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WO2016012729A1 - Methode de determination du profil de structure d'un caillot de fibrine refletant sa stabilite, pour predire le risque de saignement, de thrombose ou de re-thrombose - Google Patents

Methode de determination du profil de structure d'un caillot de fibrine refletant sa stabilite, pour predire le risque de saignement, de thrombose ou de re-thrombose Download PDF

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WO2016012729A1
WO2016012729A1 PCT/FR2015/052050 FR2015052050W WO2016012729A1 WO 2016012729 A1 WO2016012729 A1 WO 2016012729A1 FR 2015052050 W FR2015052050 W FR 2015052050W WO 2016012729 A1 WO2016012729 A1 WO 2016012729A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
clot
plasma
biological sample
patient
mixture
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2015/052050
Other languages
English (en)
Inventor
Geneviève Contant
Benoît POLACK
François CATON
Carhel DASSI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble
Diagnostica Stago SAS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Joseph Fourier Grenoble 1
Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble
Diagnostica Stago SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to EP15754272.1A priority patent/EP3177921A1/fr
Priority to US15/326,120 priority patent/US20170234853A1/en
Priority to JP2017503954A priority patent/JP2017523413A/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
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    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease

Definitions

  • the present invention relates to a method for dynamically measuring the structure of a fibrin clot reflecting its stability in a biological sample.
  • Blood coagulation is a complex phenomenon that involves several factors, including:
  • tissue factor which is responsible for the generation of thrombin
  • fibrinogen transformed into fibrin under the activation of thrombin.
  • Fibrin leads, by its accumulation, to the formation of a clot, which stops the haemorrhage.
  • Fibrinolysis plays an important role in clot stability and hemorrhagic or thrombotic risk, if it begins after clot formation. If initiated at the same time, there is competition between thrombin-fibrin binding and plasmin-fibrin binding, thus between formation and lysis of fibrin, depending on the endogenous fibrinolytic capacity of the tissue concerned.
  • activated partial thromboplastin time include the measurement of electromagnetic viscosity, and are not precise to define the clinical severity related to hemorrhagic or thrombotic risk (JJ Van Veen, Br J Haematol 2008, Mr Adams, Semin Thromb Hemost 2009, Mr Smid, J Thromb Haemost 2011, E. Castoldi, Thromb Res 2011, OR Zekavat, Clin and Applied Thromb Haemost 2013).
  • TGT Thrombin Generation Test
  • the evaluation of the thrombin potential by optical method requires the removal of fibrinogen and platelets from the sample.
  • the measurement of GT by chromogenic or fluorescence method requires the use of a dedicated instrument because of the long measurement time (90 min), and a specific software for analyzing the signal and its interpretation; therefore it is used in research.
  • GT stops thrombin, it does not reflect the stability of the fibrin clot or its resistance to lysis.
  • Measurement of fibrin clot quality coupled with GT provides additional information to evaluate the efficacy of a treatment (Y Dargaud, Haemophilia 2011).
  • clot structure is an important determinant of hemorrhagic and thrombotic risk (Wolberg, Blood Reviews 2007, Wolberg et al, Transfus Apher Sci 2008).
  • the determination of the viscoelastic properties of the clot during coagulation by thromboelastography by electronic (TEG) or optical (ROTEM) measurement is used in real time for intraoperative clinical or transfusion decisions. This method, however, suffers from its lack of well-known reproducibility and is not adapted to the management of several samples in routine.
  • Structural methods available can be used to monitor the effect of fibrin clot structure on susceptibility to fibrinolysis, but these methods are non-automatable, time-consuming and complex to implement.
  • the available turbidimetric and light scattering methods are limited to the purified fibrinogen and thrombin system.
  • Such a method must also make it possible to quantitatively measure the fibrinolysis in the sample, and must be reliable, automated, reproducible, simple and quick to implement.
  • the inventors have developed a method capable of predicting haemostatic risk and quantitatively measuring fibrinolysis in an unpurified sample. This method further allows the automated determination of the structure of the fibrin clot. It is reliable, simple and quick to implement, and reproducible. Finally, it complements the information given by thrombin generation with stability of the fibrin clot.
  • the present invention therefore relates to a method for determining the structural profile of a fibrin clot reflecting its stability in a patient biological sample, said method comprising the following steps:
  • tissue factor and phospholipids may optionally be in admixture with a plasminogen activator, preferably the tissue plasminogen activator (t-PA);
  • step b) incubation, in particular at 37 ° C, of the mixture obtained in step a), and then addition of calcium ions in the mixture obtained, to initiate the formation of a clot;
  • ⁇ is the turbidity of the clot or the expression of the optical density in turbidity, at a given wavelength ⁇
  • [Fg] is the initial mass concentration of fibrinogen
  • a and B are proportional coefficients, respectively, at the density and the radius of the fibers constituting the clot.
  • Such a method makes it possible to predict the risk of bleeding, thrombosis or rethrombosis, for the patient concerned, and this, in a very short time (ie less than one hour) as described in particular in example 6.
  • a very short time ie less than one hour
  • the number of protofibrils of the different normal, hypo- and hyper-coagulant, hypo- and hyper-fibrinolytic plasmas makes it possible to discriminate these plasmas in 30 minutes on their structural profile during thrombin generation, fibrin formation and lysis.
  • Discrimination of the hypercoagulant, normal and hypocoagulant profiles is based on the number of protofibrils, the time to reach the plateau and the speed of plateau attainment.
  • the plateau of protofibrils reflecting the stability of the clot, lasts more than 20 minutes, 10 to 20 minutes and less than 10 minutes respectively for a hypercoagulant profile, normal and hypocoagulant, in the presence of tissue factor and t-PA.
  • the protofibril plateau is shortened in proportion to the concentration of anti-FXa anticoagulant (rivaroxaban) in the hypocoagulant plasma, and is prolonged in proportion to the concentration of the plasminogen activator inhibitor (PAI-1) of the hypofibrinolytic plasma.
  • the downward slope of the plate of protofibrils is all the more important that lysis is rapid; this is the case of hyperfibrinolytic plasmas (deficient in PAI-1 or containing rivaroxaban). On the other hand, it is zero when the clot is resistant to lysis; this is the case of hypercoagulant plasmas (defective protein S or tissue factor inhibitor TFPI).
  • the disappearance of the protofibrils is reached in 33 minutes for all the samples, except one of the hypercoagulant plasmas, deficient in protein S.
  • “fibrin clot profile” is meant the structure of said clot reflecting its stability. The method according to the invention makes it possible to determine the structure of the clot formed, and in particular the number of protofibrils constituting the clot, their density and their radius.
  • the method according to the invention uses a simple biological sample of the patient.
  • This biological sample is used undiluted in the method.
  • the biological sample is a sample of blood, plasma, platelet-rich plasma or platelet-poor plasma or plasma containing platelet, erythrocyte microparticles or any other cell.
  • the biological sample is a platelet poor plasma (PPP) sample.
  • PPP platelet poor plasma
  • the undiluted biological sample is used in the present invention in low volume.
  • the biological sample has a volume between 5 ⁇ and 500 ⁇ , preferably between 50 ⁇ ⁇ and 400 ⁇ , preferably between 50 ⁇ ⁇ and 300 ⁇ , preferably between 100 ⁇ ⁇ and 300 ⁇ , preferably about 200 ⁇ L ⁇
  • a volume is sufficient for routine instrument analysis, but can be reduced if the sample volume ratio on the final volume is respected (ie ratio of approximately 2: 3). It can be further reduced in the case of a microsystem for use in the patient's bed, provided that this volume ratio constraint is respected.
  • Step a) comprises mixing the undiluted biological sample with tissue factor and phospholipids.
  • the undiluted biological sample is preferably used as it is in the case of plasma. It is mixed with tissue factor (FT), preferably human, and phospholipids (PL), preferably semi-purified or purified.
  • tissue factor and the PL are preferably premixed with a solution of plasminogen activator particularly affine for fibrin, preferably tissue plasminogen activator (t-PA), then the whole is added to the sample undiluted biological.
  • FT and the phospholipids are first reconstituted in solution by mixing with a solution of t-PA, and then the resulting mixture is added to the undiluted biological sample.
  • the plasminogen activator used is preferably affin for fibrin.
  • the plasminogen activator used is t-PA, in particular alteplase, marketed under the reference Actilyse® by Boehringer Ingelheim.
  • Any affinity activator for fibrin, such as streptokinase derivatives specific for fibrin, can be used.
  • the mixture of step a) may comprise a concentration of phospholipids of 2 to 5 ⁇ in the mixture, preferably a concentration of about 4 ⁇ .
  • the FT is used in an amount such that its final concentration in the mixture with the undiluted biological sample is between 0.01 and 20 ⁇ M.
  • the FT is used in an amount such that its final concentration in the mixture with the undiluted biological sample is between 0.1 and 5 ⁇ M, preferably between 1 and 5 ⁇ M.
  • t-PA When t-PA is present, it is used in an amount such that its final concentration in the mixture with the FT and the undiluted biological sample is between 0.1 and 0.3 ⁇ g / mL, preferably between 0.1 and 0.2 ⁇ g / mL. .
  • the tissue plasminogen activator (t-PA) mixture in the tissue factor (FT) of step a) is produced in a respective mass ratio [t-PA / FT] between 800 and 1700, preferably between 1000 and 1300.
  • the tissue factor and the t-PA were used at the final concentrations of 2 ⁇ M and 150 ng / mL respectively in Example 6, for the discrimination of different samples.
  • t-PA and FT are used in a ratio of 75 to 150 ng / mL of t-PA for 0.1 to 5 ⁇ M of FT, preferably for 1 to 5 ⁇ M of FT.
  • the mixture of step a) may also comprise at least one divalent cation, preferably calcium ions.
  • the calcium ions may be present at a concentration of 15 to 20 mM final, preferably 17 mM final.
  • step a) of the method according to the invention comprises:
  • step a) of the method according to the invention comprises: al) introducing t-PA into an FT solution,
  • a mixture of at least FT with the undiluted biological sample is obtained for the determination of the structure profile during coagulation and a mixture of at least FT and t-PA. with undiluted biological sample is obtained for determination of clot stability profile and structure profile during lysis.
  • step b) of incubating the mixture obtained in step a), then adding at least one divalent cation, preferably calcium ions in the mixture obtained, to initiate the thrombin generation and the formation a clot.
  • step b) initiates the generation of thrombin and the formation of a clot.
  • Step b) thus comprises incubating the mixture obtained in step a).
  • This incubation can typically be carried out for a time of between 60 seconds and 400 seconds, preferably between 200 seconds and 350 seconds, preferably 300 seconds on the instrument, at a temperature of between 30 ° C. and 40 ° C. preferably about 37 ° C.
  • This incubation time can be shortened with a reduction in volumes, especially with the use of a microsystem.
  • divalent cations, preferably calcium ions are added to the incubated mixture. These calcium ions can be added as a CaCl 2 solution at a concentration of about 0.1 M.
  • the structure of the fibrin clot is then followed dynamically, that is to say every 2 seconds or less in step c), by measuring the turbidity at at least two wavelengths between 450 nm and 850 nm, and for a period of between 1 and 35 minutes.
  • the turbidity measurement is at least at the two wavelengths closest to the extreme values, for example 540 nm and 780 nm, or better 540 nm and 760 nm.
  • the turbidity measurement is simultaneously at least two wavelengths most optimal for the measurements made, for example simultaneously at 540 nm and 780 nm, or better simultaneously at 540 nm and 760 nm.
