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WO2015193951A1 - 観察装置、観察方法、観察システム、そのプログラム、および細胞の製造方法 - Google Patents

観察装置、観察方法、観察システム、そのプログラム、および細胞の製造方法 Download PDF

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WO2015193951A1
WO2015193951A1 PCT/JP2014/065916 JP2014065916W WO2015193951A1 WO 2015193951 A1 WO2015193951 A1 WO 2015193951A1 JP 2014065916 W JP2014065916 W JP 2014065916W WO 2015193951 A1 WO2015193951 A1 WO 2015193951A1
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WO
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colony
area
cells
image
observation
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Application number
PCT/JP2014/065916
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English (en)
French (fr)
Inventor
泰次郎 清田
宏昭 紀伊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nikon Corp
Original Assignee
Nikon Corp
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Publication date
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Priority to JP2016528672A priority patent/JP6569672B2/ja
Priority to PCT/JP2014/065916 priority patent/WO2015193951A1/ja
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    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro
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    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30242—Counting objects in image

Definitions

  • the present invention relates to an observation apparatus, an observation method, an observation system, a program thereof, and a cell manufacturing method.
  • Stem cells such as ES (Embryonic Stem) cells or iPS (induced Pluripotent Stem) cells are theoretically infinite while maintaining the differentiation pluripotency that differentiates into almost any tissue. Because it can be proliferated, attention has been focused on pharmaceutical development and application to regenerative medicine.
  • ES Embryonic Stem
  • iPS induced Pluripotent Stem
  • stem cells When such stem cells are applied to drug discovery research and regenerative medicine, the stem cells are cultured in good condition (colony size is moderate, and the density of cells present in the colony is moderate) Therefore, it is required to accurately determine the maturity of the cell line in culture.
  • colony size is moderate, and the density of cells present in the colony is moderate
  • the accuracy of determination of the maturity level of the cell line cannot be improved.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and provides an observation apparatus, an observation method, an observation system, a program therefor, and a cell production method that can improve the accuracy of determination of the maturity of a cell line.
  • the issue is to provide.
  • an area calculation unit that calculates an area of a colony based on an image obtained by imaging a colony of cells, and the area calculation unit calculates an area. Included in the number of cells included in the target colony based on the image, the area of the target colony calculated by the area calculation unit, and the target colony calculated by the cell number calculation unit And a density calculation unit that calculates the density of cells included in the target colony based on the number of cells to be observed.
  • one embodiment of the present invention is an observation system including an imaging unit that captures an image of a cell in culture and the above-described observation device.
  • the number of cells included in the calculated target colony is calculated by the cell number calculation procedure for calculating based on the image, the area of the target colony calculated by the area calculation procedure, and the cell number calculation procedure.
  • an area calculation procedure for calculating an area of a colony based on an image obtained by imaging a colony of cells on a computer and the area calculation procedure The number of cells included in the target colony whose area is calculated by the cell number calculation procedure for calculating based on the image, the area of the target colony calculated by the area calculation procedure, and the cell number calculation procedure It is a program for executing a density calculation procedure for calculating the density of cells included in the target colony based on the calculated number of cells included in the target colony.
  • a cell culturing procedure for culturing cells and a colony of cells cultured in the culturing procedure are imaged, and an image of the imaged colony
  • An area calculation procedure for calculating the area of the colony based on the above, a cell number calculation procedure for calculating the number of cells included in the target colony whose area is calculated by the area calculation procedure based on the image, and the area Density calculation for calculating the density of cells included in the target colony based on the area of the target colony calculated by the calculation procedure and the number of cells included in the target colony calculated by the cell number calculation procedure A method for producing a cell.
  • the accuracy of determining the maturity of a cell line can be improved.
  • FIG. 1 is a block diagram showing an example of the configuration of an incubator 11 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a block diagram illustrating an example of the configuration of the control device 41 included in the incubator 11 according to the present embodiment.
  • FIG. 3, FIG. 4 is the front view and top view of the incubator 11 of this embodiment.
  • the incubator 11 is an apparatus for culturing cells and observing the state of the cells by imaging the cultured cells with a microscope camera.
  • the incubator 11 has an upper casing 12 and a lower casing 13. In the assembled state of the incubator 11, the upper casing 12 is placed on the lower casing 13. Note that the internal space between the upper casing 12 and the lower casing 13 is vertically divided by a base plate 14.
  • the temperature-controlled room 15 includes a temperature adjusting device 15a and a humidity adjusting device 15b, and the temperature-controlled room 15 is maintained in an environment suitable for cell culture (for example, an atmosphere having a temperature of 37 ° C. and a humidity of 90%) ( In addition, illustration of the temperature adjusting device 15a and the humidity adjusting device 15b in FIGS. 3 and 4 is omitted).
