine pharmakologisch wirksame Dosis eines Antikörpers und/oder Liganden gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und/oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 8 oder 9 und/oder eines IgG-lnhibitors gemäß Anspruch 10 und/oder eines Lamellipodien-Exten- sions- und/oder -Migrationshemmers gemäß Anspruch 1 1 und/oder eines CD16-Ectodomain-Shedding-Moleküls gemäß Anspruch 12 und/oder eines Inhibitors des CD16-Gens (FCGR3A) und/oder des NeuN Gens (RBFOX3) gemäß Anspruch 13 verabreicht wird.
Verfahren zum Identifizieren von Zellen, welche indikativ für Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) sind, umfassend die Schritte
Bereitstellen einer Zellprobe eines Patienten; und
Prüfen, ob die Zellprobe wenigstens eine Zelle enthält, welche NeuN und/oder CD16 umfasst;
wobei der Patient unter ALS leidet, wenn die Zellprobe wenigstens eine Zelle enthält, welche NeuN und/oder CD16 enthält.
Verfahren nach Anspruch 15,
dadurch gekennzeichnet, dass
als Zellprobe eine Blutprobe und/oder eine Gewebeprobe des Patienten bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16,
dadurch gekennzeichnet, dass
geprüft wird, ob die Zellprobe wenigstens eine Zelle enthält, welche neben NeuN und/oder CD16 zusätzlich eines oder mehrere aus CD8, STTP1 , Bax, Bcl2, CD1 1 b, CD138, CD16A, CD29, CD2, CD45RA, CD49d, CD54, CD56, CD57, CD58, CD62L, CD3, HLADR, Immunglobulin G, MHCII, MHCI, SIRT1 , RAC1 , BMX, GAK, JNK2, MAPKK6, OTUB2, PRKAR2A, SMAD2, SMAD4 und STAP2 umfasst.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17,
dadurch gekennzeichnet, dass
zum Prüfen wenigstens eine Zusammensetzung, welche wenigstens einen Antikörper und/oder Ligand enthält, und/oder ein MELK- bzw. ICM-Verfahren (Multi-Epitop-Ligand Kartographie/Imaging Cycler Mikroskopie) und/oder ein Biochip und/oder ein Kit und/oder eine Vorrichtung verwendet wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, bei welchem die Zellprobe mit der Zusammensetzung, welche den wenigstens einen Antikörper und/oder Ligand enthält, beaufschlagt wird, indem zumindest ein Teil der Zusammensetzung durch wenigstens einen Hohlkörper auf die Zellprobe geleitet, wenigstens einmal zumindest teilweise in den Hohlkörper zurückgezogen und zumindest teilweise wieder auf die Zellprobe geleitet wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, bei welchem der Hohlkörper derart relativ zur Zellprobe angeordnet wird, dass die Zusammensetzung in einem Winkel zwischen 1 ° und 90° auf die Zellprobe geleitet und/oder von der Zellprobe zurückgezogen wird.
21 . Zusammensetzung und/oder Biochip und/oder Kit und/oder Vorrichtung zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 15 bis 20.
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