  • the measurement time of step c) is between 1 minute and 35 minutes, preferably between 10 and 35 minutes, for the profile of both coagulation and lysis, preferably it is about 15 minutes for the coagulation profile (FT alone) and about 30 minutes for the lysis profile (FT + t-PA).
  • the structure of the fibrin clot is analyzed, in particular by the formation of protofibrils, of varying radius and density.
  • the structure of the fibrin clot can also be followed dynamically in step c), by measuring the optical density at at least two wavelengths between 450 nm and 850 nm, and for a period of time between 1 and 35 minutes.
  • the measurement of the optical density is at least at the two wavelengths closest to the extreme values, for example 540 nm and 780 nm, or better 540 nm and 760 nm.
  • the optical density measurement is simultaneously at least two wavelengths most optimal for the measurements made, for example simultaneously at 540 nm and 780 nm, or better simultaneously at 540 nm and 760 nm.
  • the measurement time of step c) is between 1 minute and 35 minutes, preferably between 10 and 35 minutes, for the profile of both coagulation and lysis, preferably it is about 15 minutes for the coagulation profile (FT alone) and about 30 minutes for the lysis profile (FT + t-PA).
  • ⁇ is the turbidity of the clot at a given wavelength ⁇
  • [Fg] is the initial mass concentration of fibrinogen
  • a and B are proportional coefficients, respectively, to the density and the radius of the fibers constituting the clot.
  • This measurement of turbidity or optical density can be performed by any existing apparatus, and in particular by a turbidimeter or a spectrophotometer.
  • this measurement is performed kinetically on a diagnostic automaton, preferably a coagulation analyzer. More preferably, this measurement is performed on the STA-R® Evolution Expert Series of the Stago group. It can also be used with an optical microsystem.
  • the profile of the clot studied in step c) is determined by a model linking the clot structure to its optical properties.
  • this model relates the turbidity to the structure by the formula (C. Yeromonahos, Biophysical J 2010):
  • ⁇ is the turbidity of the clot at a given wavelength ⁇
  • [Fg] is the initial mass concentration of fibrinogen, and A and B are proportional coefficients, respectively, to the density and radius of the fibers constituting the clot.
  • step d information is obtained on the structure of the fibrin clot, and therefore on its properties, as a function of time.
  • steps c) and d) of the method according to the invention are carried out on a diagnostic automaton, preferably a coagulation analyzer.
  • the method according to the invention is implemented on such an automaton. More preferably, the method according to the invention is implemented on the STA-R® Evolution Expert Series of the Stago group.
  • Such an automaton makes it possible to simultaneously load the samples, to carry out the mixtures and the incubation, to measure the optical densities at at least two wavelengths and to determine the clot profile obtained from several samples simultaneously. The whole is done in about 15 minutes for coagulation and about 30 minutes for coagulation followed by fibrinolysis. This makes it a fast, reliable, reproducible and predictive method of hemorrhagic or thrombotic risk in a patient.
  • the method is usable on a routine instrument and complements the information given by the thrombin generation with the structure of the fibrin clot, a reflection of its stability whereas this structure is only available by confocal microscopy and is qualitative.
  • the present invention also relates to a method for predicting the risk of bleeding, thrombosis or re-thrombosis from a biological sample of a patient, said method comprising the following steps: a) mixing the undiluted biological sample with tissue factor and phospholipids;
  • step b) incubating the mixture obtained in step a), then adding calcium ions in the mixture obtained, to initiate the formation of a clot;
  • step b) measuring the turbidity or optical density of the clot in formation of step b), at least two wavelengths between 450 nm and 850 nm, and for a period of between 1 and 35 minutes;
  • Step a) comparison of the profile obtained in d) with a control.
  • Steps a) to d) are as described above.
  • step a) may also include the addition of plasminogen activator, preferably tissue plasminogen activator, as described above.
  • step e it corresponds to a comparison between the profile obtained for the biological sample of the patient considered, and a profile obtained for a control.
  • Said check may in particular be:
  • a biological sample of one or more healthy individuals preferably a reference plasma
  • a biological sample of one or more quality controls to mimic patient conditions may be one or more quality controls made from a pool of normal treated or untreated plasmas to make the deficient plasma into a given coagulation factor or fibrinolysis to mimic patient conditions, as in the example 1,
  • such a method comprises a step f), after step e), of choosing the anticoagulant most adapted to the clinical situation of said patient, said clinical situation being chosen from atrial fibrillation or any other cardiac alteration; cancer or any other malignant condition or precancerous condition; and a risk of venous or arterial thrombosis.
  • the clinical situation of said patient is selected from atrial fibrillation; cancer; and a risk of venous or arterial thrombosis.
  • heparin unfractionated heparin or low molecular weight heparin
  • its derivatives such as fondaparinux, idraparinux, enoxaparin, tinzaparin, nadroparin
  • vitamin K antagonists such as coumarin derivatives (such as acenocoumarol, warfarin or fluindione)
  • thrombin inhibitors such as hirudin, bivalirudin, ximelagatran, dabigatran or odiparcil
  • factor Xa inhibitors such as rivaroxaban, otamixaban, apixaban, betixaban or edoxaban.
  • VKA is used for the prevention of stroke and systemic embolism in patients with non-valvular atrial fibrillation.
  • Direct oral anticoagulants inhibitors of thrombin or factor Xa
  • thrombin or factor Xa make it possible to avoid the initial phase of adaptation of AVK whose follow-up is restrictive and at high risk of bleeding. They also make it possible to avoid the prescription of parenteral injections of low molecular weight heparins, making ambulatory management of deep thrombosis and pulmonary embolism easier.
  • They are an alternative to heparin treatment for young subjects, without renal or hepatic insufficiency, for the prevention of venous thromboembolism in orthopedic surgery.
  • the method makes it possible to choose the anticoagulant most adapted to the clinical situation of said patient because the main undesirable effects of the new molecules concern hemorrhagic accidents (especially the digestive sphere and rather in the medical indications) then thromboembolic, rather in the course of the surgery.
  • the treatment of thromboembolic events in cancer patients is based on low molecular weight heparins, administered without oral relay for three to six months; they significantly reduce thromboembolic recurrence by 50%, without increasing hemorrhages.
  • the method makes it possible to choose low molecular weight heparin and the most appropriate dose for said patient because:
  • the low molecular weight heparin dose may be increased by 10% as it may be effective and well tolerated.
  • FIG. 1 measurement of the number of protofibrils as a function of time for a normal plasma, for a hypocoagulant plasma (heparin-controlled plasma 0.2 IU / ml) and for a hypercoagulant plasma (control plasma deficient in protein S).
  • FIG. 2 measurement of the number of protofibrils as a function of time for normal plasmas (CCN control plasma and PN normal pool), hypocoagulant (defective congenital plasma in FVIILC DEF VIII) and hypercoagulant (SPS protein-deficient plasma).
  • FIG. 3 measurement of the number of protofibrils as a function of time for normal plasmas (CCN control plasma and normal PN pool), hypocoagulant (defective congenital plasma in FVIILC DEF VIII) and hypercoagulant (defective plasma S DPS protein).
  • A t-PA at 100 ng / mL
  • B t-PA at 150 ng / mL
  • FIG. 4 measurement of the number of protofibrils as a function of time for 4 normal control plasmas comprising 2.52 g / l, 2.32 g / l, 3.34 g / l and 2.50 g / l respectively of fibrinogen with tPA 150 ng / ml .
  • FIG. 5 measurement of the number of protofibrils as a function of time for 9 control plasmas (plasmas from N-CCN 5587 to N-CCN 5594), a normal control plasma (C-CCN) and a hypercoagulant control plasma (C-DPS) with tPA 150 ng / mL.
  • 9 control plasmas plasmas from N-CCN 5587 to N-CCN 5594
  • C-CCN normal control plasma
  • C-DPS hypercoagulant control plasma
  • 6a measurement of the number of protofibrils for a normal plasma (Normal), a hypocoagulant plasma (controlled plasma heparin 0.2 IU / mL) and a hypercoagulant plasma (plasma deficient in protein S) at 2, 3, 7 or 20 wavelengths as a function of time
  • 6b measuring the number of protofibrils for a normal control plasma as a function of time, at the wavelength of 540 nm, at the two optimal wavelengths of 540 nm and 780 nm and in continuous spectrum.
  • STA COAG CONTROL N normal control plasma
  • NAMAL POOL normal pool
  • STA HEPARIN CONTROL 2 hypocoagulant control plasma
  • STA DEFICIENT PS hypercoagulant control plasma
  • Figure 8 measurement of protofibril density at time of arrest, for a normal control plasma (STA COAG CONTROL N), a normal pool (NORMAL POOL), a hypocoagulant control plasma (STA HEPARIN CONTROL 2) and a hypercoagulant control plasma (STA DEFICIENT PS), according to the variations of the percentage of fibrinogen of the patient on the determination of his profile.
  • STA COAG CONTROL N normal control plasma
  • N normal pool
  • STA HEPARIN CONTROL 2 hypocoagulant control plasma
  • STA DEFICIENT PS hypercoagulant control plasma
  • Figure 9 Measurement of the density of protofibrils at the time of arrest, for a normal control plasma (STA COAG CONTROL N), a normal pool (NORMAL POOL), a hypocoagulant control plasma (STA HEPARIN CONTROL 2) and a hypercoagulant control plasma (STA DEFICIENT PS), according to the variations of the fibrinogen level of the patient on the determination of his profile.
  • STA COAG CONTROL N normal control plasma
  • N normal pool
  • STA HEPARIN CONTROL 2 hypocoagulant control plasma
  • STA DEFICIENT PS hypercoagulant control plasma
  • FIG. 10 measurement of the number of protofibrils at the time of arrest, for a normal control plasma (STA COAG CONTROL N), a normal pool (NORMAL POOL), a hypocoagulant control plasma (STA HEPARIN CONTROL 2) and a hypercoagulant control plasma ( STA DEFICIENT PS), according to the variations of the fibrinogen level of the patient on the determination of his profile.
  • STA COAG CONTROL N normal control plasma
  • N normal pool
  • STA HEPARIN CONTROL 2 hypocoagulant control plasma
  • STA DEFICIENT PS hypercoagulant control plasma
  • FIG. 11 measurement of the number of protofibrils as a function of time for 9 normal plasmas (plasmas from N-CCN 5587 to N-CCN 5594), a normal control plasma (C-CCN) and a hypercoagulant control plasma (C-DPS), without t-PA.
  • FIG. 12 measurement of the number of protofibrils as a function of time for plasmas at 0, 20 and 40 AU / ml of PAI-1 (P-PAI 4A, 4B and 4C respectively), a plasma deficient in PAI-1 (P-PAI-1).
  • DPAI a normal control plasma
  • C-DPS hypercoagulant control plasma
  • FIG. 13 measurement of the number of protofibrils as a function of time for plasmas overloaded with rivaroxaban at 0, 100 and 200 ng / ml (P-R0, P-R100 and P-R200 respectively), a plasma deficient in TFPI (P- DTFPI), a normal control plasma (C-CCN) and a hypercoagulant control plasma (C-DPS), without t-PA.
  • P- DTFPI plasma deficient in TFPI
  • C-CCN normal control plasma
  • C-DPS hypercoagulant control plasma
  • Figure 14 measurement of the number of protofibrils as a function of time for 9 normal plasmas (plasmas from N-CCN 5587 to N-CCN 5594), a normal control plasma (C-CCN) and a hypercoagulant control plasma (C-DPS), with t-PA at 150 ng / mL.
