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WO2016080097A1 - 簡便で高効率の遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法 - Google Patents

簡便で高効率の遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法 Download PDF

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WO2016080097A1
WO2016080097A1 PCT/JP2015/078259 JP2015078259W WO2016080097A1 WO 2016080097 A1 WO2016080097 A1 WO 2016080097A1 JP 2015078259 W JP2015078259 W JP 2015078259W WO 2016080097 A1 WO2016080097 A1 WO 2016080097A1
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WO
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base sequence
fragment
crrna
target dna
cas9 protein
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PCT/JP2015/078259
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田中　光一
知海 相田
悠作 和田
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Tokyo Medical and Dental University NUC
Fasmac Co Ltd
Original Assignee
Tokyo Medical and Dental University NUC
Fasmac Co Ltd
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    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors

Definitions

  • the present invention relates to a simple and highly efficient method for producing a genetically modified non-human mammal using the CRISPR-Cas9 system, and more particularly to a method for enabling gene knock-in with high efficiency.
  • ES cells embryonic stem cells
  • CRISPR-Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromatic Repeat-associated protein 9
  • the CRISPR-Cas9 system is based on the acquired immune mechanism of bacteria, and is a Cas9 protein that is a double-stranded DNA-cleaving enzyme, RNA (crRNA) having a base sequence complementary to the target DNA region, and partially complementary to crRNA.
  • RNA crRNA
  • a complex composed of RNA having a base sequence specifically recognizes and binds to the target DNA region and cleaves it.
  • RNA and crRNA and tracrRNA or chimeric RNA linking crRNA and tracrRNA are introduced into a fertilized egg, and the genome of the fertilized egg is directly manipulated in vivo ( In vivo genome modification), gene targeting mammals can be produced without going through ES cells (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 2 Non-Patent Documents 2-4
  • knock-in mice with a single base substitution Non-Patent Documents 3, 5, and 6).
  • Non-Patent Document 7 Non-Patent Document 7
  • the present invention is a simple and highly efficient method for producing a genetically modified non-human mammal using the CRISPR-Cas9 system, and particularly enables gene knock-in with high efficiency even when the gene size is relatively large.
  • An object of the present invention is to provide a manufacturing method.
  • the present inventors have introduced Cas9 protein into a fertilized egg together with a fragment of crRNA and a fragment of tracrRNA in the form of protein instead of RNA, thereby modifying the gene of the target DNA.
  • this technique it was found that even a gene of a relatively large size can be knocked in with high efficiency, and a genetically modified non-human mammal can be produced easily and efficiently. It came to complete.
  • the present invention has the following configuration.
  • a method for producing a genetically modified non-human mammal comprising introducing a Cas9 protein, a crRNA fragment containing a base sequence complementary to a target DNA region, and a tracr RNA fragment into an oocyte of a non-human mammal. And the method comprising genetically modifying the target DNA.
  • the method of [1], wherein the non-human mammal is selected from rodents.
  • the method of [1] or [2], wherein the oocyte is a fertilized egg.
  • [7] Genetic modification is insertion of a gene or base sequence into a target DNA region, and a donor DNA containing the gene or base sequence together with a Cas9 protein, a crRNA fragment and a tracr RNA fragment is introduced into an oocyte of a non-human mammal
  • a crRNA fragment comprising a base sequence complementary to the target DNA and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a mutant sequence thereof and comprising a base sequence of 42 bases or less; and / or represented by SEQ ID NO: 4
  • a tracr RNA fragment comprising a base sequence or a mutant sequence thereof and comprising a base sequence of 69 bases or less
  • a kit for genetically modifying a target DNA comprising [10] The kit according to [9], further comprising a Cas9 protein and / or donor DNA containing a gene or base sequence for insertion into a target DNA region.
  • the crRNA fragment is 30 to 42 bases long
  • the tracr RNA fragment is 24 to 69 bases long
  • the Cas9 protein is at a concentration of 30 ng / ⁇ L or more
  • the crRNA fragment and the tracr RNA fragment are each 0
  • the above method which is used at a concentration of 6 pmol / ⁇ L or more.
  • a simple and highly efficient method for producing a genetically modified non-human mammal using the CRISPR-Cas9 system in particular, gene knock-in with high efficiency even if the gene size is relatively large. It is possible to provide a manufacturing method that enables the above.
  • FIG. 1 shows an outline of a method for producing a genetically modified mouse according to the method of the present invention.
  • a targeting vector is used in combination.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of a targeting vector “pActb-TetO-FLEX-EGFP-polyA” and an outline of homologous recombination thereby.
  • FIG. 3-1 is a graph showing the in vitro cleavage efficiency of the target DNA by the combination of the Cas9 protein and each concentration of the crRNA fragment and the tracrRNA fragment.
  • FIG. 3-2 is a graph showing the in vitro cleavage efficiency of target DNA by a combination of crRNA fragments (0 bp (none), 20 bp, 30 bp, 36 bp, 39 bp, or 42 bp) of each base length and Cas9 protein and tracrRNA fragment.
  • FIG. FIG. 4 is a photograph showing the screening results of knock-in mice. It shows that 5 out of 11 offspring (lanes 1, 2, 5, 8, 11) are knock-in mice.
  • FIG. 5 is a photograph showing the expression of EGFP in fibroblasts derived from knock-in mice. Arrowhead: In fibroblasts derived from knock-in mice, the region shown by DsRed and the region shown by EGFP overlap.
  • the Cas9 protein is not particularly limited as long as it can be used in the CRISPR / Cas system, and may be any one that can be activated by binding to the following tracr RNA fragment and crRNA fragment and cleaving the target double-stranded DNA.
  • Such Cas9 protein is publicly known, and those exemplified in WO2014 / 131833 can be used.
  • Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes is used.
  • the amino acid sequence and base sequence of Cas9 protein are registered in a public database, for example, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (for example, accession number: Q99ZW2.1, etc.) These can be used in the present invention.
  • the Cas9 protein may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or consist of the amino acid sequence.
  • the Cas9 protein is represented by SEQ ID NO: 1 as long as it retains the activity of the original protein, that is, the activity of binding to the following tracr RNA fragment and crRNA fragment and cleaving the target double-stranded DNA.
  • the amino acid sequence to be used includes an amino acid sequence in which one to a plurality of amino acids are deleted, substituted, added or inserted, or a polypeptide consisting of the amino acid sequence.
  • the “plurality” means 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10.
  • the crRNA fragment contains a base sequence complementary to the target DNA region and a base sequence capable of interacting with the tracr RNA fragment as a whole, preferably 42 bases or less, 39 bases or less, or 36 bases or less, or 30 bases or more. 36 bases or more, or 39 bases or more, for example, 30 to 42 bases, more specifically 30 bases, 31 bases, 32 bases, 33 bases, 34 bases, 35 bases, 36 bases, 37 bases, 38 bases, 39 bases, It can be 40 bases, 41 bases or 42 bases.
