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WO2016063332A1 - 新規α－グルコシダーゼの用途 - Google Patents

新規α－グルコシダーゼの用途 Download PDF

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Publication number
WO2016063332A1
WO2016063332A1 PCT/JP2014/077854 JP2014077854W WO2016063332A1 WO 2016063332 A1 WO2016063332 A1 WO 2016063332A1 JP 2014077854 W JP2014077854 W JP 2014077854W WO 2016063332 A1 WO2016063332 A1 WO 2016063332A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glucosidase
enzyme
saccharide
food
type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2014/077854
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
望 安武
雄治 松本
敦 河野
陽大 富永
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Showa Sangyo Co Ltd
Original Assignee
Showa Sangyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Showa Sangyo Co Ltd filed Critical Showa Sangyo Co Ltd
Priority to PCT/JP2014/077854 priority Critical patent/WO2016063332A1/ja
Priority to JP2016554963A priority patent/JP6434983B2/ja
Publication of WO2016063332A1 publication Critical patent/WO2016063332A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/69—Aspergillus oryzae

Definitions

  • the present invention relates to the use of a novel ⁇ -glucosidase for producing foods and beverages by processing raw materials containing polysaccharides. More specifically, it acts on a saccharide selected from the group consisting of ⁇ -type oligosaccharides and ⁇ -type polysaccharides for processing foods and drinks by processing raw materials containing polysaccharides, and a continuous ⁇ -1 , Relating to the use of ⁇ -glucosidase to produce carbohydrates having 6 bonds.
  • the present invention also relates to a method for improving a food or drink comprising using the ⁇ -glucosidase, and an agent for improving a food or drink containing the ⁇ -glucosidase.
  • the texture has a great influence on the quality and value of food.
  • consumer demand for food health functions has also increased.
  • one of the factors that greatly affects the texture and health functionality is the binding mode and ratio of sugars contained in the foods and beverages.
  • starch is composed of amylose in which glucose is linearly linked by ⁇ -1,4 bonds, and amylopectin having a structure branched by ⁇ -1,6 bonds in the middle of a straight chain in which ⁇ -1,4 bonds are linked. It is a mixture of When water is added to starch and heated, it gelatinizes and the texture improves when used as a food or drink. However, when gelatinized starch is cooled, water separates from the starch structure, and a phenomenon called “starch aging” occurs. It is thought that the aging of starch causes the texture of foods containing starch such as cooked rice and bread to harden when cooled.
  • the use of an enzyme has been proposed as a method for suppressing aging of starch, and effects such as improvement of storage stability can be obtained by suppressing aging of starch.
  • ⁇ -glucosidase having transglycosylation activity a transglucosidase ( ⁇ -glucosidase derived from Aspergillus niger) that mainly produces a carbohydrate having a degree of polymerization one greater than that of the substrate, for example, It has been proposed to be used for the manufacture of cooked rice, rice noodles, bread, udon, potato salad (Patent Document 1), processed meat / fishery processed food (Patent Document 2), and modified starch (Patent Document 3).
  • Patent Document 1 processed meat / fishery processed food
  • Patent Document 3 modified starch
  • Patent Documents 5, 6, 7, and 8 As an enzyme that produces a carbohydrate having a continuous ⁇ -1,6 bond, an enzyme mainly derived from bacteria is known, and dextrin dextranase (Patent Documents 5, 6, 7, and 8), ⁇ -gluca No-transferase (Patent Document 9), dextran glucanase (Patent Document 10) and the like.
  • dextrin dextranase Patent Documents 5, 6, 7, and 8
  • Patent Document 9 ⁇ -gluca No-transferase
  • Patent Document 10 dextran glucanase
  • all of them have low heat resistance and low stability against pH fluctuation, and are insufficient for use in the production of industrial food and drink.
  • an enzyme that can be used at a high temperature is required for hygienic reasons.
  • the enzyme which does not lose activity under wide pH is calculated
  • ⁇ -glucosidase present in Aspergillus sojae which is a kind of bacteria belonging to the genus Aspergillus, has various ⁇ -glucosidases. It has been found that it has a high activity of acting on a type oligosaccharide and an ⁇ type polysaccharide to produce a carbohydrate having a continuous ⁇ -1,6 bond. In addition, it was found that foods and beverages produced by using this ⁇ -glucosidase and processed from raw materials containing polysaccharides have a good texture even when cooled, and maintain a good texture even when stored. .
  • the present inventors have found that foods and drinks produced by processing raw materials containing polysaccharides produced using this ⁇ -glucosidase have a high content of water-soluble dietary fiber.
  • the ⁇ -glucosidase exhibits high heat resistance such that 90% or more remains even if it is kept at 50 ° C. for 1 hour, and more than 80% remains even if it is kept at pH 4.5 to 10 for 1 hour.
  • the present invention is not limited, but relates to the following.
  • [1] Use of ⁇ -glucosidase to process a raw material containing polysaccharides to produce a food or drink, wherein ⁇ -glucosidase is a sugar selected from the group consisting of ⁇ -type oligosaccharides and ⁇ -type polysaccharides Uses that act on quality and produce carbohydrates with continuous ⁇ -1,6 linkages.
  • [2] The use according to [1], wherein the polysaccharide is starch or processed starch.
  • [3] The use according to [1] or [2], wherein the food or drink is a processed rice product.
  • the ⁇ -glucosidase is an ⁇ -glucosidase derived from the genus Aspergillus and has the following enzyme chemical properties: (1) Action: acts on a saccharide selected from the group consisting of ⁇ -type oligosaccharides and ⁇ -type polysaccharides, and produces a saccharide having continuous ⁇ -1,6 bonds; (2) Substrate specificity: Acts on maltose, isomaltose, maltotriose, isomaltotriose, maltotetraose, isomalttetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose, amylose, soluble starch, dextran Do; An ⁇ -glucosidase that acts on a saccharide selected from the group consisting of an ⁇ -type oligosaccharide and an ⁇ -type polysaccharide to produce a saccharide having continuous ⁇
  • a method for improving foods and drinks comprising the use of ⁇ -glucosidase in the production of foods and drinks produced by processing raw materials containing polysaccharides, wherein ⁇ -glucosidase comprises ⁇ -type oligosaccharides and ⁇ -type oligosaccharides
  • the method according to [9] wherein the raw material containing a polysaccharide contains starch or a processed starch product.
  • the ⁇ -glucosidase is an ⁇ -glucosidase derived from the genus Aspergillus and has the following enzyme chemical properties: (1) Action: acts on a saccharide selected from the group consisting of ⁇ -type oligosaccharides and ⁇ -type polysaccharides, and produces a saccharide having continuous ⁇ -1,6 bonds; (2) Substrate specificity: Acts on maltose, isomaltose, maltotriose, isomaltotriose, maltotetraose, isomalttetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose, amylose, soluble starch, dextran Do; An ⁇ -glucosidase that acts on a saccharide selected from the group consisting of an ⁇ -type oligosaccharide and an ⁇ -type polysaccharide to produce a saccharide having continuous ⁇
  • Temperature stability pH 6.0, hold for 1 hour, and remain at 90% or more of initial activity at 50 ° C .
  • pH stability retained at 4 ° C. for 24 hours, and at pH 6.0 to 10.0, 90% or more of the initial activity remained.
  • a method for improving the quality of processed food comprising adding a raw material containing starch or processed starch product to ⁇ -glucosidase, which has been treated with ⁇ -glucosidase, wherein ⁇ -glucosidase is an ⁇ -type oligosaccharide and A method which acts on a saccharide selected from the group consisting of ⁇ -type polysaccharides to produce a saccharide having continuous ⁇ -1,6 bonds.
  • the processed food is processed livestock meat processed food or fishery processed food.
  • the ⁇ -glucosidase is an ⁇ -glucosidase derived from the genus Aspergillus and has the following enzyme chemical properties: (1) Action: acts on a saccharide selected from the group consisting of ⁇ -type oligosaccharides and ⁇ -type polysaccharides, and produces a saccharide having continuous ⁇ -1,6 bonds; (2) Substrate specificity: Acts on maltose, isomaltose, maltotriose, isomaltotriose, maltotetraose, isomalttetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose, amylose, soluble starch, dextran Do; An ⁇ -glucosidase that acts on a saccharide selected from the group consisting of an ⁇ -type oligosaccharide and an ⁇ -type polysaccharide to produce a saccharide having continuous ⁇
  • Temperature stability pH 6.0, hold for 1 hour, and remain at 90% or more of initial activity at 50 ° C .
  • pH stability retained at 4 ° C. for 24 hours, and at pH 6.0 to 10.0, 90% or more of the initial activity remained.
  • the ⁇ -glucosidase is an ⁇ -glucosidase derived from the genus Aspergillus and has the following enzyme chemical properties: (1) Action: acts on a saccharide selected from the group consisting of ⁇ -type oligosaccharides and ⁇ -type polysaccharides, and produces a saccharide having continuous ⁇ -1,6 bonds; (2) Substrate specificity: Acts on maltose, isomaltose, maltotriose, isomaltotriose, maltotetraose, isomalttetraose, maltopentaose, maltohe
  • Temperature stability pH 6.0, hold for 1 hour, and remain at 90% or more of initial activity at 50 ° C .
  • pH stability retained at 4 ° C. for 24 hours, and at pH 6.0 to 10.0, 90% or more of the initial activity remained.
  • ⁇ -glucosidase of the present invention makes it possible to improve the texture of the obtained food or drink in the production of the food or drink that processes the raw material containing the polysaccharide. Furthermore, since the use of the ⁇ -glucosidase of the present invention can suppress starch aging, it is possible to provide a food or drink that maintains an improved texture even after the time has elapsed since manufacture. In addition, by using the ⁇ -glucosidase of the present invention, it is possible to provide a food or drink with an increased content of water-soluble dietary fiber.
  • ⁇ -glucosidase used in the present invention can maintain high residual activity even at a high temperature of 50 ° C., it is possible to manufacture and process industrial food and drink at high temperatures.
  • ⁇ -glucosidase used in the present invention can maintain a high residual activity even at pH 4.5 to 10, industrial food and drink can be produced and processed in a wide range of pH.
  • FIG. 1 shows the structure of a plasmid vector incorporating a putative ⁇ -glucosidase gene derived from Aspergillus sojae NBRC4239 strain.
  • FIG. 2 shows the result of subjecting the purified fraction of ⁇ -glucosidase derived from NBRC4239 strain to native-polyacrylamide gel electrophoresis (left panel) and the result of subjecting it to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (right panel). .
  • FIG. 3 shows the influence of temperature on the enzyme activity of NBRC4239 strain-derived ⁇ -glucosidase.
  • FIG. 4 shows the effect of pH on the enzyme activity of ⁇ -glucosidase derived from NBRC4239 strain.
  • FIG. 1 shows the structure of a plasmid vector incorporating a putative ⁇ -glucosidase gene derived from Aspergillus sojae NBRC4239 strain.
  • FIG. 2 shows the result of subjecting
  • FIG. 5 shows the temperature stability of the enzyme activity of ⁇ -glucosidase derived from NBRC4239 strain.
  • FIG. 6 shows the pH stability of the enzyme activity of the NBRC4239 strain-derived ⁇ -glucosidase.
  • FIG. 7A shows the change over time in the polymerization degree distribution of the reaction product up to 72 hours after the start of the reaction when transglucosidase L “Amano” was reacted with maltose.
  • FIG. 7B shows the time course of the isomer composition of the 2, 3, and 4 sugar components of the reaction product up to 72 hours after the start of the reaction when transglucosidase L “Amano” was reacted with maltose.
  • FIG. 7A shows the change over time in the polymerization degree distribution of the reaction product up to 72 hours after the start of the reaction when transglucosidase L “Amano” was reacted with maltose.
  • FIG. 7B shows the time course of the isomer composition
  • FIG. 8A shows the polymerization of the reaction product up to 72 hours after the start of the reaction when the crude enzyme solution obtained from Aspergillus niger ATCC10254 strain by the method described in Japanese Patent No. 4830031 is reacted with maltose.
  • the time change of the degree distribution is shown.
  • FIG. 8B is a graph showing 2 of reaction products up to 72 hours after the start of the reaction when the crude enzyme solution obtained from Aspergillus niger ATCC 10254 strain by the method described in Japanese Patent No. 4830031 is reacted with maltose.
  • the time-dependent change of the isomer composition of the 3,4 tetrasaccharide component is shown.
  • FIG. 9 shows a chromatogram of the polymerization degree distribution of the reaction product 72 hours after the reaction when ⁇ -glucosidase derived from NBRC4239 strain was reacted with maltose.
  • FIG. 10 shows a chromatogram of the isomer composition of the reaction product 72 hours after the reaction when ⁇ -glucosidase derived from NBRC4239 strain was reacted with maltose.
  • FIG. 11A shows the change over time in the polymerization degree distribution of the reaction product up to 72 hours after the start of the reaction when ⁇ -glucosidase derived from NBRC4239 strain was reacted with maltose.
  • FIG. 11B shows the time course of the isomer composition of the 2, 3, and 4 sugar components of the reaction product up to 72 hours after the start of the reaction when NBRC4239 strain-derived ⁇ -glucosidase was reacted with maltose.
  • FIG. 12 shows the change with time of the continuous ⁇ 1,6 bond content of tetrasaccharide or more of the reaction product up to 72 hours after the start of the reaction when each enzyme is reacted with maltose.
  • FIG. 13 shows the results obtained by reacting NBRC4239 strain-derived ⁇ -glucosidase with maltose for 72 hours, fractionating pentasaccharide components from the obtained reaction product, and analyzing by H-NMR.
  • FIG. 14 shows a chromatogram of the polymerization degree distribution of the reaction product 72 hours after the reaction when ⁇ -glucosidase derived from NBRC4239 strain was reacted with maltopentaose.
  • FIG. 15 shows the change over time in the content of components of 6 or more sugars up to 72 hours after the start of the reaction when each enzyme is reacted with maltopentaose.
  • FIG. 16 shows the time course of the continuous ⁇ -1,6 bond content of 6 or more sugars up to 72 hours after the start of the reaction when each enzyme was reacted with maltopentaose.
  • FIG. 17 shows a comparison of various enzymes belonging to the GH31 family from the conserved sequence near the active center to the 3 residues downstream.
  • FIG. 18 shows the effect when an enzyme is added to cooked rice.
  • FIG. 19 shows the effect when the enzyme is added.
  • FIG. 20 shows the effect when an enzyme is added to bread.
  • FIG. 21 shows conditions for measuring the aging property of starch.
  • FIG. 22 shows the evaluation of aging properties of enzyme-treated starch.
  • the present invention relates to the use of ⁇ -glucosidase for producing a food or drink by processing a raw material containing a polysaccharide.
  • a polysaccharide refers to a saccharide of 10 or more sugars having a glucoside bond in the molecule.
  • the raw material containing a polysaccharide is not particularly limited as long as it contains a polysaccharide.
  • it may be a raw material containing starch.
  • the raw material containing starch is not particularly limited, and examples thereof include rice, wheat, barley, potato and the like, and starch extracted from these raw materials by a known method.
  • starch extracted by a known method include, but are not limited to, rice starch, wheat starch, potato starch, tapioca starch, and corn starch.
  • Examples of the raw material containing the processed starch product include processed starch obtained by subjecting extracted starch to physical treatment, chemical treatment, or enzymatic treatment alone or in combination of two or more.
  • Examples of physically processed processed starch include pregelatinized starch and wet heat-treated starch.
  • Examples of chemically processed processed starch include etherified derivatives such as hydroxypropyl starch and esters such as acetate starch. And cross-linked derivatives such as phosphoric acid cross-linked starch.
  • the food and drink are not particularly limited as long as the raw material containing polysaccharides is processed and manufactured, and examples include processed rice products, processed wheat products, processed barley products, processed potato products, and processed corn products. Can do.
  • the food / beverage products which processed the raw material containing the starch extracted by the said well-known method and a starch processed product are also contained.
  • processed rice products include, but are not limited to, cooked rice, rice cake, sake, amazake, and Japanese sweets made from rice flour.
  • processed wheat products include, but are not limited to, bread, noodles, Chinese buns and dumpling skin, visa dough, pie dough, baked confectionery, fresh confectionery, and the like.
  • processed barley products include, but are not limited to, beer and beer-like beverages.
  • potato processed products include, but are not limited to, mashed potatoes, french fries, hashed potatoes, gnocchi, potato chips and the like.
  • processed corn products include, but are not limited to, corn meal, corn flakes, corn whiskey and the like.
  • the present invention acts on a saccharide selected from the group consisting of ⁇ -type oligosaccharides and ⁇ -type polysaccharides, and is capable of producing a saccharide having continuous ⁇ -1,6 bonds. And the use of ⁇ -glucosidase having high stability over a wide range of pH.
  • ⁇ -type oligosaccharide refers to a disaccharide to 9-saccharide carbohydrate having an ⁇ -glucoside bond in the molecule.
  • ⁇ -type oligosaccharides include maltose, cordobiose, nigerose, isomaltose, trehalose, maltotriose, panose, isomaltotriose, maltotetraose, isomalttetraose, maltopentaose, maltohexaose, malto Examples include, but are not limited to, heptaose, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin and the like.
  • ⁇ -type polysaccharide refers to a saccharide of 10 or more sugars having an ⁇ -glucoside bond in the molecule.
  • ⁇ -type polysaccharides include, but are not limited to, glycogen, dextran, amylose, soluble starch and the like.
  • the ⁇ -glucosidase used in the present invention can generate a carbohydrate having continuous ⁇ -1,6 bonds.
  • a carbohydrate having a continuous ⁇ -1,6 bond refers to a carbohydrate containing two or more consecutive ⁇ -1,6 bonds in the molecule, in addition to a carbohydrate consisting of only an ⁇ -1,6 bond.
  • carbohydrates composed of ⁇ -1,6 bonds and other bonds are also included. Whether or not a carbohydrate has a continuous ⁇ -1,6 bond is determined by, for example, an evaluation method by dextranase degradation, NMR analysis method, methylation analysis method (Journal of Biochemistry 55, 205, 1964), etc. Judgment can be made.
  • the carbohydrate has a continuous ⁇ -1,6 bond.
  • the ⁇ -glucosidase used in the present invention can produce a saccharide having 4 or more sugars and 3 or more consecutive ⁇ -1,6 bonds.
  • the content of continuous ⁇ -1,6 bonds of 6 or more sugars is 5% or more, more preferably 8% or more, still more preferably Carbohydrates that are 10% or more can be produced.
  • the ⁇ -glucosidase used in the present invention is a thermostable enzyme having a residual activity of 90% or more even when kept at 50 ° C. for 1 hour.
