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WO2016060096A1 - ホスホリルコリン基含有化合物およびホスホリルコリン複合体 - Google Patents

ホスホリルコリン基含有化合物およびホスホリルコリン複合体 Download PDF

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WO2016060096A1
WO2016060096A1 PCT/JP2015/078862 JP2015078862W WO2016060096A1 WO 2016060096 A1 WO2016060096 A1 WO 2016060096A1 JP 2015078862 W JP2015078862 W JP 2015078862W WO 2016060096 A1 WO2016060096 A1 WO 2016060096A1
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WO
WIPO (PCT)
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compound
phosphorylcholine
group
complex
solvent
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2015/078862
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English (en)
French (fr)
Inventor
佐々木　崇
藤田　隆範
規郎 岩切
山本　宣之
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NOF Corp
Original Assignee
NOF Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to US15/519,746 priority patent/US9850266B2/en
Priority to EP15850193.2A priority patent/EP3208275B1/en
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    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
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    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/12—Esters of phosphoric acids with hydroxyaryl compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to a phosphorylcholine group-containing compound and a phosphorylcholine complex.
  • PC Phosphorylcholine
  • a compound having a PC group is used as a PC antigen for the purpose of producing a PC-specific antibody.
  • Patent Document 1 discloses a use example of a PC antigen in immunotherapy of atherosclerosis.
  • Atherosclerosis is a chronic disease that causes thickening of the innermost layer (intima) of the aorta and middle artery, and is a major cause of cardiovascular diseases including myocardial infarction. In affected areas of atherosclerosis, blood flow is reduced, and ischemia and tissue destruction can occur in tissues supplied by affected blood vessels.
  • Patent Document 1 by using a PC-protein complex in which an immunological carrier protein and PC are bound as a PC antigen, a monoclonal antibody having a PC specificity and a composition thereof can be obtained.
  • PC-specific monoclonal antibodies and compositions thereof have been shown to be useful for immunotherapy of atherosclerosis.
  • Patent Document 2 discloses the use of a PC antigen as a vaccine for inducing immune protection against infections such as Streptococcus pneumoniae. Another example of research aimed at such a vaccine is Non-Patent Document 1.
  • Non-Patent Document 1 reports that the PC antibody titer is increased by administering a PC-protein complex in the presence of an immunopotentiator in animal experiments.
  • an object of the present invention is to provide a phosphorylcholine group-containing compound and a phosphorylcholine complex which can be easily produced and can produce a phosphorylcholine complex suitable for use as a phosphorylcholine antigen.
  • the present inventors have found that a compound having a compact structure having an aromatic carboxylic acid structure in the molecule can solve the above problems unexpectedly, and The invention has been completed. That is, the present invention includes the following [1] to [4].
  • a phosphorylcholine-protein complex having a structure in which a phosphorylcholine group-containing compound having a structure represented by the following formula (1 ′) and an amino acid amine moiety of a protein are amide-bonded. ... (1 ') (X represents a hydrogen atom or a monovalent cation residue.)
  • a phosphorylcholine-peptide complex having a structure in which a phosphorylcholine group-containing compound having a structure represented by the following formula (1 ′) and an amino acid amine moiety of an oligopeptide are bonded with an amide bond. ... (1 ') (X represents a hydrogen atom or a monovalent cation residue.)
  • a phosphorylcholine-amino acid complex having a structure in which a phosphorylcholine group-containing compound having a structure represented by the following formula (1 ′) and an amino acid amine site of an amino acid are bonded with an amide bond. ... (1 ') (X represents a hydrogen atom or a monovalent cation residue.)
  • 1 is a 1 H NMR spectrum of 4-methoxycarbonylphenylphosphorylcholine. It is a 31 P NMR spectrum of 4-methoxycarbonylphenylphosphorylcholine.
  • 4 is an MS spectrum of 4-methoxycarbonylphenylphosphorylcholine.
  • 1 is a 1 H NMR spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine obtained by the DBU method. It is a 31 P NMR spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine obtained by the DBU method.
  • 3 is an MS spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine obtained by the DBU method.
  • 1 is a 1 H NMR spectrum of 4-methylphenylphosphorylcholine. It is a 31 P NMR spectrum of 4-methylphenylphosphorylcholine.
  • 4 is an MS spectrum of 4-methylphenylphosphorylcholine.
  • 1 is a 1 H NMR spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine obtained by the permanganic acid method. It is a 31 P NMR spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine obtained by the permanganic acid method.
  • 3 is an MS spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine obtained by the permanganic acid method. It is an HPLC chromatogram before reaction in the synthesis of a PC-amino acid complex. It is an HPLC chromatogram after reaction in the synthesis of a PC-amino acid complex. 2 is an MS spectrum of a PC-phenylalanine complex.
  • 1 is a 1 H NMR spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine succinimidyl. It is a 31 P NMR spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine succinimidyl. 4 is an MS spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine succinimidyl.
  • Phosphorylcholine (PC) group-containing compound The phosphorylcholine group-containing compound of the present invention has a structure represented by the following formula (1).
  • the monovalent cation residue is not particularly limited, but alkali metals such as lithium, sodium and potassium, or ammonia, imidazole, dimethylaminopyridine, triethylamine, diazabicyclooctane, diazabicyclononene (DBN), And nitrogen-containing organic compounds in which diazabicycloundecene (DBU) or the like is protonated.
  • X is a hydroxysuccinimide body having a structure represented by the above formula (2), it is more advantageous to lead the PC complex by advancing the amidation reaction advantageously as an active carboxyl group. Hydroxysuccinimide is eliminated rapidly after amidation.
  • the —COOX group in the formula (1) is bonded to any carbon on the benzene ring, but is preferably bonded to the phosphorylcholine group at the para-position.
  • the PC group-containing compound of the present invention has a structure in which one PC group and one carboxyl group are bonded to a benzene nucleus. That is, by having one carboxyl group in one molecule, a crosslinking reaction does not occur when binding to a protein, oligopeptide or amino acid.
  • a crosslinking reaction does not occur when binding to a protein, oligopeptide or amino acid.
  • PC group-containing compound of the present invention can be produced by the following production method 1 or 2.
  • -Manufacturing method 1 A compound having a structure represented by the formula (1) having a carboxyl group is generated by hydrolyzing a compound having a structure represented by the following formula (3) using a basic compound.
  • R represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a benzyl group.
  • a compound having a structure represented by the formula (1) having a carboxyl group is generated by oxidizing a compound having a structure represented by the following formula (4) using an oxidizing agent.
  • the PC group-containing compound production method 1 includes the following steps A1 to A3.
  • Step A1 Carboxylic acid ester-containing phenolic compound and 2-chloro-2-oxo-1,3,2-dioxaphosphorane (COP) are reacted with each other in a solvent using a dechlorinating agent.
  • An acid ester-containing oxaphospholane (OP) compound is produced.
  • Step A2 A carboxylic acid ester-containing PC compound is produced by reacting the carboxylic acid ester-containing OP compound obtained in Step A1 with trimethylamine.
  • Step A3 A compound having a structure represented by the formula (1) having a carboxyl group is obtained by hydrolyzing the ester in water in the presence of a basic compound, the carboxylic acid ester-containing PC compound obtained in Step A2. Generate.
  • Step A1 is a step of producing a carboxylic acid ester-containing OP compound by reacting a carboxylic acid ester-containing phenolic compound with COP using a dechlorinating agent in a solvent.
  • a carboxylic acid ester-containing phenolic compound for example, a compound having a structure in which one carboxylic acid ester is bonded to a benzene nucleus, such as oxybenzoic acid ester, can be used. These positional isomers can also be used.
  • Examples of the oxybenzoic acid ester include a methyl ester type (methyl hydroxybenzoate), an ethyl ester type (ethyl hydroxybenzoate), a propyl ester type (propyl propyl hydroxybenzoate), a butyl ester type (butyl hydroxybenzoate), Examples include pentyl ester type (pentyl hydroxybenzoate), hexyl ester type (hexyl hydroxybenzoate), and benzyl ester type (benzyl hydroxybenzoate).
  • the above oxybenzoic acid ester is, for example, a paraoxy such as methyl parahydroxybenzoate, ethyl parahydroxybenzoate, propyl parahydroxybenzoate, butyl parahydroxybenzoate, benzyl parahydroxybenzoate and the like.
  • a benzoic acid ester is preferred.
  • Step A1 can be performed in the presence of a solvent.
  • a solvent an aprotic solvent is preferable.
  • the aprotic solvent include nitriles such as acetonitrile, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, amides such as dimethylformamide, esters such as ethyl acetate and isopropyl acetate, ethers such as tetrahydrofuran, chloroform, dichloromethane and the like. And chlorinated organic solvents.
  • the amount of the solvent used is not particularly limited, but from the viewpoint of temperature control during reaction and control of side reactions, 1 part by mass to 100 parts by mass of the solvent with respect to 1 part by mass of the carboxylic acid ester-containing phenolic compound. It is preferable that In particular, in consideration of economy, the amount of the solvent used is more preferably 1 part by mass to 10 parts by mass with respect to 1 part by mass of the carboxylic acid ester-containing phenolic compound.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as it is not lower than the freezing point of the solvent, but it is preferably ⁇ 20 ° C. to 50 ° C., which allows easy temperature control. More preferably, it is ° C.
  • the reaction time in step A1 is not particularly limited, but can usually be 1 to 8 hours.
  • the amount of COP used is usually 0.7 to 3.0 molar equivalents and 0.8 to 2.0 molar equivalents per mole of the carboxylic ester-containing phenolic compound.
  • the molar ratio is preferably 0.9 molar equivalent to 1.2 molar equivalent.
  • the dehydrochlorinating agent used in Step A1 include organic bases and inorganic bases.
  • the dehydrochlorinating agent is preferably trimethylamine, triethylamine, diisopropylamine, pyridine or the like.
  • the amount of the dehydrochlorinating agent used is usually 0.7 to 3.0 molar equivalents relative to COP, preferably 0.8 to 2.0 molar equivalents, preferably 0.9 molar equivalents. More preferably, it is equivalent to 1.2 molar equivalents.