  • the tracr RNA fragment is not particularly limited as long as it can guide the Cas9 protein together with the crRNA fragment, but preferably, a tracr RNA derived from Streptococcus pyogenes is used.
  • the total amount of the tracr RNA fragment is preferably 69 bases or less, 59 bases or less, or 34 bases or less, or 24 bases or more, for example, 24 bases, 24 to 34 bases, 24 to 59 bases, or 24 to 69 bases. be able to.
  • the tracr RNA fragment has a base sequence that binds (hybridizes) under stringent conditions to a base sequence complementary to the above base sequence, and is an oligo that can guide the Cas9 protein together with the crRNA fragment. Nucleotides are also included.
  • Such oligonucleotides include oligonucleotides having a base sequence having addition, substitution, deletion or insertion of several bases in the above base sequence (here, “several bases” are within 3 bases or within 2 bases) 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more when calculated using the above base sequence and BLAST or the like (for example, default or initial setting parameters) Oligonucleotides consisting of base sequences having the same identity can be included. In the present specification, such an oligonucleotide may be referred to as a “mutant sequence” of the above base sequence.
  • the homology arm is not particularly limited as long as it has the same identity as the base sequence in the target DNA region to a degree sufficient for homologous recombination, but BLAST and the like (for example, default or initial setting parameters) ),
  • the identities are 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 99% or more, and further preferably 99.9% or more.
  • the gene or base sequence to be inserted may be endogenous, exogenous, homologous or heterologous to the oocyte used in the method of the present invention.
  • base insertion / deletion occurs frequently at a high frequency at the cleavage site, and the gene in the target DNA region can be destroyed (gene knockout) by frameshift mutation.
  • multiple types of genetic modification can be generated by using a combination of the multiple types of crRNA fragments and multiple types of donor DNA.
  • microinjected oocyte is then transplanted into the uterus of a female non-human mammal in a pseudopregnant state, and then a litter is obtained.
  • Transplantation can be performed in fertilized eggs of 1-cell stage embryo, 2-cell stage embryo, 4-cell stage embryo, 8-cell stage embryo, 16-cell stage embryo, or morula stage embryo.
  • Microinjected oocytes can be cultured under appropriate conditions until transplanted, if necessary.
  • Oocyte transplantation and culture can be performed based on a conventionally known technique (Nagy A et al., Supra).
  • the confirmation of the presence / absence of genetic modification and the determination of the genotype can be performed based on a conventionally known method, and for example, a PCR method, a sequencing method, a Southern blotting method, or the like can be used.
  • the genomic DNA subjected to these analyzes may be extracted from a part of an embryo before transplantation or may be extracted from a litter.
  • a target DNA can be genetically modified with high efficiency by introducing Cas9 protein, crRNA fragment and tracr RNA fragment into oocytes of non-human mammals, particularly in combination with donor DNA.
  • genes of various sizes are highly efficient (for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more) , 45% or more), and genetically modified non-human mammals can be efficiently produced.
  • Kit for genetically modifying target DNA The kit of the present invention comprises a crRNA fragment and / or a tracr RNA fragment, and as described above, for genetic modification of the target DNA and / or non-target DNA that has been genetically modified. It can be used to make human mammals.
  • the kit of the present invention may further contain the Cas9 protein and / or donor DNA.
  • Each element included in the kit may be stored in a separate container, or may be stored in the same container.
  • Each element may be contained in a container for each use amount, or a plurality of doses may be contained in one container (the user can determine the amount necessary for one use). Can be taken out and used).
  • Each element may be housed in the container in a dry form, or may be housed in the container in a form dissolved in a suitable solvent.
  • the targeting vector was prepared from the pAAV-TetO-FLEX-HA-mKate2-TeNT-polyA plasmid (given by Dr. Akihiro Yamanaka, Department of Neurology, Institute of Environmental Medicine, Nagoya University) as follows. First, HA-mKate2-TeNT was removed by digestion with XhoI (NEB) and HindIII (NEB), and the PCR-amplified gene encoding EGFP was replaced / inserted in the reverse direction.
  • AAV2-ITR was removed by digestion with NarI (NEB) and BstEII (NEB), and PCR amplified ⁇ -actin derived from genomic DNA of C57BL / 6J mice (hereinafter referred to as “Actb”).
  • the gene fragment (2.0 kb) was replaced and inserted using the In-Fusion HD Cloning Kit (Takara) as the left homology arm.
  • digested with NotI (NEB) and MluI (NEB) and the PCR amplified Actb gene fragment (2.0 kb) derived from the genomic DNA of C57BL / 6J mice was used as the right homology arm by In-Fusion reaction. Replaced / inserted.
  • the targeting vector thus obtained is hereinafter referred to as “pActb-TetO-FLEX-EGFP-polyA”.
  • a schematic diagram of pActb-TetO-FLEX-EGFP-polyA is shown in FIG. (Cas9 protein)
  • Cas9 protein Recombinant Cas9 protein is available from NEB and PNA Bio. We purchased more.
  • (CrRNA fragment and tracrRNA fragment) The tracrRNA fragment and the crRNA fragment were chemically synthesized having the base sequences shown in Table 1 below, and purified by polyacrylamide gel electrophoresis (Fusmac Co., Ltd.). The crRNA fragment contains the Actb target sequence.
  • the reaction was stopped with 6 ⁇ DNA loading buffer containing 30% glycerol, 1.2% SDS and 250 mM EDTA, and the reaction was electrophoresed on a 2% agarose gel. To the control, no crRNA fragment or tracrRNA fragment was added. 2. Examination of crRNA fragment length In this experiment, the in vitro cleavage assay was performed under the same conditions except that the crRNA fragment was replaced with one having the base sequence shown in Table 2 below and used at 0.61 pmol / ⁇ L, respectively. No crRNA fragment was added to the control.
  • crRNA fragment refers to a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • One-cell embryos were obtained by mating BDF1 mice (Claire Japan, Inc.), and those that were cryopreserved until use were used.
  • the complex was microinjected into the male pronucleus of a thawed embryo, incubated at 37 ° C. for 24 hours, and then transplanted into an ICR female mouse (Clea Japan Co., Ltd.) in which a two-cell stage embryo was pseudopregnant, A litter was obtained. Knock-in mice were screened from the resulting litters. (PCR screening) A part of the tail of a litter was collected and treated with proteinase K, and then genomic DNA was prepared by phenol extraction. Next, PCR was performed using the obtained genomic DNA as a template and ExTaq (Takara) and the three types of primer pairs shown in Table 3 below, and electrophoresis was performed on a 1% agarose gel to screen knock-in mice. The obtained PCR product was further cloned using TOPO TA Cloning Kit (Life Technologies) and sequenced.
