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WO2016013614A1 - 観察装置および最終像の鮮明化方法 - Google Patents

観察装置および最終像の鮮明化方法 Download PDF

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WO2016013614A1
WO2016013614A1 PCT/JP2015/070970 JP2015070970W WO2016013614A1 WO 2016013614 A1 WO2016013614 A1 WO 2016013614A1 JP 2015070970 W JP2015070970 W JP 2015070970W WO 2016013614 A1 WO2016013614 A1 WO 2016013614A1
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WO
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phase modulation
modulation element
light
scanner
wavefront
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PCT/JP2015/070970
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宏也 福山
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Olympus Corp
Original Assignee
Olympus Corp
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Publication date
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    • G01N2201/0635—Structured illumination, e.g. with grating

Definitions

  • the present invention relates to an observation apparatus and a final image sharpening method.
  • a method is known in which the focal position is moved in the direction along the optical axis by adjusting the optical path length at the intermediate image position (see, for example, Patent Document 1).
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and prevents the intermediate image from being damaged by the optical element even if the intermediate image is formed at a position coinciding with the optical element.
  • An observation apparatus and a final image sharpening method capable of acquiring a clear final image are provided.
  • One aspect of the present invention includes a plurality of imaging lenses that form a final image and at least one intermediate image, and are disposed closer to the object side than any of the intermediate images formed by the imaging lens.
  • a first phase modulation element that imparts spatial disturbance to the wavefront of the light, and at least one intermediate image interposed between the first phase modulation element and the first phase modulation element
  • An imaging optical system comprising: a second phase modulation element that cancels a spatial disturbance imparted to the wavefront of light from the object, and the imaging optical system disposed on the object side of the imaging optical system;
  • a light detector for detecting, and the first phase modulation element and the second phase modulation element are disposed at a position optically conjugate with the first scanner
  • the final image is formed by being condensed by the imaging lens.
  • a spatial disturbance is given to the wavefront of the illumination light by passing through the first phase modulation element arranged on the object side of one of the intermediate images, and the formed intermediate image is blurred.
  • the illumination light that forms the intermediate image passes through the second phase modulation element, thereby canceling the spatial disturbance of the wavefront imparted by the first phase modulation element.
  • a clear image can be obtained in the final image formed after the second phase modulation element.
  • the illumination light from the light source is scanned two-dimensionally by the first scanner and the second scanner, so that the final image formed on the observation object can be scanned two-dimensionally.
  • the first scanner when the first scanner is operated, the luminous flux of the illumination light moves in a one-dimensional linear direction, but the first scanner and the second phase modulation element are arranged at optically conjugate positions. For this reason, the position of the light beam passing through the second phase modulation element does not fluctuate.
  • the second scanner which is spaced from the first scanner in the optical axis direction, is not disposed in an optically conjugate positional relationship with the second phase modulation element, and thus activates the second scanner. Then, the luminous flux of the illumination light moves so as to change the passing position of the second phase modulation element. Since the direction in which the phase distribution characteristic of the second phase modulation element changes coincides with the scanning direction of the illumination light by the first scanner, the phase distribution in the direction orthogonal to this, that is, the scanning direction of the illumination by the second scanner The characteristic does not change, and the phase modulation applied to the illumination light does not change even if the passage position of the illumination light beam changes.
  • the second phase is not affected by the scanning state of the illumination light.
  • a constant state can be maintained without changing the phase modulation by the modulation element, and the spatial disturbance of the wavefront provided by the first phase modulation element can be completely canceled.
  • the first phase modulation element and the second phase modulation element may be lenticular elements.
  • the first phase modulation element and the second phase modulation element may be a prism array.
  • the first phase modulation element and the second phase modulation element may be diffraction gratings.
  • the first phase modulation element and the second phase modulation element may be cylindrical lenses.
  • Another aspect of the present invention includes an imaging optical system including a plurality of imaging lenses that form a final image and at least one intermediate image, and is disposed on the object side of the imaging optical system.
  • a light source that generates incident illumination light
  • a first scanner and a second scanner that are arranged at intervals in the optical axis direction and that scan illumination light from the light source, and a final image position of the imaging optical system
  • a method for sharpening a final image in an observation apparatus including a photodetector that detects light emitted from an observation object disposed on the observation object, than any one of the intermediate images formed by the imaging lens.
  • a first phase modulation element for providing a spatial disturbance to the wavefront of illumination light from the light source is disposed at a position optically conjugate with the first scanner on the object side, and the first phase modulation element And at least one intermediate image in between A one-dimensional phase distribution characteristic that changes in a direction coinciding with the scanning direction of illumination light from the first scanner at a position optically conjugate with the first scanner, and the first phase modulation element
  • the present invention even if the intermediate image is formed at a position that coincides with the optical element, it is possible to prevent a scratch, a foreign object, a defect, or the like of the optical element from overlapping the intermediate image and obtain a clear final image. There is an effect that can be done.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows the observation apparatus which concerns on one Embodiment of this invention. It is a top view which shows the illuminating device of FIG. It is a side view which shows the illuminating device of FIG. It is a cross-sectional view which shows the passage position of the light beam by the scanning operation in the wavefront recovery element of FIG. It is a cross-sectional view which shows the passage position of the light beam by the scanning operation in the pupil position of the objective lens of FIG. It is an enlarged schematic diagram which shows a part of illuminating device which concerns on one Example of this invention.
  • the observation apparatus 1 is, for example, a multiphoton excitation microscope.
  • the observation apparatus 1 includes an illumination apparatus 2 that irradiates an observation object A with an ultrashort pulse laser beam (hereinafter simply referred to as laser light (illumination light)), and a laser by the illumination apparatus 2.
  • a detector optical system 4 that guides the fluorescence generated in the observation object A due to light irradiation to the photodetector 5 and a photodetector 5 that detects the fluorescence guided by the detector optical system 4 are provided.
  • the illumination device 2 includes a light source 6 that generates laser light, and an imaging optical system 3 that irradiates the observation object A with the laser light from the light source 6.