  • Step A2 is a step of generating a carboxylic acid ester-containing PC compound by reacting the carboxylic acid ester-containing OP compound obtained in Step A1 with trimethylamine.
  • Step A2 can be performed in the presence of a solvent.
  • a solvent an aprotic solvent is preferable.
  • the aprotic solvent include nitriles such as acetonitrile, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, amides such as dimethylformamide, esters such as ethyl acetate and isopropyl acetate, ethers such as tetrahydrofuran, chloroform, dichloromethane and the like. And chlorinated organic solvents.
  • the amount of the solvent used is not particularly limited, but from the viewpoint of controlling the temperature during the reaction and controlling the side reaction, the solvent is used in an amount of 1 to 100 parts by mass with respect to 1 part by mass of the carboxylic acid ester-containing OP compound. Preferably there is. In particular, in view of economy, the amount of the solvent used is more preferably 1 part by mass to 20 parts by mass with respect to 1 part by mass of the carboxylic acid ester-containing OP compound.
  • Step A3 is a step of synthesizing a carboxyl group-containing PC compound by hydrolyzing the ester of the carboxylic acid ester-containing PC compound obtained in Step A2 in water in the presence of a basic compound.
  • Step A3 can be performed in the presence of a solvent.
  • the solvent is usually water alone or a water-containing organic solvent, preferably water alone.
  • the amount of the solvent used is not particularly limited, but from the viewpoint of controlling the temperature during the reaction and controlling the side reaction, the solvent is used in an amount of 1 to 100 parts by mass with respect to 1 part by mass of the carboxylic acid ester-containing PC compound. Preferably there is.
  • the amount of the solvent used is more preferably 1 part by mass to 20 parts by mass with respect to 1 part by mass of the carboxylic acid ester-containing PC compound.
  • the basic compound used in Step A3 is not particularly limited as long as it can cleave the ester bond and convert it to a carboxyl group.
  • the basic compound include strongly basic compounds such as potassium hydroxide, sodium hydroxide, diazabicyclononene (DBN), diazabicycloundecene (DBU), and triethylamine from the viewpoint of reaction rate.
  • the amount of the basic compound used can usually be 1 to 2 molar equivalents relative to the carboxylic ester-containing PC compound.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but can usually be 0 ° C. to 100 ° C.
  • the reaction time in step A3 is not particularly limited, but can usually be 1 to 6 hours.
  • the PC group-containing compound production method 2 includes the following steps B1 to B3.
  • Step B1 An alkyl group-containing OP compound is produced by reacting an alkyl group-containing phenolic compound with COP in a solvent using a dechlorinating agent.
  • Step B2 An alkyl group-containing PC compound is produced by reacting the alkyl group-containing OP compound obtained in Step B1 with trimethylamine.
  • Step B3 A compound having a structure represented by Formula (1) having a carboxyl group is generated by oxidizing the alkyl group-containing PC compound obtained in Step B2 using an oxidizing agent.
  • Step B1 is a step of producing an alkyl group-containing OP compound by reacting an alkyl group-containing phenolic compound with COP using a dechlorinating agent in a solvent.
  • the alkyl group-containing phenolic compound for example, a compound having a structure in which one alkyl group is bonded to a benzene nucleus, such as cresol, can be used. It can also be used by the body.
  • Step B1 can be performed in the presence of a solvent.
  • a solvent an aprotic solvent is preferable.
  • the aprotic solvent include nitriles such as acetonitrile, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, amides such as dimethylformamide, esters such as ethyl acetate and isopropyl acetate, ethers such as tetrahydrofuran, chloroform, dichloromethane and the like. And chlorinated organic solvents.
  • the amount of solvent used is not particularly limited, but from the viewpoint of temperature control during reaction and control of side reactions, the solvent is used in an amount of 1 to 100 parts by mass with respect to 1 part by mass of the alkyl group-containing phenolic compound. Preferably there is. In particular, in consideration of economy, the amount of the solvent used is more preferably 1 part by mass to 10 parts by mass with respect to 1 part by mass of the alkyl group-containing phenolic compound.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as it is not lower than the freezing point of the solvent, but it is preferably ⁇ 20 ° C. to 50 ° C., which allows easy temperature control. More preferably, it is ° C.
  • the reaction time in step B1 is not particularly limited, but can usually be 1 to 6 hours.
  • the amount of COP used is usually 0.7 molar equivalents to 3.0 molar equivalents and 0.8 molar equivalents to 2.0 molar equivalents per mole of the alkyl group-containing phenolic compound. It is preferably 0.9 molar equivalent to 1.2 molar equivalent.
  • the dehydrochlorinating agent used in Step B1 include organic bases and inorganic bases. Furthermore, from the viewpoints of solubility in a solvent and filterability of the generated salt, the dehydrochlorinating agent is preferably trimethylamine, triethylamine, diisopropylamine, pyridine or the like.
  • the amount of the dehydrochlorinating agent used is usually 0.7 to 3.0 molar equivalents relative to COP, preferably 0.8 to 2.0 molar equivalents, preferably 0.9 molar equivalents. More preferably, it is equivalent to 1.2 molar equivalents.
  • Step B2 is a step of producing an alkyl group-containing PC compound by reacting the alkyl group-containing OP compound obtained in Step B1 with trimethylamine.
  • Step B2 can be performed in the presence of a solvent.
  • a solvent an aprotic solvent is preferable.
  • the aprotic solvent include nitriles such as acetonitrile, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, amides such as dimethylformamide, esters such as ethyl acetate and isopropyl acetate, ethers such as tetrahydrofuran, chloroform, dichloromethane and the like. And chlorinated organic solvents.
  • the amount of the solvent used is not particularly limited, but from the viewpoint of temperature control during reaction and controllability of side reactions, the solvent is used in an amount of 1 to 100 parts by mass with respect to 1 part by mass of the alkyl group-containing OP compound. Preferably there is. In particular, in consideration of economy, the amount of the solvent used is more preferably 1 part by mass to 20 parts by mass with respect to 1 part by mass of the alkyl group-containing OP compound.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but can usually be 40 ° C to 80 ° C.
  • the reaction time in step B2 is not particularly limited, but can usually be 6 to 24 hours.
  • the amount of trimethylamine used can usually be 1 to 2 molar equivalents relative to the alkyl group-containing OP compound.
  • Step B3 is a step of generating a carboxyl group-containing PC compound by oxidizing the alkyl group-containing PC compound obtained in Step B2 using an oxidizing agent.
  • Step B3 can be performed in the presence of a solvent.
  • the solvent is not particularly limited, but is preferably a protic solvent, and more preferably water.
  • the amount of solvent used is not particularly limited, but from the viewpoint of temperature control during reaction and control of side reactions, it is 1 part by mass to 100 parts by mass of solvent with respect to 1 part by mass of the alkyl group-containing PC compound. It is preferable. In particular, in consideration of economy, the amount of the solvent used is more preferably 1 part by mass to 10 parts by mass with respect to 1 part by mass of the alkyl group-containing PC compound.
  • the oxidizing agent used in step B3 is not particularly limited as long as it can convert an alkyl group into a carboxyl group.
  • the oxidizing agent is preferably a strong oxidizing agent such as permanganate from the viewpoint of reaction rate, and potassium permanganate is more preferable in view of availability.
  • the amount of the oxidizing agent to be used is not particularly limited, but is preferably 1 to 10 molar equivalents relative to the alkyl group-containing PC compound. In consideration of economic efficiency and environmental load, 1 to 3 molar equivalents. More preferably.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but it is preferable to carry out the reaction under reflux near the boiling point of the solvent from the viewpoint of the reaction rate.
  • the reaction time in step B3 is not particularly limited, but can usually be 1 hour to 8 hours.
  • X is hydroxysuccinimide or hydroxysulfosuccinimide sodium sulfate (hereinafter abbreviated as NHS form) having a structure represented by the formula (2)
  • X obtained above is a carboxylic acid or a salt. It can be obtained by further performing the following step C on the carboxyl group-containing PC compound.
  • step C N-hydroxysuccinimide or sodium N-hydroxysuccinimide sulfate is condensed with a carboxyl group-containing PC compound (X is a carboxylic acid or salt) obtained in steps A3 and B3 using a condensing agent.
  • X is a carboxylic acid or salt
  • Step C can be performed in the presence of a solvent.
  • the solvent an aprotic solvent is preferable.
  • the aprotic solvent examples include nitriles such as acetonitrile and benzonitrile, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, amides such as dimethylformamide, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, esters such as ethyl acetate and isopropyl acetate, Examples thereof include ethers such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane, and chlorinated organic solvents such as chloroform and dichloromethane.
  • the solvent is preferably acetonitrile or dimethylformamide.
  • the amount of solvent used is not particularly limited, but from the viewpoint of temperature control and inhibiting side reactions, the solvent is preferably 1 part by mass to 100 parts by mass with respect to 1 part by mass of the carboxyl group-containing PC compound. In particular, in consideration of economy, the amount of the solvent used is more preferably 1 part by mass to 10 parts by mass with respect to 1 part by mass of the carboxyl group-containing PC compound.
  • the reaction temperature is not particularly limited, but can usually be 0 ° C. to 50 ° C.
  • the reaction time in Step C is not particularly limited, but can usually be 8 hours to 96 hours.
  • the condensing agent used in Step C examples include 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, N, N′-diisopropylcarbodiimide, 1,3-dicyclohexylcarbodiimide, and the like.
  • the condensing agent is preferably 1,3-dicyclohexylcarbodiimide.
  • the amount of the condensing agent used can usually be 1 to 5 molar equivalents relative to the carboxyl group-containing PC compound.
  • the amount of N-hydroxysuccinimide or sodium N-hydroxysuccinimide sulfate used can usually be 1 to 5 molar equivalents relative to the carboxyl group-containing PC compound.
  • the phosphorylcholine group-containing compound of the present invention can be reacted with an amino acid amine site of a protein, peptide, or amino acid to form an amide bond, thereby forming a phosphorylcholine-protein complex, phosphorylcholine-peptide complex, or phosphorylcholine, respectively.
  • -Amino acid complexes can be obtained.
