WO2016159153A1

WO2016159153A1 - Base member for cell culturing use, method for producing same, and cell culturing method using same

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Publication number: WO2016159153A1
Application number: PCT/JP2016/060513
Authority: WO
Inventors: 山田悟; 今富伸哉; 近藤聡; 前島雪絵
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2016-03-30
Publication date: 2016-10-06
Anticipated expiration: 2017-09-30
Also published as: JP2016192957A

Abstract

When the above-mentioned temperature-responsive polymer is used in a base member for cell culturing use, it is needed to lower the temperature of the base member for cell culturing use to a temperature equal to or lower than the critical solution of the polymer. In this case, however, the temperature of cells is also lowered simultaneously. In addition, since cells detached from the base member have a sheet-like form, it is needed to disperse the cells by pipetting or the like while keeping the cells at a low temperature, for the processing of the cells. As a result, the time of cooling of the cells is prolonged. The lowering of the temperature of the cells may induce the reduction in activity of the cells, and therefore it is needed to shorten the time of cooling of the cells. [Solution] The problem can be solved by providing: a base member for cell culturing use, which has a surface coated with a block copolymer, wherein the block copolymer contains a temperature-responsive polymer block (A) that has a lower critical solution temperature (LCST) against water of 0 to 50ºC and a hydrophilic polymer block (B) that does not have a LCST ranging in the range from 0 to 50ºC and has an HLB value (a Griffin method) of 9 to 20; and a base member for cell culturing use, which has a surface coated with a block copolymer, wherein the block copolymer contains a temperature-responsive polymer block (A) that has a lower critical solution temperature (LCST) against water of 0 to 50ºC and a block (B) that meets such a requirement (i) that the block (B) does not have an LCST in the range from 0 to 50ºC, such a requirement (ii) that the block (B) comprises a hydrophilic polymer of a monomer having at least one hydrophilic group selected from a carboxylic acid group, a carboxylic acid ester group, a carboxylic acid metal salt, a sulfonic acid group, a sulfonic acid ester group, a sulfonic acid metal salt, a hydroxy group, an alkoxy group, a phenoxy group, an amide group, a carbamoyl group, a sulfonamide group, a sulfamoyl group, a carbamate group, a phosphoric acid group, a metal salt of a phosphoric acid group, an oxyphosphoric acid group, a metal salt of an oxyphosphoric acid group, a phosphobetaine group, a sulfobetaine group, a carbobetaine group, a polyethylene glycol group and a pyrrolidone group and such a requirement (iii) the block (B) comprises the polymer mentioned in (ii) wherein the polymer contains at least one monomer unit selected from a monomer unit capable of forming an aromatic vinyl compound, a monomer unit capable of forming a (meth)acrylamide compound, a monomer unit capable of forming a fumaric acid diester compound, a monomer unit capable of forming vinyl chloride, a monomer unit capable of forming vinyl acetate, a monomer unit capable of forming (meth)acrylonitrile, a monomer unit capable of forming N-vinylimidazole and a monomer unit capable of forming N-vinylcarbazole.

Description

Cell culture substrate, method for producing the same, and cell culture method using the same

　本発明は、短時間での細胞剥離を可能にする細胞培養基材、その製造方法およびそれを用いた細胞培養方法に関する。さらに本発明は、細胞を最大直径５μｍ～３００μｍの大きさで剥離することを可能にする細胞培養基材、その製造方法およびそれを用いた細胞培養方法に関する。 The present invention relates to a cell culture substrate that enables cell detachment in a short time, a production method thereof, and a cell culture method using the same. Furthermore, the present invention relates to a cell culture substrate that enables cells to be detached with a maximum diameter of 5 μm to 300 μm, a method for producing the same, and a cell culture method using the same.

　細胞培養は生化学的な現象の理解や有用物質の産生などに用いられ、また近年、幹細胞の発見や培養技術の進歩により、再生医療を始めとする細胞を用いた治療に大きな注目が寄せられている。 Cell culture is used to understand biochemical phenomena and produce useful substances. In recent years, with the discovery of stem cells and the advancement of culture technology, there has been a great deal of attention in the treatment using cells such as regenerative medicine. ing.

　細胞の多くは接着性を有しており、体内においてはコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどの生体高分子に接着し、増殖・分化することが知られている。同様に、細胞培養においても接着性を有する細胞の多くは、培養する際に何らかの基材に接着する必要がある。従来、基材としては表面処理したガラスあるいは高分子が用いられていた。例えば、ポリスチレンにγ線照射あるいはシリコーンコーティングを行なった基材がある。また、コラーゲンやフィブロネクチンのような生体高分子を表面に塗布した支持体も用いられる。 Many cells have adhesiveness and are known to grow and differentiate in the body by adhering to biopolymers such as collagen, fibronectin and laminin. Similarly, many cells having adhesiveness in cell culture need to adhere to some kind of substrate when culturing. Conventionally, surface-treated glass or polymer has been used as a substrate. For example, there is a substrate obtained by subjecting polystyrene to γ-ray irradiation or silicone coating. In addition, a support on which a biopolymer such as collagen or fibronectin is coated on the surface is also used.

　増殖する細胞は基材上で培養後、一般的に別の基材に植え継ぐ必要が有り、多くの場合にはタンパク質分解酵素が用いられている。タンパク質分解酵素は細胞表面にあるタンパク質を分解し、細胞と基材の間の結合および細胞間の結合を切る役目を担っている。一方、タンパク質分解酵素は細胞の生存率に大きな影響を与えることが知られており、タンパク質分解酵素を用いずに細胞を基材から分離する手法は細胞にダメージを与えない方法として重要である。再生医療においても同様に、体外で培養した細胞にダメージを与えずに、さらに細胞間の結合を切断しない方法で細胞又は組織化した細胞を基材から分離し、体内に戻すことが求められており、タンパク質分解酵素を用いずに基材から分離する方法が求められている。 Proliferating cells need to be planted on another substrate after culturing on the substrate, and proteolytic enzymes are often used in many cases. Proteolytic enzymes are responsible for decomposing proteins on the cell surface and breaking the bonds between cells and substrates and between cells. On the other hand, it is known that proteolytic enzymes have a great influence on the survival rate of cells, and a technique of separating cells from a substrate without using proteolytic enzymes is important as a method that does not damage cells. Similarly, in regenerative medicine, there is a need to separate cells or organized cells from the base material and return them to the body without damaging cells cultured outside the body and further breaking the bonds between the cells. Therefore, there is a need for a method of separating from a substrate without using a proteolytic enzyme.

　上記問題を解決するために、温度応答性ポリマーを基材表面に被覆した細胞培養基材が開示されている。（特許文献１）。このような基材によれば、周囲環境の温度降下による温度応答性ポリマーのゾル転移で基材表面の接着力を弱めて、細胞を剥離させ、ダメージを与えることなく細胞を分別回収することができる。通常、細胞は体温付近で接着・培養する必要があり、培養後、体温以下で細胞を剥離できる基材が必要となる。 In order to solve the above problems, a cell culture substrate in which a temperature-responsive polymer is coated on the substrate surface is disclosed. (Patent Document 1). According to such a base material, it is possible to weaken the adhesive force on the surface of the base material by the sol transition of the temperature-responsive polymer due to a temperature drop in the surrounding environment, detach the cells, and collect and recover the cells without causing damage. it can. Usually, cells need to be adhered and cultured at around body temperature, and after culturing, a substrate capable of peeling cells at body temperature or lower is required.

　水中におけるゾル転移温度［臨界溶解温度（Ｔ）］が体温以下の範囲にある温度応答性ポリマーとして、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（Ｔ＝２１℃）、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ－Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Ｔ＝約２８℃）、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド
（Ｔ＝３２℃）等が記載されている（特許文献２、３）。 Poly-N-isopropylacrylamide (T = 32 ° C.), poly-Nn-propylacrylamide (T = T = 32 ° C.) as temperature-responsive polymers having a sol transition temperature [critical solution temperature (T)] in the range below body temperature in water. 21 ° C.), poly-Nn-propyl methacrylamide (T = 32 ° C.), poly-N-ethoxyethyl acrylamide (T = about 35 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl acrylamide (T = about 28 ° C.) Poly-N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide (T = about 35 ° C.), poly-N, N-diethylacrylamide (T = 32 ° C.) and the like are described (Patent Documents 2 and 3).

　上記温度応答性ポリマーを細胞培養基材に用いる場合、臨界溶解温度以下に細胞培養基材の温度を下げる必要があるが、同時に細胞を低温化してしまう。さらに、剥離してくる細胞はシート状であり、その後、細胞を加工するためには、低温を維持したまま、ピペッティング等で細胞を分散させる必要があり、冷却時間が長くなってしまっていた。細胞の低温化は細胞の活性低下を及ぼすため、冷却時間の短縮が必要であった。 When using the above temperature-responsive polymer as a cell culture substrate, it is necessary to lower the temperature of the cell culture substrate below the critical lysis temperature, but at the same time, the temperature of the cell is lowered. Furthermore, the cells that peel off are in the form of a sheet. After that, in order to process the cells, it was necessary to disperse the cells by pipetting while maintaining a low temperature, and the cooling time was prolonged. . Since the lowering of the cell temperature decreases the cell activity, it is necessary to shorten the cooling time.

国際公開第０１／０６８７９９号International Publication No. 01/068799 日本国特公平０６１０４０６１号公報Japanese Patent Publication No. 061040661 日本国特開平５－２４４９３８号公報Japanese Patent Laid-Open No. 5-244938

　本発明の目的は、短時間での細胞剥離を可能にする細胞培養基材、その製造方法およびそれを用いた細胞培養方法を提供することにある。さらに、もう一つの目的は、細胞を最大直径５μｍ～３００μｍの大きさで剥離し、細胞の分散化作業を省略できる細胞培養基材、その製造方法およびそれを用いた細胞培養方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a cell culture substrate that enables cell detachment in a short time, a method for producing the same, and a cell culture method using the same. Furthermore, another object is to provide a cell culture substrate capable of exfoliating cells with a maximum diameter of 5 μm to 300 μm and omitting cell dispersion, a method for producing the same, and a cell culture method using the same. It is in.

　本発明者らは、以上の点を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、温度応答性の重合体を、親水性の重合体でブロック共重合させたブロック共重合体を基材上に被覆し成膜することで、短時間での細胞剥離を可能にすること、細胞を最大直径５μｍ～３００μｍの大きさで剥離できることを見出し、本発明を完成した。 In view of the above points, the present inventors have conducted extensive research, and as a result, coated a block copolymer obtained by block copolymerization of a temperature-responsive polymer with a hydrophilic polymer on a substrate. It was found that forming a membrane enables cell detachment in a short time, and that cells can be detached with a maximum diameter of 5 μm to 300 μm, and the present invention has been completed.

　すなわち本発明によれば、以下のブロックを含むブロック共重合体で表面を被覆した細胞培養基材が提供される。
［１］下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体で表面を被覆した細胞培養基材。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃～５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）０℃～５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９～２０の範囲にある親水性重合体のブロック。
［２］ブロック（Ｂ）が、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの重合体であることを特徴とする［１］に記載の細胞培養基材。 That is, according to the present invention, there is provided a cell culture substrate whose surface is coated with a block copolymer containing the following blocks.
[1] A cell culture substrate whose surface is coated with a block copolymer containing the following blocks (A) and (B).
(A) A block of a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(B) A hydrophilic polymer block having no LCST in the range of 0 ° C. to 50 ° C. and having an HLB value (Griffin method) in the range of 9-20.
[2] The block (B) is a carboxylic acid group, a carboxylic acid ester group, a carboxylic acid metal salt, a sulfonic acid group, a sulfonic acid ester group, a sulfonic acid metal salt, a hydroxy group, an alkoxy group, a phenoxy group, an amide group, amino Alkyl group, carbamoyl group, sulfonamido group, sulfamoyl group, carbamate group, phosphate group, metal salt of phosphate group, oxyphosphate group, metal salt of oxyphosphate group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbobetaine group, The cell culture substrate according to [1], which is a polymer of a monomer having at least one hydrophilic group selected from a polyethylene glycol group and a pyrrolidone group.

　［３］ブロック（Ｂ）が水に対して溶解性を示すブロックであることを特徴とする［１］または［２］に記載の細胞培養基材。
［４］ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（１） [3] The cell culture substrate according to [1] or [2], wherein the block (B) is a block exhibiting solubility in water.
[4] The repeating unit of the block (A) is represented by the following general formula (1)

（式中、Ｒ^１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ^２およびＲ^３は各々独立して、水素基、炭素数１～６の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基であり、Ｒ^２とＲ^３は互いに結合してピロリジン環、ピペリジン環もしくはモルホリン環を形成しても良い。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］～［３］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［５］ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（２） (Wherein R ¹ is a hydrogen atom or a methyl group, R ² and R ³ are each independently a hydrogen group, a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, a furfuryl group or a tetrahydrofurfuryl group; ² and R ³ may be bonded to each other to form a pyrrolidine ring, piperidine ring or morpholine ring.
The cell according to any one of [1] to [3], which is a block of a (co) polymer comprising at least one block unit (a) among the block units represented by Culture substrate.
[5] The repeating unit of the block (A) is represented by the following general formula (2)

（式中、Ｒ^４は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ^５は、水素原子、炭素数１～６の炭化水素基であり、ａは１～１０の整数を表す。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］～［３］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［６］ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（３） (Wherein R ⁴ represents a hydrogen atom or a methyl group, R ⁵ represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, and a represents an integer of 1 to 10)
The cell according to any one of [1] to [3], which is a block of a (co) polymer comprising at least one block unit (a) among the block units represented by Culture substrate.
[6] The repeating unit of the block (A) is represented by the following general formula (3)

（式中、Ｒ^６は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ^７は炭素数１～６の炭化水素基を表す。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］～［３］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［７］ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（４） (In the formula, R ⁶ represents a hydrogen atom or a methyl group, and R ⁷ represents a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms.)
The cell according to any one of [1] to [3], which is a block of a (co) polymer comprising at least one block unit (a) among the block units represented by Culture substrate.
[7] The repeating unit of the block (B) is represented by the following general formula (4)

（式中、Ｒ^８は水素原子又はメチル基であり、Ｒ^９は、炭素数１～１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、Ｒ^１０は、炭素数１～４の２価の炭化水素基であり、Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１３は、互いに独立して、水素原子又は炭素数１～４の炭化水素基であり、Ａ^１は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］～［６］の何れか１項に記載の細胞培養基材。 (Wherein R ⁸ is a hydrogen atom or a methyl group, R ⁹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, or a (poly) oxyethylene group, and R ¹⁰ is a group having 1 to 10 carbon atoms) 4 is a divalent hydrocarbon group, R ¹¹ , R ¹² , and R ¹³ are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and A ¹ is an ester bond, an amide This is a divalent bond selected from the group consisting of a bond, a urethane bond, and an ether bond.)
The cell according to any one of [1] to [6], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) among the block units represented by Culture substrate.

　［８］ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（５） [8] The repeating unit of the block (B) is represented by the following general formula (5)

［式中、Ｒ^１４は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ^１５は－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｂ－（ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）Ｏ）_ｃ－Ｒ^１６（式中、Ｒ^１６は水素原子、炭素数１～３０のアルキル基であり、ｂは１～３００の整数であり、ｃは０～６０の整数である。）で表されるポリオキシアルキレン基、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｒ^１７（式中、Ｒ^１７は水素原子、炭素数１～５のアルキル基である。）で表される置換基、フルフリル基、テトラヒドロフルフリル基、水素原子を示す。］
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］～［６］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［９］ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（６） [Wherein R ¹⁴ represents a hydrogen atom or a methyl group, and R ¹⁵ represents — (CH ₂ CH ₂ O) _b — (CH ₂ CH (CH ₃ ) O) _c —R ¹⁶ (wherein R ¹⁶ represents hydrogen An atom, an alkyl group having 1 to 30 carbon atoms, b is an integer of 1 to 300, and c is an integer of 0 to 60)), —CH ₂ —O—R ¹⁷ (wherein R ¹⁷ represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms), a furfuryl group, a tetrahydrofurfuryl group, or a hydrogen atom. ]
The cell according to any one of [1] to [6], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) among the block units represented by Culture substrate.
[9] The repeating unit of the block (B) is represented by the following general formula (6)

（式中、Ｒ^１８は水素原子又はメチル基であり、Ｒ^１９は、炭素数１～１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、Ｒ^２０は、炭素数１～４の２価の炭化水素基であり、Ｒ^２１、Ｒ^２２は各々独立して、水素原子又は炭素数１～４の炭化水素基であり、Ａ^２は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、Ｘはスルホン酸アニオン基、カルボン酸アニオン基、リン酸アニオン基ある。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］～［６］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［１０］ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（７） (Wherein R ¹⁸ is a hydrogen atom or a methyl group, R ¹⁹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, or a (poly) oxyethylene group, and R ²⁰ is a group having 1 to 4 is a divalent hydrocarbon group, R ²¹ and R ²² are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and A ² is an ester bond, an amide bond, a urethane bond, And a divalent bond selected from the group consisting of ether bonds, and X is a sulfonate anion group, a carboxylate anion group, or a phosphate anion group.)
The cell according to any one of [1] to [6], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) among the block units represented by Culture substrate.
[10] The repeating unit of the block (B) is represented by the following general formula (7)

（式中、Ｒ^２３は水素原子又はメチル基であり、Ｒ^２４、Ｒ^２５は各々独立して水素原子又はメチル基である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］～［６］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［１１］　ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（８） (In the formula, R ²³ is a hydrogen atom or a methyl group, and R ²⁴ and R ²⁵ are each independently a hydrogen atom or a methyl group.)
The cell according to any one of [1] to [6], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) among the block units represented by Culture substrate.
[11] The repeating unit of the block (B) is represented by the following general formula (8)

（式中、Ｒ^２６は水素原子又はメチル基である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］～［６］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［１２］　ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（９） (In the formula, R ²⁶ is a hydrogen atom or a methyl group.)
The cell according to any one of [1] to [6], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) among the block units represented by Culture substrate.
[12] The repeating unit of the block (B) is represented by the following general formula (9)

（式中、Ｒ^２７は水素原子又はメチル基であり、Ｒ^２８は、炭素数１～１０の２価の炭化水素基であり、Ｒ^２９、Ｒ^３０は各々独立して、水素原子又は炭素数１～４の炭化水素基であり、Ａ^３は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］～［６］の何れか１項に記載の細胞培養基材。 (Wherein R ²⁷ is a hydrogen atom or a methyl group, R ²⁸ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, and R ²⁹ and R ³⁰ are each independently a hydrogen atom or a carbon number. 1 to 4 hydrocarbon groups, and A ³ is a divalent bond selected from the group consisting of an ester bond, an amide bond, a urethane bond, and an ether bond.
The cell according to any one of [1] to [6], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) among the block units represented by Culture substrate.

　［１３］全ブロック単位［（ａ）＋（ｂ）］に対するブロック単位（ａ）の比率が５～９５ｍｏｌ％であることを特徴とする［１］～［１２］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［１４］ブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）が３，０００以上１，０００，０００以下であることを特徴とする［１］～［１３］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［１５］　数平均分子量（Ｍｎ）が５，０００以上１００，０００以下であることを特徴とする［１］～［１３］の何れか１項に記載の細胞培養基材。 [13] The ratio according to any one of [1] to [12], wherein the ratio of the block unit (a) to the total block unit [(a) + (b)] is 5 to 95 mol% Cell culture substrate.
[14] The cell culture medium according to any one of [1] to [13], wherein the block copolymer has a number average molecular weight (Mn) of 3,000 to 1,000,000 Wood.
[15] The cell culture substrate according to any one of [1] to [13], wherein the number average molecular weight (Mn) is 5,000 or more and 100,000 or less.

　また、本発明によれば、以下の細胞培養基材が提供される。
［１６］下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体で表面を被覆した細胞培養基材。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃～５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）下記（ｉ）～（ｉｉｉ）の要件を満たすブロック。
（ｉ）０℃～５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない。
（ｉｉ）カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの親水性重合体である。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の重合体中に、芳香族ビニル化合物が生成するモノマー単位、（メタ）アクリルアミド化合物が生成するモノマー単位、フマル酸ジエステル化合物が生成するモノマー単位、塩化ビニルが生成するモノマー単位、酢酸ビニルが生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが生成するモノマー単位、Ｎ－ビニルイミダゾールが生成するモノマー単位、Ｎ－ビニルカルバゾールが生成するモノマー単位から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位を含有する。
［１７］ブロック（Ｂ）が水に対して溶解性を示すブロックであることを特徴とする［１６］に記載の細胞培養基材。
［１８］ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（１） According to the present invention, the following cell culture substrate is provided.
[16] A cell culture substrate whose surface is coated with a block copolymer containing the following blocks (A) and (B).
(A) A block of a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(B) A block that satisfies the following requirements (i) to (iii).
(I) No LCST in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(Ii) carboxylic acid group, carboxylic acid ester group, carboxylic acid metal salt, sulfonic acid group, sulfonic acid ester group, sulfonic acid metal salt, hydroxy group, alkoxy group, phenoxy group, amide group, aminoalkyl group, carbamoyl group, Sulfonamide group, sulfamoyl group, carbamate group, phosphate group, metal salt of phosphate group, oxyphosphate group, metal salt of oxyphosphate group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbobetaine group, polyethylene glycol group, pyrrolidone group A hydrophilic polymer of a monomer having at least one hydrophilic group selected from the group consisting of:
(Iii) In the polymer of (ii), a monomer unit produced by an aromatic vinyl compound, a monomer unit produced by a (meth) acrylamide compound, a monomer unit produced by a fumaric acid diester compound, and a monomer unit produced by vinyl chloride , Containing at least one monomer unit selected from a monomer unit produced by vinyl acetate, a monomer unit produced by (meth) acrylonitrile, a monomer unit produced by N-vinylimidazole, and a monomer unit produced by N-vinylcarbazole .
[17] The cell culture substrate according to [16], wherein the block (B) is a block showing solubility in water.
[18] The repeating unit of the block (A) is represented by the following general formula (1)

（式中、Ｒ^１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ^２およびＲ^３は各々独立して、水素基、炭素数１～６の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基であり、Ｒ^２とＲ^３は互いに結合してピロリジン環、ピペリジン環もしくはモルホリン環を形成しても良い。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］または［１７］に記載の細胞培養基材。
［１９］ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（２） (Wherein R ¹ is a hydrogen atom or a methyl group, R ² and R ³ are each independently a hydrogen group, a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, a furfuryl group or a tetrahydrofurfuryl group; ² and R ³ may be bonded to each other to form a pyrrolidine ring, piperidine ring or morpholine ring.
The cell culture substrate according to [16] or [17], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (a) among the block units represented by (16).
[19] The repeating unit of the block (A) is represented by the following general formula (2)

（式中、Ｒ^４は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ^５は、水素原子、炭素数１～６の炭化水素基であり、ａは１～１０の整数を表す。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］または［１７］に記載の細胞培養基材。
［２０］ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（３） (Wherein R ⁴ represents a hydrogen atom or a methyl group, R ⁵ represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, and a represents an integer of 1 to 10)
The cell culture substrate according to [16] or [17], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (a) among the block units represented by (16).
[20] The repeating unit of the block (A) is represented by the following general formula (3)

（式中、Ｒ^６は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ^７は炭素数１～６の炭化水素基を表す。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］または［１７］に記載の細胞培養基材。
［２１］ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（４） (In the formula, R ⁶ represents a hydrogen atom or a methyl group, and R ⁷ represents a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms.)
The cell culture substrate according to [16] or [17], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (a) among the block units represented by (16).
[21] The repeating unit of the hydrophilic polymer of the block (B) is represented by the following general formula (4)

（式中、Ｒ^８は水素原子又はメチル基であり、Ｒ^９は、炭素数１～１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、Ｒ^１０は、炭素数１～４の２価の炭化水素基であり、Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１３は、互いに独立して、水素原子又は炭素数１～４の炭化水素基であり、Ａ^１は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］～［２０］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［２２］ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（５） (Wherein R ⁸ is a hydrogen atom or a methyl group, R ⁹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, or a (poly) oxyethylene group, and R ¹⁰ is a group having 1 to 10 carbon atoms) 4 is a divalent hydrocarbon group, R ¹¹ , R ¹² , and R ¹³ are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and A ¹ is an ester bond, an amide This is a divalent bond selected from the group consisting of a bond, a urethane bond, and an ether bond.)
[16] The cell according to any one of [16] to [20], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) Culture substrate.
[22] The repeating unit of the hydrophilic polymer in the block (B) is represented by the following general formula (5)

［式中、Ｒ^１４は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ^１５は－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｂ－（ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）Ｏ）_ｃ－Ｒ^１６（式中、Ｒ^１６は水素原子、炭素数１～３０のアルキル基であり、ｂは１～３００の整数であり、ｃは０～６０の整数である。）で表されるポリオキシアルキレン基、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｒ^１７（式中、Ｒ^１７は水素原子、炭素数１～５のアルキル基である。）で表される置換基、フルフリル基、テトラヒドロフルフリル基、水素原子を示す。］
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］～［２０］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［２３］ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（６） [Wherein R ¹⁴ represents a hydrogen atom or a methyl group, and R ¹⁵ represents — (CH ₂ CH ₂ O) _b — (CH ₂ CH (CH ₃ ) O) _c —R ¹⁶ (wherein R ¹⁶ represents hydrogen An atom, an alkyl group having 1 to 30 carbon atoms, b is an integer of 1 to 300, and c is an integer of 0 to 60)), —CH ₂ —O—R ¹⁷ (wherein R ¹⁷ represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms), a furfuryl group, a tetrahydrofurfuryl group, or a hydrogen atom. ]
[16] The cell according to any one of [16] to [20], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) Culture substrate.
[23] The repeating unit of the hydrophilic polymer of the block (B) is represented by the following general formula (6)

（式中、Ｒ^１８は水素原子又はメチル基であり、Ｒ^１９は、炭素数１～１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、Ｒ^２０は、炭素数１～４の２価の炭化水素基であり、Ｒ^２１、Ｒ^２２は各々独立して、水素原子又は炭素数１～４の炭化水素基であり、Ａ^２は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、Ｘはスルホン酸アニオン基、カルボン酸アニオン基、リン酸アニオン基ある。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］～［２０］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［２４］ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（７） (Wherein R ¹⁸ is a hydrogen atom or a methyl group, R ¹⁹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, or a (poly) oxyethylene group, and R ²⁰ is a group having 1 to 4 is a divalent hydrocarbon group, R ²¹ and R ²² are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and A ² is an ester bond, an amide bond, a urethane bond, And a divalent bond selected from the group consisting of ether bonds, and X is a sulfonate anion group, a carboxylate anion group, or a phosphate anion group.)
[16] The cell according to any one of [16] to [20], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) Culture substrate.
[24] The repeating unit of the hydrophilic polymer of the block (B) is represented by the following general formula (7)