  • a large door 16, a middle door 17, and a small door 18 are arranged in front of the temperature-controlled room 15.
  • the large door 16 covers the front surfaces of the upper casing 12 and the lower casing 13.
  • the middle door 17 covers the front surface of the upper casing 12 and isolates the environment between the temperature-controlled room 15 and the outside when the large door 16 is opened.
  • the small door 18 is a door for carrying in and out a culture vessel 19 for culturing cells, and is attached to the middle door 17. It is possible to suppress environmental changes in the temperature-controlled room 15 by carrying the culture container 19 in and out of the small door 18.
  • the large door 16, the middle door 17, and the small door 18 are maintained airtight by the packings P1, P2, and P3, respectively.
  • a stocker 21, an observation unit 22, a container transport device 23, and a transport base 24 are arranged in the temperature-controlled room 15, a stocker 21, an observation unit 22, a container transport device 23, and a transport base 24 are arranged.
  • the conveyance stand 24 is disposed in front of the small door 18, and carries the culture container 19 in and out of the small door 18.
  • the stocker 21 is disposed on the left side of the temperature-controlled room 15 when viewed from the front surface of the upper casing 12 (the lower side in FIG. 4).
  • the stocker 21 has a plurality of shelves, and each shelf of the stocker 21 can store a plurality of culture vessels 19.
  • Each culture container 19 contains cells to be cultured together with a medium.
  • the stocker 21 is not essential.
  • the observation unit 22 is arranged on the right side of the temperature-controlled room 15 when viewed from the front of the upper casing 12.
  • the observation unit 22 can execute time-lapse observation of cells in the culture vessel 19.
  • the observation unit 22 is fitted into the opening of the base plate 14 of the upper casing 12 and arranged.
  • the observation unit 22 includes a sample table 31, a stand arm 32 for arranging an illumination light source protruding above the sample table 31, and a main body portion 33 incorporating an observation optical system and an imaging device 34.
  • the sample stage 31 and the stand arm 32 are disposed in the temperature-controlled room 15, while the main body portion 33 is accommodated in the lower casing 13.
  • the sample stage 31 is made of a translucent material, and the culture vessel 19 can be placed thereon.
  • the sample stage 31 is configured to be movable in the horizontal direction, and the position of the culture vessel 19 placed on the upper surface can be adjusted.
  • the stand arm 32 includes an LED light source 39.
  • the imaging device 34 can acquire the microscope image of a cell by imaging the cell of the culture container 19 permeate
  • the container transport device 23 is disposed in the center of the temperature-controlled room 15 when viewed from the front surface of the upper casing 12.
  • the container transport device 23 delivers the culture container 19 between the stocker 21, the sample table 31 of the observation unit 22, and the transport table 24.
  • the container transport device 23 is also unnecessary.
  • the container transport device 23 includes a vertical robot 38 having an articulated arm, a rotary stage 35, a mini stage 36, and an arm unit 37.
  • the rotary stage 35 is attached to the tip of the vertical robot 38 so as to be capable of rotating 180 ° in the horizontal direction via a rotary shaft 35a. Therefore, the rotary stage 35 can make the arm portions 37 face the stocker 21, the sample table 31, and the transport table 24.
  • mini stage 36 is attached to the rotary stage 35 so as to be slidable in the horizontal direction.
  • An arm part 37 that holds the culture vessel 19 is attached to the mini stage 36.
  • the control device 41 is connected to the temperature adjustment device 15a, the humidity adjustment device 15b, the observation unit 22 and the container transport device 23, respectively.
  • the control device 41 comprehensively controls each part of the incubator 11 according to a predetermined program.
  • control device 41 controls the temperature adjustment device 15a and the humidity adjustment device 15b, respectively, to maintain the inside of the temperature-controlled room 15 at a predetermined environmental condition.
  • the control device 41 controls the observation unit 22 and the container transport device 23 based on a predetermined observation schedule, and automatically executes the observation sequence of the culture vessel 19. Furthermore, the control device 41 executes a culture state evaluation process for evaluating the culture state of the cells based on the image acquired in the observation sequence.
  • FIG. 5 is a graph showing an example of temporal change in colony area for each cell line. Since cells proliferate over time, the area of colonies containing these cells (hereinafter also simply referred to as colony area) increases with the passage of time. The time change of the colony area differs for each cell line. As an example, the time change of the colony area of the cell line A is shown by the calibration curve L1A in the figure. Moreover, the time change of the colony area of the cell line B is shown by the calibration curve L1B in the figure.
  • calibration curves L1A and L1B are collectively referred to as a first calibration curve L1. If the cell line is specified, the change in the colony area of the cell line over time can be estimated based on the predetermined relationship shown in FIG. 5, that is, the first calibration curve L1.