  • proteins include human serum albumin (HSA), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin (OVA), keyhole limpet hemocyanin ( KLH), tri-gamma globulin (CGG), diphtheria toxoid, protein D and the like can be used.
  • HSA human serum albumin
  • BSA bovine serum albumin
  • OVA ovalbumin
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • CGG tri-gamma globulin
  • diphtheria toxoid protein D and the like
  • the reaction temperature, reaction time, and pH when synthesizing the PC-protein complex are not particularly limited as long as the protein does not decompose or denature.
  • the reaction temperature when the reaction is carried out in a buffered aqueous solution at atmospheric pressure is usually 0 ° C. to 100 ° C., preferably 20 ° C. to 60 ° C.
  • the reaction time is usually 1 second to 1 week, and preferably 1 hour to 3 days.
  • the pH is usually 2 to 12, and preferably 5 to 9.
  • a dialysis membrane For purification of the PC-protein complex, for example, a dialysis membrane can be used.
  • a buffer aqueous solution used for synthesis and dialysis purification a buffer aqueous solution used in the biochemical field such as a phosphate buffer, a borate buffer, and a carbonate buffer can be used.
  • the salt concentration of the buffered aqueous solution is usually 0.0001 mol / L to 10 mol / L, preferably 0.01 mol / L to 1 mol / L.
  • oligopeptides include alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, Oligopeptides to which 2 to 10 amino acids consisting of any combination selected from methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, and valine are bound can be used.
  • the reaction temperature, reaction time, and pH for synthesizing the PC-peptide complex are not particularly limited as long as the oligopeptide does not decompose or denature.
  • the reaction temperature when the reaction is carried out in a buffered aqueous solution at atmospheric pressure is usually 0 ° C. to 100 ° C., preferably 20 ° C. to 60 ° C.
  • the reaction time is usually 1 second to 1 week, and preferably 1 hour to 3 days.
  • the pH is usually 2 to 12, and preferably 5 to 9.
  • amino acids include alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine. , Phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, and valine can be used.
  • Examples of the method for synthesizing the PC-amino acid complex include a method in which a coupling reaction is performed using a condensing agent in water or a buffer solution.
  • the condensing agent is not particularly limited, and for example, ethyldimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride having high water solubility can be used.
  • the reaction temperature, reaction time, and pH when synthesizing the PC-amino acid complex are not particularly limited as long as the amino acid is not decomposed.
  • the reaction temperature when the reaction is carried out in a buffered aqueous solution at atmospheric pressure is usually 0 ° C. to 100 ° C., preferably 20 ° C. to 60 ° C.
  • the reaction time is usually 1 second to 1 week, and preferably 1 hour to 3 days.
  • the pH is usually 2 to 12, and preferably 5 to 9.
  • the PC-amino acid complex can be used as a raw material for obtaining a PC-protein complex or PC-peptide complex by binding to another oligopeptide or protein.
  • FIG. 1 shows the 1 H NMR spectrum of 4-methoxycarbonylphenylphosphorylcholine obtained as described above
  • FIG. 2 shows the 31 P NMR spectrum
  • FIG. 3 shows the MS spectrum of 4-methoxycarbonylphenylphosphorylcholine obtained as described above.
  • FIG. 4 shows the 1 H NMR spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine obtained as described above
  • FIG. 5 shows the 31 P NMR spectrum
  • FIG. 6 shows the MS spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine obtained as described above.
  • Example a1-3 ⁇ Synthesis of 4-carboxyphenylphosphorylcholine by hydrolysis (step A3, NaOH method)> 10 g of 4-methoxycarbonylphenylphosphorylcholine obtained above was dissolved in 90 g of distilled water, 1.2 g of sodium hydroxide was added, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 2 hours. Thereafter, the reaction solution was neutralized with 3.6 g of concentrated hydrochloric acid, and concentrated to dryness with an evaporator. The obtained solid was purified by column and the solvent was distilled off to obtain 8.5 g of solid.
  • FIG. 7 shows a 1 H NMR spectrum of 4-methylphenylphosphorylcholine obtained as described above
  • FIG. 8 shows a 31 P NMR spectrum
  • FIG. 9 shows the MS spectrum of 4-methylphenylphosphorylcholine obtained as described above.
  • step B3 ⁇ Synthesis of 4-carboxyphenylphosphorylcholine by oxidation (step B3, permanganate method)> 4 g of 4-methylphenylphosphorylcholine obtained above was dissolved in 45 g of distilled water, and then 6.1 g of potassium permanganate was added. This solution was heated to 100 ° C. and reacted under reflux for 3 hours. After cooling to 25 ° C., insoluble matters were filtered off, and 4 g of 35% hydrochloric acid was added to the resulting solution.
  • FIG. 10 shows the 1 H NMR spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine obtained as described above, and FIG. 11 shows the 31 P NMR spectrum.
  • FIG. 12 shows the MS spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine obtained as described above.
  • Example a2-1 ⁇ Synthesis of PC-amino acid complex> First, morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES, manufactured by Sigma-Aldrich) was dissolved in purified water to prepare a 0.1 M MES buffer solution. Next, 50 mg of 4-carboxyphenylphosphorylcholine synthesized in Example a1-1, 50 mg of phenylalanine and 25 mg of ethyldimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride (manufactured by Pierce Biotechnologies) as a condensing agent are dissolved in 10 mL of 0.1 M MES buffer solution. By stirring at 25 ° C. for 24 hours, a PC-phenylalanine complex having a structure represented by the formula (8) was obtained.
  • MES morpholinoethanesulfonic acid hydrate
  • FIG. 13 shows an HPLC chromatogram of the solution before the stirring for 24 hours (before the reaction) in the synthesis of the PC-amino acid complex.
  • FIG. 14 shows an HPLC chromatogram of the solution after the stirring for 24 hours (after the reaction). Represents a gram. From comparison between FIGS. 13 and 14, it was confirmed that the peak of 4-carboxyphenylphosphorylcholine disappeared and a new peak appeared.
  • Example a2-2 ⁇ Synthesis of PC-protein complex> 4 mg of 4-carboxyphenylphosphorylcholine obtained in Example a1-1, 4 mg of bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich) and 2 mg of ethyldimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) as a condensing agent Dissolved in 1.6 mL of 0.1 M MES buffer solution. This solution was stirred at 25 ° C. for 2 hours, and then purified by dialysis in phosphate buffered saline (PBS) at pH 7.4 at 4 ° C., so that the PC-protein complex (PC-BSA) was obtained. Obtained.
  • BSA bovine serum albumin
  • PC-BSA phosphate buffered saline
  • FIG. 16 shows the 1H NMR spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine succinimidyl obtained as described above, and FIG. 17 shows the 31P NMR spectrum.
  • FIG. 18 shows the MS spectrum of 4-carboxyphenylphosphorylcholine succinimidyl.
  • Example b2 ⁇ Synthesis of PC-protein complex> 20 mg of 4-carboxyphenylphosphorylcholine succinimidyl obtained in Example b1, 8 mg of bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich) and 8 mg of sodium bicarbonate were dissolved in 2 mL of distilled water. This solution was stirred at 25 ° C. for 24 hours, and then purified by dialysis in phosphate buffered saline (PBS) at pH 7.4 at 4 ° C. to obtain a PC-protein complex (PC-BSA).
  • PBS phosphate buffered saline
  • PC-BSA or BSA obtained in Examples a2-2 and b2 was dissolved in a carbonate / bicarbonate buffer solution (manufactured by Sigma-Aldrich), and the concentration was adjusted to 5 ⁇ L / mL. These solutions were dispensed into a 96-well microtiter plate (manufactured by Dynatech) at 50 ⁇ L / well and kept at 4 ° C. for 16 hours. Next, the plate was washed with PBS to which Tween 20 having a concentration of 0.05% was added, and then 25% Block Ace was dispensed at 200 ⁇ L / well and kept at 36 ° C. for 1 hour.
  • a carbonate / bicarbonate buffer solution manufactured by Sigma-Aldrich
  • the plate was washed with PBS to which Tween 20 having a concentration of 0.05% was added, the sample was injected at 50 ⁇ L / well, and held at 25 ° C. for 1 hour.
  • the plate was washed with PBS added with Tween 20 at a concentration of 0.05%, and a horseradish peroxidase (HRP) -labeled goat anti-human IgA antibody (manufactured by Southern Biotechnology Associates) 2000-fold diluted product at 50 ⁇ L / well. Poured and held at 25 ° C. for 1 hour.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the plate was washed with PBS supplemented with 0.05% Tween 20, and HRP substrate solution was dispensed at 100 ⁇ L / well and reacted at 25 ° C. for 15 minutes. After 15 minutes, 100 ⁇ L / well of dilute sulfuric acid was added to stop the reaction, and the absorbance at 450 nm (OD 450 ) was measured.
  • Table 1 shows the measurement results of the anti-PC antibody titer of PC-BSA (Example a2-2) relating to the PC group-containing compound in which X is a hydrogen atom or a monovalent cation residue.
  • Table 2 shows the measurement results of the anti-PC antibody titer of PC-BSA (Example b2) relating to the PC group-containing compound in which X is a hydroxysuccinimide group.
  • Comparative Example a1 is a comparative example of a PC group-containing compound in which X of the present invention is a hydrogen atom or a monovalent cation residue.
  • a compound having a structure represented by the formula (11) was synthesized according to the method described in International Publication No. 2004/074298.
  • Comparative example b1 is a comparative example of a PC group-containing compound in which X of the present invention is a hydroxysuccinimide group.
  • a compound having a structure represented by the formula (11) was synthesized according to the method described in International Publication No. 2004/074298. 20 mg of the compound having the structure represented by the formula (11) thus obtained, 8 mg of bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich) and 8 mg of sodium bicarbonate were dissolved in 2 mL of distilled water. Although this solution was stirred at 25 ° C. for 24 hours, the product was in a gel form and could not be dissolved in a 0.1 M MES buffer solution used for measurement of the anti-PC antibody titer.
  • BSA bovine serum albumin
  • Comparative example b2 is a comparative example of a PC group-containing compound in which X of the present invention is a hydroxysuccinimide group.