  • the ⁇ -glucosidase used in the present invention can be obtained from, for example, a filamentous fungus belonging to the genus Aspergillus (hereinafter simply referred to as Aspergillus) as an enzyme having the following enzymatic chemical properties: (1) Action: Acts on a saccharide selected from the group consisting of an ⁇ -type oligosaccharide and an ⁇ -type polysaccharide to produce a saccharide having continuous ⁇ 1,6 bonds; (2) Substrate specificity: Acts on maltose, isomaltose, maltotriose, isomaltotriose, maltotetraose, isomalttetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose, amylose, soluble starch, dextran To do.
  • Aspergillus a filamentous fungus belonging to the genus Aspergillus
  • the ⁇ -glucosidase used in the present invention may be an enzyme further having the following enzymatic chemistry: (3) Molecular weight: 65,000 dalton and 76,000 dalton by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis; (4) Isoelectric point: pI 4.9 to 5.5 (central value 5.2); (5) Optimum temperature: pH 6.0, reaction for 30 minutes, 55 ° C .; (6) Optimal pH: pH 5.5 by reaction at 40 ° C. for 30 minutes; (7) Temperature stability: pH 6.0, hold for 1 hour, and remain at 90% or more of initial activity at 50 ° C .; (8) pH stability: retained at 4 ° C. for 24 hours, and at pH 6.0 to 10.0, 90% or more of the initial activity remained.
  • an Aspergillus genus belonging to Aspergillus section Flavi can be preferably used.
  • Aspergillus sojae, Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, etc. can be used as Aspergillus sojae, Aspergillus flavus (Aspergillus flavus, etc.).
  • Aspergillus nidulans can also be used suitably as an Aspergillus genus microbe for obtaining the alpha-glucosidase used by this invention.
  • the aforementioned Aspergillus spp. Is cultured using a known culture method such as liquid culture and solid culture, and an enzyme having ⁇ -glucosidase activity is collected from the culture by a known method and used in the present invention. ⁇ -Glucosidase can be obtained.
  • the carbon source of the medium used for culturing Aspergillus for example, glucose, fructose, sucrose, lactose, starch, glycerin, dextrin, lecithin and the like are used alone or in combination, and as the nitrogen source Any of organic and inorganic nitrogen sources can be used. Among them, for example, peptone, yeast extract, soybean, kinako, rice bran, corn steep liquor, meat extract, casein, amino acid, etc. are used as the organic nitrogen source.
  • the inorganic nitrogen source ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium phosphate, diammonium phosphate, ammonium chloride and the like are used.
  • examples of inorganic salts and micronutrients added to such a medium include sodium, magnesium, potassium, iron, zinc, calcium, manganese salts, vitamins, and the like.
  • natural products such as wheat bran, as a culture medium component containing said various components.
  • the culture of Aspergillus is generally carried out at a temperature of 10 to 40 ° C., but preferably a culture temperature of 25 to 30 ° C. is advantageously employed, and the medium pH may be 2.5 to 8.0. .
  • the required culture period varies depending on the cell concentration, medium pH, medium temperature, medium composition, etc., but is usually about 3 to 9 days, and when the target ⁇ -glucosidase reaches the maximum. Then, the culture is stopped.
  • ⁇ -glucosidase used in the present invention is recovered.
  • the activity of ⁇ -glucosidase used in the present invention is found in both the cells of the culture and the medium, and can be purified and used by a known method.
  • a crude enzyme solution obtained by concentrating a treated product of a culture solution is purified by collecting the fraction having a high glucosidase activity by column chromatography or the like, and then the purified fraction is purified by Native-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a single purified ⁇ -glucosidase can be obtained by subjecting to electrophoresis (for example, “PhasSystem” manufactured by GE Healthcare) and collecting and purifying a single band.
  • the present invention also provides the use of an ⁇ -glucosidase consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and having the above-mentioned enzymatic chemistry.
  • the present invention also relates to an ⁇ -glucosidase comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and comprising an ⁇ -type oligosaccharide and an ⁇ -type polysaccharide.
  • an ⁇ -glucosidase that acts on a carbohydrate selected from the group to produce a carbohydrate having a continuous ⁇ -1,6 linkage.
  • The% identity between two amino acid sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculation.
  • the percent identity can also be determined using a computer program. Examples of such computer programs include BLAST, FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)), and ClustalW (http://www.genome.jp/tools/clustalw /) Etc., and default parameters can be used.
  • BLAST Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)
  • ClustalW http://www.genome.jp/tools/clustalw /
  • Various conditions (parameters) for identity searches using the BLAST program are described in “Altschul et al. (Nucl. Acids. Res., 25, p. 3389-3402, 1997)”.
  • NCBI Genetic Information Center
  • DDBJ DNA Data Bank of Japan
  • GENETYX® genetic information processing software
  • DNASIS® Pro manufactured by Hitachi Software
  • Vector® NTI manufactured by Infomax
  • a specific alignment scheme that juxtaposes multiple amino acid sequences can also show a match of a specific short region of the sequence, so even if there is no significant relationship between the full length sequences of the sequences used, In such a region, a region having a very high specific sequence identity can also be detected.
  • the BLAST algorithm can use the BLOSUM62 amino acid scoring matrix, but the following can be used as selection parameters: (A) Segments of query sequences with low composition complexity (Wootton and Federhen's SEG program (ComputersCompand Chemistry, 1993); Wootton and Federhen, 1996 "Analysis ofpositionalpositionbiased regions in sequence databases” Methods Enzymol., 266: 544-71 Including filters to mask segments that consist of short-period internal repeats (determined by the XNU program of Claverie and States (Computers and Chemistry, 1993)), and (B) the database Statistics for reporting matches to sequences According to the statistical significance threshold, or E-score (Karlin and Altschul, 1990) statistical model, the expected probability of a match simply found by chance; the statistical significance difference due to a match is the E-score threshold If it is larger, this match is not reported.
  • E-score Kerlin and Altschul, 1990
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 can be appropriately prepared by a known technique.
  • one or more proteins can be added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • 1 to 190, 1 to 90, 1 to 50, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, more preferably 10, 9, 8, 7, 6, (5, 4, 3, 2, or 1) amino acids can be prepared by deletion, substitution or addition.
  • substitution is preferably a conservative substitution.
  • a conservative substitution is the replacement of a particular amino acid residue with a residue having similar physicochemical characteristics, but any substitution that does not substantially change the structural characteristics of the original sequence.
  • any substitution may be made so long as the substituted amino acid does not destroy the helix present in the original sequence or other types of secondary structures characterizing the original sequence.
  • the conservative substitution is generally introduced by biological synthesis or chemical peptide synthesis, but preferably by chemical peptide synthesis.
  • the non-natural amino acid residue may be included in the substituent, and the reversed type or the same region in which the non-substituted region is reversed in the peptidomimetic or amino acid sequence is reversed. Inverted types are also included.
  • amino acid residues are classified and exemplified for each substitutable residue, but the substitutable amino acid residues are not limited to those described below.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine and cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid and 2-aminosuberic acid group
  • C asparagine and glutamine group
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid and 2,3-diaminopropionic acid group
  • E proline, 3 -Hydroxyproline and 4-hydroxyproline group
  • F serine, threonine and homos
  • amino acid substitution can be performed based on hydrophilicity.
  • stereoisomers of the above amino acids such as D-amino acids, unnatural amino acids such as ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids, N-alkyl amino acids, lactic acid, and other unconventional amino acids are also used in the present invention.
  • D-amino acids unnatural amino acids such as ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids, N-alkyl amino acids, lactic acid, and other unconventional amino acids
  • unnatural amino acids such as ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids, N-alkyl amino acids, lactic acid, and other unconventional amino acids are also used in the present invention.
  • a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.” (Cold Spring Harbor Press (2001)), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons (1987-1997), Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92, Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6 "etc., etc. It can be prepared according to a method such as site-directed mutagenesis.
  • a kit for mutation introduction using site-directed mutagenesis by a known method such as Kunkel method or Gapped duplex method, for example, QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site -Directed Mutagenesis System Gen Corp.), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: Takara Bio Inc.) and the like can be carried out using.
  • a gene can be used as a method for introducing a deletion, substitution, or addition of one or more amino acids into a protein amino acid sequence while retaining its activity. Examples thereof include a method of treating with a mutation source and a method of ligating after selectively cleaving a gene to remove, substitute or add selected nucleotides.
  • the protein notation used in this specification is based on the standard usage and the notation commonly used in the art, the left direction is the amino terminal direction, and the right direction is the carboxy terminal direction.
  • ⁇ -glucosidase described herein using techniques known in the art. For example, by targeting a region that is considered to be less important for the biological activity of the ⁇ -glucosidase used in the present invention, the structure of the protein used in the present invention is changed without impairing the biological activity. Can do. Appropriate regions in the protein molecule can be identified. Residues and regions conserved among similar proteins can also be identified. Furthermore, conservative amino acid substitutions may be made in regions believed to be important for the biological activity or structure of the protein used in the present invention without compromising biological activity and without adversely affecting the polypeptide structure of the protein. Can also be introduced.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 may be isolated from microorganisms such as Aspergillus having ⁇ -glucosidase activity, and is publicly available. Using a sequence database (for example, NCBI database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), search for a microorganism having an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, It may be isolated from the microorganism.
  • a nucleic acid encoding ⁇ -glucosidase is cloned from an Aspergillus genus, and consists of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 based on the nucleic acid. Protein may be obtained. Furthermore, as will be described later, using a publicly available sequence database (for example, NCBI database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), a nucleic acid encoding ⁇ -glucosidase is searched, and the nucleic acid is detected. Basically, a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 may be obtained.
  • the present inventors have a sequence represented by “DALWIDMNEPANX 1 X 2 X 3 ” in the amino acid sequence encoding ⁇ -glucosidase used in the present invention, wherein X 1 X 2 is an arbitrary amino acid, It has been found that it is important for X 3 to be an amino acid other than histidine, preferably arginine, in order to show the activity of producing a carbohydrate having a continuous ⁇ -1,6 bond.
  • X 1 is preferably tyrosine and X 2 is preferably asparagine. Therefore, the mutant of ⁇ -glucosidase used in the present invention may be any mutant as long as the above sequence is conserved and the above activity of ⁇ -glucosidase used in the present invention is not impaired.
  • a person skilled in the art identifies residues of peptides that are important for the biological activity or structure of the protein used in the present invention and are similar to the peptides of the proteins, and compares the amino acid residues of the two peptides.
  • a so-called structure-function study is conducted to predict which residues in a protein similar to the protein used in the present invention are amino acid residues corresponding to amino acid residues important for biological activity or structure. It can be carried out.
  • a mutant that retains the biological activity of the protein used in the present invention can be selected.
  • those skilled in the art can analyze the three-dimensional structure and amino acid sequence of the mutant of this protein.
  • amino acid residues predicted to be on the protein surface may be involved in important interactions with other molecules, but those skilled in the art will be able to do this based on the analysis results described above.
  • Mutants can be made that do not change the amino acid residues predicted to be on the surface of various proteins.
  • those skilled in the art can also produce mutants that substitute only one amino acid residue among the amino acid residues constituting the protein used in the present invention. Such mutants can be screened by known assay methods and information on individual mutants can be collected.
  • the present invention relates to the use of the above ⁇ -glucosidase in the production of foods and beverages that process raw materials containing polysaccharides.
  • the present invention also relates to a method for improving a food or drink comprising using the ⁇ -glucosidase in the production of a food or drink that processes a raw material containing a polysaccharide.
  • the aging of starch can be suppressed by the use and improvement method of the present invention, it is possible to provide a food or drink having an improved texture. Moreover, the food / beverage products containing many water-soluble dietary fiber can be provided.
  • ⁇ -glucosidase may be applied at any stage of the production of foods and beverages that process raw materials containing polysaccharides in consideration of the purpose or effect.
  • a raw material for food and drink that has been allowed to act on ⁇ -glucosidase may be subjected to subsequent manufacturing or processing steps.
  • a product obtained by allowing ⁇ -glucosidase to act on an intermediate product or an intermediate processed product of food or drink may be subjected to a subsequent manufacturing or processing step.
  • ⁇ -glucosidase may be added at the final stage of production or processing of food and drink so that the food and drink are used for consumer use.
  • the present invention also relates to a method for improving the quality of processed foods, including a step of adding a raw material containing starch or processed starch product with ⁇ -glucosidase to the processed food.
  • the processed food may be any food as long as it is obtained by subjecting the raw material to some processing, and examples thereof include, but are not limited to, livestock meat processed foods, marine processed foods, milk processed foods, seasonings, and the like.
  • the present invention also relates to a food / beverage improver produced by processing a raw material containing a polysaccharide, which contains the ⁇ -glucosidase.
  • the improving agent of the present invention may contain additional components such as excipients, preservatives, flavoring agents, antioxidants, vitamins and the like as long as the effect of the ⁇ -glucosidase is not impaired.
  • the improver of the present invention may contain 1 to 99% of the above ⁇ -glucosidase as a dry weight, may contain 5% to 80%, and may contain 10% to 50%.
  • the improving agent of the present invention can be used for various foods and drinks as an improving agent for the texture and physical properties of the foods and drinks after preparation and after sterilizing as necessary.
  • Method for analyzing enzyme activity ⁇ Method for analyzing ⁇ -glucosidase activity> The ⁇ -glucosidase activity of the enzyme was evaluated by hydrolysis activity using maltose as a substrate.
  • composition of oligosaccharides having ⁇ -1,2, ⁇ -1,3, ⁇ -1,4, ⁇ -1,6 bonds in the 2, 3, and 4 sugar components of the reaction product is as follows. Was analyzed with an amino column under the conditions of
  • Each peak was identified by comparing with the elution time of a standard sugar analyzed in advance under the same conditions, and the production amount was calculated from the peak area.
  • Standard sugar Commercial reagents were used for the disaccharides maltose, cordobiose, nigerose and isomaltose.
  • the trisaccharides maltotriose, isomaltotriose, and panose used commercially available reagents, and 3 2 -O- ⁇ -D-glucosyl-nigerose and 3 2 -O- ⁇ -D-glucosyl-maltose (Biochimica et Biophysica Acta). 1700, page 189, 2004).
  • NQAD detector manufactured by QUANT
  • Flow rate 0.4 mL / min
  • Dextranase L “Amano” (manufactured by Amano Enzyme) is known as an enzyme that degrades dextran, which is a continuous ⁇ -1,6-linked carbohydrate. It is known that a dextranase derived from a filamentous fungus which is a bacterium producing dextranase L “Amano” decomposes dextran to mainly produce isomaltose, isomaltotriose and a small amount of glucose (MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS Vol. 69, page 306, 2005).
  • dextranase L “Amano” acts on continuous ⁇ -1,6-linked carbohydrates (isomalt tetraose, isomaltopentaose, isomalthexaose, dextran) having 4 or more sugars. It was confirmed that components below sugar were produced. Therefore, whether or not a saccharide containing a continuous ⁇ 1,6 bond of 4 or more sugars is produced by causing the enzyme to act on the reaction product obtained by the action of the ⁇ -glucosidase used in the present invention. Examined.
  • reaction solution DS: solid content concentration 30%
  • 390 ⁇ L of 20 mM (pH 6.0) phosphate buffer were mixed, and 50 ° C.
  • the reaction was stopped by heat treatment at 100 ° C. for 10 minutes.
  • the polymerization degree distributions of the reaction solution not treated with dextranase and the reaction solution after treatment with dextranase were analyzed by the above-described ⁇ Method for Analyzing Polymerization Degree Distribution of Reaction Product>, respectively.
  • the amount of decrease ( ⁇ %) in the ratio of the tetrasaccharide or higher component in the reaction solution after the dextranase treatment to the ratio of the tetrasaccharide or higher component in the reaction solution not treated with dextranase is the continuous ⁇ -1 of tetrasaccharide or higher. , 6 bond content.
  • composition of the binding mode in the fraction of the reaction product was evaluated by a methylation analysis method (Journal of Biochemistry 55, 205, 1964). 3) Acquisition of ⁇ -glucosidase used in the present invention
  • ⁇ Definition of ⁇ -glucosidase gene sequence From the published genome sequence of Aspergillus sp., The identity of the agdC (Accession no. XP — 001825390) estimated to be ⁇ -glucosidase belonging to the GH31 family derived from Aspergillus oryzae is 90% or more. And was extracted from the genome sequence (Accession no. BACA00000000) of Aspergillus soja NBRC4239 strain (SEQ ID NO: 1). 4) Acquisition of genetically modified strain of putative ⁇ -glucosidase derived from NBRC4239 strain
  • ⁇ Extraction of chromosomal DNA> In a 50 mL tube, 5 mL of sterilized YPD medium was put, and Aspergillus soja NBRC4239 strain was inoculated and cultured at 30 ° C. for 24 hours. Then, the cultured cells were collected and chromosomal DNA was extracted with DNeasy Plant Mini Kit (manufactured by QIAGEN). The cells were crushed with a multi-bead shocker (manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.) after adding the AP1 buffer solution of the kit described above.
  • a primer set for obtaining a PCR product in which a 10-histidine tag was inserted before the stop codon of the defined gene sequence was designed.
  • PCR was performed using the above primer set.
  • the PCR product used In Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Clontech) from the promoter region of translation elongation factor TEF1 derived from Aspergillus oryzae RIB40 as a high expression promoter, and from the start codon of the gene sequence of this enzyme as a terminator
  • a vector was constructed by introducing it into pPTRII (manufactured by Takara Bio Inc.) digested with restriction enzymes KpnI and HindIII together with a region of 300 bp downstream.
  • the vector design is shown in FIG.
  • a protoplast-PEG method (Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 51, page 2549, 1987) was prepared using Aspergillus nidulans ATCC38163 as a host.
  • the primers used to amplify the promoter region, ⁇ -glucosidase gene, and terminator region of the translation elongation factor TEF1 derived from Aspergillus oryzae RIB40 are as follows.
  • Promoter F 5'-TGATTACGCCAAGCTTGATTTTCACTGTGGACCAGACA-3 ' Promoter
  • Terminator F (including histidine tag) 5'-GAGATTACGATTCTGCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACCACTGAATGATTTGGTTGGTGAGATAG-3 ' Terminator R 5'-GTGAATTCGAGCTCGGTACCAGGTGATGGAACGGAGTTTAA-3
  • the obtained cDNA was introduced into PCR2.1 TOPO (both manufactured by Invitrogen) using TOPO TA Cloning Kit, and then sequence analysis was performed to determine the full-length sequence of the cDNA (SEQ ID NO: 2, excluding the histidine tag portion). .
