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WO2015115568A1 - 温度応答性基材、その製造方法及びその評価方法 - Google Patents

温度応答性基材、その製造方法及びその評価方法 Download PDF

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WO2015115568A1
WO2015115568A1 PCT/JP2015/052579 JP2015052579W WO2015115568A1 WO 2015115568 A1 WO2015115568 A1 WO 2015115568A1 JP 2015052579 W JP2015052579 W JP 2015052579W WO 2015115568 A1 WO2015115568 A1 WO 2015115568A1
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WO
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temperature
polymer
responsive
fluorine
monomer
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PCT/JP2015/052579
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English (en)
French (fr)
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正道 森田
浩治 久保田
美子 小泉
央基 山口
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Daikin Industries Ltd
Original Assignee
Daikin Industries Ltd
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Publication date
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    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2537/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by physical or chemical treatment

Definitions

  • the present invention relates to a temperature-responsive substrate, a production method thereof, and an evaluation method thereof.
  • a base material having temperature responsiveness is used for various applications.
  • cell culture equipment described below, column chromatography packing materials, drug delivery systems (drug delivery systems), hydrogels, ion exchange resins, membrane separation systems, desert greening materials, water and oil repellents, etc. It is used.
  • adherent cells have been cultured by adhering them onto a glass surface or a synthetic resin surface subjected to various treatments.
  • culture vessels having various surfaces such as those obtained by hydrophilizing polystyrene by glow discharge or corona discharge, or those coated with biocompatible polymers such as collagen or MPC polymer are used (patents).
  • Document 1 Non-Patent Document 1).
  • a substance having the action of breaking the bond between the cells and the cell culture equipment for example a proteolytic enzyme such as trypsin, or a chemical is used.
  • enzyme treatment and chemical treatment are not only complicated, but also have disadvantages such as increased possibility of contamination and that the cell itself may be denatured and its original function may be impaired. .
  • the upper critical solution temperature (hereinafter may be abbreviated as UCST) or the lower critical solution temperature (hereinafter abbreviated as LCST) in water without performing enzyme treatment or chemical treatment.
  • UCST upper critical solution temperature
  • LCST lower critical solution temperature
  • Patent Document 2 This temperature-responsive polymer-coated cell culture equipment can be used not only to collect cells with little damage but also to produce a cell sheet.
  • the conventional temperature-responsive polymer-coated cell culture equipment has room for further improvement in terms of ease of cell detachment.
  • the conventional temperature-responsive polymer-coated cell culture equipment has a problem that the cell sheet may be broken when the cell sheet is peeled off.
  • the cause is considered to be that the temperature-responsive polymer coating is in the shape of a sea island (Patent Document 3).
  • the island-like crystal portion is a portion having a weak cell detachment function because grafting is difficult to proceed
  • the sea-like monomer solution portion is a portion having a strong cell detachment function because grafting is likely to proceed.
  • cells cannot adhere or grow uniformly.
  • a proposal has been made to optimize radiation irradiation conditions and drying conditions (Patent Document 3).
  • An object of the present invention is to provide a temperature-responsive base material that is superior to conventional ones. Specifically, it is a temperature-responsive substrate, and (1) it is easier to peel off an object (for example, a cell) attached to the surface, and / or (2) a sheet (for example, a cell sheet) attached to the surface. It is an object to provide a temperature-responsive cell culture device having an excellent property that it can be peeled off in a state of less damage and / or (3) LCST is lower than conventional and excellent in handleability. Furthermore, this invention makes it another subject to provide the method which can evaluate a temperature-responsive base material in the point of the above (4) characteristics.
  • the present inventors use at least one kind of polymer, wherein at least one kind exhibits temperature responsiveness, and at least one kind contains a structural unit based on a fluorine-containing monomer. It has been found that the problem (1) can be solved.
  • the present inventors have conceived that it is important to form a temperature-responsive polymer layer more uniformly on the substrate in order to solve the above problem (2). And the present inventors discovered that the said subject (2) can be solved by forming a temperature-responsive polymer layer on the surface of the said base material by the radiation surface graft polymerization by a pre-irradiation method.
  • the present inventors can solve the above problem (3) by using a temperature-responsive polymer (fluorine-containing temperature-responsive polymer) containing a structural unit based on a fluorine-containing monomer having a fluorine concentration within a predetermined range. I found that it can be solved.
  • a temperature-responsive polymer has (a) a difference in water contact angle between predetermined temperatures, and (b) the presence or absence of a peak of intermediate water in differential scanning calorimetry. It has been found that the above problem (4) can be solved by applying this knowledge to the fact that it is related to the ease of detachment of an object (for example, a cell) attached to the surface when used as a sex cell culture equipment.
  • this invention provides the following temperature-responsive base material, its manufacturing method, and its evaluation method.
  • Item 1 A temperature-responsive substrate having a layer containing at least one polymer on the surface, The temperature-responsive base material, wherein at least one polymer of the polymer exhibits temperature responsiveness, and at least one polymer of the polymer contains a structural unit based on a fluorine-containing monomer .
  • Item 2. Item 2. The temperature-responsive substrate according to Item 1, wherein the polymer exhibiting temperature responsiveness has a lower critical solution temperature (LCST) of 0 to 15 ° C.
  • LCST critical solution temperature
  • Item 4. The temperature-responsive substrate according to any one of Items 1 to 3, wherein the fluorine-containing monomer is a fluorine-containing monomer having a fluoroalkyl group.
  • X represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 21 carbon atoms, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, a CFX 1 X 2 group (where X 1 and X 2 is a hydrogen atom, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom), a cyano group, a linear or branched fluoroalkyl group having 1 to 21 carbon atoms, a substituted or unsubstituted benzyl group or A substituted or unsubstituted phenyl group; Y is —O— or —NH—; Z is an aliphatic group having 1 to 10 carbon atoms, an aromatic group having 6 to
  • Item 5 The temperature-responsive substrate according to any one of Items 1 to 4, which is represented by Item 6.
  • Item 6. The fluorinated monomer represented by the general formula (1), wherein Rf is a linear or branched fluoroalkyl group having 1 to 6 carbon atoms, which may have a hetero atom. Temperature responsive substrate.
  • Item 7. The layer is At least one polymer containing 5 mol% or more of the structural unit based on the fluorinated monomer and at least one kind of the structural unit based on the fluorinated monomer is less than 5 mol%.
  • Item 7. The temperature-responsive substrate according to any one of Items 1 to 6, comprising a blend polymer of temperature-responsive polymers.
  • Item 8. Item 8.
  • the temperature-responsive substrate according to Item 7 wherein at least one of the polymers containing 5 mol% or more of a structural unit based on a fluorine-containing monomer is a temperature-responsive polymer.
  • Item 9. Item 9. The temperature-responsive substrate according to Item 7 or 8, wherein the proportion of the constituent unit based on the fluorine-containing monomer with respect to the total of the monomer constituent units constituting the blend polymer is 0.5 mol% to 10 mol%.
  • Item 10. Item 10. A polymer containing a structural unit based on a fluorine-containing monomer, which is used for producing the temperature-responsive substrate according to any one of Items 1 to 9.
  • Item 11. Item 11.
  • Item 12. (A) a monomer that is used for producing the temperature-responsive substrate according to any one of Items 1 to 9, wherein a homopolymer obtained by polymerizing the substrate exhibits temperature-responsiveness, and (b) A composition containing a fluorine-containing monomer.
  • Item 13. A temperature responsive substrate having a layer containing a temperature responsive polymer on its surface, A temperature-responsive substrate, which can be obtained by forming the layer on the surface of the substrate by radiation surface graft polymerization by a pre-irradiation method.
  • Item 14. Item 14. The temperature-responsive substrate according to any one of Items 1 to 9 and 13, which is a cell culture device.
  • a method of detaching cells from culture equipment comprising the step of detaching cells cultured on the surface of the temperature-responsive substrate according to any one of Items 1 to 9 from the surface in an environment less than the LCST of the polymer exhibiting temperature responsiveness.
  • Item 16. The method according to Item 15, wherein the polymer exhibiting temperature responsiveness has an LCST of 0 to 15 ° C.
  • Item 17. The method according to Item 16, wherein the polymer exhibiting temperature responsiveness contains 2 to 20% by weight of fluorine based on the weight of the polymer.
  • a cell sheet manufacturing method comprising: A step of detaching the sheet-like cells cultured on the surface of the temperature-responsive substrate according to any one of Items 1 to 9 from the surface in an environment lower than the LCST of the polymer exhibiting temperature responsiveness. Including methods. Item 19. Item 19. The method according to Item 18, wherein the polymer exhibiting temperature responsiveness has an LCST of 0 to 15 ° C. Item 20. Item 20. The method according to Item 19, wherein the polymer exhibiting temperature responsiveness contains 2 to 20% by weight of fluorine based on the weight of the polymer. Item 21.
  • a method for producing a temperature-responsive substrate having a layer containing a temperature-responsive polymer on its surface comprising the step of forming the layer on the surface of a substrate by radiation surface graft polymerization by a pre-irradiation method.
  • Item 22 A temperature responsive substrate having a layer containing a temperature responsive polymer on its surface, The polymer is When prepared by solution polymerization, the contact angle of water to water at 5 ° C. (when the polymer LCST is less than 20 ° C.) or 20 ° C. (when the polymer LCST is 20 ° C. or more and 37 ° C. or less) and 40 ° C.
  • the difference ⁇ is 30 ° or more
  • Item 23 A method for evaluating a temperature-responsive substrate having a layer containing a temperature-responsive polymer on its surface, Using the polymer prepared by solution polymerization as a sample, (A) A method in which the sample is evaluated based on the difference ⁇ in water contact angle before and after the temperature response, and (b) the presence or absence of a peak of intermediate water in the differential scanning calorimetry of the sample.
  • the characteristics of the temperature-responsive substrate can be improved. Specifically, (1) it is easier to peel off an object (for example, a cell) attached to the surface, and / or (2) a sheet (for example, a cell sheet) attached to the surface can be peeled with less damage. And / or (3) LCST can be made lower than before to improve handling. Furthermore, according to another aspect of the present invention, (4) a temperature-responsive base material can be evaluated more appropriately than before.
  • 6 is a photograph showing the results of a culture experiment of Example 33.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of a culture experiment of Example 33.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of a culture experiment of Example 33.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of a culture experiment of Example 33.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of a culture experiment of Example 33.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of a culture experiment of Example 33.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of a culture experiment of Example 33.
  • thermoresponsive substrate of the present invention the temperature-responsive substrate of the present invention, its production method, and its evaluation method will be specifically described.
  • Temperature-responsive substrate The temperature-responsive substrate of the present invention is a temperature-responsive substrate having a layer containing a temperature-responsive polymer on the surface.
  • One embodiment (embodiment 1) of the temperature-responsive substrate of the present invention is: A temperature-responsive base material having a layer containing at least one polymer (sometimes referred to as a temperature-responsive polymer layer) on the surface, The temperature-responsive base material, wherein at least one polymer of the polymer exhibits temperature responsiveness, and at least one polymer of the polymer contains a structural unit based on a fluorine-containing monomer It is.
  • these temperature-responsive polymer layers contain these blend polymers.
  • the temperature-responsive polymer layer includes a structural unit based on a fluorine-containing monomer, and therefore, an object (for example, a cell) attached to the surface is peeled off due to this. There is an excellent effect that it is easy.
  • the temperature-responsive base material of the present invention is: In the above temperature-responsive substrate, the polymer exhibiting temperature responsiveness has an LCST of 0 to 15 ° C. This is advantageous in that it can be controlled so that peeling of an object (for example, a cell) attached to the surface occurs only in a temperature range lower than that in the past.
  • the temperature-responsive base material of the present invention is used as a cell culture equipment, the separation of cells from the culture equipment does not occur near room temperature, and the separation occurs only when the temperature is intentionally lowered. Can be controlled. Conventionally, when working in a room temperature environment, it was difficult to avoid unintended peeling, but according to this aspect, this can be avoided and the handling can be improved.
  • a temperature responsive substrate having a layer containing a temperature responsive polymer on its surface A temperature-responsive substrate characterized in that it can be obtained by forming the layer on the surface of the device by radiation surface graft polymerization by a pre-irradiation method.
  • a temperature-responsive polymer After forming a polymerization initiation point on the surface of the substrate by radiation surface graft polymerization by a pre-irradiation method, a temperature-responsive polymer can be grown there. This is preferable because the temperature-responsive polymer can be fixed to the surface of the substrate by chemical bonding, and the temperature-responsive polymer layer can be more uniformly formed on the substrate.
  • “chemical bond” includes a covalent bond, a coordinate bond, an ionic bond, a hydrogen bond, and a van der Waals bond unless otherwise specified.
  • Still another embodiment (embodiment 4) of the temperature-responsive substrate of the present invention is: A temperature responsive substrate having a layer containing a temperature responsive polymer on its surface, The polymer is When prepared by solution polymerization, the contact angle of water to water at 5 ° C. (when the polymer LCST is less than 20 ° C.) or 20 ° C. (when the polymer LCST is 20 ° C. or more and 37 ° C. or less) and 40 ° C. The difference ⁇ is 30 ° or more, and A temperature-responsive substrate characterized by having a peak of intermediate water in differential scanning calorimetry.
  • the temperature-responsive polymer when ⁇ is 30 ° or more, can favorably adhere a substance (for example, an adherent cell) in a certain temperature region, and a substance (for example, a substance adhered in a certain other temperature region (for example, It can be said that it is favorable in terms of the basic characteristic that cells can be detached.
  • a substance for example, an adherent cell
  • a substance for example, a substance adhered in a certain other temperature region
  • Temperature Responsive Polymer a property that is hydrophobic at a specific temperature but changes to hydrophilicity according to a temperature change is called “temperature responsiveness”, and a polymer having such a property. This is sometimes referred to as “temperature-responsive polymer”.
  • the temperature-responsive base material of the present invention is used as a temperature-responsive cell culture equipment, in one embodiment, the cell culture temperature (although it is not particularly limited, it is usually about 37 ° C.) and room temperature (usually). Can respond at temperatures between 20 and 25 ° C. In that case, the LCST is preferably 28 to 35 ° C.
  • LCST is preferably 6 to 15 ° C.
  • Temperature responsive polymers change from hydrophobic (or hydrophilic) to hydrophilic (or hydrophobic) at the critical solution temperature (CST) in water.
  • CST critical solution temperature
  • UCT upper critical dissolution temperature
  • a surface to which an object (for example, an adherent cell) adheres [for example, a surface for culturing cells (sometimes referred to as “culture surface”)] has a specific temperature region (for example, a cell culture temperature). ) Can be attached to an object (for example, adherent cells) and can be made hydrophilic by temperature change, so that the attached object (for example, adherent cells) can be easily detached from the surface (for convenience) The temperature at this time is referred to as “peeling temperature”).
  • the peeling temperature is higher than the cell culture temperature in terms of the ease of cell recovery operation after peeling cultured cells from the culture surface.
  • a low temperature is preferred.
  • the temperature-responsive polymer used at this time is a temperature at which LCST is lower than the cell culture temperature.
  • LCST is preferably at a temperature that does not damage cells, and specifically, it is preferably 0 ° C. or higher.
  • the peeling temperature may be higher than the cell culture temperature.
  • the temperature-responsive polymer used at this time is a cell that UCST uses as cells.
  • the temperature is higher than the culture temperature.
  • the UCST is preferably at a temperature that does not damage the cells, specifically 80 ° C. or lower, more preferably 50 ° C. or lower.
  • thermoresponsive polymers include alkyl-substituted cellulose derivatives such as methyl cellulose, ethyl cellulose and hydroxypropyl cellulose, polyalkylene oxide block copolymers such as block copolymers of polypolypropylene oxide and polyethylene oxide, and polyalkylenes. Examples thereof include an oxide block copolymer.
  • temperature-responsive polymers are not particularly limited, but can be obtained by polymerizing a monomer by radiation irradiation or by solution polymerization.
  • solution polymerization is not specifically limited, For example, it can carry out in a flask.
  • the temperature-responsive monomer is not particularly limited, and examples thereof include (meth) acrylamide compounds, N- (or N, N-di) alkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives, (meth) acrylamide derivatives having a cyclic group, and vinyl ether derivatives. Etc.
  • the temperature-responsive polymer may be a homopolymer obtained by polymerizing one kind of temperature-responsive monomer, or may be a copolymer obtained by polymerizing two or more kinds of temperature-responsive monomers. .
  • the copolymer may be any of a graft copolymer, a block copolymer, and a random copolymer.
  • the temperature-responsive polymer may be a monomer that does not itself fall under the temperature-responsive monomer within the range that does not inhibit the temperature-responsive monomer (for convenience, “non-temperature-responsive polymer”). It may also be a copolymer obtained by polymerizing a monomer component consisting of “monomers”.
  • the copolymer may be any of a random copolymer, a block copolymer, and a graft copolymer.
  • the “random copolymer” of the present invention is not a narrow definition defined by a statistical chain sequence, but a broad sense obtained by simultaneously polymerizing two or more kinds of mixed monomers, which is not a precise polymerization.
  • the contact angle of water to water at 5 ° C. when the polymer LCST is less than 20 ° C. or 20 ° C. (when the polymer LCST is 20 ° C. or more and 37 ° C. or less) and 40 ° C.
  • a polymer having a difference ⁇ of 30 ° or more and having a peak of intermediate water in differential scanning calorimetry is also a random copolymer in a broad sense. In the monomer group used in the present invention, the random copolymer has an effect of lowering the LCST.
  • the block polymer may be an AB type diblock or an ABA type triblock.
  • the polymer composed of the fluorine-containing monomer may be an A block or a B block.
  • graft polymers may be obtained from Macromolecules, 2010, 43, pp.
  • the main polymer may be a straight chain, or may be branched as described in International Publication No. WO / 2014133168.