  • the time variation of the colony area of a certain colony is larger than the time variation of the standard colony area (for example, when the colony area is abnormally increased)
  • the cells included in this colony May have differentiated. That is, a colony having an abnormally increased colony area can be determined as an abnormal colony, assuming that cells are differentiated.
  • the time variation of the colony area of a certain colony is smaller than the standard time variation of the colony area (for example, when the colony area does not change with time), the cells included in this colony die. There is a possibility.
  • a colony whose colony area does not change with time can be determined as an abnormal colony, assuming that cells are dead.
  • the incubator 11 of the present embodiment determines whether or not colonies are growing normally by registering (storing) the first calibration curve L1 in advance for each cell line.
  • FIG. 6 is a graph showing an example of the relationship between the colony area of one colony (hereinafter referred to as colony area) and the number of cells in one colony (hereinafter referred to as number of cells in the colony) for each cell line.
  • colony area the colony area of one colony
  • number of cells in one colony hereinafter referred to as number of cells in the colony
  • the colony used as the object at the time of creating a calibration curve selects a colony suitable for the calibration curve in the appearance of the user.
  • a colony is not preferably bonded, and a person in which individual colonies exist independently is preferably selected.
  • the size of the colony is judged visually, and a wide range of colonies are selected from small to large. These may be carried out by visual judgment by the user, or may be automatically determined by storing the selection conditions in advance and performing image analysis.
  • the relationship between the colony area of the cell line B and the number of cells contained in this colony is indicated by a calibration curve L2B in FIG.
  • the calibration curve L2A and the calibration curve L2B are collectively referred to as a second calibration curve L2. If a cell line is specified, the number of cells contained in this colony can be estimated from the colony area of this cell line based on the second calibration curve L2 shown in FIG.
  • the incubator 11 of the present embodiment estimates (calculates) the number of cells contained in the colony from the colony image by registering (storing) the second calibration curve L2 in advance for each cell line.
  • the relationship between the number of cells and the colony area is measured based on a phase difference image and a fluorescent image that is an image of a fluorescently stained cell line. Further, the relationship between the measured number of cells and the colony area is stored in advance as a second calibration curve L2.
  • the image used for measuring the number of cells is, for example, an image captured in a state where cells in the colony are fluorescently stained.
  • the number of cells is measured for cells showing a predetermined luminance value.
  • FIG. 7 is a graph showing an example of the relationship between the cell colony area and the density of cells contained in the colony.
  • the density of cells contained in the colony increases according to the maturity of the cells over time.
  • the density of the cells contained in the colony reaches a certain degree of maturity, the change with the passage of time decreases. This means that the number of cells in the colony increases as the area of the colony increases, but the change in the area per individual cell in the colony decreases. Therefore, by observing the density of the cells contained in the colony, the maturity of the cells can be determined.
  • the density of cells contained in this colony is specifically represented by the relationship between the colony area and the area per cell contained in this colony. As time progresses, the colony area increases because the cells grow. When the maturity of the cells contained in this colony increases, the inside of the colony becomes packed. That is, when the cells contained in the colony mature, the density of the cells inside the colony increases. Further, when the cells further proliferate in a state where the inside of the colony is packed, the density of the cells reaches the upper limit, the increase in density is suppressed, and the colony area increases. Therefore, the degree of maturity of the cells contained in this colony can be determined by observing changes in the density of cells inside the colony over time.
  • the density of cells contained in this colony varies from cell line to cell line.
  • the relationship between the colony area of the cell line A and the area per cell contained in this colony is indicated by a calibration curve L3A in the figure.
  • the relationship between the colony area of the cell line B and the area per cell contained in this colony is indicated by a calibration curve L3B in the figure.
  • the calibration curve L3A and the calibration curve L3B are collectively referred to as a third calibration curve L3. If the cell line is specified, the maturity of this cell can be determined based on the third calibration curve L3 shown in FIG.
  • the cell line A when the area per cell contained in the colony reaches the threshold value ThA of the calibration curve L3A shown in the figure, it is determined that the cell line A is mature.
  • the cell line B when the area per cell included in the colony reaches the threshold value ThB of the calibration curve L3B shown in the figure, it is determined that the cell line B has matured.
  • the incubator 11 of the present embodiment determines the maturity of the cell from the colony image by registering (storing) the third calibration curve L3 in advance for each cell line. Specifically, when preparing a calibration curve, for a certain cell line, based on the phase difference image and the fluorescence image that is the fluorescence-stained cell line image, the colony area and the density of cells contained in this colony Measure the relationship. Further, the relationship between the measured colony area and the density of the cells included in the colony is stored in advance as a third calibration curve L3.
  • the control device 41 includes a control unit 42, a storage unit 43, and an input unit 44.