  • a compound having a structure represented by the formula (11) was synthesized according to the method described in International Publication No. 2004/074298. 5.0 g of the obtained compound having the structure represented by the formula (11) and 6.0 g of N-hydroxysuccinimide were added to 35.0 g of DMF. This solution was kept at 25 ° C., 13.6 g of 1,3-dicyclohexylcarbodiimide dissolved in 20 g of DMF was added, and the mixture was reacted at 25 ° C. for 72 hours. After the reaction, the solution was filtered to collect a solid and recrystallized with acetonitrile to obtain 4.4 g (yield 56%) of a compound having a structure represented by the formula (12) after drying under reduced pressure.
  • An aromatic compound having a structure containing one carboxyl group and one PC group each having a structure represented by the formula (1) can be effectively used as a raw material for obtaining a PC-protein complex.
  • the obtained PC-protein complex, PC-peptide complex, or PC-amino acid complex can be used as a PC antigen or a raw material for producing PC antigen.
  • the obtained PC antigen can be effectively used as a raw material for PC antibody production in the manufacture of pharmaceuticals containing PC antibodies.

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Abstract

【課題】製造が容易であり、かつホスホリルコリン抗原としての利用に適したホスホリルコリン複合体を生成可能なホスホリルコリン基含有化合物およびホスホリルコリン複合体を提供すること。 【解決手段】下記の式（１）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物、および該ホスホリルコリン基含有化合物と、蛋白質のアミノ酸アミン部位とがアミド結合した構造を有するホスホリルコリン－蛋白複合体。（Ｘは水素原子または１価のカチオン残基、もしくはヒドロキシスクシンイミド基である。）

Description

ホスホリルコリン基含有化合物およびホスホリルコリン複合体
　本発明は、ホスホリルコリン基含有化合物およびホスホリルコリン複合体に関する。
　ホスホリルコリン（ＰＣ）は、血小板活性化因子のような炎症性リン脂質や酸化された低密度リポタンパク質において主要な成分であるだけでなく、肺炎連鎖球菌をはじめ多数の細菌の免疫原性成分としても主要な成分である。ＰＣ基を有する化合物は、ＰＣ特異的抗体の産生を目的としたＰＣ抗原として利用されている。例えば、特許文献１には、アテローム性動脈硬化症の免疫治療におけるＰＣ抗原の利用例が開示されている。アテローム性動脈硬化症は、大動脈および中動脈の最内側層（内膜）の肥厚を引き起こす慢性疾患であり、心筋梗塞をはじめとする心臓血管疾患の主な原因である。アテローム性動脈硬化症の患部では血流が減少し、影響を受けた血管によって供給されている組織において虚血および組織破壊が起こり得る。
　特許文献１によれば、ＰＣ抗原として免疫学的担体蛋白質とＰＣを結合させたＰＣ－蛋白複合体を用いることにより、ＰＣ特異性を持つモノクローナル抗体およびその組成物が得られること、および、これらのＰＣ特異的モノクローナル抗体およびその組成物が、アテローム性動脈硬化症の免疫治療に有用であることが示されている。また、特許文献２には、肺炎連鎖球菌などの感染に対する免疫保護を誘導するためのワクチンとしてのＰＣ抗原の利用が開示されている。このようなワクチンを目指した研究としては、他に非特許文献１が挙げられる。非特許文献１においては、動物実験において免疫増強剤の存在下にてＰＣ－蛋白複合体を投与することにより、ＰＣ抗体価が上昇することを報告されている。
　また、分子内にホスホリルコリン基を導入し高分子複合体を形成するための方法が種々提案されている（例えば特許文献３、４）が、ホスホリルコリン基含有化合物に基づくＰＣ－蛋白複合体の開発には至っていない。これは主に、ホスホリルコリン基含有化合物が機能を発現させるための構造に由来して、製造工程に複数段階の反応を要し、製造が容易とはいえないためである。このため、製造が容易でかつ、ＰＣ－蛋白複合体として機能するＰＣ基含有化合物が求められている。
国際公開第２００５／１００４０５号明細書 米国特許第５４５５０３２号明細書 特開２００７－１１９６４３号公報 国際公開第２００４／０７４２９８号明細書
Ｎｏｒｉｍｉｔｓｕ　Ｔ．　ｅｔ．ａｌ．，"Ｖａｃｃｉｎｅ"，２００７，２５（１４），ｐ．２６８０－２６８７．
　上記の通り、本発明の目的は、製造が容易であり、かつホスホリルコリン抗原としての利用に適したホスホリルコリン複合体を生成可能なホスホリルコリン基含有化合物およびホスホリルコリン複合体を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、芳香族カルボン酸構造を分子内に有するコンパクトな構造の化合物が意外にも上記課題を解決できることの知見を見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は下記の〔１〕～〔４〕である。
〔１〕下記の式（１）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（１）
（Ｘは水素原子または１価のカチオン残基、もしくは下記の式（２）で表される構造を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（２）
（Ｙは水素原子またはＳＯ３Ｎａを示す。）
〔２〕下記の式（１'）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物と、蛋白質のアミノ酸アミン部位とがアミド結合した構造を有するホスホリルコリン－蛋白複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（１'）
（Ｘは水素原子または１価のカチオン残基を示す。）
〔３〕下記の式（１'）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物と、オリゴペプチドのアミノ酸アミン部位とがアミド結合した構造を有するホスホリルコリン－ペプチド複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（１'）
（Ｘは水素原子または１価のカチオン残基を示す。）
〔４〕下記の式（１'）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物と、アミノ酸のアミノ酸アミン部位とがアミド結合した構造を有するホスホリルコリン－アミノ酸複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（１'）
（Ｘは水素原子または１価のカチオン残基を示す。）
　製造が容易であり、かつホスホリルコリン抗原としての利用に適したホスホリルコリン複合体を生成可能なホスホリルコリン基含有化合物およびホスホリルコリン複合体を提供することができる。
４－メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリンの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルである。 ４－メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリンの３１Ｐ　ＮＭＲスペクトルである。 ４－メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルである。 ＤＢＵ法により得られた４－カルボキシフェニルホスホリルコリンの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルである。 ＤＢＵ法により得られた４－カルボキシフェニルホスホリルコリンの３１Ｐ　ＮＭＲスペクトルである。 ＤＢＵ法により得られた４－カルボキシフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルである。 ４－メチルフェニルホスホリルコリンの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルである。 ４－メチルフェニルホスホリルコリンの３１Ｐ　ＮＭＲスペクトルである。 ４－メチルフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルである。 過マンガン酸法により得られた４－カルボキシフェニルホスホリルコリンの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルである。 過マンガン酸法により得られた４－カルボキシフェニルホスホリルコリンの３１Ｐ　ＮＭＲスペクトルである。 過マンガン酸法により得られた４－カルボキシフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルである。 ＰＣ－アミノ酸複合体合成における反応前のＨＰＬＣクロマトグラムである。 ＰＣ－アミノ酸複合体合成における反応後のＨＰＬＣクロマトグラムである。 ＰＣ－フェニルアラニン複合体のＭＳスペクトルである。 ４－カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジルの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルである。 ４－カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジルの３１Ｐ　ＮＭＲスペクトルである。 ４－カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジルのＭＳスペクトルである。
１．ホスホリルコリン（ＰＣ）基含有化合物
　本発明のホスホリルコリン基含有化合物は、下記の式（１）で表される構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（１）
（Ｘは水素原子または１価のカチオン残基、もしくは下記の式（２）で表される構造を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（２）
（Ｙは水素原子またはＳＯ３Ｎａを示す。）
　上記の１価のカチオン残基としては、特に限定されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、またはアンモニア、イミダゾール、ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、ジアザビシクロオクタン、ジアザビシクロノネン（ＤＢＮ）、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）等がプロトン化された含窒素有機化合物等が挙げられる。
　さらに、Ｘが前記の（２）式で表される構造を有するヒドロキシスクシンイミド体であるとき、活性カルボキシル基としてアミド化反応を有利に進行させ、ＰＣ複合体を導くのにより有利となる。ヒドロキシスクシンイミドは、アミド化後速やかに脱離する。また、式（１）中の－ＣＯＯＸ基は、ベンゼン環上のいずれかの炭素上に結合しているが、ホスホリルコリン基に対して、パラ－位で結合していることが好ましい。