  • the Southern probe (0.8 kb) was prepared by PCR amplification from BDF1 genomic DNA, cloning using TOPO TA Cloning Kit, and labeling with 32 P random primer (Perkin Elmer). Genomic DNA obtained from knock-in mice is digested with EcoRI, separated by electrophoresis using 0.8% agarose gel, transferred to a nylon membrane (Amersham), hybridized with a Southern probe, detected, and genotyped. It was confirmed. The position of the probe is shown in FIG.
  • the crRNA fragment has a length of 30 bp, that is, when it includes a base sequence complementary to a target DNA region consisting of 20 bp and a base sequence capable of interacting with a tracr RNA fragment consisting of 10 bp (SEQ ID NO: 9), It was confirmed that the PCR product containing the Actb target sequence can be cleaved with a high efficiency of 95%. As a result, in order to achieve high cleavage efficiency, the crRNA fragment should have a base sequence complementary to a target DNA region consisting of at least 20 bp and a base sequence capable of interacting with a tracr RNA fragment consisting of at least 10 bp. Indicates good.
  • the injection amount of the crRNA fragment and the tracrRNA fragment was increased to “0.61 pmol / ⁇ L”, respectively.
  • I could get pups.
  • the TetO-FLEX-EGFP-polyA cassette was possessed at the Actb locus at a very high rate of 5 (45.5% of offspring) ( FIG. 4 and Table 4 below).
  • the efficiency of knock-in can be significantly increased by increasing the injection amount of the crRNA fragment and the tracrRNA fragment.

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Abstract

　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを利用した簡便で、かつ高効率の遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法、特に、遺伝子サイズに関係なく、高効率にて遺伝子ノックインを可能とする作製方法を提供することを目的とする。　Ｃａｓ９タンパク質、標的ＤＮＡ領域と相補的な塩基配列を含むｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片を非ヒト哺乳動物の卵母細胞に導入し、該標的ＤＮＡを遺伝子改変することを含む、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物の作製方法。

Description

簡便で高効率の遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法
　本発明は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを利用した簡便で、かつ高効率の遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法、特に、高効率にて遺伝子ノックインを可能とする作製方法に関する。
　遺伝子ターゲティング（ノックアウト又はノックイン）哺乳動物は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける遺伝子機能を解析する上で重要なツールとなっているが、その製造は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を利用する複雑かつ手間のかかる工程を要するものとなっている。
　近年、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　Ｓｈｏｒｔ　Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　Ｒｅｐｅａｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　９）システムが開発され、遺伝子改変のための有用なツールとして注目されている。
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは細菌の獲得免疫機構を基盤とし、二本鎖ＤＮＡ切断酵素であるＣａｓ９タンパク質と、標的ＤＮＡ領域と相補的な塩基配列を有するＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、ｃｒＲＮＡと一部相補的な塩基配列を有するＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｇ　ＲＮＡ；ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなる複合体が、標的ＤＮＡ領域を特異的に認識・結合し、切断する。
　このシステムを利用して、Ｃａｓ９タンパク質をコードするＲＮＡ、ならびにｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを連結したキメラＲＮＡを受精卵に導入し、受精卵のゲノムをｉｎ　ｖｉｖｏにて直接的に操作し（ｉｎ　ｖｉｖｏゲノム改変）、ＥＳ細胞を介することなく、遺伝子ターゲティング哺乳動物を製造することができる（特許文献１、非特許文献１）。今日までに、この手法によりノックアウトマウスの製造（特許文献２、非特許文献２－４）や、一塩基置換を伴うノックインマウスの製造（非特許文献３，５，６）が多数行われている。
　一方、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いて比較的大きなサイズの遺伝子を挿入したノックイン哺乳動物の製造についてはほとんど報告がなく、またそのような大きなサイズの遺伝子のノックイン効率は非常に低いこと（例えば、およそ１０％）が知られている（非特許文献７）。すなわち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いて、比較的大きなサイズの遺伝子が挿入されたノックイン哺乳動物を製造することは容易ではない。
ＷＯ２０１４／１３１８３３ ＷＯ２０１３／１８８５２２
Ａｉｄａ，Ｔ．ら、Ｄｅｖ．Ｇｒｏｗｔｈ　Ｄｉｆｆｅｒ．５６，３４－４５，１９４（２０１４）． Ｓｈｅｎ，Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．２３　７２０－３（２０１３）． Ｗａｎｇ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ　１５３，９１０－８（２０１３）． Ｌｉ，Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，６８１－３（２０１３）． Ｌｏｎｇ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　３４５，１１８４－８（２０１４）． Ｗｕ，Ｙ．ら、Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　１３，６５９－６２（２０１３）． Ｙａｎｇ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ　１５４，１３７０－９（２０１３）．