  • the storage unit 43 includes a non-volatile storage medium such as a hard disk or flash memory, and a volatile storage medium such as DRAM or SRAM.
  • the storage unit 43 stores management data related to each culture vessel 19 stored in the stocker 21, data of the entire observation image captured by the imaging device, and data of the microscope image. Further, the storage unit 43 stores a program executed by the control unit 42. The storage unit 43 temporarily stores various calculation results by the control unit 42.
  • the management data includes (a) index data indicating individual culture containers 19, (b) the storage position of the culture container 19 in the stocker 21, and (c) the type and shape of the culture container 19 (well plate, (Dish, flask, etc.), (d) the type of cells cultured in the culture vessel 19 (information identifying the cell line), (e) the observation schedule of the culture vessel 19, and (f) imaging conditions (objective) during time-lapse observation Lens magnification, observation point in the container, etc.).
  • index data indicating individual culture containers 19, (b) the storage position of the culture container 19 in the stocker 21, and (c) the type and shape of the culture container 19 (well plate, (Dish, flask, etc.), (d) the type of cells cultured in the culture vessel 19 (information identifying the cell line), (e) the observation schedule of the culture vessel 19, and (f) imaging conditions (objective) during time-lapse observation Lens magnification, observation point in the container, etc.).
  • management data is generated for each small container.
  • cell lines to be observed different types are observed as cell lines to be observed.
  • information for identifying the cell line is required.
  • the cell line identification information is not essential.
  • information indicating the cell line may be input.
  • the storage unit 43 stores therein calibration curve information indicating the relationship between the area of the colony and the number of cells included in the colony. Moreover, when observing different types of cell lines, it is preferable to store cell line information for identifying cell lines of cells in the storage unit 43 and store them in association with each information. Moreover, it is preferable to store the feature amount information indicating the feature amount of the area of the colony, and store the feature amount information in association with each information.
  • the input unit 44 includes input devices such as a keyboard and a mouse. Various information such as cell line information is input to the input unit 44 by user operation.
  • the control unit 42 includes an image reading unit 4203, an area calculation unit 4211, a writing control unit 4221, a cell number calculation unit 4222, and a density calculation unit 4223.
  • the quality determination unit 4224 and the maturity determination unit 4225 are not essential.
  • the control unit 42 is a processor that executes various arithmetic processes of the control device 41, for example.
  • the control unit 42 executes an image reading unit 4203, an area calculation unit 4211, a pass / fail determination unit 4224, a maturity determination unit 4225, a write control unit 4221, and a cell number calculation unit 4222 by executing the program. Each may function.
  • the write control unit 4221 controls writing of information output from each unit of the control device 41 to the storage unit 43.
  • the image reading unit 4203 reads the image data of the entire observation image or the microscope image captured by the imaging device 34 and supplies the read image data to each unit of the control device 41.
  • the image reading unit 4203 reads the image data of the entire observation image or the microscope image stored in the storage unit 43 and supplies the read image data to each unit of the control device 41.
  • the area calculation unit 4211 stores the first calibration curve L1 in the storage unit 43, and determines the quality of the colony based on the colony image captured by the imaging device 34 and the first calibration curve L1. In the two cases, the area of the colony is calculated.
  • a case where the first calibration curve L1 is stored in the storage unit 43 will be described, and then a case where the quality of the colony is determined based on the first calibration curve L1 will be described.
  • the area calculation unit 4211 calculates the colony area, and the first calibration curve L1 associating the calculated colony area with the number of cells included in the colony is used as calibration curve information via the write control unit 4221.
  • the data is stored in the storage unit 43. That is, the area calculation unit 4211 causes the storage unit 43 to store the first calibration curve L1.
  • cell line information (cell line ID) is stored in the storage unit 43 via the input unit 44, and calibration curve information is stored for each cell line.
  • information indicating the cell line type (cell line ID).
  • information indicating the type of cell line may be input by a user who knows the type of cell line to be observed, or by identifying cells such as the form and brightness of the cell to be observed, and matching technology. It is also possible to automatically create and input information indicating the type of cell line by using a technique for automatically determining the type of cell line by means of, for example. In this embodiment, a case where information (cell line ID) indicating a cell line is input from the user via the input unit 44 will be described.
  • the area calculation unit 4211 calculates the area of the colony based on the image in which the cell colony is captured. A specific example of an image for which the area calculation unit 4211 calculates the area of the colony will be described with reference to FIG.
  • FIG. 8 is a schematic diagram illustrating an example of the entire observation image captured by the imaging device 34 of the present embodiment.
  • the whole observation image PIC01 is an image (frame 1) of a colony detection result after one day has elapsed since the start of culture.