　本発明のＰＣ基含有化合物は、ベンゼン核に１つのＰＣ基と１つのカルボキシル基とが結合した構造を有する。すなわち、１分子内に１つのカルボキシル基を有することにより、蛋白質、オリゴペプチド、またはアミノ酸と結合させる際に架橋反応が起こらない。これにより、ＰＣ複合体の原料として本発明のＰＣ基含有化合物を用いることで、ＰＣ抗原としての利用に適した、水に可溶なＰＣ－蛋白複合体、ＰＣ－ペプチド複合体、またはＰＣ－アミノ酸複合体を得ることができる。
２．ＰＣ基含有化合物の製造方法
　本発明のＰＣ基含有化合物は、次の製造方法１または２により製造することができる。
・製造方法１：
　下記の式（３）で表される構造を有する化合物を、塩基性化合物を用いて加水分解することにより、カルボキシル基を有する式（１）で表される構造を有する化合物を生成する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（３）
（Ｒは、炭素原子数１～６のアルキル基、またはベンジル基を示す。）
・製造方法２：
　下記の式（４）で表される構造を有する化合物を、酸化剤を用いて酸化することにより、カルボキシル基を有する式（１）で表される構造を有する化合物を生成する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（４）
＜ＰＣ基含有化合物の製造方法１＞
　ＰＣ基含有化合物の製造方法１は、具体的には、次の工程Ａ１～Ａ３を含む。
　工程Ａ１：カルボン酸エステル含有フェノール性化合物と２－クロロ－２－オキソ－１，３，２－ジオキサホスホラン（ＣＯＰ）とを、溶媒中で脱塩素化剤を用い反応させることにより、カルボン酸エステル含有オキサホスホラン（ＯＰ）化合物を生成する。
　工程Ａ２：工程Ａ１で得られたカルボン酸エステル含有ＯＰ化合物にトリメチルアミンを反応させることにより、カルボン酸エステル含有ＰＣ化合物を生成する。
　工程Ａ３：工程Ａ２で得られたカルボン酸エステル含有ＰＣ化合物を、塩基性化合物存在下、水中でエステルを加水分解することにより、カルボキシル基を有する式（１）で表される構造を有する化合物を生成する。
（工程Ａ１）
　工程Ａ１は、カルボン酸エステル含有フェノール性化合物とＣＯＰとを、溶媒中で脱塩素化剤を用いて反応させることにより、カルボン酸エステル含有ＯＰ化合物を生成する工程である。上記カルボン酸エステル含有フェノール性化合物としては、例えば、オキシ安息香酸エステルのようなベンゼン核に１個のカルボン酸エステルが結合した構造の化合物を用いることができ、また、オルト、メタ、パラ、いずれの位置異性体でも用いることができる。上記オキシ安息香酸エステルとしては、例えば、メチルエステル型（ヒドロキシ安息香酸メチル）、エチルエステル型（ヒドロキシ安息香酸エチル）、プロピルエステル型（ヒドロキシ安息香酸プロピル）、ブチルエステル型（ヒドロキシ安息香酸ブチル）、ペンチルエステル型（ヒドロキシ安息香酸ペンチル）、ヘキシルエステル型（ヒドロキシ安息香酸ヘキシル）、ベンジルエステル型（ヒドロキシ安息香酸ベンジル）等が挙げられる。さらに、上記オキシ安息香酸エステルは、入手性や経済性から、例えば、パラヒドロキシ安息香酸メチル、パラヒドロキシ安息香酸エチル、パラヒドロキシ安息香酸プロピル、パラヒドロキシ安息香酸ブチル、パラヒドロキシ安息香酸ベンジル等のパラオキシ安息香酸エステルであることが好ましい。
　工程Ａ１は、溶媒の存在下で行うことができる。当該溶媒としては、非プロトン性溶媒が好ましい。非プロトン性溶媒としては、例えば、アセトニトリル等のニトリル類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミド等のアミド類、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、テトラヒドロフラン等のエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタン等の塩素系有機溶媒等が挙げられる。工程Ａ１において、溶媒の使用量は特に限定されないが、反応時の温度制御や副反応の制御といった観点から、カルボン酸エステル含有フェノール性化合物１質量部に対して、溶媒１質量部～１００質量部であることが好ましい。特に、経済性を考慮すると、溶媒の使用量は、カルボン酸エステル含有フェノール性化合物１質量部に対して、溶媒１質量部～１０質量部であることがさらに好ましい。工程Ａ１において、反応温度は溶媒の凝固点以下でなければ特に限定されないが、温度制御が容易な－２０℃～５０℃であることが好ましく、さらに、副反応を抑制する観点から－２０℃～０℃であることがより好ましい。
　工程Ａ１の反応時間は特に限定されないが、通常１時間～８時間とすることができる。工程Ａ１において、ＣＯＰの使用量は、カルボン酸エステル含有フェノール性化合物１モルに対して通常０．７モル当量～３．０モル当量であり、０．８モル当量～２．０モル当量であることが好ましく、０．９モル当量～１．２モル当量であることがより好ましい。工程Ａ１に用いられる脱塩化水素剤としては、有機塩基または無機塩基が挙げられる。さらに、溶媒に対する溶解性、生成する塩のろ過性の観点等から、脱塩化水素剤はトリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ピリジン等であることが好ましい。
　上記脱塩化水素剤の使用量は、ＣＯＰに対して通常０．７モル当量～３．０モル当量であり、０．８モル当量～２．０モル当量であることが好ましく、０．９モル当量～１．２モル当量であることがより好ましい。
（工程Ａ２）
　工程Ａ２は、工程Ａ１で得られたカルボン酸エステル含有ＯＰ化合物にトリメチルアミンを反応させることにより、カルボン酸エステル含有ＰＣ化合物を生成する工程である。工程Ａ２は、溶媒の存在下で行うことができる。当該溶媒としては、非プロトン性溶媒が好ましい。非プロトン性溶媒としては、例えば、アセトニトリル等のニトリル類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミド等のアミド類、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、テトラヒドロフラン等のエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタン等の塩素系有機溶媒等が挙げられる。工程Ａ２において、溶媒の使用量は特に限定されないが、反応時の温度制御や副反応を制御といった観点から、カルボン酸エステル含有ＯＰ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部～１００質量部であることが好ましい。特に、経済性を考慮すると、溶媒の使用量は、カルボン酸エステル含有ＯＰ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部～２０質量部であることがさらに好ましい。
　工程Ａ２において、反応温度は特に限定されないが、通常４０℃～８０℃とすることができる。工程Ａ２の反応時間は特に限定されないが、通常６時間～２４時間とすることができる。工程Ａ２において、トリメチルアミンの使用量は、カルボン酸エステル含有ＯＰ化合物に対して、通常１モル当量～２モル当量とすることができる。
（工程Ａ３）
　工程Ａ３は、工程Ａ２で得られたカルボン酸エステル含有ＰＣ化合物を、塩基性化合物存在下、水中でエステルを加水分解することにより、カルボキシル基含有ＰＣ化合物を合成する工程である。工程Ａ３は、溶媒の存在下で行うことができる。当該溶媒は、通常水のみまたは含水有機溶媒であり、水のみであることが好ましい。工程Ａ３において、溶媒の使用量は特に限定されないが、反応時の温度制御や副反応を制御といった観点から、カルボン酸エステル含有ＰＣ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部～１００質量部であることが好ましい。特に、経済性を考慮すると、溶媒の使用量は、カルボン酸エステル含有ＰＣ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部～２０質量部であることがさらに好ましい。
　工程Ａ３に用いられる塩基性化合物としては、エステル結合を切断してカルボキシル基に転換できるものであれば特に限定されない。当該塩基性化合物としては、反応速度の観点から、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ジアザビシクロノネン（ＤＢＮ）、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）、トリエチルアミン等の強塩基性化合物が挙げられる。上記塩基性化合物の使用量は、カルボン酸エステル含有ＰＣ化合物に対して、通常１モル当量～２モル当量とすることができる。工程Ａ３において、反応温度は特に限定されないが、通常０℃～１００℃とすることができる。工程Ａ３の反応時間は、特に限定されないが、通常１時間～６時間とすることができる。
＜ＰＣ基含有化合物の製造方法２＞
　ＰＣ基含有化合物の製造方法２は、具体的には、次の工程Ｂ１～Ｂ３を含む。
　工程Ｂ１：アルキル基含有フェノール性化合物とＣＯＰとを、溶媒中で脱塩素化剤を用い反応させることにより、アルキル基含有ＯＰ化合物を生成する。
　工程Ｂ２：工程Ｂ１で得られたアルキル基含有ＯＰ化合物にトリメチルアミンを反応させることにより、アルキル基含有ＰＣ化合物を生成する。
　工程Ｂ３：工程Ｂ２で得られたアルキル基含有ＰＣ化合物を、酸化剤を用いて酸化することにより、カルボキシル基を有する式（１）で表される構造を有する化合物を生成する。
（工程Ｂ１）
　工程Ｂ１は、アルキル基含有フェノール性化合物とＣＯＰとを、溶媒中で脱塩素化剤を用いて反応させることにより、アルキル基含有ＯＰ化合物を生成する工程である。　上記アルキル基含有フェノール性化合物としては、例えばクレゾ－ルのような、ベンゼン核に１個のアルキル基が結合した構造の化合物を用いることができ、また、オルト、メタ、パラ、いずれの位置異性体でも用いることができる。
　工程Ｂ１は、溶媒の存在下で行うことができる。当該溶媒としては、非プロトン性溶媒が好ましい。非プロトン性溶媒としては、例えば、アセトニトリル等のニトリル類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミド等のアミド類、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、テトラヒドロフラン等のエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタン等の塩素系有機溶媒等が挙げられる。工程Ｂ１において、溶媒の使用量は特に限定されないが、反応時の温度制御や副反応の制御といった観点から、アルキル基含有フェノール性化合物１質量部に対して、溶媒１質量部～１００質量部であることが好ましい。特に、経済性を考慮すると、溶媒の使用量は、アルキル基含有フェノール性化合物１質量部に対して、溶媒１質量部～１０質量部であることがさらに好ましい。
　工程Ｂ１において、反応温度は溶媒の凝固点以下でなければ特に限定されないが、温度制御が容易な－２０℃～５０℃であることが好ましく、さらに、副反応を抑制する観点から－２０℃～０℃であることがより好ましい。工程Ｂ１の反応時間は特に限定されないが、通常１時間～６時間とすることができる。
　工程Ｂ１において、ＣＯＰの使用量は、アルキル基含有フェノール性化合物１モルに対して通常０．７モル当量～３．０モル当量であり、０．８モル当量～２．０モル当量であることが好ましく、０．９モル当量～１．２モル当量であることがより好ましい。工程Ｂ１に用いられる脱塩化水素剤としては、有機塩基または無機塩基が挙げられる。さらに、溶媒に対する溶解性、生成する塩のろ過性の観点等から、脱塩化水素剤はトリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ピリジン等であることが好ましい。上記脱塩化水素剤の使用量は、ＣＯＰに対して通常０．７モル当量～３．０モル当量であり、０．８モル当量～２．０モル当量であることが好ましく、０．９モル当量～１．２モル当量であることがより好ましい。
（工程Ｂ２）