  • the fluorine-containing monomer may be copolymerized with a monomer constituting the trunk portion, or may be copolymerized with a temperature-responsive monomer constituting the graft site.
  • the block copolymer and the graft copolymer can be immobilized on the base material simply by coating on the base material without going through a process such as radiation irradiation described later.
  • immobilization means that the polymer is not eluted in the medium during cell culture, and is adsorbed to such an extent that the polymer is not peeled off together with the cell sheet even when the cell sheet is peeled off. Show.
  • the ratio of the non-temperature-responsive monomer to the whole monomer component can be appropriately set within a range that does not inhibit the temperature-responsiveness of the temperature-responsive monomer.
  • the ratio of the non-temperature-responsive monomer to the whole monomer component is usually preferably 30 mol% or less, more preferably 10 mol% or less.
  • the non-temperature-responsive monomer is not particularly limited, and examples thereof include fluorine-containing monomers.
  • the temperature-responsive polymer When obtained using a fluorine-containing monomer as a non-temperature-responsive monomer, the temperature-responsive polymer contains a structural unit based on the fluorine-containing monomer.
  • (1) the temperature-responsive polymer is in contact with an object (for example, an adherent cell) on its surface due to its properties as a fluorine-containing polymer, particularly low surface free energy (in the case of cells) Has an advantageous characteristic that non-adhesiveness becomes good when cultured.
  • the temperature-responsive polymer is a graft copolymer obtained by surface graft polymerization of a monomer component containing at least one kind of temperature-responsive monomer and fluorine-containing monomer, the characteristics as the fluorine-containing polymer are stronger. Since it is provided, it is preferable.
  • the temperature-responsive polymer obtained by using a fluorine-containing monomer as a non-temperature-responsive monomer further has (2) characteristics as a fluorine-containing polymer, in particular, water insolubility, resulting in chemicals on the substrate surface. Even if it is not bound, it has another advantageous characteristic that it is possible to reduce the risk of elution into the medium and peeling together with the cell sheet when the cell sheet is peeled off. .
  • the fluorine-containing monomer is not particularly limited as long as it can impart the above advantageous characteristics to the finally obtained temperature-responsive polymer.
  • the fluorine-containing monomer is not particularly limited, and examples thereof include acrylic acid monomers, acrylate monomers, acrylamide monomers, styrene monomers, acrylonitrile monomers, and vinylpyrrolidone monomers. , Vinyl ether monomers, pyrrole monomers and the like in which at least one hydrogen atom is substituted with a fluorine atom.
  • the acrylic monomer is not particularly limited, and examples thereof include acrylic acid, methacrylic acid, itaconic acid, maleic anhydride, maleic acid, fumaric acid, and crotonic acid.
  • the acrylate monomer is not particularly limited.
  • the acrylamide monomer is not particularly limited, and examples thereof include acrylamide and methylol methacrylamide.
  • the styrene monomer is not particularly limited, and examples thereof include styrene and alkylstyrene.
  • fluorine-containing monomer for example, an acrylate ester having a fluoroalkyl group that is ester-bonded or amide-bonded directly or via a divalent organic group to the carboxyl group, and may have a substituent at the ⁇ -position (hereinafter referred to as “a fluorine-containing monomer”) , “Fluoroalkyl group-containing acrylate ester”), or “fluoroalkyl group-containing acrylamide”.
  • X represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 21 carbon atoms, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, a CFX 1 X 2 group (where X 1 and X 2 is a hydrogen atom, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom), a cyano group, a linear or branched fluoroalkyl group having 1 to 21 carbon atoms, a substituted or unsubstituted benzyl group or A substituted or unsubstituted phenyl group; Y is —O— or —
  • the fluoroalkyl group represented by Rf is an alkyl group which may have a hetero atom, in which at least one hydrogen atom is substituted with a fluorine atom, and all the hydrogen atoms are A perfluoroalkyl group which may be substituted with a fluorine atom and which may have a hetero atom is also included.
  • Rf is preferably a linear or branched fluoroalkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and particularly a straight chain having 1 to 3 carbon atoms. It is preferably a chain or branched perfluoroalkyl group.
  • EPA US Environmental Protection Agency
  • a compound having a fluoroalkyl group having 8 or more carbon atoms is a high environmental load that may decompose and accumulate in the environment and living organisms.
  • Rf when Rf is a linear or branched fluoroalkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such environmental problems are pointed out. Because it is not.
  • the fluorine-containing monomer is preferably a non-telomer, and in this respect, the Rf group includes a fluoroalkyl group having 1 to 2 carbon atoms, or two or more carbon atoms having 1 to 3 carbon atoms interposed by a hetero atom.
  • acrylate ester and acrylamide represented by the general formula (1) are as follows.
  • the temperature-responsive base material of the present invention comprises: (ii) at least one polymer in which the surface layer contains 5 mol% or more of a constituent unit based on a fluorine-containing monomer in all monomer constituent units; and (ii) fluorine-containing It is preferable to include a blend polymer of at least one temperature-responsive polymer whose proportion of the monomer-based constitutional unit to the total monomer constitutional unit is less than 5 mol%, since particularly excellent peelability is exhibited. At this time, the ratio of the structural unit based on the fluorine-containing monomer to the total of the monomer structural units constituting the polymer (i) is preferably 5 mol% to 45 mol%.
  • the ratio of the structural unit based on the fluorine-containing monomer with respect to the total of the monomer structural units constituting the temperature-responsive polymer (ii) is not particularly limited, but it is preferably as small as possible and may be 0 mol%. Although not particularly limited, for example, it may be in the range of 0 mol% to 3 mol%, may be in the range of 0 mol% to 2 mol%, or may be in the range of 0 mol% to 1 mol%.
  • the ratio of the constituent units based on the fluorine-containing monomer to the total of the monomer constituent units constituting the blend polymer is particularly preferably 0.5 mol% to 10 mol%, particularly 0.5 mol% to 5 mol%. preferable.
  • the glass transition point (Tg) of the polymer (i) can be used as an index. That is, the polymer (i) preferably has a glass transition point (Tg) of 20 to 130 ° C. in terms of peelability, and more preferably 50 to 120 ° C.
  • the glass transition point is the extrapolated glass transition end temperature (T eg ) defined in JIS K7121-1987 “Method for Measuring Plastic Transition Temperature”.
  • Temperature-responsive polymer layer A layer containing a temperature-responsive polymer (temperature-responsive polymer layer) contains a temperature-responsive polymer as an essential component, but if necessary, a polymer that does not exhibit further temperature-responsiveness (Sometimes referred to as “non-temperature-responsive polymer”).
  • non-temperature-responsive polymer is not particularly limited and can be selected widely. Although it does not specifically limit, the polymer containing the structural unit based on the said non-temperature-responsive monomer demonstrated about the temperature-responsive polymer may be sufficient.
  • the non-temperature responsive polymer may be a homopolymer or a copolymer. When the non-temperature-responsive polymer is a copolymer, it may be a graft copolymer, a block copolymer, or a random copolymer.
  • non-temperature-responsive polymer may be a polymer that does not exhibit temperature responsiveness, and as long as it is not included, may contain a structural unit based on the temperature-responsive monomer described for the temperature-responsive polymer.
  • the non-temperature-responsive polymer may contain a structural unit based on a fluorine-containing monomer. Although it does not specifically limit as a fluorine-containing monomer, The said fluorine-containing monomer demonstrated about the temperature-responsive polymer can be used. In this case, the non-temperature-responsive polymer may be composed of only a structural unit based on a fluorine-containing monomer.
  • the temperature-responsive polymer layer is not particularly limited, but usually adsorbs 1 to 10 ⁇ g / cm 2 on the substrate surface.
  • the adsorption amount is 1 ⁇ g / cm 2 or more, an object (for example, a cell) on the temperature-responsive polymer can be easily peeled when the hydrophilicity is changed in response to the temperature. If it is 10 ⁇ g / cm 2 or less, an object (for example, a cell) tends to adhere in a hydrophobic state before temperature response.
  • the surface of the temperature-responsive polymer layer is further coated with a cell-adhesive protein so that the temperature-responsive polymer on the surface of the substrate is 10 ⁇ g / cm 2.
  • the amount of the temperature-responsive polymer at that time is preferably 50 ⁇ g / cm 2 or less.
  • the amount of the temperature-responsive polymer is 50 ⁇ g / cm 2 or less because the cells are easily attached.
  • the coating method may be in accordance with a conventional method. Usually, a method in which an aqueous solution of a cell adhesive protein is applied to the substrate surface, and then the aqueous solution is removed and rinsed is employed.
  • cell adhesion protein is not limited at all, and examples thereof include collagen, laminin, laminin 5 and fibronectin. You may use these 1 type, or 2 or more types.
  • preparations containing extracellular matrix proteins eg, Matrigel (registered trademark)] can be used.
  • the temperature-responsive polymer layer further contains a non-temperature-responsive polymer
  • the temperature response occupying the entire polymer with reference to the above content when the temperature-responsive polymer layer is composed only of the temperature-responsive polymer. What is necessary is just to adjust content of a temperature-responsive polymer suitably according to the ratio of a photopolymer.
  • the amount of the temperature-responsive polymer in the temperature-responsive polymer layer is measured using FT-IR-ATR. The same applies to the measurement of the coating amount of the cell adhesion protein.
  • the temperature-responsive polymer is a polymerization of at least one temperature-responsive monomer and, if necessary, at least one non-temperature-responsive monomer component. Can be obtained.
  • a temperature-responsive polymer can be obtained by a method comprising (1) a step of dissolving the monomer component in a solvent, and (2) a step of polymerizing the monomer component in the solvent obtained in the step (1).
  • the solvent for dissolving the monomer component is not particularly limited.
  • a solvent having a boiling point of 120 ° C. or less, particularly 60 to 110 ° C. at normal temperature is preferable.
  • Specific examples include methanol, ethanol, n (or i) -propanol, 2 (or n) -butanol and water.
  • a solvent for dissolving the monomer component only one kind of solvent may be used, or two or more kinds of solvents may be mixed and used.
  • a temperature-responsive polymer or (ii) a copolymer composed of a temperature-responsive monomer and a fluorine-containing monomer, for example, 0.1 to 90% by weight, preferably 0.1% It may be dissolved in a range of ⁇ 50% by weight, more preferably 0.1 to 10% by weight.
  • the surface of the base material may be coated with the monomer component dissolved in the solvent, and then the polymerization may be performed to form a temperature-responsive polymer on the surface. After forming the responsive polymer, the surface of the substrate may be coated with the obtained temperature-responsive polymer.
  • the polymerization method is not particularly limited, and examples thereof include radical polymerization methods such as electron beam irradiation (EB), ⁇ -ray irradiation, ultraviolet irradiation, plasma treatment, corona treatment, and organic polymerization reaction.
  • EB electron beam irradiation
  • ⁇ -ray irradiation ⁇ -ray irradiation
  • ultraviolet irradiation plasma treatment
  • corona treatment corona treatment
  • organic polymerization reaction organic polymerization reaction
  • the method of coating the surface of the base material with a temperature-responsive polymer formed in advance is not particularly limited, and may be performed by simple physical adsorption such as coating and kneading, and further with electron beam irradiation (EB),
  • the temperature-responsive polymer may be fixed to the surface of the substrate through chemical bonding by performing ⁇ -ray irradiation, ultraviolet irradiation, plasma treatment, corona treatment, or the like.
  • a temperature-responsive polymer layer is formed on the surface of the substrate by surface graft polymerization. It can also be formed. In this case, both the pre-irradiation method and the simultaneous irradiation method can be employed.
  • a temperature-responsive polymer layer on the surface of the substrate by radiation surface graft polymerization by a pre-irradiation method.
  • the temperature-responsive polymer can be grown there. This is preferable in that the temperature-responsive polymer can be fixed to the surface of the substrate by chemical bonding.
  • the surface layer of the temperature-responsive substrate of the present invention has (i) at least one polymer containing 5 mol% or more of a structural unit based on a fluorine-containing monomer in all monomer structural units, and (ii) The ratio of the constituent units based on the fluorine-containing monomer to the total monomer constituent units is less than 5 mol%, and is preferable because it contains a blend polymer of at least one temperature-responsive polymer, because it exhibits particularly excellent peelability. .
  • a temperature-responsive substrate is not particularly limited.
  • a temperature-responsive monomer not containing fluorine (and a small amount of a fluorine-containing monomer if necessary) and a temperature-responsive polymer (i) are allowed to coexist on the surface.
  • it can be obtained by causing a polymerization reaction.
  • a temperature-responsive polymer (ii) is obtained on the surface by polymerizing a temperature-responsive monomer (and a small amount of fluorine-containing monomer if necessary) that does not contain fluorine, and the polymer (i) and the temperature-responsive property are obtained.
  • a blend polymer of polymer (ii) is formed on the surface. Furthermore, it is preferable to make this blend polymer the state couple
  • the surface layer of the temperature-responsive substrate of the present invention contains a blend polymer of the polymer (i) and the polymer (ii), in particular, the polymer (i) and the polymer (ii) are added to a flask. Obtained by a method such as solution polymerization, etc., and then applied or kneaded on the surface in a blended state, and if necessary, this blend polymer is fixed on the surface. In this case, the temperature responsiveness becomes better, which is preferable.
  • the coating or kneading method is not particularly limited, but spin coating, dipping, spraying, brushing, and the like can be used. Coating or kneading can be performed after dissolving each polymer in a suitable solvent as necessary.
  • the solvent is not particularly limited and can be appropriately selected according to the physical properties of the polymer.
  • isopropyl alcohol, ethanol and the like can be used as exemplified in “1.3 Temperature-responsive polymer production method”.
  • the amount of the polymer dissolved in the solvent at this time is not particularly limited, but the total amount can be 0.1 to 20% by weight, and preferably 1 to 10% by weight.
  • the treatment for immobilizing the blend polymer on the surface is not particularly limited, and heating, electron beam irradiation (EB), ⁇ -ray irradiation, ultraviolet irradiation, plasma treatment, corona treatment and the like can be used. By these treatments, each polymer is fixed to the surface through chemical bonds.
  • EB electron beam irradiation
  • ⁇ -ray irradiation ⁇ -ray irradiation
  • ultraviolet irradiation ultraviolet irradiation
  • plasma treatment corona treatment and the like
  • Aspect 2 is the above temperature-responsive base material, wherein the LCST of the polymer exhibiting temperature responsiveness is 0 to 15 ° C. This is advantageous in that it can be controlled so that peeling of an object (for example, a cell) attached to the surface occurs only in a temperature range lower than that in the past.
  • examples of the temperature-responsive polymer having an LCST of 0 to 15 ° C. include those having a fluorine content of 2 to 20% by weight, preferably 2 to 10% by weight, based on the weight of the polymer. .
  • thermoresponsive polymer containing fluorine and having an LCST of 0 to 15 ° C. those having the structure described in “1.1 Temperature-responsive polymer” can be used.
  • examples of the temperature-responsive polymer having an LCST of 0 to 15 ° C. include a copolymer of a temperature-responsive monomer not containing fluorine and a non-temperature-responsive monomer containing fluorine.
  • the ratio of fluorine to the weight of the polymer adjusts the fluorine content ratio in the fluorine-containing non-temperature-responsive monomer and / or the fluorine-containing non-temperature-responsive monomer content ratio in the entire monomer. Can be adjusted as appropriate.
  • NIPAM is used as a temperature-responsive monomer not containing fluorine and (perfluoroethyl) methyl methacrylate is copolymerized as a non-temperature-responsive monomer containing fluorine to obtain a temperature-responsive polymer
  • a temperature-responsive polymer having a critical critical dissolution temperature of 0 to 15 ° C. can be obtained.
  • a copolymer that uses at least a part of fluoroacrylate as the non-temperature-responsive monomer that contains fluorine is preferable.
  • fluoroacrylate any copolymer that uses at least a part of fluoroacrylate as the non-temperature-responsive monomer that contains fluorine.
  • the temperature-responsive substrate of the present invention is one in which a layer containing a temperature-responsive polymer is provided on the surface of the substrate.
  • the base material used in the present invention is not particularly limited as long as it is usually used, and examples thereof include substrates, powders, fibers and membranes.
  • the base material may contain only a material capable of forming a polymerization initiation point on the surface, or the whole may contain such a material.
  • the material that can form the polymerization initiation point is not particularly limited, and examples thereof include glass, plastics, ceramics, and metals. Specifically, polystyrene, polyethylene terephthalate, low density polyethylene, medium density polyethylene, high density polyethylene, polyurethane, urethane acrylate, polymethyl methacrylate, and other acrylic resins, and polyamide (nylon), polycarbonate, natural rubber with conjugated bonds And synthetic rubber having a conjugated bond and silicone rubber.
  • the material may be a blend polymer or polymer alloy containing two or more of these.
  • the substrate may be surface-treated as necessary as long as the effect of the present invention is not hindered, and may further have another layer on the surface.
  • the shape of the substrate is not particularly limited, it can be generally a dish, well plate, tube, bottle, flask shape used as a cell culture equipment, a film shape used as a cell culture / medical solution bag, or the like.
  • the method for evaluating a temperature-responsive substrate of the present invention is as follows. Using the polymer prepared by solution polymerization as a sample, This is a method in which the evaluation is performed based on (a) the difference ⁇ in water contact angle before and after the temperature response of the sample, and (b) the presence or absence of a peak of intermediate water in the differential scanning calorimetry of the sample.
  • a temperature-responsive substrate It is required for a temperature-responsive substrate that a substance (for example, an adherent cell) can be favorably adhered in a certain temperature region, and that the substance (for example, a cell) adhered in another temperature region can be peeled off. It is a basic characteristic. In the case of use as a cell culture equipment, it is required to exhibit hydrophobicity during cell culture and hydrophilicity during peeling. With this evaluation method, basic characteristics required for this temperature-responsive substrate can be evaluated.