  • the whole observation image PIC02 to the whole observation image PIC05 (frame 1 to frame 5) are images of colony detection results after two days to five days have elapsed since the start of culture.
  • the whole observation image PIC01 includes an image of the first colony CO1 and an image of the second colony CO2 after 1 day from the start of the culture.
  • the entire observation image PIC02 includes an image of the first colony CO1 and an image of the second colony CO2 after two days have elapsed from the start of culture.
  • the first colony CO1 after 2 days from the start of the culture has grown compared to the first colony CO1 after 1 day from the start of the culture, and its area has increased.
  • the second colony CO2 after 2 days from the start of the culture has grown and its area increased compared to the second colony CO2 after 1 day from the start of the culture. .
  • the entire observation image PIC03 includes an image of the first colony CO1, an image of the second colony CO2, and an image of the third colony CO3 after 3 days from the start of the culture.
  • the first colony CO1 after 3 days from the start of the culture has grown compared to the first colony CO1 after 2 days from the start of the culture, and its area has increased.
  • the second colony CO2 after 3 days from the start of the culture has grown compared to the second colony CO2 after 2 days from the start of the culture, and its area has increased. .
  • the time change of the area of the colony will be described by comparing the entire observation image PIC01 to the entire observation image PIC03 in time series.
  • the area of the first colony CO1 monotonously increases in the overall observation image PIC01 to the overall observation image PIC03.
  • the area of the second colony CO2 is greatly different from the increase amount in the overall observation image PIC01 to the overall observation image PIC02 and the increase amount in the overall observation image PIC02 to the overall observation image PIC03. That is, the area of the second colony CO2 has a larger increase amount in the overall observation image PIC02 to the overall observation image PIC03 than the increase amount in the overall observation image PIC01 to the overall observation image PIC02. That is, the area of the second colony CO2 increases rapidly after 3 days from the start of culture. This indicates that the second colony CO2 may have differentiated and proliferated abnormally after 3 days from the start of culture.
  • FIG. 9 is a graph showing an example of the relationship between the time variation of the colony area and the first calibration curve of the present embodiment.
  • the horizontal axis represents time
  • the vertical axis represents the colony area.
  • FIG. 9A shows the area of the colony included in the entire observation image PIC01 obtained by acquiring the colony image. That is, FIG. 9A shows the area of the first colony CO1 and the area of the second colony CO2 after 1 day from the start of culture.
  • the area CO11 of the first colony CO1 and the area CO21 of the second colony CO2 are both plotted on the first calibration curve L1. That is, the area CO11 of the first colony CO1 and the area CO21 of the second colony CO2 are both normal values after one day from the start of the culture.
  • FIGS. 9B to 9E show the areas of the colonies included in the overall observation image PIC02 to the overall observation image PIC05 obtained by acquiring the colony images, respectively.
  • FIG. 9 (B) shows the area CO12 of the first colony CO1 and the area CO22 of the second colony CO2 after two days from the start of the culture.
  • both the area CO12 of the first colony CO1 and the area CO22 of the second colony CO2 are plotted on the first calibration curve L1. That is, after 2 days from the start of culture, the area CO12 of the first colony CO1 and the area CO22 of the second colony CO2 both show normal values.
  • FIG. 9C shows the area CO13 of the first colony CO1 and the area CO23 of the second colony CO2 after 3 days from the start of culture.
  • the area CO13 of these first colonies CO1 is plotted on the first calibration curve L1.
  • the area CO23 of the second colony CO2 is not plotted on the first calibration curve L1. That is, after 3 days from the start of culture, the area CO12 of the first colony CO1 shows a normal value, and the area CO23 of the second colony CO2 shows an abnormal value. This indicates that the second colony CO2 may have differentiated and proliferated abnormally after 3 days from the start of culture.
  • the second colony CO2 has a larger colony area than a normal colony, and may have differentiated and proliferated abnormally after 3 days from the start of culture. Subsequent culture is stopped (eg, removed from the medium) for the colony CO2.
  • the pass / fail judgment unit 4224 makes a pass / fail judgment on this colony. That is, the pass / fail determination unit 4224 determines pass / fail of the colony based on the change of the area of the colony calculated by the area calculation unit 4211 over time. Specifically, the quality determination unit 4224 determines the quality of the colony based on the colony area calculated by the area calculation unit 4211 and the first calibration curve L1 stored in the storage unit 43.
  • a third colony CO3 that has not existed until now is generated. This is because iPS cells differ from normal cells in that the timing of adhesion is uneven. Specifically, the first colony CO1 and the second colony CO2 adhere and proliferate after one day from the start of the culture. In contrast, the third colony CO3 does not adhere until 2 days after the start of culture, and adheres and starts to grow after 3 days from the start of culture.