（式中、Ｒ^２３は水素原子又はメチル基であり、Ｒ^２４、Ｒ^２５は各々独立して水素原子又はメチル基である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］～［２０］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［２５］　ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（８） (In the formula, R ²³ is a hydrogen atom or a methyl group, and R ²⁴ and R ²⁵ are each independently a hydrogen atom or a methyl group.)
[16] The cell according to any one of [16] to [20], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) Culture substrate.
[25] The repeating unit of the hydrophilic polymer of the block (B) is represented by the following general formula (8)

（式中、Ｒ^２６は水素原子又はメチル基である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］～［２０］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［２６］　ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（９） (In the formula, R ²⁶ is a hydrogen atom or a methyl group.)
[16] The cell according to any one of [16] to [20], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) Culture substrate.
[26] The repeating unit of the hydrophilic polymer of the block (B) is represented by the following general formula (9)

（式中、Ｒ^２７は水素原子又はメチル基であり、Ｒ^２８は、炭素数１～１０の２価の炭化水素基であり、Ｒ^２９、Ｒ^３０は各々独立して、水素原子又は炭素数１～４の炭化水素基であり、Ａ^３は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］～［２０］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［２７］全ブロック単位［（ａ）＋（ｂ）］に対するブロック単位（ａ）の比率が５～９５ｍｏｌ％であることを特徴とする［１６］～［２６］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［２８］ブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）が３，０００以上１，０００，０００以下であることを特徴とする［１６］～［２７］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
また、本発明によれば、以下の製造方法が提供される。
［２９］下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体を、溶媒に溶解させ、基材に塗布後、乾燥することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃～５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）０℃～５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９～２０の範囲にある親水性重合体のブロック。
［３０］ブロック（Ｂ）が、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの重合体であることを特徴とする［２９］に記載の製造方法。
［３１］下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体を、溶媒に溶解させ、基材に塗布後、乾燥することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃～５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）下記（ｉ）～（ｉｉｉ）の要件を満たすブロック。
（ｉ）０℃～５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない。
（ｉｉ）カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの親水性重合体である。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の重合体中に、芳香族ビニル化合物が生成するモノマー単位、（メタ）アクリルアミド化合物が生成するモノマー単位、フマル酸ジエステル化合物が生成するモノマー単位、塩化ビニルが生成するモノマー単位、酢酸ビニルが生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが生成するモノマー単位、Ｎ－ビニルイミダゾールが生成するモノマー単位、Ｎ－ビニルカルバゾールが生成するモノマー単位から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位を含有する。
［３２］下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体を、基材に化学結合で固定化することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃～５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）０℃～５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９～２０の範囲にある親水性重合体のブロック。
［３３］ブロック（Ｂ）が、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの重合体であることを特徴とする［３２］に記載の製造方法。
［３４］下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体を、基材に化学結合で固定化することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃～５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）下記（ｉ）～（ｉｉｉ）の要件を満たすブロック。
（ｉ）０℃～５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない。
（ｉｉ）カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの親水性重合体である。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の重合体中に、芳香族ビニル化合物が生成するモノマー単位、（メタ）アクリルアミド化合物が生成するモノマー単位、フマル酸ジエステル化合物が生成するモノマー単位、塩化ビニルが生成するモノマー単位、酢酸ビニルが生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが生成するモノマー単位、Ｎ－ビニルイミダゾールが生成するモノマー単位、Ｎ－ビニルカルバゾールが生成するモノマー単位から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位を含有する。
また、本発明によれば、以下の細胞培養方法が提供される。
［３５］［１］～［２８］の何れか１項に記載の細胞培養基材を用いて、下限臨界溶解温度(ＬＣＳＴ)より高い温度で細胞を培養し、細胞増殖後に温度をＬＣＳＴより低くして増殖細胞を基材から剥離することを特徴とする細胞培養方法。
［３６］培養した細胞が最大直径５μｍ～３００μｍの大きさで剥離することを特徴とする［３５］に記載の細胞培養方法。
［３７］培養した細胞が単一細胞で剥離することを特徴とする［３５］または［３６］に記載の細胞培養方法。
［３８］［３５］～［３７］のいずれか１項に記載の細胞培養方法で剥離した細胞を用いて、細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。 (Wherein R ²⁷ is a hydrogen atom or a methyl group, R ²⁸ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, and R ²⁹ and R ³⁰ are each independently a hydrogen atom or a carbon number. 1 to 4 hydrocarbon groups, and A ³ is a divalent bond selected from the group consisting of an ester bond, an amide bond, a urethane bond, and an ether bond.
[16] The cell according to any one of [16] to [20], which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) Culture substrate.
[27] The ratio of the block unit (a) to the total block unit [(a) + (b)] is 5 to 95 mol%, according to any one of [16] to [26] Cell culture substrate.
[28] The cell culture medium according to any one of [16] to [27], wherein the block copolymer has a number average molecular weight (Mn) of 3,000 to 1,000,000 Wood.
Moreover, according to this invention, the following manufacturing methods are provided.
[29] A method for producing a cell culture substrate, comprising dissolving a block copolymer containing the following blocks (A) and (B) in a solvent, applying the solution to a substrate, and drying the solution.
(A) A block of a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(B) A hydrophilic polymer block having no LCST in the range of 0 ° C. to 50 ° C. and having an HLB value (Griffin method) in the range of 9-20.
[30] The block (B) is a carboxylic acid group, a carboxylic acid ester group, a carboxylic acid metal salt, a sulfonic acid group, a sulfonic acid ester group, a sulfonic acid metal salt, a hydroxy group, an alkoxy group, a phenoxy group, an amide group, amino Alkyl group, carbamoyl group, sulfonamido group, sulfamoyl group, carbamate group, phosphate group, metal salt of phosphate group, oxyphosphate group, metal salt of oxyphosphate group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbobetaine group, [29] The production method according to [29], which is a polymer of a monomer having at least one hydrophilic group selected from a polyethylene glycol group and a pyrrolidone group.
[31] A method for producing a cell culture substrate, comprising dissolving a block copolymer containing the following blocks (A) and (B) in a solvent, applying the solution to a substrate, and drying the solution.
(A) A block of a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(B) A block that satisfies the following requirements (i) to (iii).
(I) No LCST in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(Ii) carboxylic acid group, carboxylic acid ester group, carboxylic acid metal salt, sulfonic acid group, sulfonic acid ester group, sulfonic acid metal salt, hydroxy group, alkoxy group, phenoxy group, amide group, aminoalkyl group, carbamoyl group, Sulfonamide group, sulfamoyl group, carbamate group, phosphate group, metal salt of phosphate group, oxyphosphate group, metal salt of oxyphosphate group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbobetaine group, polyethylene glycol group, pyrrolidone group A hydrophilic polymer of a monomer having at least one hydrophilic group selected from the group consisting of:
(Iii) In the polymer of (ii), a monomer unit produced by an aromatic vinyl compound, a monomer unit produced by a (meth) acrylamide compound, a monomer unit produced by a fumaric acid diester compound, and a monomer unit produced by vinyl chloride , Containing at least one monomer unit selected from a monomer unit produced by vinyl acetate, a monomer unit produced by (meth) acrylonitrile, a monomer unit produced by N-vinylimidazole, and a monomer unit produced by N-vinylcarbazole .
[32] A method for producing a cell culture substrate, comprising immobilizing a block copolymer containing the following blocks (A) and (B) to the substrate by chemical bonding.
(A) A block of a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(B) A hydrophilic polymer block having no LCST in the range of 0 ° C. to 50 ° C. and having an HLB value (Griffin method) in the range of 9-20.
[33] Block (B) is a carboxylic acid group, a carboxylic acid ester group, a carboxylic acid metal salt, a sulfonic acid group, a sulfonic acid ester group, a sulfonic acid metal salt, a hydroxy group, an alkoxy group, a phenoxy group, an amide group, amino Alkyl group, carbamoyl group, sulfonamido group, sulfamoyl group, carbamate group, phosphate group, metal salt of phosphate group, oxyphosphate group, metal salt of oxyphosphate group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbobetaine group, The production method according to [32], which is a polymer of a monomer having at least one hydrophilic group selected from a polyethylene glycol group and a pyrrolidone group.
[34] A method for producing a cell culture substrate, comprising immobilizing a block copolymer containing the following blocks (A) and (B) to the substrate by chemical bonding.
(A) A block of a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(B) A block that satisfies the following requirements (i) to (iii).
(I) No LCST in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(Ii) carboxylic acid group, carboxylic acid ester group, carboxylic acid metal salt, sulfonic acid group, sulfonic acid ester group, sulfonic acid metal salt, hydroxy group, alkoxy group, phenoxy group, amide group, aminoalkyl group, carbamoyl group, Sulfonamide group, sulfamoyl group, carbamate group, phosphate group, metal salt of phosphate group, oxyphosphate group, metal salt of oxyphosphate group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbobetaine group, polyethylene glycol group, pyrrolidone group A hydrophilic polymer of a monomer having at least one hydrophilic group selected from the group consisting of:
(Iii) In the polymer of (ii), a monomer unit produced by an aromatic vinyl compound, a monomer unit produced by a (meth) acrylamide compound, a monomer unit produced by a fumaric acid diester compound, and a monomer unit produced by vinyl chloride , Containing at least one monomer unit selected from a monomer unit produced by vinyl acetate, a monomer unit produced by (meth) acrylonitrile, a monomer unit produced by N-vinylimidazole, and a monomer unit produced by N-vinylcarbazole .
The present invention also provides the following cell culture method.
[35] Using the cell culture substrate according to any one of [1] to [28], cells are cultured at a temperature higher than the lower critical lysis temperature (LCST), and the temperature is lower than the LCST after cell growth. And then detaching the proliferating cells from the substrate.
[36] The cell culture method according to [35], wherein the cultured cells are detached with a maximum diameter of 5 μm to 300 μm.
[37] The cell culture method according to [35] or [36], wherein the cultured cells are detached as single cells.
[38] A cell culture method comprising culturing cells using the cells detached by the cell culture method according to any one of [35] to [37].

　温度応答性の重合体を、親水性の重合体でブロック共重合させた、ブロック共重合体から得られる膜を細胞培養基材に被覆すれば、細胞培養後、温度降下による基材表面の親水化が促進され短時間での細胞剥離が可能になる。また、細胞を最大直径５μｍ～３００μｍの大きさで剥離することによって、シート状で剥離する場合に必要であった細胞の分散化作業を簡素化できる。具体的には、酵素消化による細胞剥離の工程を省略することにより、作業に要する時間、工程の削減、操作者毎の誤差の軽減につなげることができる。またこれによって、細胞培養後、冷却処理を施しても、細胞にダメージを与えることなく、短時間で細胞を分別回収できる細胞培養基材が得られるようになる。 If a cell culture substrate is coated with a membrane obtained from a block copolymer obtained by block copolymerization of a temperature-responsive polymer with a hydrophilic polymer, the hydrophilicity of the substrate surface due to temperature drop after cell culture. Acceleration is enabled and cell detachment in a short time becomes possible. In addition, by separating cells with a maximum diameter of 5 μm to 300 μm, it is possible to simplify the cell dispersal operation that was necessary when separating cells. Specifically, by omitting the cell detachment step by enzymatic digestion, it is possible to reduce the time required for the work, the reduction of the step, and the error for each operator. This also provides a cell culture substrate that can be separated and collected in a short time without damaging the cells even after cooling treatment after the cell culture.

　以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。 Hereinafter, a mode for carrying out the present invention (hereinafter simply referred to as “the present embodiment”) will be described in detail. The following embodiments are exemplifications for explaining the present invention, and are not intended to limit the present invention to the following contents. The present invention can be appropriately modified and implemented within the scope of the gist.

　本発明の細胞培養基材は、特定の（Ａ）および特定の（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体が表面に被覆された基材である。
本発明の細胞培養基材の一つ（第一の発明）は、下記（Ａ）および（Ｂ）
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃～５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）０℃～５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９～２０の範囲にある親水性重合体のブロック。
のブロックを含むブロック共重合体で表面を被覆した細胞培養基材である。 The cell culture substrate of the present invention is a substrate having a surface coated with a block copolymer containing specific (A) and specific (B) blocks.
One of the cell culture substrates of the present invention (first invention) is the following (A) and (B)
(A) A block of a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(B) A hydrophilic polymer block having no LCST in the range of 0 ° C. to 50 ° C. and having an HLB value (Griffin method) in the range of 9-20.
A cell culture substrate whose surface is coated with a block copolymer containing the above block.

　本明細書において、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ；Ｌｏｗｅｒ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）とは、この温度よりも低い温度では高分子が水に溶解して透明の溶液になるが、この温度よりも高い温度では不溶化して白濁するか沈殿が生じ、相分離する温度である。 In this specification, the lower critical solution temperature (LCST) means that the polymer dissolves in water at a temperature lower than this temperature and becomes a transparent solution, but becomes insoluble at a temperature higher than this temperature. The temperature at which the solution becomes cloudy or precipitates and the phases are separated.

　第一の発明におけるブロック（Ａ）はＬＣＳＴが０℃～５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロックである。本発明の培養基材を用いた場合に、体温付近で細胞接着性を付与すると共に、温度降下で細胞を剥離し、ダメージを与えることなく細胞を分別回収することを目的に、ブロック（Ａ）のＬＣＳＴは２５℃～４５℃の範囲にあることが好ましく、２８℃～４０℃の範囲にあることがさらに好ましい。ＬＣＳＴが０℃未満であれば細胞にダメージを与えることなく剥離することが困難となり、５０℃を超えれば体温付近で細胞を接着できなくなり、細胞培養が困難となる。 The block (A) in the first invention is a block of a temperature-responsive polymer having an LCST in the range of 0 ° C. to 50 ° C. Block (A) for the purpose of separating and recovering cells without damaging them while imparting cell adhesion near the body temperature when the culture substrate of the present invention is used. The LCST is preferably in the range of 25 ° C. to 45 ° C., more preferably in the range of 28 ° C. to 40 ° C. If the LCST is less than 0 ° C., it becomes difficult to detach without damaging the cells, and if it exceeds 50 ° C., the cells cannot be adhered near the body temperature, and cell culture becomes difficult.

　第一の発明におけるブロック（Ａ）は、特に限定は無いが、下記一般式（１） The block (A) in the first invention is not particularly limited, but the following general formula (1)

で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックを用いることができる。 Among these block units, a (co) polymer block comprising at least one block unit (a) can be used.

　Ｒ^１は水素原子又はメチル基であり、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、水素原子が用いられる。 R ¹ is a hydrogen atom or a methyl group, and a hydrogen atom is used to bring the LCST into a range of 25 ° C. to 45 ° C.

　Ｒ^２およびＲ^３は各々独立して、水素基、炭素数１～６の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基であり、Ｒ^２とＲ^３は互いに結合してピロリジン環、ピペリジン環もしくはモルホリン環を形成しても良い。 R ² and R ³ are each independently a hydrogen group, a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, a furfuryl group or a tetrahydrofurfuryl group, and R ² and R ³ are bonded to each other to form a pyrrolidine ring, a piperidine ring or A morpholine ring may be formed.

　炭素数１～６の炭化水素基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、好ましくはｎ－プロピル基、イソプロピル基が用いられる。 Examples of the hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert. -Butyl group, n-hexyl group and isohexyl group can be exemplified, but n-propyl group and isopropyl group are preferably used in order to make LCST in the range of 25 ° C to 45 ° C.

　第一の発明における一般式（１）で表されるブロック（Ａ）としては、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、１－（１－オキソ－２－プロペニル）ピロリジン、１－（１－オキソ－２－メチルー２－プロペニル）ピロリジン、１－（１－オキソ－２－プロペニル）ピペリジン、１－（１－オキソ－２－メチルー２－プロペニル）ピペリジン、４－（１－オキソ－２－プロペニル）モルホリン、４－（１－オキソ－２－メチルー２－プロペニル）モルホリンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、好ましくはＮ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミドの重合体を、ＬＣＳＴを２８℃～４０℃の範囲にするために、さらに好ましくはＮ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドの重合体を用いることができる。 As the block (A) represented by the general formula (1) in the first invention, N, N-diethylacrylamide, N-ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, N- Isopropylacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N-cyclopropylmethacrylamide, N-ethoxyethylacrylamide, N-ethoxyethylmethacrylamide, N-tetrahydrofurfurylacrylamide, N-tetrahydrofurfurylmethacrylamide, 1- (1-oxo-2-propenyl) pyrrolidine, 1- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl) pyrrolidine, 1- (1-oxo-2-propenyl) piperidine, 1- (1-oxo-2 -Methyl-2- Examples include (co) polymers of at least one monomer selected from (lopenyl) piperidine, 4- (1-oxo-2-propenyl) morpholine, 4- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl) morpholine, In order to make the LCST in the range of 25 ° C. to 45 ° C., preferably N, N-diethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, N-isopropylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, N-ethoxyethylacrylamide, N -In order to make the polymer of tetrahydrofurfuryl acrylamide and N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide in the range of 28 to 40 ° C LCST, more preferably a polymer of N, N-diethylacrylamide and N-isopropylacrylamide Can be used.

　第一の発明におけるブロック（Ａ）は、特に限定は無いが、下記一般式（２） The block (A) in the first invention is not particularly limited, but the following general formula (2)

　で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックを用いることができる。 Among the block units represented by, a (co) polymer block comprising at least one type of block unit (a) can be used.

　Ｒ^４は水素原子またはメチル基を表し、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、水素原子が用いられる。 R ⁴ represents a hydrogen atom or a methyl group, to a range of 25 ° C. ~ 45 ° C. The LCST, hydrogen atom is used.

　Ｒ^５は、水素原子、炭素数１～６の炭化水素基であり、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、炭素数１～３のアルキル基が用いられる。 R ⁵ is a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, and an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is used in order to bring the LCST into a range of 25 ° C. to 45 ° C.

　炭素数１～６の炭化水素基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基が用いられる。 Examples of the hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert. -Butyl group, n-hexyl group and isohexyl group can be exemplified, but a methyl group, an ethyl group and an n-propyl group are preferably used in order to bring the LCST into a range of 25 ° C to 45 ° C.

　ａは１～１０の整数であり、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、１～３の整数が用いられる。 A is an integer of 1 to 10, and an integer of 1 to 3 is used to make LCST in the range of 25 ° C to 45 ° C.

　第一の発明における一般式（２）で表されるブロック（Ａ）としては、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、好ましくは２－（２－エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルの重合体を用いることができる。 The block (A) represented by the general formula (2) in the first invention is preferably a polymer of 2- (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether so that the LCST is in the range of 25 ° C. to 45 ° C. Can be used.

　第一の発明におけるブロック（Ａ）は、特に限定は無いが、下記一般式（３） The block (A) in the first invention is not particularly limited, but the following general formula (3)

　Ｒ^６は水素原子またはメチル基を表し、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、水素原子が用いられる。 R ⁶ represents a hydrogen atom or a methyl group, and a hydrogen atom is used to make LCST in the range of 25 ° C. to 45 ° C.

　Ｒ^７は炭素数１～６の炭化水素基を表し、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、好ましくはメチル基、エチル基が用いられる。 R ⁷ represents a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert. -Butyl group, n-hexyl group and isohexyl group can be exemplified, but a methyl group and an ethyl group are preferably used in order to bring the LCST into a range of 25 ° C to 45 ° C.

　第一の発明における一般式（３）で表されるブロック（Ａ）としては、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、好ましくはメチルビニルエーテルの重合体を用いることができる。 As the block (A) represented by the general formula (3) in the first invention, a polymer of methyl vinyl ether can be preferably used so that the LCST is in the range of 25 ° C to 45 ° C.

　本明細書において、ＨＬＢ値（ＨＬＢ；Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ－Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ　Ｂａｌａｎｃｅ）とは、Ｗ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，　Ｊ．　Ｓｏｃ．　Ｃｏｓｍｅｔｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，　１，　３１１（１９４９）．に記載の、水と油への親和性の程度を表す値であり、０から２０までの値を取り、０に近いほど親油性が高く、２０に近いほど親水性が高くなる。計算によって決定する方法として、アトラス法、グリフィン法、デイビス法、川上法があるが、本発明においてはグリフィン法で計算した値を使用し、ブロック単位中の親水部の式量とブロック単位の総式量を元に、下記の計算式で求めた。
ＨＬＢ値＝２０×（親水部の式量）÷（総式量）
　第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、０℃～５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、特定範囲のＨＬＢ値を有する親水性重合体のブロックである。
第一の発明におけるブロック（Ｂ）としては、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの（共）重合体を例示することができる。 In the present specification, the HLB value (HLB; Hydrophile-Lipophile Balance) C. Griffin, J. et al. Soc. Cosmetic Chemists, 1, 311 (1949). Is a value representing the degree of affinity for water and oil, and takes a value from 0 to 20, and the closer to 0, the higher the lipophilicity, and the closer to 20, the higher the hydrophilicity. There are Atlas method, Griffin method, Davis method, and Kawakami method as the method to be determined by calculation.In the present invention, the value calculated by the Griffin method is used, and the formula amount of the hydrophilic part in the block unit and the total of the block unit are used. It calculated | required with the following formula based on the formula amount.
HLB value = 20 × (formula amount of hydrophilic part) ÷ (total formula amount)
The block (B) in the first invention is a hydrophilic polymer block having an HLB value in a specific range and having no LCST in the range of 0 ° C. to 50 ° C.
As the block (B) in the first invention, carboxylic acid group, carboxylic acid ester group, carboxylic acid metal salt, sulfonic acid group, sulfonic acid ester group, sulfonic acid metal salt, hydroxy group, alkoxy group, phenoxy group, amide Group, aminoalkyl group, carbamoyl group, sulfonamido group, sulfamoyl group, carbamate group, phosphate group, metal salt of phosphate group, oxyphosphate group, metal salt of oxyphosphate group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbo Examples thereof include (co) polymers of monomers having at least one hydrophilic group selected from a betaine group, a polyethylene glycol group, and a pyrrolidone group.

　第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはタンパク質、ペプチド、糖タンパク質等の生体高分子と親和性の無いブロックまたは細胞と親和性の無いブロックであり、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、メトキシエチレン基、フルフリル基、ジアルキルアミノアルキル基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの重合体である。 The block (B) in the first invention is preferably a block having no affinity for biopolymers such as proteins, peptides, glycoproteins or the like, in order to shorten the cooling time required for cell detachment. A polymer of a block and having at least one hydrophilic group selected from a phosphobetaine group, a sulfobetaine group, a carbobetaine group, a polyethylene glycol group, a methoxyethylene group, a furfuryl group, a dialkylaminoalkyl group, and a pyrrolidone group It is.

　第一の発明におけるＨＬＢ値は９～２０の範囲にあるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは１１～２０の範囲にあり、さらに好ましくは１３～２０の範囲にある。ＨＬＢ値が９未満である場合は、細胞剥離に必要な冷却時間が長くなり、細胞の活性低下を招く。
また、第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは水に対して溶解性を示すブロックであり、より好ましくは２０℃の水１００ｍＬに０．５ｇ以上溶解するブロックであり、さらに好ましくは２０℃の水１００ｍＬに１ｇ以上溶解するブロックである。 The HLB value in the first invention is in the range of 9 to 20, but is preferably in the range of 11 to 20, more preferably in the range of 13 to 20 for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment. It is in. When the HLB value is less than 9, the cooling time required for cell detachment becomes longer, leading to a decrease in cell activity.
Further, the block (B) in the first invention is preferably a block exhibiting solubility in water in order to shorten the cooling time required for cell detachment, and more preferably 0 in 100 mL of water at 20 ° C. A block that dissolves 5 g or more, more preferably a block that dissolves 1 g or more in 100 mL of water at 20 ° C.

　第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、特に限定は無いが、下記一般式（４） The block (B) in the first invention is not particularly limited, but the following general formula (4)

　で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックを用いることができる。 Among the block units represented by, a (co) polymer block comprising at least one type of block unit (b) can be used.

　Ｒ^８は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的にメチル基が用いられる。 R ⁸ represents a hydrogen atom or a methyl group, and a methyl group is used for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment.

　Ｒ^９は、炭素数１～１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基：－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－（式中、ｎは本発明のブロック共重合体に適切な親水性と生体適合性を付与するブロック（Ｂ）の機能を損なわない限り特に限定されず、例えば１～１０である。なお、該（ポリ）オキシエチレン基は－Ｏ－を介して基Ａ^１と結合する。）であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の炭素数１～６の２価のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。 R ⁹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, or (poly) oxyethylene group: — (OCH ₂ CH ₂ ) _n — (wherein n is suitable for the block copolymer of the present invention). There is no particular limitation as long as the function of the block (B) imparting hydrophilicity and biocompatibility is not impaired, for example, 1 to 10. The (poly) oxyethylene group is a group A ¹ through —O—. And preferably a divalent alkylene group having 1 to 6 carbon atoms such as methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene, etc., for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment. And more preferably ethylene.

　Ｒ^１０は、炭素数１～４の２価の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン等のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。 R ¹⁰ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and is preferably an alkylene group such as methylene, ethylene, propylene, butylene for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment. More preferably, it is ethylene.

　Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１３は、各々独立して、水素原子又は炭素数１～４の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは、Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１３が同時に水素原子またはメチル基であり、更に好ましくは同時にメチル基である。 R ¹¹ , R ¹² , and R ¹³ are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment, preferably R 11 ¹¹ , R ¹² and R ¹³ are simultaneously a hydrogen atom or a methyl group, more preferably a methyl group.

　Ａ^１は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくはエステル結合、アミド結合であり、特に好ましくはエステル結合である。 A ¹ is a divalent bond selected from the group consisting of an ester bond, an amide bond, a urethane bond, and an ether bond, and for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment, preferably an ester bond, An amide bond, particularly preferably an ester bond.

　第一の発明における一般式（４）で表されるブロック（Ｂ）としては、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２－アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３－（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４－（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６－（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０－（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω－（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２－アクリルアミドエチルホスホリルコリン、３－アクリルアミドプロピルホスホリルコリン、４－アクリルアミドブチルホスホリルコリン、６－アクリルアミドヘキシルホスホリルコリン、１０－アクリルアミドデシルホスホリルコリン、ω－（メタ）アクリルアミド（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルエタノールアミン、２－アクリロイルオキシエチルホスホリルエタノールアミン、３－（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルエタノールアミン、４－（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルエタノールアミン、６－（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルエタノールアミン、１０－（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルエタノールアミン、ω－（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体を用いることができる。 The block (B) represented by the general formula (4) in the first invention includes 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, 2-acryloyloxyethyl phosphorylcholine, 3- (meth) acryloyloxypropyl phosphorylcholine, 4- (meth) Acryloyloxybutyl phosphorylcholine, 6- (meth) acryloyloxyhexyl phosphorylcholine, 10- (meth) acryloyloxydecylphosphorylcholine, ω- (meth) acryloyl (poly) oxyethylene phosphorylcholine, 2-acrylamidoethylphosphorylcholine, 3-acrylamidopropylphosphorylcholine, 4-acrylamidobutylphosphorylcholine, 6-acrylamidehexylphosphorylcholine, 10-acrylamidedecylphosphorylcholine, ω- ( (Meth) acrylamide (poly) oxyethylene phosphorylcholine, 2-methacryloyloxyethyl phosphorylethanolamine, 2-acryloyloxyethyl phosphorylethanolamine, 3- (meth) acryloyloxypropyl phosphorylethanolamine, 4- (meth) acryloyloxybutyl phosphorylethanol (Copolymer) of at least one monomer selected from amine, 6- (meth) acryloyloxyhexyl phosphorylethanolamine, 10- (meth) acryloyloxydecyl phosphorylethanolamine, ω- (meth) acryloyl (poly) oxyethylene phosphorylethanolamine. ) A polymer can be exemplified, but 2-methacryloyloxyethylphosphine is preferable for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment. It can be used a polymer of Rirukorin.