  • FIG. 15 measurement of the number of protofibrils as a function of time for plasmas at 0, 20 and 40 AU / ml of PAI-1 (P-PAI 4A, 4B and 4C respectively), a deficient plasma PAI-1 (P-PAIP), normal control plasma (C-CCN) and hypercoagulant control plasma (C-DPS), with t-PA at 150 ng / mL.
  • P-PAI 4A, 4B and 4C respectively
  • P-PAIP deficient plasma PAI-1
  • C-CCN normal control plasma
  • C-DPS hypercoagulant control plasma
  • FIG. 16 measurement of the number of protofibrils as a function of time for plasmas overloaded with rivaroxaban at 0, 100 and 200 ng / ml (P-R0, P-R100 and P-R200, respectively), a plasma deficient in TFPI (P- DTFPI), normal control plasma (C-CCN) and hypercoagulant control plasma (C-DPS), with t-PA at 150 ng / mL.
  • P- DTFPI plasma deficient in TFPI
  • C-CCN normal control plasma
  • C-DPS hypercoagulant control plasma
  • Protocol A comparative, manual method
  • Protocol B without t-PA, method on STA-R® with tissue factor:
  • the automaton is agitated by the arm, and incubates for 300 seconds at 37 ° C. He then added 50 ⁇ ⁇ of CaC12 16.7 mM final, and agitated by the needle of the triggering reagent. The automaton finally measures the number of protofibrils at 2 wavelengths of 540 nm and 780 nm as a function of time for 15 minutes.
  • Protocol C (with t-PA, method on STA-R® with tissue factor and plasminogen activator):
  • the automaton finally measures the number of protofibrils at 2 wavelengths of 540 nm and 780 nm as a function of time for 30 minutes.
  • the controller 50 After stirring, and incubated for 300 seconds at 37 ° C, the controller 50 adds ⁇ ⁇ of CaC12 16.7 mM final, and stirred by the needle.
  • the automaton finally measures the number of protofibrils at 2 wavelengths of 540 nm and 780 nm as a function of time for 15 minutes.
  • the number of protofibrils of the different normal, hypo- and hyper-coagulant plasmas as a function of time makes it possible to discriminate these plasmas in less than 6 minutes in this example, during thrombin generation and clot formation.
  • Discrimination is based on the number of protofibrils, the time to reach the plateau and the speed of plateau attainment.
  • Protocol C STA-R® method with tissue factor and plasminogen activator FT + t-PA - Influence of t-PA concentration
  • the instrument After stirring and incubation for 300 seconds at 37 ° C, the instrument adds 50 ⁇ ⁇ of CaC12 16.7 mM final, and stirred by the needle.
  • the number of protofibrils of the different normal, hypo- and hyper-coagulating plasmas makes it possible to discriminate these plasmas in a time that depends on the concentration of t-PA contained in the tissue factor.
  • the discrimination is based on the number of protofibrils, the time to reach the plateau and the plateau velocity, and also the duration of the plateau and its slope.
  • the downward slope of the plate of protofibrils is all the more important that lysis is rapid; it is null or weak when the clot is resistant to lysis (deficient in FVIILC factor, and depleted plasma in protein S respectively).
  • Example 2 Structural Profile of Fibrin with Normal Plasmas from Healthy Donors or Patients with a Normal Hemostasis Assessment
  • Protocol A manual method
  • Protocol C STA-R® method with tissue factor and plasminogen activator FT + t-PA
  • the instrument After stirring and incubation for 300 seconds at 37 ° C, the instrument adds 50 ⁇ ⁇ of CaC12 16.7 mM final, and stirred by the needle.
  • the automaton finally measures the number of protofibrils at 2 wavelengths of 540 nm and 780 nm as a function of time for 30 minutes. • Hemostasis assessment of fresh plasma from "normal" patients by routine haemostasis tests
  • the number of protofibrils of the different normal fresh plasmas varies from 70 to 120; the time to reach the plateau, the plateau plateau speed, vary more than for healthy donors, in connection with the hemorrhagic or thrombotic risk associated with their hospitalization.
  • the duration of the plateau and its slope vary less than for healthy donors, in relation to the optimized t-PA concentration in this example.
  • Protocol A was performed as follows: In a 1 mL spectrophotometer tank, manually add:
  • the curves are superimposable for each of the plasmas regardless of the number of wavelengths.
  • the number of minimum 2 wavelengths was therefore selected for the automated method on the routine instrument.
  • Protocol B on STA-R® with FT Tissue Factor was used as follows:
  • hypocoagulant heparinized plasma control 0.2 IU / mL, STA HEP C2
  • hypercoagulating depleted plasma protein S, STA DEF PS
  • the controller 50 After stirring, and incubated for 300 seconds at 37 ° C, the controller 50 adds ⁇ ⁇ of CaC12 16.7 mM final, and stirred by the needle.
  • the automaton finally measures the number of protofibrils at 2 wavelengths of 540 nm and 780 nm as a function of time for 15 minutes.
  • Stopping time time at which the reaction speed corresponds to 1% of the maximum speed
  • the CVs on the temporal parameters (coagulation, freezing and stopping time) are higher, in particular the downtime, but they are not used for determining clot structure, nor for interpretation, unlike turbidimetric methods used to measure fibrin formation or lysis time.
  • Coagulation time extrapolation on the abscissa axis or tangent to the inflection point
  • Stopping time time at which the reaction speed corresponds to 1% of the maximum speed
  • the CVs on temporal parameters (coagulation, freezing and stopping time) are higher, especially the downtime, but they are not used for the determination of the clot structure, nor for the interpretation , unlike the turbidimetric methods used to measure fibrin formation or lysis time.
  • Protocol B on STA-R® with FT Tissue Factor was used as follows:
  • the controller 50 After stirring, and incubated for 300 seconds at 37 ° C, the controller 50 adds ⁇ ⁇ of CaC12 16.7 mM final, and stirred by the needle.
  • the automaton finally measures the number of protofibrils at 2 wavelengths of 540 nm and 780 nm as a function of time for 15 minutes.
  • the calculations are performed for each plasma with variations of the fibrinogen level of plus or minus 20% to study the influence of these variations on the determination of the profile of each plasma.
  • the optical density as well as the structure of the fibrin depend on the intrinsic fibrinogen level of the sample.
  • PAI-1 frozen plasmas 3 controls at 0, 20 and 40 AU / ml PAI-1, Protein-deficient plasma, TFPI-depleted plasma and 3, 100 and 200 ng / mL Rivaroxaban overloaded plasmas,
  • the automaton is agitated by the arm, and incubates for 300 seconds at 37 ° C. He then added 50 ⁇ ⁇ of CaC12 16.7 mM final, and agitated by the needle.
  • the automaton finally measures the number of protofibrils at 2 wavelengths of 540 nm and 780 nm as a function of time for 15 minutes.
  • the number of protofibrils of the different normal, hypo- and hypercoagulants plasmas makes it possible to discriminate these plasmas in 15 minutes, on the other hand it does not make it possible to discriminate the hypo- and hyper-fibrinolytic plasmas of the other plasmas.
  • Discrimination of the hypercoagulant, normal and hypocoagulant profiles is based on the number of protofibrils, the time to reach the plateau and the speed of plateau attainment.
  • PAI-1 S-protein deficient plasma
  • TFPI-depleted plasma 3 over-loaded plasmas at 0, 100 and 200 ng / mL rivaroxaban.
  • the automaton is agitated by the arm, and incubates for 300 seconds at 37 ° C.
  • the automaton finally measures the number of protofibrils at 2 wavelengths 540 nm and
  • the number of protofibrils of the different normal, hypo- and hyper-coagulant, hypo- and hyper-fibrinolytic plasmas makes it possible to discriminate all these plasmas in 30 minutes on their structural profile during thrombin generation, fibrin formation and lysis.
  • the discrimination of all the profiles is obtained on the number of protofibrils, the time to reach the plateau and the speed of reaching the plateau, the duration of the plateau and its slope.
  • the plateau of protofibrils reflecting the stability of the clot, lasts more than 20 min, 10 to 20 min and less than 10 min for a hypercoagulant profile, normal and hypocoagulant, respectively.
  • the protofibril plateau is shortened proportionally to the concentration of anti-FXa anticoagulant (rivaroxaban) of the hypocoagulant plasma, in connection with the hemorrhagic risk due to the anticoagulant.
  • anti-FXa anticoagulant rivaroxaban
  • PAI-1 inhibitor of the plasminogen activator
  • the downward slope of the protofibril plateau is all the more important as the lysis is rapid, in the case of hyperfibrinolytic plasmas (deficient in PAI-1 or containing rivaroxaban); it is nil when the clot is resistant to lysis, in the case of hypercoagulant plasmas (deficient in protein S or tissue factor inhibitor TFPI).
  • hypercoagulant plasmas deficient in protein S or tissue factor inhibitor TFPI.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode de détermination dynamique du profil de structure d'un caillot de fibrine, reflétant sa stabilité dans un échantillon biologique de patient, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) mélange de l'échantillon biologique, non dilué, avec du facteur tissulaire ou un mélange de facteur tissulaire et d'activateur tissulaire du plasminogène; b) incubation du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions calcium dans le mélange obtenu, pour initier la formation d'un caillot de fibrine; c) mesure de la turbidité ou de la densité optique du caillot en formation de l'étape b), à au moins deux longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, et pendant une durée comprise entre 1 et 35 minutes; et d) détermination du profil de structure du caillot analysé, exprimé en nombre de protofibrilles, densité et rayon en c) par la formule t.λ5 = A [Fg].(λ2 - B), où τ est la turbidité du caillot à une longueur d'onde donnée λ, [Fg] est la concentration massique initiale en fibrinogène, et A et B sont des coefficients proportionnels, respectivement, à la densité et au rayon des fibres constituant le caillot. e) comparaison du profil obtenu à un contrôle. De préférence, la méthode comprend une étape f) permettant de prédire le risque de saignement, de thrombose ou de re-thrombose et de choisir l'anticoagulant le plus adapté à la situation clinique d'un patient.

Description

METHODE DE DETERMINATION DU PROFIL DE STRUCTURE D'UN CAILLOT DE FIBRINE REFLETANT SA STABILITE, POUR PREDIRE LE RISQUE DE
SAIGNEMENT, DE THROMBOSE OU DE RE-THROMBOSE
La présente invention concerne un procédé de mesure dynamique de la structure d'un caillot de fibrine reflétant sa stabilité dans un échantillon biologique.
La coagulation sanguine est un phénomène complexe qui fait intervenir plusieurs facteurs, dont notamment :
- le facteur tissulaire, qui est responsable de la génération de thrombine, et
le fibrinogène, transformé en fibrine sous l'activation de la thrombine.
La fibrine conduit, par son accumulation, à la formation d'un caillot, qui arrête l'hémorragie.
La coagulation sanguine est régulée par différents composés, dont le plasminogène, responsable de la génération de plasmine. En effet, le caillot formé par la fibrine est lysé sous l'effet de la plasmine : c'est la fibrinolyse. La fibrinolyse joue un rôle important sur la stabilité du caillot et le risque hémorragique ou thrombotique, si elle commence après la formation du caillot. Si elle est initiée en même temps, il y a compétition entre la liaison thrombine-fibrine et la liaison plasmine-fibrine, donc entre formation et lyse de la fibrine, en fonction de la capacité fibrinolytique endogène au niveau du tissu concerné.