  • the imaging device 34 generates a whole observation image by performing imaging a plurality of times as time elapses from the start of culture.
  • the whole observation image PIC04 (frame 4) includes an image of the first colony CO1, an image of the second colony CO2, and an image of the third colony CO3 after 4 days from the start of the culture. .
  • the first colony CO1 after 4 days from the start of culturing has grown compared to the first colony CO1 after 3 days from the start of culturing, and its area has increased.
  • the second colony CO2 after 4 days from the start of the culture has grown compared to the second colony CO2 after 2 days from the start of the culture, and its area has increased. .
  • the imaging device 34 captures a time-lapse image from the start of culture.
  • the incubator 11 of this embodiment can observe the state of a colony accurately also about the cell in which the timing of adhesion
  • the area calculation unit 4211 acquires the entire observation image captured by the imaging device 34 from the image reading unit 4203. Further, the area calculation unit 4211 generates a colony detection result image (overall observation image PIC01 to overall observation image PIC05) shown in FIG. 8 based on the acquired overall observation image.
  • the area calculation unit 4211 calculates the area of the cell colony based on the generated colony detection result image. Specifically, the area calculation unit 4211 masks the colony portion using an object detection algorithm based on a known learning function, and the masked portion (region surrounded by a curve in the colony detection result image of FIG. 8). A colony area is calculated from the masked area, assuming that the colony exists. In addition, the calculation method of a colony area is not restricted to this.
  • the cell number calculation unit 4222 When the cell number calculation unit 4222 receives information (cell line ID) indicating a cell line from the user via the input unit 44, the cell number calculation unit 4222 uses the cell line ID as a search key to obtain calibration curve information stored in the storage unit 43. A search is performed, and based on the result of the search, a second calibration curve L2 (the relationship between the colony area and the number of cells) having the same cell line ID is obtained. In addition, the cell number calculation unit 4222 calculates the cell number based on the area of the colony calculated by the area calculation unit 4211 using the acquired second calibration curve L2. That is, the cell number calculation unit 4222 calculates the number of cells included in the target colony whose area is calculated by the area calculation unit 4211 based on the image captured by the imaging device 34.
  • information cell line ID
  • the cell number calculation unit 4222 uses the cell line ID as a search key to obtain calibration curve information stored in the storage unit 43. A search is performed, and based on the result of the search, a second calibration
  • the density calculation unit 4223 calculates the density of cells included in the colony based on the area of the colony calculated by the area calculation unit 4211 and the number of cells included in the colony calculated by the cell number calculation unit 4222. Specifically, the density calculation unit 4223 calculates the area per cell included in the colony based on the colony area calculated by the area calculation unit 4211 and the number of cells calculated by the cell number calculation unit 4222. To do.
  • the maturity determination unit 4225 determines the maturity of cells included in the colony based on the cell density calculated by the density calculation unit 4223. Specifically, when the area per cell included in the colony reaches the threshold ThA of the calibration curve L3A shown in FIG. Determine that A is mature. In addition, when the area per cell included in the colony reaches the threshold value ThB of the calibration curve L3B shown in FIG. It is determined that
  • the incubator 11 calculates the number of cells by estimating the number of cells contained in this colony from the area of the colony of cells based on the registered calibration curve.
  • the calibration curve is information indicating the relationship between the area of a cell colony and the number of cells contained in the colony.
  • an operation for registering a calibration curve will be described first, and then an operation for calculating the number of cells based on the registered calibration curve will be described.
  • FIG. 10 is a flowchart showing an example of the calibration curve registration operation by the incubator 11 (observation apparatus) of the present embodiment.
  • the incubator 11 stores a calibration curve (a first calibration curve L1, a second calibration curve L2, and a third calibration curve L3) for each cell line.
  • the incubator 11 detects a colony image in the image data based on the image data described above, and calculates the area of the colony image.
  • the incubator 11 registers the first calibration curve L1 for a certain cell line by associating the calculated colony area with the elapsed time from the start of culture for each cell line.
  • the incubator 11 associates the calculated colony area with the number of cells in the colony counted by the fluorescence staining observation image for each cell line, thereby obtaining the second calibration curve L2 for a certain cell line. Register as information.
  • the incubator 11 registers the third calibration curve L3 for a cell line as calibration curve information by associating the calculated colony area with the area per cell in the colony for each cell line. To do.
  • the control unit 42 receives in advance an instruction for the calibration curve registration operation that the user inputs via the input unit 44.
  • the instruction for the calibration curve registration operation includes information (cell line ID) indicating the cell line to which the calibration curve is registered (if there is only one cell line to be observed, the calibration curve is registered). It is not essential to input information (cell line ID) indicating the target cell line, and the storage unit 43 is configured to start observation from 1 day to 5 days after the start of culture.