　第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、特に限定は無いが、下記一般式（５） The block (B) in the first invention is not particularly limited, but the following general formula (5)

で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックを用いることができる。 Among these block units, a (co) polymer block comprising at least one type of block unit (b) can be used.

　Ｒ^１４は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的にメチル基が用いられる。 R ¹⁴ represents a hydrogen atom or a methyl group, and a methyl group is used for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment.

　Ｒ^１５は－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｂ－（ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）Ｏ）_ｃ－Ｒ^１６（式中、Ｒ^１６は水素原子、炭素数１～３０のアルキル基であり、ｂは１～３００の整数であり、ｃは０～６０の整数である。）で表されるポリオキシアルキレン基、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｒ^１７（式中、Ｒ^１７は水素原子、炭素数１～６の炭化水素基である。）で表される置換基、フルフリル基、テトラヒドロフルフリル基、水素原子を示す。 R ¹⁵ is — (CH ₂ CH ₂ O) _b — (CH ₂ CH (CH ₃ ) O) _c —R ¹⁶ (wherein R ¹⁶ is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 30 carbon atoms, and b is A polyoxyalkylene group represented by the formula: —CH ₂ —O—R ¹⁷ (wherein R ¹⁷ is a hydrogen atom, a carbon number of 1 to 6 is a substituent represented by (6), a furfuryl group, a tetrahydrofurfuryl group, and a hydrogen atom.

　Ｒ^１６に用いられる炭素数１～３０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に好ましくはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が用いられる。 Examples of the alkyl group having 1 to 30 carbon atoms used for R ¹⁶ include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert. -Butyl group, n-hexyl group and isohexyl group can be exemplified, but methyl group, ethyl group, n-propyl group and isopropyl group are preferably used for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment.

　Ｒ^１７に用いられる炭素数１～６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に好ましくはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が用いられる。 Examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms used for R ¹⁷ include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert. -Butyl group, n-hexyl group and isohexyl group can be exemplified, but methyl group, ethyl group, n-propyl group and isopropyl group are preferably used for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment.

　第一の発明における一般式（５）で表されるブロック（Ｂ）としては、ポリエチレングリコールメタクリレート、２－ヒドロキシエチルアクリレート、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、２－メトキシエチルアクリレート、２－メトキシエチルメタクリレート、フルフリルアクリレート、フルフリルメタクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレートまたはテトラヒドロフルフリルメタクリレートから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくはポリエチレングリコールメタクリレート、２－メトキシエチルアクリレートまたはテトラヒドロフルフリルアクリレートから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を用いることができる。 The block (B) represented by the general formula (5) in the first invention includes polyethylene glycol methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, hydroxymethyl acrylate, hydroxymethyl methacrylate, 2-methoxyethyl acrylate. , A (co) polymer of at least one monomer selected from 2-methoxyethyl methacrylate, furfuryl acrylate, furfuryl methacrylate, tetrahydrofurfuryl acrylate, or tetrahydrofurfuryl methacrylate. For the purpose of shortening, preferably selected from polyethylene glycol methacrylate, 2-methoxyethyl acrylate or tetrahydrofurfuryl acrylate. It can be used at least one monomer (co) polymers to be.

　第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、特に限定は無いが、下記一般式（６） The block (B) in the first invention is not particularly limited, but the following general formula (6)

　Ｒ^１８は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的にメチル基が用いられる。 R ¹⁸ represents a hydrogen atom or a methyl group, and a methyl group is used for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment.

　Ｒ^１９は、炭素数１～１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基：－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－（式中、ｎは本発明のブロック共重合体に適切な親水性と生体適合性を付与するブロック（Ｂ）の機能を損なわない限り特に限定されず、例えば１～１０である。なお、該（ポリ）オキシエチレン基は－Ｏ－を介して基Ａ^１と結合する。）であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の炭素数１～６の２価のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。 R ¹⁹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms or a (poly) oxyethylene group: — (OCH ₂ CH ₂ ) _n — (wherein n is suitable for the block copolymer of the present invention). There is no particular limitation as long as the function of the block (B) imparting hydrophilicity and biocompatibility is not impaired, for example, 1 to 10. The (poly) oxyethylene group is a group A ¹ through —O—. And preferably a divalent alkylene group having 1 to 6 carbon atoms such as methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene, etc., for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment. And more preferably ethylene.

　Ｒ^２０は、炭素数１～４の２価の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン等のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。 R ²⁰ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and is preferably an alkylene group such as methylene, ethylene, propylene, butylene for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment. More preferably, it is ethylene.

　Ｒ^２１及びＲ^２２は、各々独立して、水素原子又は炭素数１～４の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは、Ｒ^２１及びＲ^２２が同時に水素原子またはメチル基であり、更に好ましくは同時にメチル基である。 R ²¹ and R ²² are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and preferably R ²¹ and R ²² for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment. Are simultaneously a hydrogen atom or a methyl group, more preferably a methyl group.

　Ａ^２は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくはエステル結合、アミド結合であり、特に好ましくはエステル結合である。 A ² is an ester bond, an amide bond, a urethane bond, and a divalent bond selected from the group consisting of ether bond, for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment, preferably an ester bond, An amide bond, particularly preferably an ester bond.

　Ｘはスルホン酸アニオン基、カルボン酸アニオン基、リン酸アニオン基ある。 X is a sulfonate anion group, a carboxylic acid anion group, or a phosphate anion group.

　第一の発明における一般式（６）で表されるブロック（Ｂ）としては、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（２－カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２－アクリロイルオキシエチル）（２－カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（３－カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２－アクリロイルオキシエチル）（３－カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（４－スルホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（２－スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２－アクリロイルオキシエチル）（２－スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２－アクリロイルオキシエチル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（２－ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２－アクリロイルオキシエチル）（２－ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（３－ホスホナトプロピル）アミニウム、またはジメチル（２－アクリロイルオキシエチル）（３－ホスホナトプロピル）アミニウムから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくはジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（２－カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（４－スルホナトブチル）アミニウムまたはジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（２－スルホナトエチル）アミニウムから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を用いることができる。 Examples of the block (B) represented by the general formula (6) in the first invention include dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (carboxylatomethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (2-carboxylatoethyl). ) Aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (2-carboxylatoethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (3-carboxylatopropyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (3-carboxylato) Propyl) aminium, dimethyl (2-methacryloylaminopropyl) (3-sulfonatopropyl) aminium, dimethyl (2-methacryloylaminopropyl) (4-sulfonatobutyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxy) Ethyl) (2-sulfonatoethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (2-sulfonatoethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (3-sulfonatopropyl) aminium, dimethyl (2-acryloyl) Oxyethyl) (3-sulfonatopropyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (2-phosphonatoethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (2-phosphonatoethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) Examples include (co) polymers of at least one monomer selected from (3-phosphonatopropyl) aminium or dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (3-phosphonatopropyl) aminium. For the purpose of shortening the cooling time required for the separation, preferably dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (carboxylatomethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (2-carboxylatoethyl) aminium, dimethyl ( At least selected from 2-methacryloylaminopropyl) (3-sulfonatopropyl) aminium, dimethyl (2-methacryloylaminopropyl) (4-sulfonatobutyl) aminium or dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (2-sulfonatoethyl) aminium One monomer (co) polymer can be used.

　第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、特に限定は無いが、下記一般式（７） The block (B) in the first invention is not particularly limited, but the following general formula (7)

　Ｒ^２３は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的にメチル基が用いられる。 R ²³ represents a hydrogen atom or a methyl group, and a methyl group is used for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment.

　Ｒ^２４、Ｒ^２５は各々独立して水素原子又はメチル基である。 R ²⁴ and R ²⁵ are each independently a hydrogen atom or a methyl group.

　第一の発明における一般式（７）で表されるブロック（Ｂ）としては、アクリルアミドまたはＮ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を用いることができる。 As the block (B) represented by the general formula (7) in the first invention, a (co) polymer of at least one monomer selected from acrylamide or N, N-dimethylacrylamide can be used.

　第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、特に限定は無いが、下記一般式（８） The block (B) in the first invention is not particularly limited, but the following general formula (8)

　Ｒ^２６は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的にメチル基が用いられる。 R ²⁶ represents a hydrogen atom or a methyl group, and a methyl group is used for the purpose of shortening the cooling time required for cell detachment.

　第一の発明における一般式（８）で表されるブロック（Ｂ）としては、Ｎ－ビニルピロリドンの（共）重合体を用いることができる。
第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、特に限定は無いが、下記一般式（９） As the block (B) represented by the general formula (8) in the first invention, a (co) polymer of N-vinylpyrrolidone can be used.
The block (B) in the first invention is not particularly limited, but the following general formula (9)

で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる重合体のブロックを用いることができる。
Ｒ^２７は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するためにメチル基が用いられる。
Ｒ^２８は炭素数１～１０の２価の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の炭素数１～６の２価のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。 Among these block units, a polymer block comprising at least one type of block unit (b) can be used.
R ²⁷ represents a hydrogen atom or a methyl group, a methyl group is used to shorten the cooling time required for the cell detachment.
R ²⁸ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, and preferably has a carbon number of 1 such as methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene, etc. in order to shorten the cooling time required for cell detachment. To 6 divalent alkylene groups, more preferably ethylene.

　Ｒ^２９及びＲ^３０は、各々独立して、水素原子又は炭素数１～４の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、Ｒ^２９及びＲ^３０が同時に水素原子またはメチル基であり、更に好ましくは同時にメチル基である。
Ａ^３は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはエステル結合、アミド結合であり、特に好ましくはエステル結合である。 R ²⁹ and R ³⁰ are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms. In order to shorten the cooling time required for cell detachment, it is preferable that R ²⁹ and R ³⁰ are simultaneously A hydrogen atom or a methyl group, more preferably a methyl group at the same time.
A ³ is a divalent bond selected from the group consisting of an ester bond, an amide bond, a urethane bond, and an ether bond, and is preferably an ester bond or an amide bond in order to shorten the cooling time required for cell detachment. And particularly preferably an ester bond.

　第一の発明における一般式（９）で表されるブロック（Ｂ）としては、アミノメチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノメチル（メタ）アクリレート、アミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、３－アミノプロピル（メタ）アクリレート、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）－プロピル（メタ）アクリレート、３－（Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノ）－プロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミドメチルアミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、ジエチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、（メタ）アクリルアミドエチルアミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミン、ジエチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミン、３－（メタ）アクリルアミドプロピルアミン、ジメチル［３－（メタ）アクリルアミドプロピル］アミン、ジエチル［３－（メタ）アクリルアミドエチル］アミンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはＮ，Ｎ－ジメチルアミノメチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体である。 The block (B) represented by the general formula (9) in the first invention includes aminomethyl (meth) acrylate, N, N-dimethylaminomethyl (meth) acrylate, N, N-diethylaminomethyl (meth) acrylate Aminoethyl (meth) acrylate, N, N-dimethylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-diethylaminoethyl (meth) acrylate, 3-aminopropyl (meth) acrylate, 3- (N, N-dimethylamino) -Propyl (meth) acrylate, 3- (N, N-diethylamino) -propyl (meth) acrylate, (meth) acrylamide methylamine, dimethyl [(meth) acrylamidomethyl] amine, diethyl [(meth) acrylamidomethyl] amine, (Meth) acrylamidoethylamine, Methyl [(meth) acrylamidoethyl] amine, diethyl [(meth) acrylamidoethyl] amine, 3- (meth) acrylamidopropylamine, dimethyl [3- (meth) acrylamidopropyl] amine, diethyl [3- (meth) acrylamidoethyl An (co) polymer of at least one monomer selected from amines can be exemplified, but in order to shorten the cooling time required for cell detachment, N, N-dimethylaminomethyl (meth) acrylate, preferably N, N A polymer of at least one monomer selected from dimethylaminoethyl (meth) acrylate, dimethyl [(meth) acrylamidomethyl] amine, dimethyl [(meth) acrylamidoethyl] amine.

　第一の発明の細胞培養基材に用いるブロック共重合体は、基材に被覆した場合に、細胞接着性を付与すると共に、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくはブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロック（Ａ）、およびブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロック（Ｂ）を含むブロック共重合体を用いることができる。さらに好ましくは、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドの重合体のブロック（Ａ）と２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体のブロック（Ｂ）を含むブロック共重合体を用いることができる。 The block copolymer used for the cell culture substrate of the first invention is preferably used for the purpose of imparting cell adhesion and shortening the cooling time required for cell detachment when coated on the substrate. A block copolymer comprising a block (A) of a (co) polymer comprising the block unit (a) and a block (B) of the (co) polymer comprising the block unit (b) can be used. More preferably, a block copolymer containing a block (A) of a polymer of N-isopropylacrylamide and a block (B) of a polymer of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine can be used.

　全ブロック単位［（ａ）＋（ｂ）］に対する（ａ）の比率は１～９５ｍｏｌ％であり、基材に被覆した場合に、細胞接着性を付与すると共に、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、５～８５ｍｏｌ％であることが好ましい。１ｍｏｌ％未満であれば細胞接着性が低下し、９５ｍｏｌ％を超えれば細胞剥離に必要な冷却時間が長くなる。 The ratio of (a) to all block units [(a) + (b)] is 1 to 95 mol%. When coated on a substrate, cell adhesion is imparted and cooling time required for cell detachment is increased. For the purpose of shortening, the content is preferably 5 to 85 mol%. If it is less than 1 mol%, the cell adhesiveness is lowered, and if it exceeds 95 mol%, the cooling time required for cell detachment becomes longer.

　第一の発明に用いるブロック共重合体は、ブロック（Ａ）または（Ｂ）中に、ブロック単位（ａ）または（ｂ）以外のモノマー単位を含有できる。
ブロック単位（ａ）または（ｂ）以外のモノマー単位を生成するモノマーとしては、スチレン、１－ビニルナフタレン、２－ビニルナフタレン、９－ビニルアントラセン、１－ビニルピレンおよびその誘導体等の芳香族ビニル化合物、Ｎ－ｎ－オクチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ｎ－デシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ｎ－ドデシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ｎ－ヘキサデシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ｎ－オクタデシル（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ－ビニル－ｎ－オクチルアミド、Ｎ－ビニル－ｎ－デシルアミド、Ｎ－ビニル－ｎ－ドデシルアミド、Ｎ－ビニル－ｎ－ヘキサデシルアミド等のＮ－ビニルアミド化合物、Ｎ－シクロヘキシルマレイミド、Ｎ－フェニルマレイミド等のＮ－アルキルマレイミド化合物、フマル酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル、フマル酸ジ－ｎ－ブチル等のフマル酸ジエステル化合物、塩化ビニル、酢酸ビニル、（メタ）アクリロニトリル、Ｎ－ビニルイミダゾール、Ｎ－ビニルカルバゾールを例示できる。 The block copolymer used in the first invention can contain monomer units other than the block unit (a) or (b) in the block (A) or (B).
Monomers that generate monomer units other than the block unit (a) or (b) include aromatic vinyl compounds such as styrene, 1-vinylnaphthalene, 2-vinylnaphthalene, 9-vinylanthracene, 1-vinylpyrene and derivatives thereof, Nn-octyl (meth) acrylamide, Nn-decyl (meth) acrylamide, Nn-dodecyl (meth) acrylamide, Nn-hexadecyl (meth) acrylamide, Nn-octadecyl (meth) acrylamide, etc. N-vinylamide compounds such as (meth) acrylamide compounds, N-vinyl-n-octylamide, N-vinyl-n-decylamide, N-vinyl-n-dodecylamide, N-vinyl-n-hexadecylamide, N -N-acrylates such as cyclohexylmaleimide and N-phenylmaleimide Kill maleimide compound, fumarate -tert- butyl, fumaric acid diester compounds such as fumarate -n- butyl, vinyl chloride, vinyl acetate, can be exemplified (meth) acrylonitrile, N- vinylimidazole, N- vinylcarbazole.

　さらに、第一の発明に用いるブロック共重合体は、ブロック（Ａ）または（Ｂ）以外の重合体ブロックを含むことができる。 Furthermore, the block copolymer used in the first invention can contain a polymer block other than the block (A) or (B).

　ブロック（Ａ）または（Ｂ）以外の重合体ブロックを生成するモノマーとしては、前記ブロック単位（ａ）または（ｂ）以外のモノマー単位を生成するモノマーを例示できる。
第一の発明に用いるブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）は３，０００以上１，０００，０００以下の範囲にあり、好ましくは４，０００以上５００，０００以下、さらに好ましくは５，０００以上１００，０００以下である。３，０００未満の場合は細胞培養基材に被覆しても細胞培養中に基材から培地中に溶出してしまう。また、１，０００，０００を越える場合は溶液粘度が高くなり、細胞培養基材への被覆が困難になる。 As a monomer which produces | generates polymer blocks other than block (A) or (B), the monomer which produces | generates monomer units other than the said block unit (a) or (b) can be illustrated.
The number average molecular weight (Mn) of the block copolymer used in the first invention is in the range of 3,000 to 1,000,000, preferably 4,000 to 500,000, more preferably 5,000. More than 100,000. In the case of less than 3,000, even if the cell culture substrate is coated, it is eluted from the substrate into the medium during cell culture. On the other hand, when it exceeds 1,000,000, the solution viscosity becomes high and it becomes difficult to coat the cell culture substrate.

　第一の発明に用いるブロック共重合体の合成方法としては、特に限定はないが、株式会社エヌ・ティー・エス発行、“ラジカル重合ハンドブック”、ｐ．１６１～２２５（２０１０）に記載のリビングラジカル重合技術を用いて、共重合する方法を用いることができる。 The method for synthesizing the block copolymer used in the first invention is not particularly limited, but is published by NTS Corporation, “Radical Polymerization Handbook”, p. 161 to 225 (2010), and a copolymerization method can be used.

　重合するモノマーの順番としては、ブロック単位（ｂ）を生成するモノマーを（共）重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを（共）重合する方法、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを（共）重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ｂ）を生成するモノマーを（共）重合する方法、ブロック単位（ｂ）を生成するモノマーを（共）重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを（共）重合し、更に未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ｂ）を生成するモノマーを（共）重合する方法、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを（共）重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ｂ）を生成するモノマーを（共）重合し、更に未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを（共）重合する方法、ブロック単位（ｂ）を生成するモノマーを（共）重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）または（ｂ）以外のモノマー単位を生成するモノマーを（共）重合し、更に未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを（共）重合する方法、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを（共）重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）または（ｂ）以外のモノマー単位を生成するモノマーを（共）重合し、更に未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ｂ）を生成するモノマーを（共）重合する方法を例示することができる。 As the order of the monomers to be polymerized, a method of (co) polymerizing the monomer that produces the block unit (b), removing the unreacted monomer, and (co) polymerizing the monomer that produces the block unit (a), block A method of (co) polymerizing the monomer that generates the unit (a) and removing the unreacted monomer, and then (co) polymerizing the monomer that generates the block unit (b), and a monomer that generates the block unit (b). After (co) polymerizing and removing the unreacted monomer, the monomer producing the block unit (a) is (co) polymerized, and after further removing the unreacted monomer, the monomer producing the block unit (b) is ( (Co) polymerization method, (co) polymerization of the monomer that produces the block unit (a), after removing the unreacted monomer, (co) polymerization of the monomer that produces the block unit (b), After removing the monomer, a method of (co) polymerizing the monomer that generates the block unit (a), (co) polymerizing the monomer that generates the block unit (b), removing the unreacted monomer, a method of (co) polymerizing a monomer that generates a monomer unit other than a) or (b), further removing an unreacted monomer, and (co) polymerizing a monomer that generates a block unit (a), (Co) polymerization of the monomer that produces a), after removing the unreacted monomer, (co) polymerization of a monomer that produces a monomer unit other than the block unit (a) or (b), A method of (co) polymerizing the monomer that forms the block unit (b) after removal can be exemplified.

　本発明のもう一つの細胞培養基材（第二の発明）は、下記（Ａ）および（Ｂ）
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃～５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）下記（ｉ）～（ｉｉｉ）の要件を満たすブロック。
（ｉ）０℃～５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない。
（ｉｉ）カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの親水性重合体である。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の重合体中に、芳香族ビニル化合物が生成するモノマー単位、（メタ）アクリルアミド化合物が生成するモノマー単位、フマル酸ジエステル化合物が生成するモノマー単位、塩化ビニルが生成するモノマー単位、酢酸ビニルが生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが生成するモノマー単位、Ｎ－ビニルイミダゾールが生成するモノマー単位、Ｎ－ビニルカルバゾールが生成するモノマー単位から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位を含有する。
のブロックを含むブロック共重合体で表面を被覆した細胞培養基材である。
第二の発明におけるブロック（Ａ）はＬＣＳＴが０℃～５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロックである。本発明の培養基材を用いた場合に、体温付近で細胞接着性を付与すると共に、温度降下で細胞を剥離し、ダメージを与えることなく細胞を分別回収するために、ブロック（Ａ）のＬＣＳＴは２５℃～４５℃の範囲にあることが好ましく、２８℃～４０℃の範囲にあることがさらに好ましい。ＬＣＳＴが０℃未満であれば細胞にダメージを与えることなく剥離することが困難となり、５０℃を超えれば体温付近で細胞培養が困難となる。
第二の発明におけるブロック（Ａ）は、特に限定は無いが、下記一般式（１） Another cell culture substrate of the present invention (second invention) includes the following (A) and (B)
(A) A block of a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(B) A block that satisfies the following requirements (i) to (iii).
(I) No LCST in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(Ii) carboxylic acid group, carboxylic acid ester group, carboxylic acid metal salt, sulfonic acid group, sulfonic acid ester group, sulfonic acid metal salt, hydroxy group, alkoxy group, phenoxy group, amide group, aminoalkyl group, carbamoyl group, Sulfonamide group, sulfamoyl group, carbamate group, phosphate group, metal salt of phosphate group, oxyphosphate group, metal salt of oxyphosphate group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbobetaine group, polyethylene glycol group, pyrrolidone group A hydrophilic polymer of a monomer having at least one hydrophilic group selected from the group consisting of:
(Iii) In the polymer of (ii), a monomer unit produced by an aromatic vinyl compound, a monomer unit produced by a (meth) acrylamide compound, a monomer unit produced by a fumaric acid diester compound, and a monomer unit produced by vinyl chloride , Containing at least one monomer unit selected from a monomer unit produced by vinyl acetate, a monomer unit produced by (meth) acrylonitrile, a monomer unit produced by N-vinylimidazole, and a monomer unit produced by N-vinylcarbazole .
A cell culture substrate whose surface is coated with a block copolymer containing the above block.
The block (A) in the second invention is a block of a temperature-responsive polymer having an LCST in the range of 0 ° C. to 50 ° C. When the culture substrate of the present invention is used, the LCST of the block (A) is used to impart cell adhesion at around body temperature, detach the cells when the temperature drops, and collect and collect the cells without damage. Is preferably in the range of 25 ° C to 45 ° C, more preferably in the range of 28 ° C to 40 ° C. If LCST is less than 0 ° C., it is difficult to detach without damaging the cells, and if it exceeds 50 ° C., cell culture is difficult near body temperature.
The block (A) in the second invention is not particularly limited, but the following general formula (1)

で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる重合体のブロックを用いることができる。 Among these block units, a polymer block comprising at least one type of block unit (a) can be used.

　第二の発明における一般式（１）で表されるブロック（Ａ）としては、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、１－（１－オキソ－２－プロペニル）ピロリジン、１－（１－オキソ－２－メチルー２－プロペニル）ピロリジン、１－（１－オキソ－２－プロペニル）ピペリジン、１－（１－オキソ－２－メチルー２－プロペニル）ピペリジン、４－（１－オキソ－２－プロペニル）モルホリン、４－（１－オキソ－２－メチルー２－プロペニル）モルホリンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、好ましくはＮ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミドの重合体を、ＬＣＳＴを２８℃～４０℃の範囲にするために、さらに好ましくはＮ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドの重合体を用いる。 The block (A) represented by the general formula (1) in the second invention includes N, N-diethylacrylamide, N-ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, N- Isopropylacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N-cyclopropylmethacrylamide, N-ethoxyethylacrylamide, N-ethoxyethylmethacrylamide, N-tetrahydrofurfurylacrylamide, N-tetrahydrofurfurylmethacrylamide, 1- (1-oxo-2-propenyl) pyrrolidine, 1- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl) pyrrolidine, 1- (1-oxo-2-propenyl) piperidine, 1- (1-oxo-2 -Methyl-2- Examples include polymers of at least one monomer selected from (lopenyl) piperidine, 4- (1-oxo-2-propenyl) morpholine, and 4- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl) morpholine. Preferably, N, N-diethyl acrylamide, Nn-propyl acrylamide, N-isopropyl acrylamide, Nn-propyl methacrylamide, N-ethoxyethyl acrylamide, N-tetrahydroflur in order to be in the range of from 0 to 45 ° C. A polymer of N, N-diethylacrylamide or N-isopropylacrylamide is more preferably used in order to make the polymer of furylacrylamide and N-tetrahydrofurfurylmethacrylamide in the range of 28 to 40 ° C. LCST.

　第二の発明におけるブロック（Ａ）は、特に限定は無いが、下記一般式（２） The block (A) in the second invention is not particularly limited, but the following general formula (2)

で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる重合体のブロックを用いることができる。
Ｒ^４は水素原子またはメチル基を表し、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、水素原子が用いられる。
Ｒ^５は、水素原子、炭素数１～６の炭化水素基であり、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、炭素数１～３のアルキル基が用いられる。
炭素数１～６の炭化水素基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基が用いられる。
ａは１～１０の整数であり、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、１～３の整数が用いられる。 Among these block units, a polymer block comprising at least one type of block unit (a) can be used.
R ⁴ represents a hydrogen atom or a methyl group, and a hydrogen atom is used to make LCST in the range of 25 ° C. to 45 ° C.
R ⁵ is a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, and an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is used in order to bring the LCST into a range of 25 ° C. to 45 ° C.
Examples of the hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert. -Butyl group, n-hexyl group and isohexyl group can be exemplified, but a methyl group, an ethyl group and an n-propyl group are preferably used in order to bring the LCST into a range of 25 ° C to 45 ° C.
a is an integer of 1 to 10, and an integer of 1 to 3 is used to make LCST in the range of 25 ° C to 45 ° C.