  • the imaging optical system 3 condenses the beam expander 7 that expands the beam diameter of the laser light from the light source 6 and the laser light that has passed through the beam expander 7 to form an intermediate image, and its imaging position. Are moved in a direction along the optical axis S, and a collimating lens 9 that makes the laser light that has passed through the Z scanning portion 8 and formed an intermediate image substantially parallel light.
  • the imaging optical system 3 is formed by a wavefront confusion element (first phase modulation element) 10 disposed at a position where laser light that has been substantially collimated by the collimator lens 9 passes, and a Z scanning unit 8.
  • the laser beam that has passed through the element (second phase modulation element) 14 and the wavefront recovery element 14 is condensed and irradiated onto the observation object A, while the condensing point (final image) of the laser light on the observation object A IF) Smell
  • the generated fluorescence and an objective lens (imaging lens) 15 for condensing are condensed and irradiated onto the observation object A, while the condensing point (final image) of the laser light on the observation object A IF) Smell.
  • the Z scanning unit 8 includes a condensing lens 8a that condenses the laser light whose beam diameter has been expanded by the beam expander 7, and an actuator 8b that moves the condensing lens 8a in a direction along the optical axis S. ing.
  • the condenser lens 8a By moving the condenser lens 8a in the direction along the optical axis S by the actuator 8b, the image forming position can be moved in the direction along the optical axis S.
  • the wavefront confusion element 10 is a lenticular element made of an optically transparent material that can transmit light.
  • the wavefront confusion element 10 imparts phase modulation that changes in a one-dimensional direction perpendicular to the optical axis S to the wavefront of the laser light according to the shape of the surface 16 when the laser light is transmitted.
  • the necessary wavefront disturbance is imparted by transmitting the laser light from the light source 6 once.
  • the relay lens pair 11 condenses the laser light that has become substantially parallel light by the collimating lens 9 by one lens 11a to form an intermediate image II, and then condenses the diffusing laser light again by the other lens 11b. So that it returns to almost parallel light.
  • the two relay lens pairs 11 and 12 are arranged with a space therebetween so as to sandwich the XY scanning unit 13 in the direction along the optical axis S.
  • the galvanometer mirrors 13a and 13b are provided so as to be swingable about an axis perpendicular to the optical axis S and in a twisted relationship with each other. These galvanometer mirrors 13a and 13b are oscillated to change the tilt angle of the laser beam in a two-dimensional direction orthogonal to the optical axis S, and the position of the final image IF by the objective lens 15 intersects the optical axis S. It is possible to scan in a two-dimensional direction.
  • the wavefront recovery element 14 is a lenticular element made of an optically transparent material capable of transmitting light and having a phase distribution characteristic opposite to that of the wavefront confusion element 10.
  • the wavefront recovery element 14 imparts phase modulation that changes only in a one-dimensional direction perpendicular to the optical axis S according to the shape of the surface 17 to the light wavefront when the laser light is transmitted, and is imparted by the wavefront confusion element 10. It is designed to cancel the wave front disturbance.
  • the two galvanometer mirrors 13 a and 13 b are arranged with a gap in the direction along the optical axis S, and their intermediate position 13 c is optically substantially the same as the pupil position POB of the objective lens 15. It arrange
  • the galvanometer mirror 13a on the light source 6 side is disposed at a position optically conjugate with the wavefront confusion element 10 and the wavefront recovery element 14. Thereby, even if the galvano mirror 13a on the light source 6 side is swung and the tilt angle is given to the laser beam, the center ray Ra of the light beam P of the laser beam is not changed as shown in FIG. 14 intersects the optical axis S on the surface 17 of the surface. That is, the laser beam P can pass through the same region without changing the passage position in the wavefront recovery element 14.
  • the galvanometer mirror 13a is arranged such that its swinging direction (the direction of arrow X in FIG. 2) coincides with the direction in which the phase distribution characteristic of the wavefront recovery element 14 changes.
  • the light beam P of the laser beam passes through the same region of the wavefront recovery element 14 regardless of the oscillation of the galvanometer mirror 13a, so that the phase modulation applied to the laser beam changes even if the galvanometer mirror 13a oscillates. You do n’t have to.
  • the galvanometer mirror 13b on the side of the observation object A is disposed at a position optically unconjugated with the wavefront recovery element 14.
  • the center ray Rb of the light beam P of the laser light is recovered as shown in FIG.
  • the surface of the element 14 is separated from the optical axis S.
  • the galvanometer mirror 13b matches the swinging direction (the direction of arrow Y in FIG. 3) with the direction orthogonal to the direction in which the phase distribution characteristic of the wavefront recovery element 14 changes (the direction in which the phase distribution characteristic does not change). Are arranged.
  • the laser beam is caused by the oscillation of the galvanometer mirrors 13a and 13b. 5 moves in the two-dimensional directions of arrows X and Y at the pupil position POB of the objective lens 15 as shown in FIG.
  • the movement range is limited to a minute range that can be passed without being kicked by the opening 18a of the aperture stop 18 disposed at the pupil position POB of the objective lens 15.
  • the detector optical system 4 includes a dichroic mirror 19 that branches the fluorescence condensed by the objective lens 15 from the optical path of the laser light, and two condenser lenses 4a and 4b that collect the fluorescence branched by the dichroic mirror 19. And.
  • the photodetector 5 is, for example, a photomultiplier tube, and detects the intensity of incident fluorescence.
  • the imaging object 3 is irradiated with the laser light emitted from the light source 6.
  • the beam diameter of the laser light is expanded by the beam expander 7 and passed through the Z scanning unit 8, the collimating lens 9, and the wavefront confusion element 10.
  • the laser light is condensed by the condensing lens 8a of the Z scanning unit 8, and the condensing position can be adjusted in the direction along the optical axis S by the operation of the actuator 8b. Further, the laser light is allowed to pass through the wavefront confusion element 10, whereby a spatial disturbance is imparted to the wavefront.
  • the laser light is passed through the two relay lens pairs 11 and 12 and the XY scanning unit 13, whereby the inclination angle of the light beam P is changed while forming the intermediate image II, and passes through the dichroic mirror 19. .