Un très grand nombre de méthodes d'évaluation du risque hémorragique ou thrombotique d'un patient sont décrites depuis longtemps. Ces méthodes sont basées sur la génération de thrombine (GT) et/ou de plasmine (GP), sur la fibrinolyse, sur les propriétés viscoélastiques du caillot (thromboélastographie ou TEG) ou sur ses propriétés optiques (turbidimétrie). Parmi les méthodes disponibles, certaines comme le temps de céphaline activée (TCA, ou PTT ou aPTT en anglais) comprennent la mesure de la viscosité en méthode électro-magnétique, et ne sont pas précises pour définir la gravité clinique liée au risque hémorragique ou thrombotique (JJ. van Veen, Br J Haematol 2008 ; M. Adams, Semin Thromb Hemost 2009 ; M. Smid, J Thromb Haemost 2011 ; E. Castoldi, Thromb Res 2011 ; O.R. Zekavat, Clin and Applied Thromb Haemost 2013). Le Test de Génération de Thrombine (TGT) est reconnu comme un outil diagnostic versatile pour investiguer les patients avec des phénotypes hypo- ou hypercoagulables. Quant à l'évaluation du potentiel thrombinique par méthode optique, elle nécessite d'éliminer le fibrinogène et les plaquettes de l'échantillon. La mesure de GT par méthode chromogénique ou en fluorescence nécessite d'utiliser un instrument dédié en raison de la durée longue de mesure (90 min), et un logiciel spécifique d'analyse du signal et de son interprétation ; par conséquent elle est utilisée en recherche.
La GT s'arrête à la thrombine, elle ne reflète pas la stabilité du caillot de fibrine ni sa résistance à la lyse. La mesure de la qualité du caillot de fibrine couplée à la GT apporte des informations complémentaires pour évaluer l'efficacité d'un traitement (Y Dargaud, Haemophilia 2011). En particulier, la structure du caillot est un déterminant important du risque hémorragique et thrombotique (Wolberg, Blood Reviews 2007 ; Wolberg et al, Transfus Apher Sci 2008). La détermination des propriétés viscoélastiques du caillot pendant la coagulation en thromboélastographie par mesure électronique (TEG) ou optique (ROTEM) est utilisée en temps réel pour des décisions cliniques ou transfusionnelles en peropératoire. Cette méthode souffre cependant de son manque de reproductibilité bien connue et n'est pas adaptée à la gestion de plusieurs échantillons en routine.
Quant aux autres méthodes, elles utilisent un appareillage spécifique et volumineux, et leur mise en œuvre est limitée aux laboratoires de recherche, car les tests ne sont pas automatisables et requièrent un grand volume d'échantillons.
Notamment, un test de mesure simultanée de la génération de thrombine et de plasmine à l'aide de deux substrats fluorescents (Novel Haemostasis Assay NHA) a été décrit, mais n'est réalisable que sur un fluorimètre dédié à la GT (A. van Geffen, Hematology 2011, WO2011/057143). La combinaison des deux tests TGT et TEG modifié par l'ajout de t-PA pour refléter la qualité du caillot de fibrine, apporte des informations complémentaires (Y Dargaud, Haemophilia 2011), mais la mise en œuvre n'est réalisable que sur 2 instruments spécifiques et manque de praticabilité. Les méthodes structurelles disponibles (microscopie électronique, microscopie confocale, diffusion électrophorétique de la lumière, diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS) ou diffusion de neutrons aux petits angles (SANS)) peuvent être utilisées pour suivre l'effet de la structure du caillot de fibrine sur la sensibilité à la fibrinolyse, mais ces méthodes sont non automatisables, longues et complexes à mettre en œuvre.
Les méthodes turbidimétriques et de diffusion de la lumière disponibles sont limitées au système purifié fibrinogène et thrombine.
Récemment une méthode physique de spectrophotométrie multi-longueurs d'onde a été proposée pour déterminer quantitativement la nanostructure du caillot de fibrine (dont le rayon des fibres, le nombre de protofibrilles par fibre, la distance inter-protofibrilles et la densité des fibres) pendant la formation du caillot mais elle est manuelle, requiert un grand volume d'échantillon (600 μί), et ne se prête pas à une automatisation de par la durée de mesure longue (90 min) et le manque de disponibilité de toutes les longueurs d'onde sur l'instrument de routine (C. Yeromonahos, Biophysical J 2010 ; Thèse 12 octobre 2011 et ATVB 2012). Un grand nombre d'études ont montré qu'il existe des différences fondamentales dans la formation du caillot de fibrine entre les tests en système purifié (thrombine + fibrinogène) et les situations où la thrombine est générée in situ, car la présence de cellules et d'autres protéines modifie la GT et la formation de fibrine. Enfin, l'analyse du profil optique de formation de fibrine (ou « waveform analysis ») peut être effectuée, mais elle reste qualitative et laborieuse.
Aucune méthode de l'art antérieur n'est donc capable de mesurer la stabilité du caillot de fibrine, pour prédire le risque de saignement, de thrombose ou de re-thrombose, en pratique courante. L'essentiel de ces méthodes est réservée à un usage de recherche ou au lit du patient car :
elles sont limitées à un échantillon purifié à cause de l'interférence du fibrinogène du plasma, ou à l'étape de formation de fibrine après ajout de thrombine au plasma,
- elles requièrent des équipements spécialisés, une grande quantité de plasma, et une grande expertise, elles manquent de reproductibilité, de praticabilité ou sont trop longues à mettre en œuvre, et/ou
elles ne reflètent pas la stabilité du caillot de fibrine ou sa résistance à la lyse. II existe donc un besoin de disposer d'une méthode de détermination du profil de structure d'un caillot de fibrine reflétant sa stabilité à partir d'un échantillon de patient, ladite méthode étant capable de prédire le risque hémostatique dudit patient, car seule la méthode de recherche par microscopie confocale, considérée comme référence à ce jour, le permet (JP. Collet, Arterioscler Thromb Vase Biol. 2000).
Une telle méthode doit en outre permettre de mesurer quantitativement la fibrinolyse dans l'échantillon, et doit être fiable, automatisée, reproductible, simple et rapide à mettre en œuvre.
Les inventeurs ont mis au point une méthode capable de prédire le risque hémostatique et de mesurer quantitativement la fibrinolyse dans un échantillon non purifié. Cette méthode permet en outre la détermination automatisée de la structure du caillot de fibrine. Elle est fiable, simple et rapide à mettre en œuvre, et reproductible. Enfin, elle complète l'information donnée par la génération de thrombine avec la stabilité du caillot de fibrine.
La présente invention concerne donc une méthode de détermination du profil de structure d'un caillot de fibrine reflétant sa stabilité dans un échantillon biologique de patient, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a) mélange de l'échantillon biologique, non dilué, avec du facteur tissulaire et des phospholipides. Le facteur tissulaire et les phospholipides peuvent éventuellement être en mélange avec un activateur de plasminogène, de préférence l'activateur tissulaire du plasminogène (t-PA) ;
b) incubation, notamment à 37°C, du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions calcium dans le mélange obtenu, pour initier la formation d'un caillot ;
c) mesure de la turbidité ou de la densité optique du caillot en formation de l'étape b), à au moins deux longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, et pendant une durée comprise entre 1 et 35 minutes ; et d) détermination du profil du caillot analysé en c), de préférence exprimé en nombre de protofibrilles, densité et rayon, par la formule τ.λ5 = A [Fg].( 2 - B),
où τ est la turbidité du caillot ou l'expression de la densité optique en turbidité, à une longueur d'onde donnée λ, [Fg] est la concentration massique initiale en fibrinogène, et A et B sont des coefficients proportionnels, respectivement, à la densité et au rayon des fibres constituant le caillot.
Une telle méthode permet de prédire le risque de saignement, de thrombose ou de rethrombose, pour le patient concerné, et ce, en un temps très court (i.e. moins d'une heure) comme décrit notamment dans l'exemple 6. En effet, le nombre de protofibrilles des différents plasmas normaux, hypo- et hyper-coagulant, hypo- et hyper-fibrinolytique permet de discriminer ces plasmas en 30 minutes sur leur profil de structure pendant la génération de thrombine, la formation de fibrine et la lyse.
La discrimination des profils hypercoagulant, normal et hypocoagulant, est basée sur le nombre de protofibrilles, le temps pour atteindre le plateau et la vitesse d'atteinte du plateau.
Le plateau de protofibrilles, reflétant la stabilité du caillot, dure plus de 20 minutes, 10 à 20 minutes et moins de 10 minutes respectivement pour un profil hypercoagulant, normal et hypocoagulant, en présence de facteur tissulaire et t-PA. Le plateau de protofibrilles est raccourci proportionnellement à la concentration d'anticoagulant anti- FXa (rivaroxaban) du plasma hypocoagulant, et est prolongé proportionnellement à la concentration d'inhibiteur de l'activateur du plasminogène (PAI-1) du plasma hypofibrinolytique.
La pente descendante du plateau de protofibrilles est d'autant plus importante que la lyse est rapide ; cela est le cas des plasmas hyperfibrinolytiques (déficient en PAI-1 ou contenant du rivaroxaban). En revanche, elle est nulle quand le caillot est résistant à la lyse ; cela est le cas des plasmas hypercoagulants (déficient en protéine S ou en inhibiteur du facteur tissulaire TFPI).
Comme montré en exemples, la disparition des protofibrilles, correspondant à la lyse totale, est atteinte en 33 minutes pour tous les échantillons, excepté un des plasmas hypercoagulants, déficient en protéine S. Par « profil d'un caillot de fibrine », on entend la structure dudit caillot reflétant sa stabilité. La méthode selon l'invention permet de déterminer la structure du caillot formé, et notamment le nombre de protofibrilles constituant le caillot, leur densité et leur rayon.
La méthode selon l'invention utilise un simple échantillon biologique du patient. Cet échantillon biologique est utilisé non dilué dans la méthode. De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma, de plasma riche en plaquettes ou de plasma pauvre en plaquettes ou de plasma contenant des microparticules plaquettaires, érythrocytaires ou toute autre cellule. De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de plasma pauvre en plaquettes (PPP). Dans ce cas, il est notamment obtenu par centrifugation du tube citraté comprenant l'échantillon de sang de patient pendant 15 minutes, à une vitesse de 2000 à 2500g, dans une centrifugeuse thermostatée à 18-22°C. Si l'échantillon doit être conservé, le protocole suivant peut être utilisé :
- décanter rapidement le plasma, en laissant environ 0.5cm de plasma au-dessus de la couche cellulaire des globules blancs et plaquettes ;
- récupérer le plasma dans un tube à hémolyse ou un tube plastique;
- centrifuger ce tube à nouveau pendant 15 minutes, à une vitesse de 2000 à 2500g, dans une centrifugeuse thermostatée à 18-22°C ;
- aliquoter en fractions de 0,5 à 1 mL sans prendre le fond du tube (débris cellulaires) ; puis
- congeler rapidement à -70°C, mieux à -80°C. L'échantillon biologique non dilué est utilisé dans la présente invention en faible volume. De préférence, l'échantillon biologique a un volume compris entre 5μί et 500 μί, de préférence compris entre 50 μΐ^ et 400 μί, de préférence compris entre 50 μΐ^ et 300 μί, de préférence compris entre 100 μΐ^ et 300 μί, de préférence d'environ 200 μL· Un tel volume suffit en effet pour l'analyse sur instrument de routine, mais peut être réduit à condition de respecter le rapport de volume d'échantillon sur le volume final (i.e. rapport d'environ 2 : 3). Il peut être réduit davantage dans le cas d'un microsystème pour une utilisation au lit du malade, pourvu que cette contrainte de rapport de volume soit respectée.