　第二の発明における一般式（２）で表されるブロック（Ａ）としては、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、好ましくは２－（２－エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルの重合体が用いられる。
第二の発明におけるブロック（Ａ）は、特に限定は無いが、下記一般式（３） The block (A) represented by the general formula (2) in the second invention is preferably a polymer of 2- (2-ethoxy) ethoxyethyl vinyl ether so that the LCST is in the range of 25 ° C. to 45 ° C. Is used.
The block (A) in the second invention is not particularly limited, but the following general formula (3)

で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる重合体のブロックを用いることができる。
Ｒ^６は水素原子またはメチル基を表し、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、水素原子が用いられる。
Ｒ^７は炭素数１～６の炭化水素基を表し、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、好ましくはメチル基、エチル基が用いられる。
第二の発明における一般式（３）で表されるブロック（Ａ）としては、ＬＣＳＴを２５℃～４５℃の範囲にするために、好ましくはメチルビニルエーテルの重合体が用いられる。 Among these block units, a polymer block comprising at least one type of block unit (a) can be used.
R ⁶ represents a hydrogen atom or a methyl group, and a hydrogen atom is used to make LCST in the range of 25 ° C. to 45 ° C.
R ⁷ represents a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert. -Butyl group, n-hexyl group and isohexyl group can be exemplified, but a methyl group and an ethyl group are preferably used in order to bring the LCST into a range of 25 ° C to 45 ° C.
As the block (A) represented by the general formula (3) in the second invention, a polymer of methyl vinyl ether is preferably used so that the LCST is in the range of 25 ° C to 45 ° C.

　第二の発明におけるブロック（Ｂ）は、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）
（ｉ）０℃～５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない。
（ｉｉ）カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの親水性重合体である。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の重合体中に、芳香族ビニル化合物モノマーが生成するモノマー単位、（メタ）アクリルアミド化合物が生成するモノマー単位、フマル酸ジエステル化合物が生成するモノマー単位、塩化ビニルが生成するモノマー単位、酢酸ビニルが生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが生成するモノマー単位、Ｎ－ビニルイミダゾールが生成するモノマー単位、Ｎ－ビニルカルバゾールが生成するモノマー単位から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位を含有する。
の要件を満たすブロックである。 The block (B) in the second invention is the following (i) to (iii)
(I) No LCST in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(Ii) carboxylic acid group, carboxylic acid ester group, carboxylic acid metal salt, sulfonic acid group, sulfonic acid ester group, sulfonic acid metal salt, hydroxy group, alkoxy group, phenoxy group, amide group, aminoalkyl group, carbamoyl group, Sulfonamide group, sulfamoyl group, carbamate group, phosphate group, metal salt of phosphate group, oxyphosphate group, metal salt of oxyphosphate group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbobetaine group, polyethylene glycol group, pyrrolidone group A hydrophilic polymer of a monomer having at least one hydrophilic group selected from the group consisting of:
(Iii) A monomer unit produced by an aromatic vinyl compound monomer, a monomer unit produced by a (meth) acrylamide compound, a monomer unit produced by a fumaric acid diester compound, and a monomer produced by vinyl chloride in the polymer of (ii) Contains at least one monomer unit selected from units, monomer units produced by vinyl acetate, monomer units produced by (meth) acrylonitrile, monomer units produced by N-vinylimidazole, and monomer units produced by N-vinylcarbazole To do.
It is a block that satisfies the requirements of

　第二の発明におけるブロック（Ｂ）は、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはタンパク質、ペプチド、糖タンパク質等の生体高分子と親和性の無いブロックまたは細胞と親和性の無いブロックであり、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、メトキシエチレン基、フルフリル基、ジアルキルアミノアルキル基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの重合体を親水性重合体に用いたブロックである。 The block (B) in the second invention is preferably a block having no affinity for biopolymers such as proteins, peptides, glycoproteins or the like, in order to shorten the cooling time required for cell detachment. A polymer of a block and having at least one hydrophilic group selected from a phosphobetaine group, a sulfobetaine group, a carbobetaine group, a polyethylene glycol group, a methoxyethylene group, a furfuryl group, a dialkylaminoalkyl group, and a pyrrolidone group Is a block using a hydrophilic polymer.

　また、第二の発明におけるブロック（Ｂ）は、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは水に対して溶解性を示すブロックであり、より好ましくは２０℃の水１００ｍＬに０．５ｇ以上溶解するブロックであり、さらに好ましくは２０℃の水１００ｍＬに１ｇ以上溶解するブロックである。 Further, the block (B) in the second invention is preferably a block showing solubility in water in order to shorten the cooling time necessary for cell detachment, and more preferably 0 in 100 mL of water at 20 ° C. A block that dissolves 5 g or more, more preferably a block that dissolves 1 g or more in 100 mL of water at 20 ° C.

　第二の発明におけるブロック（Ｂ）の親水性重合体は、特に限定は無いが、下記一般式（４） The hydrophilic polymer of the block (B) in the second invention is not particularly limited, but the following general formula (4)

で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる重合体のブロックを用いることができる。 Among these block units, a polymer block comprising at least one type of block unit (b) can be used.

　Ｒ^８は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するためにメチル基が用いられる。 R ⁸ represents a hydrogen atom or a methyl group, and a methyl group is used to shorten the cooling time required for cell detachment.

　Ｒ^９は、炭素数１～１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基：－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－（式中、ｎは本発明のブロック共重合体に適切な親水性と生体適合性を付与するブロック（Ｂ）の機能を損なわない限り特に限定されず、例えば１～１０である。なお、該（ポリ）オキシエチレン基は－Ｏ－を介して基Ａ^１と結合する。）であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の炭素数１～６の２価のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。 R ⁹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, or (poly) oxyethylene group: — (OCH ₂ CH ₂ ) _n — (wherein n is suitable for the block copolymer of the present invention). There is no particular limitation as long as the function of the block (B) imparting hydrophilicity and biocompatibility is not impaired, for example, 1 to 10. The (poly) oxyethylene group is a group A ¹ through —O—. And a divalent alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, such as methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene, etc., in order to shorten the cooling time required for cell detachment. More preferably, it is ethylene.

　Ｒ^１０は、炭素数１～４の２価の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン等のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。 R ¹⁰ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and is preferably an alkylene group such as methylene, ethylene, propylene, butylene, etc. in order to shorten the cooling time required for cell detachment, Ethylene is preferable.

　Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１３は、各々独立して、水素原子又は炭素数１～４の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、Ｒ^１１、Ｒ^１２、及びＲ^１３が同時に水素原子またはメチル基であり、更に好ましくは同時にメチル基である。 R ¹¹ , R ¹² and R ¹³ are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms. In order to shorten the cooling time required for cell detachment, preferably R ¹¹ , R ¹² and R ¹³ are simultaneously a hydrogen atom or a methyl group, more preferably a methyl group.

　Ａ^１は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはエステル結合、アミド結合であり、特に好ましくはエステル結合である。
第二の発明における一般式（４）で表される親水性重合体としては、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２－アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３－（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４－（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６－（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０－（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω－（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２－アクリルアミドエチルホスホリルコリン、３－アクリルアミドプロピルホスホリルコリン、４－アクリルアミドブチルホスホリルコリン、６－アクリルアミドヘキシルホスホリルコリン、１０－アクリルアミドデシルホスホリルコリン、ω－（メタ）アクリルアミド（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルエタノールアミン、２－アクリロイルオキシエチルホスホリルエタノールアミン、３－（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルエタノールアミン、４－（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルエタノールアミン、６－（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルエタノールアミン、１０－（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルエタノールアミン、ω－（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体を用いることができる。 A ¹ is a divalent bond selected from the group consisting of an ester bond, an amide bond, a urethane bond, and an ether bond, and is preferably an ester bond or an amide bond in order to shorten the cooling time required for cell detachment. And particularly preferably an ester bond.
Examples of the hydrophilic polymer represented by the general formula (4) in the second invention include 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, 2-acryloyloxyethyl phosphorylcholine, 3- (meth) acryloyloxypropyl phosphorylcholine, 4- (meth) Acryloyloxybutyl phosphorylcholine, 6- (meth) acryloyloxyhexyl phosphorylcholine, 10- (meth) acryloyloxydecylphosphorylcholine, ω- (meth) acryloyl (poly) oxyethylene phosphorylcholine, 2-acrylamidoethylphosphorylcholine, 3-acrylamidopropylphosphorylcholine, 4-acrylamidobutylphosphorylcholine, 6-acrylamidehexylphosphorylcholine, 10-acrylamidedecylphosphorylcholine, ω- (meta ) Acrylamide (poly) oxyethylene phosphorylcholine, 2-methacryloyloxyethyl phosphorylethanolamine, 2-acryloyloxyethyl phosphorylethanolamine, 3- (meth) acryloyloxypropyl phosphorylethanolamine, 4- (meth) acryloyloxybutyl phosphorylethanolamine A polymer of at least one monomer selected from 6- (meth) acryloyloxyhexyl phosphorylethanolamine, 10- (meth) acryloyloxydecyl phosphorylethanolamine, and ω- (meth) acryloyl (poly) oxyethylene phosphorylethanolamine In order to shorten the cooling time required for cell detachment, it is preferable to use 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine It is possible to use the body.

　第二の発明におけるブロック（Ｂ）の親水性重合体は、特に限定は無いが、下記一般式（５） The hydrophilic polymer of the block (B) in the second invention is not particularly limited, but the following general formula (5)

　Ｒ^１４は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するためにメチル基が用いられる。 R ¹⁴ represents a hydrogen atom or a methyl group, and a methyl group is used to shorten the cooling time required for cell detachment.

　Ｒ^１６に用いられる炭素数１～３０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために好ましくはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が用いられる。 Examples of the alkyl group having 1 to 30 carbon atoms used for R ¹⁶ include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert. -Butyl group, n-hexyl group and isohexyl group can be exemplified, but methyl group, ethyl group, n-propyl group and isopropyl group are preferably used in order to shorten the cooling time required for cell detachment.

　Ｒ^１７に用いられる炭素数１～６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために好ましくはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が用いられる。 Examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms used for R ¹⁷ include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert. -Butyl group, n-hexyl group and isohexyl group can be exemplified, but methyl group, ethyl group, n-propyl group and isopropyl group are preferably used in order to shorten the cooling time required for cell detachment.

　第二の発明における一般式（５）で表される親水性重合体としては、ポリエチレングリコールメタクリレート、２－ヒドロキシエチルアクリレート、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、２－メトキシエチルアクリレート、２－メトキシエチルメタクリレート、フルフリルアクリレート、フルフリルメタクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレートまたはテトラヒドロフルフリルメタクリレートから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはポリエチレングリコールメタクリレート、２－メトキシエチルアクリレートまたはテトラヒドロフルフリルアクリレートから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を用いることができる。 Examples of the hydrophilic polymer represented by the general formula (5) in the second invention include polyethylene glycol methacrylate, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, hydroxymethyl acrylate, hydroxymethyl methacrylate, 2-methoxyethyl acrylate. , 2-methoxyethyl methacrylate, furfuryl acrylate, furfuryl methacrylate, tetrahydrofurfuryl acrylate, or a polymer of at least one monomer selected from tetrahydrofurfuryl methacrylate, in order to shorten the cooling time required for cell detachment And preferably at least selected from polyethylene glycol methacrylate, 2-methoxyethyl acrylate or tetrahydrofurfuryl acrylate. It can be used a polymer of one monomer.

　第二の発明におけるブロック（Ｂ）の親水性重合体は、特に限定は無いが、下記一般式（６） The hydrophilic polymer of the block (B) in the second invention is not particularly limited, but the following general formula (6)

　Ｒ^１８は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するためにメチル基が用いられる。 R ¹⁸ represents a hydrogen atom or a methyl group, and a methyl group is used to shorten the cooling time required for cell detachment.

　Ｒ^１９は、炭素数１～１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基：－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ－（式中、ｎは本発明のブロック共重合体に適切な親水性と生体適合性を付与するブロック（Ｂ）の機能を損なわない限り特に限定されず、例えば１～１０である。なお、該（ポリ）オキシエチレン基は－Ｏ－を介して基Ａ^１と結合する。）であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の炭素数１～６の２価のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。
Ｒ^２０は、炭素数１～４の２価の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン等のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。 R ¹⁹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, or (poly) oxyethylene groups _:-( OCH 2 _CH _{2) n} - (wherein, n suitable for the block copolymer of the present invention There is no particular limitation as long as the function of the block (B) imparting hydrophilicity and biocompatibility is not impaired, for example, 1 to 10. The (poly) oxyethylene group is a group A ¹ through —O—. And a divalent alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, such as methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene, etc., in order to shorten the cooling time required for cell detachment. More preferably, it is ethylene.
R ²⁰ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and is preferably an alkylene group such as methylene, ethylene, propylene, butylene, etc. in order to shorten the cooling time required for cell detachment, Ethylene is preferable.

　Ｒ^２１及びＲ^２２は、各々独立して、水素原子又は炭素数１～４の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、Ｒ^２１及びＲ^２２が同時に水素原子またはメチル基であり、更に好ましくは同時にメチル基である。
Ａ^２は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはエステル結合、アミド結合であり、特に好ましくはエステル結合である。
Ｘはスルホン酸アニオン基、カルボン酸アニオン基、リン酸アニオン基ある。 R ²¹ and R ²² are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms. In order to reduce the cooling time required for cell detachment, preferably R ²¹ and R ²² are simultaneously A hydrogen atom or a methyl group, more preferably a methyl group at the same time.
A ² is a divalent bond selected from the group consisting of an ester bond, an amide bond, a urethane bond, and an ether bond, and is preferably an ester bond or an amide bond in order to shorten the cooling time required for cell detachment. And particularly preferably an ester bond.
X is a sulfonate anion group, a carboxylic acid anion group, or a phosphate anion group.

　第二の発明における一般式（６）で表される親水性重合体としては、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（２－カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２－アクリロイルオキシエチル）（２－カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（３－カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２－アクリロイルオキシエチル）（３－カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（４－スルホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（２－スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２－アクリロイルオキシエチル）（２－スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２－アクリロイルオキシエチル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（２－ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２－アクリロイルオキシエチル）（２－ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（３－ホスホナトプロピル）アミニウム、またはジメチル（２－アクリロイルオキシエチル）（３－ホスホナトプロピル）アミニウムから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくはジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（２－カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（４－スルホナトブチル）アミニウムまたはジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（２－スルホナトエチル）アミニウムから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を用いることができる。 Examples of the hydrophilic polymer represented by the general formula (6) in the second invention include dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (carboxylatomethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (2-carboxylatoethyl). ) Aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (2-carboxylatoethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (3-carboxylatopropyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (3-carboxylato) Propyl) aminium, dimethyl (2-methacryloylaminopropyl) (3-sulfonatopropyl) aminium, dimethyl (2-methacryloylaminopropyl) (4-sulfonatobutyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxy) Til) (2-sulfonatoethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (2-sulfonatoethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (3-sulfonatopropyl) aminium, dimethyl (2-acryloyl) Oxyethyl) (3-sulfonatopropyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (2-phosphonatoethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (2-phosphonatoethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) A polymer of at least one monomer selected from (3-phosphonatopropyl) aminium or dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (3-phosphonatopropyl) aminium can be exemplified, but is necessary for cell detachment. In order to shorten the cooling time, preferably dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (carboxylatomethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (2-carboxylatoethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyl) At least one monomer selected from aminopropyl) (3-sulfonatopropyl) aminium, dimethyl (2-methacryloylaminopropyl) (4-sulfonatobutyl) aminium or dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (2-sulfonatoethyl) aminium These polymers can be used.

　第二の発明におけるブロック（Ｂ）の親水性重合体は、特に限定は無いが、下記一般式（７） The hydrophilic polymer of the block (B) in the second invention is not particularly limited, but the following general formula (7)

　Ｒ^２３は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するためにメチル基が用いられる。 R ²³ represents a hydrogen atom or a methyl group, and a methyl group is used to shorten the cooling time required for cell detachment.

　Ｒ^２４、Ｒ^２５は各々独立して水素原子又はメチル基である。
第一の発明における一般式（７）で表される親水性重合体としては、アクリルアミドまたはＮ，Ｎ－ジメチルアクリルアミドから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を用いることができる。 R ²⁴ and R ²⁵ are each independently a hydrogen atom or a methyl group.
As the hydrophilic polymer represented by the general formula (7) in the first invention, a polymer of at least one monomer selected from acrylamide or N, N-dimethylacrylamide can be used.

　第二の発明におけるブロック（Ｂ）の親水性重合体は、特に限定は無いが、下記一般式（８） The hydrophilic polymer of the block (B) in the second invention is not particularly limited, but the following general formula (8)

　Ｒ^２６は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するためにメチル基が用いられる。 R ²⁶ represents a hydrogen atom or a methyl group, and a methyl group is used to shorten the cooling time required for cell detachment.

　第二の発明における一般式（８）で表される親水性重合体としては、Ｎ－ビニルピロリドンの重合体を用いることができる。
第二の発明におけるブロック（Ｂ）の親水性重合体は、特に限定は無いが、下記一般式（９） As the hydrophilic polymer represented by the general formula (8) in the second invention, a polymer of N-vinylpyrrolidone can be used.
The hydrophilic polymer of the block (B) in the second invention is not particularly limited, but the following general formula (9)

　Ｒ^２７は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するためにメチル基が用いられる。 R ²⁷ represents a hydrogen atom or a methyl group, and a methyl group is used to shorten the cooling time required for cell detachment.

　Ｒ^２８は炭素数１～１０の２価の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の炭素数１～６の２価のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。 R ²⁸ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, and preferably has a carbon number of 1 such as methylene, ethylene, propylene, butylene, pentylene, hexylene, etc. in order to shorten the cooling time required for cell detachment. To 6 divalent alkylene groups, more preferably ethylene.

　Ｒ^２９及びＲ^３０は、各々独立して、水素原子又は炭素数１～４の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、Ｒ^２９及びＲ^３０が同時に水素原子またはメチル基であり、更に好ましくは同時にメチル基である。 R ²⁹ and R ³⁰ are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms. In order to shorten the cooling time required for cell detachment, it is preferable that R ²⁹ and R ³⁰ are simultaneously A hydrogen atom or a methyl group, more preferably a methyl group at the same time.

　Ａ^３は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはエステル結合、アミド結合であり、特に好ましくはエステル結合である。 A ³ is a divalent bond selected from the group consisting of an ester bond, an amide bond, a urethane bond, and an ether bond, and is preferably an ester bond or an amide bond in order to shorten the cooling time required for cell detachment. And particularly preferably an ester bond.

　第二の発明における一般式（９）で表される親水性重合体としては、アミノメチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノメチル（メタ）アクリレート、アミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、３－アミノプロピル（メタ）アクリレート、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）－プロピル（メタ）アクリレート、３－（Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノ）－プロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミドメチルアミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、ジエチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、（メタ）アクリルアミドエチルアミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミン、ジエチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミン、３－（メタ）アクリルアミドプロピルアミン、ジメチル［３－（メタ）アクリルアミドプロピル］アミン、ジエチル［３－（メタ）アクリルアミドエチル］アミンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはＮ，Ｎ－ジメチルアミノメチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を用いることができる。 Examples of the hydrophilic polymer represented by the general formula (9) in the second invention include aminomethyl (meth) acrylate, N, N-dimethylaminomethyl (meth) acrylate, and N, N-diethylaminomethyl (meth) acrylate. Aminoethyl (meth) acrylate, N, N-dimethylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-diethylaminoethyl (meth) acrylate, 3-aminopropyl (meth) acrylate, 3- (N, N-dimethylamino) -Propyl (meth) acrylate, 3- (N, N-diethylamino) -propyl (meth) acrylate, (meth) acrylamide methylamine, dimethyl [(meth) acrylamidomethyl] amine, diethyl [(meth) acrylamidomethyl] amine, (Meth) acrylamidoethylamine, di Chill [(meth) acrylamidoethyl] amine, diethyl [(meth) acrylamidoethyl] amine, 3- (meth) acrylamidopropylamine, dimethyl [3- (meth) acrylamidopropyl] amine, diethyl [3- (meth) acrylamidoethyl A polymer of at least one monomer selected from amines can be exemplified, but in order to shorten the cooling time required for cell detachment, N, N-dimethylaminomethyl (meth) acrylate, N, N-dimethylamino is preferable. A polymer of at least one monomer selected from ethyl (meth) acrylate, dimethyl [(meth) acrylamidomethyl] amine, and dimethyl [(meth) acrylamidoethyl] amine can be used.

　第二の発明において上述の親水性重合体中に更に含有するモノマー単位としては、スチレン、１－ビニルナフタレン、２－ビニルナフタレン、９－ビニルアントラセン、１－ビニルピレンおよびその誘導体等の芳香族ビニル化合物が重合することによって生成するモノマー単位、Ｎ－ｎ－オクチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ｎ－デシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ｎ－ドデシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ｎ－ヘキサデシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ｎ－オクタデシル（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物が重合することによって生成するモノマー単位、Ｎ－ビニル－ｎ－オクチルアミド、Ｎ－ビニル－ｎ－デシルアミド、Ｎ－ビニル－ｎ－ドデシルアミド、Ｎ－ビニル－ｎ－ヘキサデシルアミド等のＮ－ビニルアミド化合物が重合することによって生成するモノマー単位、Ｎ－シクロヘキシルマレイミド、Ｎ－フェニルマレイミド等のＮ－アルキルマレイミド化合物が重合することによって生成するモノマー単位、フマル酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル、フマル酸ジ－ｎ－ブチル等のフマル酸ジエステル化合物が重合することによって生成するモノマー単位、塩化ビニルが重合することによって生成するモノマー単位、酢酸ビニルが重合することによって生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが重合することによって生成するモノマー単位、Ｎ－ビニルイミダゾールが重合することによって生成するモノマー単位、Ｎ－ビニルカルバゾールが重合することによって生成するモノマー単位を用いることができる。 In the second invention, the monomer unit further contained in the hydrophilic polymer includes aromatic vinyl compounds such as styrene, 1-vinylnaphthalene, 2-vinylnaphthalene, 9-vinylanthracene, 1-vinylpyrene and derivatives thereof. Monomer units produced by polymerization of Nn-octyl (meth) acrylamide, Nn-decyl (meth) acrylamide, Nn-dodecyl (meth) acrylamide, Nn-hexadecyl (meth) acrylamide, Monomer units produced by polymerization of (meth) acrylamide compounds such as Nn-octadecyl (meth) acrylamide, N-vinyl-n-octylamide, N-vinyl-n-decylamide, N-vinyl-n-dodecyl N such as amide and N-vinyl-n-hexadecylamide Monomer units produced by polymerization of vinylamide compounds, monomer units produced by polymerization of N-alkylmaleimide compounds such as N-cyclohexylmaleimide and N-phenylmaleimide, di-tert-butyl fumarate, di-fumarate Monomer units produced by polymerizing fumaric acid diester compounds such as n-butyl, monomer units produced by polymerizing vinyl chloride, monomer units produced by polymerizing vinyl acetate, (meth) acrylonitrile polymerizes A monomer unit produced by polymerization, a monomer unit produced by polymerization of N-vinylimidazole, and a monomer unit produced by polymerization of N-vinylcarbazole can be used.

　第二の発明において、ブロック単位［（ａ）＋（ｂ）］に対する（ａ）の比率は１～９５ｍｏｌ％であり、基材に被覆した場合に、細胞接着性を付与すると共に、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、５～８５ｍｏｌ％であることが好ましい。１ｍｏｌ％未満であれば細胞接着性が低下し、９５ｍｏｌ％を超えれば細胞剥離に必要な冷却時間が長くなる。 In the second invention, the ratio of (a) to the block unit [(a) + (b)] is 1 to 95 mol%. When coated on a substrate, cell adhesion is imparted and cell detachment is achieved. In order to shorten the necessary cooling time, the content is preferably 5 to 85 mol%. If it is less than 1 mol%, the cell adhesiveness is lowered, and if it exceeds 95 mol%, the cooling time required for cell detachment becomes longer.

　第二の発明において、ブロック共重合体を構成する全ブロック単位の量に対するブロックＡを構成するブロック単位（ａ）の量が４～９４ｍｏｌ％であり、基材に被覆した場合に、細胞接着性を付与すると共に、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、１０～８５ｍｏｌ％であることが好ましい。４ｍｏｌ％未満であれば細胞接着性が低下し、９４ｍｏｌ％を超えれば細胞剥離に必要な冷却時間が長くなる。 In the second invention, when the amount of the block unit (a) constituting the block A is 4 to 94 mol% with respect to the amount of all block units constituting the block copolymer, Is preferably 10 to 85 mol% in order to impart a low temperature and shorten the cooling time required for cell detachment. If it is less than 4 mol%, the cell adhesiveness is lowered, and if it exceeds 94 mol%, the cooling time required for cell detachment becomes longer.

　第二の発明に用いるブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）は３，０００以上１，０００，０００以下の範囲にあり、好ましくは４，０００以上５００，０００以下、さらに好ましくは５，０００以上１００，０００以下である。３，０００未満の場合は細胞培養基材に被覆しても細胞培養中に基材から培地中に溶出してしまう。また、１，０００，０００を越える場合は溶液粘度が高くなり、細胞培養基材への被覆が困難になる。 The number average molecular weight (Mn) of the block copolymer used in the second invention is in the range of 3,000 to 1,000,000, preferably 4,000 to 500,000, more preferably 5,000. More than 100,000. In the case of less than 3,000, even if the cell culture substrate is coated, it is eluted from the substrate into the medium during cell culture. On the other hand, when it exceeds 1,000,000, the solution viscosity becomes high and it becomes difficult to coat the cell culture substrate.

　第二の発明に用いるブロック共重合体の合成方法としては、特に限定はないが、株式会社エヌ・ティー・エス発行、“ラジカル重合ハンドブック”、ｐ．１６１～２２５（２０１０）に記載のリビングラジカル重合技術を用いて、共重合する方法を用いることができる。 The method for synthesizing the block copolymer used in the second invention is not particularly limited, but is published by NTS Corporation, “Radical Polymerization Handbook”, p. 161 to 225 (2010), and a copolymerization method can be used.