  • the observation start time is stored in advance as an observation schedule for management data, and the method in which the user counts the number of cells in the colony is a culture method such as a counting method in which cells are fluorescently stained and the cells are counted by fluorescence observation.
  • the number of the culture containers 19 corresponding to the number of observations is prepared, for example, 1 day after the start of culture, 2 days after, 3 days after Observe
  • at least three culture vessels 19 are housed in the stocker 21 of the temperature-controlled room 15.
  • the same cell line is cultured in each of these culture vessels 19.
  • the culture vessels 19 are used for one day.
  • Step S101 The control unit 42 compares the observation schedule of the management data in the storage unit 43 with the current date and time, and determines whether or not the observation start time of the culture vessel 19 has arrived. When the observation start time is reached (YES side), the control unit 42 shifts the process to step S102. On the other hand, when it is not the observation time (NO side), the control unit 42 waits until the time of the next observation schedule.
  • Step S102 The control unit 42 instructs the container transport device 23 to transport the culture container 19 corresponding to the observation schedule. Then, the container transport device 23 carries the instructed culture container 19 out of the stocker 21 and places it on the sample stage 31 of the observation unit 22. Note that, when the culture vessel 19 is placed on the sample stage 31, an entire observation image of the culture vessel 19 is captured by a bird view camera (not shown) built in the stand arm 32. Thereby, the image of the culture container 19 containing the image of a colony is imaged. As described above, the stacker 21 is not essential, and if the stacker 21 is not present, the steps related to the conveyance of the container are not necessary.
  • Step S103 The image reading unit 4203 of the control unit 42 stores the entire observation image captured in step S102.
  • the area calculation unit 4211 of the control unit 42 detects a colony image from the stored whole observation image, and calculates the area of each colony cell in the culture container 19 or the total area of each colony as the colony area.
  • obtain an image of the culture vessel containing the colony image count the number of cells in each colony (or the total number of cells in each colony) from the fluorescence observation image, and calculate the colony area from the phase contrast image May be.
  • the total number of cells of each colony may be counted using a hemocytometer, and the colony area may be calculated from the phase difference image.
  • Step S104 The control unit 42 instructs the container transport device 23 to transport the culture container 19 to the small door 18 after the observation schedule is completed.
  • the container transport device 23 transports the instructed culture container 19 from the sample stage 31 of the observation unit 22 to the position of the small door 18.
  • Step S105 The user opens the small door 18 and takes out the culture vessel 19.
  • the user counts the number of cells of the extracted culture container 19 by a known method. For example, the user counts the number of cells by fluorescent staining.
  • the user inputs the counted number of cells to the input unit 44.
  • the user calculates the density of the cells in the colony and inputs the calculated density to the input unit 44.
  • Step S106 The writing control unit 4221 of the control unit 42 includes information indicating the number of cells in the colony and the density of cells in the colony input to the input unit 44, the colony area calculated in step S103, and the cell line. (Cell line ID) is associated and stored in the storage unit 43. Thereby, the colony area, the number of cells, and the cell line ID are associated and stored as calibration curve information in the storage unit 43 (in the case of observation of one cell line, the association with the cell line ID is not essential). ). Then, the control part 42 complete
  • the calibration curve information is stored in the storage unit 43 by repeating steps S101 to S106 in this way.
  • Steps S101 to S106 for a plurality of cell lines calibration curve information for each of the plurality of cell lines is stored in the storage unit 43.
  • the calibration curve information of the cell line A and the calibration curve information of the cell line B are stored in the storage unit 43 by repeating steps S101 to S106 for each of the cell line A and the cell line B. .
  • FIG. 11 is a flowchart showing an example of the cell number estimation operation by the incubator 11 (observation apparatus) of the present embodiment.
  • data referred to as comparison data
  • comparison data regarding the number of cells with respect to the change in colony area of a specific cell line to be observed
  • the incubator 11 observes the culture vessel 19 carried into the temperature-controlled room 15 in a time-lapse manner according to a registered observation schedule.
  • a plurality of specific cell lines are cultured in the culture container 19.
  • the cell line A is cultured in the culture container 19A among the culture containers 19.
  • the cell line B is cultured in the culture container 19B among the culture containers 19.
  • the incubator 11 sequentially conveys the culture vessel 19A and the culture vessel 19B to the vertical robot 38 observation unit 22 according to the observation schedule, and the entire image of the culture vessel 19 (overall observation image) and a part of the culture vessel 19 An enlarged microscope image is taken.
  • the calibration curve information of the cell line A and the calibration curve information of the cell line B are stored in the storage unit 43 in advance by the calibration curve information registration procedure described above.
  • the operation of estimating the number of cells in the time lapse observation of the incubator 11 will be described below.