  • the laser light that has passed through the dichroic mirror 19 passes through the wavefront recovery element 14, cancels the spatial disturbance imparted by the wavefront confusion element 10, and is collected by the objective lens 15, and the final image IF is observed. An image is formed on the object A.
  • the focal position of the laser beam which is the position of the final image IF imaged by the imaging optical system 3, is moved in the direction along the optical axis S by moving the condenser lens 8a by the operation of the actuator 8b. .
  • the observation depth of the observation object A can be adjusted.
  • the focus position of the laser beam on the observation object A can be scanned two-dimensionally in a direction perpendicular to the optical axis S by swinging the galvanometer mirrors 13a and 13b.
  • the laser light to which the wavefront confusion element 10 imparts spatial wavefront disturbance is formed on the lenticular element, that is, the cylindrical lens array that forms the wavefront confusion element 10.
  • astigmatism is given after one light beam P is divided into a large number of small light beams.
  • a point image that is originally one is blurred and formed as a collection of a large number of circular images, elliptical images, or linear images arranged in a straight line. Since the laser light passes through the wavefront recovery element 14, the spatial disturbance of the wavefront imparted by the wavefront confusion element 10 is canceled, so that the final image IF formed after the wavefront recovery element 14 is formed. Can obtain a clear image.
  • the intermediate image II is located in the vicinity of an optical element in which scratches, foreign matter, or defects are present on the surface or inside because the intermediate image II is blurred and blurred, the scratches, foreign matter, or defects Or the like overlaps the intermediate image II, and the final image IF formed on the observation object A can be prevented from becoming unclear. As a result, a very small spot can be formed as the final image IF.
  • the light beam P of the laser beam moves in a one-dimensional linear direction, but is in a positional relationship optically conjugate with the galvanometer mirror 13a.
  • the light flux P in the wavefront recovery element 14 passes through the same region in the direction of the arrow X. Therefore, it is not necessary to change the phase modulation applied to the laser beam by the wavefront recovery element 14 regardless of the oscillation of the galvanometer mirror 13a.
  • the galvanometer mirror 13b on the observation object A side is swung, the tilt of the light beam P of the laser beam is changed by the swing of the galvanometer mirror 13b, and the passing position of the light beam P in the wavefront recovery element 14 is changed to an arrow.
  • Move in the Y direction Since the direction of the arrow Y coincides with the direction in which the phase distribution characteristic of the wavefront recovery element 14 does not change, the direction of the arrow Y of the wavefront recovery element 14 is given even if it passes through a different region in the direction of arrow Y of the wavefront recovery element 14 due to the movement of the passage position of the light flux P The phase modulation does not change. Therefore, even if the galvano mirror 13b is swung, it is not necessary to change the phase modulation applied to the laser light by the wavefront recovery element.
  • the wavefront recovery element 14 always maintains a constant phase modulation without being affected by the scanning state of the laser beam. And the spatial disturbance of the wavefront imparted by the wavefront confusion element 10 can be completely cancelled.
  • fluorescence can be generated by increasing the photon density in an extremely small region, and the generated fluorescence is condensed by the objective lens 15, and the dichroic mirror 19. And can be detected by guiding fluorescence to the photodetector 5 by the detector optical system 4.
  • the fluorescence intensity detected by the photodetector 5 corresponds to the scanning position of the three-dimensional laser beam by the position in the directions of arrows X and Y by the galvanometer mirrors 13a and 13b and the position along the optical axis S by the actuator 8b.
  • the fluorescence image of the observation object A is acquired by adding and storing. That is, according to the observation apparatus 1 according to the present embodiment, since fluorescence is generated in an extremely small spot region at each scanning position, there is an advantage that a fluorescence image with high spatial resolution can be acquired.
  • the observation apparatus 1 since the observation apparatus 1 according to the present embodiment does not require a relay lens pair to be disposed between the two galvanometer mirrors 13a and 13b, the number of parts of the apparatus can be reduced. Further, by adopting a configuration in which the galvanometer mirrors 13a and 13b are arranged close to each other without arranging the relay lens pair, the apparatus can be reduced in size.
  • lenticular elements are exemplified as the wavefront confusion element 10 and the wavefront recovery element 14, but instead, elements having a one-dimensional phase distribution characteristic may be employed.
  • elements having a one-dimensional phase distribution characteristic may be employed.
  • a prism array, a diffraction grating, or a cylindrical lens may be employed.
  • the galvanometer mirrors 13a and 13b are exemplified as the first scanner and the second scanner, but another type of scanner may be used instead of one or both of them.
  • a polygon mirror, AOD (acousto-optic element), KTN (potassium tantalate niobate) crystal, or the like may be employed.
  • observation apparatus 1 which concerns on this embodiment illustrated the multiphoton excitation microscope, it may replace with this and may apply to a confocal microscope. According to this, by forming a very small spot on the observation object A as the sharpened final image IF, it is possible to increase the photon density in a very small region and to generate fluorescence, and the confocal pinhole A bright confocal image can be obtained by increasing the fluorescence passing through the lens.
  • the present invention has been described as the observation apparatus 1, but the present invention can also be understood as a final image sharpening method. That is, the final image sharpening method according to an embodiment of the present invention is a general laser scanning multiphoton excitation microscope in which the wavefront confusion element 10 and the wavefront recovery element 14 are removed from the observation apparatus 1 shown in FIG. This is a method for sharpening the final image IF.
  • the wavefront confusion element 10 is disposed at a position optically conjugate with the galvanometer mirror 13a between the galvanometer mirror 13a on the light source 6 side and the light source 6, and the objective lens 15
  • the wavefront recovery element 14 is disposed at a position optically conjugate with the galvano mirror 13a on the rear light source 6 side.
  • the wavefront recovery element 14 is disposed so that the phase distribution characteristic thereof coincides with the scanning direction of the laser light (the direction of the arrow X) by the galvanometer mirror 13a.