L'étape a) comprend le mélange de l'échantillon biologique, non dilué, avec du facteur tissulaire et des phospholipides. L'échantillon biologique non dilué est de préférence utilisé tel quel dans le cas de plasma. Il est mélangé à du facteur tissulaire (FT), de préférence humain, et des phospholipides (PL), de préférence semi-purifiés ou purifiés. Ledit facteur tissulaire et les PL sont, de préférence, préalablement mélangés à une solution d' activateur du plasminogène notamment affin pour la fibrine, de préférence d'activateur tissulaire de plasminogène (t-PA), puis le tout est ajouté à l'échantillon biologique non dilué. Dans ce cas, le FT et les phospholipides sont d'abord reconstitués en solution par mélange avec une solution de t-PA, puis le mélange obtenu est ajouté à l'échantillon biologique non dilué.
L'activateur du plasminogène utilisé est de préférence affin pour la fibrine. De préférence, l'activateur du plasminogène utilisé est le t-PA, notamment l'altéplase, commercialisé sous la référence Actilyse® par Boehringer Ingelheim. Tout activateur affin pour la fibrine, comme les dérivés de la streptokinase spécifiques de la fibrine, peuvent être utilisés.
Le mélange de l'étape a) peut comprendre une concentration de phospholipides de 2 à 5 μΜ dans le mélange, de préférence une concentration d'environ 4 μΜ.
De préférence, le FT est utilisé en quantité telle que sa concentration finale dans le mélange avec l'échantillon biologique non dilué soit comprise entre 0.01 et 20 pM. De préférence, le FT est utilisé en quantité telle que sa concentration finale dans le mélange avec l'échantillon biologique non dilué soit comprise entre 0.1 et 5 pM, de préférence entre 1 et 5 pM.
Lorsque du t-PA est présent, il est utilisé en quantité telle que sa concentration finale dans le mélange avec le FT et l'échantillon biologique non dilué soit comprise entre 0.1 et 0.3 μg/mL, de préférence entre 0.1 et 0.2 μg/mL.
De préférence, le mélange de l'activateur tissulaire de plasminogène (t-PA) dans le facteur tissulaire (FT) de l'étape a) est réalisé dans un ratio respectif massique [t-PA / FT] compris entre 800 et 1700, de préférence compris entre 1000 et 1300. Le facteur tissulaire et le t-PA ont été utilisés aux concentrations finales de 2 pM et 150 ng/mL respectivement dans l'exemple 6, pour la discrimination des différents échantillons. De préférence, le t-PA et le FT sont utilisés dans un ratio de 75 à 150 ng/mL de t-PA pour 0.1 à 5 pM de FT, de préférence pour 1 à 5 pM de FT.
Le mélange de l'étape a) peut comprendre également au moins un cation divalent, de préférence des ions calcium. Les ions calcium peuvent être présents à une concentration de 15 à 20 mM final, de préférence à 17 mM final.
De préférence, l'étape a) de la méthode selon l'invention comprend :
al) l'introduction de FT dans une solution de phospholipides et éventuellement de calcium, puis
a2) le mélange de la solution obtenue en al) avec l'échantillon biologique non dilué.
Alternativement, de préférence, l'étape a) de la méthode selon l'invention comprend : al) l'introduction de t-PA dans une solution de FT,
a2) l'ajout de phospholipides et optionnellement l'ajout de calcium à la solution obtenue en al), puis
a3) le mélange de la solution obtenue en al) ou a2) avec l'échantillon biologique non dilué.
A la fin de l'étape a), un mélange d'au moins le FT avec l'échantillon biologique non dilué est obtenu pour la détermination du profil de structure pendant la coagulation et un mélange d'au moins le FT et t-PA avec l'échantillon biologique non dilué est obtenu pour la détermination du profil de stabilité du caillot et du profil de structure pendant la lyse.
S'ensuit une étape b) d'incubation du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'au moins un cation divalent, de préférence d'ions calcium dans le mélange obtenu, pour initier la génération de thrombine et la formation d'un caillot. Préférentiellement, l'étape b) initie la génération de thrombine et la formation d'un caillot. L'étape b) comprend ainsi l'incubation du mélange obtenu à l'étape a). Cette incubation peut typiquement se faire pendant un temps compris entre 60 secondes et 400 secondes, de préférence compris entre 200 secondes et 350 secondes, de préférence de 300 secondes sur l'instrument, à une température comprise entre 30°C et 40°C, de préférence d'environ 37°C. Ce temps d'incubation peut être raccourci avec une réduction des volumes, en particulier avec l'utilisation d'un microsystème. Puis des cations divalents, de préférence des ions calcium, sont ajoutés au mélange incubé. Ces ions calcium peuvent être ajoutés sous forme de solution de CaC12, à une concentration d'environ 0.1 M.
Par l'ajout de cation divalent tel que le calcium, en présence de FT, la génération de thrombine et la formation d'un caillot de fibrine sont initiées.
La structure du caillot de fibrine est ensuite suivie de façon dynamique, c'est-à-dire toutes les 2 secondes ou moins lors de l'étape c), par mesure de la turbidité à au moins deux longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, et pendant une durée comprise entre 1 et 35 minutes. De préférence, la mesure de turbidité se fait au moins aux deux longueurs d'onde les plus proches des valeurs extrêmes, par exemple 540 nm et 780 nm, ou mieux 540 nm et 760 nm. De préférence, la mesure de turbidité se fait simultanément à au moins deux longueurs d'onde les plus optimales pour les mesures effectuées, par exemple simultanément à 540 nm et 780 nm, ou mieux simultanément à 540 nm et 760 nm. De préférence, la durée de mesure de l'étape c) est comprise entre 1 minute et 35 minutes, de préférence comprise entre 10 et 35 minutes, pour le profil à la fois de coagulation et de lyse, de préférence elle est d'environ 15 minutes pour le profil de coagulation (FT seul) et d'environ 30 minutes pour le profil de lyse (FT+t-PA).
Pendant cette durée, la structure du caillot de fibrine est donc analysée, notamment par la formation de protofibrilles, de rayon et de densité variables.
La structure du caillot de fibrine peut également être suivie de façon dynamique lors de l'étape c), par mesure de la densité optique à au moins deux longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, et pendant une durée comprise entre 1 et 35 minutes. De préférence, la mesure de la densité optique se fait au moins aux deux longueurs d'onde les plus proches des valeurs extrêmes, par exemple 540 nm et 780 nm, ou mieux 540 nm et 760 nm. De préférence, la mesure de densité optique se fait simultanément à au moins deux longueurs d'onde les plus optimales pour les mesures effectuées, par exemple simultanément à 540 nm et 780 nm, ou mieux simultanément à 540 nm et 760 nm. De préférence, la durée de mesure de l'étape c) est comprise entre 1 minute et 35 minutes, de préférence comprise entre 10 et 35 minutes, pour le profil à la fois de coagulation et de lyse, de préférence elle est d'environ 15 minutes pour le profil de coagulation (FT seul) et d'environ 30 minutes pour le profil de lyse (FT+t-PA).
L'expression de τ au temps t, à une longueur d'onde donnée λ, applicable avec une mesure de densité optique, est logarithmique selon la formule x(t) = [DO(t) - DO(ini)] ln (10), où DO(t) et DO(ini) sont respectivement la densité optique à l'instant t et la densité optique initiale (à t=0). La détermination du profil du caillot analysé en c) est obtenue à partir d'un modèle reliant la structure du caillot à ses propriétés optiques, de préférence par la formule τ.λ5 = A[Fg].( 2 - B), où τ est la turbidité du caillot à une longueur d'onde donnée λ, [Fg] est la concentration massique initiale en fibrinogène, et A et B sont des coefficients proportionnels, respectivement, à la densité et au rayon des fibres constituant le caillot.
Cette mesure de turbidité ou de densité optique peut être effectuée par tout appareil existant, et notamment par un turbidimètre ou un spectrophotomètre. De préférence, cette mesure est réalisée en cinétique sur un automate de diagnostic, de préférence un analyseur de coagulation. Plus préférentiellement, cette mesure est effectuée sur l'automate STA-R® Evolution Expert Séries du groupe Stago. Elle peut également être utilisée avec un microsystème optique. In fine, le profil du caillot étudié à l'étape c) est déterminé par un modèle reliant la structure du caillot à ses propriétés optiques. De préférence, ce modèle relie la turbidité à la structure par la formule (C. Yeromonahos, Biophysical J 2010) :
τ.λ5 = Α |¾].(λ2 - Β)
où :
τ est la turbidité du caillot à une longueur d'onde donnée λ,
[Fg] est la concentration massique initiale en fibrinogène, et A et B sont des coefficients proportionnels, respectivement, à la densité et au rayon des fibres constituant le caillot.
Ainsi, lors de l'étape d), des informations sont obtenues sur la structure du caillot de fibrine, et donc sur ses propriétés, en fonction du temps.
Avec ces informations, on obtient un suivi de la structure du caillot pendant la coagulation et la fibrinolyse, reflétant sa stabilité. Il est donc possible de prédire le risque de saignement, de thrombose ou de re-thrombose, du patient dont l'échantillon biologique a été analysé, d'autant qu'on tient compte de la concentration de fibrinogène intrinsèque du patient, qui est un facteur de risque hémostatique connu.
On parle de « re-thrombose » dans le cas où le patient a déjà été victime d'une thrombose, et fait l'objet d'un suivi médical particulier pour éviter les récidives.
En particulier, au moins les étapes c) et d) de la méthode selon l'invention sont réalisées sur un automate de diagnostic, de préférence un analyseur de coagulation.
Plus préférentiellement, toutes les étapes de la méthode selon l'invention sont mises en œuvre sur un tel automate. Plus préférentiellement, la méthode selon l'invention est mise en œuvre sur l'automate STA-R® Evolution Expert Séries du groupe Stago. Un tel automate permet de charger simultanément les échantillons, d'effectuer les mélanges et l'incubation, de mesurer les densités optiques à au moins deux longueurs d'onde et de déterminer le profil du caillot obtenu de plusieurs échantillons en simultané. Le tout est réalisé en 15 minutes environ pour la coagulation et 30 minutes environ pour la coagulation suivie de la fibrinolyse. Cela en fait une méthode rapide, fiable, reproductible et prédictive du risque hémorragique ou thrombotique chez un patient. La méthode est utilisable sur instrument de routine et complète l'information donnée par la génération de thrombine avec la structure du caillot de fibrine, reflet de sa stabilité alors que cette structure n'est disponible que par la microscopie confocale et est qualitative.