　工程Ｂ２は、工程Ｂ１で得られたアルキル基含有ＯＰ化合物にトリメチルアミンを反応させることにより、アルキル基含有ＰＣ化合物を生成する工程である。工程Ｂ２は、溶媒の存在下で行うことができる。当該溶媒としては、非プロトン性溶媒が好ましい。非プロトン性溶媒としては、例えば、アセトニトリル等のニトリル類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミド等のアミド類、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、テトラヒドロフラン等のエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタン等の塩素系有機溶媒等が挙げられる。工程Ｂ２において、溶媒の使用量は特に限定されないが、反応時の温度制御や副反応の制御性といった観点から、アルキル基含有ＯＰ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部～１００質量部であることが好ましい。特に、経済性を考慮すると、溶媒の使用量は、アルキル基含有ＯＰ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部～２０質量部であることがさらに好ましい。
　工程Ｂ２において、反応温度は特に限定されないが、通常４０℃～８０℃とすることができる。工程Ｂ２の反応時間は特に限定されないが、通常６時間～２４時間とすることができる。工程Ｂ２において、トリメチルアミンの使用量は、アルキル基含有ＯＰ化合物に対して、通常１モル当量～２モル当量とすることができる。
（工程Ｂ３）
　工程Ｂ３は、工程Ｂ２で得られたアルキル基含有ＰＣ化合物を、酸化剤を用いて酸化することにより、カルボキシル基含有ＰＣ化合物を生成する工程である。工程Ｂ３は、溶媒の存在下で行うことができる。当該溶媒としては、特に限定されないが、プロトン性溶媒であることが好ましく、特に、水であることがさらに好ましい。工程Ｂ３において、溶媒の使用量は特に限定されないが、反応時の温度制御や副反応の制御といった観点から、アルキル基含有ＰＣ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部～１００質量部であることが好ましい。特に、経済性を考慮すると、溶媒の使用量は、アルキル基含有ＰＣ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部～１０質量部であることがさらに好ましい。
　工程Ｂ３に用いられる酸化剤としては、アルキル基をカルボキシル基に転換できるものであれば特に限定されない。当該酸化剤としては、反応速度の観点から、例えば、過マンガン酸塩等の強酸化剤であることが好ましく、入手性を考慮すると、過マンガン酸カリウムであることがさらに好ましい。上記酸化剤の使用量は、特に限定されないが、アルキル基含有ＰＣ化合物に対して１モル当量～１０モル当量であることが好ましく、経済性や環境負荷を考慮すると、１モル当量～３モル当量であることがさらに好ましい。
　工程Ｂ３において、反応温度は特に限定されないが、反応速度の観点から、溶媒の沸点付近にて還流下、反応を行うことが好ましい。工程Ｂ３の反応時間は特に限定されないが、通常１時間～８時間とすることができる。
　前記のＸが（２）式で表される構造を有するヒドロキシスクシンイミドまたはヒドロキシスルホスクシンイミド硫酸ナトリウム（以下ＮＨＳ体と略記する）とするためには、上記で得られたＸがカルボン酸または塩であるカルボキシル基含有ＰＣ化合物に対して、さらに次の工程Ｃを行うことにより得られる。
（工程Ｃ）
　工程Ｃは、工程Ａ３、Ｂ３にて得られたカルボキシル基含有ＰＣ化合物（Ｘがカルボン酸または塩）に縮合剤を用いて、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミド硫酸ナトリウムを縮合することにより、ＮＨＳ体を生成する工程である。工程Ｃは、溶媒の存在下で行うことができる。当該溶媒としては、非プロトン性溶媒が好ましい。非プロトン性溶媒としては、例えば、アセトニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルホルムアミド等のアミド類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル類、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン等のエーテル類、クロロホルム、ジクロロメタン等の塩素系有機溶媒等が挙げられる。特に、溶解性や反応速度を考慮すると、溶媒はアセトニトリルまたはジメチルホルムアミドであることが好ましい。
　工程Ｃにおいて、溶媒の使用量は、特に限定されないが、温度制御や副反応を抑止するという観点から、カルボキシル基含有ＰＣ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部～１００質量部が好ましい。特に、経済性を考慮すると、溶媒の使用量は、カルボキシル基含有ＰＣ化合物１質量部に対して、溶媒１質量部～１０質量部であることがさらに好ましい。工程Ｃにおいて、反応温度は特に限定されないが、通常０℃～５０℃とすることができる。工程Ｃの反応時間は、特に限定されないが、通常８時間～９６時間とすることができる。
　工程Ｃに用いられる縮合剤としては、例えば、塩酸１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ，Ｎ'－ジイソプロピルカルボジイミド、１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミド等が挙げられる。特に、経済性を考慮すると、縮合剤は１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミドであることが好ましい。
　上記縮合剤の使用量は、カルボキシル基含有ＰＣ化合物に対して、通常１モル当量～５モル当量とすることができる。工程Ｃにおいて、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミド硫酸ナトリウムの使用量は、カルボキシル基含有ＰＣ化合物に対して、通常１モル当量～５モル当量とすることができる。
　以上の製造方法により、本発明のＰＣ基含有化合物を効率よく製造することが可能となる。
３．ＰＣ複合体の合成
　本発明のホスホリルコリン基含有化合物は、蛋白質、ペプチド、またはアミノ酸のアミノ酸アミン部位と反応させてアミド結合させることにより、各々、ホスホリルコリン－蛋白複合体、ホスホリルコリン－ペプチド複合体、またはホスホリルコリン－アミノ酸複合体を得ることができる。
［ＰＣ－蛋白複合体の合成］
　本発明のＰＣ基含有化合物を用いてＰＣ－蛋白複合体を合成する場合、蛋白質としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、トリγグロブリン（ＣＧＧ）、ジフテリアトキソイド、プロテインＤ等を用いることができる。
　ＰＣ－蛋白複合体を合成する際の反応温度、反応時間、ｐＨについては、蛋白質が分解や変性を起こさない限り特に限定されない。例えば、大気圧下、緩衝水溶液中で反応を行う場合の反応温度は、通常０℃～１００℃であり、２０℃～６０℃であることが好ましい。この場合の反応時間は、通常１秒間～１週間であり、１時間～３日間であることが好ましい。また、この場合のｐＨは通常２～１２であり、５～９であることが好ましい。
　ＰＣ－蛋白複合体の精製には、例えば、透析膜を用いることができる。合成および透析精製に用いる緩衝水溶液としては、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液等の生化学分野で使用される緩衝水溶液を用いることができる。緩衝水溶液の塩濃度は、通常０．０００１ｍｏｌ／Ｌ～１０ｍｏｌ／Ｌであり、０．０１ｍｏｌ／Ｌ～１ｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
［ＰＣ－ペプチド複合体の合成］
　本発明のＰＣ基含有化合物を用いてＰＣ－ペプチド複合体を合成する場合、オリゴペプチドとしては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンから選ばれる任意の組み合わせからなるアミノ酸２個～１０個が結合したオリゴペプチドを用いることができる。
　ＰＣ－ペプチド複合体を合成する際の反応温度、反応時間、ｐＨについては、オリゴペプチドが分解や変性を起こさない限り特に限定されない。例えば、大気圧下、緩衝水溶液中で反応を行う場合の反応温度は、通常０℃～１００℃であり、２０℃～６０℃であることが好ましい。この場合の反応時間は、通常１秒間～１週間であり、１時間～３日間であることが好ましい。また、この場合のｐＨは通常２～１２であり、５～９であることが好ましい。
［ＰＣ－アミノ酸複合体の合成］
　本発明のＰＣ基含有化合物を用いてＰＣ－アミノ酸複合体を合成する場合、アミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンを用いることができる。
　ＰＣ－アミノ酸複合体の合成方法としては、水または緩衝溶液中、縮合剤を用いて結合反応を行う方法が挙げられる。
　上記縮合剤としては、特に限定されないが、例えば、水溶性の高いエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩を用いることができる。
　ＰＣ－アミノ酸複合体を合成する際の反応温度、反応時間、ｐＨについては、アミノ酸が分解しない限り特に限定されない。例えば、大気圧下、緩衝水溶液中で反応を行う場合の反応温度は、通常０℃～１００℃であり、２０℃～６０℃であることが好ましい。この場合の反応時間は、通常１秒間～１週間であり、１時間～３日間であることが好ましい。また、この場合のｐＨは通常２～１２であり、５～９であることが好ましい。
　ＰＣ－アミノ酸複合体は、他のオリゴペプチドや蛋白質と結合させて、ＰＣ－蛋白複合体、またはＰＣ－ペプチド複合体を得るための原料として用いることができる。
　以下、実施例および比較例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の範囲に限定されるものではない。なお、例中の各種測定は以下の通り行った。
（１）ＰＣ基含有化合物の分析方法
＜１Ｈ　ＮＭＲ測定＞
　日本電子株式会社製、商品名「ＪＮＭ－ＡＬ４００」を用い、溶媒：Ｄ２Ｏ、標準物質：ＨＯＤ、試料濃度：１０ｍｇ／ｇ、積算回数：３２回の条件で測定を行った。
＜３１Ｐ　ＮＭＲ測定＞
　日本電子株式会社製、商品名「ＪＮＭ－ＡＬ４００」を用い、溶媒：Ｄ２Ｏ、標準物質：Ｈ３ＰＯ４、試料濃度：１０ｍｇ／ｇ、積算回数：３２回の条件で測定を行った。
＜質量分析＞
　Ｗａｔｅｒｓ社製、商品名「Ｑ－ｍｉｃｒｏ２６９５」を用い、試料濃度：１００ｐｐｍ、検出モード：ＥＳＩ＋、キャピラリー電圧：３．５４Ｖ、コーン電圧：３０Ｖ、イオン源ヒーター：１２０℃、脱溶媒ガス：３５０℃の条件で測定を行った。
＜高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）＞
　カラムに、Ｗａｔｅｒｓ社製、商品名「Ａｔｌａｎｔｉｓ　Ｔ３　３μｍ　４．６×１００ｍｍ」を用い、流速：０．９ｍＬ／ｍｉｎ、温度：４０℃、試料注入量：１０μＬ、検出波長：２５４ｎｍ、移動相：０．１ｖｏｌ％トリフルオロ酢酸含有蒸留水／０．１ｖｏｌ％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル、グラジエント条件：蒸留水／アセトニトリル＝１００／０（０分），８５／１５（０分～２０分），８５／１５（２０分～３０分）の条件で測定を行った。
＜吸光度の測定＞
　モレキュラーデバイス社製、商品名「ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　Ｍ３」を用い、４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。
（２）ＰＣ基含有化合物の製造方法および複合体の合成
［実施例ａ１－１］
＜カルボン酸エステル含有ＰＣ化合物の合成（工程Ａ１、Ａ２）＞
　４－ヒドロキシ安息香酸メチル２０ｇにアセトニトリル１６０ｇ、トリエチルアミン１５ｇを加えて溶解させ、０℃に冷却した。その後、ＣＯＰ２１ｇを滴下した。滴下終了後、０℃で５時間反応させ、生成したトリエチルアミン塩酸塩をろ過で除いた。得られたろ液に、アセトニトリル２００ｇとトリメチルアミン１２ｇとを加えた後、７５℃で１５時間反応させた。その後、６０℃まで冷却し、窒素を吹き込みながら溶液量が約２００ｍｌになるまで濃縮した。濃縮後、溶液を２５℃まで冷却し、析出した結晶をろ別、減圧乾燥することにより、反応中間体として式（５）で表される構造を有する４－メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリンを３５．２ｇ（収率８５％）得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（５）
　図１は、上記により得られた４－メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリンの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルを、図２は３１Ｐ　ＮＭＲスペクトルをそれぞれ表している。また、図３は、上記により得られた４－メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルを表している。