  • the adsorption amount of the grafted temperature-responsive polymer is very small and the film thickness becomes very thin.
  • the present inventors have found that there is a problem that the temperature responsiveness of the contact angle is greatly influenced by the base material, and therefore cannot be clearly observed.
  • the present inventors have found that by using this evaluation method, even a temperature-responsive cell culture device having such a problem can be screened for the detachability of a substance (for example, adherent cells). In addition, this evaluation is a screening to the last, and not all the equipment which satisfy
  • Temperature-responsive polymer for sample prepared by solution polymerization uses the polymer prepared by solution polymerization as a sample.
  • the method for solution polymerization is not particularly limited, but it is preferably carried out in the same solvent as in “1.2 Method for producing temperature-responsive polymer”.
  • a method for polymerizing the monomer component in a solvent for example, a method in which the monomer component is dissolved in a solvent, and after deoxygenation, a radical polymerization initiator is added while stirring the resulting solution to advance the polymerization reaction. Etc.
  • the polymerization initiator is not particularly limited as long as it is a known polymerization initiator for radical polymerization reaction.
  • azo initiators such as azoisobutyronitrile, methyl azoisobutyrate, azobisdimethylvaleronitrile; benzoyl peroxide, potassium persulfate, ammonium persulfate, benzophenone derivatives, phosphine oxide derivatives, benzoketone derivatives, phenylthioether derivatives, azides Derivatives, diazo derivatives, disulfide derivatives and the like can be used. These polymerization initiators can be used singly or in combination of two or more.
  • the amount of the polymerization initiator used is not particularly limited, but it is usually preferably about 0.01 to 10 parts by weight, and preferably about 0.1 to 1 part by weight with respect to 100 parts by weight of the monomer component. More preferred.
  • the concentration of the monomer component in the solvent is not particularly limited, but is usually preferably about 10 to 50% by weight, more preferably about 20 to 40% by weight.
  • the polymerization conditions such as polymerization temperature and polymerization time may be appropriately adjusted according to the type of monomer component, the amount used thereof, the type of polymerization initiator, the amount used, and the like, but usually at a temperature of about 50 to 100 ° C.
  • a polymerization reaction with a monomer conversion of about 60 to 100% may be performed.
  • the monomer conversion rate can be calculated from the monomer peak areas before and after polymerization measured by gas chromatography.
  • calculation is preferably performed by obtaining a film obtained by spin-coating the sample obtained as described above and measuring the water contact angle of this film.
  • the conditions for spin coating are not particularly limited, but the obtained polymer is diluted with a solvent so as to have a predetermined concentration, spin-coated on a specific substrate, and heat-treated as necessary.
  • the polymer concentration at the time of spin coating is not particularly limited, but can be, for example, 1% by weight.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include isopropyl alcohol.
  • the substrate is not particularly limited, and examples thereof include a silicon wafer. Although not particularly limited, for example, a silicon wafer with a natural oxide film [surface roughness Ra (arithmetic average roughness) 0.5 nm or less] can be used as the silicon wafer.
  • the spin coating conditions are not particularly limited, but examples include conditions of 2000 rpm.
  • the conditions for the heat treatment are not particularly limited, but examples include a condition of 110 ° C. for 3 minutes.
  • the heat treatment in order to distill off the solvent remaining in the spin coat film, it is stored in a vacuum desiccator for 1 hour or more while continuously reducing the pressure with a vacuum pump.
  • ⁇ is 30 ° or more, it can be said that the temperature-responsive polymer is good in terms of the basic characteristics described above. It can be said that when ⁇ is 40 ° or more, it is better in terms of basic characteristics, and when ⁇ is 50 ° or more, it is better in terms of basic properties.
  • the temperature-responsive polymer When the temperature-responsive base material of the present invention is used as a cell culture equipment, the temperature-responsive polymer exhibits (1) hydrophobicity near 37 ° C., which is a normal cell culture temperature, and (2) hydrophilicity due to temperature change. However, it preferably exhibits hydrophilicity when changed within a range of 20 ° C. or less. Therefore, when evaluating such a temperature-responsive polymer, for the sample obtained as described above, (1) 30 to 50 ° C. as a culture temperature region and (2) a temperature region ( Set the temperature range (1) [30-50 ° C] and the temperature range (2) within ⁇ 20 ° C, ie, 10-30 ° C (low temperature side) or 50-70 ° C (high temperature side).
  • the difference ⁇ in water contact angle at 5 ° C. and 40 ° C. is measured.
  • the difference ⁇ between the water contact angles at 20 ° C. and 40 ° C. is measured.
  • the method for measuring the contact angle with water is not particularly limited, but specific examples include the following.
  • a drop volume of 2 ⁇ L was dropped on the surface of the film on which the sample was spin-coated, and the static contact angle after 60 seconds at 5 ° C. and 20 ° C. and after 5 seconds at 40 ° C. was measured using a fully automatic contact angle meter DropMaster 701 (Kyowa Interface Science). Product) or its equivalent.
  • Intermediate water is a water molecule that interacts weakly on the surface of a synthetic polymer, and its presence contributes to prevention of cell and protein adhesion, for example.
  • the present inventors have found that if intermediate water is present in the temperature-responsive polymer, the detachability of an object (for example, adherent cells) attached to the surface of the temperature-responsive cell culture equipment using the intermediate water is improved. .
  • 0.1 g of the sample obtained as described in 2.1 above is immersed in 50 g of water at room temperature (20 to 25 ° C.) for 24 hours to remove excess water with filter paper, and then 5 mg of polymer is filled in an aluminum pan.
  • DSC822e manufactured by Mettler Toledo
  • the low temperature crystal formation peak detected in the range of ⁇ 50 to 0 ° C. when the temperature is raised from ⁇ 75 ° C. to 50 ° C. is intermediate water.
  • the conditions for cooling to raising the temperature are not particularly limited, but can be, for example, as follows.
  • the temperature responsive substrate of the present invention can be widely used for applications in which an object is adhered to and peeled off from a surface.
  • the kind of base material is not specifically limited, they are a board
  • Applications are not particularly limited, but for example, cell culture equipment, column chromatography packing materials, drug delivery systems (drug delivery systems), hydrogels, ion exchange resins, membrane separation systems, desert greening materials, water and oil repellents, etc. Can be used as
  • various cells for example, epithelial cells and endothelial cells constituting each tissue and organ in the living body, skeletal muscle cells showing smoothness, smooth muscle cells, cardiomyocytes, nerves Neurons, glial cells, fibroblasts, hepatocytes related to metabolism in the body, non-hepatocytes and adipocytes, stem cells that exist in various tissues, bone marrow cells, Cell sheets can be prepared from ES cells and the like. The cell sheet thus prepared is suitable for use in regenerative medicine and the like because the adhesion factor on the surface is not impaired and the portion in contact with the cell culture surface has a uniform quality.
  • the cell sheet can be applied to detection devices such as biosensors.
  • Method for peeling cells from culture equipment is a method for peeling cells from culture equipment, A method comprising the step of detaching cells cultured on the surface of the temperature-responsive substrate of the present invention from the surface in an environment below the LCST of the polymer exhibiting temperature responsiveness is included.
  • the cells are not particularly limited as long as they are anchorage-dependent cells (adhesive cells).
  • the origin is not particularly limited, and cells used in a wide range of applications from medical use (including regenerative medicine) to experimental use can be used. Any of a stem cell, a primary culture cell, and a cell line may be sufficient.
  • cells include, but are not limited to, fibroblasts, epidermis cells, epithelial cells (including corneal epithelial cells, bladder epithelial cells, etc.), myoblasts, smooth muscle cells, hepatocytes, endothelial cells, nerve cells, oral cavity Mucosal cells, amniotic cells, adipocytes (including preadipocytes), dendritic cells (including mononuclear cells), osteoclasts, tumor cells, various stem cells (bone marrow stem cells, mesenchymal stem cells, ES cells and iPS) Cell)).
  • fibroblasts including corneal epithelial cells, bladder epithelial cells, etc.
  • myoblasts smooth muscle cells
  • hepatocytes including endothelial cells
  • nerve cells include, oral cavity Mucosal cells, amniotic cells, adipocytes (including preadipocytes), dendritic cells (including mononuclear cells), osteoclasts, tumor cells, various stem cells (bone
  • the cell culture conditions can be appropriately set according to a known method according to the cell type.
  • the surface of the temperature-responsive substrate of the present invention changes from hydrophobic during cell culture to hydrophilic during detachment above and below the LCST of the polymer exhibiting temperature responsiveness. Thereby, a cell can be easily peeled from the surface.
  • mechanical stimulation such as shaking and expansion / contraction of the substrate and / or chemicals such as trypsin. Separation can be promoted as appropriate by the action.
  • the time for placing the cells in an environment lower than the LCST of the polymer exhibiting temperature responsiveness is not particularly limited and can be set as appropriate.
  • the present invention is a cell sheet production method, The method includes a step of detaching the sheet-like cells cultured on the surface of the temperature-responsive substrate of the present invention from the surface in an environment below the LCST of the polymer exhibiting temperature-responsiveness.
  • the cells those described in “4. Method for peeling cells from culture equipment” can be used, but since it is necessary to form a sheet, such cells should be appropriately selected according to the culture conditions. That's fine.
  • particularly preferable cells for preparing the cell sheet are not particularly limited.
  • fibroblasts for example, fibroblasts, epidermis cells, epithelial cells (including corneal epithelial cells, bladder epithelial cells, etc.), myoblasts, smooth cells Muscle cells, oral mucosal cells, amniotic cells, adipocytes (including preadipocytes), dendritic cells (including mononuclear cells), osteoclasts, tumor cells, various stem cells (mesenchymal stem cells, ES cells and (including iPS cells).
  • the cell sheet may be a single-layer sheet or a laminated sheet.
  • Examples 1-32 and Comparative Examples 1-4 1.1 Material As the cell culture equipment (cell culture dish), a Falcon (registered trademark) 3001 Petri dish (diameter: 3.5 cm) manufactured by Corning International, Inc. (formerly Becton Dickinson Labware) was used.
  • IPA isopropyl alcohol
  • IPA was used in the case of NIPAM
  • HCFC225 was used in the case of a fluorine monomer alone.
  • the monomer concentration was 20% by weight, 1 mol% (based on monomer) of azobisisobutylnitrile was used as a polymerization initiator, and polymerization was performed at 70 ° C. in the case of NIPAM system and 50 ° C. in the case of a fluorine monomer alone.
  • Table 1 shows the evaluation results for polymers prepared by surface graft polymerization of various monomer solutions.
  • C6-SFMA (perfluorohexyl) ethyl methacrylate
  • C6-SFA (per Fluorohexyl) ethyl acrylate and (CF3) 2CH-Ac C3F7OCF (CF3) CF2O-CF (CF3) CH2-Ac C3F7OCF (CF3) CF2O-CF (CF3) CH2-MAc
  • Ac represents CH ⁇ C (H) COO—
  • MAc represents CH ⁇ C (CH
  • Examples 1 to 8 and Examples 9 to 18 use the same monomer, but in Examples 1 to 8, experiments in which surface graft polymerization was performed by a simultaneous irradiation method were used. The results are shown in Examples 9 to 16, respectively, in which the results of experiments in which surface graft polymerization was performed by the pre-irradiation method were shown. The results of solution polymerization are shown only in the columns of Examples 1 to 8.
  • N1s / C1s and F1s / C1s when the surface prepared by the pre-irradiation method is measured by XPS are higher than the measurement values of the surface prepared by the simultaneous irradiation method using the same amount of the same monomer, more polymers It is thought that it adsorbed.
  • Table 2 shows the relationship between the molar ratio and weight ratio of the NIPAM / Cn-SF (M) A copolymer and NIPAM / n-butyl methacrylate (BMA) copolymer prepared by solution polymerization, the fluorine-containing concentration, and various physical properties. Shown in
  • the conditions for surface graft polymerization in Tables 3 to 6 are the simultaneous irradiation method (see Example 1.3) with a monomer concentration of 40% by weight, and washing after the surface graft polymerization is performed in the same manner as in Example 1.4. It was.
  • 1 to 4 show only the temperature responsiveness enhancement effect under specific conditions (for example, a change from a specific temperature to a specific temperature). 1 to 4 show that the temperature responsiveness is maximized by blending a predetermined amount of NIPAM / fluorinated monomer copolymer with NIPAM under this specific condition.
  • Test Example 1 (Preparation of fibroblast sheet) Primary fibroblasts were obtained from known procedures (Z. Yablonka-Reuveni, M. Nameroff. Skeletal muscle cell populations. Separation and partial characterization of fibroblast-like cells from embryonic tissue using density centrifugation. Histochemistry. 1987; 87: 27-38) Prepare according to In summary, this is a procedure in which cell suspensions from leg muscles of 8-week-old Lewis rats are separated into fibroblasts and myocytes by Percoll® (Amersham Biosciences Sweden) density centrifugation. is there.
  • the isolated fibroblast is cultured on the temperature-responsive cell culture device of the present invention.
  • the culture included 6% FBS, 40% Medium 199 (Gibco® BRL), 0.2% penicillin-streptomycin solution, 2.7 mmol / L glucose and 54% balanced salt solution (116 mmol / L NaCl, 1.0 mmol / A culture medium containing LNaH 2 PO 4 , 0.8 mmol / LMgSO 4 , 1.18 mmol / LKCl, 0.87 mmol / LCaCl 2 and 26.2 mmol / KNaHCO 3 ) is used. After culturing for 2 days, it is peeled off as a cell sheet by changing the temperature.
  • an electron beam (200 kGy) was irradiated to fix the polymer on the surface of the equipment.
  • Cells used Mouse fibroblasts Media used: DMEM / 10% FCS Cell seeding density: 1 ⁇ 10 5 cells / dish (3.5 cm diameter) (2) Cell detachment test at the initial stage of culture Culture was performed for 1 day, and cell adhesion was observed with a microscope (FIG. 5). At this time, adhesion of the cells to the culture surface was confirmed.
  • Example 37 An AB type diblock copolymer [P (NIPAM-block-C2-SFA)] of NIPAM and C2-SFA was prepared as follows.
  • bpy 2,2′-bipyridyl 93.7 mg (0.600 mmol) was added, purged with nitrogen, 8.49 g (75.0 mmol) of NIPAM, IPA 21.5 g was added, freeze degassing was performed, 58.5 mg (0.300 mmol) of ethyl ⁇ -bromoisobutyrate as a polymerization initiator was charged, freeze degassing was performed, and the temperature was increased to 25 ° C. under a nitrogen atmosphere. And stirred.
  • the reaction solution was poured into a large amount of water at 50 ° C. to obtain a white solid.
  • the white solid is dissolved by setting the temperature of the mixed solution to 20 ° C., the CuCl and bpy are removed by passing the liquid through an alumina column, the solvent is distilled off until the liquid reaches an appropriate amount, and freeze drying is performed again. A white solid was obtained.
  • Example 38 An ABA type triblock copolymer [P (NIPAM-block-C2-SFA-block-NIPAM)] of NIPAM and C2-SFA was prepared as follows.
  • the white solid was evaluated by 1H-NMR and GPC to be P (NIPAM-block-C2-SFA-block-NIPAM) having a number average molecular weight of 82,900, a weight average molecular weight of 115,000 and a molecular weight distribution of 1.39. It was confirmed.