  • sequence analysis was performed to determine the full-length sequence of the cDNA (SEQ ID NO: 2, excluding the histidine tag portion).
  • amino acid sequence of this enzyme was determined from the obtained cDNA (SEQ ID NO: 3, excluding the histidine tag portion).
  • the amino acid sequence of the obtained enzyme is 99% identical to the sequence of agdC (Accession no. XP — 001825390), which is estimated to be ⁇ -glucosidase belonging to the GH31 family derived from Aspergillus oryzae, and GH31. Since the sequences in two conserved regions (PROSITE: PS00129, PS00707) shared by the family are completely identical to agdC, this enzyme is considered to belong to the GH31 family.
  • Ni-NTA affinity chromatography A sample obtained by passing a crude enzyme solution through a 0.2 ⁇ m filter is passed through His-Trap HP (GE Healthcare), and 20 mM containing 0.5 M NaCl and 500 mM imidazole. Elute with Tris buffer (pH 7.4). Thereby, the protein to which the histidine tag is added can be selectively recovered.
  • ⁇ Optimum temperature and pH> The effects of temperature and pH on the ⁇ -glucosidase activity of this enzyme were examined.
  • the enzyme activity was analyzed according to ⁇ Method for analyzing ⁇ -glucosidase activity>. The results are shown in FIG. 3 (effect of temperature) and FIG. 4 (effect of pH).
  • the optimum temperature of this enzyme was pH 6.0 at 55 ° C. for 30 minutes and the optimum pH was 5.5 at 40 ° C. for 30 minutes.
  • pH 3,0 to 5.0 is phthalate buffer
  • pH 5.5 to 7.0 is MES buffer
  • pH 7.5 to 8.0 is MOPS buffer
  • pH 9.0 to 11.0 used a CAPS buffer.
  • ⁇ Temperature stability, pH stability> The temperature and pH stability of the ⁇ -glucosidase activity of this enzyme were examined. The enzyme activity was analyzed according to ⁇ Method for analyzing ⁇ -glucosidase activity>. The results are shown in FIG. 5 (temperature stability) and FIG. 6 (pH stability). As for the temperature stability of this enzyme, the activity remained at 90% or more at 50 ° C. As for pH stability, the activity remained at 80% or more in the pH range of 4.5 to 10, and the activity remained at 90% or more in the pH range of 6.0 to 10.0.
  • Temperature stability was determined by holding an enzyme solution (containing 20 mM MES buffer, pH 6.0, 1 mM CaCl 2) at each temperature for 1 hour, cooling with ice water, and then evaluating the remaining enzyme activity.
  • the pH stability was determined by maintaining the enzyme solution (40 mM buffer solution at each pH) at 4 ° C. for 24 hours, adjusting the pH to 6.0, and then evaluating the remaining enzyme activity.
  • pH 2.0 to 5.0 is phthalate buffer
  • pH 6.0 to 7.0 is MES buffer
  • pH 8.0 is MOPS buffer
  • pH 9.0 to 12.0 Used CAPS buffer.
  • Disaccharides such as maltose, cordobiose, nigerose, isomaltose, and malto-oligosaccharides having a polymerization degree of 2 to 7, excluding maltotetraose, isomalt-oligosaccharides having a polymerization degree of 2 to 4, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, It worked well on amylose and soluble starch to produce glucose. In particular, an isomaltooligosaccharide having an ⁇ -1,6 bond and a degree of polymerization of 2 to 4 was the best substrate.
  • Maltotetraose and ⁇ -cyclodextrin were slightly less active. There was a slight reaction with trehalose, glycogen, and dextran.
  • This enzyme was slightly increased by calcium. Its activity was inhibited by zinc ion, copper ion and iron ion. The activity was also somewhat inhibited by sodium ions and EDTA.
  • Transglucosidase L “Amano” (manufactured by Amano Enzyme) 0.2 mL (1.8 U / mL), which is a commercially available enzyme preparation derived from the same genus Aspergillus (Aspergillus niger), with ⁇ -glucosidase as the main activity was added to 0.4 mL of 45% maltose solution (final concentration 30%), and the reaction was performed at 40 ° C. After the reaction for a predetermined time, the enzyme was inactivated by heating in a boiling bath for 10 minutes.
  • FIG. 7A shows the degree of polymerization distribution of the reaction product up to 72 hours after the start of the reaction
  • a trisaccharide component was generated with a decrease in the substrate maltose (DP2), and subsequently a component having a higher polymerization degree was increased.
  • DP2 substrate maltose
  • low molecular weight carbohydrates having both ⁇ -1,4 bonds and ⁇ -1,6 bonds panose, isomaltriosylglucose, hereinafter ⁇ -1,4 ⁇ 1 and 6-linked oligosaccharides
  • low molecular weight carbohydrates having only ⁇ -1,6 bonds isomaltose, isomaltotriose, isomalttetraose, hereinafter referred to as ⁇ -1,6-linked oligosaccharides
  • ⁇ -1,6-linked oligosaccharides isomaltose, isomaltotriose, isomalttetraose, hereinafter referred to as ⁇ -1,6-linked oligosaccharides
  • the molecular weight distribution 72 hours after the start of the reaction was 29.0% monosaccharide, 30.9% disaccharide, 25.9% trisaccharide, 14.2% over 4 sugars.
  • isomaltose which is a disaccharide is 20.8%
  • panose which is a trisaccharide is 10.0%
  • isomalt The triose was 11.1%
  • the tetrasaccharide isomaltotriosylglucose was 5.0%
  • the isomalttetraose was 2.8%.
  • FIG. 12 shows the change over time in the continuous ⁇ -1,6 bond content of tetrasaccharides or more of the reaction product up to 72 hours after the start of the reaction. By 72 hours after the start of the reaction, the content of continuous ⁇ -1,6 bonds over 4 sugars increased from 0% to 3%.
  • DP2 ⁇ Transfer of maltose (DP2) by crude enzyme solution derived from Aspergillus niger ATCC 10254>
  • a crude enzyme solution is obtained from Aspergillus niger ATCC10254 strain, which is known to secrete ⁇ -glucosidase into the crude enzyme solution, by the method described in Japanese Patent No. 4830031, and 0.2 mL (1.8 U) / ML) was added to 0.4 mL of 45% maltose solution (final concentration 30%) and the reaction was carried out at 40 ° C. After the reaction for a predetermined time, the enzyme was inactivated by heating in a boiling bath for 10 minutes.
  • the polymerization degree distribution of the obtained reaction product and the composition of the isomers of the 2, 3, and 4 sugar components are described in the above ⁇ Method for analyzing the polymerization degree distribution of reaction product> and ⁇ Isomer composition of reaction product> Analysis was performed by the method described in the section “Analysis method”. Further, the continuous ⁇ -1,6 bond content of tetrasaccharide or more of the reaction product was analyzed by the method described in ⁇ Method for Analyzing Continuous ⁇ -1,6 Bond Content of Reaction Product>.
  • the polymerization degree distribution is shown in FIG. 8A, and the isomer composition of the saccharide component is shown in FIG. 8B.
  • a trisaccharide component was generated with a decrease in the substrate maltose (DP2), and subsequently a component having a higher polymerization degree was increased.
  • DP2 substrate maltose
  • the isomeric composition of 2, 3, and 4 sugar components low-molecular-weight carbohydrates with ⁇ -1,3 bonds (hereinafter referred to as ⁇ 1,3 linked oligosaccharides) increase at the beginning of the reaction, and remain in equilibrium. It was done.
  • the molecular weight distribution at 72 hours after the start of the reaction was 29.2% monosaccharide, 31.0% disaccharide, 19.5% trisaccharide, 20.2% over 4 sugars. Further, among ⁇ -1,4,1,6-linked oligosaccharides or ⁇ -1,6-linked oligosaccharides, 3.2% of isomaltose which is a disaccharide was obtained and 1.3% of panose which was a trisaccharide was obtained. . Isomalt triose, isomalt triosyl glucose, and isomalt tetraose were not obtained.
  • FIG. 12 shows the change over time in the continuous ⁇ -1,6 bond content of tetrasaccharides or more of the reaction product up to 72 hours after the start of the reaction. By 72 hours after the start of the reaction, no increase in the continuous ⁇ -1,6 bond content over 4 sugars was observed.
  • the polymerization degree distribution of the obtained reaction product and the composition of the isomers of the 2, 3, and 4 sugar components are described in the above ⁇ Method for analyzing the polymerization degree distribution of reaction product> and ⁇ Isomer composition of reaction product> Analysis was performed by the method described in the section “Analysis method”. Further, the continuous ⁇ -1,6 bond content of tetrasaccharide or more of the reaction product was analyzed by the method described in ⁇ Method for Analyzing Continuous ⁇ -1,6 Bond Content of Reaction Product>. Furthermore, the proportion of ⁇ -1,6 bonds contained in the pentasaccharide component was analyzed by H-NMR according to the method of ⁇ Structural analysis of reaction product>.
  • the chromatogram of the polymerization degree distribution of the reaction product is shown in FIG. 9, and the chromatogram of the isomer composition is shown in FIG.
  • FIG. 11A shows the polymerization degree distribution and the isomer composition of the saccharide components in FIG. 11A for the time course of the reaction product up to 72 hours after the start of the reaction.
  • a trisaccharide component was generated with a decrease in the substrate maltose (DP2), and subsequently a component having a higher polymerization degree was increased.
  • DP2 substrate maltose
  • ⁇ -1,4,1,6 linked oligosaccharides and ⁇ -1,3 linked oligosaccharides increased at the beginning of the reaction, but then decreased.
  • ⁇ -1,6-linked oligosaccharides increased from the early stage to the middle stage of the reaction and were maintained in equilibrium.
  • the molecular weight distribution at 72 hours after the start of the reaction was 27.9% monosaccharide, 25.6% disaccharide, 18.4% trisaccharide, and 28.1% tetrasaccharide or more.
  • isomaltose which is a disaccharide is 17.8%
  • panose which is a trisaccharide is 2.7%
  • isomalt As a result, 10.8% of triose was obtained, 1.0% of isomalt triosylglucose, which is a tetrasaccharide, and 7.8% of isomalttetraose was obtained.
  • FIG. 12 shows the change over time in the continuous ⁇ -1,6 bond content of tetrasaccharides or more of the reaction product up to 72 hours after the start of the reaction.
  • the content of continuous ⁇ -1,6 bonds above 4 sugars increased to 14%.
  • the enzyme of the present invention is allowed to act on maltose, compared to the case where a crude enzyme solution derived from transglucosidase L “Amano” or Aspergillus niger ATCC 10254 strain is allowed to act, 4 or more sugars of the reaction product
  • the continuous ⁇ -1,6 bond content was significantly higher.
  • the pentasaccharide component was fractionated from the obtained reaction product and analyzed by H-NMR. 81% was contained (FIG. 13).
  • the ⁇ -1,6-linked component occupies most of the 2, 3, and 4 sugar components, and the components having 6 or more sugars are similarly ⁇ It is estimated that the ratio of -1,6 bonds is high. From the above, it was found that when the enzyme of the present invention was allowed to act on maltose, most of the produced carbohydrates were linked by ⁇ -1,6 bonds.
  • the polymerization degree distribution of the obtained reaction product was analyzed by the method described in the above ⁇ Method for analyzing polymerization degree distribution of reaction product>. Further, the continuous ⁇ -1,6 bond content of the reaction product was analyzed in accordance with the method described in ⁇ Method for analyzing continuous ⁇ -1,6 bond content of reaction product>.
  • the amount of decrease in the ratio of the components having 6 or more saccharides due to the dextranase treatment was regarded as the continuous ⁇ -1,6-bond content of 6 or more saccharides and evaluated over time.
  • FIG. 14 shows a chromatogram of the polymerization degree distribution of the reaction product 72 hours after the start of the reaction.
  • FIG. 15 shows the change over time in the content of components of 6 or more sugars up to 72 hours after the reaction starts.
  • the enzyme of the present invention is allowed to act on maltopentaose, compared to the case where a crude enzyme solution derived from transglucosidase L “Amano” or Aspergillus niger ATCC 10254 strain is allowed to act, The amount of components of 6 sugars or more was always large throughout the reaction time.
  • FIG. 16 shows the change with time of the continuous ⁇ -1,6 bond content of 6 sugars or more.
  • the continuous ⁇ -1,6 linkage content of 6 sugars or more increased to 13% by 72 hours after the start of the reaction.
  • the continuous ⁇ -1,6 bond content of 6 or more sugars was significantly higher.
  • the purified enzyme of the present invention was allowed to act on maltopentaose for 72 hours under the same reaction conditions as above, and the components of hexasaccharide or more were fractionated from the obtained reaction product, and the results of analysis by methylation analysis are shown in Table 4 below. Shown in Of the glucose constituting the reaction product other than the non-reducing end glucose, 62% contain ⁇ -1,6 bonds, and 30% contain only ⁇ -1,4 bonds. there were. From the analysis result of the reaction product obtained by acting on maltose as described above, it is clear that the enzyme of the present invention hardly undergoes ⁇ -1,4 transfer. Therefore, it is included in the reaction product of maltopentaose. The ⁇ -1,4 bond derived from the substrate maltopentaose was considered to be mostly ⁇ -1,6 bond in the newly generated bond mode in the transfer reaction.
  • the aspergillus oryzae RBD601-derived agdC and Aspergillus sojae NBRC 4239 point mutation-introducing enzymes have ⁇ -glucosidase activity but no continuous ⁇ -1,6 bonds. It was. The latter two enzymes were allowed to act on maltose, and the composition of isomers of 2, 3, and 4 sugar components was analyzed by the method described in ⁇ Method for analyzing isomer composition of reaction product>. The oligosaccharide content was small, and many oligosaccharides having ⁇ -1,3 or ⁇ -1,4 bonds were produced.
  • FIG. 17 shows the sequence from the conserved sequence in the vicinity of the active center to the downstream of 3 residues in various ⁇ -glucosidase sequences derived from the genus Aspergillus, and the presence or absence of continuous ⁇ -1,6 transfer activity of each ⁇ -glucosidase.
  • the gene sequence of the enzyme having continuous ⁇ -1,6 transfer activity all amino acids in the conserved sequence were identical.
  • X 1 X 2 is an arbitrary amino acid
  • X 3 is an amino acid other than histidine
  • a continuous ⁇ ⁇ -Glucosidase having the activity of producing a carbohydrate having a -1,6 bond is derived from Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae RIB1 mutant RIB1 enzyme was found from.
  • Aspergillus oryzae 3.042 strain and Aspergillus flavus NRRL 3357 strain have sequences predicted to be enzymes belonging to the GH31 family on the genomic sequence (Accession no. EIT77388, and Accession no. XP — 002380576).
  • the amino acid sequences of these enzymes are 98% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and an enzyme having an activity to produce a carbohydrate having continuous ⁇ -1,6 bonds is obtained. Presumed to be produced.
  • Aspergillus oryzae and Aspergillus flavus, as well as Aspergillus sojae belong to the Aspergillus species Flavi section (Aspergillus section v).
  • Penicillium chrysogenum (Penicillium chrysogenum) is on the database, Nectria-Hematokokka (Nectria haematococca), Stachybotrys, Kuroroharonata (Stachybotrys chlorohalonata), Stachybotrys, Karutarumu (Stachybotrys chartarum), Fusarium oxysporum (Fusarium oxysporum), Fusarium fujikuroi (Fusarium FU3 (Fujikuroi) and Fusarium verticilioides also have the sequence “DALWIDMNEPANF” in the vicinity of the active center, and 10 residues downstream of the active center is not histidine, GH3 Has an enzyme belonging to the family, these fungi, like ⁇ - glucosidase used in the present invention, is likely to produce an enzyme having a continuous alpha-1, 6-metastatic activity.
  • Aspergillus sojae derived from various Aspergillus genera when compared with the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3), genomic gene sequence (SEQ ID NO: 1), and cDNA sequence (SEQ ID NO: 2) of ⁇ -glucosidase derived from NBRC4239 strain The identity of the ⁇ -glucosidase sequence is as shown in Table 5 below. Since the genome sequence of the Aspergillus oryzae RIB601 strain was not decoded, the inventors analyzed the sequence of agdC derived from this strain (SEQ ID NO: 4). In addition, sequence identity was evaluated using the clustalW (http://www.genome.jp/tools/clustalw/) program.
  • ⁇ -glucosidase derived from NBRC4239 strain (hereinafter referred to as the present enzyme: Test Example 1) and transglucosidase L “Amano” (manufactured by Amano Enzyme, Inc., hereinafter also referred to as TGL, Comparative Example 1) were used.
  • the cooked rice (Reference example 1) cooked on the same conditions, without adding an enzyme as a control, was produced.
  • the purified enzyme obtained in ⁇ Purification of NBRC4239 strain-derived ⁇ -glucosidase> described in 5) of [Example 1] was used as this enzyme.
  • the activity of the added enzyme was defined by ⁇ Method for analyzing ⁇ -glucosidase activity> described in 1) of [Example 1].
  • the texture analyzer TA Using XT Plus (manufactured by Stable-Micro Systems, also referred to as TA hereinafter), the stress (N) due to 90% compression was measured under the conditions of a cylindrical plunger with a diameter of 20 mm, a plunger speed of 2 mm / s, and a load cell of 5 kg. The value was the hardness of one grain of rice. Ten grains were measured for each sample, and the average value was determined. The results are shown in FIG. The softness of the cooked rice was increased by adding this enzyme (Test Example 1) and TGL (Comparative Example 1) compared to no enzyme added (Reference Example 1). Further, in the comparison between the present enzyme (Test Example 1) and the addition of TGL (Comparative Example 1), the result of the present enzyme was softer. From these results, by adding this enzyme, cooked rice with a soft and preferable texture can be obtained.
  • the purified enzyme obtained in ⁇ Purification of NBRC4239 strain-derived ⁇ -glucosidase> described in 5) of [Example 1] was used as this enzyme.
  • the activity of the added enzyme was defined by ⁇ Method for analyzing ⁇ -glucosidase activity> described in 1) of [Example 1].
  • the prepared rice cakes were measured for 20 g each in plastic petri dishes, molded and then allowed to cool to room temperature, and then stored at 4 ° C. for 24 hours.
  • TA was used, a cylindrical plunger with a diameter of 40 mm, a plunger speed of 2 mm / s, and a load cell of 5 kg. N) was measured and the value was taken as the hardness.
  • Ten points were measured for each sample, and the average value was determined. The results are shown in FIG.
  • the purified enzyme obtained in ⁇ Purification of NBRC4239 strain-derived ⁇ -glucosidase> described in 5) of [Example 1] was used as this enzyme.