　本発明は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを利用した簡便で、かつ高効率の遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法、特に、遺伝子サイズが比較的大きなものであっても、高効率にて遺伝子ノックインを可能とする作製方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｃａｓ９タンパク質をＲＮＡの形態ではなくタンパク質の形態で、ｃｒＲＮＡの断片及びｔｒａｃｒＲＮＡの断片と共に受精卵に導入することによって、標的ＤＮＡの遺伝子改変が可能であること、特に当該手法によれば比較的大きなサイズの遺伝子であっても高効率にノックインすることができ、簡便、かつ高効率に遺伝子改変非ヒト哺乳動物を作製できること見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［１］　遺伝子改変された非ヒト哺乳動物の作製方法であって、Ｃａｓ９タンパク質、標的ＤＮＡ領域と相補的な塩基配列を含むｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片を非ヒト哺乳動物の卵母細胞に導入し、該標的ＤＮＡを遺伝子改変することを含む、上記方法。
［２］　非ヒト哺乳動物が、げっ歯類より選択される、［１］の方法。
［３］　卵母細胞が受精卵である、［１］又は［２］の方法。
［４］　ｃｒＲＮＡ断片が、標的ＤＮＡと相補的な塩基配列、及び配列番号２で表される塩基配列もしくはその変異配列を含む、［１］～［３］のいずれかの方法。
［５］　ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片が、配列番号４で表される塩基配列もしくはその変異配列を含む、［１］～［４］のいずれかの方法。
［６］　Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片が複合体を形成している、［１］～［５］のいずれかの方法。
［７］　遺伝子改変が標的ＤＮＡ領域への遺伝子又は塩基配列の挿入であり、Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片と共に、該遺伝子又は塩基配列を含むドナーＤＮＡを非ヒト哺乳動物の卵母細胞に導入することを含む、［１］～［６］のいずれかの方法。
［８］　Ｃａｓ９タンパク質１ｎｇ／μＬに対し、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片をそれぞれ０．００２ｐｍｏｌ／μＬを超える濃度で用いる、［１］～［７］のいずれかの方法。
［９］　標的ＤＮＡと相補的な塩基配列、及び配列番号２で表される塩基配列もしくはその変異配列を含み、４２塩基以下の塩基配列からなるｃｒＲＮＡ断片；ならびに／あるいは
　配列番号４で表される塩基配列もしくはその変異配列を含み、６９塩基以下の塩基配列からなるｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片、
を含む標的ＤＮＡを遺伝子改変するためのキット。
［１０］　Ｃａｓ９タンパク質、及び／又は、標的ＤＮＡ領域へ挿入するための遺伝子もしくは塩基配列を含むドナーＤＮＡをさらに含む、［９］のキット。
［１１］　標的ＤＮＡ領域へ遺伝子又は塩基配列が挿入されたマウスの作製方法であって、Ｃａｓ９タンパク質、標的ＤＮＡ領域と相補的な塩基配列を含むｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片、ならびに該遺伝子又は塩基配列を含むドナーＤＮＡをマウスの卵母細胞に導入し、該標的ＤＮＡ領域へ該遺伝子又は塩基配列を挿入することを含み、
ここで、該ｃｒＲＮＡ断片は３０～４２塩基長であり、該ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片は２４～６９塩基長であり、該Ｃａｓ９タンパク質を３０ｎｇ／μＬ以上の濃度で、かつｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片をそれぞれ０．６ｐｍｏｌ／μＬ以上の濃度で用いる、上記方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2014-232963号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを利用した簡便で、かつ高効率の遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法、特に、遺伝子サイズが比較的大きなものであっても、高効率にて遺伝子ノックインを可能とする作製方法を提供することができる。
図１は本発明方法による遺伝子改変マウスの作製方法の概略を示す。遺伝子改変マウスがノックインマウスである場合には、ターゲティングベクターを併用する。 図２はターゲティングベクター「ｐＡｃｔｂ－ＴｅｔＯ－ＦＬＥＸ－ＥＧＦＰ－ｐｏｌｙＡ」の模式図及びそれによる相同組換えの概略を示す。 図３－１はＣａｓ９タンパク質と、各濃度のｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片の組み合わせによる標的ＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける切断効率を示すグラフ図である。 図３－２は、各塩基長のｃｒＲＮＡ断片（０ｂｐ（なし）、２０ｂｐ、３０ｂｐ、３６ｂｐ、３９ｂｐ、又は４２ｂｐ）と、Ｃａｓ９タンパク質及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片の組み合わせによる標的ＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける切断効率を示すグラフ図である。 図４はノックインマウスのスクリーニング結果を示す写真図である。１１匹の産仔のうち５匹（レーン１，２，５，８，１１）がノックインマウスであることを示す。 図５はノックインマウス由来の繊維芽細胞におけるＥＧＦＰの発現を示す写真図である。矢頭：ノックインマウスに由来する繊維芽細胞において、ＤｓＲｅｄにて示される領域とＥＧＦＰにて示される領域とが重なることを示す。
１．Ｃａｓ９タンパク質
　本発明においてＣａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて使用できるものであればよく、下記ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片及びｃｒＲＮＡ断片と結合して活性化し、標的二本鎖ＤＮＡを切断できるものであればよく特に限定はされない。このようなＣａｓ９タンパク質は公知であり、ＷＯ２０１４／１３１８３３に例示されるものを利用することができる。好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質を利用する。Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列及び塩基配列は公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に登録されており（例えば、アクセッション番号：Ｑ９９ＺＷ２．１等）、本発明においてはこれらを利用することができる。
　好ましくは本発明においてＣａｓ９タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなるものを利用することができる。また、本発明においてＣａｓ９タンパク質には、元のタンパク質の活性、すなわち下記ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片及びｃｒＲＮＡ断片と結合して活性化し、標的二本鎖ＤＮＡを切断する活性を保持する限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなるポリペプチドも含む。ここで「複数個」とは１～５０個、好ましくは１～３０個、さらに好ましくは１～１０個である。さらに、本発明においてＣａｓ９タンパク質には、元のタンパク質の活性を保持する限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなるポリペプチドも含む。アミノ酸配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。
　本発明においてＣａｓ９タンパク質は、タンパク質の形態で利用される。Ｃａｓ９タンパク質は、遺伝子組換え技術により得られた形質転換細胞又は微生物に産生させることを含む生物学的手法により製造されたものであってもよいし、慣用のペプチド合成法を用いて化学的に製造されたものであってもよい。あるいは、Ｃａｓ９タンパク質は市販品を使用してもよい。
２．ｃｒＲＮＡ断片
　本発明においてｃｒＲＮＡ断片は少なくとも、標的ＤＮＡ領域と相補的な塩基配列とｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片と相互作用可能な塩基配列を、５’側よりこの順で含んでなる。
　標的ＤＮＡ領域とは、非ヒト動物のゲノムＤＮＡ上、目的とする遺伝子改変を生じる部位を含む１７～３０塩基、好ましくは１７～２０塩基からなる領域を意味する。当該領域は３’側にて「ＮＧＧ（Ｎは任意の塩基）」（ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ　ａｄｊａｃｅｎｔ　ｍｏｔｉｆ）配列）と隣接する領域より選択されることが好ましい。