　得られた生成物についての１Ｈ　ＮＭＲ測定、３１Ｐ　ＮＭＲ測定および質量分析の結果は以下の通りである。
　１Ｈ　ＮＭＲ：δ＝８．０４ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８：ｄ），７．３０ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８：ｅ），４．４１ｐｐｍ（ｂｒｓ，２Ｈ：ｃ），３．９１ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ：ｆ），３．６８ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ：ｂ），３．１８ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ：ａ）
　３１Ｐ　ＮＭＲ：－４．５９ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝１５．９）
　ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝３１７．９１，［Ｍ＋Ｎａ］＋＝３４０．０１
＜加水分解による４－カルボキシフェニルホスホリルコリンの合成（工程Ａ３、ＤＢＵ法）＞
　上記により得られた４－メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリン１０ｇを蒸留水９０ｇに溶解させ、ＤＢＵを５．０ｇ加えて２５℃にて３時間撹拌した。その後、濃塩酸３．６ｇを加えることにより反応液を中和し、エバポレーターで濃縮乾固した。得られた固体をエタノール５０ｇで再結晶することにより、式（６）で表される構造を有する４－カルボキシフェニルホスホリルコリンの固体を９．０ｇ（収率９４％）得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（６）
　図４は、上記により得られた４－カルボキシフェニルホスホリルコリンの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルを、図５は３１Ｐ　ＮＭＲスペクトルをそれぞれ表している。また、図６は、上記により得られた４－カルボキシフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルを表している。
　得られた生成物についての１Ｈ　ＮＭＲ測定、３１Ｐ　ＮＭＲ測定および質量分析の結果は以下の通りである。　１Ｈ　ＮＭＲ：δ＝８．０６ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８：ｄ），７．３３ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８：ｅ），４．４３ｐｐｍ（ｂｒｓ，２Ｈ：ｂ），３．７０ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ：ｃ），３．１９ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ：ａ）
　３１Ｐ　ＮＭＲ：－４．５６ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝１５．９）
　ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝３０４．１２
［実施例ａ１－２］
＜加水分解による４－カルボキシフェニルホスホリルコリンの合成（工程Ａ３、トリエチルアミン法）＞
　上記により得られた４－メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリン５ｇを蒸留水４５ｇに溶解させ、トリエチルアミンを３．１９ｇ加え、還流下４時間反応させた。反応終了後、室温まで冷却し、濃塩酸３．４ｇを加えることにより反応液を中和し、ロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。得られた残留物に、２－プロパノール５０ｇを添加して減圧濃縮する操作を２回行い、さらに２－プロパノール５０ｇを加え、－１０℃で終夜攪拌して結晶を析出させた。溶液を加圧ろ過し、得られた結晶を減圧乾燥することにより、固体を４．０ｇ得た。
　得られた生成物について、１Ｈ　ＮＭＲ測定、３１Ｐ　ＮＭＲ測定および質量分析を行い、４－カルボキシフェニルホスホリルコリンであることを確認した（収率８４％）。１Ｈ　ＮＭＲ測定の結果は以下の通りである。
　１Ｈ　ＮＭＲ：δ＝８．０６ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），７．３３ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），４．４３ｐｐｍ（ｂｒｓ，２Ｈ），３．７０ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），３．１９ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ）
［実施例ａ１－３］
＜加水分解による４－カルボキシフェニルホスホリルコリンの合成（工程Ａ３、ＮａＯＨ法）＞
　上記により得られた４－メトキシカルボニルフェニルホスホリルコリン１０ｇを蒸留水９０ｇに溶解させ、水酸化ナトリウムを１．２ｇ加え、２５℃にて２時間撹拌した。その後、濃塩酸３．６ｇで反応液を中和し、エバポレーターで濃縮乾固した。得られた固体をカラム精製後、溶媒を留去することにより、固体８．５ｇを得た。
　得られた生成物について、１Ｈ　ＮＭＲ測定、３１Ｐ　ＮＭＲ測定および質量分析を行い、４－カルボキシフェニルホスホリルコリンであることを確認した（収率８８％）。１Ｈ　ＮＭＲ測定の結果は以下の通りである。
　１Ｈ　ＮＭＲ：δ＝８．０６ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），７．３３ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８），４．４３ｐｐｍ（ｂｒｓ，２Ｈ），３．７０ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ），３．１９ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ）
［実施例ａ１－４］
＜アルキル基含有ＰＣ化合物の合成（工程Ｂ１、Ｂ２）＞
　ｐ－クレゾール２０．０ｇに、アセトニトリル１００ｇとジイソプロピルアミン２２．５ｇとを加えて溶解させ、０℃に冷却した。その後、ＣＯＰ３１．６ｇを滴下した。滴下終了後、０℃にて３時間反応させ、生成したジイソプロピルアミン塩酸塩をろ過で除いた。得られたろ液に、アセトニトリル１００ｇとトリメチルアミン１６．４ｇとを加え、７５℃で１５時間反応させた。その後、６０℃まで冷却し、窒素を吹き込みながら溶液量が約２００ｍｌになるまで濃縮し、２５℃まで冷却した。析出した結晶をろ別し、アセトニトリル１００ｇで洗浄後にろ過、減圧乾燥することにより、反応中間体として式（７）で表される構造を有する４－メチルフェニルホスホリルコリンの固体を３２．８ｇ（収率６５％）得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（７）
　図７は、上記により得られた４－メチルフェニルホスホリルコリンの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルを、図８は３１Ｐ　ＮＭＲスペクトルをそれぞれ表している。また、図９は、上記により得られた４－メチルフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルを表している。
　得られた生成物についての１Ｈ　ＮＭＲ測定、３１Ｐ　ＮＭＲ測定および質量分析の結果は以下の通りである。
　１Ｈ　ＮＭＲ：δ＝７．２５ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８：ｂ），７．１１ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３：ｃ），４．３８ｐｐｍ（ｂｒｓ，２Ｈ：ｅ），３．６５ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ：ｄ），３．１６ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ：ｆ），２．３２ｐｐｍ（ｓ，３Ｈ：ａ）
　３１Ｐ　ＮＭＲ：－３．７０ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝１５．９）
　ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝２９６．２３
＜酸化による４－カルボキシフェニルホスホリルコリンの合成（工程Ｂ３、過マンガン酸法）＞
　上記により得られた４－メチルフェニルホスホリルコリン５ｇを蒸留水４５ｇに溶解させ、次いで過マンガン酸カリウム６．１ｇを加えた。この溶液を１００℃に加熱し、還流下３時間反応させた。２５℃に冷却後、不溶物をろ別し、得られた溶液に３５％塩酸４ｇを加えた。その後、溶液をエバポレーターにて減圧乾固し、得られた固体をカラム精製後、溶媒を留去することにより４－カルボキシフェニルホスホリルコリンの固体を４．４ｇ（収率８０％）得た。
　図１０は、上記により得られた４－カルボキシフェニルホスホリルコリンの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルを、図１１は３１Ｐ　ＮＭＲスペクトルをそれぞれ表している。また、図１２は、上記により得られた４－カルボキシフェニルホスホリルコリンのＭＳスペクトルを表している。
　得られた生成物についての１Ｈ　ＮＭＲ測定、３１Ｐ　ＮＭＲ測定および質量分析の結果は以下の通りである。
　１Ｈ　ＮＭＲ：δ＝８．０６ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８：ｄ），７．３３ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８：ｅ），４．４３ｐｐｍ（ｂｒｓ，２Ｈ：ｂ），３．７０ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ：ｃ），３．１９ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ：ａ）
　３１Ｐ　ＮＭＲ：－４．５６ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝１５．９）
　ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝３０４．１２，［Ｍ＋ＮＨ４］＋＝３２０．１３
［実施例ａ２－１］
＜ＰＣ－アミノ酸複合体の合成＞
　まず、モルホリノエタンスルホン酸水和物（ＭＥＳ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を精製水に溶解し、０．１Ｍ　ＭＥＳ緩衝溶液を調製した。次に、実施例ａ１－１にて合成した４－カルボキシフェニルホスホリルコリン５０ｍｇ、フェニルアラニン５０ｍｇおよび縮合剤としてエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）２５ｍｇを０．１Ｍ　ＭＥＳ緩衝溶液１０ｍＬに溶解させ、２５℃にて２４時間撹拌することにより、式（８）で表される構造を有するＰＣ－フェニルアラニン複合体を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（８）
　図１３は、上記ＰＣ－アミノ酸複合体の合成における、２４時間攪拌前（反応前）の溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを表しており、図１４は、２４時間攪拌後（反応後）の溶液のＨＰＬＣクロマトグラムを表している。図１３，１４の比較から、４－カルボキシフェニルホスホリルコリンのピークが消失し、新たなピークが出現することを確認した。図１５は、上記により得られた生成物のＭＳスペクトルを表している。図１５から、ＰＣ－フェニルアラニン複合体の分子量に相当するピーク（［Ｍ＋Ｈ］＋＝４５１．１６，［Ｍ＋Ｎａ］＋＝４７３．１３）が得られたことから、生成物がＰＣ－フェニルアラニン複合体であることを確認した。
［実施例ａ２－２］
＜ＰＣ－蛋白複合体の合成＞