　第二の発明において重合するモノマーの順番としては、１）親水性基を有するモノマーと芳香族ビニル化合物を共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、２）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと芳香族ビニル化合物を共重合する方法、３）親水性基を有するモノマーと芳香族ビニル化合物を共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、更に未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと芳香族ビニル化合物を共重合する方法、４）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと芳香族ビニル化合物を共重合し、更に未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、５）親水性基を有するモノマーと（メタ）アクリルアミド化合物を共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、６）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと（メタ）アクリルアミド化合物を共重合する方法、７）親水性基を有するモノマーと（メタ）アクリルアミド化合物を共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、更に未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと（メタ）アクリルアミド化合物を共重合する方法、８）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと（メタ）アクリルアミド化合物を共重合し、更に未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、９）親水性基を有するモノマーとフマル酸ジエステル化合物を共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、１０）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーとフマル酸ジエステル化合物を共重合する方法、１１）親水性基を有するモノマーと塩化ビニルを共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、１２）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと塩化ビニルを共重合する方法、１３）親水性基を有するモノマーと酢酸ビニルを共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと酢酸ビニルを共重合する方法、１４）親水性基を有するモノマーと（メタ）アクリロニトリルを共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、１５）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと（メタ）アクリロニトリルを共重合する方法、１６）親水性基を有するモノマーとＮ－ビニルイミダゾールを共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、１７）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーとＮ－ビニルイミダゾールを共重合する方法、１８）親水性基を有するモノマーとＮ－ビニルカルバゾールを共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、１９）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーとＮ－ビニルカルバゾールを共重合する方法を例示することができる。 The order of monomers to be polymerized in the second invention is as follows: 1) copolymerize a monomer having a hydrophilic group and an aromatic vinyl compound, remove the unreacted monomer, and then polymerize the monomer that forms the block unit (a). 2) A method of polymerizing a monomer that forms the block unit (a), removing an unreacted monomer, and then copolymerizing a monomer having a hydrophilic group and an aromatic vinyl compound, 3) having a hydrophilic group After copolymerizing the monomer and the aromatic vinyl compound, removing the unreacted monomer, polymerizing the monomer that forms the block unit (a), and further removing the unreacted monomer, the monomer having a hydrophilic group and the aromatic 4. Method of copolymerizing vinyl compound, 4) Polymerizing monomers to form block unit (a), removing unreacted monomers, then monomer having hydrophilic group and aromatic vinyl A method of polymerizing the compound and further removing the unreacted monomer, and then polymerizing the monomer that forms the block unit (a), 5) copolymerizing the monomer having a hydrophilic group and the (meth) acrylamide compound, A method of polymerizing a monomer that generates the block unit (a) after removing the reactive monomer, 6) A monomer having a hydrophilic group after polymerizing the monomer that generates the block unit (a) and removing the unreacted monomer And (meth) acrylamide compound copolymerization method, 7) Monomer having a hydrophilic group and (meth) acrylamide compound are copolymerized, the unreacted monomer is removed, and then the monomer that forms block unit (a) is polymerized. Further, after removing unreacted monomers, a method of copolymerizing a monomer having a hydrophilic group and a (meth) acrylamide compound, 8) producing a block unit (a) After the monomer is polymerized and the unreacted monomer is removed, the monomer having a hydrophilic group and the (meth) acrylamide compound are copolymerized, and after further removing the unreacted monomer, the monomer that forms the block unit (a) is obtained. 9) A method of polymerizing a monomer having a hydrophilic group and a fumaric acid diester compound and removing an unreacted monomer, and then polymerizing a monomer that forms a block unit (a). 10) A block unit (a ) And a monomer having a hydrophilic group and a fumaric acid diester compound are copolymerized after removing the unreacted monomer, 11) a monomer having a hydrophilic group and vinyl chloride are copolymerized, After removing unreacted monomers, a method of polymerizing monomers that produce block units (a), 12) polymerizing monomers that produce block units (a) And a method of copolymerizing a monomer having a hydrophilic group and vinyl chloride after removing the unreacted monomer, 13) copolymerizing the monomer having a hydrophilic group and vinyl acetate, removing the unreacted monomer, and then blocking A method of polymerizing a monomer that generates a unit (a), a method of polymerizing a monomer that generates a block unit (a), removing an unreacted monomer, and then copolymerizing a monomer having a hydrophilic group and vinyl acetate, 14 ) A method in which a monomer having a hydrophilic group and (meth) acrylonitrile are copolymerized to remove an unreacted monomer, and then a monomer that forms a block unit (a) is polymerized; 15) a monomer that forms a block unit (a) And a method of copolymerizing a monomer having a hydrophilic group and (meth) acrylonitrile after removing the unreacted monomer, and 16) a monomer having a hydrophilic group -Copolymerization of vinylimidazole and removal of unreacted monomer, followed by polymerization of monomer producing block unit (a), 17) Polymerization of monomer producing block unit (a) and removal of unreacted monomer Then, a method of copolymerizing a monomer having a hydrophilic group and N-vinylimidazole, 18) copolymerizing a monomer having a hydrophilic group and N-vinylcarbazole, removing the unreacted monomer, 19) a method of polymerizing a monomer that produces a block unit 19) a method of polymerizing a monomer that produces a block unit (a), removing an unreacted monomer, and then copolymerizing a monomer having a hydrophilic group and N-vinylcarbazole. It can be illustrated.

　本発明の細胞培養基材は、上記ブロック共重合体を例えば、各種溶媒に溶解させ、基材に塗布後、乾燥することによって製造することができる。
塗布に用いる溶媒としては残留していても培養細胞に及ぼす影響が小さい、エタノール、水とエタノールの混合溶媒が好ましく用いられる。 The cell culture substrate of the present invention can be produced by, for example, dissolving the block copolymer in various solvents, applying the solution to the substrate, and then drying.
As a solvent used for coating, ethanol, a mixed solvent of water and ethanol, which has little influence on cultured cells even if it remains, is preferably used.

　基材としては、特に限定はないが、好ましくは各種疎水性ポリマー材料が用いられる。疎水性ポリマー材料としては、例えば、ポリメタクリル酸メチル等のアクリル系ポリマー、ポリジメチルシロキサン等の各種シリコーンゴム、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート等が挙げられる。また、金属基材、セラミックス基材あるいはガラス基材にシランカップリング剤で表面処理したものも用いることができる。 The substrate is not particularly limited, but various hydrophobic polymer materials are preferably used. Examples of the hydrophobic polymer material include acrylic polymers such as polymethyl methacrylate, various silicone rubbers such as polydimethylsiloxane, polystyrene, polyethylene terephthalate, and polycarbonate. Further, a metal substrate, a ceramic substrate, or a glass substrate that has been surface-treated with a silane coupling agent can also be used.

　また、基材の形状は、特に限定はないが、例えば、板状、ビーズ状および繊維状の形状のほか、板状の基材に設けられた穴や溝や突起なども挙げられる。 The shape of the substrate is not particularly limited, and examples thereof include plate-like, bead-like, and fiber-like shapes, and holes, grooves, and protrusions provided in the plate-like substrate.

　基材に塗布する方法としては、例えば、はけ塗り、ディップコーティング、スピンコーティング、バーコーティング、流し塗り、スプレー塗装、ロール塗装、エアーナイフコーティング、ブレードコーティングなど通常知られている各種の方法を用いることが可能である。 As a method of applying to the substrate, for example, various commonly known methods such as brush coating, dip coating, spin coating, bar coating, flow coating, spray coating, roll coating, air knife coating and blade coating are used. It is possible.

　本発明の培養基材に被覆されたブロック共重合体の厚さは１ｎｍ以上１０μｍ以下であり、好ましくは１０ｎｍ以上５μｍ以下であり、より好ましくは３０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である。１ｎｍ未満の場合は細胞培養基材に被覆した時に細胞剥離に必要な冷却時間が長くなってしまう。１０μｍを越える場合は細胞培養基材に被覆した時に細胞の接着性が低下する。 The thickness of the block copolymer coated on the culture substrate of the present invention is 1 nm or more and 10 μm or less, preferably 10 nm or more and 5 μm or less, more preferably 30 nm or more and 500 nm or less, and further preferably 50 nm or more and 200 nm. It is as follows. When the thickness is less than 1 nm, the cooling time required for cell detachment becomes long when the cell culture substrate is coated. When the thickness exceeds 10 μm, the adhesion of cells decreases when the cell culture substrate is coated.

　本発明の培養基材の表面は、細胞培養後、温度降下による基材表面の親水化を促進し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、ミクロ相分離構造を有することが好ましい。 The surface of the culture substrate of the present invention may have a microphase separation structure for the purpose of promoting hydrophilicity of the substrate surface due to a temperature drop after cell culture and shortening the cooling time required for cell detachment. preferable.

　ミクロ相分離構造のドメイン径およびドメイン間隔は、各ブロック単位の比率、ブロック共重合体の分子量、塗布方法および塗布条件で任意に制御できる。細胞培養後、温度降下による基材表面の親水化を促進し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、ドメイン径およびドメイン間隔を細胞増殖因子よりも大きく、細胞よりも小さいことが好ましい。 The domain diameter and domain spacing of the microphase separation structure can be arbitrarily controlled by the ratio of each block unit, the molecular weight of the block copolymer, the coating method and the coating conditions. After cell culture, the domain diameter and the domain interval should be larger than the cell growth factor and smaller than the cell in order to promote the hydrophilicity of the substrate surface due to the temperature drop and shorten the cooling time required for cell detachment. Is preferred.

　本発明の細胞培養基材の製造方法としては、特に限定はないが、ブロック共重合体を前記塗布／乾燥する方法に加え、ブロック共重合体を化学結合で固定化する方法を用いることができる。 The method for producing the cell culture substrate of the present invention is not particularly limited, but in addition to the method of coating / drying the block copolymer, a method of immobilizing the block copolymer with a chemical bond can be used. .

　化学結合で固定化する方法としては、特に限定はないが、ブロック共重合体を合成後、化学固定する方法と、ブロック重合体の合成と同時に固定化する方法を用いることができる。 There are no particular limitations on the method of immobilizing by chemical bonding, but a method of chemically immobilizing after synthesizing the block copolymer and a method of immobilizing simultaneously with the synthesis of the block polymer can be used.

　ブロック共重合体を合成後、化学固定する方法としては、特に限定はないが、ブロック共重合体中に予め特定の官能基を含有するモノマー単位を導入しておき、基材上の特定官能基と化学結合させる方法、ブロック共重合体を基材に塗布した後、電子線を照射して固定化する方法、ブロック共重合体の溶液中にラジカル発生剤（ベンゾフェノン等）を添加しておき、塗布した後、紫外線を照射する方法を例示することができる。 The method of chemically fixing the block copolymer after synthesis is not particularly limited, but a monomer unit containing a specific functional group is introduced into the block copolymer in advance, and the specific functional group on the base material is introduced. A method of chemically bonding with a block copolymer, a method of immobilizing a block copolymer by irradiating it with an electron beam, a radical generator (such as benzophenone) added to the block copolymer solution, A method of irradiating with ultraviolet rays after coating can be exemplified.

　ブロック共重合体中の官能基と基材上の官能基との化学結合で固定化する場合に用いる官能基の組み合わせとしては、特に限定は無いが、水酸基とアミノ基、メルカプト基とアミノ基、メルカプト基とマレイミド基、メルカプト基とメルカプト基、カルボキシル基とアミノ基、カルボキシル基と水酸基、水酸基と水酸基を例示することができる。 As a combination of functional groups used in the case of immobilization by a chemical bond between a functional group in the block copolymer and a functional group on the substrate, there is no particular limitation, but a hydroxyl group and an amino group, a mercapto group and an amino group, Examples include mercapto group and maleimide group, mercapto group and mercapto group, carboxyl group and amino group, carboxyl group and hydroxyl group, and hydroxyl group and hydroxyl group.

　ブロック共重合体中の官能基と基材上の官能基との反応において、特に限定はないが縮合試薬または架橋剤を添加することができる。 In the reaction between the functional group in the block copolymer and the functional group on the substrate, there is no particular limitation, but a condensation reagent or a crosslinking agent can be added.

　ブロック共重合体の合成と同時に基材に固定化する方法としては、表面開始リビングラジカル重合技術を用いることができる。 As a method of immobilizing the block copolymer simultaneously with the synthesis of the block copolymer, a surface initiated living radical polymerization technique can be used.

　表面開始リビングラジカル重合は、ブロック共重合体鎖の起点となる基材表面に、重合開始剤を化学結合させ、該重合開始剤を始点として、リビングラジカル重合を行うことで、ブロック共重合体鎖を形成する手法であり、たとえば、特開２００９－５９６５９号公報や特開２０１０－２１８９８４号公報に記載された方法などを適用することができる。 In the surface-initiated living radical polymerization, the block copolymer chain is obtained by chemically bonding a polymerization initiator to the surface of the base material from which the block copolymer chain starts, and by performing living radical polymerization using the polymerization initiator as a starting point. For example, a method described in JP 2009-59659 A or JP 2010-218984 A can be applied.

　表面開始リビングラジカル重合で用いる基材としては、特に限定はないが、鋳鉄、鋼、ステンレス鋼などの鉄や鉄合金、アルミニウム、銅などの非鉄及び非鉄合金、さらには、シリコンウエハ、ガラス、石英などの非金属などを用いることができるが、本発明の細胞培養基材を、表面開始リビングラジカル重合で製造するために必要となる、重合開始剤をその表面に化学結合可能な材料、具体的には、シリコンウエハ、雲母の剥離片などの劈開性の鉱物、表面上に水酸基などの反応性置換基が存在する平面基材などが好ましく用いられる。 The base material used in the surface-initiated living radical polymerization is not particularly limited, but iron and iron alloys such as cast iron, steel, and stainless steel, non-ferrous and non-ferrous alloys such as aluminum and copper, and silicon wafer, glass, quartz A material capable of chemically bonding a polymerization initiator to its surface, which is necessary for producing the cell culture substrate of the present invention by surface-initiated living radical polymerization, can be used. For this, a silicon wafer, a cleaving mineral such as a mica peeling piece, or a planar substrate having a reactive substituent such as a hydroxyl group on the surface is preferably used.

　重合開始剤としては、特に限定されないが、基材に化学結合可能な基と、ラジカル発生基とを有する化合物が好ましく、たとえば、特開２０１０－２１８９８４号公報に開示されている重合開始剤、すなわち、ＴＥＭＰＯ系、ＡＴＲＰ系、ＲＡＦＴ系、ＲＴＣＰ系の重合開始剤を用いることができる。これらのなかでも、ＴＥＭＰＯ系、ＲＡＦＴ系、ＲＴＣＰ系の重合開始剤がより好ましい。また、ＴＥＭＰＯ系の重合開始剤の中では、特にＤＥＰＮ系の重合開始剤が好ましい。なお、基材に化学結合可能な基としては、たとえば、－ＳｉＣｌ_３、－Ｓｉ（ＣＨ_３）Ｃｌ_２、－Ｓｉ（ＣＨ_３）　_２Ｃｌ、－Ｓｉ（ＯＲ）_３（これらの式中、Ｒはメチル、エチル、プロピルまたはブチルを示す。）などが挙げられる。 The polymerization initiator is not particularly limited, but a compound having a group capable of being chemically bonded to the substrate and a radical generating group is preferable. For example, the polymerization initiator disclosed in JP 2010-218984 A, , TEMPO, ATRP, RAFT, and RTCP polymerization initiators can be used. Among these, TEMPO-based, RAFT-based, and RTCP-based polymerization initiators are more preferable. Of the TEMPO polymerization initiators, DEPN polymerization initiators are particularly preferable. Examples of groups that can be chemically bonded to the substrate include -SiCl ₃ , -Si (CH ₃ ) Cl ₂ , -Si (CH ₃ ) ₂ Cl, and -Si (OR) ₃ (in these formulas, R Represents methyl, ethyl, propyl or butyl).

　基材表面に上記重合開始剤を化学結合させる方法としては、特に限定されないが、重合開始剤を溶剤に溶解あるいは分散することで、重合開始剤溶液を調製し、調製した重合開始剤溶液中に基材を浸漬する方法などが挙げられる。 The method for chemically bonding the polymerization initiator to the surface of the substrate is not particularly limited, but a polymerization initiator solution is prepared by dissolving or dispersing the polymerization initiator in a solvent. The method of immersing a base material etc. are mentioned.

　重合開始剤を化学結合させた基材を、モノマーを含有する重合反応溶液に浸漬し、必要に応じて加熱することで、基材表面に、ブロック共重合体鎖を形成することができる。なお、重合反応溶液には、モノマーの他、各種ラジカル開始剤や、溶剤など重合反応に必要な成分を含有させることができる。 A block copolymer chain can be formed on the surface of the base material by immersing the base material chemically bonded with the polymerization initiator in a polymerization reaction solution containing a monomer and heating as necessary. In addition to the monomer, the polymerization reaction solution may contain various radical initiators and components necessary for the polymerization reaction such as a solvent.

　本発明の細胞培養基材による細胞培養は、培養基材の表面に被覆されたブロック共重合体のＬＣＳＴよりも高い温度で行われるが、ヒト由来細胞を用いる場合は、高い培養効率を得ることを目的に体温付近で行うことが好ましく、３５～３９℃の温度範囲で行うことがより好ましく、３６～３８℃の温度範囲で行うことがさらに好ましい。その他の培養条件は特に限定されず、当分野において通常行われる条件下で培養を行ってよい。例えば、培地としては、ウシ胎児血清等の血清が添加されているものでもよいし、無血清培地でもよい。 Cell culture using the cell culture substrate of the present invention is performed at a temperature higher than the LCST of the block copolymer coated on the surface of the culture substrate, but when human-derived cells are used, high culture efficiency is obtained. For the purpose of the above, it is preferably carried out near body temperature, more preferably in the temperature range of 35 to 39 ° C, and further preferably in the temperature range of 36 to 38 ° C. The other culture conditions are not particularly limited, and the culture may be performed under conditions normally performed in this field. For example, the medium may be a medium supplemented with serum such as fetal bovine serum or a serum-free medium.

　培養後、増殖細胞を細胞培養基材から剥離するには、周囲の温度をＬＣＳＴよりも低い温度、好ましくはＬＣＳＴより１０℃低い温度以下に変化させるだけでよく、細胞を培養していた培養液中においても、その他の培地溶液中においても可能であり、目的に応じて選択することができる。その際、増殖細胞を効果的にかつ容易に剥離させるため、細胞培養基材を軽くたたいたり、揺らしたり、更にはピペット等を使用して培地を撹拌するなどしてもよい。 After culturing, in order to peel off the proliferating cells from the cell culture substrate, it is only necessary to change the ambient temperature to a temperature lower than LCST, preferably 10 ° C. or lower than LCST. It can be used in or in other medium solutions, and can be selected according to the purpose. At that time, in order to effectively and easily detach the proliferating cells, the cell culture substrate may be tapped or shaken, or the medium may be stirred using a pipette or the like.

　本発明の培養方法において、好ましくは培養した細胞が冷却のみで最大径５μｍ～３００μｍの大きさで剥離することができる。さらに好ましくは冷却のみで単一細胞の形状で剥離することができる。剥離細胞の大きさ、形状は、ブロック共重合体の組成および分子量、細胞培養基材の構造、細胞培養基材の製造方法、細胞培養方法、培養される細胞の種類を選択することによって調整できる。例えば、ブロック共重合体の中のブロック（Ｂ）の比率を上げること、細胞培養基材の製造方法によってブロック共重合体の厚さを増加させること、培養基材表面の凹凸を増加させることによって、細胞凝集塊の大きさを小さくでき、さらに単一細胞で剥離することができる。 In the culture method of the present invention, preferably, cultured cells can be detached with a maximum diameter of 5 μm to 300 μm only by cooling. More preferably, it can be detached in the form of a single cell only by cooling. The size and shape of exfoliated cells can be adjusted by selecting the composition and molecular weight of the block copolymer, the structure of the cell culture substrate, the cell culture substrate production method, the cell culture method, and the type of cells to be cultured. . For example, by increasing the ratio of the block (B) in the block copolymer, increasing the thickness of the block copolymer by the cell culture substrate production method, and increasing the unevenness of the culture substrate surface The size of the cell aggregate can be reduced, and the cells can be detached with a single cell.

　本発明の細胞培養基材を用いて培養される細胞としては、温度降下による刺激付与前の表面に接着可能なものであれば特に限定されるものではない。例えばチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞やマウス結合組織Ｌ９２９細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞ＨＥＫ２９３細胞やヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞等の種々の培養細胞株に加え、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々の組織に存在する幹細胞、さらにはそれらから分化誘導した細胞等を用いることができる。これら以外でも、血液、リンパ液、髄液、喀痰、尿又は便に含まれる細胞（生細胞）や、体内あるいは環境中に存在する微生物、ウイルス、原虫等を例示できる。 The cell cultured using the cell culture substrate of the present invention is not particularly limited as long as it can adhere to the surface before applying a stimulus due to a temperature drop. For example, in addition to various cultured cell lines such as Chinese hamster ovary-derived CHO cells, mouse connective tissue L929 cells, human fetal kidney-derived cells HEK293 cells and human cervical cancer-derived HeLa cells, each tissue and organ in the living body is constituted. Epithelial cells and endothelial cells, skeletal muscle cells that exhibit contractility, smooth muscle cells, cardiomyocytes, neuronal cells that make up the nervous system, glial cells, fibroblasts, liver parenchymal cells involved in the metabolism of the body, liver non-parenchymal cells As stem cells, adipocytes, and cells having differentiation ability, stem cells present in various tissues, and further cells induced to differentiate from them can be used. Other than these, cells (live cells) contained in blood, lymph, spinal fluid, sputum, urine or stool, microorganisms, viruses, protozoa, etc. present in the body or environment can be exemplified.

　以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら制限されるものではない。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。 Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples. Unless otherwise noted, commercially available reagents were used.

　＜本ポリマーの組成＞　
核磁気共鳴測定装置（日本電子製、商品名ＪＮＭ－ＧＸ２７０）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（^１Ｈ－ＮＭＲ）スペクトル分析、およびフーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ－ＩＲ）（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社製、商品名ＳＰＥＣＴＲＵＭ　ＯＮＥ）より求めた。 <Composition of this polymer>
Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy ( ¹ H-NMR) spectrum analysis using a nuclear magnetic resonance measuring apparatus (trade name JNM-GX270, manufactured by JEOL Ltd.), and Fourier transform infrared spectrophotometer (FT-IR) (Perkin Elmer) Manufactured and trade name SPECTRUM ONE).

　＜樹脂の物性＞
重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）および重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量の比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置としては東ソー（株）製　ＨＬＣ－８１２０ＧＰＣを用い、カラムとしては、東ソー製　ＴＳＫｇｅｌ　α－Ｍを用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液として１０ｍＭ－ＬｉＢｒ　メタノール／水溶液（メタノール：水＝７０ｖｏｌ％：３０ｖｏｌ％）を用いて測定した。測定試料は２．０ｍｇ／ｍＬで調製し、０．１ｍＬ注入して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリエチレンオキサイド試料を用いて校正した。なお、ＭｎとＭｗはポリエチレンオキサイド換算の値として求めた。 <Resin physical properties>
The weight average molecular weight (Mw), the number average molecular weight (Mn), and the ratio of the weight average molecular weight (Mw) to the number average molecular weight (Mw / Mn) were measured by gel permeation chromatography (GPC). Tosoh Co., Ltd. HLC-8120GPC was used as the GPC apparatus, Tosoh TSKgel α-M was used as the column, the column temperature was set to 40 ° C., and 10 mM LiBr methanol / water solution (methanol: water) as the eluent. = 70 vol%: 30 vol%). A measurement sample was prepared at 2.0 mg / mL, and 0.1 mL was injected and measured. The calibration curve of molecular weight was calibrated using a polyethylene oxide sample having a known molecular weight. In addition, Mn and Mw were calculated | required as a value of polyethylene oxide conversion.

　＜膜の物性＞
膜の厚さは細胞培養基材断面の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察により求めた。 <Physical properties of membrane>
The thickness of the membrane was determined by observing a cross section of the cell culture substrate with a transmission electron microscope (TEM).

　実施例１
［ガラス製シャーレ表面への重合開始剤の導入］
固定化開始剤としての３－（３－（トリエトキシシリル）プロピルチオ）プロピル－２－ブロモ－２－メチルプロパネート０．５ｇ、エタノール５０ｇ、およびアンモニア２．８ｇを混合した溶液に、φ２５ｍｍガラス製シャーレを浸漬し、２４時間静置した。その後、エタノールで洗浄・乾燥を行うことで、表面に重合開始剤が導入されたシャーレを得た。 Example 1
[Introduction of polymerization initiator to glass petri dish surface]
A solution prepared by mixing 0.5 g of 3- (3- (triethoxysilyl) propylthio) propyl-2-bromo-2-methylpropanoate as an immobilization initiator, 50 g of ethanol, and 2.8 g of ammonia was made of 25 mm glass. The petri dish was immersed and allowed to stand for 24 hours. Then, the petri dish by which the polymerization initiator was introduce | transduced on the surface was obtained by wash | cleaning and drying with ethanol.

　［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコ中において、窒素ガス雰囲気下で、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを２．０ｇ、塩化銅（Ｉ）１８．５ｍｇ、塩化銅（ＩＩ）２．８ｍｇ、およびビピリジル６５ｍｇを、エタノール１０ｇに溶解することで、重合反応溶液を調製した。 [Synthesis of polymer block (B)]
In a 100 mL two-necked eggplant-shaped flask, under a nitrogen gas atmosphere, 2.0 g of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, 18.5 mg of copper (I) chloride, 2.8 mg of copper (II) chloride, and 65 mg of bipyridyl were A polymerization reaction solution was prepared by dissolving in 10 g of ethanol.

　次いで、上記にて製造した表面に重合開始剤が導入されたガラス製シャーレを、上記にて調製した重合反応溶液に浸漬させ、６５℃に加熱し、撹拌することで反応を開始した。反応時間は６時間とし、反応終了後エタノールにて洗浄を行うことで、表面に２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られた２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、１０ｇを不溶部無しに溶解できた。２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）のブロック単位中の親水部の式量は炭素８個、水素１７個、窒素１個、酸素６個、リン１個の合計（２５４．２）であり、ブロック単位の総式量は２９５．３であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１７であった。 Next, the glass petri dish having a polymerization initiator introduced on the surface produced above was immersed in the polymerization reaction solution prepared above, heated to 65 ° C., and stirred to start the reaction. The reaction time was 6 hours, and after completion of the reaction, washing with ethanol was performed to obtain a glass petri dish having the 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer block (B) introduced on the surface. The obtained glass petri dish into which the 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer block (B) was introduced was treated with sulfuric acid to isolate the 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer block and dissolved in 100 mL of water at 20 ° C. As a result, 10 g could be dissolved without any insoluble part. The formula amount of the hydrophilic part in the block unit of the 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer block (B) is a total of 8 carbons, 17 hydrogens, 1 nitrogen, 6 oxygens and 1 phosphorus (254.2). Yes, the total formula amount in block units was 295.3, and the HLB value (Griffin method) was 17.