  • the wavefront recovery element 14 can cancel the spatial disturbance of the wavefront imparted by the wavefront confusion element 10 regardless of the swing angle of the galvanometer mirrors 13a and 13b. Therefore, it is possible to prevent the intermediate image II from becoming unclear and the foreign object image at the intermediate image II imaging position from overlapping the intermediate image II, and to sharpen the final image IF. That is, the final image IF can be sharpened and an image with high spatial resolution can be obtained by simply adding the wavefront confusion element 10 and the wavefront recovery element 14 to an existing general scanning multiphoton excitation microscope. There is an advantage that can be.
  • the observation device 1 includes an illumination device 2, a detector optical system 4, and a photodetector 5. Further, the distance a from the pupil position POB of the objective lens 15 to the wavefront recovery element 14 satisfies the condition of Expression (1).
  • b b (fTL / fPL) 2 (1)
  • b is the distance from the position 13c substantially conjugate to the pupil position POB of the objective lens 15 located between the two galvanometer mirrors 13a and 13b to the galvanometer mirror 13a on the light source 6 side
  • fPL is the relay lens pair 12.
  • the focal length fTL of the lens 12a on the light source 6 side indicates the focal length of the lens 12b on the observation object A side of the relay lens pair 12.
  • the distance c from the screw rear end of the objective lens 15 to the wavefront recovery element 14 satisfies the condition of Expression (2).
  • c a ⁇ (d + e) (2)
  • d represents the screw protrusion amount of the objective lens
  • e represents the distance from the body surface of the objective lens 15 to the pupil position POB of the objective lens 15.
  • the wavefront recovery element 14 is disposed at a position optically conjugate with the galvano mirror 13 a on the light source 6 side behind the objective lens 15 without contacting the outer frame of the objective lens 15.

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Abstract

　中間像が光学素子に一致する位置で結像されても、中間像に光学素子の傷、異物および欠陥等が重なることを防止して鮮明な最終像を取得することを目的として、本発明の観察装置（１）は、最終像（ＩＦ）と中間像（ＩＩ）とを形成する結像レンズ（１１，１２，１５）と、光の波面に空間的な乱れを付与する第１の位相変調素子（１０）と、光の波面に付与された空間的な乱れを打ち消す第２の位相変調素子（１４）とを備える結像光学系（３）と、物体側に配置される光源（６）と、光軸（Ｓ）方向に間隔をあけて配置された第１および第２のスキャナ（１３ａ，１３ｂ）を備えるＸＹ走査部（１３）と、光を検出する光検出器（５）とを備え、２つの位相変調素子（１０，１４）が光源（６）側に配置された第１のスキャナ（１３ａ）と光学的に共役な位置に配置され照明光の走査方向に変化する一次元的な位相分布特性を有する。

Description

観察装置および最終像の鮮明化方法
　本発明は、観察装置および最終像の鮮明化方法に関するものである。
　中間像位置において光路長を調節することにより、合焦点位置を光軸に沿う方向に移動させる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
特許第４０１１７０４号公報
　特許文献１の方法では、中間像面に平面鏡を配置するので、平面鏡の表面の傷や異物が像に重なってしまうという不都合がある。また、顕微鏡光学系に適用される場合には、拡大光学系であるため、縦倍率は横倍率の２乗に等しく、観察対象物における合焦点位置の光軸に沿う方向への僅かな移動によっても、中間像はその光軸方向に大きく移動する。その結果、移動した中間像がその前後に位置していたレンズに重なると、上記と同様に、レンズの表面の傷や異物あるいはレンズ内の欠陥等が像に重なってしまう。