　実施例ａ１－１にて得られた４－カルボキシフェニルホスホリルコリン４ｍｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）４ｍｇおよび縮合剤としてエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（東京化成工業株式会社）２ｍｇを０．１Ｍ　ＭＥＳ緩衝溶液１．６ｍＬに溶解させた。この溶液を、２５℃にて２時間攪拌した後、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、４℃で透析精製を行うことにより、ＰＣ－蛋白複合体（ＰＣ－ＢＳＡ）を得た。
［実施例ｂ１］
＜４－カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジルの合成（工程Ｃ）＞
　実施例ａ１－１にて得られた４－カルボキシフェニルホスホリルコリン５．０ｇとＮ－ヒドロキシスクシンイミド３．０ｇとを、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３５ｇに懸濁させた。この溶液を２５℃に保ち、１０ｇのＤＭＦに溶解させた１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミド６．８ｇを加え、２５℃にて７２時間反応させた。反応後、溶液をろ過して固体を回収し、アセトニトリル１６０ｇで再結晶することにより、減圧乾燥後に式（９）で表される構造を有する４－カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジルを４．５ｇ（収率６８％）得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（９）
　図１６は、上記により得られた４－カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジルの１Ｈ　ＮＭＲスペクトルを、図１７は３１Ｐ　ＮＭＲスペクトルをそれぞれ示している。また、図１８は、４－カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジルのＭＳスペクトルを示している。
　得られた生成物についての１Ｈ　ＮＭＲ測定、３１Ｐ　ＮＭＲ測定および質量分析の結果は以下の通りである。
　１Ｈ　ＮＭＲ：δ＝８．２３ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８：ｅ），７．４２ｐｐｍ（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３：ｄ），４．４５ｐｐｍ（ｂｒｓ，２Ｈ：ｂ），３．７２ｐｐｍ（ｍ，２Ｈ：ｃ），３．２２ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ：ａ），３．０４ｐｐｍ（ｓ，４Ｈ：ｆ）
　３１Ｐ　ＮＭＲ：－４．９６ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝１５．９）
　ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］＋＝４００．９９、［Ｍ＋Ｎａ］＋＝４２３．０３
［実施例ｂ２］
＜ＰＣ－蛋白複合体の合成＞
　実施例ｂ１にて得られた４－カルボキシフェニルホスホリルコリンスクシンイミジル２０ｍｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）８ｍｇおよび炭酸水素ナトリウム８ｍｇを蒸留水２ｍＬに溶解させた。この溶液を２５℃、２４時間攪拌した後、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、４℃で透析精製を行うことにより、ＰＣ－蛋白複合体（ＰＣ－ＢＳＡ）を得た。
（３）ＰＣ基含有化合物の評価
＜検体の調製＞
　年齢２０歳台～４０歳台の健常な被験者５名から唾液を採取し、１０％ブロックエース（大日本住友製薬製）を用いて１６倍に希釈した溶液を検体とした。
＜抗ＰＣ抗体の測定＞
　まず、カーボネート／バイカーボネート緩衝溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に、上記実施例ａ２－２、ｂ２にてそれぞれ得られたＰＣ－ＢＳＡまたはＢＳＡを溶解させ、濃度５μＬ／ｍＬに調整した。これらの溶液を９６ウェルマイクロタイタープレート（ダイナテック社製）に５０μＬ／ウェル分注し、４℃にて１６時間保持した。次に、濃度０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳを用いてプレートを洗浄した後、２５％ブロックエースを２００μＬ／ウェル分注し、３６℃にて１時間保持した。次に、濃度０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳを用いてプレートを洗浄し、検体を５０μＬ／ウェル注入し、２５℃にて１時間保持した。次に、濃度０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳを用いてプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）２０００倍希釈品を５０μＬ／ウェル分注し、２５℃にて１時間保持した。次に、濃度０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳを用いてプレートを洗浄し、ＨＲＰ基質液を１００μＬ／ウェル分注し、２５℃にて１５分間反応した。１５分後、希硫酸を１００μＬ／ウェル添加して反応を停止した後、４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。
＜抗ＰＣ抗体価の算出方法＞
　ＰＣ－ＢＳＡを吸着させたプレートから得られた吸光度（ａｎｔｉ－ＰＣ－ＢＳＡ（ＯＤ４５０））と、陰性対象としてＢＳＡを吸着させたプレートから得られた吸光度（ａｎｔｉ－ＢＳＡ（ＯＤ４５０））との差分（ａｎｔｉ－ＰＣ（ＯＤ４５０））を式（１０）により算出した。測定毎に検量線を作成し、求めたａｎｔｉ－ＰＣ（ＯＤ４５０）の値から各検体の抗ＰＣ抗体価（μｇ等量／ｍＬ）を算出した。
ａｎｔｉ－ＰＣ（ＯＤ４５０）＝ａｎｔｉ－ＰＣ－ＢＳＡ（ＯＤ４５０）－ａｎｔｉ－ＢＳＡ（ＯＤ４５０）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（１０）
＜測定結果＞
　表１は、Ｘが水素原子または１価のカチオン残基であるＰＣ基含有化合物に係るＰＣ－ＢＳＡ（実施例ａ２－２）の抗ＰＣ抗体価の測定結果を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　表２は、Ｘがヒドロキシスクシンイミド基であるＰＣ基含有化合物に係るＰＣ－ＢＳＡ（実施例ｂ２）の抗ＰＣ抗体価の測定結果を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　表１、２より、いずれの被験者においても抗ＰＣ抗体価が確認された。このことから、本試験に用いたＰＣ－ＢＳＡはＰＣ抗原としての機能を示すことが明らかになった。以上の結果により、本発明のＰＣ基含有化合物を用いたＰＣ－蛋白複合体は、ＰＣ－蛋白質間の架橋反応が起こらないため、ＰＣ抗原としての利用に適した、水に可溶なＰＣ－蛋白複合体となっていることが明らかになった。
（４）比較例
［比較例ａ１］
　比較例ａ１は、本発明のＸが水素原子または１価のカチオン残基であるＰＣ基含有化合物の比較例である。
　国際公開第２００４／０７４２９８号明細書に記載の方法に従い、式（１１）で表される構造を有する化合物を合成した。得られた式（１１）で表される構造を有する化合物４ｍｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）４ｍｇおよび縮合剤としてエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（東京化成工業社製）２ｍｇを０．１Ｍ　ＭＥＳ緩衝溶液１．６ｍＬに溶解させた。この溶液を２５℃で攪拌し、ＰＣ－蛋白複合体の合成を試みたが、生成物はゲル状であり、抗ＰＣ抗体価の測定に用いる０．１Ｍ，ＭＥＳ緩衝溶液に溶解させることができなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（１１）
［比較例ｂ１］
　比較例ｂ１は、本発明のＸがヒドロキシスクシンイミド基であるＰＣ基含有化合物の比較例である。
　国際公開第２００４／０７４２９８号明細書に記載の方法に従い、式（１１）で表される構造を有する化合物を合成した。得られた式（１１）で表される構造を有する化合物２０ｍｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）８ｍｇおよび炭酸水素ナトリウム８ｍｇを蒸留水２ｍＬに溶解させた。この溶液を２５℃、２４時間攪拌したが、生成物はゲル状であり、抗ＰＣ抗体価の測定に用いる０．１Ｍ，ＭＥＳ緩衝溶液に溶解させることができなかった。
［比較例ｂ２］
　比較例ｂ２は、本発明のＸがヒドロキシスクシンイミド基であるＰＣ基含有化合物の比較例である。
　国際公開第２００４／０７４２９８号明細書に記載の方法に従い、式（１１）で表される構造を有する化合物を合成した。得られた式（１１）で表される構造を有する化合物５．０ｇとＮ－ヒドロキシスクシンイミド６．０ｇとを、ＤＭＦ３５．０ｇに加えた。この溶液を２５℃に保ち、２０ｇのＤＭＦに溶解させた１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミド１３．６ｇを加え、２５℃にて７２時間反応させた。反応後、溶液をろ過して固体を回収し、アセトニトリルで再結晶を行うことにより、減圧乾燥後に式（１２）で表される構造を有する化合物を４．４ｇ（収率５６％）得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（１２）
　得られた式（１２）で表される構造を有する化合物２０ｍｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）８ｍｇおよび炭酸水素ナトリウム８ｍｇを蒸留水２ｍＬに溶解させた。この溶液を２５℃、２４時間攪拌したが、生成物はゲル状であり、抗ＰＣ抗体価の測定に用いる０．１Ｍ，ＭＥＳ緩衝溶液に溶解させることができなかった。
　式（１）で表される構造を有するカルボキシル基およびＰＣ基をそれぞれ１つずつ含む構造を有する芳香族化合物は、ＰＣ－蛋白複合体を得るための原料として、有効に利用することができる。また、得られたＰＣ－蛋白複合体、ＰＣ－ペプチド複合体、またはＰＣ－アミノ酸複合体は、ＰＣ抗原またはＰＣ抗原製造用の原料として利用することができる。さらに、得られたＰＣ抗原は、ＰＣ抗体を含む医薬品の製造において、ＰＣ抗体産生用原料として有効に利用することができる。

Claims (4)

  1. 　下記の式（１）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（１）
    （Ｘは水素原子または１価のカチオン残基、もしくは式（２）で表される構造を示す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（２）
    （Ｙは水素原子またはＳＯ３Ｎａを示す。）
  2. 　下記の式（１'）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物と、蛋白質のアミノ酸アミン部位とがアミド結合した構造を有するホスホリルコリン－蛋白複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（１'）
    （Ｘは水素原子または１価のカチオン残基を示す。）
  3. 　下記の式（１'）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物と、オリゴペプチドのアミノ酸アミン部位とがアミド結合した構造を有するホスホリルコリン－ペプチド複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（１'）
    （Ｘは水素原子または１価のカチオン残基を示す。）
  4. 　下記の式（１'）で表される構造を有するホスホリルコリン基含有化合物と、アミノ酸のアミノ酸アミン部位とがアミド結合した構造を有するホスホリルコリン－アミノ酸複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（１'）
    （Ｘは水素原子または１価のカチオン残基を示す。）
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