La présente invention a également pour objet une méthode de prédiction du risque de saignement, de thrombose ou de re-thrombose à partir d'un échantillon biologique d'un patient, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a) mélange de l'échantillon biologique, non dilué, avec du facteur tissulaire et des phospholipides ;
b) incubation du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions calcium dans le mélange obtenu, pour initier la formation d'un caillot ;
c) mesure de la turbidité ou de la densité optique du caillot en formation de l'étape b), à au moins deux longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, et pendant une durée comprise entre 1 et 35 minutes ; et
d) détermination du profil du caillot analysé en c) par la formule τ.λ5 = A [Fg].( 2 - B), où τ est la turbidité du caillot ou la densité optique calculée selon la formule x(t) = [DO(t) - DO(ini)] ln (10) à une longueur d'onde donnée λ, [Fg] est la concentration massique initiale en fibrinogène, et A et B sont des coefficients proportionnels, respectivement, à la densité et au rayon des fibres constituant le caillot, et
e) comparaison du profil obtenu en d) à un contrôle. Les étapes a) à d) sont telles que décrites ci-dessus. Notamment, l'étape a) peut également comprendre l'addition d'activateur de plasminogène, de préférence l'activateur tissulaire de plasminogène, comme cela est décrit ci-avant.
Quant à l'étape e), elle correspond à une comparaison entre le profil obtenu pour l'échantillon biologique du patient considéré, et un profil obtenu pour un contrôle. Ledit contrôle peut notamment être :
- un échantillon biologique d'un ou plusieurs individus sains, de préférence un plasma de référence,
- un échantillon biologique d'un ou plusieurs contrôles de qualité pour mimer les conditions de patients. Cela peut être un ou plusieurs contrôles de qualité fabriqués à partir d'un pool de plasmas normaux traités ou non traités pour rendre le plasma déficient en un facteur de la coagulation donné ou de la fibrinolyse pour mimer les conditions de patients, comme dans l'exemple 1,
- un échantillon biologique d'un patient hémorragique,
- un échantillon biologique d'un patient thrombotique, ou
- un échantillon biologique d'un patient ayant re-thrombosé, notamment comme dans l'exemple 6. Cette simple étape e) permet de déduire directement et rapidement le risque de thrombose ou d'hémorragie du patient considéré, d'autant qu'on tient compte de la concentration de fibrinogène intrinsèque du patient, qui influence la stabilité du caillot, comme montré dans l'exemple 6.
De préférence, une telle méthode comprend une étape f), après l'étape e), de choix de l'anticoagulant le plus adapté à la situation clinique dudit patient, ladite situation clinique étant choisie parmi la fibrillation auriculaire ou toute autre altération cardiaque ; un cancer ou toute autre affection maligne ou état précancéreux ; et un risque de thrombose veineuse ou artérielle. De préférence, la situation clinique dudit patient est choisie parmi la fibrillation auriculaire; un cancer; et un risque de thrombose veineuse ou artérielle.
Parmi les anticoagulants utilisables, on choisit de préférence l'héparine (héparine non fractionnée ou héparine de bas poids moléculaire) et ses dérivés (tels que le fondaparinux, l'idraparinux, l'énoxaparine, la tinzaparine, la nadroparine) ; les antivitamines K (AVK) comme les dérivés de la coumarine (tel que l'acénocoumarol, la warfarine ou la fluindione) ; les inhibiteurs de la thrombine comme l'hirudine, la bivalirudine, le ximélagatran, le dabigatran ou odiparcil ; et les inhibiteurs du facteur Xa comme le rivaroxaban, l'otamixaban, l'apixaban, le bétrixaban ou l'édoxaban.
Les AVK sont utilisés en prévention des accidents vasculaires cérébraux et des embolies systémiques chez les patients atteints de fibrillation atriale non valvulaire. Les anticoagulants oraux directs (inhibiteurs de la thrombine ou du facteur Xa) permettent d'éviter la phase initiale d'adaptation des AVK dont le suivi est contraignant et à haut risque hémorragique. Ils permettent aussi d'éviter la prescription d'injections parentérales d'héparines de bas poids moléculaire, rendant la prise en charge ambulatoire de la thrombose profonde et de l'embolie pulmonaire plus aisée. Ils sont une alternative au traitement héparinique pour des sujets jeunes, sans insuffisance rénale ni hépatique, en prévention de la maladie thromboembolique veineuse en chirurgie orthopédique. La méthode permet de choisir l'anticoagulant le plus adapté à la situation clinique dudit patient car les principaux effets indésirables des nouvelles molécules concernent les accidents hémorragiques (surtout la sphère digestive et plutôt dans les indications médicales) puis thromboemboliques, plutôt au décours de la chirurgie.
Le traitement des événements thromboemboliques chez les patients atteints de cancer repose sur les héparines de bas poids moléculaire, administrées sans relais oral pendant trois à six mois ; elles réduisent notablement les récidives thromboemboliques de 50%, sans augmenter les hémorragies. La méthode permet de choisir l'héparine de bas poids moléculaire et la dose la plus adaptée audit patient car :
i) L'incidence des récidives d'événement thromboembolique sous traitement reste élevée, elle est de l'ordre de 7 % après trois ou six mois de traitement. Elle est plus élevée en présence qu'en l'absence d'un cancer,
ii) En cas de récidive, la dose d'héparine de bas poids moléculaire peut être augmentée de 10%, car elle pourrait être efficace et bien tolérée.
Les exemples suivants sont donnés en vue d'illustrer divers modes de réalisation de l'invention.
Les légendes des figures sont les suivantes :
Figure 1 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour un plasma normal, pour un plasma hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 UI/mL) et pour un plasma hypercoagulant (plasma contrôle déficient en protéine S).
Figure 2 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour des plasmas normaux (plasma contrôle CCN et pool normal PN), hypocoagulant (plasma déficient congénital en FVIILC DEF VIII) et hypercoagulant (plasma déficient en protéine S DPS).
Figure 3 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour des plasmas normaux (plasma contrôle CCN et pool normal PN), hypocoagulant (plasma déficient congénital en FVIILC DEF VIII) et hypercoagulant (plasma déficient en protéine S DPS).
A : t-PA à 100 ng/mL ; B : t-PA à 150 ng/mL ;
C : t-PA à 175 ng/mL.
Figure 4 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour 4 plasmas témoins normaux comprenant 2,52g/L, 2,32g/L, 3,34g/L et 2,50g/L respectivement de fibrinogène avec tPA 150 ng/mL.
Figure 5 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour 9 plasmas témoins (plasmas de N-CCN 5587 à N-CCN 5594), un plasma contrôle normal (C- CCN) et un plasma contrôle hypercoagulant (C-DPS) avec tPA 150 ng/mL.
Figure 6 :
6a) mesure du nombre de protofibrilles pour un plasma normal (Normal), un plasma hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 UI/mL) et un plasma hypercoagulant (plasma déficient en protéine S) à 2, 3, 7 ou 20 longueurs d'onde en fonction du temps, 6b) mesure du nombre de protofibrilles pour un plasma contrôle normal en fonction du temps, à la longueur d'onde de 540 nm, aux deux longueurs d'onde optimales de 540 nm et 780 nm et en spectre continu. Figure 7 : mesure du nombre de protofibrilles au temps d'arrêt, pour un plasma contrôle normal (STA COAG CONTROL N), un pool normal (POOL NORMAL), un plasma contrôle hypocoagulant (STA HEPARIN CONTROL 2) et un plasma contrôle hypercoagulant (STA DEFICIENT PS), en fonction en fonction des variations du pourcentage de fibrinogène du patient sur la détermination de son profil.
Figure 8 : mesure de la densité de protofibrilles au temps d'arrêt, pour un plasma contrôle normal (STA COAG CONTROL N), un pool normal (POOL NORMAL), un plasma contrôle hypocoagulant (STA HEPARIN CONTROL 2) et un plasma contrôle hypercoagulant (STA DEFICIENT PS), en fonction des variations du pourcentage de fibrinogène du patient sur la détermination de son profil. Figure 9 : mesure de la densité de protofibrilles au temps d'arrêt, pour un plasma contrôle normal (STA COAG CONTROL N), un pool normal (POOL NORMAL), un plasma contrôle hypocoagulant (STA HEPARIN CONTROL 2) et un plasma contrôle hypercoagulant (STA DEFICIENT PS), en fonction des variations du taux de fibrinogène du patient sur la détermination de son profil.
Figure 10 : mesure du nombre de protofibrilles au temps d'arrêt, pour un plasma contrôle normal (STA COAG CONTROL N), un pool normal (POOL NORMAL), un plasma contrôle hypocoagulant (STA HEPARIN CONTROL 2) et un plasma contrôle hypercoagulant (STA DEFICIENT PS), en fonction des variations du taux de fibrinogène du patient sur la détermination de son profil.
Figure 11 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour 9 plasmas normaux (plasmas de N-CCN 5587 à N-CCN 5594), un plasma contrôle normal (C- CCN) et un plasma contrôle hypercoagulant (C-DPS), sans t-PA.
Figure 12 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour des plasmas à 0, 20 et 40 UA/mL de PAI-1 (P-PAI 4A, 4B et 4C respectivement), un plasma déficient en PAI-1 (P-DPAI), un plasma contrôle normal (C-CCN) et un plasma contrôle hypercoagulant (C-DPS), sans t-PA.
Figure 13 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour des plasmas surchargés en rivaroxaban à 0, 100 et 200 ng/mL (P-R0, P-R100 et P-R200 respectivement), un plasma déficient en TFPI (P-DTFPI), un plasma contrôle normal (C-CCN) et un plasma contrôle hypercoagulant (C-DPS), sans t-PA.
Figure 14 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour 9 plasmas normaux (plasmas de N-CCN 5587 à N-CCN 5594), un plasma contrôle normal (C- CCN) et un plasma contrôle hypercoagulant (C-DPS), avec t-PA à 150 ng/mL.
Figure 15 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour des plasmas à 0, 20 et 40 UA/mL de PAI-1 (P-PAI 4A, 4B et 4C respectivement), un plasma déficient en PAI-1 (P-DPAI), un plasma contrôle normal (C-CCN) et un plasma contrôle hypercoagulant (C-DPS), avec t-PA à 150 ng/mL.
Figure 16 : mesure du nombre de protofibrilles en fonction du temps pour des plasmas surchargés en rivaroxaban à 0, 100 et 200 ng/mL (P-R0, P-R100 et P-R200 respectivement), un plasma déficient en TFPI (P-DTFPI), un plasma contrôle normal (C-CCN) et un plasma contrôle hypercoagulant (C-DPS), avec t-PA à 150 ng/mL.
Exemples : Mise en œuyre de la méthode selon l'invention
Protocoles expérimentaux
Les protocoles suivant sont utilisés dans les exemples qui suivent :
• Protocole A (comparatif, méthode manuelle) :
Dans une cuve de spectrophotomètre de 1 mL, on ajoute manuellement :
- 667 μL· d'échantillon de plasma pur,
- 167 d'un mélange [FT 1 à 5pM final + PL 4μΜ final].
Puis on agite manuellement.
On incube pendant 600 secondes à 37°C.
On ajoute manuellement 167μί de CaC12 à 16.7 mM final.
On agite manuellement.
Enfin, on mesure le nombre de protofibrilles à 20 longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm en fonction du temps pendant 90 minutes. · Protocole B (sans t-PA, méthode sur STA-R® avec facteur tissulaire) :
Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Séries (Stago), sont ajoutés simultanément par l'instrument :
- 200 μΐ^ d'échantillon de plasma pur,
- 50 μΐ, d'un mélange [FT 2 à 5pM final + PL 4μΜ final].
L'automate agite par le bras, et procède à une incubation pendant 300 secondes à 37°C. Il ajoute ensuite 50 μΐ^ de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille du réactif déclenchant. L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 15 minutes.