  • the activity of the added enzyme was defined by ⁇ Method for analyzing ⁇ -glucosidase activity> described in 1) of [Example 1].
  • the obtained amazake was centrifuged to collect the supernatant, and the water-soluble dietary fiber content in the liquid was determined by enzyme-HPLC method (AOAC 2001.03). The results are shown in Table 7.
  • the content of water-soluble dietary fiber in the obtained amazake was 0.4% in the enzyme-free group (Reference Example 3), but this enzyme 0.3 U added group (Test Example 3), 1.5 U added. In the ward (Test Example 4), the number significantly increased. Moreover, when this enzyme (Test Examples 3 and 4) and TGL (Comparative Examples 3 and 4) were compared, the water-soluble dietary fiber content was higher when this enzyme was added. From these results, amazake with an increased amount of water-soluble dietary fiber can be obtained by adding this enzyme.
  • the water-soluble dietary fiber content was 0.3% in the enzyme-free group (Reference Example 4). On the other hand, the water-soluble dietary fiber content was significantly increased in the 2.5 U addition group (Test Example 5). Moreover, the change of water-soluble dietary fiber content was not seen in the TGL addition area (comparative example 5).
  • the purified enzyme obtained in ⁇ Purification of NBRC4239 strain-derived ⁇ -glucosidase> described in 5) of [Example 1] was used as this enzyme.
  • the activity of the added enzyme was defined by ⁇ Method for analyzing ⁇ -glucosidase activity> described in 1) of [Example 1].
  • the prepared bread was allowed to cool to room temperature, stored at 25 ° C. for 1 day and 2 days, sliced to a thickness of 10 mm, and the physical properties were measured by cutting the crumb portion into a 33 mm square.
  • SUN RHEO METER COMPAC-100II manufactured by SUNSSCIENTIFIC was used, and the stress when compressed to a thickness of 5mm was measured under the conditions of a flat plunger with a diameter of 40mm and a gantry speed of 60mm / min. did. Ten points were measured for each sample, and the average value was determined. The results are shown in FIG.
  • the purified enzyme obtained in ⁇ Purification of NBRC4239 strain-derived ⁇ -glucosidase> described in 5) of [Example 1] was used as this enzyme.
  • the activity of the added enzyme was defined by ⁇ Method for analyzing ⁇ -glucosidase activity> described in 1) of [Example 1].
  • Water-soluble dietary fiber content was 0.8% in the enzyme-free group (Reference Example 6), but markedly increased in the 1U-added group (Test Example 7) and 5U-added group (Test Example 8). did. Moreover, when this enzyme (Test Examples 7 and 8) and TGL (Comparative Examples 7 and 8) were compared, the water-soluble dietary fiber content was higher when this enzyme was added. In the production of beer, there is a fermentation process using brewer's yeast after the saccharification process, which is the aforementioned process. Since dietary fiber is not assimilated by brewer's yeast, beer with an increased amount of water-soluble dietary fiber can be obtained by adding this enzyme.
  • Water-soluble dietary fiber content was 1.2% in the enzyme-free group (Reference Example 7), but markedly increased in the enzyme 1U-added group (Test Example 9) and 5U-added group (Test Example 10). . Moreover, when this enzyme (Test Examples 9 and 10) and TGL (Comparative Examples 9 and 10) were compared, the content of water-soluble dietary fiber was higher when this enzyme was added. From these results, it is possible to increase the amount of water-soluble dietary fiber by adding this enzyme regardless of the malt compounding ratio.
  • This enzyme was prepared from an enzyme solution obtained by culturing the NBRC4239 strain.
  • the production method and purification method of the enzyme solution are shown below.
  • the obtained crude enzyme solution was filtered through a 0.2 ⁇ m filter and subjected to anion exchange chromatography.
  • the separation resin was TOYOPEARL DEAE-650M (manufactured by Tosoh Corporation), and the amount of resin (hereinafter referred to as CV) was 100 mL. Wash with 500 mL of 20 mM Tris buffer (pH 7.4) containing 0.12 M sodium chloride and elute with 500 mL of 20 mM Tris buffer (pH 7.4) containing 0.22 M sodium chloride to collect fractions with high dextran degradation activity did.
  • the collected fraction was replaced with 20 mM Tris buffer (pH 7.4) by ultrafiltration, and again subjected to anion exchange chromatography.
  • As the separation resin HiLoad 26/10 Q Sepharose HP (manufactured by GE Healthcare) was used.
  • elution was performed with a linear concentration gradient (20 CV) of 0 to 0.5 M sodium chloride, and a fraction having a high dextran decomposition activity was collected.
  • the collected fractions are concentrated by ultrafiltration, replaced with 20 mM phosphate buffer (pH 6.0), and separated by Hiload 16/60 Superdex Pregrade (manufactured by GE Healthcare), and fractions with high dextran decomposition activity And purified enzyme was obtained. The obtained purified enzyme was used as this enzyme.
  • Dextran degradation activity was determined by mixing 50 ⁇ L of a 2% dextran solution (20 mM MES buffer: pH 6.0) and 50 ⁇ L of an enzyme solution diluted with the same buffer, followed by reaction at 40 ° C. for 30 minutes, followed by 10% oxalic acid The reaction was stopped by adding 1 ⁇ L of the solution and heating at 100 ° C. for 10 minutes. The amount of glucose produced in the reaction solution was measured with Glucose CII Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries). The amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of glucose per minute was defined as 1 U.
  • Table 13 shows the results of purification at each stage.
  • the purified enzyme thus obtained was subjected to the methods described in 7) ⁇ Transfer of maltose (DP2) by purified enzyme derived from NBRC4239 strain> and ⁇ Transfer of maltopentaose (DP5)> in [Example 1].
  • DP2 ⁇ Transfer of maltose
  • DP5 ⁇ Transfer of maltopentaose
  • the activity of the enzyme added to udon was defined by ⁇ Method for analyzing ⁇ -glucosidase activity> described in 1) of [Example 1].
  • the prepared mashed potatoes were evaluated for moist feeling and softness immediately after preparation and after standing at 25 ° C. for 2 hours. The results are shown in Table 15. The evaluation was made by the number of respondents who sampled 10 subjects and answered that they were good against the additive.
  • the mashed potatoes immediately after the preparation had a moist feeling and softness increased with the addition of this enzyme (Test Example 12) and TGL (Comparative Example 12), compared to the case where no enzyme was added (Reference Example 9).
  • the enzyme (Test Example 12) and TGL (Comparative Example 12) addition groups were compared, no difference in texture was observed. However, a more preferable result was obtained when the enzyme was added after standing for 2 hours. From these results, by adding this enzyme, it is possible to obtain mashed potatoes that have a good texture immediately after production, a moist feeling, and a soft texture.
  • the produced enzyme-treated starch was evaluated for aging with a solid content of 6% using RVA4500 (manufactured by Perten Instruments). It processed on the conditions shown in FIG. 21, and the setback value (The difference of final viscosity and the minimum viscosity after gelatinization) was computed. The results are shown in FIG.
  • the obtained enzyme-treated starch can also be used as a raw material for starch-containing foods.
  • a processed livestock meat product having the composition shown in Table 16 and a processed fishery food product having the composition shown in Table 17 were produced to obtain good products.
  • an enzyme may be added during the manufacturing process of a starch containing foodstuff, and enzyme-processed starch may be produced

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Abstract

　多糖類を含む原料を加工して飲食品を製造するための、α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成するα－グルコシダーゼの使用を提供する。また、前記α－グルコシダーゼを使用することを含む飲食品の改良方法、前記α－グルコシダーゼを含む飲食品の改良剤を提供する。アスペルギルス属に属する菌の一種であるアスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）に存在するα－グルコシダーゼが、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する高い活性を有すること、このα－グルコシダーゼを用いて製造した飲食品は、冷めても食感が良好であり、保存しても食感が良好に保たれること、及び、このα－グルコシダーゼが高い耐熱性を示すことを見出した。

Description

新規α－グルコシダーゼの用途
　多糖類を含む原料を加工して飲食品を製造するための新規α－グルコシダーゼの用途に関する。さらに詳しくは、多糖類を含む原料を加工して飲食品を製造するための、α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成するα－グルコシダーゼの使用に関する。また、前記α－グルコシダーゼを使用することを含む飲食品の改良方法、前記α－グルコシダーゼを含む飲食品の改良剤に関する。
　食感は、食品の品質や価値に大きな影響を及ぼす。また、近年、食品の健康機能に対する消費者の要求も大きくなっている。多糖類を含む原料を加工して製造する飲食品において、その食感や健康機能性に大きな影響を及ぼす要因の１つに、飲食品に含まれる糖の結合様式とその割合がある。
　たとえば澱粉は、α－１，４結合によってグルコースが直鎖状に結合したアミロースと、α－１，４結合が連なった直鎖の途中でα－１，６結合で分岐した構造を有するアミロペクチンとの混合物である。澱粉に水を加えて加熱すると糊化して、飲食品として利用した場合に食感が向上する。しかし、糊化澱粉を冷却すると、澱粉の組織から水が分離してしまい、「澱粉の老化」と呼ばれる現象が生じる。米飯やパンなどの澱粉を含む食品の食感が、冷めると固くなるのは、澱粉の老化が原因であると考えられている。
　澱粉の老化を抑制する方法として酵素の使用が提案されており、澱粉の老化を抑制することにより保存性を高めるなどの効果が得られる。糖転移活性を有するα－グルコシダーゼとして知られている、主に基質よりも重合度が１つ大きい糖質を生成するトランスグルコシダーゼ（アスペルギルス・ニジュール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）由来のα－グルコシダーゼ）を、例えば、米飯、米麺、パン、うどん、ポテトサラダ（特許文献１）、畜肉・水産加工食品（特許文献２）、改質澱粉（特許文献３）の製造に使用することが提案されている。しかしながら、いずれも得られた飲食品の食感改良効果が低く、品質の良い食品を製造するには不十分であった。
　また、α－１，６結合を多く有する分岐オリゴ糖や、水溶性食物繊維は、消化酵素によって分解されにくい一方、腸内細菌によって資化されやすいため、整腸作用等の健康機能性が期待される。清酒醸造に際して、α－アミラーゼ、上述したトランスグルコシダーゼおよび、酸性プロテアーゼを添加することにより、非発酵性オリゴ糖を主として含むことを特徴とする清酒の製造方法が提案されている（特許文献４）。　
　連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する酵素としては、主に細菌由来の酵素が知られており、デキストリンデキストラナーゼ（特許文献５、６、７、８）、α－グルカノトランスフェラーゼ（特許文献９）、デキストラングルカナーゼ（特許文献１０）等がある。しかしながら、いずれも耐熱性や、ｐＨの変動に対する安定性が低く、工業的な飲食品の製造に使用するためには不十分であった。飲食品を工業的に製造する場合、衛生上の理由により、高い温度使用できる酵素が求められている。また、種々の飲食品の製造に使用するために、幅広いｐＨ下でも活性が失われない酵素が求められている。
ＷＯ２００５／０９６８３９ ＷＯ２００８／１５６１２６ ＷＯ２０１１／０２１３７２ 特公昭６２－１０６３５ 特開平４－２９３４９３ 特開平５－２３６９８２ 特開２００１－２５８５８９ ＷＯ２００６／０５４４７４ 特表２０１２－５２５８４０ 特開２０１２－９５６０６
　本発明の課題は、多糖類を含む原料を加工して飲食品を製造するための、α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成するα－グルコシダーゼの使用を提供することである。また、前記α－グルコシダーゼを使用することを含む飲食品の改良方法、前記α－グルコシダーゼを含む飲食品の改良剤を提供することである。
　本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する菌の一種であるアスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）に存在するα－グルコシダーゼが、種々のα型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類に作用して、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する高い活性を有することを見出した。また、このα－グルコシダーゼを用いて製造した、多糖類を含む原料を加工した飲食品は、冷めても食感が良好であり、保存しても食感が良好に保たれることを見出した。さらに、このα－グルコシダーゼを用いて製造した、多糖類を含む原料を加工して製造した飲食品は、水溶性食物繊維の含有量が多いものであることを見出した。そして、このα－グルコシダーゼを５０℃において１時間保持しても、９０％以上が残存するという高い耐熱性を示し、さらに、ｐＨ４．５～１０において１時間保持しても、８０％以上が残存し、ｐＨ６～１０では９０％以上が残存するという高いｐＨ安定性を示すことを見出した。
　すなわち、本発明は、限定されるものではないが、以下に関する。
［１］
　多糖類を含む原料を加工して飲食品を製造するためのα－グルコシダーゼの使用であって、ここでα－グルコシダーゼはα型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成するものである、使用。
［２］
　多糖類が澱粉または澱粉加工品である、［１］に記載の使用。
［３］
　飲食品が米加工品である、［１］または［２］に記載の使用。
［４］
　飲食品が小麦加工品である、［１］または［２］に記載の使用。
［５］
　飲食品が大麦加工品である、［１］または［２］に記載の使用。
［６］
　飲食品がじゃがいも加工品である、［１］または［２］に記載の使用。
［７］
　α－グルコシダーゼが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌由来のα－グルコシダーゼであって、以下の酵素化学的性質：
（１）作用：α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する；
（２）基質特異性：マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、可溶性澱粉、デキストランに作用する；
を有し、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する、α－グルコシダーゼである、［１］～［６］のいずれかに記載の使用。
［８］
　α－グルコシダーゼが、以下の酵素化学的性質をさらに有するものである、［７］に記載の使用：
（３）分子量：ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６５，０００ダルトンおよび７６，０００ダルトン；
（４）等電点：ｐＩ４．９～５．５（中心値５．２）
（５）至適温度：ｐＨ６．０、３０分間反応で、５５℃；
（６）至適ｐＨ：４０℃、３０分間反応で、ｐＨ５．５；
（７）温度安定性：ｐＨ６．０、１時間保持で、５０℃では初期活性の９０％以上の残存；
（８）ｐＨ安定性：４℃、２４時間保持で、ｐＨ６．０～１０．０では初期活性の９０％以上の残存。
［９］
　多糖類を含む原料を加工して製造する飲食品の製造において、α－グルコシダーゼを使用することを含む飲食品の改良方法であって、ここでα－グルコシダーゼはα型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成するものである、方法。