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Abstract

温度応答性基材であって、（１）表面に付着した物体（例えば細胞）の剥離がより容易であること、及び／又は（２）表面に付着したシート（例えば細胞シート）を、より損傷が少ない状態で剥離できること及び／又は（３）ＬＣＳＴが従来よりも低く取扱性に優れる、という優れた特性を備える温度応答性細胞培養器材を提供すること、並びに（４）上記のような特性の点で温度応答性基材を評価できる方法を提供すること。 少なくとも一種のポリマーを含有する層を表面に有する温度応答性基材であって、 前記ポリマーの少なくとも一種のポリマーが温度応答性を示すものであり、かつ 前記ポリマーの少なくとも一種のポリマーが含フッ素モノマーに基づく構成単位を含有するものであることを特徴とする、温度応答性基材。

Description

温度応答性基材、その製造方法及びその評価方法
　本発明は、温度応答性基材、その製造方法及びその評価方法に関する。
　温度応答性を有する基材が、各種用途に用いられている。例えば、以下に説明する細胞培養器材をはじめ、カラムクロマトグラフィーの充填剤、薬物送達システム（ドラッグデリバリーシステム）、ハイドロゲル、イオン交換樹脂、膜分離システム、砂漠の緑化材料及び撥水撥油剤等に用いられている。
　従来、接着細胞の培養は、ガラス表面あるいは種々の処理を行なった合成樹脂表面の上に接着させることにより行われていた。例えば、ポリスチレンをグロー放電若しくはコロナ放電等により親水化処理したもの、又はポリスチレンをコラーゲン若しくはＭＰＣポリマー等の生体親和性ポリマーによってコーティングしたもの等、様々な表面を有する培養容器が用いられている（特許文献１、非特許文献１）。
　このような材料（細胞培養器材）の表面に接着させて培養した細胞を回収するためには、細胞を細胞培養器材表面から剥離する必要がある。この目的のために、細胞と細胞培養器材の間の結合を破壊する作用を有する物質、例えばトリプシンのようなタンパク質分解酵素、又は化学薬品が用いられる。しかしながら、酵素処理や化学薬品処理は煩雑であるだけでなく、不純物混入の可能性が高くなること、また細胞自体が変性し本来の機能が損なわれる場合があること等の欠点が指摘されている。
　また、近年、再生医療分野や３Ｄ培養等において、細胞同士が細胞外マトリックスを介して結合したシート状の細胞集合体（細胞シート）が注目されている。ところが、いったん細胞培養器材表面上で細胞シートを形成したとしても、酵素処理や化学薬品処理では、細胞外マトリックスも破壊されるため、細胞をシート状のまま回収することが困難であるという問題があった。
　これらの欠点を解消するために、酵素処理や化学薬品処理を行うことなく、水に対する上限臨界溶解温度（以後、ＵＣＳＴと省略することがある）又は下限臨界溶解温度（以後、ＬＣＳＴと省略することがある）が０～８０℃である温度応答性ポリマーで被覆した細胞培養器材を用い、温度変化によって細胞を剥離する技術が提案されている(特許文献２)。この温度応答性ポリマー被覆細胞培養器材は、細胞を損傷の少ない状態で回収できるだけでなく、細胞シートの作製にも有効である。
　しかしながら、従来の温度応答性ポリマー被覆細胞培養器材には、細胞の剥離しやすさの点で、さらに向上させる余地があった。具体的には、従来の温度応答性ポリマー被覆細胞培養器材には、細胞シートを剥離する際に、細胞シートが破れてしまう場合があるという問題があった。この原因は、温度応答性ポリマー被覆が海島状になっているためであるとされる（特許文献３）。具体的には、島状の結晶部分はグラフト化が進みにくいため細胞剥離機能が弱い部分となり、海状のモノマー溶解液部分はグラフト化が進みやすいため細胞剥離機能が強い部分となる。このような温度応答性ポリマー被覆細胞培養器材では、細胞が均一に接着又は増殖できない。この問題を解決する目的で、放射線照射条件及び乾燥条件等を最適化するという提案がなされている（特許文献３）。
特開２００８－２９７４８８号公報 特開平２－２１１８６５号公報 特開２０１３－１１６１３０号公報
細胞培養関連製品カタログ 2013、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社ラボプロダクツ事業本部、p.3
　本発明は、従来よりも優れた温度応答性基材を提供することを課題とする。具体的には、温度応答性基材であって、（１）表面に付着した物体（例えば細胞）の剥離がより容易であること、及び／又は（２）表面に付着したシート（例えば細胞シート）を、より損傷が少ない状態で剥離できること及び／又は（３）ＬＣＳＴが従来よりも低く取扱性に優れる、という優れた特性を備える温度応答性細胞培養器材を提供することを課題とする。さらに、本発明は、（４）上記のような特性の点で温度応答性基材を評価できる方法を提供することも別の課題とする。
　本発明者らは、少なくとも一種のポリマーであって、少なくとも一種が温度応答性を示すものであり、かつ少なくとも一種が含フッ素モノマーに基づく構成単位を含有するものであるポリマーを用いることにより、上記課題（１）を解決できることを見出した。
　また、本発明者らは、上記課題（２）の解決のために、基材上に温度応答性ポリマー層をより均一に形成することが重要であることを着想した。そして、本発明者らは、前照射法による放射線表面グラフト重合によって、温度応答性ポリマー層を前記基材の表面に形成することにより上記課題（２）を解決できることを見出した。
　また、本発明者らは、フッ素濃度が所定範囲内である、含フッ素モノマーに基づく構成単位を含有する温度応答性ポリマー（含フッ素温度応答性ポリマー）を用いることにより、上記課題（３）を解決できることを見出した。
　さらに、本発明者らは、温度応答性ポリマーの、（ａ）所定温度間における対水接触角の差、及び（ｂ）示差走査熱量分析における中間水のピークの有無が、そのポリマーを温度応答性細胞培養器材として利用したときにおける、表面に付着した物体（例えば細胞）の剥離し易さと関連していること、ひいてはかかる知見を応用することにより上記課題（４）を解決できることを見出した。
　すなわち、本発明は、下記の温度応答性基材、その製造方法及びその評価方法を提供するものである。
項１．
少なくとも一種のポリマーを含有する層を表面に有する温度応答性基材であって、
前記ポリマーの少なくとも一種のポリマーが温度応答性を示すものであり、かつ
前記ポリマーの少なくとも一種のポリマーが含フッ素モノマーに基づく構成単位を含有するものであることを特徴とする、温度応答性基材。
項２．
温度応答性を示す前記ポリマーの下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０～１５℃である、項１に記載の温度応答性基材。
項３．
温度応答性を示す前記ポリマーが、ポリマーの重量に対して２～４０重量％のフッ素を含有するものである、項１又は２に記載の温度応答性基材。
項４．
前記含フッ素モノマーが、フルオロアルキル基を有する含フッ素モノマーである、項１～３のいずれか一項に記載の温度応答性基材。
項５．
　含フッ素モノマーが、一般式（１）：
ＣＨ２＝Ｃ（－Ｘ）－Ｃ（＝Ｏ）－Ｙ－Ｚ－Ｒｆ　　　　（１）
［式中、Ｘは、水素原子、炭素数１～２１の直鎖状又は分岐状のアルキル基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、ＣＦＸ１Ｘ２基（但し、Ｘ１及びＸ２は、水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子である。）、シアノ基、炭素数１～２１の直鎖状若しくは分岐状のフルオロアルキル基、置換若しくは非置換のベンジル基又は置換若しくは非置換のフェニル基であり；
Ｙは、－Ｏ－又は－ＮＨ－であり；
Ｚは、炭素数１～１０の脂肪族基、炭素数６～１０の芳香族基若しくは環状脂肪族基、
－ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）ＳＯ２－基（但し、Ｒ１は炭素数１～４のアルキル基である。）、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＺ）１）ＣＨ２－基（但し、Ｚ１は水素原子又はアセチル基である。）、－（ＣＨ２）ｍ－ＳＯ２－（ＣＨ２）ｎ－基、－（ＣＨ２）ｍ－Ｓ－（ＣＨ２）ｎ－基（但し、ｍは１～１０、ｎは０～１０である。）又は－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯＯ－基（ｍは１～１０である。）であり；
Ｒｆは、ヘテロ原子を有していてもよい、炭素数１～２０の直鎖状又は分岐状のフルオロアルキル基である。］で表される、項１～４のいずれか一項に記載の温度応答性基材。
項６．
一般式（１）で表される含フッ素モノマーにおいて、Ｒｆが炭素数１～６の直鎖状又は分岐状の、ヘテロ原子を有していてもよいフルオロアルキル基である、項５に記載の温度応答性基材。
項７． 
前記層が、
含フッ素モノマーに基づく構成単位を全モノマー構成単位中５ｍｏｌ％以上含有する、少なくとも一種のポリマー、及び
含フッ素モノマーに基づく構成単位の全モノマー構成単位に占める割合が５ｍｏｌ％未満である、少なくとも一種の温度応答性ポリマー
のブレンドポリマーを含有する、項１～６のいずれか一項に記載の温度応答性基材。
項８．
含フッ素モノマーに基づく構成単位を全モノマー構成単位中５ｍｏｌ％以上含有する前記ポリマーの少なくとも一種が、温度応答性ポリマーである、項７に記載の温度応答性基材。
項９．
前記ブレンドポリマーを構成するモノマー構成単位の合計に対する前記含フッ素モノマーに基づく構成単位の割合が０．５ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％である、項７又は８に記載の温度応答性基材。
項１０．
項１～９のいずれか一項に記載の温度応答性基材を製造するために用いられる、含フッ素モノマーに基づく構成単位を含有するポリマー。
項１１．
温度応答性ポリマーである、項１０に記載のポリマー。
項１２．
項１～９のいずれか一項に記載の温度応答性基材を製造するために用いられる、（ａ）それを重合することにより得られるホモポリマーが温度応答性を示すモノマー、及び
（ｂ）含フッ素モノマー
を含有する組成物。
項１３．
温度応答性ポリマーを含有する層を表面に有する温度応答性基材であって、
前照射法による放射線表面グラフト重合によって、前記層を基材の表面に形成することにより得られうるものであることを特徴とする、温度応答性基材。
項１４．
細胞培養器材である、項１～９及び１３のいずれか一項に記載の温度応答性基材。
項１５．培養器材から細胞を剥離する方法であって、
項１～９のいずれか一項に記載の温度応答性基材の表面で培養された細胞を、温度応答性を示す前記ポリマーのＬＣＳＴ未満の環境下で該表面から剥離する工程
を含む方法。
項１６．
温度応答性を示す前記ポリマーのＬＣＳＴが０～１５℃である、項１５に記載の方法。
項１７．
温度応答性を示す前記ポリマーが、ポリマーの重量に対して２～２０重量％のフッ素を含有するものである、項１６に記載の方法。
項１８．
細胞シートの製造方法であって、
項１～９のいずれか一項に記載の温度応答性基材の表面で培養されたシート状の細胞を、温度応答性を示す前記ポリマーのＬＣＳＴ未満の環境下で該表面から剥離する工程
を含む方法。
項１９．
温度応答性を示す前記ポリマーのＬＣＳＴが０～１５℃である、項１８に記載の方法。
項２０．
温度応答性を示す前記ポリマーが、ポリマーの重量に対して２～２０重量％のフッ素を含有するものである、項１９に記載の方法。
項２１．
温度応答性ポリマーを含有する層を表面に有する温度応答性基材の製造方法であって、
前照射法による放射線表面グラフト重合によって、前記層を基材の表面に形成する工程を含むことを特徴とする、製造方法。
項２２．
温度応答性ポリマーを含有する層を表面に有する温度応答性基材であって、
前記ポリマーが、
溶液重合により調製された場合に、５℃（前記ポリマーのＬＣＳＴが２０℃未満の場合）又は２０℃（前記ポリマーのＬＣＳＴが２０℃以上３７℃以下の場合）及び４０℃における対水接触角の差△θが３０°以上であり、かつ、
示差走査熱量分析法において中間水のピークを有する
ものであることを特徴とする、温度応答性基材。
項２３．
温度応答性ポリマーを含有する層を表面に有する温度応答性基材の評価方法であって、
溶液重合により調製された前記ポリマーを試料として用い、
（ａ）前記試料の、温度応答前後における対水接触角の差△θ、及び
（ｂ）前記試料の、示差走査熱量分析における中間水のピークの有無
に基づいて評価を行う、方法。
　本発明によれば、温度応答性基材の特性を改良できる。具体的には、（１）表面に付着した物体（例えば細胞）の剥離をより容易とし、及び／又は（２）表面に付着したシート（例えば細胞シート）を、より損傷が少ない状態で剥離できるようにし、及び／又は（３）ＬＣＳＴを従来よりも低くして取扱性を改善することができる。さらに、本発明の別の態様によれば、（４）温度応答性基材を従来よりも適正に評価できる。
溶液重合で調製した「NIPAMホモポリマー －NIPAM/C2-SFMA(=90/10mol)共重合体」ブレンドポリマーの温度応答性を評価した結果を示すグラフである。 溶液重合で調製した「NIPAMホモポリマー －NIPAM/C2-SFMA(=70/30mol)共重合体」ブレンドポリマーの温度応答性を評価した結果を示すグラフである。 溶液重合で調製した「NIPAMホモポリマー －NIPAM/C6-SFMA(=90/10mol)共重合体」ブレンドポリマーの温度応答性を評価した結果を示すグラフである。 溶液重合で調製した「NIPAMホモポリマー －NIPAM/C6-SFMA(=70/30mol)共重合体」ブレンドポリマーの温度応答性を評価した結果を示すグラフである。 実施例３３の培養実験の結果を示す写真である。 実施例３３の培養実験の結果を示す写真である。 実施例３３の培養実験の結果を示す写真である。 実施例３３の培養実験の結果を示す写真である。 実施例３３の培養実験の結果を示す写真である。
　以下、本発明の温度応答性基材、その製造方法及びその評価方法について具体的に説明する。
　１．　温度応答性基材
　本発明の温度応答性基材は、温度応答性ポリマーを含有する層を表面に有する温度応答性基材である。
　本発明の温度応答性基材の一態様（態様１）は、
少なくとも一種のポリマーを含有する層（温度応答性ポリマー層ということがある。）を表面に有する温度応答性基材であって、
前記ポリマーの少なくとも一種のポリマーが温度応答性を示すものであり、かつ
前記ポリマーの少なくとも一種のポリマーが含フッ素モノマーに基づく構成単位を含有するものであることを特徴とする、温度応答性基材である。
　前記温度応答性ポリマー層は、二種以上のポリマーを含有する場合、これらのブレンドポリマーを含有する。
　この本発明の温度応答性基材は、前記温度応答性ポリマー層が、含フッ素モノマーに基づく構成単位を含むものであるため、このことに起因して、表面に付着した物体（例えば細胞）の剥離が容易であるという優れた効果を奏する。
　また、本発明の温度応答性基材の別の態様（態様２）は、
上記温度応答性基材において、温度応答性を示す前記ポリマーのＬＣＳＴが０～１５℃であるものである。これにより、表面に付着した物体（例えば細胞）の剥離が、従来よりも低い温度領域でのみ起こるように制御でき、有利である。例えば、本発明の温度応答性基材を、細胞培養器材として用いる場合には、培養器材からの細胞の剥離が室温付近では起こらず、意図的により低温としたときに限って剥離が生じるように制御できる。従来は、室温環境下で作業する場合、意図しない剥離を避けるのが困難であったが、本態様によればこれを回避でき、取扱性により優れたものとすることができる。
　また、本発明の温度応答性基材の別の態様（態様３）は、
温度応答性ポリマーを含有する層を表面に有する温度応答性基材であって、
前照射法による放射線表面グラフト重合によって、前記層を前記器材の表面に形成することにより得られうるものであることを特徴とする、温度応答性基材である。
　前照射法による放射線表面グラフト重合によって、基材の表面に重合開始点を形成した後、そこに温度応答性ポリマーを成長させることができる。これにより、温度応答性ポリマーを基材の表面に化学結合により固定することができ、基材上に温度応答性ポリマー層をより均一に形成することができるので好ましい。なお、本明細書において、「化学結合」には、特に断りのない限り、共有結合、配位結合、イオン結合、水素結合及びファンデルワールス結合が含まれる。
　本発明の温度応答性基材のさらに別の態様（態様４）は、
温度応答性ポリマーを含有する層を表面に有する温度応答性基材であって、
前記ポリマーが、
溶液重合により調製された場合に、５℃（前記ポリマーのＬＣＳＴが２０℃未満の場合）又は２０℃（前記ポリマーのＬＣＳＴが２０℃以上３７℃以下の場合）及び４０℃における対水接触角の差△θが３０°以上であり、かつ、
示差走査熱量分析法において中間水のピークを有する
ものであることを特徴とする、温度応答性基材である。
　上記において、△θが、３０°以上を示すとき、温度応答性ポリマーは、物質（例えば接着細胞）をある温度領域において良好に接着させることができ、ある別の温度領域において接着した物質（例えば細胞）を剥離することができるという基本的特性の点で良好であるといえる。
　１．１　温度応答性ポリマー
　本発明において、特定の温度で疎水性であるが、温度変化に応じて親水性に変わる特性のことを、「温度応答性」といい、そのような特性を有するポリマーのことを、「温度応答性ポリマー」ということがある。本発明の温度応答性基材を温度応答性細胞培養器材として用いる場合には、ある態様においては、細胞培養温度（特に限定されないが、通常は、３７℃程度である。）と室温（通常は２０～２５℃）の間の温度で応答することができる。その場合、ＬＣＳＴは２８～３５℃が好ましい。また、詳しくは後述する別の態様（態様２）においては、より低温領域（０～１５℃）で応答することとすることができる。その場合、ＬＣＳＴは６～１５℃が好ましい。
　温度応答性ポリマーは、水に対する臨界溶解温度（ＣＳＴ）において、疎水性（または親水性）から親水性（または疎水性）に変化する。温度応答性ポリマーとしては、（１）臨界溶解温度未満（このときの臨界溶解温度を特に「下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）」という。）の温度で親水性を示すが、同温度以上の温度で疎水性を示す温度応答性ポリマーと、（２）臨界溶解温度以上（このときの臨界溶解温度を特に「上限臨界溶解温度（ＵＣＳＴ）」という。）の温度で親水性を示すが、同温度未満の温度で疎水性を示す温度応答性ポリマーのいずれも用いることができる。
　本発明の温度応答性基材は、物体（例えば接着細胞）が付着する表面［例えば細胞を培養する表面（「培養面」ということがある。）］が、特定の温度領域（例えば細胞培養温度）において疎水性であるため物体（例えば接着細胞）を付着させることができ、温度変化により親水性に変化するため、付着した物体（例えば接着細胞）を表面から容易に剥離させることができる（便宜上、このときの温度を「剥離温度」という。）。