　［細胞培養基材の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコ中において、窒素ガス雰囲気下で、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド１．２ｇ、塩化銅（Ｉ）１８．５ｍｇ、塩化銅（ＩＩ）２．８ｍｇ、およびビピリジル６５ｍｇを、エタノール１０ｇに溶解することで、重合反応溶液を調製した。 [Synthesis of cell culture substrate]
In a 100 mL two-necked eggplant-shaped flask, under a nitrogen gas atmosphere, 1.2 g of N-isopropylacrylamide, 18.5 mg of copper (I) chloride, 2.8 mg of copper (II) chloride, and 65 mg of bipyridyl were added to 10 g of ethanol. By dissolving, a polymerization reaction solution was prepared.

　次いで、上記にて製造した表面に２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを、上記にて調製した重合反応溶液に浸漬させ、６５℃に加熱し、撹拌することで反応を開始した。反応時間は６時間とし、反応終了後エタノールにて洗浄を行うことで、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは４５０ｎｍであった。 Next, the glass petri dish having the 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer block (B) introduced on the surface produced above is immersed in the polymerization reaction solution prepared above, heated to 65 ° C., and stirred. The reaction started. The reaction time was 6 hours, and after completion of the reaction, washing with ethanol was performed to obtain a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on the surface. The thickness of the film was 450 nm.

　得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。 The obtained cell culture substrate was treated with sulfuric acid, the block copolymer was isolated, and the results of evaluating the polymer composition, Mw, Mn, and Mw / Mn are shown in Table 1.

　［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ^２）を、３７℃、ＣＯ_２濃度５％で培養した。培養液は１０ｖｏｌ％ウシ胎児血清を含むダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）を用いた。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１５分冷却することで細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。 [Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Mouse connective tissue L929 cells (100 cells / mm ² ) were cultured at 37 ° C. with a CO ₂ concentration of 5% using the cell culture substrate having the surface prepared above and having a temperature-responsive membrane introduced. As the culture solution, Dulbecco's Forked modified Eagle's minimum essential medium (10 vol% FBS / DMEM) containing 10 vol% fetal bovine serum was used. When cell growth was confirmed and the cultured cells were cultured until they covered 100% of the substrate, the number of cells was confirmed with a 10 × 10 magnification microscope. After cooling the substrate to 10 ° C., the detached cells were removed with an aspirator, and the number of cells was confirmed again with a 10 × 10 magnification microscope. By cooling for 15 minutes, the cells were detached 100% in the form of single cells having a maximum diameter of 20 μm.

　［剥離細胞の培養評価］
上記細胞培養評価で基材の１００％を覆うまで増殖した細胞から培地成分を除いた後、新たにＤＭＥＭ培地を添加して、１０℃に冷却した。１５分間で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。コーニング製の細胞培養表面処理φ３５ｍｍディッシュを用いて、上述にて剥離したＬ９２９細胞（５０個／ｍｍ^２）を、３７℃、ＣＯ_２濃度５％で培養した。培養液は１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いた。細胞は２４時間後に９５個／ｍｍ^２に、７２時間後に６６０個／ｍｍ^２まで増加した。 [Culture evaluation of exfoliated cells]
The medium component was removed from the cells grown to cover 100% of the substrate in the cell culture evaluation, and then a DMEM medium was newly added and cooled to 10 ° C. In 15 minutes, the cells were 100% detached in the form of single cells with a maximum diameter of 20 μm. Using Corning cell culture surface treatment φ35mm dish, the L929 cells were detached by the above-mentioned (50 / mm ^2), 37 ℃, it was cultured in 5% CO _2. As a culture solution, 10 vol% FBS / DMEM was used. Cells increased to 95 / mm ² after 24 hours and to 660 / mm ² after 72 hours.

　参考例１
［細胞培養評価］
実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面に２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）のみが導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。 Reference example 1
[Cell culture evaluation]
Except that a glass petri dish (base material) in which only the 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer block (B) was introduced on the surface synthesized in Example 1 [Synthesis of polymer block (B)] was used. Cell culture evaluation similar to Example 1 [Cell culture evaluation and peeling evaluation] was carried out for 5 days, but the cells did not adhere to the substrate, and proliferation could not be confirmed.

　実施例２
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
反応時間を４８時間としたこと以外は実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られた２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、１０ｇを不溶部無しに溶解できた。 Example 2
[Synthesis of polymer block (B)]
The synthesis was performed in the same manner as in Example 1 [Synthesis of polymer block (B)] except that the reaction time was 48 hours, and the 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer block (B) was introduced on the surface. A glass petri dish was obtained. The obtained glass petri dish into which the 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer block (B) was introduced was treated with sulfuric acid to isolate the 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer block and dissolved in 100 mL of water at 20 ° C. As a result, 10 g could be dissolved without any insoluble part.

　［細胞培養基材の合成］
上記重合体ブロック（Ｂ）を用い、反応時間を４８時間としたこと以外は実施例１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは５００ｎｍであった。 [Synthesis of cell culture substrate]
Synthesis was carried out in the same manner as in Example 1 [Synthesis of cell culture substrate] except that the polymer block (B) was used and the reaction time was 48 hours, and a temperature-responsive membrane was introduced on the surface. A cell culture substrate was obtained. The thickness of the film was 500 nm.

　［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径１９μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。 [Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Cell proliferation was confirmed by performing the same evaluation as in Example 1 [Evaluation of cell culture and exfoliation] except that a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on the surface produced above was used. . Further, after culturing until the cultured cells covered 100% of the substrate, the substrate was cooled to 10 ° C., and the cells were detached 100% in the form of a single cell having a maximum diameter of 19 μm in 15 minutes.

　［剥離細胞の培養評価］
上記細胞培養評価で基材の１００％を覆うまで増殖した細胞から培地成分を除いた後、新たにＤＭＥＭ培地を添加して、１０℃に冷却した。１５分間で細胞は最大直径１９μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。剥離したＬ９２９細胞（５０個／ｍｍ^２）を、実施例１［剥離細胞の培養評価］と同様の方法で培養した。細胞は２４時間後に９５個／ｍｍ^２に、７２時間後に７００個／ｍｍ^２まで増加した。 [Culture evaluation of exfoliated cells]
The medium component was removed from the cells grown to cover 100% of the substrate in the cell culture evaluation, and then a DMEM medium was newly added and cooled to 10 ° C. In 15 minutes, the cells were 100% detached in the form of single cells with a maximum diameter of 19 μm. Exfoliated L929 cells (50 cells / mm ² ) were cultured in the same manner as in Example 1 [Cultural evaluation of exfoliated cells]. Cells increased to 95 / mm ² after 24 hours and to 700 / mm ² after 72 hours.

　参考例２
［細胞培養評価］
実施例２［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面に２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）のみが導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。 Reference example 2
[Cell culture evaluation]
Except that a glass petri dish (base material) in which only the 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer block (B) was introduced on the surface synthesized in Example 2 [Synthesis of polymer block (B)] was used. Cell culture evaluation similar to Example 1 [Cell culture evaluation and peeling evaluation] was carried out for 5 days, but the cells did not adhere to the substrate, and proliferation could not be confirmed.

　実施例３
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン２．０ｇの代わりに２－メトキシエチルアクリレート２．０ｇを用いたこと以外は実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に２－メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られた２－メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、２－メトキシエチルアクリレート重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、１．５ｇを不溶部無しに溶解できた。２－メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）のブロック単位中の親水部の式量は炭素３個、水素４個、酸素３個の合計（８８．１）であり、ブロック単位の総式量は１３０．１であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１４であった。 Example 3
[Synthesis of polymer block (B)]
Synthesis was performed in the same manner as in Example 1 [Synthesis of polymer block (B)] except that 2.0 g of 2-methoxyethyl acrylate was used instead of 2.0 g of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine. A glass petri dish into which the 2-methoxyethyl acrylate polymer block (B) was introduced was obtained. The glass petri dish into which the obtained 2-methoxyethyl acrylate polymer block (B) was introduced was treated with sulfuric acid, and the 2-methoxyethyl acrylate polymer block was isolated and dissolved in 100 mL of water at 20 ° C. 1.5 g could be dissolved without any insoluble part. The formula amount of the hydrophilic part in the block unit of the 2-methoxyethyl acrylate polymer block (B) is the sum of 3 carbons, 4 hydrogens and 3 oxygens (88.1), and the total formula amount of the block units is It was 130.1, and the HLB value (Griffin method) was 14.

　［細胞培養基材の合成］
上記２－メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド１．２ｇの代わりに１－（１－オキソ－２－プロペニル）ピロリジン１．２ｇを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは４００ｎｍであった。　
得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。 [Synthesis of cell culture substrate]
A glass petri dish having the 2-methoxyethyl acrylate polymer block (B) introduced therein, except that 1.2 g of 1- (1-oxo-2-propenyl) pyrrolidine was used instead of 1.2 g of N-isopropylacrylamide. Was synthesized in the same manner as in Example 1 [Synthesis of cell culture substrate] to obtain a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on its surface. The thickness of the film was 400 nm.
The obtained cell culture substrate is treated with sulfuric acid, the block copolymer is isolated, and the results of evaluating the polymer composition, Mw, Mn, and Mw / Mn are shown in Table 1.

　［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で８５％剥離した。 [Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Cell proliferation was confirmed by performing the same evaluation as in Example 1 [Evaluation of cell culture and exfoliation] except that a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on the surface produced above was used. . Further, after culturing until the cultured cells covered 100% of the substrate, the substrate was cooled to 10 ° C., and in 15 minutes, the cells were detached by 85% in the form of a single cell having a maximum diameter of 20 μm.

　参考例３
［細胞培養評価］
実施例３［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面に２－メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）のみが導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。 Reference example 3
[Cell culture evaluation]
Example 3 Example 3 except that a glass petri dish (base material) in which only the 2-methoxyethyl acrylate polymer block (B) was introduced on the surface synthesized in Example 3 [Synthesis of polymer block (B)] was used. Cell culture evaluation similar to 1 [cell culture evaluation and peeling evaluation] was performed for 5 days, but the cells did not adhere to the substrate and proliferation could not be confirmed.

　実施例４
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン２．０ｇの代わりにジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム２．０ｇを用いたこと以外は実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、表面にジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られたジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、１０ｇを不溶部無しに溶解できた。２－メトキシエチルアクリレートジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）のブロック単位中の親水部の式量は炭素６個、水素１０個、窒素１個、酸素４個の合計（１６０．１）であり、ブロック単位の総式量は２１５．２であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１５であった。 Example 4
[Synthesis of polymer block (B)]
Example 1 [Synthesis of polymer block (B)] except that 2.0 g of dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (carboxylatomethyl) aminium was used instead of 2.0 g of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine. Thus, a glass petri dish having a dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (carboxylatomethyl) aminium polymer block (B) introduced on the surface was obtained. The resulting petri dish made of dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (carboxylatomethyl) aminium polymer block (B) was treated with sulfuric acid to give dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (carboxylatomethyl) aminium. The polymer block was isolated and dissolved in 100 mL of water at 20 ° C. As a result, 10 g could be dissolved without any insoluble part. The formula amount of the hydrophilic part in the block unit of 2-methoxyethyl acrylate dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (carboxylatomethyl) aminium polymer block (B) is 6 carbons, 10 hydrogens, 1 nitrogen, 4 oxygen The total formula amount in block units was 215.2, and the HLB value (Griffin method) was 15.

　［細胞培養基材の合成］
上記ジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド１．２ｇの代わりに１－（１－オキソ－２－プロペニル）ピペリジン１．２ｇを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは３５０ｎｍであった。　
　得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。 [Synthesis of cell culture substrate]
Glass petri dish in which the above dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (carboxylatomethyl) aminium polymer block (B) was introduced, 1- (1-oxo-2-propenyl) instead of 1.2 g of N-isopropylacrylamide Synthesis was performed in the same manner as in Example 1 [Synthesis of cell culture substrate] except that 1.2 g of piperidine was used to obtain a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on the surface. The thickness of the film was 350 nm.
The obtained cell culture substrate is treated with sulfuric acid, the block copolymer is isolated, and the results of evaluating the polymer composition, Mw, Mn, and Mw / Mn are shown in Table 1.

　［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で９０％剥離した。 [Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Cell proliferation was confirmed by performing the same evaluation as in Example 1 [Evaluation of cell culture and exfoliation] except that a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on the surface produced above was used. . Further, after culturing until the cultured cells covered 100% of the substrate, the substrate was cooled to 10 ° C., and the cells were peeled 90% in the form of a single cell having a maximum diameter of 20 μm in 15 minutes.

　参考例４
［細胞培養評価］
実施例４［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面にジメチル（２－メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）のみが導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。 Reference example 4
[Cell culture evaluation]
A glass petri dish (base material) in which only the dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (carboxylatomethyl) aminium polymer block (B) was introduced on the surface synthesized in Example 4 [Synthesis of polymer block (B)] A cell culture evaluation similar to that in Example 1 [Cell culture evaluation and peeling evaluation] was performed for 5 days, except that the cells were not used.

　実施例５
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン２．０ｇの代わりにジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム２．０ｇを用いたこと以外は実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、表面にジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られたジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、ジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、１０ｇを不溶部無しに溶解できた。ジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）のブロック単位中の親水部の式量は炭素５個、水素１１個、窒素１個、酸素４個、硫黄１個の合計（１８１．２）であり、ブロック単位の総式量は２７８．４であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１３であった。 Example 5
[Synthesis of polymer block (B)]
Example 1 [Synthesis of polymer block (B)] except that 2.0 g of dimethyl (2-methacryloylaminopropyl) (3-sulfonatopropyl) aminium was used instead of 2.0 g of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine Thus, a glass petri dish having a dimethyl (2-methacryloylaminopropyl) (3-sulfonatopropyl) aminium polymer block (B) introduced on the surface was obtained. The obtained glass petri dish into which the dimethyl (2-methacryloylaminopropyl) (3-sulfonatopropyl) aminium polymer block (B) was introduced was treated with sulfuric acid to obtain dimethyl (2-methacryloylaminopropyl) (3-sulfo As a result of isolating the natopropyl) aminium polymer block and dissolving it in 100 mL of water at 20 ° C., 10 g could be dissolved without any insoluble portion. Formula amount of hydrophilic part in block unit of dimethyl (2-methacryloylaminopropyl) (3-sulfonatopropyl) aminium polymer block (B) is 5 carbons, 11 hydrogens, 1 nitrogen, 4 oxygens, sulfur The total was 1 (181.2), the total formula amount in block units was 278.4, and the HLB value (Griffin method) was 13.

　［細胞培養基材の合成］
上記ジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド１．２ｇの代わりに４－（１－オキソ－２－プロペニル）モルホリン１．２ｇを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは３８０ｎｍであった。
得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。 [Synthesis of cell culture substrate]
A glass petri dish having the dimethyl (2-methacryloylaminopropyl) (3-sulfonatopropyl) aminium polymer block (B) introduced therein, instead of 1.2 g of N-isopropylacrylamide, 4- (1-oxo-2- Synthesis was performed in the same manner as in Example 1 [Synthesis of cell culture substrate] except that 1.2 g of propenyl) morpholine was used to obtain a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on the surface. . The thickness of the film was 380 nm.
The obtained cell culture substrate is treated with sulfuric acid, the block copolymer is isolated, and the results of evaluating the polymer composition, Mw, Mn, and Mw / Mn are shown in Table 1.

　［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径２１μｍの単一細胞の形状で８０％剥離した。 [Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Cell proliferation was confirmed by performing the same evaluation as in Example 1 [Evaluation of cell culture and exfoliation] except that a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on the surface produced above was used. . Further, after culturing until the cultured cells covered 100% of the substrate, the substrate was cooled to 10 ° C., and in 15 minutes, the cells were detached 80% in the form of a single cell having a maximum diameter of 21 μm.

　［剥離細胞の培養評価］
上述の細胞培養評価で基材の１００％を覆うまで増殖した細胞から培地成分を除いた後、新たにＤＭＥＭ培地を添加して、１０℃に冷却した。３０分間で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。剥離したＬ９２９細胞（５０個／ｍｍ^２）を、実施例１［剥離細胞の培養評価］と同様の方法で培養した。細胞は２４時間後に９３個／ｍｍ^２に、７２時間後に６４０個／ｍｍ^２まで増加した。 [Culture evaluation of exfoliated cells]
The medium component was removed from the cells grown to cover 100% of the substrate in the cell culture evaluation described above, and then a DMEM medium was newly added and cooled to 10 ° C. In 30 minutes, the cells were 100% detached in the form of single cells with a maximum diameter of 20 μm. Exfoliated L929 cells (50 cells / mm ² ) were cultured in the same manner as in Example 1 [Cultural evaluation of exfoliated cells]. Cells increased to 93 cells / mm ² after 24 hours and to 640 cells / mm ² after 72 hours.

　参考例５
［細胞培養評価］
実施例５［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面にジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（３－スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）のみが導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。 Reference Example 5
[Cell culture evaluation]
Example 5 [Synthesis of polymer block (B)] A glass petri dish (group) in which only the dimethyl (2-methacryloylaminopropyl) (3-sulfonatopropyl) aminium polymer block (B) was introduced on the surface synthesized in Example 5 The same cell culture evaluation as in Example 1 [Cell culture evaluation and exfoliation evaluation] was performed for 5 days except that the material was used. However, the cells did not adhere to the substrate, and proliferation could not be confirmed.

　実施例６
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン２．０ｇの代わりにポリエチレングリコールメタクリレート（ｂ＝８．５，　ｃ＝０，　Ｒ^１６＝メチル基）２．０ｇを用いたこと以外は実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、表面にポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られたポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、ポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、１０ｇを不溶部無しに溶解できた。ジメチル（２－メタクリロイルアミノプロピル）（３－スルホナトプロピル）アミニウムポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）のブロック単位中の親水部の式量は炭素１８個、水素３４個、酸素１０．５個の合計（４１８．５）であり、ブロック単位の総式量は４７４．６であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１８であった。 Example 6
[Synthesis of polymer block (B)]
Except that 2.0 g of polyethylene glycol methacrylate (b = 8.5, c = 0, R ¹⁶ = methyl group) was used instead of 2.0 g of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, Example 1 [Polymer Block (B The glass petri dish having a polyethylene glycol methacrylate polymer block (B) introduced on its surface was obtained. The obtained petri dish made of polyethylene glycol methacrylate polymer block (B) was treated with sulfuric acid to isolate the polyethylene glycol methacrylate polymer block and dissolved in 100 mL of water at 20 ° C. As a result, 10 g was insoluble. It was able to dissolve without. Formula amount of hydrophilic part in block unit of dimethyl (2-methacryloylaminopropyl) (3-sulfonatopropyl) aminium polyethylene glycol methacrylate polymer block (B) is 18 carbons, 34 hydrogens, 10.5 oxygens The total formula amount in block units was 474.6, and the HLB value (Griffin method) was 18.

　［細胞培養基材の合成］
上記ポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド１．２ｇの代わりにＮ－ｎ－プロピルメタクリルアミド１．２ｇを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは４００ｎｍであった。　
得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。 [Synthesis of cell culture substrate]
Example 1 [Cells, except that 1.2 g of Nn-propylmethacrylamide was used instead of 1.2 g of N-isopropylacrylamide, a glass petri dish into which the polyethylene glycol methacrylate polymer block (B) was introduced. Synthesis was performed in the same manner as in [Synthesis of culture substrate] to obtain a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on the surface. The thickness of the film was 400 nm.
The obtained cell culture substrate is treated with sulfuric acid, the block copolymer is isolated, and the results of evaluating the polymer composition, Mw, Mn, and Mw / Mn are shown in Table 1.

　［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。 [Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Cell proliferation was confirmed by performing the same evaluation as in Example 1 [Evaluation of cell culture and exfoliation] except that a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on the surface produced above was used. . Further, after culturing until the cultured cells covered 100% of the substrate, the substrate was cooled to 10 ° C., and the cells were detached 100% in the form of a single cell having a maximum diameter of 20 μm in 15 minutes.

　参考例６
［細胞培養評価］
実施例６［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面にポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）のみが導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。 Reference Example 6
[Cell culture evaluation]
Example 1 [Except that a glass petri dish (base material) in which only the polyethylene glycol methacrylate polymer block (B) was introduced on the surface synthesized in Example 6 [Synthesis of polymer block (B)] was used. Cell culture evaluation and peeling evaluation] were carried out for 5 days, but the cells did not adhere to the substrate and proliferation could not be confirmed.

　実施例７
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン２．０ｇの代わりに２－ヒドロキシエチルメタクリエレート２．０ｇを用いたこと以外は実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に２－ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られた２－ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、２－ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、５ｇを不溶部無しに溶解できた。２－ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロック（Ｂ）のブロック単位中の親水部の式量は炭素３個、水素５個、酸素３個の合計（８９．１）であり、ブロック単位の総式量は１３０．１であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１４であった。 Example 7
[Synthesis of polymer block (B)]
Synthesis was performed in the same manner as in Example 1 [Synthesis of polymer block (B)] except that 2.0 g of 2-hydroxyethyl methacrylate was used instead of 2.0 g of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine. A glass petri dish having 2-hydroxyethyl methacrylate polymer block (B) introduced on the surface was obtained. The glass petri dish into which the obtained 2-hydroxyethyl methacrylate polymer block (B) was introduced was treated with sulfuric acid to isolate the 2-hydroxyethyl methacrylate polymer block and dissolved in 100 mL of water at 20 ° C. As a result, 5 g could be dissolved without any insoluble part. The formula amount of the hydrophilic part in the block unit of the 2-hydroxyethyl methacrylate polymer block (B) is a total of 3 carbons, 5 hydrogens and 3 oxygens (89.1). The amount was 130.1 and the HLB value (Griffin method) was 14.

　［細胞培養基材の合成］
上記２－ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド１．２ｇの代わりにＮ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド１．２ｇを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは２５０ｎｍであった。　
　得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。 [Synthesis of cell culture substrate]
Example 1 except that 1.2 g of N, N-diethylacrylamide was used instead of 1.2 g of N-isopropylacrylamide, a glass petri dish into which the 2-hydroxyethyl methacrylate polymer block (B) was introduced. Synthesis was performed in the same manner as in 1 [Synthesis of cell culture substrate] to obtain a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on its surface. The film thickness was 250 nm.
The obtained cell culture substrate is treated with sulfuric acid, the block copolymer is isolated, and the results of evaluating the polymer composition, Mw, Mn, and Mw / Mn are shown in Table 1.

　参考例７
［細胞培養評価］
実施例７［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面に２－ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。 Reference Example 7
[Cell culture evaluation]
Except that a glass petri dish (base material) having a 2-hydroxyethyl methacrylate polymer block (B) introduced on the surface synthesized in Example 7 [Synthesis of polymer block (B)] was used. Cell culture evaluation similar to Example 1 [Cell culture evaluation and peeling evaluation] was carried out for 5 days, but the cells did not adhere to the substrate, and proliferation could not be confirmed.

　実施例８
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン２．０ｇの代わりにＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート２．０ｇを用いたこと以外は実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、表面にＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られたＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、５ｇを不溶部無しに溶解できた。Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）のブロック単位中の親水部の式量は炭素５個、水素１０個、窒素１個、酸素２個の合計（１１６．１）であり、ブロック単位の総式量は１５７．２であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１５であった。 Example 8
[Synthesis of polymer block (B)]
Synthesis was performed in the same manner as in Example 1 [Synthesis of polymer block (B)] except that 2.0 g of N, N-dimethylaminoethyl methacrylate was used instead of 2.0 g of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine. A glass petri dish having an N, N-dimethylaminoethyl methacrylate polymer block (B) introduced on the surface was obtained. The obtained petri dish with N, N-dimethylaminoethyl methacrylate polymer block (B) was treated with sulfuric acid to isolate the N, N-dimethylaminoethyl methacrylate polymer block, and 100 mL of water at 20 ° C. As a result, 5 g could be dissolved without any insoluble part. The formula amount of the hydrophilic part in the block unit of the N, N-dimethylaminoethyl methacrylate polymer block (B) is the sum of 5 carbons, 10 hydrogens, 1 nitrogen and 2 oxygens (116.1). The total formula amount in block units was 157.2, and the HLB value (Griffin method) was 15.

　［細胞培養基材の合成］
上述のＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド１．２ｇの代わりにＮ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド１．２ｇを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは２００ｎｍであった。　
得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。 [Synthesis of cell culture substrate]
A glass petri dish introduced with the above N, N-dimethylaminoethyl methacrylate polymer block (B), except that 1.2 g of N, N-diethylacrylamide was used instead of 1.2 g of N-isopropylacrylamide. Synthesis was performed in the same manner as in Example 1 [Synthesis of cell culture substrate] to obtain a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on its surface. The thickness of the film was 200 nm.
The obtained cell culture substrate is treated with sulfuric acid, the block copolymer is isolated, and the results of evaluating the polymer composition, Mw, Mn, and Mw / Mn are shown in Table 1.

　［細胞培養評価および剥離評価］
上述にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で９０％剥離した。 [Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
The same evaluation as in Example 1 [Evaluation of cell culture and exfoliation] was performed except that a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on the surface produced above was used, and cell growth was confirmed. . Further, after culturing until the cultured cells covered 100% of the substrate, the substrate was cooled to 10 ° C., and the cells were peeled 90% in the form of a single cell having a maximum diameter of 20 μm in 15 minutes.

　参考例８
［細胞培養評価］
実施例７［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面にＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。 Reference Example 8
[Cell culture evaluation]
Except that a glass petri dish (base material) in which the N, N-dimethylaminoethyl methacrylate polymer block (B) was introduced on the surface synthesized in Example 7 [Synthesis of polymer block (B)] was used. Cell culture evaluation similar to that in Example 1 [Cell culture evaluation and peeling evaluation] was performed for 5 days, but the cells did not adhere to the substrate, and proliferation could not be confirmed.

　実施例９
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコに２－ヒドロキシエチルメタクリエレート２．０ｇ、４－シアノ－４－［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド０．０７３ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００４ｇを加え、１，４－ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間反応させた。反応後ジエチルエーテルで再沈し、２－ヒドロキシエチルメタクリエレートの重合体ブロック（Ｂ）を得た。得られた２－ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロック（Ｂ）を２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、５ｇを不溶部無しに溶解できた。 Example 9
[Synthesis of polymer block (B)]
In a 100 mL two-necked eggplant type flask, 2.0 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 0.073 g of 4-cyano-4-[(dodecylsulfonylthiocarbonyl) sulfonyl] pentanoic acid, and 0.004 g of azobisisobutylnitrile were added. In addition, it was dissolved in 10 mL of a 1,4-dioxane / ethanol = 1: 1 mixed solution. Nitrogen bubbling was performed for 30 minutes, and then the mixture was reacted at 65 ° C. for 12 hours. After the reaction, it was reprecipitated with diethyl ether to obtain a polymer block (B) of 2-hydroxyethyl methacrylate. As a result of dissolving the obtained 2-hydroxyethyl methacrylate polymer block (B) in 100 mL of water at 20 ° C., 5 g could be dissolved without any insoluble part.