　標的ＤＮＡ領域を選択する方法として種々の方法が知られており、例えば、ＣＲＩＳＰＲ　Ｄｅｓｉｇｎ　Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／）（マサチューセッツ工科大学）、Ｅ－ＣＲＩＳＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅ－ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ－ＣＲＩＳＰ／）、Ｚｉｆｉｔ　Ｔａｒｇｅｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｚｉｆｉｔ．ｐａｒｔｎｅｒｓ．ｏｒｇ／ＺｉＦｉＴ／）（Ｚｉｎｇ　Ｆｉｎｇｅｒコンソーシアム）、Ｃａｓ９　ｄｅｓｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｃａｓ９．ｃｂｉ．ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／）（北京大学）、ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／）（東京大学）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｒｉｓｐｒ／）（華中農業大学）、Ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ　Ｔａｒｇｅｔ　Ｄｅｓｉｇｎ　Ｔｏｏｌ．（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗｓ．ｂｌｕｅｈｅｒｏｎｂｉｏ．ｃｏｍ／ｅｘｔｅｒｎａｌ／ｔｏｏｌｓ／ｇＲＮＡＳｒｃ．ｊｓｐ）（Ｂｌｕｅ　Ｈｅｒｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）などを利用して決定することができる。
　ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片と相互作用可能な塩基配列とは、ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片の一部の塩基配列と結合（ハイブリダイズ）可能な塩基配列を意味し、本発明においては少なくとも配列番号２で表される塩基配列を含む。好ましくはｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片と相互作用可能な塩基配列は、配列番号３で表される塩基配列において５’末のグリシン「Ｇ」を１番目として以降の塩基については２番目、３番目、４番目．．．２２番目と順次番号付けを行った場合、１番目から１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、又は２２番目で表される塩基配列を含むか、当該塩基配列よりなる。
　また、本発明においてｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片と相互作用可能な塩基配列には、上記塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）塩基配列を有し、かつｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片と相互作用可能なオリゴヌクレオチドも含まれる。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃｉｔｒａｔｅ；１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）溶液を用いて、６５℃で洗浄することを意味する（以下においても、同じ意味で使用する）。このようなオリゴヌクレオチドには、上記塩基配列において数塩基の付加、置換、欠失又は挿入を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドや（ここで「数塩基」とは、３塩基以内、又は２塩基以内の塩基数を意味する）、上記塩基配列と、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド等が含まれ得る。このようなオリゴヌクレオチドのことを本明細書においては、上記塩基配列の「変異配列」と記載する場合がある。
　ｃｒＲＮＡ断片は上記標的ＤＮＡ領域と相補的な塩基配列と上記ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片と相互作用可能な塩基配列を含み全体として、好ましくは４２塩基以下、３９塩基以下、又は３６塩基以下、あるいは３０塩基以上、３６塩基以上、又は３９塩基以上、例えば、３０～４２塩基、より詳細には３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、３９塩基、４０塩基、４１塩基又は４２塩基とすることができる。
　ｃｒＲＮＡ断片は、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、また通常用いられるＲＮＡ自動合成装置を利用して、化学的に合成することができる。
　本発明のｃｒＲＮＡ断片は、標的ＤＮＡ領域が異なる、すなわち標的ＤＮＡ領域と相補的な塩基配列が異なる、複数種のｃｒＲＮＡ断片を含めることができる。
３．ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片
　本発明においてｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片は、５’側にｃｒＲＮＡ断片の一部の塩基配列と結合（ハイブリダイズ）可能な塩基配列を有し、これら塩基配列の相互作用によりｃｒＲＮＡ断片／ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片ハイブリッドを形成する。これが標的ＤＮＡ領域へのＣａｓ９タンパク質のガイドとして作用する。
　本発明においてｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片は、ｃｒＲＮＡ断片と共にＣａｓ９タンパク質をガイドできるものであれば特に限定されないが、好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｔｒａｃｒ　ＲＮＡを利用する。
　ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片について、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに必要とされる塩基配列はある程度明らかにされており（Ｊｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　３３７：８１６，２０１２）、本発明においてはこれらの知見を利用することができる。本発明のｔｒａｃｒＲＮＡ断片は、少なくとも配列番号４で表される塩基配列を含む。好ましくはｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片は、配列番号５で表される塩基配列において５’末のアデニン「Ａ」を１番目として以降の塩基については２番目、３番目、４番目．．．６９番目と順次番号付けを行った場合、１１番目から３４番目の塩基からなる塩基配列と共に、１番目から１０番目及び／又は３５番目から６９番目の領域より、１１番目及び／又は３４番目の塩基に隣接して選択される１又は連続する複数の塩基からなる塩基配列を含むか、当該塩基配列よりなる。
　したがって、ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片は全体として、好ましくは６９塩基以下、５９塩基以下、又は３４塩基以下、あるいは２４塩基以上、例えば、２４塩基、２４～３４塩基、２４～５９塩基又は２４～６９塩基とすることができる。
　また、本発明においてｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片には、上記塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下で結合する（ハイブリダイズする）塩基配列を有し、かつｃｒＲＮＡ断片と共にＣａｓ９タンパク質をガイドできるオリゴヌクレオチドも含まれる。このようなオリゴヌクレオチドには、上記塩基配列において数塩基の付加、置換、欠失又は挿入を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドや（ここで「数塩基」とは、３塩基以内、又は２塩基以内の塩基数を意味する）、上記塩基配列と、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチド等が含まれ得る。このようなオリゴヌクレオチドのことを本明細書においては、上記塩基配列の「変異配列」と記載する場合がある。
　ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片は、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、また通常用いられるＲＮＡ自動合成装置を利用して、化学的に合成することができる。
４．ドナーＤＮＡ
　本発明においてドナーＤＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質に切断された部位にて生じる相同組換え修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：ＨＲ）を利用して、標的ＤＮＡ領域に所望の遺伝子又は塩基配列を挿入（ノックイン）するために用いられるＤＮＡである。