　本発明の温度応答性基材を細胞培養器材として用いる場合、特に限定されないが、培養細胞を培養面から剥離させた後の細胞回収操作の容易さの点では、剥離温度は細胞培養温度よりも低い温度であることが好ましい。言い換えれば、このときに用いる温度応答性ポリマーは、ＬＣＳＴが細胞培養温度よりも低い温度である。このとき、ＬＣＳＴは細胞に傷害を与えない程度の温度であることが好ましく、具体的には、０℃以上であることが好ましい。
　なお、本発明の温度応答性基材を細胞培養器材として用いる場合、剥離温度は細胞培養温度よりも高い温度であってもよく、言い換えれば、このときに用いる温度応答性ポリマーは、ＵＣＳＴが細胞培養温度よりも高い温度である。このとき、ＵＣＳＴは細胞に傷害を与えない程度の温度であることが好ましく、具体的には、８０℃以下、より好ましくは５０℃以下である。
　温度応答性ポリマーとしては、特に限定されないが、アクリル系ポリマー及びメタクリル系ポリマー等が挙げられる。特に限定されないが、具体例としては、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（本明細書において、「ＮＩＰＡＭ」と表記することがある。））(ＬＣＳＴ＝３２℃)、ポリ（Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド）(ＬＣＳＴ＝２１℃)、ポリ（Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド）(ＬＣＳＴ＝３２℃)、ポリ（Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド）(ＬＣＳＴ＝約３５℃)、ポリ（Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド）(ＬＣＳＴ＝約２８℃)、ポリ（Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド）（ＬＣＳＴ＝約３５℃）、ポリ（Ｎ,Ｎ－ジエチルアクリルアミド）(ＬＣＳＴ＝３２℃)、ポリ（Ｎ－エチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ－アクリロイルピロリジン）、ポリ（Ｎ－アクリロイルピペリジン）及びポリメチルビニルエーテル等が挙げられる。
　温度応答性ポリマーとしては、他にも、メチルセルロース、エチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース等のアルキル置換セルロース誘導体、ポリポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等のポリアルキレンオキサイドブロック共重合体、並びにポリアルキレンオキサイドブロック共重合体等も挙げられる。
　これらの温度応答性ポリマーは、特に限定されないが、モノマーを放射線照射によって重合することにより、または、溶液重合することにより得られうるものである。溶液重合は、特に限定されないが、例えばフラスコ内で行うことができる。
　モノマーとしては、それを重合することにより得られるホモポリマーが温度応答性を示すもの（便宜上、「温度応答性モノマー」ということがある。）を用いることができる。
温度応答性モノマーとしては、特に限定されないが、例えば、(メタ)アクリルアミド化合物、Ｎ－(若しくはＮ,Ｎ－ジ)アルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体、環状基を有する(メタ)アクリルアミド誘導体及びビニルエーテル誘導体等が挙げられる。温度応答性ポリマーは、１種の温度応答性モノマーを重合することにより得られるホモポリマーであってもよいし、２種以上の温度応答性モノマーを重合することにより得られるコポリマーであってもよい。コポリマーは、グラフトコポリマー、ブロックコポリマー及びランダムコポリマーのいずれであってもよい。
　また、温度応答性ポリマーは、必要に応じて、温度応答性モノマーに加えて、温度応答性を阻害しない範囲内において、それ自体は温度応答性モノマーに該当しないモノマー（便宜上、「非温度応答性モノマー」ということがある。）からなるモノマー成分を重合することにより得られる共重合体であってもよい。共重合体は、ランダム共重合体、ブロック共重合体及びグラフト共重合体のいずれであってもよい。本発明の「ランダム共重合体」は、統計連鎖配列により定義された狭義ではなく、精密重合ではない、混合した２種類以上のモノマーを同時に重合して得られる広義を指す。溶液重合により調製された場合に、５℃（前記ポリマーのＬＣＳＴが２０℃未満の場合）又は２０℃（前記ポリマーのＬＣＳＴが２０℃以上３７℃以下の場合）及び４０℃における対水接触角の差△θが３０°以上であり、かつ、示差走査熱量分析法において中間水のピークを有するポリマー（態様４）も広義のランダム共重合体である。本発明で使用されるモノマー群において、ランダム共重合体は、ＬＣＳＴを下げる効果がある。
　ブロックポリマーは、ＡＢ型ジブロックであってもよいし、ＡＢＡ型トリブロックであってもよい。後者の場合、含フッ素モノマーからなるポリマーはＡブロックであってもよいし、Ｂブロックであってもよい。また、特に限定されないが、グラフトポリマーは、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１０年、４３、ｐｐ．１９６４－１９７４記載のように幹となるポリマーが直鎖であってもよいし、国際公開第ＷＯ／２０１４１３３１６８号に記載されているような分岐状であってもよい。その際、含フッ素モノマーは幹の部分を構成するモノマーと共重合してもよいし、グラフト部位を構成する温度応答性モノマーと共重合してもよい。ブロック共重合体及びグラフト共重合体は、後述する放射線照射のような工程を経ないでも、単に基材上に塗布するだけで、基材に固定化されうる。なお、上記「固定化」は、細胞培養時にポリマーが培地中に溶出することなく、細胞シートを剥離するときにも、ポリマーが細胞シートと一緒に剥離することがない程度吸着されている状態を示す。
　上記において、非温度応答性モノマーのモノマー成分全体に占める割合は、温度応答性モノマーの温度応答性を阻害しない範囲内において適宜設定することができる。非温度応答性モノマーのモノマー成分全体に占める割合は、通常、好ましくは３０ｍｏｌ％以下、より好ましくは１０ｍｏｌ％以下である。
　非温度応答性モノマーとしては、特に限定されないが、含フッ素モノマー等が挙げられる。非温度応答性モノマーとして含フッ素モノマーを用いて得られる場合、温度応答性ポリマーは、含フッ素モノマーに基づく構成単位を含有する。この場合、（１）温度応答性ポリマーは、含フッ素ポリマーとしての特性、特に低表面自由エネルギー性を備えていることに起因して、その表面で物体（例えば接着細胞）を接触（細胞の場合は培養）させた際に非粘着性が良好となるという有利な特性を備えたものとなる。この点では、温度応答性ポリマーは、少なくとも一種の温度応答性モノマー及び含フッ素モノマーを含有するモノマー成分を表面グラフト重合することにより得られるグラフトコポリマーであれば、含フッ素ポリマーとしての特性がより強く付与されるため好ましい。非温度応答性モノマーとして含フッ素モノマーを用いて得られる温度応答性ポリマーは、さらに、（２）含フッ素ポリマーとしての特性、特に水不溶性を備えていることに起因して、基材表面に化学結合させなくとも、培地中への溶出や、細胞シート剥離時に細胞シートと一緒に剥離されるリスクを低減できるという別の有利な特性を備えたものとなる。。
　含フッ素モノマーとしては、上記のような有利な特性を最終的に得られる温度応答性ポリマーに付与できるものであればよく、特に限定されない。
　含フッ素モノマーとしては、特に限定されないが、例えば、アクリル酸系単量体、アクリレート系単量体、アクリルアミド系単量体、スチレン系単量体、アクリロニトリル系単量体、ビニルピロリドン系単量体、ビニルエーテル系単量体及びピロール系単量体等において、少なくとも一つの水素原子がフッ素原子に置換されたものが挙げられる。
　上記においてアクリル酸系単量体としては、特に限定されないが、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、無水マレイン酸、マレイン酸、フマル酸、クロトン酸等が挙げられる。
　上記においてアクリレート系単量体としては、特に限定されないが、例えば、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ｎ－プロピルアクリレート、ｎ－プロピルメタクリレート、イソプロピルアクリレート、イソプロピルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ステアリルアクリレート等のα，β－エチレン性不飽和カルボン酸エステル；２－ヒドロキシルエチルアクリレート、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、３－ヒドロキシプロピルメタクリレート等のα，β－エチレン性不飽和カルボン酸のヒドロキシアルキルエステル；並びにジエチレングリコールメタクリレートのようなα，β－エチレン性不飽和カルボン酸のアルコキシアルキルエステル等が挙げられる。
　上記においてアクリルアミド系単量体としては、特に限定されないが、例えば、アクリルアミド、メチロールメタクリルアミド等が挙げられる。
　上記においてスチレン系単量体としては、特に限定されないが、例えば、スチレン、アルキルスチレン等が挙げられる。
　含フッ素モノマーとして、例えば、カルボキシル基に対して直接又は２価の有機基を介してエステル結合又はアミド結合したフルオロアルキル基を有し、α位に置換基を有することのあるアクリル酸エステル（以下、「フルオロアルキル基含有アクリル酸エステル」と略記することがある。）、又は「フルオロアルキル基含有アクリルアミド」等が挙げられる。
　フルオロアルキル基含有アクリル酸エステル又はフルオロアルキル基含有アクリルアミドの好ましい具体例としては、下記一般式（１）：
ＣＨ２＝Ｃ（－Ｘ）－Ｃ（＝Ｏ）－Ｙ－Ｚ－Ｒｆ　　　　（１）
［式中、Ｘは、水素原子、炭素数１～２１の直鎖状又は分岐状のアルキル基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、ＣＦＸ１Ｘ２基（但し、Ｘ１及びＸ２は、水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子である。）、シアノ基、炭素数１～２１の直鎖状若しくは分岐状のフルオロアルキル基、置換若しくは非置換のベンジル基又は置換若しくは非置換のフェニル基であり；
Ｙは、－Ｏ－又は－ＮＨ－であり；
Ｚは、炭素数１～１０の脂肪族基、炭素数６～１０の芳香族基若しくは環状脂肪族基、
－ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）ＳＯ２－基（但し、Ｒ１は炭素数１～４のアルキル基である。）、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＺ）１）ＣＨ２－基（但し、Ｚ１は水素原子又はアセチル基である。）、－（ＣＨ２）ｍ－ＳＯ２－（ＣＨ２）ｎ－基、－（ＣＨ２）ｍ－Ｓ－（ＣＨ２）ｎ－基（但し、ｍは１～１０、nは０～１０である。）又は－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯＯ－基（ｍは１～１０である。）であり；
Ｒｆは、ヘテロ原子を有していてもよい、炭素数１～２０の直鎖状又は分岐状のフルオロアルキル基である。］で表されるアクリル酸エステル及びアクリルアミドを例示できる。
　上記一般式（１）において、Rfで表されるフルオロアルキル基は、少なくとも一個の水素原子がフッ素原子で置換された、ヘテロ原子を有していてもよいアルキル基であり、全ての水素原子がフッ素原子で置換された、ヘテロ原子を有していてもよいパーフルオロアルキル基も包含するものである。
　上記一般式（１）で表されるアクリル酸エステル及びアクリルアミドでは、Ｒｆが炭素数１～６の直鎖状又は分岐状のフルオロアルキル基であることが好ましく、特に、炭素数１～３の直鎖状又は分岐状のパーフルオロアルキル基であることが好ましい。近年、ＥＰＡ（米国環境保護庁）により、炭素数が８以上のフルオロアルキル基を有する化合物は、環境、生体中で分解して蓄積するおそれがある環境負荷が高い化合物であることが指摘されているが、一般式（１）で表されるアクリル酸エステル及びアクリルアミドにおいてＲｆが炭素数１～６の直鎖状又は分岐状のフルオロアルキル基である場合には、この様な環境問題が指摘されていないためである。
　上記式（１）において、Rf基の例として、－CF3、－CF2CF3、－CF2CF2H、－CF2CF2CF3、－CF2CFHCF3、－CF(CF3)2、－CF2CF2CF2CF3、－CF2CF(CF3)2、－C(CF3)3、－(CF2)4CF3、－(CF2)2CF(CF3)2、－CF2C(CF3)3、－CF(CF3)CF2CF2CF3、－(CF2)5CF3、－(CF2)3CF(CF3)2等が挙げられる。
　さらに、含フッ素モノマーは、非テロマーであることが好ましく、この点で、Rf基としては、炭素数１～２のフルオロアルキル基、又はヘテロ原子によって介在された二以上の炭素数１～３のフルオロアルキル基が好ましい。具体例としては、C3F7OCF(CF3)CF2OCF(CF3)-、(CF3)2NCnF2n-(n=1～6)等が挙げられる。
　上記した一般式（１）で表されるアクリル酸エステル及びアクリルアミドの具体例は、次の通りである。
　　CH2=C(－H)－C(=O)－O－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－H)－C(=O)－O－C6H4－Rf
　　CH2=C(－Cl)－C(=O)－O－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－H)－C(=O)－O－(CH2)2N(－CH3)SO2－Rf
　　CH2=C(－H)－C(=O)－O－(CH2)2N(－C2H5)SO2－Rf
　　CH2=C(－H)－C(=O)－O－CH2CH(－OH)CH2－Rf
　　CH2=C(－H)－C(=O)－O－CH2CH(－OCOCH3)CH2－Rf
　　CH2=C(－H)－C(=O)－O－(CH2)2－S－Rf
　　CH2=C(－H)－C(=O)－O－(CH2)2－S－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－H)－C(=O)－O－(CH2)3－SO2－Rf
　　CH2=C(－H)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－H)－C(=O)－NH－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CH3)－C(=O)－O－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CH3)－C(=O)－O－C6H4－Rf
　　CH2=C(－CH3)－C(=O)－O－(CH2)2N(－CH3)SO2－Rf
　　CH2=C(－CH3)－C(=O)－O－(CH2)2N(－C2H5)SO2－Rf
　　CH2=C(－CH3)－C(=O)－O－CH2CH(－OH)CH2－Rf
　　CH2=C(－CH3)－C(=O)－O－CH2CH(－OCOCH3)CH2－Rf
　　CH2=C(－CH3)－C(=O)－O－(CH2)2－S－Rf
　　CH2=C(－CH3)－C(=O)－O－(CH2)2－S－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CH3)－C(=O)－O－(CH2)3－SO2－Rf
　　CH2=C(－CH3)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CH3)－C(=O)－NH－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－F)－C(=O)－O－(CH2)2－S－Rf
　　CH2=C(－F)－C(=O)－O－(CH2)2－S－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－F)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－Rf
　　CH2=C(－F)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－F)－C(=O)－NH－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－Cl)－C(=O)－O－(CH2)2－S－Rf
　　CH2=C(－Cl)－C(=O)－O－(CH2)2－S－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－Cl)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－Rf
　　CH2=C(－Cl)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－Cl)－C(=O)－NH－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF3)－C(=O)－O－(CH2)2－S－Rf
　　CH2=C(－CF3)－C(=O)－O－(CH2)2－S－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF3)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－Rf
　　CH2=C(－CF3)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF3)－C(=O)－NH－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF2H)－C(=O)－O－(CH2)2－S－Rf
　　CH2=C(－CF2H)－C(=O)－O－(CH2)2－S－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF2H)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－Rf
　　CH2=C(－CF2H)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF2H)－C(=O)－NH－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CN)－C(=O)－O－(CH2)2－S－Rf
　　CH2=C(－CN)－C(=O)－O－(CH2)2－S－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CN)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－Rf