［１０］
　多糖類を含む原料が澱粉または澱粉加工品を含有するものである、［９］に記載の方法。
［１１］
　飲食品が米加工品である、［９］または［１０］に記載の方法。
［１２］
　飲食品が小麦加工品である、［９］または［１０］に記載の方法。
［１３］
　飲食品が大麦加工品である、［９］または［１０］に記載の方法。
［１４］
　飲食品がじゃがいも加工品である、［９］または［１０］に記載の方法。
［１５］
　α－グルコシダーゼが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌由来のα－グルコシダーゼであって、以下の酵素化学的性質：
（１）作用：α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する；
（２）基質特異性：マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、可溶性澱粉、デキストランに作用する；
を有し、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する、α－グルコシダーゼである、［９］～［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］
　α－グルコシダーゼが、以下の酵素化学的性質をさらに有するものである、［１５］に記載の方法：
（３）分子量：ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６５，０００ダルトンおよび７６，０００ダルトン；
（４）等電点：ｐＩ４．９～５．５（中心値５．２）
（５）至適温度：ｐＨ６．０、３０分間反応で、５５℃；
（６）至適ｐＨ：４０℃、３０分間反応で、ｐＨ５．５；
（７）温度安定性：ｐＨ６．０、１時間保持で、５０℃では初期活性の９０％以上の残存；
（８）ｐＨ安定性：４℃、２４時間保持で、ｐＨ６．０～１０．０では初期活性の９０％以上の残存。
［１７］
　澱粉または澱粉加工品を含有する原料をα－グルコシダーゼで処理したものを加工食品に添加する工程を含む、加工食品の品質の改良方法であって、ここでα－グルコシダーゼはα型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成するものである、方法。
［１８］
　加工食品が畜肉加工食品または水産加工食品である、［１７］に記載の方法。
［１９］
　α－グルコシダーゼが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌由来のα－グルコシダーゼであって、以下の酵素化学的性質：
（１）作用：α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する；
（２）基質特異性：マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、可溶性澱粉、デキストランに作用する；
を有し、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する、α－グルコシダーゼである、［１７］または［１８］に記載の方法。
［２０］
　α－グルコシダーゼが、以下の酵素化学的性質をさらに有するものである、［１９］に記載の方法：
（３）分子量：ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６５，０００ダルトンおよび７６，０００ダルトン；
（４）等電点：ｐＩ４．９～５．５（中心値５．２）
（５）至適温度：ｐＨ６．０、３０分間反応で、５５℃；
（６）至適ｐＨ：４０℃、３０分間反応で、ｐＨ５．５；
（７）温度安定性：ｐＨ６．０、１時間保持で、５０℃では初期活性の９０％以上の残存；
（８）ｐＨ安定性：４℃、２４時間保持で、ｐＨ６．０～１０．０では初期活性の９０％以上の残存。
［２１］
　α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成するα－グルコシダーゼを含む、多糖類を含む原料を加工して製造する飲食品の改良剤。
［２２］
　α－グルコシダーゼが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌由来のα－グルコシダーゼであって、以下の酵素化学的性質：
（１）作用：α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する；
（２）基質特異性：マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、可溶性澱粉、デキストランに作用する
を有し、かつ、α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する、α－グルコシダーゼである、［２１］に記載の改良剤。
［２３］
　α－グルコシダーゼが、以下の酵素化学的性質をさらに有するものである、［２２］に記載の改良剤：
（３）分子量：ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６５，０００ダルトンおよび７６，０００ダルトン；
（４）等電点：ｐＩ４．９～５．５（中心値５．２）
（５）至適温度：ｐＨ６．０、３０分間反応で、５５℃；
（６）至適ｐＨ：４０℃、３０分間反応で、ｐＨ５．５；
（７）温度安定性：ｐＨ６．０、１時間保持で、５０℃では初期活性の９０％以上の残存；
（８）ｐＨ安定性：４℃、２４時間保持で、ｐＨ６．０～１０．０では初期活性の９０％以上の残存。
　本発明のα－グルコシダーゼの使用により、多糖類を含む原料を加工する飲食品の製造において、得られた飲食品の食感を改善することが可能になる。さらに、本発明のα－グルコシダーゼの使用により、澱粉の老化を抑制することができるため、改善された食感が、製造後時間が経過しても維持される飲食品の提供が可能となる。
また、本発明のα－グルコシダーゼの使用により、水溶性食物繊維の含有量が増加した飲食品の提供が可能となる。
　　さらに、本発明で使用するα－グルコシダーゼは、５０℃という高温においても高い残存活性を維持することができるため、高温での工業的な飲食品の製造や加工が可能となる。また、本発明で使用するα－グルコシダーゼは、ｐＨ４．５～１０においても高い残存活性を維持することができるため、幅広い範囲のｐＨでの工業的な飲食品の製造や加工が可能となる。
図１は、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）　ＮＢＲＣ４２３９株由来推定α－グルコシダーゼ遺伝子を組み込んだプラスミドベクターの構造を示す。 図２は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼの精製画分をＮａｔｉｖｅ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果（左のパネル）およびＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果（右のパネル）を示す。 図３は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼの酵素活性に対する温度の影響を示す。 図４は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼの酵素活性に対するｐＨの影響を示す。 図５は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼの酵素活性の温度安定性を示す。 図６は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼの酵素活性のｐＨ安定性を示す。 図７Ａは、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」をマルトースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの反応生成物の重合度分布の経時変化を示す。 図７Ｂは、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」をマルトースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの反応生成物の２、３、４糖成分の異性体組成の経時変化を示す。 図８Ａは、アスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　ＡＴＣＣ１０２５４株から特許第４８３００３１号に記載の方法で取得した粗酵素液をマルトースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの反応生成物の重合度分布の経時変化を示す。 図８Ｂは、アスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　ＡＴＣＣ１０２５４株から特許第４８３００３１号に記載の方法で取得した粗酵素液をマルトースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの反応生成物の２、３、４糖成分の異性体組成の経時変化を示す。 図９は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼをマルトースに反応させた場合の、反応後７２時間における反応生成物の重合度分布のクロマトグラムを示す。 図１０は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼをマルトースに反応させた場合の、反応後７２時間における反応生成物の異性体組成のクロマトグラムを示す。 図１１Ａは、ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼをマルトースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの反応生成物の重合度分布の経時変化を示す。 図１１Ｂは、ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼをマルトースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの反応生成物の２、３、４糖成分の異性体組成の経時変化を示す。 図１２は、各酵素をマルトースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの、反応生成物の４糖以上の連続α１，６結合含有量の経時変化を示す。 図１３は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼをマルトースに７２時間反応させ、得られた反応生成物から５糖成分を分画し、Ｈ－ＮＭＲで解析した結果を示す。 図１４は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼをマルトペンタオースに反応させた場合の、反応後７２時間における反応生成物の重合度分布のクロマトグラムを示す。 図１５は、各酵素をマルトペンタオースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの６糖以上成分含有量の経時変化を示す。 図１６は、各酵素をマルトペンタオースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの６糖以上の連続α－１，６結合含有量の経時変化を示す。 図１７は、ＧＨ３１ファミリーに属する種々の酵素の、活性中心付近の保存配列から３残基下流までの配列を比較したものを示す。 図１８は、米飯に酵素を添加した場合の効果を示す。 図１９は、もちに酵素を添加した場合の効果を示す。 図２０は、パンに酵素を添加した場合の効果を示す。 図２１は、澱粉の老化性測定条件を示す。 図２２は、酵素処理澱粉の老化性の評価を示す。
＜多糖類を含む原料＞
　本発明は、多糖類を含む原料を加工して飲食品を製造するためのα－グルコシダーゼの使用に関する。
　本発明において、多糖類とは、分子内にグルコシド結合を有する１０糖以上の糖質をいう。
　本発明において、多糖類を含む原料は、多糖類を含むものであれば特に限定されないが、たとえば澱粉を含有する原料であることができる。澱粉を含有する原料としては、特に限定されないが、米、小麦、大麦、じゃがいも等、さらに、これらの原料から公知の方法で抽出した澱粉などがあげられる。公知の方法で抽出した澱粉の例としては、特に限定されないが、米澱粉、小麦澱粉、馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、コーンスターチ等が挙げられる。澱粉加工品を含有する原料としては、抽出した澱粉に物理的処理または化学的処理または酵素的処理を、単独または２種以上組合せて行った加工澱粉等が挙げられる。物理的に処理した加工澱粉の例としては、α化澱粉、湿熱処理澱粉等が挙げられ、化学的に処理した加工澱粉の例としては、ヒドロキシプロピル澱粉等のエーテル化誘導体、酢酸澱粉等のエステル化誘導体、リン酸架橋澱粉等の架橋誘導体等が挙げられる。
＜飲食品＞
　本発明において、飲食品は、多糖類を含む原料を加工し製造するものであれば特に限定されないが、たとえば米加工品、小麦加工品、大麦加工品、じゃがいも加工品、コーン加工品を挙げることができる。また、前記の公知の方法で抽出した澱粉や澱粉加工品を含有する原料を加工した飲食品も含まれる。米加工品の例としては、米飯、もち、清酒、甘酒、米粉を原料とする和菓子等を挙げることができるが、これらに限定されない。小麦加工品の例としては、パン、麺、中華饅頭や餃子の皮、ビザ生地、パイ生地、焼菓子、生菓子等を挙げることができるが、これらに限定されない。大麦加工品の例としては、ビール、ビール様飲料等が挙げられるが、これらに限定されない。じゃがいも加工品の例としては、マッシュポテト、フライドポテト、ハッシュドポテト、ニョッキ、ポテトチップス等が挙げられるが、これらに限定されない。コーン加工品の例としては、コーンミール、コーンフレーク、コーンウィスキー等が挙げられるが、これらに限定されない。
＜α－グルコシダーゼ＞
　本発明は、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成することのできる、耐熱性および幅広い範囲のｐＨに対する安定性が高いα－グルコシダーゼの使用等に関する。
　本発明において、α型のオリゴ糖類とは、分子内にα－グルコシド結合を有する２糖～９糖の糖質をいう。α型のオリゴ糖類の例としては、マルトース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、トレハロース、マルトトリオース、パノース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、α－サイクロデキストリン、β－サイクロデキストリン、γ－サイクロデキストリン等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明において、α型の多糖類とは、分子内にα－グルコシド結合を有する１０糖以上の糖質をいう。α型の多糖類の例としてはグリコーゲン、デキストラン、アミロース、可溶性澱粉等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明で使用するα－グルコシダーゼは、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成することができる。連続するα－１，６結合を有する糖質とは、分子内にα－１，６結合を連続して２個所以上含む糖質をいい、α－１，６結合のみからなる糖質のほか、α－１，６結合とそれ以外の結合とからなる糖質も含む。糖質が連続するα－１，６結合を有するかどうかは、たとえば、デキストラナーゼ分解による評価法、ＮＭＲ分析法、メチル化分析法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　第５５巻　第２０５項　１９６４年）等によって判断することができる。具体的には、実施例に示す方法により、糖質が連続するα－１，６結合を有するかどうかを判断することができる。本発明で使用するα－グルコシダーゼは、４糖以上の糖質であって３つ以上の連続するα－１，６結合を有する糖質を生成することもできる。また、本発明で使用するα－グルコシダーゼは、マルトペンタオースに作用させると、６糖以上の連続するα－１，６結合の含有量が５％以上、より好ましくは８％以上、さらに好ましくは１０%以上である糖質を生成することができる。
　本発明で使用するα－グルコシダーゼは、５０℃で１時間保持しても９０％以上の残存活性を有する耐熱酵素である。
　本発明で使用するα－グルコシダーゼは、たとえばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する糸状菌（以下、単にアスペルギルス属菌と表記する）から、以下の酵素化学的性質を有する酵素として得ることができる：
（１）作用：α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα１，６結合を有する糖質を生成する；
（２）基質特異性：マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、可溶性澱粉、デキストランに作用する。
　本発明で使用するα－グルコシダーゼは、以下の酵素化学的性質をさらに有する酵素であってもよい：
（３）分子量：ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６５，０００ダルトンおよび７６，０００ダルトン；
（４）等電点：ｐＩ４．９～５．５（中心値５．２）；
（５）至適温度：ｐＨ６．０、３０分間反応で、５５℃；
（６）至適ｐＨ：４０℃、３０分間反応で、ｐＨ５．５；
（７）温度安定性：ｐＨ６．０、１時間保持で、５０℃では初期活性の９０％以上の残存；
（８）ｐＨ安定性：４℃、２４時間保持で、ｐＨ６．０～１０．０では初期活性の９０％以上の残存。
　本発明で使用するα－グルコシダーゼを得るためのアスペルギルス属菌としては、アスペルギルス属フラビ節（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｅｃｔｉｏｎ　Ｆｌａｖｉ）に属するアスペルギルス属菌を好適に用いることができる。アスペルギルス属フラビ節（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｅｃｔｉｏｎ　Ｆｌａｖｉ）に属するアスペルギルス属菌としては、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ）等を好適に用いることができる。また、本発明で使用するα－グルコシダーゼを得るためのアスペルギルス属菌として、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）も好適に用いることができる。
　上記のアスペルギルス属菌を、液体培養および固体培養等の公知の培養方法を用いて培養し、その培養物から公知の方法によってα－グルコシダーゼ活性を有する酵素を採取することで、本発明で使用するα－グルコシダーゼを得ることができる。
　アスペルギルス属菌の培養に際して用いられる培地の炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、ショ糖、乳糖、澱粉、グリセリン、デキストリン、レシチン等が、単独で又は組み合わせて用いられ、また、窒素源としては、有機および無機の窒素源の何れもが利用可能であり、そのうち、有機窒素源としては、例えば、ペプトン、酵母エキス、大豆、きなこ、米ぬか、コーンスティープリカー、肉エキス、カゼイン、アミノ酸等が用いられ、一方、無機窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸二アンモニウム、塩化アンモニウム等が用いられることとなる。更に、そのような培地に添加される無機塩や微量栄養素としては、例えば、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、鉄、亜鉛、カルシウム、マンガンの塩類の他、ビタミン等を挙げることができる。また、上記の各種成分を含有する培地成分として小麦ふすま等の天然物を用いることも可能である。
　アスペルギルス属菌の培養は、一般に１０～４０℃の温度で行なわれるが、好ましくは２５～３０℃の培養温度が有利に採用され、更に、培地ｐＨは２．５～８．０であれば良い。そして、必要な培養期間は、菌体濃度、培地ｐＨ、培地温度、培地の構成等によって異なるが、通常、３日～９日程度であり、目的物であるα－グルコシダーゼが最大に達した頃に、その培養が停止される。
　このようにして、アスペルギルス属菌を培養した後、本発明で使用するα－グルコシダーゼを回収する。本発明で使用するα－グルコシダーゼの活性は、培養物の菌体と培地の両方に認められ、公知の方法によって精製して利用することができる。一例として、培養液の処理物を濃縮した粗酵素液を、カラムクロマトグラフィー等に供してグルコシダーゼ活性の高い画分を回収することによって精製し、続いて、精製画分をＮａｔｉｖｅ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（たとえばＧＥヘルスケア社製「ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ」）に供して単一バンドを回収して精製することにより、単一の精製されたα－グルコシダーゼを得ることができる。
＜α－グルコシダーゼのアミノ酸配列＞
　本発明はまた、配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、上記の酵素化学的性質を有するα－グルコシダーゼの使用を提供する。また、本発明は、α－グルコシダーゼであって、配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する、α－グルコシダーゼの使用も提供する。
　具体的には、配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％、９０％、さらに好ましくは９５％以上、より一層好ましくは、９７％（例えば、９８％、さらには、９９％）以上の同一性を有するアミノ酸配列等があげられる。
　２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性％を決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410（1990））、及びＣｌｕｓｔａｌＷ（http://www.genome.jp/tools/clustalw/）等があげられ、デフォルトのパラメーターを用いることができる。また、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、「Altschulら（Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）」に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）やDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894）。また、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ （ゼネティックス社製）、ＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフト社製）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｍａｘ社製）等のプログラムを用いて決定することもできる。
　複数のアミノ酸配列を並列させる特定のアラインメントスキームは、配列のうち、特定の短い領域のマッチングをも示すことができるため、用いた配列の全長配列間に有意な関係がない場合であっても、そのような領域において、特定の配列同一性が非常に高い領域を検出することもできる。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを用いることができるが、選択パラメーターとしては、以下のものを用いることができる：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（WoottonおよびFederhenのSEGプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；Wootton及びFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases）」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ClaverieおよびStates（Computers and Chemistry, 1993）のXNUプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、又はＥ－スコア（KarlinおよびAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ－スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない。
　配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、公知の手法によって適宜調製することができるが、たとえば配列番号３で示されるアミノ酸配列に１若しくは複数個（例えば１～１９０個、１～９０個、１～５０個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個）のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加して調製することができる。
　上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。
　保存的置換は、一般的には、生物学的合成や化学的ペプチド合成で導入されるが、好ましくは、化学的ペプチド合成による。この場合、置換基には、非天然アミノ酸残基が含まれていてもよく、ペプチド模倣体や、アミノ酸配列のうち、置換されていない領域が逆転している逆転型又は同領域が反転している反転型も含まれる。