　ドナーＤＮＡは、標的ＤＮＡ領域内の塩基配列と高い同一性を有する２つの塩基配列（所謂、相同性アーム）とそれらの間に配置された挿入する遺伝子又は塩基配列を含む。
　相同性アームは相同組換えを行うのに十分な程度の大きさがあればよく特に限定されないが、例えば０．５～１０ｋｂの範囲よりそれぞれ独立して選択することができる。
　また、相同性アームは相同組換えを行うのに十分な程度に標的ＤＮＡ領域内の塩基配列と同一性を有していればよく特に限定されないが、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．９％以上の同一性をそれぞれ有する。
　挿入する遺伝子又は塩基配列は、本発明方法にて用いる卵母細胞に対して内因性、外因性、同種、異種のいずれであってもよい。
　また、挿入する遺伝子又は塩基配列の大きさは特に限定されることなく、様々なサイズのものを利用することができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて従来挿入されていた遺伝子と比べて、比較的大きなサイズ、例えば、１００ｂｐ以上、３００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、７００ｂｐ以上、９００ｂｐ以上、１ｋｂ以上、１．５ｋｂ以上、２ｋｂ以上、３ｋｂ以上、４ｋｂ以上、あるいは５ｋｂ以上のものも利用することができる。
　挿入する遺伝子又は塩基配列にはプロモーター及び／又はその他の制御配列を作動可能に連結することができる。「作動可能に連結する」とは、挿入された遺伝子又は塩基配列が細胞内においてプロモーター及び／又はその他の制御配列の制御下において発現されることを意味する。プロモーター及び／又はその他の制御配列は特に限定されないが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター、誘導性プロモーター、ＣＭＶプロモーターなど、その他の調節エレメントなど（例えば、ターミネーター配列）を適宜選択することができる。
　本発明のドナーＤＮＡは、標的ＤＮＡ領域が異なる複数種のｃｒＲＮＡ断片が存在する場合には、当該複数種の標的ＤＮＡ領域にそれぞれ対応した相同性アームを有する、複数種のドナーＤＮＡを含めることができる。また、複数種のドナーＤＮＡに含まれる挿入する遺伝子又は塩基配列はそれぞれ別個の遺伝子又は塩基配列とすることができる。
　なお、本明細書中、ドナーＤＮＡをターゲティングベクターと記載する場合があるが、これらの用語は相互互換的に使用される。
５．遺伝子改変された非ヒト動物の作製方法
　本発明の遺伝子改変された非ヒト哺乳動物の作製方法は、Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片を非ヒト哺乳動物の卵母細胞に導入し、標的ＤＮＡを遺伝子改変することを含む。
　「非ヒト哺乳動物」とは、非ヒト霊長類（サル等）、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等、ヒトを除く哺乳動物を意味する。好ましくは、げっ歯類であり、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ等より選択することができる。特に好ましくは、マウスである。
　「卵母細胞」は、受精前及び受精後の卵母細胞を利用することができるが、好ましくは受精後の卵母細胞、すなわち受精卵である。特に好ましくは、受精卵は前核期胚のものである。卵母細胞は、凍結保存されたものを解凍して用いることができる。
　Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片の卵母細胞への導入は、核酸及びタンパク質を卵母細胞へ導入する際に一般的に用いられている、顕微注入法に基づいて行うことができる（Ｎａｇｙ　Ａ，Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ　Ｍ，Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ　Ｋ，Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｒ．，２００３．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）。
　顕微注入は卵母細胞の前核、受精卵の場合には雌性前核及び／又は雄性前核、好ましくは雄性前核に対して行う。
　注入溶液には、Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片をそれぞれ以下（ｉ）～（ｉｉｉ）の一又は複数にて規定される量より選択される量にて含めることができる：
（ｉ）　Ｃａｓ９タンパク質は、５～５０００ｎｇ／μＬ、好ましくは５～５００ｎｇ／μＬ、より好ましくは１０～５０ｎｇ／μＬ、さらに好ましくは２０～４０ｎｇ／μＬ、よりさらに好ましくは３０ｎｇ／μＬとする；
（ｉｉ）　ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片はそれぞれ、Ｃａｓ９タンパク質１ｎｇ／μＬに対し、０．００２ｐｍｏｌ／μＬを超える濃度、好ましくは０．００５ｐｍｏｌ／μＬ以上、より好ましくは０．０１ｐｍｏｌ／μＬ以上、さらに好ましくは０．０２ｐｍｏｌ／μＬ以上であり、上限は２ｐｍｏｌ／μＬ以下、好ましくは０．２ｐｍｏｌ／μＬ以下となる濃度とする（ｃｒＲＮＡ断片の量とｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片の量とは、同一であってもよいし、異なっていてもよい）；
（ｉｉｉ）　ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片はそれぞれ、０．０６ｐｍｏｌ／μＬを超える濃度、好ましくは０．１５ｐｍｏｌ／μＬ以上、より好ましくは０．３ｐｍｏｌ／μＬ以上、さらに好ましくは０．６ｐｍｏｌ／μＬ以上であり、上限は６０ｐｍｏｌ／μＬ以下、好ましくは６ｐｍｏｌ／μＬ以下、となる濃度とする（ｃｒＲＮＡ断片の量とｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片の量とは、同一であってもよいし、異なっていてもよい）。
　一態様において注入溶液中には、Ｃａｓ９タンパク質を２０～４０ｎｇ／μＬ、好ましくは３０ｎｇ／μＬ、ｃｒＲＮＡ断片を０．１５ｐｍｏｌ／μＬ以上、好ましくは０．３ｐｍｏｌ／μＬ以上、より好ましくは０．６ｐｍｏｌ／μＬ以上、ならびに、ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片を０．１５ｐｍｏｌ／μＬ以上、好ましくは０．３ｐｍｏｌ／μＬ以上、より好ましくは０．６ｐｍｏｌ／μＬ以上の濃度でそれぞれ含めることができる。
　顕微注入に際して、Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片は複合体を形成していることが好ましい。複合体の形成は、Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片を注入溶液中にて、３５～４０℃、好ましくは３７℃にて、少なくとも１５分間程度、インキュベートすることにより行うことができる。これにより相補的な塩基配列の相互作用によりｃｒＲＮＡ断片／ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片ハイブリッドが形成され、これにＣａｓ９タンパク質が結合した複合体を得ることができる。
　注入溶液の注入量は、卵母細胞への顕微注入において一般的に用いられている量であればよく、前核へ顕微注入する場合には、前核の膨化が飽和状態となる量とすることができる。
　注入されたＣａｓ９タンパク質は、ｃｒＲＮＡ断片／ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片ハイブリッドにより、非ヒト動物のゲノムＤＮＡ上の標的ＤＮＡ領域にガイドされ当該領域内の二本鎖ＤＮＡの切断を引き起こし、非相同末端結合（Ｎｏｎ　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｅｎｄ　Ｊｏｉｎｉｎｇ：ＮＨＥＪ）又は相同組換え修復（ＨＲ）を介して遺伝子改変を生じる。
　非相同末端結合によれば、切断部位にて高頻度で偶発的に塩基の挿入欠失が高率に起こり、フレームシフト変異により標的ＤＮＡ領域における遺伝子が破壊（遺伝子ノックアウト）され得る。
　相同組換え修復によれば、ドナーＤＮＡの存在下、これを鋳型として相同組換え修復が起こり、ドナーＤＮＡに含まれた所望の遺伝子又は塩基配列が標的ＤＮＡ領域に挿入（遺伝子ノックイン）され得る。ドナーＤＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片と共に卵母細胞に注入することができ、１～３０ｎｇ／μＬ、好ましくは５～１５ｎｇ／μＬ、より好ましくは１０ｎｇ／μＬの濃度にて他の成分と共に注入溶液中に含めることができる。
　また、上記複数種のｃｒＲＮＡ断片や複数種のドナーＤＮＡを組み合わせて用いることによって、複数種の遺伝子改変を生じることができる。
　なお、本発明方法による顕微注入の一態様を図１に示す。