　本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、中間像が光学素子に一致する位置で結像されても、中間像に光学素子の傷、異物および欠陥等が重なることを防止して鮮明な最終像を取得することができる観察装置および最終像の鮮明化方法を提供する。
　本発明の一態様は、最終像および少なくとも１つの中間像を形成する複数の結像レンズと、該結像レンズにより形成されるいずれかの前記中間像よりも物体側に配置され、前記物体からの光の波面に空間的な乱れを付与する第１の位相変調素子と、該第１の位相変調素子との間に少なくとも１つの中間像を挟む位置に配置され、前記第１の位相変調素子により前記物体からの光の波面に付与された空間的な乱れを打ち消す第２の位相変調素子とを備える結像光学系と、該結像光学系の物体側に配置され、該結像光学系に入射させる照明光を発生する光源と、光軸方向に間隔をあけて配置され、前記光源からの照明光を走査する第１のスキャナおよび第２のスキャナと、前記結像光学系の最終像位置に配置された観察対象物から発せられた光を検出する光検出器とを備え、前記第１の位相変調素子および前記第２の位相変調素子が、前記光源側に配置された前記第１のスキャナと光学的に共役な位置に配置されるとともに、前記第１のスキャナによる照明光の走査方向に一致する方向に変化する一次元的な位相分布特性を有する観察装置である。
　本態様によれば、光源から発せられた照明光が結像レンズの物体側から入射されると、結像レンズによって集光されることにより最終像を結像する。この過程において、中間像の一つよりも物体側に配置された第１の位相変調素子を通過することにより、照明光の波面に空間的な乱れが付与され、結像される中間像はぼやけて不鮮明化する。また、中間像を結像した照明光は第２の位相変調素子を通過することにより、第１の位相変調素子によって付与された波面の空間的な乱れが打ち消される。これにより、第２の位相変調素子以降においてなされる最終像の結像においては、鮮明な像を得ることができる。
　すなわち、中間像をぼやけさせ不鮮明化させることにより、表面や内部に傷、異物あるいは欠陥等が存在する光学素子の近傍に中間像が位置する場合であっても、該傷や異物あるいは欠陥等が中間像に重なって、最終的に最終像の一部として形成されてしまう不都合の発生を防止することができる。
　光源からの照明光は第１のスキャナおよび第２のスキャナによって二次元的に走査されることにより、観察対象物に結像された最終像を二次元的に走査させることができる。この場合において、第１のスキャナを作動させると、照明光の光束は一次元的な直線方向に移動するが、第１のスキャナと第２の位相変調素子とが光学的に共役な位置に配置されているために、第２の位相変調素子を通過する光束の位置は変動しない。
　一方、第１のスキャナに対して光軸方向に間隔をあけた第２のスキャナは、第２の位相変調素子とは光学的に共役な位置関係に配置されないため、第２のスキャナを作動させると、照明光の光束は、第２の位相変調素子の通過位置を変化させるように移動する。第２の位相変調素子の位相分布特性の変化する方向が第１のスキャナによる照明光の走査方向に一致するので、これに直交する方向すなわち第２のスキャナによる照明の走査方向には、位相分布特性が変化しておらず、照明光の光束の通過位置が変化しても照明光に付与される位相の変調は変化しない。
　したがって、本態様によれば、光軸方向に間隔をあけた第１のスキャナおよび第２のスキャナのどちらを作動させても、照明光の走査の状態から影響を受けることなく、第２の位相変調素子による位相変調を変化させずに一定の状態を保つことが可能であり、第１の位相変調素子によって付与された波面の空間的な乱れを完全に打ち消すことができる。
　上記態様においては、前記第１の位相変調素子および前記第２の位相変調素子がレンチキュラー素子であってもよい。
　上記態様においては、前記第１の位相変調素子および前記第２の位相変調素子がプリズムアレイであってもよい。
　上記態様においては、前記第１の位相変調素子および前記第２の位相変調素子が回折格子であってもよい。
　また、上記態様においては、前記第１の位相変調素子および前記第２の位相変調素子がシリンドリカルレンズであってもよい。
　本発明の他の態様は、最終像および少なくとも１つの中間像を形成する複数の結像レンズを備える結像光学系と、該結像光学系の物体側に配置され、該結像光学系に入射させる照明光を発生する光源と、光軸方向に間隔をあけて配置され、前記光源からの照明光を走査する第１のスキャナおよび第２のスキャナと、前記結像光学系の最終像位置に配置された観察対象物から発せられた光を検出する光検出器とを備える観察装置における最終像の鮮明化方法であって、前記結像レンズにより形成されるいずれかの前記中間像よりも物体側の前記第１のスキャナと光学的に共役な位置に、前記光源からの照明光の波面に空間的な乱れを付与する第１の位相変調素子を配置し、該第１の位相変調素子との間に少なくとも１つの中間像を挟んだ前記第１のスキャナと光学的に共役な位置に、前記第１のスキャナによる照明光の走査方向に一致する方向に変化する一次元的な位相分布特性を有し、前記第１の位相変調素子により前記物体からの光の波面に付与された空間的な乱れを打ち消す第２の位相変調素子を配置する最終像の鮮明化方法である。
　本発明によれば、中間像が光学素子に一致する位置で結像されても、中間像に光学素子の傷、異物および欠陥等が重なることを防止して鮮明な最終像を取得することができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る観察装置を示す模式図である。 図１の照明装置を示す平面図である。 図１の照明装置を示す側面図である。 図１の波面回復素子におけるスキャン動作による光束の通過位置を示す横断面図である。 図１の対物レンズの瞳位置におけるスキャン動作による光束の通過位置を示す横断面図である。 本発明の一実施例に係る照明装置の一部を示す拡大模式図である。
　本発明の一実施形態に係る観察装置１および最終像の鮮明化方法について、図面を参照して以下に説明する。
　本実施形態に係る観察装置１は、例えば、多光子励起顕微鏡である。