　以下に、アミノ酸残基を置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニンおよびシクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸および２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギンおよびグルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸および２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリンおよび４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニンおよびホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニンおよびチロシン
　非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができるが、この場合は、本発明で使用するタンパク質の生物学的機能を保持するために、アミノ酸のヒドロパシー指数（ヒドロパシーアミノ酸指数）を考慮することが好ましい（Kyteら, J. Mol. Biol., 157:105-131（1982））。
　また、非保存的置換の場合は、親水性に基づいてアミノ酸の置換を行うことができる。
　本明細書および図面において、塩基やアミノ酸およびその略語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature に従うか、又は、例えば、Immunology--A Synthesis（第２版, E.S. GolubおよびD.R. Gren監修, Sinauer Associates，マサチューセッツ州サンダーランド(1991)）等に記載されているような、当業界で慣用されている略語に基づく。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。
　Ｄ－アミノ酸等の上記のアミノ酸の立体異性体、α,α－二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸、およびその他の非慣用的なアミノ酸もまた、本発明で使用するタンパク質を構成する要素となりうる。
　上述したように、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.」(Cold Spring Harbor Press (2001))、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons (1987-1997)、「Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6」等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。このようなアミノ酸の欠失、置換若しくは付加等の変異がなされた変異体の作製は、例えば、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
　なお、タンパク質のアミノ酸配列に、その活性を保持しつつ１又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加を導入する方法としては、上記の部位特異的変異誘発法の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、および遺伝子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチドを除去、置換若しくは付加した後に連結する方法があげられる。
　なお、本明細書で用いるタンパク質の表記法は、標準的用法および当業界で慣用されている標記法に基づき、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。
　当業者であれば、当業界で公知の技術を用いて、本明細書に記載したα－グルコシダーゼの適当な変異体を設計し、作製することができる。例えば、本発明で使用するα－グルコシダーゼの生物学的活性にさほど重要でないと考えられる領域をターゲティングすることにより、本発明で使用するタンパク質の生物学的活性を損なうことなくその構造を変化させることができる。タンパク質分子中の適切な領域を同定することができる。また、類似のタンパク質間で保存されている残基および領域を同定することもできる。さらに、本発明で使用するタンパク質の生物学的活性又は構造に重要と考えられる領域中に、生物学的活性を損なわず、かつ、タンパク質のポリペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を導入することもできる。
　また、配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、α－グルコシダーゼ活性を有するアスペルギルス属菌等の微生物から単離してもよいし、公開されている配列データベース（たとえばNCBIデータベースhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を用いて配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する微生物を検索し、その微生物から単離してもよい。また、後述するように、α－グルコシダーゼをコードする核酸をアスペルギルス属菌からクローニングし、その核酸をもとに、配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質を得てもよい。さらに、後述するように、公開されている配列データベース（たとえばNCBIデータベースhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を用いて、α－グルコシダーゼをコードする核酸を検索し、その核酸をもとに、配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質を得てもよい。
　本発明者らは、本発明で使用するα－グルコシダーゼをコードするアミノ酸配列中に「ＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦＸ１Ｘ２Ｘ3」で示される配列を有し、ここでＸ１Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ3はヒスチジン以外のアミノ酸、好ましくはアルギニンであることが、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する活性を示すために重要であることを見出した。ここで、Ｘ１はチロシンであり、Ｘ２はアスパラギンであることが好ましい。したがって、本発明で使用するα－グルコシダーゼの変異体は、上記の配列が保存され、かつ、本発明で使用するα－グルコシダーゼの上記活性が損なわれない限り、いかなる変異体でもよい。
　当業者であれば、本発明で使用するタンパク質の生物学的活性又は構造に重要であり、同タンパク質のペプチドと類似するペプチドの残基を同定し、この２つのペプチドのアミノ酸残基を比較して、本発明で使用するタンパク質と類似するタンパク質のどの残基が、生物学的活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基であるかを予測する、いわゆる、構造－機能研究を行うことができる。さらに、このように予測したアミノ酸残基の化学的に類似のアミノ酸置換を選択することにより、本発明で使用するタンパク質の生物学的活性が保持されている変異体を選択することもできる。また、当業者であれば、本タンパク質の変異体の三次元構造およびアミノ酸配列を解析することもできる。さらに、得られた解析結果から、タンパク質の三次元構造に関する、アミノ酸残基のアラインメントを予測することもできる。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるが、当業者であれば、上記したような解析結果に基づいて、このようなタンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基を変化させないような変異体を作製することができる。さらに、当業者であれば、本発明で使用するタンパク質を構成する各々のアミノ酸残基のうち、一つのアミノ酸残基のみを置換するような変異体を作製することもできる。このような変異体を公知のアッセイ方法によりスクリーニングし、個々の変異体の情報を収集することができる。それにより、ある特定のアミノ酸残基が置換された変異体の生物学的活性が、本発明で使用するタンパク質の生物学的活性に比して低下する場合、そのような生物学的活性を呈さない場合、又は、本タンパク質の生物学的活性を阻害するような不適切な活性を生じるような場合を比較することにより、本発明で使用するタンパク質を構成する個々のアミノ酸残基の有用性を評価することができる。また、当業者であれば、このような日常的な実験から収集した情報に基づいて、単独で、又は他の突然変異と組み合わせて、本発明で使用するタンパク質の変異体としては望ましくないアミノ酸置換を容易に解析することができる。
＜α－グルコシダーゼの使用、及び飲食品の改良方法＞
　本発明は、上記α－グルコシダーゼの、多糖類を含む原料を加工する飲食品の製造における使用に関する。また、本発明は、上記α－グルコシダーゼを、多糖類を含む原料を加工する飲食品の製造に使用することを含む飲食品の改良方法にも関する。
　本発明の使用及び改良方法により、澱粉の老化を抑制することができるため、改善された食感を有する飲食品の提供が可能となる。また、水溶性食物繊維を多く含む飲食品の提供が可能となる。
　本発明の使用又は改良方法において、目的又は効果を考慮して、多糖類を含む原料を加工する飲食品の製造のいずれの段階においてもα－グルコシダーゼを適用してよい。たとえば、飲食品の原料にα－グルコシダーゼを作用させたものを、それに続く製造又は加工の工程に供してよい。また、飲食品の中間製造物または中間加工品にα－グルコシダーゼを作用させたものを、それに続く製造又は加工の工程に供してもよい。さらに、飲食品の製造又は加工の最終段階でα－グルコシダーゼを添加して、飲食品が消費者の使用に供されるまでの間にα－グルコシダーゼが作用するようにしてもよい。
　また、本発明は、澱粉または澱粉加工品を含有する原料をα－グルコシダーゼで処理したものを加工食品に添加する工程を含む、加工食品の品質の改良方法にも関する。加工食品は、原料になんらかの加工を施して得られる食品であれば何でもよいが、たとえば畜肉加工食品、水産加工食品、乳加工食品、調味料等が挙げられるが、これらに限定されない。
＜α－グルコシダーゼを含む、多糖類を含む原料を加工して製造する飲食品の改良剤＞
　本発明は、上記α－グルコシダーゼを含む、多糖類を含む原料を加工して製造する飲食品の改良剤にも関する。
　本発明の改良剤は、上記α－グルコシダーゼの効果を損なわない範囲で、賦形剤、保存剤、香味料、抗酸化剤、ビタミン類等の追加の成分を含むものであってよい。
　本発明の改良剤は、上記α－グルコシダーゼを乾燥重量として１～９９％含むものであってよく、５％～８０％含むものであってよく、１０％～５０％含むものであってよい。
　本発明の改良剤は、調製後、必要に応じて殺菌処理を行った後、飲食品の食感や物性の改良剤として、種々の飲食品に使用することができる。
　以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。なお、本発明は、下記実施例に記載の範囲に限定されるものではない。
１）酵素活性の分析方法
＜α―グルコシダーゼ活性の分析方法＞
　酵素のα―グルコシダーゼ活性は、マルトースを基質とした加水分解活性にて評価した。
　マルトースを基質とした加水分解活性は、以下のように分析した。２０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した２０ｍＭ　マルトース　５０μLと、同緩衝液で希釈した酵素溶液５０μLとを混合し、４０℃で３０分間反応させた後、１０％シュウ酸溶液を１μL添加し１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止した。反応液に生成したグルコース量をグルコースCIIテストワコー（和光純薬工業社製）にて分析した。１分間に１μｍｏｌのマルトースを分解する酵素量を１Ｕと定義した。
２）酵素を各種基質に作用させた際の反応生成物の分析方法
＜反応生成物の重合度分布の分析方法＞
　反応生成物の重合度（ＤＰ）は、反応液を以下の条件でゲルろ過カラムにより分析した。
　ＨＰＬＣ測定条件　：
　　カラム：　ＭＣＩ　ＧＥＬ　ＣＫ０４Ｓ（三菱化学社製）
　　カラム温度　：　６５℃
　　移動層組成　：　超純水
　　検出器　：　ＲＩ（示差屈折検出器）
　　流速　：　０．３５ｍＬ／分
＜反応生成物の異性体組成の分析方法＞
　反応生成物の２、３、４糖成分中の、α－１，２、α－１，３、α－１，４、α－１，６結合を有するオリゴ糖の組成は、反応液を以下の条件でアミノカラムにより分析した。
　各ピークは、あらかじめ同条件で分析した標準糖の溶出時間と比較して同定し、ピーク面積より生成量を算出した。
標準糖：　
　２糖類のマルトース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトースは市販試薬を用いた。
　３糖類のマルトトリオース、イソマルトトリオース、パノースは市販試薬を用い、３２－Ｏ－α－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｙｌ－ｎｉｇｅｒｏｓｅ、３２－Ｏ－α－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｙｌ－ｍａｌｔｏｓｅは（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　第１７００巻　１８９ページ　２００４年）を参考に同定した。
　４糖類のマルトテトラオース、イソマルトテトラオースは市販試薬を用い、イソマルトトリオシルグルコースは（Ｔｈｅ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ　第５３巻　２１５ページ　２００６年）を参考に、３２－Ｏ－α－ｎｉｇｅｒｏｓｙｌ－ｍａｌｔｏｓｅ、３２－Ｏ－α－Ｄ－ｍａｌｔｏｓｙｌ－ｍａｌｔｏｓｅ、４２－Ｏ－α－Ｄ－ｎｉｇｅｒｏｓｙｌ－ｍａｌｔｏｓｅは（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　第１７００巻　１８９ページ　２００４年）を参考に同定した。
ＨＰＬＣ分析条件　：　
カラム：　Ｕｎｉｓｏｎ　ＵＫ－Ａｍｉｎｏ　２５０×３ｍｍ　（インタクト社製）
カラム温度　：　５０℃
溶媒グラディエント：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　検出器　：　ＮＱＡＤ検出器（ＱＵＡＮＴ社製）
　流速　：　０．４ｍＬ／分
＜反応生成物の連続α－１，６結合含有量の分析方法＞
　反応生成物の連続α－１，６結合含有量は、デキストラナーゼ分解による簡易評価法により分析した。
　デキストラナーゼＬ「アマノ」（天野エンザイム社製）は連続α－１，６結合糖質であるデキストランを分解する酵素として知られている。デキストラナーゼＬ「アマノ」の生産菌である糸状菌由来のデキストラナーゼは、デキストランを分解しイソマルトース、イソマルトトリオースと少量のグルコースを主に生成することが知られている（ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ　ＲＥＶＩＥＷＳ　第６９巻　３０６ページ　２００５年）。本発明者は、デキストラナーゼＬ「アマノ」が、４糖以上の連続α－１，６結合糖質（イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオース、イソマルトヘキサオース、デキストラン）に作用し、３糖以下の成分が生成することを確認した。そこで当該酵素を、本発明で使用するα－グルコシダーゼを作用させて得られた反応生成物に作用させることにより、４糖以上の連続α１，６結合を含有する糖質が生成しているかどうかを調べた。
　具体的には、反応液３０μL（ＤＳ：固形分濃度３０％）、１，０００倍希釈のデキストラナーゼＬ「アマノ」３０μL、２０ｍＭ（ｐＨ６．０）リン酸緩衝液３９０μLを混合し、５０℃１６時間反応させた後に、１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止した。そしてデキストラナーゼ未処理の反応液およびデキストラナーゼ処理後の反応液の重合度分布を前述＜反応生成物の重合度分布の分析方法＞にてそれぞれ分析した。デキストラナーゼ未処理の反応液中の４糖以上成分の割合に対する、デキストラナーゼ処理後の反応液中の４糖以上成分の割合の減少量（Δ％）を４糖以上の連続α－１，６結合含有量とした。
＜反応生成物の構造解析＞
　反応生成物の分画物に含まれるα－１，６結合の割合は、Ｈ-ＮＭＲの積分値によって確認した。
　反応生成物の分画物中の結合様式の組成は、メチル化分析法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　第５５巻　第２０５項　１９６４年）によって評価した。
３）本発明で使用するα―グルコシダーゼの取得
＜α―グルコシダーゼの遺伝子配列の定義＞
　公開されているアスペルギルス属菌のゲノム配列から、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のＧＨ３１ファミリーに属するα―グルコシダーゼと推定されているａｇｄＣの配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＸＰ＿００１８２５３９０）と同一性が９０％以上となる配列を探索し、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）ＮＢＲＣ４２３９株のゲノム配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．　ＢＡＣＡ００００００００）より抽出した（配列番号：１）。
４）ＮＢＲＣ４２３９株由来推定α―グルコシダーゼの遺伝子組換え株の取得
＜染色体ＤＮＡの抽出＞
　５０ｍＬ容のチューブに、滅菌したＹＰＤ培地５ｍLを入れ、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）　ＮＢＲＣ４２３９株を植菌し、３０℃２４時間培養した。そして培養菌体を回収し、ＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で染色体ＤＮＡを抽出した。なお菌体は前述のキットのＡＰ１緩衝液を添加し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）で破砕した。
＜遺伝子組換え株の作成＞
　定義した遺伝子配列の、終始コドンの前に１０残基のヒスチジンタグを挿入したＰＣＲ産物を得るためのプライマーセットを設計した。抽出した染色体ＤＮＡをテンプレートとして、上記プライマーセットを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はＩｎ　Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて、高発現プロモーターとしてアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）　ＲＩＢ４０由来の翻訳伸長因子ＴＥＦ１のプロモーター領域、ターミネーターとして本酵素の遺伝子配列の終始コドンより下流３００ｂｐの領域とともに、制限酵素ＫｐｎI、ＨｉｎｄIIIで消化したｐＰＴＲII（タカラバイオ社製）に導入しベクターを構築した。ベクターの設計を図1に示す。そしてアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）　ＡＴＣＣ３８１６３株を宿主にプロトプラスト－ＰＥＧ法（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　第５１巻　２５４９ページ　１９８７年）を行い、遺伝子組換え株を作成した。
　上記アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）　ＲＩＢ４０由来の翻訳伸長因子ＴＥＦ１のプロモーター領域、α－グルコシダーゼ遺伝子、およびターミネーター領域を増幅するために用いたプライマーは以下のとおりである。
プロモーターＦ
５‘－ＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＴＴＴＣＡＣＴＧＴＧＧＡＣＣＡＧＡＣＡ－３’
プロモーターＲ
５‘－ＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＧＡＡＣＴ－３’
α－グルコシダーゼＦ
５‘－ＣＧＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＴＣ－３’
α－グルコシダーゼＲ
５‘－ＣＡＧＡＡＴＣＧＴＡＡＴＣＴＣＡＴＴＣＴＣＧＣ－３’
ターミネーターＦ（ヒスチジンタグを含む）
５‘－ＧＡＧＡＴＴＡＣＧＡＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＡＴＧＡＴＴＴＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＡＴＡＧ－３’
ターミネーターＲ
５‘－ＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＣＧＧＡＧＣＴＴＴＡＡ－３’
＜ｃＤＮＡの配列解析＞
　得られた酵素の遺伝子のｃＤＮＡ配列を確認するために、上記遺伝子組み換え株から、前述した染色体ＤＮＡ抽出時と同様の操作で菌体を取得し、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）でＲＮＡの抽出を行った。得られたＲＮＡから、Ｒｅｖｅｒ　Ｔｒａ　Ａｃｅ（東洋紡社製）を用いて逆転写反応でｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ反応で酵素遺伝子のｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡをＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＫｉｔでＰＣＲ２．１　ＴＯＰＯ（いずれもインビトロジェン社製）に導入した後にシークエンス解析を行い、ｃＤＮＡの全長配列を決定した（配列番号：２、ヒスチジンタグ部分は除いた）。得られたｃＤＮＡから本酵素のアミノ酸配列を決定した（配列番号：３、ヒスチジンタグ部分は除いた）。
　得られた酵素のアミノ酸配列は、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のＧＨ３１ファミリーに属するα―グルコシダーゼと推定されているａｇｄＣの配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＸＰ＿００１８２５３９０）と同一性が９９％であり、かつＧＨ３１ファミリーが共通に持つ２つの保存領域（ＰＲＯＳＩＴＥ：ＰＳ００１２９，ＰＳ００７０７）における配列がａｇｄＣと完全に一致するため、本酵素はＧＨ３１ファミリーに属する酵素と考えられる。
５）ＮＢＲＣ４２３９株由来転移酵素の生産・精製
＜ＮＢＲＣ４２３９株由来推定α―グルコシダーゼの生産＞
　２Ｌ容の三角フラスコに、ツァペック　ドックス培地１Ｌを入れて、蒸気滅菌した後、ピリチアミンを添加し、上記の遺伝子組換え株を植菌し、３７℃の温度で４日間、振とう培養を行なった。そして、ミラクロス（メルク・ミリポア社製）で集菌、蒸留水で洗浄し、水分をよく搾った。
　得られた菌体のうち１００ｇに、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールを含んだ２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）を２００ｍL加え、ヒスコトロン（日音医理科器械製作所社製）で２０，０００ｒｐｍ、３０秒の破砕を５回繰り返した。そして１０，０００ｒｐｍ、２０分遠心分離を行って上清をとり、粗酵素液とした。得られた粗酵素液の酵素活性を上記＜α―グルコシダーゼ活性の分析方法＞に記載した方法で評価した結果、９７Ｕの活性を得た。その結果、この酵素がα―グルコシダーゼ活性を有することがわかった。
＜ＮＢＲＣ４２３９株由来α―グルコシダーゼの精製＞
　得られた粗酵素液を、以下の２段階のクロマト分離に供した。
　（１）Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー：粗酵素液を０．２μｍのフィルターを通過させたサンプルをＨｉｓ－Ｔｒａｐ　ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に通し、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールを含んだ２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。これにより、ヒスチジンタグが付加されたタンパク質を選択的に回収することができる。
　（２）ゲルろ過クロマトグラフィー：　（１）で得られた溶出液を、限外ろ過により２０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に置換し、Ｈｉｌｏａｄ　１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　Ｐｒｅｐｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケア社製）による分離を行い、α―グルコシダーゼ活性の高い画分を回収した。得られた画分から、１７Ｕのα―グルコシダーゼ活性を得た。
　（２）で得られた画分をＮａｔｉｖｅ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＧＥヘルスケア社製、「ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ」）に供した結果を図２（左方）に示す。１１０，０００ダルトンの単一バンドであった。この結果より、単一の精製された酵素を含む画分が得られたと考えられる。
６）ＮＢＲＣ４２３９株由来α―グルコシダーゼの性質
酵素の性質は、５）で得られた精製酵素を用いて評価した。
＜ＮＢＲＣ４２３９株由来α―グルコシダーゼの分子量＞