　顕微注入された卵母細胞は次いで、偽妊娠状態にした雌非ヒト哺乳動物の子宮に移植し、その後産仔を得る。移植は１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、又は桑実期胚の受精卵にて行うことができる。顕微注入された卵母細胞は必要に応じて、移植されるまで適当な条件下にて培養することができる。卵母細胞の移植及び培養は従来公知の手法に基づいて行うことができる（Ｎａｇｙ　Ａら、上掲）。
　遺伝子改変の有無の確認、及び遺伝子型の決定は、従来公知の手法に基づいて行うことができ、例えばＰＣＲ法、配列決定法、サザンブロッティング法等を利用することができる。これらの分析に供されるゲノムＤＮＡは、移植前の胚の一部より抽出されたものであってもよいし、産仔より抽出されたものであってもよい。
　本発明方法によれば、Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片を非ヒト哺乳動物の卵母細胞に導入することによって、高効率にて標的ＤＮＡを遺伝子改変することができ、特にドナーＤＮＡと併用することによって様々なサイズの遺伝子を（従来導入されていた遺伝子と比べて比較的大きなサイズの遺伝子であっても）高効率（例えば、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、４５％以上、又はそれ以上の割合）でノックインすることが可能であり、遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を効率的に製造することができる。また、本発明方法によれば、遺伝子改変をホモ接合型及びヘテロ接合型にて有する非ヒト哺乳動物の製造が可能であり、ＥＳ細胞を介した従来法と比べて早期に（例えば、マウスであればおよそ一か月程度で）所望の遺伝型を有する遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を得ることができる。
６．標的ＤＮＡを遺伝子改変するためのキット
　本発明のキットは、ｃｒＲＮＡ断片及び／又はｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片を含み、上記のとおり、標的ＤＮＡを遺伝子改変するため、ならびに／あるいは、標的ＤＮＡが遺伝子改変された非ヒト哺乳動物を作製するために用いることができる。
　本発明のキットにはさらに、上記Ｃａｓ９タンパク質及び／又はドナーＤＮＡを含めることができる。
　キットに含まれる各要素は、それぞれ別個の容器に収容されていてもよいし、あるいは同一の容器に収容されていてもよい。各要素は、一回の使用量ごとに容器に収容されていてもよいし、あるいは複数回分の量が一つの容器に収容されていてもよい（使用者は一回の使用に必要な量を取り出して用いることができる）。各要素は乾燥形態で容器に収容されていてもよいし、適当な溶媒中に溶解した形態で容器に収容されていてもよい。
　以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実験材料及び方法］
（ターゲティングベクター）
　ターゲティングベクターは、ｐＡＡＶ－ＴｅｔＯ－ＦＬＥＸ－ＨＡ－ｍＫａｔｅ２－ＴｅＮＴ－ｐｏｌｙＡプラスミド（名古屋大学環境医学研究所神経系分野２　山中章弘博士より贈与）より以下のとおり作製した。まず、ＸｈｏＩ（ＮＥＢ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）で消化してＨＡ－ｍＫａｔｅ２－ＴｅＮＴを除去し、そこにＰＣＲ増幅されたＥＧＦＰをコードする遺伝子を逆向きに置換・挿入した。次いで、ＮａｒＩ（ＮＥＢ）及びＢｓｔＥＩＩ（ＮＥＢ）で消化してＡＡＶ２－ＩＴＲを除去し、そこにＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのゲノムＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅したβ－アクチン（以下、「Ａｃｔｂ」と記載する）遺伝子の断片（２．０ｋｂ）を左ホモロジーアームとして、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて置換・挿入した。最後に、ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）及びＭｌｕＩ（ＮＥＢ）で消化し、そこにＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのゲノムＤＮＡに由来するＰＣＲ増幅したＡｃｔｂ遺伝子の断片（２．０ｋｂ）を右ホモロジーアームとしてＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応により置換・挿入した。
　このようにして得られたターゲティングベクターを以下、「ｐＡｃｔｂ－ＴｅｔＯ－ＦＬＥＸ－ＥＧＦＰ－ｐｏｌｙＡ」と記載する。また、ｐＡｃｔｂ－ＴｅｔＯ－ＦＬＥＸ－ＥＧＦＰ－ｐｏｌｙＡの模式図を図２に示す。
（Ｃａｓ９タンパク質）
　組換えＣａｓ９タンパク質は、ＮＥＢ及びＰＮＡ　Ｂｉｏ．より購入した。
（ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片）
　ｔｒａｃｒＲＮＡ断片及びｃｒＲＮＡ断片は下記表１に示す塩基配列を有するものを化学合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した（株式会社ファスマック）。ｃｒＲＮＡ断片はＡｃｔｂ標的配列を含む。
（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ切断アッセイ）
１．濃度の検討
　Ｃａｓ９タンパク質（３０ｎｇ／μＬ）とｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片（それぞれ、０ｐｍｏｌ／μＬ，０．０６１ｐｍｏｌ／μＬ，０．１５３ｐｍｏｌ／μＬ，０．３０５ｐｍｏｌ／μＬ、又は０．６１ｐｍｏｌ／μＬ）をＡｃｔｂ標的配列を含むＰＣＲ産物と共に、Ｃａｓ９　Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎバッファー（ＮＥＢ）中にて３７℃で６０分間インキュベートし、次いでＲＮａｓｅ　Ａ（５ｍｇ）で処理して（３７℃にて３０分間）、ＲＮＡを除去した。反応を３０％グリセロール、１．２％ＳＤＳ及び２５０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む６×ＤＮＡローディングバッファーで停止し、反応物を２％アガロースゲルにて電気泳動した。対照には、ｃｒＲＮＡ断片、及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片を加えなかった。
２．ｃｒＲＮＡ断片長の検討
　上記１．の実験においてｃｒＲＮＡ断片を、下記表２に示す塩基配列を有するものに代え、それぞれ０．６１ｐｍｏｌ／μＬにて用いた以外は同一の条件にてｉｎ　ｖｉｔｒｏ切断アッセイを行った。対照には、いずれのｃｒＲＮＡ断片も加えなかった。
　なお、以下において特記しないかぎり、「ｃｒＲＮＡ断片」とは配列番号６で表される塩基配列からなるものを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（ノックインマウスの作製）
　０．１ＴＥバッファー中に、Ｃａｓ９タンパク質（３０ｎｇ／μＬ）、ｃｒＲＮＡ断片（０．０６１もしくは０．６１ｐｍｏｌ／μＬ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ断片（０．０６１もしくは０．６１ｐｍｏｌ／μＬ）、及びｐＡｃｔｂ－ＴｅｔＯ－ＦＬＥＸ－ＥＧＦＰ－ｐｏｌｙＡ（１０ｎｇ／μＬ）を添加・混合し、３７℃にて少なくとも１５分間インキュベートし、複合体を形成した。
　一細胞期の胚はＢＤＦ１マウスを交配して得られたものであり（日本クレア株式会社）、使用まで凍結保存されたものを使用した。
　上記複合体を、解凍した胚の雄性前核に顕微注入し、３７℃にて２４時間インキュベートした後、二細胞期の胚を偽妊娠させたＩＣＲ雌マウス（日本クレア株式会社）に移植し、産仔を得た。得られた産仔よりノックインマウスをスクリーニングした。
（ＰＣＲスクリーニング）
　産仔の尾部を一部採取し、プロテイナーゼＫで処理した後、フェノール抽出法によりゲノムＤＮＡを調製した。次いで、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、ＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）及び下記表３に示す３種のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、１％アガロースゲルにて電気泳動してノックインマウスをスクリーニングした。得られたＰＣＲ産物についてはさらに、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてクローニングし、配列決定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
・サザンブロッティング
　サザンプローブ（０．８ｋｂ）は、ＢＤＦ１ゲノムＤＮＡよりＰＣＲ増幅し、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いてクローニングした後、32Ｐランダムプライマー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を用いて標識して調製した。ノックインマウスより得たゲノムＤＮＡは、ＥｃｏＲＩで消化して０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動により分離し、ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）へ転写した後、サザンプローブとハイブリダイズさせ検出し、遺伝子型を確認した。プローブの位置は図２に示す。