　［ブロック共重合体の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコに上記重合体ブロック（Ｂ）１．２ｇ、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド１．２ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００４ｇを加え、１，４－ジオキサン／エタノール＝１：２混合溶液１５ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間反応させた。反応後ヘキサンで再沈し、ブロック共重合体を得た。ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。 [Synthesis of block copolymer]
To a 100 mL two-necked eggplant type flask were added 1.2 g of the polymer block (B), 1.2 g of N, N-diethylacrylamide and 0.004 g of azobisisobutylnitrile, and 1,4-dioxane / ethanol = 1: 2. Dissolved in 15 mL of the mixed solution. Nitrogen bubbling was performed for 30 minutes, and then the mixture was reacted at 65 ° C. for 12 hours. After the reaction, it was reprecipitated with hexane to obtain a block copolymer. The results of evaluating the polymer composition, Mw, Mn, and Mw / Mn are shown in Table 1.

　［細胞培養基材の合成］
上記にて製造したブロック共重合体１００重量部と、架橋剤としてヘキサメトキシメチルメラミン３０重量部と。光酸発生剤としてトリフェニルスルホニウムトリフレート１０重量部を、溶媒としてジアセトンアルコール２５０部に溶解し、塗布溶液とした。ガラス基板上に上記塗布溶液をスピンコーターの回転速度３０００ｒｐｍでスピンコートした。塗布後８０℃で５分間加熱処理して溶媒を揮発させ、膜厚１．８μｍの塗膜を得た。高圧水銀ランプを用いて、塗膜への露光を行った。露光後、１２０℃で５分間加熱処理を行い、露光によって発生した酸による酸触媒反応によって架橋反応を進行させた。その後、水で洗浄し、１２０℃で３０分間加熱乾燥した。膜の厚さは２５ｎｍであった。 [Synthesis of cell culture substrate]
100 parts by weight of the block copolymer produced above and 30 parts by weight of hexamethoxymethylmelamine as a crosslinking agent. 10 parts by weight of triphenylsulfonium triflate as a photoacid generator was dissolved in 250 parts of diacetone alcohol as a solvent to obtain a coating solution. The coating solution was spin coated on a glass substrate at a spin coater rotational speed of 3000 rpm. After coating, the film was heat-treated at 80 ° C. for 5 minutes to volatilize the solvent, and a coating film having a thickness of 1.8 μm was obtained. The coating film was exposed using a high-pressure mercury lamp. After the exposure, heat treatment was performed at 120 ° C. for 5 minutes, and the crosslinking reaction was advanced by an acid-catalyzed reaction with an acid generated by the exposure. Then, it wash | cleaned with water and heat-dried at 120 degreeC for 30 minutes. The film thickness was 25 nm.

　［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造したガラス基板をガラス製シャーレに入れ、細胞培養基材として用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認され、細胞増殖後の細胞剥離評価では、３分冷却することで細胞はシート状で２４％剥離した。また１５分冷却することで細胞は最大直径５ｍｍのシート状で９０％剥離した。 [Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Except that the glass substrate produced above was put into a glass petri dish and used as a cell culture substrate, the same evaluation as in Example 1 [Cell culture evaluation and peeling evaluation] was performed, and cell proliferation was confirmed. In the cell peeling evaluation after the growth, the cells were peeled in a sheet form by 24% by cooling for 3 minutes. Further, by cooling for 15 minutes, the cells were peeled 90% in the form of a sheet having a maximum diameter of 5 mm.

　参考例９
［細胞培養基材の合成］
実施例９［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面に２－ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロック（Ｂ）のみをブロック共重合体の替わりに用いたこと以外は、実施例９［細胞培養基材の合成］と同様の方法でガラス基材を合成した。 Reference Example 9
[Synthesis of cell culture substrate]
Example 9 [Except that only 2-hydroxyethyl methacrylate polymer block (B) was used instead of block copolymer on the surface synthesized in Example 9 [Synthesis of polymer block (B)]. A glass substrate was synthesized in the same manner as in [Synthesis of cell culture substrate].

　［細胞培養評価］
上述のガラス基板を用いたこと以外は、実施例８［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。 [Cell culture evaluation]
A cell culture evaluation similar to that in Example 8 [Cell culture evaluation and peeling evaluation] was performed for 5 days except that the glass substrate described above was used, but the cells did not adhere to the substrate and proliferation could not be confirmed. .

　実施例１０
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコにＮ－ビニルピロリドンを１．０ｇ、スチレン１．３ｇ、ＲＡＦＴ剤として４－シアノ－４－［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド０．０７３ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００４ｇを加え、１，４－ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間反応させた。反応後ジエチルエーテルで再沈し、Ｎ－ビニルピロリドンとスチレンのランダム共重合体ブロック（Ｂ）を得た。得られたＮ－ビニルピロリドンとスチレンのランダム共重合体ブロック（Ｂ）を２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、０．５ｇを不溶部無しに溶解できた。 Example 10
[Synthesis of polymer block (B)]
In a 100 mL two-necked eggplant type flask, 1.0 g of N-vinylpyrrolidone, 1.3 g of styrene, 0.073 g of 4-cyano-4-[(dodecylsulfonylthiocarbonyl) sulfonyl] pentanoic acid as RAFT agent, azobis 0.004 g of isobutylnitrile was added and dissolved in 10 mL of a 1,4-dioxane / ethanol = 1: 1 mixed solution. Nitrogen bubbling was performed for 30 minutes, and then the mixture was reacted at 65 ° C. for 12 hours. After the reaction, reprecipitation with diethyl ether was performed to obtain a random copolymer block (B) of N-vinylpyrrolidone and styrene. As a result of dissolving the obtained random copolymer block (B) of N-vinylpyrrolidone and styrene in 100 mL of water at 20 ° C., 0.5 g could be dissolved without any insoluble part.

　［ブロック共重合体の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコに上記ランダム共重合体ブロック（Ｂ）１．２ｇ、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド１．２ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００４ｇを加え、１，４－ジオキサン／エタノール＝１：２混合溶液１５ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間反応させた。反応後ヘキサンで再沈し、ブロック共重合体を得た。 [Synthesis of block copolymer]
To a 100 mL two-necked eggplant type flask, 1.2 g of the random copolymer block (B), 1.2 g of N-ethoxyethylacrylamide, and 0.004 g of azobisisobutylnitrile were added, and 1,4-dioxane / ethanol = 1: 2 Dissolved in 15 mL of mixed solution. Nitrogen bubbling was performed for 30 minutes, and then the mixture was reacted at 65 ° C. for 12 hours. After the reaction, it was reprecipitated with hexane to obtain a block copolymer.

　得られたブロック共重合体のポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。 Table 1 shows the results of evaluating the polymer composition, Mw, Mn, and Mw / Mn of the obtained block copolymer.

　［細胞培養基材の合成］
上記にて製造したブロック共重合体０．１０ｇをエタノール４９．９０ｇに溶解し、ブロック共重合体の０．２ｗｔ％エタノール溶液を作成した。φ２５ｍｍガラス製シャーレにブロック共重合体の０．２ｗｔ％エタノール溶液を２．５ｍＬ加え、３０分間静置した。その後ブロック共重合体の０．２ｗｔ％エタノール溶液をピペットで抜き取り、デシケータで乾燥することで表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を合成した。膜の厚さは６５ｎｍであった。　
　［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で７５％剥離した。 [Synthesis of cell culture substrate]
0.10 g of the block copolymer produced above was dissolved in 49.90 g of ethanol to prepare a 0.2 wt% ethanol solution of the block copolymer. 2.5 mL of a 0.2 wt% ethanol solution of a block copolymer was added to a φ25 mm glass petri dish and allowed to stand for 30 minutes. Thereafter, a 0.2 wt% ethanol solution of the block copolymer was extracted with a pipette, and dried with a desiccator to synthesize a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on the surface. The thickness of the film was 65 nm.
[Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Cell proliferation was confirmed by performing the same evaluation as in Example 1 [Evaluation of cell culture and exfoliation] except that a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on the surface produced above was used. . Further, after culturing until the cultured cells covered 100% of the base material, the base material was cooled to 10 ° C., so that the cells were detached 75% in the form of a single cell having a maximum diameter of 20 μm in 15 minutes.

　参考例１０
［細胞培養基材の合成］
実施例１０［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成したＮ－ビニルピロリドンとスチレンのランダム共重合体ブロック（Ｂ）をブロック共重合体の代わりに用いたこと以外は実施例１０［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面にＮ－ビニルピロリドンとスチレンのランダム共重合体ブロックが導入された細胞培養基材を合成した。 Reference Example 10
[Synthesis of cell culture substrate]
Example 10 [Cell culture except that the random copolymer block (B) of N-vinylpyrrolidone and styrene synthesized in Example 10 [Synthesis of polymer block (B)] was used instead of the block copolymer. Synthesis was performed in the same manner as in [Synthesis of Substrate] to synthesize a cell culture substrate in which a random copolymer block of N-vinylpyrrolidone and styrene was introduced on the surface.

　［細胞培養評価］
上述にて製造した表面にＮ－ビニルピロリドンとスチレンのランダム共重合体ブロックが導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。 [Cell culture evaluation]
Cell culture similar to that in Example 1 [Evaluation of cell culture and exfoliation], except that the cell culture substrate in which a random copolymer block of N-vinylpyrrolidone and styrene was introduced on the surface produced above was used. Evaluation was conducted for 5 days, but the cells did not adhere to the substrate, and proliferation could not be confirmed.

　実施例１１
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコに２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを１．５ｇ、スチレン１．３ｇ、ＲＡＦＴ剤として４－シアノ－４－［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド６ｍｇ、アゾビスイソブチルニトリル１ｍｇを加え、１，４－ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で７２時間反応させた。反応後アセトンで再沈し、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとスチレンのランダム共重合体ブロック（Ｂ）を得た。得られた２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとスチレンのランダム共重合体ブロック（Ｂ）を２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、１．０ｇを不溶部無しに溶解できた。 Example 11
[Synthesis of polymer block (B)]
In a 100 mL two-necked eggplant type flask, 1.5 g of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, 1.3 g of styrene, 4-cyano-4-[(dodecylsulfonylthiocarbonyl) sulfonyl] pentanoic acid 6 mg as an RAFT agent, azobis 1 mg of isobutyl nitrile was added and dissolved in 10 mL of a 1,4-dioxane / ethanol = 1: 1 mixed solution. Nitrogen bubbling was performed for 30 minutes, followed by reaction at 65 ° C. for 72 hours. After the reaction, reprecipitation with acetone was performed to obtain a random copolymer block (B) of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and styrene. As a result of dissolving the obtained random copolymer block (B) of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and styrene in 100 mL of water at 20 ° C., 1.0 g could be dissolved without any insoluble portion.

　［ブロック共重合体の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコに上記ランダム共重合体ブロック（Ｂ）０．８ｇ、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド０．９ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００３ｇを加え、１，４－ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で２４時間反応させた。反応後ヘキサンで再沈し、ブロック共重合体を得た。
得られたブロック共重合体のポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。 [Synthesis of block copolymer]
To a 100 mL two-necked eggplant type flask, 0.8 g of the random copolymer block (B), 0.9 g of N-isopropylacrylamide, and 0.003 g of azobisisobutylnitrile are added, and 1,4-dioxane / ethanol = 1: 1. Dissolved in 10 mL of the mixed solution. Nitrogen bubbling was performed for 30 minutes, followed by reaction at 65 ° C. for 24 hours. After the reaction, it was reprecipitated with hexane to obtain a block copolymer.
The results of evaluating the polymer composition, Mw, Mn, and Mw / Mn of the obtained block copolymer are shown in Table 1.

　［細胞培養基材の合成］
上述のブロック共重合体０．０１ｇをエタノール４．９９ｇに溶解し、ブロック共重合体の０．２ｗｔ％エタノール溶液を作製した。　さらに、０．２ｗｔ％エタノール溶液１ｍＬとエタノール９ｍＬを混合し、０．０２ｗｔ％エタノール溶液を調製した。コーニング社製直径３５ｍｍ細胞培養表面処理ディッシュ（Ｎｏ．４３０１６５）に０．０２ｗｔ％エタノール溶液を０．４４ｍＬ加え、室温で乾燥した。さらに、減圧乾燥を６時間行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を合成した。膜の厚さは１００ｎｍであった。 [Synthesis of cell culture substrate]
0.01 g of the above block copolymer was dissolved in 4.99 g of ethanol to prepare a 0.2 wt% ethanol solution of the block copolymer. Further, 1 mL of a 0.2 wt% ethanol solution and 9 mL of ethanol were mixed to prepare a 0.02 wt% ethanol solution. To a Corning 35 mm diameter cell culture surface treatment dish (No. 430165), 0.44 mL of 0.02 wt% ethanol solution was added and dried at room temperature. Furthermore, vacuum drying was performed for 6 hours to synthesize a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on the surface. The thickness of the film was 100 nm.

　参考例１１
［細胞培養基材の合成］
実施例１１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとスチレンのランダム共重合体ブロック（Ｂ）をブロック共重合体の代わりに用いたこと以外は実施例１１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとスチレンのランダム共重合体ブロックが導入された細胞培養基材を合成した。 Reference Example 11
[Synthesis of cell culture substrate]
A random copolymer block (B) of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and styrene synthesized in Example 11 [Synthesis of polymer block (B)] was used in place of the block copolymer in Example 11 [ Synthesis was performed in the same manner as in [Synthesis of cell culture substrate] to synthesize a cell culture substrate having a random copolymer block of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and styrene introduced on the surface.

　［細胞培養評価］
上述にて製造した表面に２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとスチレンのランダム共重合体ブロックが導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。 [Cell culture evaluation]
The same as in Example 1 [Evaluation of cell culture and exfoliation], except that a cell culture substrate in which a random copolymer block of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and styrene was introduced on the surface prepared above was used. Cell culture evaluation was performed for 5 days, but the cells did not adhere to the substrate, and proliferation could not be confirmed.

　実施例１２
［細胞培養評価および剥離評価］
実施例１１［細胞培養基材の合成］で製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用い、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ細胞）（１１４個／ｍｍ^２）を、３７℃、ＣＯ_２濃度５％で培養した。培養液はＤＳファーマバイオメディカル（株）製ＣＳ－Ｃ培地キット（Ｎｏ．ＣＳ４Ｚ０５００Ｒ）を用いた。細胞増殖が確認され、７２時間培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認し、４２５個／ｍｍ^２まで増殖していた。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１５分冷却することで細胞は最大直径２２μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。 Example 12
[Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Normal human skin fibroblasts (NHDF cells) (114 cells / mm ² ) were prepared using the cell culture substrate in which a temperature-responsive membrane was introduced on the surface produced in Example 11 [Synthesis of cell culture substrate]. The cells were cultured at 37 ° C. and a CO ₂ concentration of 5%. As a culture solution, a CS-C medium kit (No. CS4Z0500R) manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd. was used. When cell proliferation was confirmed and cultured for 72 hours, the number of cells was confirmed with a 10 × 10 magnification microscope, and the cells grew to 425 cells / mm ² . After cooling the substrate to 10 ° C., the detached cells were removed with an aspirator, and the number of cells was confirmed again with a 10 × 10 magnification microscope. By cooling for 15 minutes, the cells were detached 100% in the form of a single cell having a maximum diameter of 22 μm.

　［剥離細胞の培養評価］
上述の細胞培養評価で７２時間培養した細胞から培地成分を除いた後、新たにＤＳファーマバイオメディカル（株）製ＣＳ－Ｃ培地キット（Ｎｏ．ＣＳ４Ｚ０５００Ｒ）基礎培地を添加して、１０℃に冷却した。１５分間で細胞は最大直径２２μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。コーニング社製直径３５ｍｍ細胞培養表面処理ディッシュ（Ｎｏ．４３０１６５）を用いて、上記にて剥離したＮＨＤＦ細胞（５０個／ｍｍ^２）を、３７℃、ＣＯ_２濃度５％で培養した。培養液はＤＳファーマバイオメディカル（株）製ＣＳ－Ｃ培地キット（Ｎｏ．ＣＳ４Ｚ０５００Ｒ）を用いた。細胞は２４時間後に１５０個／ｍｍ^２に、７２時間後に４６０個／ｍｍ^２まで増加した。 [Culture evaluation of exfoliated cells]
After removing medium components from the cells cultured for 72 hours in the cell culture evaluation described above, a new CS-C medium kit (No. CS4Z0500R) basal medium manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd. was added and cooled to 10 ° C. did. In 15 minutes, the cells were 100% detached in the form of single cells with a maximum diameter of 22 μm. Using a 35 mm diameter cell culture surface treatment dish (No. 430165) manufactured by Corning, the NHDF cells (50 cells / mm ² ) detached as described above were cultured at 37 ° C. and a CO ₂ concentration of 5%. As a culture solution, a CS-C medium kit (No. CS4Z0500R) manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd. was used. Cells increased to 150 cells / mm ² after 24 hours and to 460 cells / mm ² after 72 hours.

　実施例１３
［細胞培養評価および剥離評価］
実施例１１［細胞培養基材の合成］で製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ^２）の代わりにチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（１００個／ｍｍ^２）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径１８μｍの単一細胞の形状で７０％剥離した。 Example 13
[Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Example 11 [Synthesis of cell culture substrate] The cell culture substrate in which a temperature-responsive membrane was introduced on the surface was used and derived from Chinese hamster ovary instead of mouse connective tissue L929 cells (100 cells / mm ² ). Except for using CHO cells (100 cells / mm ² ), the same evaluation as in Example 1 [Cell culture evaluation and peeling evaluation] was performed, and cell proliferation was confirmed. Further, after culturing until the cultured cells covered 100% of the substrate, the substrate was cooled to 10 ° C., and in 15 minutes, the cells were detached by 70% in the form of a single cell having a maximum diameter of 18 μm.

　参考例１２
［細胞培養評価］
参考例１１［細胞培養基材の合成］で製造した表面に２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとスチレンのランダム共重合体ブロックのみが導入された細胞培養基材を用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ^２）の代わりにチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（１００個／ｍｍ^２）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。 Reference Example 12
[Cell culture evaluation]
Using a cell culture substrate in which only a random copolymer block of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and styrene was introduced on the surface produced in Reference Example 11 [Synthesis of cell culture substrate], mouse connective tissue L929 cells (100 cells) / mm ²⁾ except for the use of Chinese hamster ovary-derived CHO cells (100 / mm ²⁾ in place of, was performed in example 1 [cell culture evaluation and peeling evaluation] similar cell culture evaluation as a 5 days The cells did not adhere to the substrate and proliferation could not be confirmed.

　実施例１４
［細胞培養基材の合成］
実施例１１［ブロック共重合体の合成］で合成したブロック共重合体０．０４ｇをエタノール２０ｇに溶解し、ブロック共重合体の０．２ｗｔ％エタノール溶液を作製した。　さらに、０．２ｗｔ％エタノール溶液２０ｍＬとエタノール１８０ｍＬを混合し、０．０２ｗｔ％エタノール溶液を調製した。３００ｍＬガラス製フラスコに上述のブロック共重合体０．０２ｗｔ％エタノール溶液を１８０ｍＬ添加した後、エタノール溶液をスターラーで撹拌しながら、Ｃｏｒｎｉｎｇ(R)　Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ　Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ（Ｎｏ．４６２５）１０ｇを添加し、室温で３０分間撹拌した。得られた培養基材懸濁液から、減圧下でエタノールを除去し、減圧下、室温で乾燥することによって、表面に２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとスチレンのランダム共重合体ブロック（Ｂ）とＮ－イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる温度応答性膜が導入された細胞培養基材を合成した。 Example 14
[Synthesis of cell culture substrate]
0.04 g of the block copolymer synthesized in Example 11 [Synthesis of block copolymer] was dissolved in 20 g of ethanol to prepare a 0.2 wt% ethanol solution of the block copolymer. Furthermore, 20 mL of 0.2 wt% ethanol solution and 180 mL of ethanol were mixed to prepare a 0.02 wt% ethanol solution. After adding 180 mL of the above-mentioned block copolymer 0.02 wt% ethanol solution to a 300 mL glass flask, stirring the ethanol solution with a stirrer, adding 10 g of Corning (R) Extended Microcarriers (No. 4625) at room temperature Stir for 30 minutes. Ethanol was removed from the obtained culture substrate suspension under reduced pressure and dried at room temperature under reduced pressure, whereby a random copolymer block (B) of 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine and styrene and N was formed on the surface. A cell culture substrate into which a temperature-responsive membrane made of a block copolymer made of isopropylacrylamide polymer block (A) was introduced was synthesized.

　［細胞培養評価および剥離評価］
上記細胞培養基材をリン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳ）溶液に分散させ、オートクレーブ滅菌を行った。その後、血球計算盤上に０．５μＬを添加し、ビーズ濃度を計算した。（株）セルシード製ＨｙｄｒｏＣｅｌｌ(R)３．５ｃｍディッシュに細胞培養基材を１×１０^４ビーズ／ｍＬ、Ｌ９２９細胞を１００ｃｅｌｌｓ／ビーズとなるように加え、３７℃で培養を行った。７２時間培養後、培養液をチューブにに移し、培養液を２ｍＬ加え、１０分間静置した後、上澄みを捨てることで、未接着の浮遊細胞および細胞凝集塊を除いた。さらにセルストレーナー（メッシュサイズ４０μｍ）で浮遊細胞をろ過し、ろ物を培地２ｍＬ中で再分散させた。その後、１０℃のインキュベーターで１５分間インキュベートし、細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で剥離した。セルストレーナー（メッシュサイズ４０μｍ）で剥離した細胞をろ過し、血球計算盤を用いて細胞数を計算した。また、対照実験として、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液中で処理を行った際の細胞剥離数を計測した。１０℃への温度低下により剥離した細胞は４×１０^５個で、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液中での処理により剥離した細胞（４×１０^５個）とほぼ同等であり、温度低下によってほぼ１００％細胞を回収することができた。 [Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
The cell culture substrate was dispersed in a phosphate buffered saline (PBS) solution, and autoclaved. Thereafter, 0.5 μL was added to the hemocytometer, and the bead concentration was calculated. A cell culture substrate was added to a cell seed HydroCell® 3.5 cm dish at 1 × 10 ⁴ beads / mL and L929 cells were added at 100 cells / bead, and cultured at 37 ° C. After culturing for 72 hours, the culture solution was transferred to a tube, 2 mL of the culture solution was added, allowed to stand for 10 minutes, and then the supernatant was discarded to remove unattached floating cells and cell aggregates. Furthermore, floating cells were filtered with a cell strainer (mesh size 40 μm), and the filtrate was redispersed in 2 mL of medium. Thereafter, the cells were incubated for 15 minutes in an incubator at 10 ° C., and the cells detached in the form of single cells having a maximum diameter of 20 μm. The detached cells were filtered with a cell strainer (mesh size 40 μm), and the number of cells was calculated using a hemocytometer. In addition, as a control experiment, the number of cell detachments when treated in a trypsin-EDTA solution was measured. The number of cells exfoliated due to the temperature drop to 10 ° C. is 4 × 10 ⁵ cells, which is almost the same as the cells exfoliated by treatment in the trypsin-EDTA solution (4 × 10 ⁵ cells). Could be recovered.

　比較例１
［重合体ブロック（Ａ）の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコにｎ－ブチルメタクリレート２．２４０ｇ、ＲＡＦＴ剤として４－シアノ－４－［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド０．０７３ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００４ｇを加え、１，４－ジオキサン１０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間反応させた。反応後、メタノールで再沈し、ｎ－ブチルメタクリレートの重合体を得た。得られたｎ－ブチルメタクリレート重合体ブロック０．５ｇを２０℃の水１００ｍＬに添加した結果、不溶部が存在し完全に溶解できなかった。 Comparative Example 1
[Synthesis of polymer block (A)]
In a 100 mL two-necked eggplant type flask, 2.240 g of n-butyl methacrylate, 0.073 g of 4-cyano-4-[(dodecylsulfonylthiocarbonyl) sulfonyl] pentanoic acid as a RAFT agent, and 0.004 g of azobisisobutylnitrile were added. In addition, it was dissolved in 10 mL of 1,4-dioxane. Nitrogen bubbling was performed for 30 minutes, and then the mixture was reacted at 65 ° C. for 12 hours. After the reaction, it was reprecipitated with methanol to obtain a polymer of n-butyl methacrylate. As a result of adding 0.5 g of the obtained n-butyl methacrylate polymer block to 100 mL of water at 20 ° C., an insoluble part was present and could not be completely dissolved.

　さらに１００ｍＬの２口ナス型フラスコにｎ－ブチルメタクリレート重合体１．２００ｇ、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド１．２１０ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００４ｇを加え、１，４－ジオキサン／エタノール＝１：２混合溶液１５ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間反応させた。反応後、純水で再沈し、ｎ－ブチルメタクリレートとＮ－イソプロピルアクリルアミドがブロック共重合したポリマーを得た。 Further, 1.200 g of n-butyl methacrylate polymer, 1.210 g of N-isopropylacrylamide, and 0.004 g of azobisisobutylnitrile were added to a 100 mL two-necked eggplant type flask, and 1,4-dioxane / ethanol = 1: 2 mixed solution. Dissolved in 15 mL. Nitrogen bubbling was performed for 30 minutes, and then the mixture was reacted at 65 ° C. for 12 hours. After the reaction, it was reprecipitated with pure water to obtain a polymer in which n-butyl methacrylate and N-isopropylacrylamide were block copolymerized.

　［細胞培養基材の合成］
上記にて製造した重合体を用いたこと以外は、実施例１０［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは１００ｎｍであった。 [Synthesis of cell culture substrate]
Except that the polymer produced above was used, synthesis was carried out in the same manner as in Example 10 [Synthesis of cell culture substrate] to obtain a cell culture substrate in which a temperature-responsive membrane was introduced on the surface. It was. The thickness of the film was 100 nm.

　［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認され、細胞増殖後の細胞剥離評価では、３分冷却することで細胞はシート状で２４％剥離した。また１５分冷却することで細胞は最大直径８ｍｍのシート状で６０％剥離した。 [Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Except that a cell culture substrate having a temperature-responsive membrane introduced on the surface produced above was used, the same evaluation as in Example 1 [Cell culture evaluation and peeling evaluation] was performed, and cell proliferation was confirmed. In the cell detachment evaluation after cell proliferation, the cells were detached in a sheet form by 24% by cooling for 3 minutes. Further, by cooling for 15 minutes, the cells were peeled off by 60% in the form of a sheet having a maximum diameter of 8 mm.