• Protocole C (avec t-PA, méthode sur STA-R® avec facteur tissulaire et activateur du plasminogène) :
Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Séries (Stago), sont ajoutés simultanément par l'instrument :
- 200 μΐ^ d'échantillon de plasma pur,
- 50 d'un mélange [FT 2 à 5pM final + PL 4μΜ final+ tPA 0.1 à O^g/rnL final]. L'automate agite par le bras, et procède à une incubation pendant 300 secondes à 37°C.
Il ajoute ensuite 50 μΐ^ de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille du réactif déclenchant.
L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 30 minutes.
Exemple 1 - Profil de structure de la fibrine avec 3 plasmas contrôles normal, hypo- et hypercoagulant : la) Protocole A : méthode manuelle
Dans une cuve de spectrophotomètre de 1 mL, on ajoute manuellement :
- 667 μL· d'échantillon de plasma pur : normal (pool normal congelé), hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 UI/mL) ou hypercoagulant (plasma contrôle dépiété en protéine S),
- 167 μL· d'un mélange [FT 2 pM final + PL 4μΜ final], puis on agite manuellement. On incube pendant 600 secondes à 37°C.
On ajoute manuellement 167μί de CaC12 à 16.7 mM final et on agite manuellement. Enfin, on mesure le nombre de protofibrilles à 20 longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, en fonction du temps pendant 90 minutes.
Les résultats sont en Figure 1. Le nombre de protofibrilles mesuré en fonction du temps pour les différents plasmas normal, hypo- et hyper-coagulant, permet de discriminer ces plasmas pendant la génération de thrombine et la formation du caillot. lb) Protocole B : méthode sur STA-R® avec facteur tissulaire FT
Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Séries (Stago), sont ajoutés simultanément par l'instrument :
- 200 μΐ^ d'échantillon de plasma pur : normaux (plasma contrôle Coag Control N et pool normal congelé), hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 UI/mL) et hypercoagulants (plasma dépiété en protéine S et plasma déficient congénital en FVIILC),
- 50 d'un mélange [FT 2 pM final + PL 4μΜ final].
Après agitation, et incubation pendant 300 secondes à 37°C, l'automate ajoute 50 μΐ^ de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille.
L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 15 minutes.
Les résultats sont en Figure 2.
Le nombre de protofibrilles des différents plasmas normaux, hypo- et hyper-coagulants, en fonction du temps permet de discriminer ces plasmas en moins de 6 minutes dans cet exemple, pendant la génération de thrombine et la formation du caillot.
La discrimination est basée sur le nombre de protofibrilles, le temps pour atteindre le plateau et la vitesse d'atteinte du plateau.
le) Protocole C : méthode sur STA-R® avec facteur tissulaire et activateur du plasminogène FT + t-PA - Influence de la concentration de t-PA
Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Séries (Stago), sont ajoutés simultanément par l'instrument :
- 200 μΐ^ d'échantillon de plasma pur : normaux (plasma contrôle Coag Control N et pool normal congelé), hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 UI/mL) et hypercoagulants (plasma dépiété en protéine S et plasma déficient congénital en FVIILC), - 50 d'un mélange [FT 2 pM final + PL 4μΜ final + tPA 100, 150 ou 175 ng/mL final].
Après agitation et incubation pendant 300 secondes à 37°C, l'instrument ajoute 50 μΐ^ de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille.
L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 30 minutes. a) [t-PA] = 100 ng/mL
Les résultats sont en Figure 3A. b) [t-PA] = 150 ng/mL
Les résultats sont en Figure 3B. c) [t-PA] = 175 ng/mL
Les résultats sont en Figure 3C.
Le nombre de protofibrilles des différents plasmas normaux, hypo- et hyper-coagulants, permet de discriminer ces plasmas en un temps dépendant de la concentration de t-PA contenue dans le facteur tissulaire. La discrimination est basée sur le nombre de protofibrilles, le temps pour atteindre le plateau et la vitesse d'atteinte du plateau, et également la durée du plateau et sa pente.
La durée du plateau de protofibrilles, reflétant la stabilité du caillot, n'est atteinte en 30 minutes pour les différents profils, qu'à partir de la concentration de 175 ng/mL de t-PA dans cet exemple.
La pente descendante du plateau de protofibrilles est d'autant plus importante que la lyse est rapide; elle est nulle ou faible quand le caillot est résistant à la lyse (déficient en facteur FVIILC, et plasma dépiété en protéine S respectivement).
La disparition des protofibrilles, correspondant à la lyse totale, est atteinte à 175 ng/mL de t-PA dans cet exemple. Exemple 2 - Profil de structure de la fibrine avec les plasmas normaux de donneurs sains ou de patients avec un bilan d'hémostase normal
2a) Protocole A : méthode manuelle
Dans une cuve de spectrophotomètre de 1 mL, on ajoute manuellement :
- 667 μL· d'échantillon de plasma pur de 4 plasmas normaux congelés de donneurs sains,
- 161 μΐ, d'un mélange [FT 2 pM final + PL 4μΜ final + t-PA 150 ng/mL], puis on agite manuellement. On incube pendant 600 secondes à 37 °C.
On ajoute manuellement 167μί de CaC12 à 16.7 mM final et on agite manuellement.
Enfin, on mesure le nombre de protofibrilles à 20 longueurs d'onde en fonction du temps pendant 90 minutes.
Les résultats sont en Figure 4. Le nombre de protofibrilles des différents plasmas normaux, le temps pour atteindre le plateau et la vitesse d'atteinte du plateau est très proche. Par contre la durée du plateau et sa pente varient beaucoup d'un plasma à l'autre à la concentration de t-PA de 150 ng/mL. La disparition des protofibrilles n'est pas atteinte en 50 min pour tous les plasmas.
2b) Protocole C : méthode sur STA-R® avec facteur tissulaire et activateur du plasminogène FT + t-PA
Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Séries (Stago), sont ajoutés simultanément par l'instrument :
- 200 μΐ^ d'échantillon de plasma pur frais de patients normaux par les tests d'hémostase de routine (Temps de Quick, temps de céphaline activée, fibrinogène),
- 50 d'un mélange optimisé [FT 2 pM final + PL 4μΜ final + t-PA 150 ng/mL final] .
Après agitation et incubation pendant 300 secondes à 37°C, l'instrument ajoute 50 μΐ^ de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille.
L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 30 minutes. • Bilan d'hémostase des plasmas frais de patients "normaux par les tests d'hémostase de routine"
Figure imgf000024_0001
Les résultats sont également en Figure 5.
• Nombre de protofibrilles
Le nombre de protofibrilles des différents plasmas normaux frais varie de 70 à 120 ; le temps pour atteindre le plateau, la vitesse d'atteinte du plateau, varient plus que pour les donneurs sains, en lien avec le risque hémorragique ou thrombotique lié à leur hospitalisation.
La durée du plateau et sa pente varient moins que pour les donneurs sains, en lien avec la concentration de t-PA optimisée dans cet exemple.
La disparition des protofibrilles est atteinte en 33 min à la concentration de t-PA utilisée pour tous les plasmas. Tous ces plasmas sont discriminés du plasma hypercoagulant dépiété en protéine S sur la base du plateau de protofibrilles.
Exemple 3 - Profil de structure de la fibrine avec 3 plasmas contrôles normal, hypo- et hypercoagulant : Influence de la longueur d'onde
Le protocole A a été réalisé comme suit : Dans une cuve de spectrophotomètre de 1 mL, on ajoute manuellement :
- 667 μL· d'échantillon de plasma pur du plasma normal (pool normal congelé), hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 UI/mL) et hypercoagulants (plasma dépiété en protéine S),
- 167 d'un mélange [FT 2 pM final + PL 4μΜ final], puis on agite manuellement. On incube pendant 600 secondes à 37°C.
On ajoute manuellement 167μί de CaC12 à 16.7 mM final et on agite manuellement. Enfin, on mesure le nombre de protofibrilles à 2, 3, 7 ou 20 longueurs d'onde en fonction du temps pendant 90 minutes.
Puis l'on compare les résultats obtenus à différents nombres de longueurs d'ondes.
Les résultats sont en Figure 6.
Les courbes sont superposables pour chacun des plasmas quelque soit le nombre de longueurs d'onde. Le nombre de 2 longueurs d'onde minimum a donc été sélectionné pour la méthode automatisée sur l'instrument de routine.
Exemple 4 - Profil de structure de la fibrine avec 3 plasmas contrôles normal, hypo- et hypercoagulant : Répétabilité et reproductibilité de la méthode automatisée sur STA-R®
Le protocole B sur STA-R® avec facteur tissulaire FT a été utilisé comme suit :
Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Séries (Stago), sont ajoutés simultanément par l'instrument :
- 200 μΐ^ d'échantillon de plasma pur normal (plasma normal congelé), hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 UI/mL, STA HEP C2) et hypercoagulant (plasma dépiété en protéine S, STA DEF PS),
- 50 μΐ, d'un mélange [FT 2 pM final + PL 4μΜ final] .
Après agitation, et incubation pendant 300 secondes à 37°C, l'automate ajoute 50 μΐ^ de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille. L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 15 minutes.
4a) Répétabilité de la méthode
5 24 tests ont été réalisés dans 3 séries de dosages consécutives : Les résultats sont dans le tableau ci-après.
Figure imgf000026_0001
Np : Nombre de protofibrilles
Temps de gel : point d'inflexion de la courbe
10 Temps de coagulation : extrapolation sur l'axe des abscisses ou tangente au point d'inflexion
Temps d'arrêt : temps auquel la vitesse de réaction correspond à 1% de la vitesse maximale
Les coefficients de variation (CV) obtenus sur les paramètres de structure de la fibrine: nombre de protofibrilles, rayon et pente sont inférieurs à 2.5% pour le plasma normal et 15 inférieurs ou égal à 5% pour les plasmas pathologiques, donc très inférieurs à ceux obtenus par le test de génération de thrombine. Les CV sur les paramètres temporels (temps de coagulation, de gel et d'arrêt) sont plus élevés, en particulier le temps d'arrêt, mais ils ne sont pas utilisés pour la détermination de la structure du caillot, ni pour l'interprétation, à l'inverse des méthodes turbidimétriques utilisées pour mesurer la formation de fibrine ou le temps de lyse.
5 4b) Reproductibilité de la méthode
20 mesures ont été réalisées dans 10 séries de 2 mesures, pendant 5 jours consécutifs.
Figure imgf000027_0001
Np : Nombre de protofibrilles
Temps de gel : point d'inflexion de la courbe
Temps de coagulation : extrapolation sur l'axe des abscisses ou tangente au point d'inflexion Temps d'arrêt : temps auquel la vitesse de réaction correspond à 1 % de la vitesse maximale
Les coefficients de variation (CV) obtenus sur les paramètres de structure de la fibrine : nombre de protofibrilles, rayon et pente sont tous inférieurs à 5% quelque soit le plasma. Les CV sur les paramètres temporels (temps de coagulation, de gel et d'arrêt) sont plus élevés, en particulier le temps d'arrêt, mais ils ne sont pas utilisés pour la détermination de la structure du caillot, ni pour l'interprétation, à l'inverse des méthodes turbidimétriques utilisées pour mesurer la formation de fibrine ou le temps de lyse.
Exemple 5 - Profil de structure de la fibrine avec 4 plasmas normaux, hypo- et hypercoagulants : Influence des variations de fibrinogène du patient sur la détermination de son profil.