　得られた精製酵素をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＧＥヘルスケア社製、「ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ」）に供した結果を図２（右方）に示す。分子量６５，０００、７６，０００ダルトンの２本のバンドが検出された。Ｎａｔｉｖｅ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動による結果と比較すると、本酵素はヘテロダイマーの構造を持つと考えられた。
　また、等電点電気泳動（ＧＥヘルスケア社製、「ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ」）に供した結果、本酵素の等電点は４．９～５．５（中心値は５．２）であった。
＜至適温度、至適ｐＨ＞
　本酵素のα―グルコシダーゼ活性に対する温度、ｐＨの影響を調べた。酵素の活性は、＜α―グルコシダーゼ活性の分析方法＞に準じて分析した。その結果を図３（温度の影響）、図４（ｐＨの影響）に示す。本酵素の至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応で５５℃、至適ｐＨは４０℃、３０分間反応で５．５であった。
　なお、ｐＨの影響の評価では、ｐＨ３，０～５．０はフタル酸緩衝液、ｐＨ５．５～７．０はＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５～８．０はＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ９．０～１１．０はＣＡＰＳ緩衝液を使用した。
＜温度安定性、ｐＨ安定性＞
　本酵素のα―グルコシダーゼ活性について温度、ｐＨ安定性を調べた。酵素の活性は、＜α―グルコシダーゼ活性の分析方法＞に準じて分析した。その結果を図５（温度安定性）、図６（ｐＨ安定性）に示す。本酵素の温度安定性は、５０℃で活性が９０％以上残存していた。また、ｐＨ安定性は、ｐＨ４．５～１０の範囲で活性が８０％以上、ｐＨ６．０～１０．０の範囲で活性が９０％以上残存していた。
　温度安定性は酵素溶液（２０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０、１ｍＭ　ＣａＣｌ２含有）を各温度に１時間保持し、氷水にて冷却後、残存する酵素活性を評価した。ｐＨ安定性は酵素溶液（各ｐＨの４０ｍＭ緩衝液）を４℃、２４時間保持し、ｐＨを６．０に調整した後、残存する酵素活性を評価した。
　なお、ｐＨの安定性の評価では、ｐＨ２．０～５．０はフタル酸緩衝液、ｐＨ６．０～７．０はＭＥＳ緩衝液、ｐＨ８．０はＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ９．０～１２．０はＣＡＰＳ緩衝液を使用した。
＜基質特異性＞
　本酵素の基質特異性を４０℃、ｐＨ６．０の条件にて評価した。結果を下記表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　マルトースや、コージビオース、ニゲロース、イソマルトースなどの２糖類、および、マルトテトラオースを除く重合度２～７のマルトオリゴ糖、重合度２～４のイソマルトオリゴ糖、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、アミロース、可溶性澱粉などには良好に作用してグルコースを生成した。特にα－１，６結合を有する重合度２～４のイソマルトオリゴ糖が最も良好な基質であった。
　マルトテトラオース、γ－シクロデキストリンについては作用性がやや低かった。トレハロース、グリコーゲン、デキストランについてはわずかに反応がみられた。
＜金属イオンの影響＞
　本酵素の各金属イオンの影響を調べた。酵素活性は、＜α―グルコシダーゼ活性の分析方法＞に準じて分析した。各種イオンを反応系に添加して分析した結果を下記表３に示す。
　本酵素はカルシウムによって活性がやや増加した。亜鉛イオン、銅イオン、鉄イオンによりその活性を阻害された。ナトリウムイオン、ＥＤＴＡによっても活性がやや阻害された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 ７）ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼと既存の酵素との比較
　ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼの活性と、既存のα－グルコシダーゼを主活性とする酵素の活性とを、マルトース（グルコース重合度（Ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、ＤＰ）２）およびマルトペンタオース（ＤＰ５）を基質とした際の反応生成物について比較した。
＜トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」によるマルトース（ＤＰ２）の転移物＞
　α－グルコシダーゼを主活性とし、同じアスペルギルス属（アスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ））由来の市販の酵素製剤であるトランスグルコシダーゼＬ「アマノ」（天野エンザイム社製）０．２ｍＬ（１．８Ｕ／ｍＬ）を、４５％マルトース溶液０．４ｍＬに加え（最終濃度３０％）、４０℃で反応を行った。所定時間反応後に沸騰浴槽で１０分間加熱し、酵素を失活させた。
　得られた反応生成物の重合度分布および、２、３、４糖成分の異性体の組成を、上記＜反応生成物の重合度分布の分析方法＞および、＜反応生成物の異性体組成の分析方法＞に記載した方法にて分析した。また、反応生成物の４糖以上の連続α－１，６結合含有量を＜反応生成物の連続α－１，６結合含有量の分析方法＞に記載した方法にて分析した。
反応開始後の７２時間までの反応生成物の経時変化について、重合度分布を図７Ａ、２、３、４糖成分の異性体組成を図７Ｂに示す。重合度分布では、基質であるマルトース（ＤＰ２）の減少と共に３糖成分が生成し、続いてさらに重合度の高い成分が増加した。２、３、４糖成分の異性体組成では、α－１，４結合とα－１，６結合をともに有する低分子糖質（パノース、イソマルトトリオシルグルコース、以降はα－１，４・１，６結合オリゴ糖と記載）、α－１，６結合のみを有する低分子糖質（イソマルトース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、以後はα－１，６結合オリゴ糖と記載）が増加した。
　反応開始後７２時間での分子量分布は、単糖２９．０％、２糖３０．９％、３糖２５．９％、４糖以上１４．２％であった。また、α－１，４・１，６結合オリゴ糖またはα－１，６結合オリゴ糖のうち２糖類であるイソマルトースが２０．８％、３糖類であるパノースが１０．０％、イソマルトトリオースが１１．１％、４糖類であるイソマルトトリオシルグルコースが５．０％、イソマルトテトラオースが２．８％であった。
　反応開始後の７２時間までの、反応生成物の４糖以上の連続α－１，６結合含有量の経時変化を図１２に示す。反応開始後７２時間までに、４糖以上の連続α－１，６結合含有量は、０％から３％まで増加した。
＜アスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　ＡＴＣＣ１０２５４株由来粗酵素液によるマルトース（ＤＰ２）の転移物＞
　α－グルコシダーゼを粗酵素液中に分泌することが知られているアスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　ＡＴＣＣ１０２５４株から特許第４８３００３１号に記載の方法で粗酵素液を取得し、０．２ｍＬ（１．８Ｕ／ｍＬ）を、４５％マルトース溶液０．４ｍＬに加え（最終濃度３０％）、４０℃で反応を行った。所定時間反応後に沸騰浴槽で１０分間加熱し、酵素を失活させた。
　得られた反応生成物の重合度分布および、２、３、４糖成分の異性体の組成を、上記＜反応生成物の重合度分布の分析方法＞および、＜反応生成物の異性体組成の分析方法＞に記載した方法にて分析した。また、反応生成物の４糖以上の連続α－１，６結合含有量を＜反応生成物の連続α－１，６結合含有量の分析方法＞に記載した方法にて分析した。
　反応開始後の７２時間までの反応生成物の経時変化について、重合度分布を図８Ａ、２、３、４糖成分の異性体組成を図８Ｂに示す。重合度分布では、基質であるマルトース（ＤＰ２）の減少と共に３糖成分が生成し、続いてさらに重合度の高い成分が増加した。２、３、４糖成分の異性体組成では、反応初期にα－１，３結合を有する低分子糖質（以降はα１，３結合オリゴ糖と記載）が増加し、平衡に達したまま維持された。
　反応開始後７２時間での分子量分布は、単糖２９．２％、２糖３１．０％、３糖１９．５％、４糖以上２０．２％であった。また、α－１，４・１，６結合オリゴ糖またはα－１，６結合オリゴ糖のうち２糖類であるイソマルトースが３．２％、３糖類であるパノースが１．３％得られた。イソマルトトリオース、イソマルトトリオシルグルコース、イソマルトテトラオースは得られなかった。
　反応開始後の７２時間までの、反応生成物の４糖以上の連続α－１，６結合含有量の経時変化を図１２に示す。反応開始後７２時間までに、４糖以上の連続α－１，６結合含有量の増加は全く認められなかった。
＜ＮＢＲＣ４２３９株由来のα－グルコシダーゼによるマルトース（ＤＰ２）の転移物＞
　５）に記載の方法で得られた精製酵素０．２ｍＬ（１．８Ｕ／ｍＬ）を、４５％マルトース溶液０．４ｍＬに加え（最終濃度３０％）、４０℃で反応を行った。所定時間反応後に沸騰浴槽で１０分間加熱し、酵素を失活させた。
　得られた反応生成物の重合度分布および、２、３、４糖成分の異性体の組成を、上記＜反応生成物の重合度分布の分析方法＞および、＜反応生成物の異性体組成の分析方法＞に記載した方法にて分析した。また、反応生成物の４糖以上の連続α－１，６結合含有量を＜反応生成物の連続α－１，６結合含有量の分析方法＞に記載した方法にて分析した。さらに、５糖成分に含まれるα－１，６結合の割合を＜反応生成物の構造解析＞の手法に従い、Ｈ－ＮＭＲで分析を行った。
　反応生成物の重合度分布のクロマトグラムを図９、異性体組成のクロマトグラムを図１０に示す。
　反応開始後の７２時間までの反応生成物の経時変化について、重合度分布を図１１Ａ、２、３、４糖成分の異性体組成を図１１Ｂに示す。重合度分布では、基質であるマルトース（ＤＰ２）の減少と共に３糖成分が生成し、続いてさらに重合度の高い成分が増加した。２、３、４糖成分の異性体組成では、反応初期はα－１，４・１，６結合オリゴ糖、α－１，３結合オリゴ糖が増加したが、その後減少に転じた。一方、α－１，６結合オリゴ糖は、反応初期から中期にかけて増加し平衡に達したまま維持された。
　反応開始後７２時間での分子量分布は、単糖２７．９％、２糖２５．６％、３糖１８．４％、４糖以上２８．１％であった。また、α－１，４・１，６結合オリゴ糖またはα－１，６結合オリゴ糖のうち２糖類であるイソマルトースが１７．８％、３糖類であるパノースが２．７％、イソマルトトリオースが１０．８％、４糖類であるイソマルトトリオシルグルコースが１．０％、イソマルトテトラオースが７．８％得られた。
　反応開始後の７２時間までの、反応生成物の４糖以上の連続α－１，６結合含有量の経時変化を図１２に示す。反応開始後７２時間までに、４糖以上の連続α－１，６結合含有量は、１４％までに増加した。本発明の酵素をマルトースに作用させた場合、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」やアスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　ＡＴＣＣ１０２５４株由来の粗酵素液を作用させた場合と比較して、反応生成物の４糖以上の連続α－１，６結合含有量が顕著に多かった。
　上記と同じ反応条件でマルトースに、本発明の精製酵素を７２時間作用させ、得られた反応生成物から５糖成分を分画し、Ｈ－ＮＭＲで解析したところ、α－１，６結合は８１％含まれていた（図１３）。また、２、３、４糖成分は、上記に記載した通りα－１，６結合の成分（α－１，６結合オリゴ糖）が多くを占めており、６糖以上の成分も同様にα－１，６結合の割合が高いと推測される。以上より、本発明の酵素をマルトースに作用させると、生成する糖質の大部分はα－１，６結合で連結していることが分かった。
＜マルトペンタオース（ＤＰ５）の転移物＞
　５）に記載の方法で得られた精製酵素、０．２ｍＬ（７．２Ｕ／ｍＬ）を、４５％マルトペンタオース溶液０．４ｍＬに加え（最終濃度３０％）、４０℃で反応を行った。所定時間反応後に沸騰浴槽で１０分間加熱し、酵素を失活させた。
　得られた反応生成物の重合度分布を上記＜反応生成物の重合度分布の分析方法＞に記載した方法で分析した。また、反応生成物の連続α－１，６結合含有量を＜反応生成物の連続α－１，６結合含有量の分析方法＞に記載した方法に準じて分析した。ここでは、デキストラナーゼ処理による６糖以上成分の割合の減少量を６糖以上の連続α－１，６結合含有量とし、経時的に評価した。
　反応開始後７２時間における、反応生成物の重合度分布のクロマトグラムを図１４に示す。
　また、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」、アスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　ＡＴＣＣ１０２５４株由来の粗酵素液についても同様に反応し、分析を行った。
　反応開後の７２時間までの６糖以上成分含有量の経時変化を図１５に示す。本発明の酵素をマルトペンタオースに作用させた場合、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」やアスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　ＡＴＣＣ１０２５４株由来の粗酵素液を作用させた場合と比較して、反応生成物中の６糖以上の成分量が、反応時間を通して常に多かった。
　６糖以上の連続α－１，６結合含有量の経時変化を図１６に示す。本発明の酵素は、反応開始後７２時間までに、６糖以上の連続α－１，６結合含有量が１３％まで増加した。トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」やアスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　ＡＴＣＣ１０２５４株由来の粗酵素液を作用させた場合と比較して、６糖以上の連続α－１，６結合含有量が顕著に多かった。
　上記と同じ反応条件でマルトペンタオースに、本発明の精製酵素を７２時間作用させ、得られた反応生成物から６糖以上の成分を分画し、メチル化分析で分析した結果を下記表４に示す。非還元末端のグルコース以外の、反応生成物を構成するグルコースのうち、６２％がα－１，６結合を含有しており、α－１，４結合のみを含有しているグルコースは３０％であった。上述した、マルトースに作用させて得られた反応生成物の解析結果から、本発明の酵素はほとんどα－１，４転移をしないことが明らかであるので、上記マルトペンタオースの反応生成物に含まれるα－１，４結合は基質のマルトペンタオース由来であり、転移反応で新たに生成する結合様式は大部分がα－１，６結合であると考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
８）その他のアスペルギルス属由来のα－グルコシダーゼの調製と評価
　上記アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）　ＮＢＲＣ４２３９株由来の酵素の他に、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）　ＡＴＣＣ３８１６３株由来のａｇｄＢ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＥＡＡ６３７４８）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）　ＲＩＢ６０１株由来のａｇｄＣに関して、４）と同様の手法で、遺伝子組換え株を作成し、粗酵素液を得た。また、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）を用い、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）　ＮＢＲＣ４２３９株由来酵素のアミノ酸配列の４５０番目のアルギニンをヒスチジンに変換した遺伝子、および、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）　ＲＩＢ６０１株由来のａｇｄＣの４５０番目のヒスチジンをアルギニンに変換した遺伝子の遺伝子組換え株を作成し、粗酵素液を得た。
　これらの粗酵素液を、７）＜マルトペンタオース（ＤＰ５）の転移物＞と同様の方法でマルトペンタオースに作用させ、その反応生成物の連続α－１，６結合含有量の分析を行った。その結果、反応２４時間における、６糖以上の連続α－１，６結合含有量は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）　ＡＴＣＣ３８１６３株由来のａｇｄＢは８％、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）　ＲＩＢ６０１株由来のａｇｄＣの点変異導入酵素は１０％となり、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）　ＮＢＲＣ４２３９株由来の酵素（１１％）と同程度の連続α１，６結合を生成した。一方、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）　ＲＩＢ６０１株由来のａｇｄＣ、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）　ＮＢＲＣ４２３９株の点変異導入酵素は、α－グルコシダーゼ活性はあるものの連続α－１，６結合が全く生成しなかった。後者２種の酵素をマルトースに作用させ、＜反応生成物の異性体組成の分析方法＞に記載した方法で２、３、４糖成分の異性体の組成を分析したところ、α１，６結合を有するオリゴ糖の含有量は少なく、α－１，３またはα－１，４結合を有するオリゴ糖が多く生成した。
９）アスペルギルス属由来のα－グルコシダーゼ配列の比較
　ＧＨ３１ファミリーに属する酵素は活性中心に保存性の高い配列を持つことが知られている（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　第37巻1ページ　１９９８年、ＰＲＯＳＩＴＥ：ＰＳ００１２９）。アスペルギルス属由来のさまざまなα－グルコシダーゼ配列における活性中心付近の保存配列から３残基下流までの配列、および各α－グルコシダーゼの連続α－１，６転移活性の有無を図１７に示す。連続α－１，６転移活性を有する酵素の遺伝子配列は保存配列の全てのアミノ酸が一致していた。また、保存配列は共通するものの、活性中心の１０残基下流がアルギニンではなくヒスチジンであるアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）　ＲＩＢ６０１株由来のａｇｄＣは連続α－１，６転移活性を持っていなかった。また、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）　ＮＢＲＣ４２３９株由来の酵素に点変異導入をして、活性中心の１０残基下流がアルギニンではなくヒスチジンとした酵素も、連続α－１，６転移活性を持っていなかった。さらに、同じα―グルコシダーゼであるが連続α－１，６転移酵素ではないことが知られている他の既知の酵素は、保存配列のアミノ酸が一致していなかった。したがって活性中心付近に「ＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦ」の配列を持っており、かつ活性中心の１０残基下流がヒスチジンではないことが連続α－１，６転移活性を持つために重要であることが分かった。
　つまり、上記の条件にあうアミノ酸配列、すなわちＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦＸ１Ｘ２Ｘ３からなる配列を含有し、ここでＸ１Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はヒスチジン以外のアミノ酸であり、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するα－グルコシダーゼが、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）　ＲＩＢ６０１株由来の変異酵素から見出された。またアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）　３．０４２株、およびアスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ）　ＮＲＲＬ３３５７株は、ゲノム配列上、ＧＨ３１ファミリーに属する酵素と予測される配列を有している（それぞれ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．　ＥＩＴ７７３８８、およびＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．ＸＰ＿００２３８０５７６）。そして、これらの酵素のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と９８％の同一性を有しており、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する活性を有する酵素を生産すると推測される。アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、およびアスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ）は、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）と同様にアスペルギルス属フラビ節（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｅｃｔｉｏｎ　Ｆｌａｖｉ）に属する菌種である。さらに、データベース上ではペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ） 　、ネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ　ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）、スタキボトリス・クロロハロナタ（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ　ｃｈｌｏｒｏｈａｌｏｎａｔａ）、スタキボトリス・カルタルム（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ　ｃｈａｒｔａｒｕｍ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、フザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）も活性中心付近に「ＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦ」の配列を持っており、かつ活性中心の１０残基下流がヒスチジンではない、ＧＨ３１ファミリーに属する酵素を有しており、これらの糸状菌は、本発明で使用するα－グルコシダーゼ同様、連続α－１，６転移活性を有する酵素を生産する可能性が高い。
　アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）　ＮＢＲＣ４２３９株由来のα－グルコシダーゼのアミノ酸配列（配列番号３）、ゲノム遺伝子配列（配列番号１）、およびｃＤＮＡ配列（配列番号２）と比較した場合の、各種アスペルギルス属由来のα－グルコシダーゼ配列の同一性は以下の表５に示すとおりである。なお、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）　ＲＩＢ６０１株についてはゲノム配列が解読されていなかったものであるため、本株由来のａｇｄＣの配列は、発明者等が独自に解析した（配列番号４）。また、配列同一性は、clustalW（http://www.genome.jp/tools/clustalw/）プログラムを用いて評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
１）米飯での添加効果
　試験は、「応用糖質科学　第４巻　ｐ.９３－１０２　２０１４年」を参照して行った。市販の米一粒（約２０ｍｇ）に、原料生米１ｇ当り２５Ｕとなるよう酵素を添加した緩衝液（１２ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．０）を７０μＬ加え、常温で２時間浸漬した。その後、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して、表６に示す条件で炊飯した。酵素はＮＢＲＣ４２３９株由来のα－グルコシダーゼ（以下、本酵素と記載する。：試験例１）及びトランスグルコシダーゼＬ「アマノ」（天野エンザイム社製、以下ＴＧＬともいう。比較例１）を用いた。また、コントロールとして酵素を添加せずに同様の条件で炊飯した米飯（参考例１）を作製した。
　本酵素は、［実施例１］の５）に記載の＜ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼの精製＞で得た、精製酵素を用いた。添加した酵素の活性は、［実施例１］の１）に記載の＜α－グルコシダーゼ活性の分析方法＞によって定義した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　炊飯後、３０℃まで放冷して米飯の硬さを測定した。測定にはテクスチャーアナライザーＴＡ．ＸＴ　Ｐｌｕｓ（Ｓｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、以下ＴＡともいう。）を用い、直径２０ｍｍの円柱プランジャー、プランジャースピード２ｍｍ／ｓ、ロードセル５ｋｇの条件で９０％圧縮による応力（Ｎ）を測定し、その値を米一粒の硬さとした。各サンプルについて１０粒を測定し、その平均値を求めた。結果を図１８に示す。　酵素無添加（参考例１）に比べ、本酵素（試験例１）及びＴＧＬ（比較例１）を添加することにより、炊飯米の柔らかさは増していた。また、本酵素(試験例１)とＴＧＬ（比較例１）添加の比較では、本酵素の方が柔らかい結果であった。これらの結果より、本酵素を添加することで、柔らかく好ましい食感の米飯を得ることができる。