　　CH2=C(－CN)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CN)－C(=O)－NH－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF2CF3)－C(=O)－O－(CH2)2－S－Rf
　　CH2=C(－CF2CF3)－C(=O)－O－(CH2)2－S－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF2CF3)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－Rf
　　CH2=C(－CF2CF3)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF2CF3)－C(=O)－NH－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－F)－C(=O)－O－(CH2)3－S－Rf
　　CH2=C(－F)－C(=O)－O－(CH2)3－S－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－F)－C(=O)－O－(CH2)3－SO2－Rf
　　CH2=C(－F)－C(=O)－O－(CH2)3－SO2－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－F)－C(=O)－NH－(CH2)3－Rf
　　CH2=C(－Cl)－C(=O)－O－(CH2)3－S－Rf
　　CH2=C(－Cl)－C(=O)－O－(CH2)3－S－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－Cl)－C(=O)－O－(CH2)3－SO2－Rf
　　CH2=C(－Cl)－C(=O)－O－(CH2)3－SO2－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF3)－C(=O)－O－(CH2)3－S－Rf
　　CH2=C(－CF3)－C(=O)－O－(CH2)3－S－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF3)－C(=O)－O－(CH2)3－SO2－Rf
　　CH2=C(－CF3)－C(=O)－O－(CH2)3－SO2－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF2H)－C(=O)－O－(CH2)3－S－Rf
　　CH2=C(－CF2H)－C(=O)－O－(CH2)3－S－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF2H)－C(=O)－O－(CH2)3－SO2－Rf
　　CH2=C(－CF2H)－C(=O)－O－(CH2)3－SO2－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CN)－C(=O)－O－(CH2)3－S－Rf
　　CH2=C(－CN)－C(=O)－O－(CH2)3－S－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CN)－C(=O)－O－(CH2)3－SO2－Rf
　　CH2=C(－CN)－C(=O)－O－(CH2)3－SO2－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF2CF3)－C(=O)－O－(CH2)3－S－Rf
　　CH2=C(－CF2CF3)－C(=O)－O－(CH2)3－S－(CH2)2－Rf
　　CH2=C(－CF2CF3)－C(=O)－O－(CH2)3－SO2－Rf
　　CH2=C(－CF2CF3)－C(=O)－O－(CH2)2－SO2－(CH2)2－Rf
[上記式中、Rfは、炭素数１～６、好ましくは、１～３のフルオロアルキル基である。]
C3F7OCF(CF3)CF2O-CF(CF3)CH2-MAc
C3F7OCF(CF3)CF2O-CF(CF3)CH2-Ac
(CF3)2CH-Ac
C2F5CH2-MAc
C2F5CH2-Ac
［上記式中において、Acはアクリレート、MAcはメタクリレートを、それぞれ表す。］
　上記したフルオロアルキル基含有アクリル酸エステル及びフルオロアルキル基含有アクリルアミドは、一種単独又は二種以上混合して用いることができる。
　特に、本発明の温度応答性基材は、表面の層が、（ｉ）含フッ素モノマーに基づく構成単位を全モノマー構成単位中５ｍｏｌ％以上含有する、少なくとも一種のポリマー、及び（ｉｉ）含フッ素モノマーに基づく構成単位の全モノマー構成単位に占める割合が５ｍｏｌ％未満である、少なくとも一種の温度応答性ポリマーのブレンドポリマーを含有するものである場合、特に優れた剥離性を示すので好ましい。このとき、ポリマー（ｉ）を構成するモノマー構成単位の合計に対する含フッ素モノマーに基づく構成単位の割合が５ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％であることが好ましい。特に限定されないが、他の範囲としては、例えば１０ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％～３０ｍｏｌ％等が挙げられ、適宜設定できる。また、温度応答性ポリマー（ｉｉ）を構成するモノマー構成単位の合計に対する含フッ素モノマーに基づく構成単位の割合は特に限定されないが、少なければ少ないほど好ましく、０ｍｏｌ％であってもよい。特に限定されないが、例えば、０ｍｏｌ％～３ｍｏｌ％の範囲内であってもよいし、０ｍｏｌ％～２ｍｏｌ％、あるいは０ｍｏｌ％～１ｍｏｌ％範囲内であってもよい。
　さらに、剥離性の点で、ブレンドポリマーを構成するモノマー構成単位の合計に対する含フッ素モノマーに基づく構成単位の割合が０．５ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％、特に０．５ｍｏｌ％～５ｍｏｌ％であることが特に好ましい。または代替的に、ポリマー（ｉ）のガラス転移点（Ｔｇ）を指標とすることもできる。すなわち、ポリマー（ｉ）が、ガラス転移点（Ｔｇ）が２０～１３０℃であれば剥離性の点で好ましく、５０～１２０℃であればより好ましい。ガラス転移点は、ＪＩＳ Ｋ７１２１-１９８７「プラスチックの転移温度測定方法」で規定される補外ガラス転移終了温度(Ｔｅｇ)とする。
　１．２　温度応答性ポリマー層
　温度応答性ポリマーを含有する層（温度応答性ポリマー層）は、温度応答性ポリマーを必須成分として含有するが、必要に応じて、さらに温度応答性を示さないポリマー（「非温度応答性ポリマー」ということがある。）を含有していてもよい。
　そのような非温度応答性ポリマーとしては、特に限定されず、幅広く選択することができる。特に限定されないが、温度応答性ポリマーについて説明した前記非温度応答性モノマーに基づく構成単位を含有するポリマーであってもよい。この非温度応答性ポリマーは、ホモポリマーであってもよいし、コポリマーであってもよい。この非温度応答性ポリマーは、コポリマーである場合、グラフトコポリマー、ブロックコポリマー及びランダムコポリマーのいずれであってもよい。
　なお、非温度応答性ポリマーは、温度応答性を示さないポリマーであればよいので、その限りにおいて、温度応答性ポリマーについて説明した前記温度応答性モノマーに基づく構成単位を含有していてもよい。
　非温度応答性ポリマーは、含フッ素モノマーに基づく構成単位を含有するものであってもよい。含フッ素モノマーとしては、特に限定されないが、温度応答性ポリマーについて説明した前記含フッ素モノマーを用いることができる。この場合、非温度応答性ポリマーは、含フッ素モノマーに基づく構成単位のみからなるものであってもよい。
　温度応答性ポリマー層が温度応答性ポリマーのみからなる場合、温度応答性ポリマー層は、温度応答性ポリマーを、特に限定されないが、通常、基材表面に、１～１０μｇ／ｃｍ２吸着させる。吸着量が１μｇ／ｃｍ２以上であれば、温度応答して親水性に変化した場合に温度応答性ポリマー上の物体（例えば細胞）を剥離し易い。１０μｇ／ｃｍ２以下であれば、温度応答前の疎水性の状態で物体（例えば細胞）が付着し易い。
　本発明の温度応答性基材を細胞培養器材として用いる場合には、温度応答性ポリマー層の表面にさらに細胞接着性タンパク質を被覆すれば、基材表面の温度応答性ポリマーがたとえ１０μｇ／ｃｍ２以上であってもよく、その際の温度応答性ポリマーの量は５０μｇ／ｃｍ２以下が好ましい。細胞接着性タンパク質を被覆した場合、温度応答性ポリマーの量が５０μｇ／ｃｍ２以下であれば細胞が付着し易くなり好ましい。被覆方法は常法にしたがえばよく、通常、細胞接着性タンパク質の水溶液を基材表面に塗布し、その後その水溶液を除去しリンスする方法がとられている。
　そのような細胞接着性タンパク質の種類は何ら限定されるものではないが、例えば、コラーゲン、ラミニン、ラミニン５及びフィブロネクチン等が挙げられる。これらを一種又は二種以上用いてもよい。また、細胞外マトリックスタンパク質を含有する調製品［例えばマトリゲル（登録商標）等］も使用できる。
　温度応答性ポリマー層が非温度応答性ポリマーをさらに含有するものである場合は、温度応答性ポリマー層が温度応答性ポリマーのみからなる場合の上記含有量を参考にして、ポリマー全体に占める温度応答性ポリマーの割合に応じて温度応答性ポリマーの含有量を適宜調整すればよい。
　なお、温度応答性ポリマー層中における温度応答性ポリマーの量の測定は、ＦＴ－ＩＲ－ＡＴＲを用いて行うこととする。細胞接着性タンパク質の被覆量の測定も同様とする。
　１．３　温度応答性ポリマーの製造方法
　特に限定されないが、温度応答性ポリマーは、少なくとも一種の前記温度応答性モノマー、及び必要に応じて少なくとも一種の前記非温度応答性モノマーからなるモノマー成分を重合させることによって、得ることができる。
　より具体的には、
　（１）上記モノマー成分を溶媒に溶解させる工程、及び
　（２）前記工程（１）により得られた溶媒中のモノマー成分を重合させる工程　を含む方法により、温度応答性ポリマーを得ることができる。
　工程（１）において、上記モノマー成分を溶解させる溶媒は、特に限定されないが、例えば、常温下において沸点１２０℃以下、特に６０～１１０℃のものが好ましい。具体例として、メタノール、エタノール、ｎ（又はｉ）－プロパノール、２（又はｎ）－ブタノール及び水等が挙げられる。上記モノマー成分を溶解させる溶媒として、一種の溶媒のみを用いてもよいし、二種以上の溶媒を混合して用いてもよい。二種以上を混合する場合には、例えば、１－ペンタノール、２－エチル－１－ブタノール、２－ブトキシエタノール及びエチレン（若しくはジエチレン）グリコール又はそのモノエチルエーテル等からなる群より選択される少なくとも一種の溶媒をさらに混合してもよい。溶媒には、さらに必要に応じて添加剤を添加して用いてもよい。特に限定されないが、添加剤としては、硫酸等の酸類、及びモール塩等が挙げられる。
　また、モノマーに対して、（ｉ）温度応答性ポリマー、又は（ｉｉ）温度応答性モノマーと含フッ素モノマーから成る共重合体を、例えば、０．１～９０重量％、好ましくは、０．１～５０重量％、より好ましくは、０．１～１０重量％の範囲で溶解させておいてもよい。
　重合工程（２）において、溶媒中に溶解させたモノマー成分で基材の表面を被覆してから重合を行って表面上で温度応答性ポリマーを形成してもよいし、予め重合を行って温度応答性ポリマーを形成しておいてから、得られた温度応答性ポリマーで基材の表面を被覆してもよい。
　重合の方法としては、特に限定されないが、例えば、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理及び有機重合反応等でラジカル重合する方法が挙げられる。
　予め形成しておいた温度応答性ポリマーで基材の表面を被覆する方法は、特に限定されず、塗布及び混練等の単なる物理的吸着により行ってもよいし、さらに電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理及びコロナ処理等を行うことにより、化学結合を介して温度応答性ポリマーを基材の表面に固定してもよい。
　溶媒中に溶解させたモノマー成分で基材の表面を被覆してから重合を行って表面上で温度応答性ポリマーを形成する方法として、表面グラフト重合によって温度応答性ポリマー層を基材の表面に形成することもできる。この場合、前照射法及び同時照射法のいずれも採用できる。
　特に、前照射法による放射線表面グラフト重合によって、温度応答性ポリマー層を基材の表面に形成することが好ましい。この方法によれば、基材の表面に重合開始点を形成した後、そこに温度応答性ポリマーを成長させることができる。温度応答性ポリマーを基材の表面に化学結合により固定することができる点で、好ましい。
　先述したように、本発明の温度応答性基材は表面の層が、（ｉ）含フッ素モノマーに基づく構成単位を全モノマー構成単位中５ｍｏｌ％以上含有する、少なくとも一種のポリマー、及び（ｉｉ）含フッ素モノマーに基づく構成単位の全モノマー構成単位に占める割合が５ｍｏｌ％未満である、少なくとも一種の温度応答性ポリマーのブレンドポリマーを含有するものであるときに、特に優れた剥離性を示すので好ましい。このような温度応答性基材は、特に限定されないが、例えば、フッ素を含有しない温度応答性モノマー（及び必要に応じて少量の含フッ素モノマー）並びに温度応答性ポリマー（ｉ）を表面に共存させた状態で、重合反応を生じさせることによって得ることができる。これにより、フッ素を含有しない温度応答性モノマー（及び必要に応じて少量の含フッ素モノマー）が重合することによって温度応答性ポリマー（ｉｉ）が表面上で得られ、ポリマー（ｉ）と温度応答性ポリマー（ｉｉ）のブレンドポリマーが表面に生成する。さらに、このブレンドポリマーを、化学結合を介して表面に結合した状態とすることが好ましい。
　本発明の温度応答性基材は、表面の層が、上記ポリマー（ｉ）及びポリマー（ｉｉ）のブレンドポリマーを含有するものである場合、特に、上記ポリマー（ｉ）及びポリマー（ｉｉ）をフラスコ等における溶液重合等の方法でそれぞれ得てから、両者をブレンドした状態で表面に塗布又は混練し、必要に応じてこのブレンドポリマーを表面に固定化する処理を行うことにより得られたものであれば、温度応答性がより良好となるため好ましい。
　上記において、塗布又は混練の方法は、特に限定されないが、スピンコート法、ディップ法、スプレー法、刷毛塗り法等を利用できる。塗布又は混練は、必要に応じて適当な溶媒に各ポリマーを溶解した上で行うことができる。
　上記において、溶媒としては、特に限定されず、ポリマーの物性に応じて適宜選択できるが、例えば、イソプロピルアルコール、エタノールなど「１．３　温度応答性ポリマーの製造方法」の例示と同じ溶媒を使用できる。この際の溶媒中に溶解させるポリマーの量は、特に限定されないが、総量で０．１～２０重量％とすることができ、好ましくは１～１０重量％である。
　ブレンドポリマーを表面に固定化する処理としては、特に限定されないが、加熱、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理及びコロナ処理等を利用できる。
これらの処理により、化学結合を介して各ポリマーが表面に固定される。
　１．４　態様２
　態様２は、上記温度応答性基材において、温度応答性を示すポリマーのＬＣＳＴが０～１５℃であるものである。これにより、表面に付着した物体（例えば細胞）の剥離が、従来よりも低い温度領域でのみ起こるように制御でき、有利である。
　特に限定されないが、ＬＣＳＴが０～１５℃を示す温度応答性ポリマーの例としては、ポリマーの重量に対してフッ素含有量が２～２０重量％、好ましくは２～１０重量％のものが挙げられる。
る。
　ＬＣＳＴが０～１５℃を示す、フッ素を含有する温度応答性ポリマーとしては、上記「１．１　温度応答性ポリマー」で説明した構造を有するものを使用することができる。
　特に限定されないが、ＬＣＳＴが０～１５℃を示す温度応答性ポリマーの例としては、フッ素を含有しない温度応答性モノマーと、フッ素を含有する非温度応答性モノマーとの共重合体が挙げられる。この場合、ポリマーの重量に対するフッ素の割合は、フッ素を含有する非温度応答性モノマーに占めるフッ素含有割合、及び／又はモノマー全体に占める、フッ素を含有する非温度応答性モノマーの含有割合を調整することにより適宜調整できる。
　一例として、フッ素を含有しない温度応答性モノマーとしてＮＩＰＡＭを用い、フッ素を含有する非温度応答性モノマーとして（パーフルオロエチル）メチルメタクリレートを共重合して温度応答性ポリマーを得る場合には、（パーフルオロエチル）メチルメタクリレートのモノマー全体に占める割合を２～２０ｍｏｌ％とすることにより、限臨界溶解温度が０～１５℃の温度応答性ポリマーを得ることができる。
　フッ素を含有しない温度応答性モノマーと、フッ素を含有する非温度応答性モノマーとの共重合体としては、フッ素を含有する非温度応答性モノマーとして少なくとも一部フルオロアクリレートを用いたものが好ましい。特に限定されないが、フルオロアクリレートとして、上記「１．１　温度応答性ポリマー」で説明した構造を有するものを使用することができる。
　１．５　基材
　本発明の温度応答性基材は、先述のとおり、基材の表面に温度応答性ポリマーを含有する層が設けられたものである。本発明において用いる基材は、通常用いられるものであればよく、例えば、基板、粉体、繊維及び膜等が挙げられ、特に限定されない。
　基材は、少なくともその表面が、放射線照射により重合開始点を形成し得る材料を含むものであれば、前述の表面グラフト重合によって、温度応答性ポリマー層を基材の表面に形成することができる点で好ましい。この場合、基材は、重合開始点を形成し得る材料を表面にのみ含んでいてもよいし、全体がそのような材料を含むものであってもよい。
　重合開始点を形成し得る材料としては、特に限定されないが、ガラス類、プラスチック類、セラミックス及び金属等が挙げられる。具体的には、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリウレタン、ウレタンアクリレート及びポリメチルメタクリレート等のアクリル系樹脂、並びにポリアミド(ナイロン)、ポリカーボネート、共役結合を持つ天然ゴム、共役結合を持つ合成ゴム及びシリコーンゴム等が挙げられる。材料はこれらを２種以上含むブレンドポリマー又はポリマーアロイであってもよい。
　基材は、本発明の効果を妨げない限り必要に応じて、表面処理がされていてもよいし、表面にさらに他の層を有していてもよい。
　基材の形状は、特に限定されないが、通常、細胞培養器材として用いられるディッシュ、ウェルプレート、チューブ、ボトル、フラスコ形状や、細胞培養・薬液バッグとして用いられるフィルム形状等とすることができる。
　２．　温度応答性基材の評価方法
　本発明の温度応答性基材の評価方法は、