　観察装置１は、図１に示されるように、観察対象物Ａに極短パルスレーザ光（以下、単にレーザ光（照明光）という。）を照射する照明装置２と、該照明装置２によるレーザ光の照射により観察対象物Ａにおいて発生する蛍光を光検出器５に導く検出器光学系４と、該検出器光学系４により導かれた蛍光を検出する光検出器５とを備えている。
　照明装置２は、レーザ光を発生する光源６と、該光源６からのレーザ光を観察対象物Ａに照射する結像光学系３とを備えている。
　結像光学系３は、光源６からのレーザ光のビーム径を拡大するビームエキスパンダ７と、該ビームエキスパンダ７を通過したレーザ光を集光して中間像を結像しその結像位置を光軸Ｓに沿う方向に移動させるＺ走査部８と、該Ｚ走査部８を通過して中間像を結像したレーザ光を略平行光にするコリメートレンズ９とを備えている。
　また、結像光学系３は、コリメートレンズ９により略平行光となったレーザ光を通過させる位置に配置された波面錯乱素子（第１の位相変調素子）１０と、Ｚ走査部８により形成された中間像をリレーする複数対のリレーレンズ対（結像レンズ）１１，１２と、該リレーレンズ対１１，１２間に配置された光源６側のガルバノミラー（第１のスキャナ）１３ａと観察対象物Ａ側のガルバノミラー（第２のスキャナ）１３ｂとからなるＸＹ走査部１３と、リレーレンズ対１１，１２を通過して略平行光となったレーザ光を通過させる位置に配置された波面回復素子（第２の位相変調素子）１４と、該波面回復素子１４を通過したレーザ光を集光して観察対象物Ａに照射する一方、観察対象物Ａにおけるレーザ光の集光点（最終像ＩＦ）において発生した蛍光を集光する対物レンズ（結像レンズ）１５とを備えている。
　Ｚ走査部８は、ビームエキスパンダ７によりビーム径を拡大させられたレーザ光を集光する集光レンズ８ａと、該集光レンズ８ａを光軸Ｓに沿う方向に移動させるアクチュエータ８ｂとを備えている。アクチュエータ８ｂにより集光レンズ８ａを光軸Ｓに沿う方向に移動させることで、その結像位置を光軸Ｓに沿う方向に移動させることができるようになっている。
　波面錯乱素子１０は、光を透過可能な光学的に透明な材料により構成されたレンチキュラー素子である。波面錯乱素子１０は、レーザ光が透過する際に、表面１６の形状に従って光軸Ｓに直交する一次元方向に変化する位相変調をレーザ光の波面に付与するようになっている。本実施形態においては、光源６からのレーザ光を１回透過させることにより、必要な波面の乱れを付与するようになっている。
　リレーレンズ対１１は、コリメートレンズ９によって略平行光となったレーザ光を一方のレンズ１１ａによって集光して中間像ＩＩを形成した後に、拡散するレーザ光を他方のレンズ１１ｂによって再度集光して略平行光に戻すようになっている。本実施形態においては、２つのリレーレンズ対１１，１２はＸＹ走査部１３を光軸Ｓに沿う方向に挟むように間隔をあけて配置されている。
　ガルバノミラー１３ａ，１３ｂは、それぞれ光軸Ｓに直交して互いにねじれの位置関係にある軸線回りに揺動可能に設けられている。これらのガルバノミラー１３ａ，１３ｂは、揺動させられることによって、レーザ光の傾き角度を光軸Ｓに直交する二次元方向に変化させ、対物レンズ１５による最終像ＩＦの位置を光軸Ｓに交差する二次元方向に走査させることができるようになっている。
　波面回復素子１４は、光を透過可能な光学的に透明な材料により構成された、波面錯乱素子１０とは逆の位相分布特性を有するレンチキュラー素子である。波面回復素子１４は、レーザ光が透過する際に、表面１７の形状に従って光軸Ｓに直交する一次元方向にのみ変化する位相変調を光の波面に付与し、波面錯乱素子１０により付与された波面の乱れを打ち消すようになっている。
　本実施形態においては、２つのガルバノミラー１３ａ，１３ｂは、光軸Ｓに沿う方向に間隔をあけて配置され、かつ、それらの中間位置１３ｃが、対物レンズ１５の瞳位置ＰＯＢと光学的に略共役な位置となるように配置されている。
　また、光源６側のガルバノミラー１３ａは、波面錯乱素子１０および波面回復素子１４と光学的に共役な位置に配置されている。これにより、光源６側のガルバノミラー１３ａが揺動させられてレーザ光に傾き角度が付与されても、図２に示されるように、該レーザ光の光束Ｐの中心光線Ｒａは、波面回復素子１４の表面１７において、光軸Ｓと交わる。すなわち、レーザ光の光束Ｐは波面回復素子１４における通過位置を変化させることなく、同一領域を通過させられるようになっている。
　そして、このガルバノミラー１３ａは、その揺動方向（図２における矢印Ｘの方向）を、波面回復素子１４の位相分布特性が変化する方向に一致させて配置されている。上述したようにガルバノミラー１３ａの揺動に関わらず、レーザ光の光束Ｐが波面回復素子１４の同一領域を通過するので、ガルバノミラー１３ａが揺動してもレーザ光に付与する位相変調を変化させずに済むようになっている。
　一方、観察対象物Ａ側のガルバノミラー１３ｂは、波面回復素子１４とは光学的に非共役な位置に配置されている。これにより、観察対象物Ａ側のガルバノミラー１３ｂが揺動させられてレーザ光に傾きが付与されると、図３に示されるように、該レーザ光の光束Ｐの中心光線Ｒｂは、波面回復素子１４の表面において光軸Ｓから離れることになる。そしてこのガルバノミラー１３ｂは、その揺動方向（図３における矢印Ｙの方向）を、波面回復素子１４の位相分布特性が変化する方向に直交する方向（位相分布特性が変化しない方向）に一致させて配置されている。これにより、観察対象物Ａ側のガルバノミラー１３ｂが揺動させられてこの揺動に対応する傾きが光源６側のガルバノミラー１３ａからのレーザ光に付与されると、図４に示されるように、レーザ光に付与された傾きによって、波面回復素子１４におけるレーザ光の光束Ｐの通過位置が波面回復素子１４の位相分布特性が変化しない方向に移動するようになっている。
　なお、上述したように、ガルバノミラー１３ａ，１３ｂはいずれもが、対物レンズ１５の瞳位置ＰＯＢに対して非共役な位置に配置されているので、ガルバノミラー１３ａ，１３ｂの揺動によって、レーザ光の光束Ｐは、対物レンズ１５の瞳位置ＰＯＢにおいて、図５に示されるように、矢印Ｘおよび矢印Ｙの二次元方向に移動する。しかしながら、その移動範囲は、対物レンズ１５の瞳位置ＰＯＢに配置されている開口絞り１８の開口部１８ａに蹴られることなく通過可能な微小範囲の移動に留められる。
　検出器光学系４は、対物レンズ１５によって集光された蛍光をレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー１９と、該ダイクロイックミラー１９によって分岐された蛍光を集光する２つの集光レンズ４ａ，４ｂとを備えている。