２）もちでの添加効果
　もち米２５０ｇに、原料生米１ｇ当り０．０２Ｕとなるよう酵素を添加した緩衝液（１２ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．０）を１８０ｍＬ加え、常温で３０分間浸漬した。その後、ホームベーカリー ＳＤ―ＢＭＳ１０２（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ社製）のもちコースにて、もちを作製した。本酵素を用いたもちを試験例２とし、ＴＧＬを用いたもちを比較例２とした。また、コントロールとして酵素を添加せずに同様の条件で作製したもちを参考例２とした。
　本酵素は、［実施例１］の５）に記載の＜ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼの精製＞で得た、精製酵素を用いた。添加した酵素の活性は、［実施例１］の１）に記載の＜α－グルコシダーゼ活性の分析方法＞によって定義した。
　作製したもちは、２０ｇずつプラスチック製のシャーレに詰めて成形後、常温まで放冷したもの、及びその後４℃２４時間保存したものについて硬さを測定した。測定には、ＴＡを用い、直径４０ｍｍの円柱プランジャー、プランジャースピード２ｍｍ／ｓ、ロードセル５ｋｇの条件で、放冷後のものは３０％圧縮、１日保存したものは１０％圧縮による応力（Ｎ）を測定し、その値をもちの硬さとした。各サンプルについて１０点測定し、その平均値を求めた。結果を図１９に示す。
　放冷後において、無添加(参考例２)に比べ、本酵素（試験例２）を添加することによりもちの柔らかさは増していた。一方、ＴＧＬ（比較例２）の添加では変化はみられなかった。また、１日保存後においても同様に、本酵素を添加して作製したもち（試験例２）は酵素無添加（参考例２）および、ＴＧＬ添加区（比較例２）より顕著に柔らかかった。これらの結果より、本酵素を添加することで、作製後も柔らかく、しかもその柔らかさが持続するもちを得ることができる。
３）甘酒、清酒での添加効果
　乾燥米麹２００ｇに、原料米麹１ｇ当り０．３Ｕ又は１．５Ｕとなるよう酵素を添加した緩衝液（１２ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．０）を８００ｍＬ加え、５０℃で６時間浸漬し、甘酒を得た。本酵素を用いた甘酒を試験例３及び４とし、ＴＧＬを用いた甘酒を比較例３及び４とした。また、コントロールとして酵素を添加せずに同様の条件で得た甘酒を参考例３とした。
　本酵素は、［実施例１］の５）に記載の＜ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼの精製＞で得た、精製酵素を用いた。添加した酵素の活性は、［実施例１］の１）に記載の＜α－グルコシダーゼ活性の分析方法＞によって定義した。
　得られた甘酒は、遠心して上清を回収し、液中の水溶性食物繊維含有量を酵素－ＨＰＬＣ法（ＡＯＡＣ　２００１．０３）により求めた。その結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　得られた甘酒中の水溶性食物繊維含有量は、酵素無添加区（参考例３）で０．４％であったが、本酵素０．３Ｕ添加区（試験例３）、１．５Ｕ添加区（試験例４）では顕著に増加した。また、本酵素(試験例３、４)とＴＧＬ（比較例３、４）を比較すると本酵素を添加した場合の方が水溶性食物繊維含有量は高かった。これらの結果より、本酵素を添加することで、水溶性食物繊維が増量した甘酒を得ることができる。
　清酒の仕込み工程に添加することを想定し、低温にて同様の試験を行った。原料米麹１ｇ当り２．５Ｕとなるように、乾燥米麹と酵素溶液を混合したものを、１０℃で２週間保持した。その結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　水溶性食物繊維含有量は、酵素無添加区（参考例４）で０．３％であった。一方、本酵素２．５Ｕ添加区（試験例５）では顕著に水溶性食物繊維含有量が増加した。また、ＴＧＬ添加区（比較例５）では水溶性食物繊維含有量の変化はみられなかった。
　食物繊維は酵母により資化されないため、仕込み工程に本酵素を添加することで、水溶性食物繊維が増量した清酒を得ることができる。
４）パンでの添加効果
　表９に示す配合の製パン原料を用いて、ホームベーカリー ＳＤ―ＢＨ１０５（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ社製）の食パン・早焼きコースにて、食パンを作製した。本酵素を添加して作製した食パンを試験例６とし、ＴＧＬを添加して作製した食パンを比較例６とした。また、コントロールとして酵素を添加せずに同様の条件で作製した食パンを参考例５とした。添加量は本酵素、ＴＧＬともに強力粉１ｇ当り０．２Ｕとした。
　本酵素は、［実施例１］の５）に記載の＜ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼの精製＞で得た、精製酵素を用いた。添加した酵素の活性は、［実施例１］の１）に記載の＜α－グルコシダーゼ活性の分析方法＞によって定義した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　作製した食パンは、常温まで放冷し、２５℃で１日及び２日保存したものを厚さ１０ｍｍにスライスし、クラム部分を３３ｍｍ四方にカットして物性測定を行った。測定には、ＳＵＮ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製ＳＵＮ ＲＨＥＯ ＭＥＴＥＲ ＣＯＭＰＡＣ―１００IIを用い、直径４０ｍｍのフラットプランジャー、架台スピード６０ｍｍ／ｍｉｎの条件で、厚さ５ｍｍまで圧縮したときの応力を測定し、食パンの硬さとした。各サンプルについて１０点測定し、その平均値を求めた。結果を図２０に示す。
　１日保存後において、無添加（参考例５)に比べ、本酵素（試験例６）及びＴＧＬ（比較例６）を添加することにより食パンの柔らかさは増していた。また、２日保存後においても、本酵素（試験例６）及びＴＧＬ（比較例６）を添加した食パンは柔らかさを保っていた。また、本酵素（試験例６）とＴＧＬ（比較例６）添加区とを比較すると、１日及び２日保存後、ともに本酵素を添加したパンの方が柔らかい結果であった。本酵素を添加することで、柔らかが持続する食パンを得ることができる。
５）ビール、ビール様飲料での添加効果　
麦芽２００ｇに対して、麦芽１ｇ当り１Ｕ又は５Ｕの酵素を添加した酵素溶液８００ｍＬを加え、５０℃で１時間、更に６０℃で１時間、その後８０℃で１０分間の加熱処理を行った。本酵素を添加したものを試験例７及び８とし、ＴＧＬを添加した物を比較例７及び８とした。また、コントロールとして酵素を添加せずに同様の条件で加熱処理を行ったものを参考例６とした。
　本酵素は、［実施例１］の５）に記載の＜ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼの精製＞で得た、精製酵素を用いた。添加した酵素の活性は、［実施例１］の１）に記載の＜α－グルコシダーゼ活性の分析方法＞によって定義した。
　加熱処理後、遠心にて上清を回収し、液中の水溶性食物繊維含有量を酵素－ＨＰＬＣ法（ＡＯＡＣ　２００１．０３）により求めた。その結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　水溶性食物繊維含有量は、酵素無添加区（参考例６）で０．８％であったが、本酵素１Ｕ添加区（試験例７）、５Ｕ添加区（試験例８）では顕著に増加した。また、本酵素（試験例７、８）とＴＧＬ（比較例７、８）を比較すると本酵素を添加した場合の方が水溶性食物繊維含有量は高かった。ビールの製造では、前述の処理である糖化工程の後にビール酵母による醗酵工程がある。食物繊維はビール酵母により資化されないため、本酵素添加により、水溶性食物繊維を増量したビールを得ることができる。
　また、原料の麦芽に大麦を混ぜ同様の試験を行った。麦芽２０ｇ、大麦１８０ｇに対して、原料１ｇ当り１Ｕ又は５Ｕの酵素を添加した酵素溶液８００ｍＬを加え、前述の加熱処理を行った。その結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　水溶性食物繊維含有量は、酵素無添加区（参考例７）で１．２％であったが、本酵素１Ｕ添加区（試験例９）、５Ｕ添加区（試験例１０）では顕著増加した。また、本酵素（試験例９、１０）とＴＧＬ（比較例９、１０）を比較すると本酵素を添加した場合の方が水溶性食物繊維含有量は高かった。これらの結果から、麦芽の配合率に関わらず本酵素の添加により水溶性食物繊維を増量することができる。
６）うどんでの添加効果
　表１２に示す配合の製麺原料を用いて、市販の製麺機（ＰＨＩＬＩＰＳ社製　Ｎｏｏｄｌｅ ＭａｋｅｒＨＲ２３６５／０１）にて２ｍｍ丸麺用製麺キャップを使用し、製麺した。本酵素を添加したものを試験例１１とし、ＴＧＬを添加したものを比較例１１とした。また、コントロールとして酵素を添加せずに同様の条件で製麺したものを参考例８とした。添加量は本酵素、ＴＧＬともに中力粉１ｇ当り２Ｕとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　本酵素は、ＮＢＲＣ４２３９株を培養して得られた酵素液より調製した。酵素液の製造方法および精製方法を以下に示す。
　５００ｍｌ容の三角フラスコ１０本に、小麦ふすま各１０ｇを入れて、蒸気滅菌した後、ＮＢＲＣ４２３９株をＹＰＤ培地で培養した前培養液を各１０ｍＬ添加し、水分が均一になるようによく撹拌した後、３０℃で４日間、固体培養を行なった。培養終了後、各１００ｍＬの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で小麦ふすまを洗浄し、ミラクロス（メルク・ミリポア社製）によるろ過、３，５００ｒｐｍ、２０分間で２回遠心分離後、上清を回収し、粗酵素液とした。
　得られた粗酵素液を０．２μｍのフィルターでろ過したものを陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。分離樹脂はＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＤＥＡＥ－６５０Ｍ（東ソー社製）を用い、樹脂量（以降はＣＶと記載）は１００ｍＬとした。０．１２Ｍ　塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）５００ｍＬで洗浄、０．２２Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）５００ｍＬで溶出し、デキストラン分解活性が高い画分を回収した。
　回収した画分を限外ろ過により２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）に置換し、再度陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。分離樹脂はＨｉＬｏａｄ　２６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。初発の緩衝液として２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、０→０．５Ｍ　塩化ナトリウムの直線的濃度勾配（２０ＣＶ）で溶出し、デキストラン分解活性の高い画分を回収した。
　回収した画分を限外ろ過により濃縮、２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に置換し、Ｈｉｌｏａｄ　１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　Ｐｒｅｐｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケア社製）による分離を行い、デキストラン分解活性の高い画分を回収し、精製酵素を得た。得られた精製酵素を本酵素として使用した。
　デキストラン分解活性は、２％デキストラン溶液（２０ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液：ｐＨ６．０）５０μＬと、同緩衝液で希釈した酵素溶液５０μＬとを混合し、４０℃で３０分間反応させた後、１０％シュウ酸溶液を１μＬ添加し１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止した。反応液中に生成したグルコース量をグルコースCIIテストワコー（和光純薬工業製）にて測定した。１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を１Ｕと定義した。
　各段階における精製の結果を表１３に示す。得られた精製酵素を、［実施例１］の７）＜ＮＢＲＣ４２３９株由来の精製酵素によるマルトース（ＤＰ２）の転移物＞、＜マルトペンタオース（ＤＰ５）の転移物＞、それぞれに記載した方法と同様にマルトース、マルトペンタオースに作用させたところ、［実施例１］の５）に記載の＜ＮＢＲＣ４２３９株由来α－グルコシダーゼの精製＞で得た、精製酵素を作用させた場合と同等の反応生成物が得られた。
　うどんに添加した酵素の活性は、［実施例１］の１）に記載の＜α－グルコシダーゼ活性の分析方法＞によって定義した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　うどんは、茹でた後に冷水で締めたものを評価した。結果を表１４に示す。なお、評価は１０人の被験者に試食してもらい、無添加に対して良いと答えた人数とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　無添加(参考例８)に比べ、本酵素（試験例１１）及びＴＧＬ(比較例１１)添加することで、うどんは好ましい硬さになり、弾力感、粘りのある好ましい食感となった。また、本酵素（試験例１１）及びＴＧＬ（比較例１１）添加区を比較すると、本酵素を添加した場合の方が好ましい結果であった。これらの結果より、本酵素を添加することで、好ましい硬さで弾力感、粘りのある好ましい食感のうどんを得ることができる。
７）マッシュポテトでの添加効果
　じゃがいも１個を、皮をむいて１．５ｃｍの厚さに切り、じゃがいも１ｇ当り２Ｕとなるよう酵素を添加した緩衝液（１２ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ６．０）を１８０ｍＬ加え、常温で２時間浸漬した。その後、じゃがいもを茹で、水を切ってマッシャ―でつぶしマッシュポテトを作製した。本酵素を用いたものを試験例１２とし、ＴＧＬを用いたものを比較例１２とした。また、コントロールとして酵素を添加せずに同様の条件で作製したマッシュポテトを参考例９とした。
　本酵素としては、上記試験例１１で使用したものと同じものを用いた。添加した酵素の活性は、［実施例１］の１）に記載の＜α－グルコシダーゼ活性の分析方法＞によって定義した。
　作製したマッシュポテトは、作製直後、及びその後２時間２５℃で静置後、しっとり感および柔らかさを評価した。結果を表１５に示した。評価は１０人の被験者に試食してもらい、無添加に対して良いと答えた人数をとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　作製直後のマッシュポテトでは、酵素無添加（参考例９）に比べ、本酵素（試験例１２）及びＴＧＬ（比較例１２）添加により、しっとり感及び柔らかさが増し、好ましい食感であった。本酵素（試験例１２）及びＴＧＬ（比較例１２）添加区を比較すると、食感の差は見られなかった。しかし、２時間静置後では本酵素を添加した場合の方がより好ましい結果となった。これらの結果より、本酵素を添加することで、作製直後の食感が良く、さらに、しっとり感が持続し、柔らかい食感が続くマッシュポテトを得ることができる。
８）酵素処理澱粉の製造
　小麦澱粉１０ｇに、原料小麦澱粉１ｇ当り０．２Ｕとなるよう酵素を添加した緩衝液（１２ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ６．０）を２０ｍＬ加え、２５℃で２４時間撹拌し、酵素反応を行った。反応終了後、反応液をろ過し、ろ物を１００ｍＬの水で洗浄後、乾燥させ、酵素処理澱粉を得た。本酵素を用いたものを試験例１３とし、ＴＧＬを用いたものを比較例１３とした。また、コントロールとして酵素を添加せずに同様の条件で得た酵素処理澱粉を参考例１０とした。
　本酵素としては、上記試験例１１で使用したものと同じものを用いた。添加した酵素の活性は、［実施例１］の１）に記載の＜α－グルコシダーゼ活性の分析方法＞によって定義した。
　作製した酵素処理澱粉は、固形分６％の老化性をＲＶＡ４５００（Ｐｅｒｔｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて評価した。図２１に示す条件で処理し、セットバック値（最終粘度と糊化後の最小粘度の差）を算出した。結果を図２２に示す。
　無添加（参考例１０）に比べ、本酵素（試験例１３）及びＴＧＬ（比較例１３）で処理した澱粉のセットバック値は小さい値であった。また、本酵素（試験例１３）及びＴＧＬ（比較例１３）で処理した澱粉のセットバック値を比較すると、本酵素で処理した澱粉（試験例１３）の方が小さい値を示した。本酵素を添加することで、老化しにくい澱粉を得ることができた。
　得られた酵素処理澱粉は澱粉含有食品の原料に使用することもできる。表１６の組成で畜肉加工品、表１７の組成で水産加工食品を作製し良好な製品を得た。また、澱粉含有食品の製造工程中に酵素を添加し、酵素処理澱粉を生成しても良い。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017

Claims (23)

  1. 　多糖類を含む原料を加工して飲食品を製造するためのα－グルコシダーゼの使用であって、ここでα－グルコシダーゼはα型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成するものである、使用。
  2. 　多糖類が澱粉または澱粉加工品である、請求項１に記載の使用。
  3. 　飲食品が米加工品である、請求項１または２に記載の使用。
  4. 　飲食品が小麦加工品である、請求項１または２に記載の使用。
  5. 　飲食品が大麦加工品である、請求項１または２に記載の使用。
  6. 　飲食品がじゃがいも加工品である、請求項１または２に記載の使用。
  7. 　α－グルコシダーゼが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌由来のα－グルコシダーゼであって、以下の酵素化学的性質：
    （１）作用：α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する；
    （２）基質特異性：マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、可溶性澱粉、デキストランに作用する；
    を有し、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する、α－グルコシダーゼである、請求項１～６のいずれかに記載の使用。
  8. 　α－グルコシダーゼが、以下の酵素化学的性質をさらに有するものである、請求項７に記載の使用：
    （３）分子量：ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６５，０００ダルトンおよび７６，０００ダルトン；
    （４）等電点：ｐＩ４．９～５．５（中心値５．２）
    （５）至適温度：ｐＨ６．０、３０分間反応で、５５℃；
    （６）至適ｐＨ：４０℃、３０分間反応で、ｐＨ５．５；
    （７）温度安定性：ｐＨ６．０、１時間保持で、５０℃では初期活性の９０％以上の残存；
    （８）ｐＨ安定性：４℃、２４時間保持で、ｐＨ６．０～１０．０では初期活性の９０％以上の残存。
  9. 　多糖類を含む原料を加工して製造する飲食品の製造において、α－グルコシダーゼを使用することを含む飲食品の改良方法であって、ここでα－グルコシダーゼはα型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成するものである、方法。
  10. 　多糖類を含む原料が澱粉または澱粉加工品を含有するものである、請求項９に記載の方法。
  11. 　飲食品が米加工品である、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 　飲食品が小麦加工品である、請求項９または１０に記載の方法。
  13. 　飲食品が大麦加工品である、請求項９または１０に記載の方法。
  14. 　飲食品がじゃがいも加工品である、請求項９または１０に記載の方法。
  15. 　α－グルコシダーゼが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌由来のα－グルコシダーゼであって、以下の酵素化学的性質：
    （１）作用：α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する；
    （２）基質特異性：マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、可溶性澱粉、デキストランに作用する；
    を有し、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する、α－グルコシダーゼである、請求項９～１４のいずれかに記載の方法。
  16. 　α－グルコシダーゼが、以下の酵素化学的性質をさらに有するものである、請求項１５に記載の方法：
    （３）分子量：ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６５，０００ダルトンおよび７６，０００ダルトン；
    （４）等電点：ｐＩ４．９～５．５（中心値５．２）
    （５）至適温度：ｐＨ６．０、３０分間反応で、５５℃；
    （６）至適ｐＨ：４０℃、３０分間反応で、ｐＨ５．５；
    （７）温度安定性：ｐＨ６．０、１時間保持で、５０℃では初期活性の９０％以上の残存；
    （８）ｐＨ安定性：４℃、２４時間保持で、ｐＨ６．０～１０．０では初期活性の９０％以上の残存。
  17. 　澱粉または澱粉加工品を含有する原料をα－グルコシダーゼで処理したものを加工食品に添加する工程を含む、加工食品の品質の改良方法であって、ここでα－グルコシダーゼはα型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成するものである、方法。
  18. 　加工食品が畜肉加工食品または水産加工食品である、請求項１７に記載の方法。
  19. 　α－グルコシダーゼが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌由来のα－グルコシダーゼであって、以下の酵素化学的性質：
    （１）作用：α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する；
    （２）基質特異性：マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、可溶性澱粉、デキストランに作用する；
    を有し、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する、α－グルコシダーゼである、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 　α－グルコシダーゼが、以下の酵素化学的性質をさらに有するものである、請求項１９に記載の方法：
    （３）分子量：ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６５，０００ダルトンおよび７６，０００ダルトン；
    （４）等電点：ｐＩ４．９～５．５（中心値５．２）
    （５）至適温度：ｐＨ６．０、３０分間反応で、５５℃；
    （６）至適ｐＨ：４０℃、３０分間反応で、ｐＨ５．５；
    （７）温度安定性：ｐＨ６．０、１時間保持で、５０℃では初期活性の９０％以上の残存；
    （８）ｐＨ安定性：４℃、２４時間保持で、ｐＨ６．０～１０．０では初期活性の９０％以上の残存。
  21. 　α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成するα－グルコシダーゼを含む、多糖類を含む原料を加工して製造する飲食品の改良剤。
  22. 　α－グルコシダーゼが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌由来のα－グルコシダーゼであって、以下の酵素化学的性質：
    （１）作用：α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する；
    （２）基質特異性：マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、可溶性澱粉、デキストランに作用する；
    を有し、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα－１，６結合を有する糖質を生成する、α－グルコシダーゼである、請求項２１に記載の改良剤。
  23. 　α－グルコシダーゼが、以下の酵素化学的性質をさらに有するものである、請求項２２に記載の改良剤：
    （３）分子量：ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６５，０００ダルトンおよび７６，０００ダルトン；
    （４）等電点：ｐＩ４．９～５．５（中心値５．２）
    （５）至適温度：ｐＨ６．０、３０分間反応で、５５℃；
    （６）至適ｐＨ：４０℃、３０分間反応で、ｐＨ５．５；
    （７）温度安定性：ｐＨ６．０、１時間保持で、５０℃では初期活性の９０％以上の残存；
    （８）ｐＨ安定性：４℃、２４時間保持で、ｐＨ６．０～１０．０では初期活性の９０％以上の残存。
     
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