溶液重合により調製された前記ポリマーを試料として用い、
（ａ）前記試料の、温度応答前後における対水接触角の差△θ、及び
（ｂ）前記試料の、示差走査熱量分析における中間水のピークの有無
に基づいて評価を行う、方法である。
　物質（例えば接着細胞）をある温度領域において良好に接着させることができ、ある別の温度領域において接着した物質（例えば細胞）を剥離することができるというのは、温度応答性基材に求められる基本的特性である。なお、細胞培養器材として用いる場合であれば、細胞培養時に疎水性、剥離時に親水性をそれぞれ示すことが求められる。この評価方法により、この温度応答性基材に求められる基本的特性を評価することができる。
　放射線表面グラフト重合により得られうる前記温度応答性基材においては、グラフトした温度応答性ポリマーの吸着量が非常に少なく、膜厚が非常に薄くなるため、吸着させた温度応答性ポリマー層表面の接触角の温度応答性が基材の影響を大きく受け、このため明瞭には観察されないという問題があることを本発明者らは見出した。本発明者らは、この評価方法を用いることにより、そのような問題を有する温度応答性細胞培養器材であっても、物質（例えば接着細胞）の剥離性をスクリーニングできることを見出した。なお、この評価はあくまでスクリーニングであり、これを満たす器材がすべて良好な剥離性を示すとは限らない。
　２．１　溶液重合により調製された、試料用の温度応答性ポリマー
　本発明の温度応答性基材の評価方法は、溶液重合により調製された前記ポリマーを試料として用いる。
　溶液重合の方法については特に限定はないが、「１．２　温度応答性ポリマーの製造方法」と同様の溶媒中で行うことが好ましい。
　モノマー成分を溶媒中で重合させる方法としては、例えば、モノマー成分を溶媒に溶解させ、脱酸素後、得られた溶液を攪拌しながらラジカル重合開始剤を添加することによって、重合反応を進行させる方法等を挙げることができる。
　重合開始剤としては、公知のラジカル重合反応用の重合開始剤であれば特に限定なく使用できる。例えば、アゾイソブチロニトリル、アゾイソ酪酸メチル、アゾビスジメチルバレロニトリル等のアゾ系開始剤；過酸化ベンゾイル、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、ベンゾフェノン誘導体、ホスフィンオキサイド誘導体、ベンゾケトン誘導体、フェニルチオエーテル誘導体、アジド誘導体、ジアゾ誘導体、ジスルフィド誘導体などを用いることができる。これらの重合開始剤は、一種単独又は二種以上混合して用いることができる。
　重合開始剤の使用量は、特に限定されないが、通常、モノマー成分１００重量部に対して、０．０１～１０重量部程度とすることが好ましく、０．１～１重量部程度とすることがより好ましい。
　溶媒中におけるモノマー成分の濃度については特に限定的ではないが、通常、１０～５０重量％程度とすることが好ましく、２０～４０重量％程度とすることがより好ましい。
　重合温度、重合時間などの重合条件は、モノマー成分の種類、その使用量、重合開始剤の種類、その使用量などに応じて適宜調整すればよいが、通常、５０～１００℃程度の温度でモノマー転化率６０～１００％程度の重合反応を行えばよい。なお、モノマー転化率はガスクロマトグラフィー法により測定される重合前後のモノマーピーク面積から算出することができる。
　２．２　対水接触角差△θ
　このようにして得られた試料の、温度応答前後における対水接触角の差△θを測定する。
　特に限定されないが、好ましくは、前述のようにして得られた試料をスピンコートした膜を得て、この膜についての対水接触角を測定することにより算出する。
　スピンコートの条件は特に限定されないが、得られたポリマーを所定濃度となるように溶媒で希釈し、特定の基材上にスピンコートし、必要に応じて熱処理を行う。
　上記において、スピンコート時のポリマー濃度は、特に限定されないが、例えば１重量％とすることができる。
　溶媒としては、特に限定されないが、例えばイソプロピルアルコール等が挙げられる。
　基材としては、特に限定されないが、シリコンウエハ等が挙げられる。特に限定されないが、シリコンウエハとして、例えば、自然酸化膜付きシリコンウエハ［表面粗さＲａ（算術平均粗さ）０．５ｎｍ以下］を使用することができる。
　スピンコート条件としては、特に限定されないが、例えば２０００ｒｐｍの条件等が挙げられる。
　熱処理の条件としては、特に限定されないが、例えば１１０℃、３分間という条件等が挙げられる。また、熱処理しない場合は、スピンコート膜中に残留する溶剤を留去するために、真空ポンプで連続的に減圧しながら真空デシケータ中で１時間以上保存する。
　△θが、３０°以上を示すとき、温度応答性ポリマーは、先述の基本的特性の点で良好であるといえる。△θが４０°以上を示すとき、基本的特性の点でより良好であるといえ、△θが５０°以上を示すとき、基本的特性の点でさらにより良好であるといえる。
　温度応答性ポリマーは、本発明の温度応答性基材が細胞培養器材として用いられる場合、（１）通常の細胞培養温度である３７℃近辺で疎水性を示し、（２）温度変化により親水性を示すようになるが、好ましくは２０℃以内の範囲内で変化したときに、親水性を示す。したがって、このような温度応答性ポリマーを評価する際には、上述のようにして得られた試料について、（１）培養温度領域として３０～５０℃と、（２）温度変化領域として温度領域（１）を基準として±２０℃以内、すなわち１０～３０℃（低温側）又は５０～７０℃（高温側）をそれぞれ設定して、温度領域（１）［３０～５０℃］と温度領域（２）［１０～３０℃（低温側）又は５０～７０℃（高温側）］の間における対水接触角の差△θを測定する。上記において、温度応答性ポリマーが培養温度未満のＬＣＳＴを示すものである場合には、低温側で親水性となるため、温度領域（２）では低温側の対水接触角を測定する。同様に、温度応答性ポリマーが培養温度を超えるＵＣＳＴを示すものである場合には、高温側で親水性となるため、温度領域（２）では高温側の対水接触角を測定する。
　好ましくは、温度応答性ポリマーのＬＣＳＴが２０℃未満の場合、５℃及び４０℃における対水接触角の差△θを測定する。また、温度応答性ポリマーのＬＣＳＴが２０℃以上３７℃以下の場合、２０℃及び４０℃における対水接触角の差△θを測定する。
　対水接触角の測定方法は、特に限定されないが、具体例として以下が挙げられる。
　試料をスピンコートした膜の表面に水滴容量２μＬを滴下し、５℃と２０℃では６０秒後、４０℃では５秒後の静的接触角を、全自動接触角計ＤｒｏｐＭａｓｔｅｒ　７０１（協和界面科学製）又はその同等品を用いて測定する。
　２．３　中間水のピーク
　上記２．１のようにして得られた試料の、示差走査熱量分析における中間水のピークの有無を調べる。
　中間水とは、合成高分子表面に弱く相互作用する水分子であり、この存在が例えば細胞及びタンパク質の付着性防止に寄与するとされる。
　中間水は、示差走査熱量分析法（ＤＳＣ）を用いて水和ポリマーを-75℃から昇温する際の低温結晶形成に由来する発熱ピーク（－５０～０℃）として観測される。
　本発明者らは、温度応答性ポリマーに中間水が存在すれば、それを用いた温度応答性細胞培養器材における表面に付着した物体（例えば接着細胞）の剥離性が良好となることを見出した。
　中間水の測定は、上記２．１のようにして得られた試料を用いて行う。特に限定されないが、具体例としては、以下のような方法が挙げられる。
　上記２．１のようにして得られた試料０．１ｇを水５０ｇに室温（２０～２５℃）で一昼夜浸漬し、過剰の水分を濾紙で取り除いた後、５ｍｇのポリマーをアルミパンに充填し、ＤＳＣ８２２ｅ（Ｍｅｔｔｌｅｒ　Ｔｏｌｅｄｏ社製）又はその同等品により、測定する。－７５℃から５０℃まで昇温したときに－５０～０℃の範囲で検出される低温結晶形成ピークが中間水である。冷却～昇温の条件は、特に限定されないが、例えば以下のとおりとすることができる。
２５℃　→　－７５℃　（液体窒素で冷却）
－７５℃　（３０分　保持）
－７５℃　→　５０℃　（２．５℃／分　昇温）
　３．　温度応答性基材の用途
　本発明の温度応答性基材は、表面に物体を付着させ、剥離する用途のために幅広く用いることができる。基材の種類は特に限定されないが、基板、粉体、繊維及び膜等である。
用途は特に限定されないが、例えば、細胞培養器材、カラムクロマトグラフィーの充填剤、薬物送達システム（ドラッグデリバリーシステム）、ハイドロゲル、イオン交換樹脂、膜分離システム、砂漠の緑化材料及び撥水撥油剤等として使用することができる。
　本発明の温度応答性細胞培養器材を用いて、種々の細胞、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関係する肝実質細胞、非肝実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々組織に存在する幹細胞、さらには骨髄細胞、ＥＳ細胞等から細胞シートを作製することができる。こうして作製された細胞シートは表面の接着因子が損なわれていないことに加えて、細胞培養面に接した部分が均一な品質を有することから、再生医療などへの利用に適したものである。また、細胞シートを利用することでバイオセンサー等の検出デバイスへの応用へも展開できる。
　４．　培養器材から細胞を剥離する方法
　本発明には、培養器材から細胞を剥離する方法であって、
本発明の温度応答性基材の表面で培養された細胞を、温度応答性を示すポリマーのＬＣＳＴ未満の環境下で該表面から剥離する工程
を含む方法が含まれる。
　細胞は、足場依存性の細胞（接着性の細胞）であればよく、特に限定されない。由来も特に限定されず、医療用（再生医療含む）から実験用に至るまで幅広い用途において使用される細胞を使用できる。幹細胞、初代培養細胞及び株化細胞のいずれであってもよい。
　細胞の例として、特に限定されないが、繊維芽細胞、表皮細胞、上皮細胞（角膜上皮細胞、膀胱上皮細胞等を含む）、筋芽細胞、平滑筋細胞、肝細胞、内皮細胞、神経細胞、口腔粘膜細胞、羊膜細胞、脂肪細胞（脂肪前駆細胞を含む）、樹状細胞（単核球由来を含む）、破骨細胞、腫瘍細胞、各種幹細胞（骨髄幹細胞、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞を含む）等が挙げられる。
　細胞の培養条件は、細胞の種類に応じて公知の方法にしたがって適宜設定することができる。
　本発明の温度応答性基材の表面は、温度応答性を示すポリマーのＬＣＳＴの上下で、細胞培養時の疎水性から剥離時の親水性へと変化する。これにより、該表面から細胞を容易に剥離することができる。細胞の種類や培養条件等にもよるが、単に温度変化のみにより自然と剥離することができる場合もあり、また、振とう、基板の拡張収縮等の力学的刺激及び／又はトリプシン等の化学的作用により剥離を適宜促すこともできる。
　温度応答性を示すポリマーのＬＣＳＴ未満の環境下に細胞を置く時間は、特に限定されず、適宜設定することができる。
　５．　細胞シートの製造方法
　本発明には、細胞シートの製造方法であって、
本発明の温度応答性基材の表面で培養されたシート状の細胞を、温度応答性を示すポリマーのＬＣＳＴ未満の環境下で該表面から剥離する工程
を含む方法が含まれる。
　細胞については、上記「４．　培養器材から細胞を剥離する方法」で説明したものを使用できるが、シート状となることが必要であるので、培養条件に応じてそのような細胞を適宜選択すればよい。
　細胞シートを作成するために特に好ましい細胞の具体例としては、特に限定されないが、例えば、繊維芽細胞、表皮細胞、上皮細胞（角膜上皮細胞、膀胱上皮細胞等を含む）、筋芽細胞、平滑筋細胞、口腔粘膜細胞、羊膜細胞、脂肪細胞（脂肪前駆細胞を含む）、樹状細胞（単核球由来を含む）、破骨細胞、腫瘍細胞、各種幹細胞（間葉系幹細胞、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞を含む）等が挙げられる。
　細胞シートは、単層のシートであってもよいし、積層シートであってもよい。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
　１．　実施例１～３２、比較例１～４
　１．１　材料
　細胞培養器材（細胞培養ディッシュ）は、米国コーニングインターナショナル社（旧ベクトン・ディキンソン・ラブウェア社）製ファルコン(Ｆａｌｃｏｎ)（登録商標）３００１ペトリディッシュ（直径３．５ｃｍ）を用いた。
　１．２　前照射法
　ディッシュに１００ｋＧｙの線量の電子線を照射した。次に、表１に記載のモノマーをイソプロピルアルコール（以下、ＩＰＡと省略）（比較例３及び４のみ、ＨＣＦＣ２２５を使用）を用いて４０重量％または６０重量％に希釈した溶液０．１２ｍＬをディッシュに注入し、室温で一晩放置して、表面グラフト重合させた。
　１．３　同時照射法
　ディッシュに表１に記載のモノマーをＩＰＡ（比較例３及び４のみ、ＨＣＦＣ２２５を使用）を用いて４０重量％または６０重量％に希釈した溶液を０．１２ｍＬ注入した。次に１００ｋＧｙの線量の電子線を照射した後、室温で一晩放置して、表面グラフト重合させた。
　１．４　表面グラフト重合後の洗浄
　表面グラフト重合後のディッシュを市販の洗浄液を用いて洗浄し、室温にて乾燥させた。
　１．５　溶液重合によるポリマーの調製
　重合溶剤は、ＮＩＰＡＭ系の場合はＩＰＡを、フッ素系モノマー単体の場合はＨＣＦＣ２２５を用いた。モノマー濃度は２０重量％とし、重合開始剤として１ｍｏｌ％（対モノマー）のアゾビスイソブチルニトリルを使用し、ＮＩＰＡＭ系の場合は７０℃、フッ素系モノマー単体の場合は５０℃で重合した。
　１．６　Ｘ線光電子分光分析法 (X-ray Photoelectron Spectroscopy：ＸＰＳ)による表面分析
　ＥＳＣＡ３４００（島津製作所製）を用いて、放出角９０°の条件にてＮ１ｓ／Ｃ１ｓ、Ｆ１ｓ／Ｃ１ｓを測定することにより、基材表面にポリマーがグラフトしていることを確認した。
　１．７　ディッシュの温度依存性接触角の測定
　全自動接触角計ＤｒｏｐＭａｓｔｅｒ７０１（協和界面科学製）を用い、基材表面に水滴容量２μＬを滴下して１秒後の静的接触角を、５℃、２０℃と４０℃で測定した。５℃における測定は５℃に温度調整した冷蔵室で、２０℃における測定は、室温（２０℃）で、４０℃における測定は、試験片を４０℃加温したホットプレート上に置き、試験片全体を覆う大きさのケースでフタをし、３０分以上放置した後、温調ステージ（４０℃）に移動させて測定した。
　１．８　溶液重合で調製したポリマーの温度依存性接触角の測定
　溶液重合で調製したポリマーを濃度が１重量％となるようにＩＰＡ（比較例３及び４のみ、ＨＣＦＣ２２５を使用）で希釈し、自然酸化膜付きシリコンウエハ［表面粗さＲａ（算術平均粗さ）０．５ｎｍ以下］上に２０００ｒｐｍの条件でスピンコートした後、真空デシケータで２時間乾燥したものをサンプルとした。温度依存性接触角の測定は、基材表面に水滴滴下後、５℃と２０℃は６０秒後、４０℃は５秒後の静的接触角を測定する以外は前述のディッシュと同様の方法で行った。
　１．９　溶液重合で調製したポリマーのガラス転移点の測定
　１０ｍｇのポリマー粉末をＤＳＣ８２２ｅ［米国Ｍｅｔｔｌｅｒ　Ｔｏｌｅｄｏ社製］により、温度範囲－５０～１５０℃、昇温速度１０℃／ｍｉｎの条件で測定したときの２ｎｄサイクル目のサーモグラムより、補外ガラス転移終了温度(JIS K7121-1987)を読み取った。
　１．１０　溶液重合で調製したポリマーの分子量の測定
　溶離液に１０ｍＭのＬｉＢｒを添加したＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを使用し、ポリマー濃度を０．２重量％として、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）により標準ポリエチレングリコール換算で求めた。
　１．１１　中間水の測定
溶液重合で調製したポリマー０．１ｇを水５０ｇに室温（２０～２５℃）で一昼夜浸漬し、過剰の水分を濾紙で取り除いた後、５ｍｇのポリマーをアルミパンに充填し、ＤＳＣ８２２ｅにより、
室温　→　－７５℃ （液体窒素で冷却）
－７５℃ （３０分　保持）
－７５℃ 　→　５０℃ （２．５℃／分　昇温）
の温度条件で測定した。－７５℃から５０℃まで昇温したときに－５０～０℃の範囲で検出される低温結晶形成ピークが中間水である。
　各種モノマー溶液の表面グラフト重合により調製したポリマーについての評価結果を表１に示す。
　なお、表中の略号はそれぞれ以下の化合物名を指している。
　Cn-SF(M)A：（パーフルオロアルキル）メチルメタクリレート又は（パーフルオロアルキル）エチル（メタ）クリレート（ｎはパーフルオロアルキル基の炭素数を表す）
　C2-SFMA：（パーフルオロエチル）メチルメタクリレート
　C4-SFMA：（パーフルオロブチル）メチルメタクリレート
　C6-SFMA：（パーフルオロヘキシル）エチルメタクリレート
　C2-SFA：（パーフルオロエチル）メチルアクリレート
　C6-SFA：（パーフルオロヘキシル）エチルアクリレート
　また、
　(CF3)2CH-Ac
　C3F7OCF(CF3)CF2O-CF(CF3)CH2-Ac
　C3F7OCF(CF3)CF2O-CF(CF3)CH2-MAc
　のAcはCH=C(H)COO-を、MAcはCH=C(CH3)COO-を表す。
　なお、実施例１～８と、実施例９～１８は表１に示すように、それぞれ同一のモノマーを使用しているが、実施例１～８では表面グラフト重合を同時照射法で行った実験結果を、実施例９～１６では表面グラフト重合を前照射法で行った実験結果をそれぞれ示している。なお、溶液重合の結果に関しては実施例１～８の欄にのみ示してある。
　前照射法で調製した表面をＸＰＳで測定したときのＮ１ｓ／Ｃ１ｓ及びＦ１ｓ／Ｃ１ｓは、同じモノマーを同じ量用いて同時照射法で調製した表面の測定値よりも高いため、より多くのポリマーが吸着したと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　溶液重合で調製したＮＩＰＡＭ／Ｃｎ－ＳＦ（Ｍ）Ａ共重合体、および、ＮＩＰＡＭ／ｎ－ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）共重合体のモル比と重量比の関係、含フッ素濃度と各種物性を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＮＩＰＡＭに表２のＮＩＰＡＭ／Ｃｎ－ＳＦＭＡ共重合体（n=2, 6）をブレンドしたときの温度応答性に及ぼす効果を表３～６及び図１～４に示す。表３～６の表面グラフト重合の条件は、モノマー濃度４０重量％の同時照射法（実施例１．３参照）とし、表面グラフト重合後の洗浄は、実施例１．４と同様の方法で行った。
　溶液重合の条件は、上記１．５と同様とし、温度依存性接触角の測定は、上記１．８と同様とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
表３に示すように、ＮＩＰＡＭに、所定量のＮＩＰＡＭ/Ｃ２－ＳＦＭＡ（＝９０／１０ｍｏｌ）共重合体をブレンドすることにより、ＮＩＰＡＭの温度応答性が増強された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