（繊維芽細胞の初代培養）
　２週齢のマウスの耳より小片を切り取り、３７℃にて３０分間、４ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＬ（新田ゼラチン株式会社）及び４ｍｇ／ｍｌディスパーゼで処理した後、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中、３７℃、１０％ＣＯ2条件下にて数日間培養した。ｐＣＡＧ－Ｃｒｅ、ｐＣＭＶ－ｔＴＡ（Ｔａｋａｒａ）及びｐＣＭＶ－ＤｓＲｅｄ（Ｔａｋａｒａ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＬＴＸ　＆　Ｐｌｕｓ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞にコトランスフェクトし、ＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡にて確認した。
［結果］
（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ切断アッセイ）
１．濃度の検討結果
　結果を図３－１に示す。
　ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片の濃度依存的にＡｃｔｂ標的配列を含むＰＣＲ産物の切断効率が増加することが確認できた。そして、０．６１ｐｍｏｌ／μＬのｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片を用いた場合に、およそ９５％の高い効率でＡｃｔｂ標的配列を含むＰＣＲ産物を切断できることが確認できた。
２．ｃｒＲＮＡ断片長の検討結果
　結果を図３－２に示す。
　ｃｒＲＮＡ断片が３０ｂｐの長さを有する場合、すなわち２０ｂｐからなる標的ＤＮＡ領域と相補的な塩基配列と、１０ｂｐからなるｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片と相互作用可能な塩基配列を含む場合（配列番号９）に、およそ９５％の高い効率でＡｃｔｂ標的配列を含むＰＣＲ産物を切断できることが確認できた。この結果は、高い切断効率を達成するためにｃｒＲＮＡ断片は少なくとも２０ｂｐからなる標的ＤＮＡ領域と相補的な塩基配列と、少なくとも１０ｂｐからなるｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片と相互作用可能な塩基配列を有していればよいことを示す。
（ノックインマウスの作製）
　ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムにて一般的に用いられるＲＮＡ量「０．０６１ｐｍｏｌ／μＬ」にてｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片を、Ｃａｓ９タンパク質及びｐＡｃｔｂ－ＴｅｔＯ－ＦＬＥＸ－ＥＧＦＰ－ｐｏｌｙＡと共に受精卵の前核に注入した結果、９匹の産仔を得ることができた。得られた産仔についてＰＣＲスクリーニングしたところ、Ａｃｔｂ遺伝子座にＴｅｔＯ－ＦＬＥＸ－ＥＧＦＰ－ｐｏｌｙＡカセットを保有するマウスは確認できなかった（下記表４）。
　一方、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片の注入量をそれぞれ「０．６１ｐｍｏｌ／μＬ」に増大し、Ｃａｓ９タンパク質及びｐＡｃｔｂ－ＴｅｔＯ－ＦＬＥＸ－ＥＧＦＰ－ｐｏｌｙＡと共に受精卵の前核に注入した結果、１１匹の産仔を得ることができた。得られた産仔についてＰＣＲスクリーニングしたところ、５匹（産仔の４５．５％）という非常に高い割合で、Ａｃｔｂ遺伝子座にＴｅｔＯ－ＦＬＥＸ－ＥＧＦＰ－ｐｏｌｙＡカセットを保有することが確認できた（図４及び下記表４）。また、得られたノックインマウスには、ノックインアレルをホモ接合に有するものも認められた。すなわち、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒＲＮＡ断片の注入量を増大させることによって、ノックインの効率を顕著に高められることが確認できた。
　従来、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いて比較的大きなサイズの遺伝子を挿入したノックイン哺乳動物の製造効率が非常に低い（例えば、およそ１０％以下）ことを考慮すると（Ｙａｎｇ，Ｈ．ら、上掲）、本方法によりもたらされるノックインの効率は顕著に高いものであるといえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（ノックイン遺伝子の機能確認）
　得られたノックインマウス及び野生型マウスの耳介より採取した繊維芽細胞をそれぞれ培養し、これにｐＣＡＧ－Ｃｒｅ、ｐＣＭＶ－ｔＴＡ及びｐＣＭＶ－ＤｓＲｅｄをコトランスフェクトしたところ、ノックインマウスに由来する繊維芽細胞においてＥＧＦＰの蛍光が観察された（図５：矢頭）。特に、ノックインアレルをホモ接合に有するマウスにおいて強いシグナルが確認された。
　この結果は、Ｃｒｅ及びｔＴＡの存在下、Ａｃｔｂ遺伝子座に挿入されたＴｅｔＯ－ＦＬＥＸ－ＥＧＦＰ－ｐｏｌｙＡカセットより機能的なＥＧＦＰが産生されたことを示す。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (11)

  1. 　標的ＤＮＡ領域へ遺伝子又は塩基配列が挿入されたマウスの作製方法であって、Ｃａｓ９タンパク質、標的ＤＮＡ領域と相補的な塩基配列を含むｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片、ならびに該遺伝子又は塩基配列を含むドナーＤＮＡをマウスの卵母細胞に導入し、該標的ＤＮＡ領域へ該遺伝子又は塩基配列を挿入することを含み、
    ここで、該ｃｒＲＮＡ断片は３０～４２塩基長であり、該ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片は２４～６９塩基長であり、該Ｃａｓ９タンパク質を３０ｎｇ／μＬ以上の濃度で、かつｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片をそれぞれ０．６ｐｍｏｌ／μＬ以上の濃度で用いる、上記方法。
  2. 　遺伝子改変された非ヒト哺乳動物の作製方法であって、Ｃａｓ９タンパク質、標的ＤＮＡ領域と相補的な塩基配列を含むｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片を非ヒト哺乳動物の卵母細胞に導入し、該標的ＤＮＡを遺伝子改変することを含む、上記方法。
  3. 　非ヒト哺乳動物が、げっ歯類より選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 　卵母細胞が受精卵である、請求項２又は３に記載の方法。
  5. 　ｃｒＲＮＡ断片が、標的ＤＮＡと相補的な塩基配列、及び配列番号２で表される塩基配列もしくはその変異配列を含む、請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　ｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片が、配列番号４で表される塩基配列もしくはその変異配列を含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片が複合体を形成している、請求項２～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　遺伝子改変が標的ＤＮＡ領域への遺伝子又は塩基配列の挿入であり、Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片と共に、該遺伝子又は塩基配列を含むドナーＤＮＡを非ヒト哺乳動物の卵母細胞に導入することを含む、請求項２～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　Ｃａｓ９タンパク質１ｎｇ／μＬに対し、ｃｒＲＮＡ断片及びｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片をそれぞれ０．００２ｐｍｏｌ／μＬを超える濃度で用いる、請求項２～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　標的ＤＮＡと相補的な塩基配列、及び配列番号２で表される塩基配列もしくはその変異配列を含み、４２塩基以下の塩基配列からなるｃｒＲＮＡ断片；ならびに／あるいは
    　配列番号４で表される塩基配列もしくはその変異配列を含み、６９塩基以下の塩基配列からなるｔｒａｃｒ　ＲＮＡ断片、
    を含む標的ＤＮＡを遺伝子改変するためのキット。
  11. 　Ｃａｓ９タンパク質、及び／又は、標的ＤＮＡ領域へ挿入するための遺伝子もしくは塩基配列を含むドナーＤＮＡをさらに含む、請求項１０に記載のキット。
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