Le protocole B sur STA-R® avec facteur tissulaire FT a été utilisé comme suit :
Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Séries (Stago), sont ajoutés simultanément par l'instrument :
- 200 μΐ^ d'échantillon de plasma pur normal (plasma normal congelé et pool normal congelé), hypocoagulant (plasma contrôle hépariné 0.2 UI/mL) et hypercoagulant
(plasma dépiété en protéine S),
- 50 d'un mélange [FT 2 pM final + PL 4μΜ final].
Après agitation, et incubation pendant 300 secondes à 37°C, l'automate ajoute 50 μΐ^ de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille.
L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 15 minutes.
Les calculs sont effectués pour chaque plasma avec des variations du taux de fibrinogène de plus ou moins 20% pour étudier l'influence de ces variations sur la détermination duprofil de chaque plasma.
Les résultats sont présentés Figures 7 à 10.
La densité optique ainsi que la structure de la fibrine dépendent du taux de fibrinogène intrinsèque de l'échantillon. La densité optique ainsi que le nombre de protofibrilles et la densité augmentent d'autant plus que le fibrinogène augmente selon une relation linéaire y=ax-b. Exemple 6 - Profil de structure de la fibrine avec des plasmas normaux, hypo- et hypercoagulants, hypo- et hyper-fibrinolytiques : Discrimination des échantillons normaux des échantillons pathologiques 6a) Protocole B sur STAR® avec facteur tissulaire FT :
Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Séries (Stago), sont ajoutés simultanément par l'instrument :
- 200 μΐ^ d'échantillon de plasma pur de 9 patients avec un bilan d'hémostase normal, d'un plasma déficient en PAI-1 congelé, de 3 plasmas contrôles à 0, 20 et 40 UA/mL de PAI-1, d'un plasma déficient en protéine S, d'un plasma dépiété en TFPI et de 3 plasmas surchargés à 0, 100 et 200 ng/mL de rivaroxaban,
- 50 d'un mélange [FT 2 à 5pM final + PL 4μΜ final].
L'automate agite par le bras, et procède à une incubation pendant 300 secondes à 37°C. Il ajoute ensuite 50 μΐ^ de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille.
L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde de 540 nm et 780 nm en fonction du temps pendant 15 minutes.
Les résultats sont présentés Figures 11 à 13.
Le nombre de protofibrilles des différents plasmas normaux, hypo- et hypercoagulants, permet de discriminer ces plasmas en 15 minutes, par contre il ne permet pas de discriminer les plasmas hypo- et hyper-fibrinolytiques des autres plasmas.
La discrimination des profils hypercoagulant, normal et hypocoagulant, est basée sur le nombre de protofibrilles, le temps pour atteindre le plateau et la vitesse d'atteinte du plateau.
- ces paramètres augmentent parallèlement à la concentration d'anticoagulant, témoignant d'une structure plus lâche du caillot.
- ils sont plus bas pour les plasmas hypercoagulants que pour tous les plasmas normaux, témoignant d'une structure plus compacte du caillot.
- ces paramètres sont compris dans la zone des échantillons normaux pour les plasmas hypofibrinolytiques surchargés en PAI-1. Les informations obtenues pendant la génération de thrombine sont insuffisantes et ne permettent pas de discriminer ce type de plasma. 6b -Protocole C sur STAR® avec facteur tissulaire et activateur du plasminogène FT + t-PA :
Dans 8 cuvettes de l'automate STA-R® Evolution Expert Séries (Stago), sont ajoutés simultanément par l'instrument :
- 200 μΐ^ d'échantillon de plasma pur de 9 patients avec un bilan d'hémostase normal, d'un plasma déficient en PAI-1 congelé, de 3 plasmas contrôles à 0, 20 et 40 UA/mL de
PAI- 1, d'un plasma déficient en protéine S, d'un plasma dépiété en TFPI et de 3 plasmas surchargés à 0, 100 et 200 ng/mL de rivaroxaban.
- 50 μΙ, d'un mélange [FT 2 à 5pM final + PL 4μΜ final + t-PA 150 ng/mL] .
L'automate agite par le bras, et procède à une incubation pendant 300 secondes à 37°C.
Il ajoute ensuite 50 μΐ^ de CaC12 à 16.7 mM final, et agite par l'aiguille.
L'automate mesure enfin le nombre de protofibrilles aux 2 longueurs d'onde 540 nm et
780 nm en fonction du temps pendant 30 minutes.
Les résultats sont présentés Figures 14 à 16.
Le nombre de protofibrilles des différents plasmas normaux, hypo- et hyper-coagulant, hypo- et hyper-fibrinolytique permet de discriminer tous ces plasmas en 30 minutes sur leur profil de structure pendant la génération de thrombine, la formation de fibrine et la lyse.
La discrimination de tous les profils est obtenue sur le nombre de protofibrilles, le temps pour atteindre le plateau et la vitesse d'atteinte du plateau, la durée du plateau et sa pente.
Le plateau de protofibrilles, reflétant la stabilité du caillot, dure plus de 20 min, 10 à 20 min et moins de 10 min pour un profil hypercoagulant, normal et hypocoagulant, respectivement.
- le plateau de protofibrilles est raccourci proportionnellement à la concentration d'anticoagulant anti-FXa (rivaroxaban) du plasma hypocoagulant, en lien avec le risque hémorragique dû à l'anticoagulant.
- il est prolongé proportionnellement à la concentration d'inhibiteur de l'activateur du plasminogène (PAI- 1) du plasma hypofibrinolytique, et avec les déficits en protéine S et TFPI, en lien avec le risque thrombotique lié à ces troubles d'hémostase.
La pente descendante du plateau de protofibrilles est d'autant plus importante que la lyse est rapide, cas des plasmas hyperfibrinolytiques (déficient en PAI-1 ou contenant du rivaroxaban) ; elle est nulle quand le caillot est résistant à la lyse, cas des plasmas hypercoagulants (déficient en protéine S ou en inhibiteur du facteur tissulaire TFPI). La disparition des protofibrilles, correspondant à la lyse totale, est atteinte en 33 min pour tous les échantillons, excepté un des plasmas hypercoagulants, déficient en protéine S.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de détermination du profil de structure d'un caillot de fibrine reflétant sa stabilité dans un échantillon biologique de patient, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a) mélange de l'échantillon biologique, non dilué, avec du facteur tissulaire et des phospholipides ;
b) incubation du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions calcium dans le mélange obtenu, pour initier la formation d'un caillot ;
c) mesure de la turbidité ou de la densité optique du caillot en formation de l'étape b), à au moins deux longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, et pendant une durée comprise entre 1 et 35 minutes ; et
d) détermination du profil de structure du caillot analysé en c), de préférence exprimé en nombre de protofibrilles, densité et rayon, et calculé par la formule τ.λ5 = A [Fg].( 2 - B),
où τ est la turbidité du caillot ou l'expression de la densité optique en turbidité, à une longueur d'onde donnée λ, [Fg] est la concentration massique initiale en fibrinogène, et A et B sont des coefficients proportionnels, respectivement, à la densité et au rayon des fibres constituant le caillot.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'à l'étape a), le facteur tissulaire et les phospholipides sont préalablement mélangés à une solution d'activateur du plasminogène, de préférence d'activateur tissulaire du plasminogène, puis le tout est ajouté à l'échantillon biologique non dilué.
3. Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que le facteur tissulaire du mélange de l'étape a) est présent en quantité telle que sa concentration finale dans le mélange avec l'échantillon biologique non dilué soit comprise entre 0.01 et 20 pM, de préférence entre 0.1 et 5 pM, de préférence entre 1 et 5 pM.
4. Méthode selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce que le mélange du facteur tissulaire avec l'activateur tissulaire de plasminogène est réalisé dans un ratio respectif massique [t-PA / FT] compris entre 800 et 1700, ou dans un ratio de 75-150 ng/mL de t- PA pour 0.1-5 pM de FT, de préférence pour 1-5 pM de FT.
5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le mélange de l'étape a) comprend au moins un cation divalent, de préférence des ions calcium.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de sang, de plasma, de plasma riche en plaquettes ou de plasma pauvre en plaquettes, de plasma contenant des microparticules plaquettaires, érythrocytaires ou toute autre cellule, de préférence de plasma pauvre en plaquettes.
7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'échantillon biologique a un volume compris entre 5μί et 500 μί, de préférence compris entre 50 μL· et 400 μί, de préférence compris entre 50 μΐ^ et 300 μί, de préférence compris entre 100 μΐ^ et 300 μί, de préférence d'environ 200 μL·
8. Méthode selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que l'activateur du plasminogène est affin pour la fibrine.
9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'étape b) comprend l'incubation du mélange obtenu à l'étape a) pendant un temps compris entre 60 secondes et 400 secondes, de préférence compris entre 200 secondes et 350 secondes, à une température comprise entre 30°C et 40°C.
10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que l'étape b) initie la génération de thrombine et la formation d'un caillot.
11. Méthode selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la mesure de la turbidité ou de la densité optique de l'étape c) se fait à au moins deux longueurs d'onde les plus proches des extrêmes, de préférence à 540 nm et 760 nm et de préférence simultanément.
12. Méthode selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que la mesure de la turbidité ou de la densité optique de l'étape c) se fait pendant une durée comprise 1 minute et 35 minutes, de préférence d'environ 15 minutes avec le facteur tissulaire seul, et de préférence d'environ 30 minutes avec un mélange de facteur tissulaire et d'activateur tissulaire du plasminogène.
13. Méthode selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'au moins les étapes c) et d) sont réalisées sur un automate de diagnostic, de préférence un analyseur de coagulation.
14. Méthode de prédiction du risque de saignement, de thrombose ou de re-thrombose à partir d'un échantillon biologique d'un patient, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a) mélange de l'échantillon biologique, non dilué, avec du facteur tissulaire et des phospholipides ;
b) incubation du mélange obtenu à l'étape a), puis ajout d'ions calcium dans le mélange obtenu, pour initier la formation d'un caillot ;
c) mesure de la turbidité ou de la densité optique du caillot en formation de l'étape b), à au moins deux longueurs d'onde comprises entre 450 nm et 850 nm, et pendant une durée comprise entre 1 et 35 minutes ; et
d) détermination du profil du caillot analysé en c) par la formule τ.λ5 = A [Fg].( 2 - B), où τ est la turbidité du caillot à une longueur d'onde donnée λ, [Fg] est la concentration massique initiale en fibrinogène, et A et B sont des coefficients proportionnels, respectivement, à la densité et au rayon des fibres constituant le caillot, et
e) comparaison du profil obtenu en d) à un contrôle.
15. Méthode selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle présente les caractéristiques selon l'une des revendications 2 à 13.
16. Méthode selon l'une des revendications 14 ou 15, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape f), après l'étape e), de choix de l'anticoagulant le plus adapté à la situation clinique dudit patient, ladite situation clinique étant choisie parmi la fibrillation auriculaire ou autre altération cardiaque ; un cancer ou autre affection maligne ou état précancéreux ; et un risque de thrombose veineuse ou artérielle.
17. Méthode selon l'une des revendications 14 à 16 caractérisée en ce que le contrôle de l'étape e) est choisi parmi :
- un échantillon biologique d'un ou plusieurs individus sains, de préférence un plasma de référence,
- un échantillon biologique d'un ou plusieurs contrôles de qualité pour mimer les conditions de patients,
- un échantillon biologique d'un patient hémorragique,
- un échantillon biologique d'un patient thrombotique, et
- un échantillon biologique d'un patient ayant re-thrombosé.
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