表４に示すように、ＮＩＰＡＭ/Ｃ２－ＳＦＭＡ（＝７０／３０ｍｏｌ）共重合体をＮＩＰＡＭに所定量ブレンドすることにより、ＮＩＰＡＭの温度応答性が増強された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すように、ＮＩＰＡＭに、所定量のＮＩＰＡＭ／Ｃ６－ＳＦＭＡ（＝９０／１０ｍｏｌ）重合体をブレンドすることにより、ＮＩＰＡＭの温度応答性が増強された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、ＮＩＰＡＭ／Ｃ６－ＳＦＭＡ（＝７０／３０ｍｏｌ）共重合体をＮＩＰＡＭに所定量ブレンドすることにより、ＮＩＰＡＭの温度応答性が増強された。
　なお、図１～４に示したのはあくまで特定条件下（例えば、特定の温度から特定の温度への変化である点等）における温度応答性増強効果である。図１～４には、この特定条件下において、所定量のＮＩＰＡＭ／含フッ素モノマー共重合体をＮＩＰＡＭにブレンドすることにより温度応答性が極大化することが示されている。別の条件下では温度応答性が極大化するＮＩＰＡＭ／Ｃ２－ＳＦＭＡ（＝９０／１０ｍｏｌ）共重合体のブレンド量は異なってくるものの、全体的な傾向としては、ＮＩＰＡＭ／含フッ素モノマー共重合体をブレンドすることにより温度応答性が増強する傾向が見られることが観察されている。したがって、所望の条件において増強効果が得られるよう、ブレンド量を適宜設定することができる。
　２．　試験例１（線維芽細胞シートの作成）
　初代線維芽細胞を、公知の手順（Z.Yablonka-Reuveni, M.Nameroff. Skeletal muscle cell populations.Separation and partial characterization of fibroblast-like cellsfrom embryonic tissue using density centrifugation. Histochemistry. 1987;87:27-38）に従って調製する。要約すると、これは、８週齢のＬｅｗｉｓラットの脚の筋肉由来の細胞懸濁物を、Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＳｗｅｄｅｎ）密度遠心分離により、線維芽細胞と筋細胞とに分離するという手順である。
　単離した線維芽細胞を、本発明の温度応答性細胞培養器材上で培養する。培養には、６％ＦＢＳ、４０％Ｍｅｄｉｕｍ１９９（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ＢＲＬ）、０．２％ペニシリン－ストレプトマイシン溶液、２．７ｍｍｏｌ／Ｌグルコース及び５４％平衡塩類溶液（１１６ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、１．０ｍｍｏｌ／ＬＮａＨ２ＰＯ４、０．８ｍｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ４、１．１８ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ、０．８７ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２及び２６．２ｍｍｏｌ／ＫＮａＨＣＯ３を含む）を含む培養培地を使用する。２日間培養した後、温度を変化させることによって、細胞シートとして剥離する。
　３．　実施例３３
　（１）細胞培養器材の調製
　ＮＩＰＡＭ／Ｃ２－ＳＦＡ（＝９５／５ｍｏｌ）共重合体の１×１０－４重量％ＩＰＡ溶液を用意し、市販の細胞培養器材［Ｆａｌｃｏｎ３００１ペトリディッシュ（３．５ｃｍ径）］の培養面に所定量塗布することで、ＮＩＰＡＭ成分量として２．０μｇ／ｃｍ２となるように当該ポリマーを溶媒キャスト法により製膜した。
　製膜後に電子線（２００ｋＧｙ）を照射し、ポリマーを器材表面に固定した。
　次に、この培養面で以下の手順に従い、細胞培養を行った。
　使用細胞：マウス線維芽細胞
　使用培地：ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ
　細胞播種密度：１×１０５ｃｅｌｌｓ／ディッシュ（３．５ｃｍ径）
　（２）培養初期における細胞剥離試験
　培養を１日行い、細胞の付着性を顕微鏡により観察した（図５）。このとき、細胞の培養面への接着が確認された。
　その後に、２０℃環境下に細胞が培養された培養器材を静置し、１５分経過時の様子を観察した（図６）。このとき、細胞の培養面への接着が維持されていることが確認された。
　さらに、５℃環境下に細胞が培養された培養器材を静置し、１５分経過時の様子を観察した（図７）。このとき、細胞が培養面から剥離されていることが確認された。
　（３）長期培養後の細胞剥離試験
　培養を４日行い、細胞の付着性を顕微鏡により観察した（図８）。このとき、細胞がコンフルエントの状態で培養面へ接着していることが確認された。
　その後に、２０℃環境下に細胞が培養された培養器材を静置し、１５分経過時の様子を観察した。このとき、細胞の培養面への接着が維持されていることが確認された。
　その後に、５℃環境下に細胞が培養された培養器材を静置し、１５分経過時の様子を観察した（図９）。このとき、シート状の細胞が培養面から剥離されていることが確認された。
　４．実施例３４～３６、比較例５～７
　実施例３３のＮＩＰＡＭ／Ｃ２－ＳＦＡ（＝９５／５ｍｏｌ）共重合体を、ＮＩＰＡＭ／Ｃ２－ＳＦＡ（＝９０／１０ｍｏｌ）、ＮＩＰＡＭ／Ｃ６－ＳＦＡ（＝９８／２ｍｏｌ）、ＮＩＰＡＭ／Ｃ６－ＳＦＡ（＝９６／４ｍｏｌ）に変更したものを、それぞれ実施例３４～３６とし、ＮＩＰＡＭ／ＢＭＡ（＝９５／５ｍｏｌ）、ＮＩＰＡＭ／ＢＭＡ（＝９０／１０ｍｏｌ）、ＮＩＰＡＭホモポリマーに変更したものを、それぞれ比較例５～７とした。いずれも処理ポリマーを変更した以外は、同じ方法で試験した。結果を表７に示す。
　実施例３３～３６のＬＣＳＴ１５℃以下のＮＩＰＡＭ／フッ素モノマー共重合体で表面処理したディッシュを使用することにより、２０℃では細胞シートが剥がれず、５℃で剥がれることが確認された。一方、比較例５～７は、室温の２０℃に冷却した時点で細胞シートが剥がれた。細胞培養には種々の操作が必要であるが、その多くが室温下で行わる。室温での操作中に、温度応答性器材上で培養した細胞が剥離しないことは工業的に大きなメリットがある。
　５．実施例３７
　以下のようにして、ＮＩＰＡＭ及びＣ２－ＳＦＡのＡＢ型ジブロック共重合体［Ｐ（ＮＩＰＡＭ－ｂｌｏｃｋ－Ｃ２－ＳＦＡ）］を調製した。
　（１）ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）［Ｐ（ＮＩＰＡＭ）］の調製
　重合管を窒素雰囲気下にし、撹拌子、塩化銅（I）（以下、ＣｕＣｌと表記する。） ２９．７ ｍｇ（０．３００ ｍｍｏｌ）、２，２’－ビピリジル（以下、ｂｐｙと表記する。） ９３．７ ｍｇ（０．６００ ｍｍｏｌ）を入れ、窒素パージを行い、ＮＩＰＡＭ ８．４９ ｇ（７５．０ ｍｍｏｌ）、ＩＰＡ　２１．５ｇを投入し、凍結脱気を行い、重合開始剤であるα－ブロモイソ酪酸エチル ５８．５ ｍｇ（０．３００ ｍｍｏｌ）を投入し、凍結脱気を行い、窒素雰囲気下で２５℃にて撹拌した。
　６時間後反応液を大量の５０℃の水に投入することにより白色の固体を得た。混合溶液の温度を２０℃にすることで白色固体を溶解させ、その液をアルミナカラムに通すことでＣｕＣｌ、ｂｐｙを除去し、液が適量になるまで溶媒留去し、凍結乾燥することで再び白色固体を得た。
　得られたポリマー（白色固体）の分子量を１Ｈ－ＮＭＲ（数平均）、ＧＰＣ（重量平均）にて測定したところ数平均分子量２２，６００、重量平均分子量２８，３００、分子量分布１．２５のＰ（ＮＩＰＡＭ）であることを確認した。１Ｈ－ＮＭＲはＣＤＣｌ３を測定溶溶媒とした。なお、ＧＰＣ測定は溶離液にテトラヒドロフランを、標準ポリマーにポリメタクリル酸メチルを用いた。
　（２）Ｐ（ＮＩＰＡＭ－ｂｌｏｃｋ－Ｃ２－ＳＦＡ）の調製
　重合管にＣｕＣｌ１９．８ ｍｇ（０．２００ ｍｍｏｌ）、ｂｐｙ ６２．４ ｍｇ（０．４００ ｍｍｏｌ）を入れ、窒素パージを行い、Ｃ２－ＳＦＡ ８．１６ ｇ（４０．０ ｍｍｏｌ）、ＩＰＡ １７．５ ｇを投入し、凍結脱気を行った。その後、上記にて調製したＰ（ＮＩＰＡＭ） ４．４６ ｇ（０．２００ ｍｍｏｌ）を投入し、凍結脱気を行い、窒素雰囲気下で７０℃にて撹拌した。
　６時間後反応液を大量の５０℃の水、メタノール混合溶媒［水:メタノール＝１：１（ｗ/ｗ）］に投入することにより白色の固体を得た。白色固体をＩＰＡ、ノベック７２００［住友スリーエム製のフッ素系溶剤（以下、ＨＦＥ７２００と表記）］の混合溶液［ＩＰＡ：ＨＦＥ７２００＝１：１（ｗ/ｗ）］に溶解させ、液をアルミナカラムに通すことでＣｕＣｌ、ｂｐｙを除去した後、溶媒留去し、ベンゼンを用いて凍結乾燥することで再び白色固体を得た。
　得られたポリマー（白色固体）を１Ｈ－ＮＭＲ、ＧＰＣにて評価したところ数平均分子量５２，８００、重量平均分子量７８，１００、分子量分布１．４８のＰ（ＮＩＰＡＭ－ｂｌｏｃｋ－Ｃ２－ＳＦＡ）であることを確認した。
　（３）試験方法
　ＮＩＰＡＭ／Ｃ２－ＳＦＡ（＝９５／５ｍｏｌ）共重合体をＰ（ＮＩＰＡＭ－ｂｌｏｃｋ－Ｃ２－）ＳＦＡ）に変更することと、電子線を照射しないこと以外は実施例３３と同じ方法で試験した。結果を表７に示す。ＮＩＰＡＭとＣ２－ＳＦＡをブロック共重合することにより、電子線照射なしで、基材表面にポリマーを固定化できることが判った。
　６．　実施例３８
　以下のようにして、ＮＩＰＡＭ及びＣ２－ＳＦＡのＡＢＡ型トリブロック共重合体［Ｐ（ＮＩＰＡＭ－ｂｌｏｃｋ－Ｃ２－ＳＦＡ－ｂｌｏｃｋ－ＮＩＰＡＭ）］を調製した。
　（１）　Ｐ（ＮＩＰＡＭ）の調製
　実施例３７（１）と同様の方法にて重合を行い、数平均分子量２４，３００、重量平均分子量２９，７００、分子量分布１．２２のＰ（ＮＩＰＡＭ）を得た。
　（２）　Ｐ（ＮＩＰＡＭ－ｂｌｏｃｋ－Ｃ２－ＳＦＡ）の調製
　投入したＰ（ＮＩＰＡＭ）の量を４．４６ ｇから４．８６ ｇに変更すること以外は実施例３７（２）と同様の方法にて重合を行った。その結果、数平均分子量５１，５００、重量平均分子量８０，４００、分子量分布１．５６のＰ（ＮＩＰＡＭ－ｂｌｏｃｋ－Ｃ２－ＳＦＡ）を得た。
　（３）　Ｐ（ＮＩＰＡＭ－ｂｌｏｃｋ－Ｃ２－ＳＦＡ－ｂｌｏｃｋ－ＮＩＰＡＭ）の調製
　重合管にＣｕＣｌ９．９０ ｍｇ（０．１００ ｍｍｏｌ）、ｂｐｙ ３１．２ ｍｇ（０．２００ ｍｍｏｌ）を入れ、窒素パージを行い、ＮＩＰＡＭ ３．３９ ｇ（３０．０ ｍｍｏｌ）、ＩＰＡ２１．５ｇを投入し、凍結脱気を行った。その後、上記実施例３７（２）にて調製したＰ（ＮＩＰＡＭ－ｂｌｏｃｋ－Ｃ２－ＳＦＡ） ５．１５ ｇ（０．１００ ｍｍｏｌ）を投入し、凍結脱気を行い、窒素雰囲気下で７０℃にて撹拌した。
　６時間後反応液を大量の５０℃の水、メタノール混合溶媒［水：メタノール＝１：１（ｗ/ｗ）］に投入することにより白色の固体を得た。その後、白色固体をＩＰＡ、ＨＦＥ７２００の混合溶液［ＩＰＡ：ＨＦＥ７２００＝１：１（ｗ/ｗ）］に溶解させ、液をアルミナカラムに通すことでＣｕＣｌ、ｂｐｙを除去した後、溶媒留去し、ベンゼンを用いて凍結乾燥することで再び白色固体を得た。
　白色固体を１Ｈ－ＮＭＲ、ＧＰＣにて評価したところ数平均分子量８２，９００、重量平均分子量１１５，０００、分子量分布１．３９のＰ（ＮＩＰＡＭ－ｂｌｏｃｋ－Ｃ２－ＳＦＡ－ｂｌｏｃｋ－ＮＩＰＡＭ）であることを確認した。
　（４）　試験方法
　実施例３３のＮＩＰＡＭ／Ｃ２－ＳＦＡ（＝９５／５ｍｏｌ）共重合体をＰ（ＮＩＰＡＭ－ｂｌｏｃｋ－Ｃ２－ＳＦＡ－ｂｌｏｃｋ－ＮＩＰＡＭ）に変更することと、電子線を照射しないこと以外は同じ方法で試験した。結果を表７に示す。ＮＩＰＡＭとＣ２－ＳＦＡをブロック共重合することにより、電子線照射なしで、基材表面にポリマーを固定化できることが判った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007

Claims (23)

  1. 少なくとも一種のポリマーを含有する層を表面に有する温度応答性基材であって、
    前記ポリマーの少なくとも一種のポリマーが温度応答性を示すものであり、かつ
    前記ポリマーの少なくとも一種のポリマーが含フッ素モノマーに基づく構成単位を含有するものであることを特徴とする、温度応答性基材。
  2. 温度応答性を示す前記ポリマーの下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０～１５℃である、請求項１に記載の温度応答性基材。
  3. 温度応答性を示す前記ポリマーが、ポリマーの重量に対して２～４０重量％のフッ素を含有するものである、請求項１又は２に記載の温度応答性基材。
  4. 前記含フッ素モノマーが、フルオロアルキル基を有する含フッ素モノマーである、請求項１～３のいずれか一項に記載の温度応答性基材。
  5. 　含フッ素モノマーが、一般式（１）：
    ＣＨ２＝Ｃ（－Ｘ）－Ｃ（＝Ｏ）－Ｙ－Ｚ－Ｒｆ　　　　（１）
    ［式中、Ｘは、水素原子、炭素数１～２１の直鎖状又は分岐状のアルキル基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、ＣＦＸ１Ｘ２基（但し、Ｘ１及びＸ２は、水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子である。）、シアノ基、炭素数１～２１の直鎖状若しくは分岐状のフルオロアルキル基、置換若しくは非置換のベンジル基又は置換若しくは非置換のフェニル基であり；
    Ｙは、－Ｏ－又は－ＮＨ－であり；
    Ｚは、炭素数１～１０の脂肪族基、炭素数６～１０の芳香族基若しくは環状脂肪族基、
    －ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）ＳＯ２－基（但し、Ｒ１は炭素数１～４のアルキル基である。）、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＺ）１）ＣＨ２－基（但し、Ｚ１は水素原子又はアセチル基である。）、－（ＣＨ２）ｍ－ＳＯ２－（ＣＨ２）ｎ－基、－（ＣＨ２）ｍ－Ｓ－（ＣＨ２）ｎ－基（但し、ｍは１～１０、ｎは０～１０である。）又は－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯＯ－基（ｍは１～１０である。）であり；
    Ｒｆは、ヘテロ原子を有していてもよい、炭素数１～２０の直鎖状又は分岐状のフルオロアルキル基である。］で表される、請求項１～４のいずれか一項に記載の温度応答性基材。
  6. 一般式（１）で表される含フッ素モノマーにおいて、Ｒｆが炭素数１～６の直鎖状又は分岐状の、ヘテロ原子を有していてもよいフルオロアルキル基である、請求項５に記載の温度応答性基材。
  7. 前記層が、
    含フッ素モノマーに基づく構成単位を全モノマー構成単位中５ｍｏｌ％以上含有する、少なくとも一種のポリマー、及び
    含フッ素モノマーに基づく構成単位の全モノマー構成単位に占める割合が５ｍｏｌ％未満である、少なくとも一種の温度応答性ポリマー
    のブレンドポリマーを含有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の温度応答性基材。
  8. 含フッ素モノマーに基づく構成単位を全モノマー構成単位中５ｍｏｌ％以上含有する前記ポリマーの少なくとも一種が、温度応答性ポリマーである、請求項７に記載の温度応答性基材。
  9. 前記ブレンドポリマーを構成するモノマー構成単位の合計に対する前記含フッ素モノマーに基づく構成単位の割合が０．５ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％である、請求項７又は８に記載の温度応答性基材。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の温度応答性基材を製造するために用いられる、含フッ素モノマーに基づく構成単位を含有するポリマー。
  11. 温度応答性ポリマーである、請求項１０に記載のポリマー。
  12. 請求項１～９のいずれか一項に記載の温度応答性基材を製造するために用いられる、（ａ）それを重合することにより得られるホモポリマーが温度応答性を示すモノマー、及び
    （ｂ）含フッ素モノマー
    を含有する組成物。
  13. 温度応答性ポリマーを含有する層を表面に有する温度応答性基材であって、
    前照射法による放射線表面グラフト重合によって、前記層を基材の表面に形成することにより得られうるものであることを特徴とする、温度応答性基材。
  14. 細胞培養器材である、請求項１～９及び１３のいずれか一項に記載の温度応答性基材。
  15. 培養器材から細胞を剥離する方法であって、
    請求項１～９のいずれか一項に記載の温度応答性基材の表面で培養された細胞を、温度応答性を示す前記ポリマーのＬＣＳＴ未満の環境下で該表面から剥離する工程
    を含む方法。
  16. 温度応答性を示す前記ポリマーのＬＣＳＴが０～１５℃である、請求項１５に記載の方法。
  17. 温度応答性を示す前記ポリマーが、ポリマーの重量に対して２～２０重量％のフッ素を含有するものである、請求項１６に記載の方法。
  18. 細胞シートの製造方法であって、
    請求項１～９のいずれか一項に記載の温度応答性基材の表面で培養されたシート状の細胞を、温度応答性を示す前記ポリマーのＬＣＳＴ未満の環境下で該表面から剥離する工程
    を含む方法。
  19. 温度応答性を示す前記ポリマーのＬＣＳＴが０～１５℃である、請求項１８に記載の方法。
  20. 温度応答性を示す前記ポリマーが、ポリマーの重量に対して２～２０重量％のフッ素を含有するものである、請求項１９に記載の方法。
  21. 温度応答性ポリマーを含有する層を表面に有する温度応答性基材の製造方法であって、
    前照射法による放射線表面グラフト重合によって、前記層を基材の表面に形成する工程を含むことを特徴とする、製造方法。
  22. 温度応答性ポリマーを含有する層を表面に有する温度応答性基材であって、
    前記ポリマーが、
    溶液重合により調製された場合に、５℃（前記ポリマーのＬＣＳＴが２０℃未満の場合）又は２０℃（前記ポリマーのＬＣＳＴが２０℃以上３７℃以下の場合）及び４０℃における対水接触角の差△θが３０°以上であり、かつ、
    示差走査熱量分析法において中間水のピークを有する
    ものであることを特徴とする、温度応答性基材。
  23. 温度応答性ポリマーを含有する層を表面に有する温度応答性基材の評価方法であって、
    溶液重合により調製された前記ポリマーを試料として用い、
    （ａ）前記試料の、温度応答前後における対水接触角の差△θ、及び
    （ｂ）前記試料の、示差走査熱量分析における中間水のピークの有無
    に基づいて評価を行う、方法。
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