　光検出器５は、例えば、光電子増倍管であり、入射された蛍光の強度を検出するようになっている。
　このように構成された本実施形態に係る観察装置１の作用について以下に説明する。
　本実施形態に係る観察装置１を用いて観察対象物Ａを観察するには、光源６から発せられたレーザ光を結像光学系３によって観察対象物Ａに照射する。レーザ光は、まず、ビームエキスパンダ７によってビーム径が拡大され、Ｚ走査部８、コリメートレンズ９および波面錯乱素子１０を通過させられる。
　レーザ光は、Ｚ走査部８の集光レンズ８ａによって集光され、アクチュエータ８ｂの作動によって集光位置を光軸Ｓに沿う方向に調節することができる。
　また、レーザ光は、波面錯乱素子１０を通過させられることにより、波面に空間的な乱れが付与される。
　レーザ光はその後、２つのリレーレンズ対１１，１２とＸＹ走査部１３とを通過させられることにより、中間像ＩＩを形成しながら光束Ｐの傾き角度を変化させられて、ダイクロイックミラー１９を通過する。そして、ダイクロイックミラー１９を通過したレーザ光は、波面回復素子１４を通過して波面錯乱素子１０によって付与された空間的な乱れを打ち消されて対物レンズ１５により集光され、最終像ＩＦが観察対象物Ａに結像される。
　結像光学系３によって結像される最終像ＩＦの位置であるレーザ光の合焦点位置は、アクチュエータ８ｂの作動によって集光レンズ８ａを移動させることで、光軸Ｓに沿う方向に移動させられる。これにより、観察対象物Ａの観察深さを調節することができる。また、ガルバノミラー１３ａ，１３ｂの揺動によって、観察対象物Ａにおけるレーザ光の合焦位置を光軸Ｓに直交する方向に二次元的に走査させることができる。
　波面錯乱素子１０によって波面の空間的な乱れが付与されたレーザ光は、リレーレンズ対１１，１２によって複数の中間像ＩＩが形成されても、波面錯乱素子１０をなすレンチキュラー素子すなわちシリンドリカルレンズアレイの作用により、一つの光束Ｐが多数の小光束に分割された上で非点収差が付与される。これにより、本来は一つである点像が、一直線上に並んだ多数の円形像、あるいは楕円形像、あるいは線形像の集まりとして、不鮮明化されて結像される。そして、レーザ光は、波面回復素子１４を通過することにより、波面錯乱素子１０によって付与された波面の空間的な乱れが打ち消されるので、波面回復素子１４以降においてなされる最終像ＩＦの結像においては、鮮明な像を得ることができる。
　すなわち、中間像ＩＩが不鮮明化されてぼやけることにより、表面や内部に傷、異物あるいは欠陥等が存在する光学素子の近傍に中間像ＩＩが位置する場合であっても、該傷や異物あるいは欠陥等が中間像ＩＩに重なって、観察対象物Ａに形成される最終像ＩＦが不鮮明になることを防止することができる。その結果、最終像ＩＦとして極めて小さいスポットを結像させることができる。
　この場合において、光源６側のガルバノミラー１３ａが揺動させられても、レーザ光の光束Ｐは一次元的な直線方向に移動するが、このガルバノミラー１３ａと光学的に共役な位置関係にある波面回復素子１４における光束Ｐは、矢印Ｘの方向において同一領域を通過する。したがって、ガルバノミラー１３ａの揺動に関わらず、波面回復素子１４によってレーザ光に付与される位相変調を変化させずに済む。
　一方、観察対象物Ａ側のガルバノミラー１３ｂが揺動させられると、このガルバノミラー１３ｂの揺動によってレーザ光の光束Ｐの傾きが変動させられて波面回復素子１４における光束Ｐの通過位置が矢印Ｙの方向に移動する。矢印Ｙの方向は波面回復素子１４の位相分布特性が変化しない方向に一致するので、光束Ｐの通過位置の移動によって波面回復素子１４の矢印Ｙの方向において異なる領域を通過しても付与される位相変調は変化しない。したがって、ガルバノミラー１３ｂが揺動しても、波面回復素子１４によってレーザ光に付与される位相変調を変化させずに済む。
　その結果、２つのガルバノミラー１３ａ，１３ｂを揺動させてレーザ光を二次元方向に走査しても、レーザ光の走査の状態から影響を受けることなく、波面回復素子１４によって常に一定の位相変調を付与することができ、波面錯乱素子１０によって付与された波面の空間的な乱れを完全に打ち消すことができる。
　そして、観察対象物Ａに極めて小さいスポットが結像されることにより、極めて小さい領域において光子密度を高めて蛍光を発生させることができ、発生した蛍光を対物レンズ１５によって集光し、ダイクロイックミラー１９によって分岐し、検出器光学系４によって蛍光を光検出器５へ導くことによって検出することができる。
　光検出器５によって検出された蛍光強度が、ガルバノミラー１３ａ，１３ｂによる矢印Ｘ，Ｙの方向の位置およびアクチュエータ８ｂによる光軸Ｓに沿う方向の位置によって三次元的なレーザ光の走査位置と対応付けて記憶されることにより、観察対象物Ａの蛍光画像が取得される。すなわち、本実施形態に係る観察装置１によれば、各走査位置において、極めて小さいスポットの領域において蛍光を発生させるので、空間分解能の高い蛍光画像を取得することができるという利点がある。
　また、本実施形態に係る観察装置１は、２つのガルバノミラー１３ａ，１３ｂ間にリレーレンズ対を配置する必要がないため、装置の部品点数を少なくすることができる。また、リレーレンズ対を配置せずにガルバノミラー１３ａ，１３ｂを近接させて配置する構成を取ることによって、装置の小型化を図ることができる。
　なお、本実施形態においては波面錯乱素子１０および波面回復素子１４として、レンチキュラー素子を例示したが、これに代えて、一次元的な位相分布特性を有するものを採用してもよい。例えば、プリズムアレイ、回折格子、あるいはシリンドリカルレンズ等を採用してもよい。
　また、本実施形態においては、第１のスキャナおよび第２のスキャナとしてガルバノミラー１３ａ，１３ｂを例示したが、これらのうちの片方または両方に別の種類のスキャナを代えて用いても良い。例えば、ポリゴンミラー、ＡＯＤ（音響光学素子）、ＫＴＮ（タンタル酸ニオブ酸カリウム）結晶等を採用しても良い。
　また、本実施形態に係る観察装置１は、多光子励起顕微鏡を例示したが、これに代えて、共焦点顕微鏡に適用してもよい。
　これによれば、鮮明化された最終像ＩＦとして観察対象物Ａに極めて小さいスポットが結像されることにより、極めて小さい領域において光子密度を高めて蛍光を発生させることができ、共焦点ピンホールを通過する蛍光を増加させて明るい共焦点画像を取得することができる。