　比較例２
［細胞培養評価および剥離評価］
セルシード（株）製ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）３５ｍｍφディッシュを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認され、細胞増殖後の細胞剥離評価では、３分冷却することで細胞はシート状で３０％剥離した。また１５分冷却することで細胞は最大直径１ｃｍのシート状で６５％剥離した。 Comparative Example 2
[Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Except for using CellCell Co., Ltd. UpCell (R) 35 mmφ dish, the same evaluation as in Example 1 [Cell culture evaluation and exfoliation evaluation] was performed, and cell proliferation was confirmed. In cell exfoliation evaluation after cell proliferation, By cooling for 3 minutes, the cells were peeled off in a sheet form by 30%. Further, by cooling for 15 minutes, the cells were peeled off by 65% in the form of a sheet having a maximum diameter of 1 cm.

　［剥離細胞の培養評価］
上述の細胞培養評価で基材の１００％を覆うまで増殖した細胞から培地成分を除いた後、新たにＤＭＥＭ培地を添加して、１０℃に冷却した。１時間で細胞は最大直径１ｃｍのシート状で１００％剥離した。剥離したＬ９２９細胞をピペェッティングで分散化させた後、５０個／ｍｍ^２の細胞密度で播種し、実施例１［剥離細胞の培養評価］と同様の方法で培養した。細胞は２４時間後に８０個／ｍｍ^２に、７２時間後に４５０個／ｍｍ^２まで増加し、本発明の細胞培養基材から剥離した細胞よりも増殖速度が遅かった。 [Culture evaluation of exfoliated cells]
The medium component was removed from the cells grown to cover 100% of the substrate in the cell culture evaluation described above, and then a DMEM medium was newly added and cooled to 10 ° C. In 1 hour, the cells were detached 100% in the form of a sheet having a maximum diameter of 1 cm. The exfoliated L929 cells were dispersed by pipetting, seeded at a cell density of 50 cells / mm ² , and cultured in the same manner as in Example 1 [Cultural evaluation of exfoliated cells]. The cells increased to 80 cells / mm ² after 24 hours and to 450 cells / mm ² after 72 hours, and the growth rate was slower than the cells detached from the cell culture substrate of the present invention.

　比較例３
［細胞培養評価および剥離評価］
コーニング製の細胞培養表面処理φ３５ｍｍディッシュを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認されたが、細胞増殖後の細胞剥離評価では、１５分冷却しても細胞は全く剥離しなかった。
［トリプシンによる剥離および剥離細胞の評価］
上述の細胞培養評価で基材の１００％を覆うまで増殖した細胞から培地成分を除いた後、トリプシンＥＤＴＡ溶液（和光純薬工業（株）製）１ｍＬを添加し、３７℃、ＣＯ_２濃度５％で１０分間放置し、細胞を剥離した。剥離した細胞とトリプシンＥＤＴＡ溶液の混合物を遠心管中に移送し、１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地１ｍＬを追加し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄みを除去した後、新たに１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地を添加して、トリプシン処理で剥離したＬ９２９細胞を回収した。回収したＬ９２９細胞（５０個／ｍｍ^２）を、実施例１［剥離細胞の培養評価］と同様の方法で培養した。細胞は２４時間後に８０個／ｍｍ^２に、７２時間後に４８０個／ｍｍ^２まで増加し、本発明の細胞培養基材から冷却により剥離した細胞よりも増殖速度が遅かった。 Comparative Example 3
[Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Cell proliferation was confirmed by the same evaluation as in Example 1 [Cell culture evaluation and exfoliation evaluation] except that a Corning cell culture surface treatment φ35 mm dish was used. In cell exfoliation evaluation after cell proliferation, The cells did not peel at all even after cooling for 15 minutes.
[Evaluation of exfoliated and exfoliated cells by trypsin]
After removing medium components from the cells grown to cover 100% of the substrate in the cell culture evaluation described above, 1 mL of trypsin EDTA solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the temperature was 37 ° C. and the CO ₂ concentration was 5 % For 10 minutes to detach the cells. The mixture of exfoliated cells and trypsin EDTA solution was transferred into a centrifuge tube, 1 mL of 10 vol% FBS / DMEM medium was added, and the mixture was centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes. After removing the supernatant, 10 vol% FBS / DMEM medium was newly added to recover L929 cells detached by trypsin treatment. The recovered L929 cells (50 cells / mm ² ) were cultured in the same manner as in Example 1 [Cultural evaluation of detached cells]. Cells increased to 80 cells / mm ² after 24 hours and 480 cells / mm ² after 72 hours, and the growth rate was slower than that of cells detached from the cell culture substrate of the present invention by cooling.

　比較例４
［細胞培養評価および剥離評価］
セルシード（株）製ＵｐＣｅｌｌ^(R)３５ｍｍφディッシュを用いたこと以外は、実施例１２　［細胞培養評価および剥離評価］と同様に評価を行い、細胞増殖が確認され、７２時間培養したところで３８４個／ｍｍ^２まで増殖していた。基材を１０℃に冷却し、１５分冷却することで細胞は最大直径１．２ｃｍのシート状で９０％剥離した。
［剥離細胞の培養評価］
上述の細胞培養評価で得られた細胞をピペッティングで分散化させた後、用いたたこと以外は、実施例１２［剥離細胞の培養評価］と同様の方法で評価を行った。細胞は２４時間後に２１０個／ｍｍ^２に、７２時間後に８８０個／ｍｍ^２まで増加した。 Comparative Example 4
[Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Evaluation was conducted in the same manner as in Example 12 [Evaluation of cell culture and exfoliation] except that CellCell Co., Ltd. UpCell ^(R) 35 mmφ dish was used, and cell growth was confirmed. until mm ² it had grown. The substrate was cooled to 10 ° C. and cooled for 15 minutes, so that the cells were peeled 90% in a sheet form having a maximum diameter of 1.2 cm.
[Culture evaluation of exfoliated cells]
Evaluation was performed in the same manner as in Example 12 [Culture evaluation of detached cells] except that the cells obtained by the above cell culture evaluation were dispersed by pipetting and then used. Cells increased to 210 cells / mm ² after 24 hours and to 880 cells / mm ² after 72 hours.

　比較例５
［細胞培養評価および剥離評価］
コーニング製の細胞培養表面処理φ３５ｍｍディッシュを用いたこと以外は、実施例１２　［細胞培養評価および剥離評価］と同様に評価を行い、細胞増殖が確認され、７２時間培養したところで２６６個／ｍｍ^２まで増殖していた。基材を１０℃に冷却し、６０分冷却したが細胞は剥離しなかった。
［トリプシンによる剥離および剥離細胞の評価］
上述の細胞培養評価で得られた細胞から培地成分を除いた後、０．２５％トリプシンＥＤＴＡ溶液（和光純薬工業（株）製）１．５ｍＬを添加し、３７℃、ＣＯ_２濃度５％で２分間放置し、細胞を剥離した。剥離した細胞とトリプシンＥＤＴＡ溶液の混合物を遠心管中に移送し、ＤＳファーマバイオメディカル（株）製ＣＳ－Ｃ培地キット（Ｎｏ．ＣＳ４Ｚ０５００Ｒ）基礎培地２ｍＬを追加し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄みを除去した後、新たに、ＤＳファーマバイオメディカル（株）製ＣＳ－Ｃ培地キット（Ｎｏ．ＣＳ４Ｚ０５００Ｒ）基礎培地を添加して、トリプシン処理で剥離したＮＨＤＦ細胞を回収した。回収したＮＨＤＦ細胞（５０個／ｍｍ^２）を用いたたこと以外は、実施例１２［剥離細胞の培養評価］と同様の方法で評価を行った。細胞は２４時間後に１５０個／ｍｍ^２に、７２時間後に６９０個／ｍｍ^２まで増加した。 Comparative Example 5
[Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
The cells were evaluated in the same manner as in Example 12 [Evaluation of cell culture and exfoliation] except that a Corning cell culture surface treatment φ35 mm dish was used. When cell growth was confirmed and cultured for 72 hours, 266 cells / mm ^{2 were used.} Was growing. The substrate was cooled to 10 ° C. and cooled for 60 minutes, but the cells did not detach.
[Evaluation of exfoliated and exfoliated cells by trypsin]
After removing the medium components from the cells obtained in the above cell culture evaluation, 1.5 mL of 0.25% trypsin EDTA solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the temperature was 37 ° C. and the CO ₂ concentration was 5%. For 2 minutes to detach the cells. A mixture of detached cells and trypsin EDTA solution was transferred into a centrifuge tube, 2 mL of CS-C medium kit (No. CS4Z0500R) basal medium manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd. was added, and centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes. After removing the supernatant, a CS-C medium kit (No. CS4Z0500R) basal medium manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd. was added to recover NHDF cells detached by trypsin treatment. Evaluation was performed in the same manner as in Example 12 [Cultural evaluation of exfoliated cells] except that the recovered NHDF cells (50 cells / mm ² ) were used. Cells increased to 150 cells / mm ² after 24 hours and to 690 cells / mm ² after 72 hours.

　比較例６
［細胞培養評価および剥離評価］
セルシード（株）製ＵｐＣｅｌｌ^(R)３５ｍｍφディッシュを用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ^２）の代わりにチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（１００個／ｍｍ^２）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認され、細胞増殖後の細胞剥離評価では、３分冷却することで細胞はシート状で１５％剥離した。また１５分冷却することで細胞は最大直径１．２ｃｍのシート状で５０％剥離した。

Comparative Example 6
[Cell culture evaluation and exfoliation evaluation]
Implemented except that CellCell Co., Ltd. UpCell ^(R) 35 mmφ dish was used and Chinese hamster ovary-derived CHO cells (100 cells / mm ² ) were used instead of mouse connective tissue L929 cells (100 cells / mm ² ). The same evaluation as in Example 1 [Cell culture evaluation and peeling evaluation] was performed, and cell growth was confirmed. In the cell peeling evaluation after cell growth, the cells were peeled 15% in a sheet form by cooling for 3 minutes. Further, by cooling for 15 minutes, the cells were separated by 50% in the form of a sheet having a maximum diameter of 1.2 cm.

　なお、２０１５年３月３１日に出願された日本特許出願２０１５－０７２９０８の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。 The entire contents of the specification, claims, drawings and abstract of Japanese Patent Application No. 2015-072908 filed on March 31, 2015 are incorporated herein by reference. Is.

　本発明によれば、短時間での細胞剥離を可能にする細胞培養基材、その製造方法およびそれを用いた細胞培養方法を提供することができる。さらに、細胞を最大直径５μｍ～３００μｍの大きさで剥離し、細胞の分散化作業を省略できる細胞培養基材、その製造方法およびそれを用いた細胞培養方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a cell culture substrate that enables cell detachment in a short time, a production method thereof, and a cell culture method using the same. Furthermore, it is possible to provide a cell culture substrate capable of exfoliating cells with a maximum diameter of 5 μm to 300 μm and omitting the cell dispersal operation, a production method thereof, and a cell culture method using the same.

Claims

A cell culture substrate whose surface is coated with a block copolymer containing the following blocks (A) and (B).
(A) A block of a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(B) A hydrophilic polymer block having no LCST in the range of 0 ° C. to 50 ° C. and having an HLB value (Griffin method) in the range of 9-20.

Block (B) is a carboxylic acid group, a carboxylic acid ester group, a carboxylic acid metal salt, a sulfonic acid group, a sulfonic acid ester group, a sulfonic acid metal salt, a hydroxy group, an alkoxy group, a phenoxy group, an amide group, an aminoalkyl group, Carbamoyl group, sulfonamide group, sulfamoyl group, carbamate group, phosphate group, metal salt of phosphate group, oxyphosphate group, metal salt of oxyphosphate group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbobetaine group, polyethylene glycol group The cell culture substrate according to claim 1, which is a polymer of a monomer having at least one hydrophilic group selected from pyrrolidone groups.

The cell culture substrate according to claim 1 or 2, wherein the block (B) is a block exhibiting solubility in water.

The repeating unit of the block (A) is represented by the following general formula (1)

(Wherein R ¹ is a hydrogen atom or a methyl group, R ² and R ³ are each independently a hydrogen group, a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, a furfuryl group or a tetrahydrofurfuryl group; ² and R ³ may be bonded to each other to form a pyrrolidine ring, piperidine ring or morpholine ring.
The cell culture medium according to any one of claims 1 to 3, which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (a) among the block units represented by Wood.

The repeating unit of the block (A) is represented by the following general formula (2)

(Wherein R ⁴ represents a hydrogen atom or a methyl group, R ⁵ represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, and a represents an integer of 1 to 10)
The cell culture medium according to any one of claims 1 to 3, which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (a) among the block units represented by Wood.

The repeating unit of the block (A) is represented by the following general formula (3)

(In the formula, R ⁶ represents a hydrogen atom or a methyl group, and R ⁷ represents a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms.)
The cell culture medium according to any one of claims 1 to 3, which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (a) among the block units represented by Wood.

The repeating unit of the block (B) is represented by the following general formula (4)

(Wherein R ⁸ is a hydrogen atom or a methyl group, R ⁹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, or a (poly) oxyethylene group, and R ¹⁰ is a group having 1 to 10 carbon atoms) 4 is a divalent hydrocarbon group, R ¹¹ , R ¹² , and R ¹³ are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and A ¹ is an ester bond, an amide This is a divalent bond selected from the group consisting of a bond, a urethane bond, and an ether bond.)
The cell culture medium according to any one of claims 1 to 6, wherein the block is a block of a (co) polymer comprising at least one block unit (b). Wood.

The repeating unit of the block (B) is represented by the following general formula (5)

[Wherein R ¹⁴ represents a hydrogen atom or a methyl group, and R ¹⁵ represents — (CH ₂ CH ₂ O) _b — (CH ₂ CH (CH ₃ ) O) _c —R ¹⁶ (wherein R ¹⁶ represents hydrogen An atom, an alkyl group having 1 to 30 carbon atoms, b is an integer of 1 to 300, and c is an integer of 0 to 60)), —CH ₂ —O—R ¹⁷ (wherein R ¹⁷ represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms), a furfuryl group, a tetrahydrofurfuryl group, or a hydrogen atom. ]
The cell culture medium according to any one of claims 1 to 6, wherein the block is a block of a (co) polymer comprising at least one block unit (b). Wood.

The repeating unit of the block (B) is represented by the following general formula (6)

(Wherein R ¹⁸ is a hydrogen atom or a methyl group, R ¹⁹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, or a (poly) oxyethylene group, and R ²⁰ is a group having 1 to 4 is a divalent hydrocarbon group, R ²¹ and R ²² are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and A ² is an ester bond, an amide bond, a urethane bond, And a divalent bond selected from the group consisting of ether bonds, and X is a sulfonate anion group, a carboxylate anion group, or a phosphate anion group.)
The cell culture medium according to any one of claims 1 to 6, wherein the block is a block of a (co) polymer comprising at least one block unit (b). Wood.

The repeating unit of the block (B) is represented by the following general formula (7)

(In the formula, R ²³ is a hydrogen atom or a methyl group, and R ²⁴ and R ²⁵ are each independently a hydrogen atom or a methyl group.)
The cell culture medium according to any one of claims 1 to 6, wherein the block is a block of a (co) polymer comprising at least one block unit (b). Wood.

The repeating unit of the block (B) is represented by the following general formula (8)

(In the formula, R ²⁶ is a hydrogen atom or a methyl group.)
The cell culture medium according to any one of claims 1 to 6, wherein the block is a block of a (co) polymer comprising at least one block unit (b). Wood.

The repeating unit of the block (B) is represented by the following general formula (9)

(Wherein R ²⁷ is a hydrogen atom or a methyl group, R ²⁸ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, and R ²⁹ and R ³⁰ are each independently a hydrogen atom or a carbon number. 1 to 4 hydrocarbon groups, and A ³ is a divalent bond selected from the group consisting of an ester bond, an amide bond, a urethane bond, and an ether bond.
The cell culture medium according to any one of claims 1 to 6, wherein the block is a block of a (co) polymer comprising at least one block unit (b). Wood.

The cell culture substrate according to any one of claims 1 to 12, wherein the ratio of the block unit (a) to the total block unit [(a) + (b)] is 5 to 95 mol%.

The cell culture substrate according to any one of claims 1 to 13, wherein the block copolymer has a number average molecular weight (Mn) of 3,000 or more and 1,000,000 or less.

The cell culture substrate according to any one of claims 1 to 13, wherein the number average molecular weight (Mn) is 5,000 or more and 100,000 or less.

A cell culture substrate whose surface is coated with a block copolymer containing the following blocks (A) and (B).
(A) A block of a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(B) A block that satisfies the following requirements (i) to (iii).
(I) No LCST in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(Ii) Carboxylic acid group, carboxylic acid ester group, carboxylic acid metal salt, sulfonic acid group, sulfonic acid, ester group, sulfonic acid metal salt, hydroxy group, alkoxy group, phenoxy group, amide group, aminoalkyl group, carbamoyl group , Sulfonamido group, sulfamoyl group, carbamate group, phosphoric acid group, metal salt of phosphoric acid group, oxyphosphoric acid group, metal salt of oxyphosphoric acid group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbobetaine group, polyethylene glycol group, pyrrolidone It is a hydrophilic polymer of a monomer having at least one hydrophilic group selected from the group.
(Iii) In the polymer of (ii), a monomer unit produced by an aromatic vinyl compound, a monomer unit produced by a (meth) acrylamide compound, a monomer unit produced by a fumaric acid diester compound, and a monomer unit produced by vinyl chloride , Containing at least one monomer unit selected from a monomer unit produced by vinyl acetate, a monomer unit produced by (meth) acrylonitrile, a monomer unit produced by N-vinylimidazole, and a monomer unit produced by N-vinylcarbazole .

The cell culture substrate according to claim 16, wherein the block (B) is a block exhibiting solubility in water.

(Wherein R ¹ is a hydrogen atom or a methyl group, R ² and R ³ are each independently a hydrogen group, a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, a furfuryl group or a tetrahydrofurfuryl group; ² and R ³ may be bonded to each other to form a pyrrolidine ring, piperidine ring or morpholine ring.
The cell culture substrate according to claim 16 or 17, which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (a) among the block units represented by formula (1).

(Wherein R ⁴ represents a hydrogen atom or a methyl group, R ⁵ represents a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, and a represents an integer of 1 to 10)
The cell culture substrate according to claim 16 or 17, which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (a) among the block units represented by formula (1).

(In the formula, R ⁶ represents a hydrogen atom or a methyl group, and R ⁷ represents a hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms.)
The cell culture substrate according to claim 16 or 17, which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (a) among the block units represented by formula (1).

The repeating unit of the hydrophilic polymer of the block (B) is represented by the following general formula (4)

(Wherein R ⁸ is a hydrogen atom or a methyl group, R ⁹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, or a (poly) oxyethylene group, and R ¹⁰ is a group having 1 to 10 carbon atoms) 4 is a divalent hydrocarbon group, R ¹¹ , R ¹² , and R ¹³ are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and A ¹ is an ester bond, an amide This is a divalent bond selected from the group consisting of a bond, a urethane bond, and an ether bond.)
The cell culture medium according to any one of claims 16 to 20, which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) among the block units represented by Wood.

The repeating unit of the hydrophilic polymer of the block (B) is represented by the following general formula (5)

[Wherein R ¹⁴ represents a hydrogen atom or a methyl group, and R ¹⁵ represents — (CH ₂ CH ₂ O) _b — (CH ₂ CH (CH ₃ ) O) _c —R ¹⁶ (wherein R ¹⁶ represents hydrogen An atom, an alkyl group having 1 to 30 carbon atoms, b is an integer of 1 to 300, and c is an integer of 0 to 60)), —CH ₂ —O—R ¹⁷ (wherein R ¹⁷ represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms), a furfuryl group, a tetrahydrofurfuryl group, or a hydrogen atom. ]
The cell culture medium according to any one of claims 16 to 20, which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) among the block units represented by Wood.

The repeating unit of the hydrophilic polymer of the block (B) is represented by the following general formula (6)

(Wherein R ¹⁸ is a hydrogen atom or a methyl group, R ¹⁹ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, or a (poly) oxyethylene group, and R ²⁰ is a group having 1 to 4 is a divalent hydrocarbon group, R ²¹ and R ²² are each independently a hydrogen atom or a hydrocarbon group having 1 to 4 carbon atoms, and A ² is an ester bond, an amide bond, a urethane bond, And a divalent bond selected from the group consisting of ether bonds, and X is a sulfonate anion group, a carboxylate anion group, or a phosphate anion group.)
The cell culture medium according to any one of claims 16 to 20, which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) among the block units represented by Wood.

The repeating unit of the hydrophilic polymer of the block (B) is represented by the following general formula (7)

(In the formula, R ²³ is a hydrogen atom or a methyl group, and R ²⁴ and R ²⁵ are each independently a hydrogen atom or a methyl group.)
The cell culture medium according to any one of claims 16 to 20, which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) among the block units represented by Wood.

The repeating unit of the hydrophilic polymer of the block (B) is represented by the following general formula (8)

(In the formula, R ²⁶ is a hydrogen atom or a methyl group.)
The cell culture medium according to any one of claims 16 to 20, which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) among the block units represented by Wood.

The repeating unit of the hydrophilic polymer of the block (B) is represented by the following general formula (9)

(Wherein R ²⁷ is a hydrogen atom or a methyl group, R ²⁸ is a divalent hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, and R ²⁹ and R ³⁰ are each independently a hydrogen atom or a carbon number. 1 to 4 hydrocarbon groups, and A ³ is a divalent bond selected from the group consisting of an ester bond, an amide bond, a urethane bond, and an ether bond.
The cell culture medium according to any one of claims 16 to 20, which is a block of a (co) polymer comprising at least one type of block unit (b) among the block units represented by Wood.

The cell culture substrate according to any one of claims 16 to 26, wherein the ratio of the block unit (a) to the total block unit [(a) + (b)] is 5 to 95 mol%.

The cell culture substrate according to any one of claims 16 to 27, wherein the block copolymer has a number average molecular weight (Mn) of 3,000 or more and 1,000,000 or less.

A method for producing a cell culture substrate, comprising dissolving a block copolymer containing the following blocks (A) and (B) in a solvent, applying the solution to a substrate, and drying the solution.
(A) A block of a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(B) A hydrophilic polymer block having no LCST in the range of 0 ° C. to 50 ° C. and having an HLB value (Griffin method) in the range of 9-20.

Block (B) is a carboxylic acid group, a carboxylic acid ester group, a carboxylic acid metal salt, a sulfonic acid group, a sulfonic acid ester group, a sulfonic acid metal salt, a hydroxy group, an alkoxy group, a phenoxy group, an amide group, an aminoalkyl group, Carbamoyl group, sulfonamide group, sulfamoyl group, carbamate group, phosphate group, metal salt of phosphate group, oxyphosphate group, metal salt of oxyphosphate group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbobetaine group, polyethylene glycol group 30. The production method according to claim 29, which is a polymer of a monomer having at least one hydrophilic group selected from pyrrolidone groups.

A method for producing a cell culture substrate, comprising dissolving a block copolymer containing the following blocks (A) and (B) in a solvent, applying the solution to a substrate, and drying the solution.
(A) A block of a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(B) A block that satisfies the following requirements (i) to (iii).
(I) No LCST in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(Ii) carboxylic acid group, carboxylic acid ester group, carboxylic acid metal salt, sulfonic acid group, sulfonic acid ester group, sulfonic acid metal salt, hydroxy group, alkoxy group, phenoxy group, amide group, carbamoyl group, sulfonamide group, At least selected from sulfamoyl group, carbamate group, phosphate group, metal salt of phosphate group, oxyphosphate group, metal salt of oxyphosphate group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbobetaine group, polyethylene glycol group, pyrrolidone group It is a hydrophilic polymer of a monomer having one kind of hydrophilic group.
(Iii) In the polymer of (ii), a monomer unit produced by an aromatic vinyl compound, a monomer unit produced by a (meth) acrylamide compound, a monomer unit produced by a fumaric acid diester compound, and a monomer unit produced by vinyl chloride , Containing at least one monomer unit selected from a monomer unit produced by vinyl acetate, a monomer unit produced by (meth) acrylonitrile, a monomer unit produced by N-vinylimidazole, and a monomer unit produced by N-vinylcarbazole .

A method for producing a cell culture substrate, comprising immobilizing a block copolymer containing the following blocks (A) and (B) to the substrate by chemical bonding.
(A) A block of a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(B) A hydrophilic polymer block having no LCST in the range of 0 ° C. to 50 ° C. and having an HLB value (Griffin method) in the range of 9-20.

Block (B) is a carboxylic acid group, a carboxylic acid ester group, a carboxylic acid metal salt, a sulfonic acid group, a sulfonic acid ester group, a sulfonic acid metal salt, a hydroxy group, an alkoxy group, a phenoxy group, an amide group, an aminoalkyl group, Carbamoyl group, sulfonamide group, sulfamoyl group, carbamate group, phosphate group, metal salt of phosphate group, oxyphosphate group, metal salt of oxyphosphate group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbobetaine group, polyethylene glycol group The production method according to claim 32, which is a polymer of a monomer having at least one hydrophilic group selected from pyrrolidone groups.

A method for producing a cell culture substrate, comprising immobilizing a block copolymer containing the following blocks (A) and (B) to the substrate by chemical bonding.
(A) A block of a temperature-responsive polymer having a lower critical solution temperature (LCST) in water in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(B) A block that satisfies the following requirements (i) to (iii).
(I) No LCST in the range of 0 ° C to 50 ° C.
(Ii) carboxylic acid group, carboxylic acid ester group, carboxylic acid metal salt, sulfonic acid group, sulfonic acid ester group, sulfonic acid metal salt, hydroxy group, alkoxy group, phenoxy group, amide group, aminoalkyl group, carbamoyl group, Sulfonamide group, sulfamoyl group, carbamate group, phosphate group, metal salt of phosphate group, oxyphosphate group, metal salt of oxyphosphate group, phosphobetaine group, sulfobetaine group, carbobetaine group, polyethylene glycol group, pyrrolidone group A hydrophilic polymer of a monomer having at least one hydrophilic group selected from the group consisting of:
(Iii) In the polymer of (ii), a monomer unit produced by an aromatic vinyl compound, a monomer unit produced by a (meth) acrylamide compound, a monomer unit produced by a fumaric acid diester compound, and a monomer unit produced by vinyl chloride , Containing at least one monomer unit selected from a monomer unit produced by vinyl acetate, a monomer unit produced by (meth) acrylonitrile, a monomer unit produced by N-vinylimidazole, and a monomer unit produced by N-vinylcarbazole .

Using the cell culture substrate according to any one of claims 1 to 28, cells are cultured at a temperature higher than a lower critical lysis temperature (LCST), and after the cells are grown, the temperature is lower than the LCST and A cell culture method comprising peeling from a substrate.

The cell culture method according to claim 35, wherein the cultured cells are detached with a maximum diameter of 5 μm to 300 μm.

37. The cell culture method according to claim 35 or 36, wherein the cultured cells are detached as a single cell.

A cell culture method comprising culturing cells using cells detached by the cell culture method according to any one of claims 35 to 37.