　さらにまた、共焦点顕微鏡として共焦点ピンホールを通過する蛍光を検出するのに代えて、共焦点ピンホールを通過する、観察対象物Ａにおいて反射または散乱した光を検出することとしても良い。
　また、本実施形態においては、観察装置１として本発明を説明したが、本発明は最終像の鮮明化方法としても捉えることができる。
　すなわち、本発明の一実施形態に係る最終像の鮮明化方法は、図１に示される観察装置１から波面錯乱素子１０および波面回復素子１４を除いた一般的なレーザ走査型多光子励起顕微鏡の最終像ＩＦを鮮明化する方法である。
　本実施形態に係る最終像の鮮明化方法は、光源６側のガルバノミラー１３ａと光源６との間のガルバノミラー１３ａと光学的に共役な位置に波面錯乱素子１０を配置し、対物レンズ１５の後ろ側の光源６側のガルバノミラー１３ａと光学的に共役な位置に、波面回復素子１４を配置するものである。波面回復素子１４は、その位相分布特性が、ガルバノミラー１３ａによるレーザ光の走査方向（矢印Ｘの方向）に一致するように配置する。
　この最終像の鮮明化方法によれば、ガルバノミラー１３ａ，１３ｂの揺動角度に関わらず、波面錯乱素子１０によって付与された波面の空間的な乱れを波面回復素子１４によって打ち消すことができる。したがって、中間像ＩＩが不鮮明化されて中間像ＩＩ結像位置にある異物の像が中間像ＩＩに重なることを防止し、最終像ＩＦを鮮明化することができる。すなわち、既存の一般的な走査型多光子励起顕微鏡に波面錯乱素子１０と波面回復素子１４とをアドオンするだけで、最終像ＩＦを鮮明化することができ、空間分解能の高い画像を取得することができるという利点がある。
　次に、本実施形態に係る観察装置１の実施例について、図６を用いて以下に説明する。
　本実施形態に係る観察装置１は、照明装置２、検出器光学系４、および光検出器５を備えている。
　また、対物レンズ１５の瞳位置ＰＯＢから波面回復素子１４までの距離ａは、式（１）の条件を満足する。
　　ａ＝ｂ（ｆＴＬ／ｆＰＬ）２　　　（１）
　ここで、ｂは２つのガルバノミラー１３ａ，１３ｂに挟まれて位置する対物レンズ１５の瞳位置ＰＯＢに略共役な位置１３ｃから光源６側のガルバノミラー１３ａまでの距離、ｆＰＬはリレーレンズ対１２の光源６側のレンズ１２ａの焦点距離、ｆＴＬはリレーレンズ対１２の観察対象物Ａ側のレンズ１２ｂの焦点距離を示している。
　また、対物レンズ１５のねじ後端から波面回復素子１４までの距離ｃは、式（２）の条件を満足する。
　　ｃ＝ａ－（ｄ＋ｅ）　　　（２）
　ここで、ｄは対物レンズ１５のねじ突出量、ｅは対物レンズ１５の胴付面から対物レンズ１５の瞳位置ＰＯＢまでの距離を示している。
　本実施例における各値は以下の通りである。
　　ｂ＝２．７（ｍｍ）
　　ｆＰＬ＝５２（ｍｍ）
　　ｆＴＬ＝２００（ｍｍ）
　　ｄ＝５（ｍｍ）
　　ｅ＝２８（ｍｍ）
となる。
　したがって、式（１）よりａ＝３９．９（ｍｍ）が算出され、式（２）よりｃ＝６．９（ｍｍ）が算出される。その結果、波面回復素子１４は、対物レンズ１５の外枠に接触することなく、対物レンズ１５の後ろ側の光源６側のガルバノミラー１３ａと光学的に共役な位置に配置される。
　１　観察装置
　３　結像光学系
　５　光検出器
　６　極短パルスレーザ光（光源）
　１０　波面錯乱素子（第１の位相変調素子）
　１１，１２　リレーレンズ対（結像レンズ）
　１３　ＸＶ走査部
　１３ａ　ガルバノミラー（第１のスキャナ）
　１３ｂ　ガルバノミラー（第２のスキャナ）
　１４　波面回復素子（第２の位相変調素子）
　１５　対物レンズ（結像レンズ）
 

Claims (6)

  1. 　最終像および少なくとも１つの中間像を形成する複数の結像レンズと、該結像レンズにより形成されるいずれかの前記中間像よりも物体側に配置され、前記物体からの光の波面に空間的な乱れを付与する第１の位相変調素子と、該第１の位相変調素子との間に少なくとも１つの中間像を挟む位置に配置され、前記第１の位相変調素子により前記物体からの光の波面に付与された空間的な乱れを打ち消す第２の位相変調素子とを備える結像光学系と、
    　該結像光学系の物体側に配置され、該結像光学系に入射させる照明光を発生する光源と、
    　光軸方向に間隔をあけて配置され、前記光源からの照明光を走査する第１のスキャナおよび第２のスキャナと、
    　前記結像光学系の最終像位置に配置された観察対象物から発せられた光を検出する光検出器とを備え、
    　前記第１の位相変調素子および前記第２の位相変調素子が、前記光源側に配置された前記第１のスキャナと光学的に共役な位置に配置されるとともに、前記第１のスキャナによる照明光の走査方向に一致する方向に変化する一次元的な位相分布特性を有する観察装置。
  2. 　前記第１の位相変調素子および前記第２の位相変調素子がレンチキュラー素子である請求項１に記載の観察装置。
  3. 　前記第１の位相変調素子および前記第２の位相変調素子がプリズムアレイである請求項１に記載の観察装置。
  4. 　前記第１の位相変調素子および前記第２の位相変調素子が回折格子である請求項１に記載の観察装置。
  5. 　前記第１の位相変調素子および前記第２の位相変調素子がシリンドリカルレンズである請求項１に記載の観察装置。
  6. 　最終像および少なくとも１つの中間像を形成する複数の結像レンズを備える結像光学系と、該結像光学系の物体側に配置され、該結像光学系に入射させる照明光を発生する光源と、光軸方向に間隔をあけて配置され、前記光源からの照明光を走査する第１のスキャナおよび第２のスキャナと、前記結像光学系の最終像位置に配置された観察対象物から発せられた光を検出する光検出器とを備える観察装置における最終像の鮮明化方法であって、
    　前記結像レンズにより形成されるいずれかの前記中間像よりも物体側の前記第１のスキャナと光学的に共役な位置に、前記光源からの照明光の波面に空間的な乱れを付与する第１の位相変調素子を配置し、該第１の位相変調素子との間に少なくとも１つの中間像を挟んだ前記第１のスキャナと光学的に共役な位置に、前記第１のスキャナによる照明光の走査方向に一致する方向に変化する一次元的な位相分布特性を有し、前記第１の位相変調素子により前記物体からの光の波面に付与された空間的な乱れを打ち消す第２の位相変調素子を配置する最終像の鮮明化方法。
     
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