  • Step S201 The control unit 42 compares the observation schedule of the management data in the storage unit 43 with the current date and time, and determines whether or not the observation start time of the culture vessel 19 has come. When it is the observation start time (YES side), the control unit 42 shifts the process to step S202. On the other hand, when it is not the observation time of the culture vessel 19 (NO side), the control unit 42 waits until the time of the next observation schedule.
  • Step S202 The control unit 42 instructs the container transport device 23 to transport the culture container 19 corresponding to the observation schedule. Then, the container transport device 23 carries the instructed culture container 19 out of the stocker 21 and places it on the sample stage 31 of the observation unit 22. Note that, when the culture vessel 19 is placed on the sample stage 31, an entire observation image of the culture vessel 19 is captured by a bird view camera (not shown) built in the stand arm 32.
  • the observation apparatus shown in FIGS. 1, 3, and 4 is an apparatus provided with a temperature-controlled room for culturing cells to be observed. Therefore, the cells imaged in step S202 are cultured in the temperature-controlled room of the observation apparatus. Therefore, this step can also be started from the step of culturing cells. Further, as in the present embodiment, the observation device may not be provided with a temperature-controlled room, and the temperature-controlled room for culturing cells may be a device separate from the observation device.
  • Step S203 The cell number calculation unit 4222 that calculates the number of cells in the colony acquires information (cell line ID) indicating the cell line from the management data stored in the storage unit 43.
  • Step S205 The image reading unit 4203 acquires the image captured in step 202. This image includes a colony image.
  • Step S206 The area calculation unit 4211 calculates the area of the colony included in this image based on the image acquired in step S205.
  • Step S207 The cell number calculation unit 4222 estimates (calculates) the cell number based on the area of the colony calculated in step S206 and the second calibration curve L2 in the calibration curve information acquired in step S204.
  • the area calculation unit 4211 calculates the area of the recognized colony in the acquired image. Note that this step may be executed when observation is possible after the culture vessel is transported to the observation unit (S202). In this case, information indicating the cell line is obtained after calculating the colony area.
  • Step S208 The density calculation unit 4223 calculates the density of the cells based on the area of the colony calculated in step S206 and the number of cells calculated in step S207.
  • Step S209 When the pass / fail judgment unit 4224 is provided, the pass / fail judgment unit 4224 uses the colony area calculated from the acquired image and the first calibration curve L1 in the calibration curve information acquired in Step S204. Based on this, the quality of the colony is determined. If the quality determination unit 4224 is not provided, the user can determine whether the colony is acceptable based on the calculated colony area and the first calibration curve L1 in the calibration curve information acquired in step S204. judge.
  • the maturity determination unit 4225 uses the acquired image, the colony area calculated in step S206, the cell density calculated in step S208, and step S204. The maturity of the cells is determined based on the third calibration curve L3 in the calibration curve information acquired in step (1). If the maturity determination unit 4225 is not provided, the area of the colony calculated in step S206, the cell density calculated in step S208, and the third standard curve information acquired in step S204. Based on the calibration curve L3, the user determines the maturity of the cells.
  • Step S210 The control unit 42 instructs the container transport device 23 to transport the culture container 19 after the observation schedule is completed. Then, the container transport device 23 transports the designated culture container 19 from the sample stage 31 of the observation unit 22 to a predetermined storage position of the stocker 21. Thereafter, the control unit 42 ends the observation sequence and returns the process to S201. In addition, after determining whether or not the cells are in a good state as a result of the determination in step S209, the cells determined to be in a good state are taken out from the observation device, for example, drug discovery research or regenerative medicine It can provide as a cell used for.
  • the estimation result of the number of cells in each observation schedule is stored in the storage unit 43. Furthermore, it is possible to determine the quality of the cells based on the estimation result of the number of cells. Furthermore, only selected good cells can be provided to research institutions.
  • the incubator 11 calculates the number of cells contained in this colony based on the calibration curve information and the area of the colony based on the image obtained by non-invasiveness.
  • a cell number calculation unit 4222 for calculation is provided.
  • the incubator 11 can calculate the number of cells by a non-invasive method and can improve the accuracy of the calculated number of cells.
  • cells determined from the use of images obtained by non-invasive observation for example, phase contrast observation
  • pass / fail determination continue without failure in drug discovery research and regenerative medicine, which are subsequent processes. Can be used.
  • control device 41 treats a plurality of microscope images obtained by imaging a plurality of points (for example, five-point observation or the entire culture container 19) of the same culture container 19 in the same observation time period as an image for one time-lapse observation. It may be.
  • the area calculation part 4211 demonstrated the example which detects the image of a colony based on a whole observation image, it is not restricted to this.
  • the area calculation unit 4211 may detect a colony image by performing image processing on the phase-contrast microscope image.
  • a program for executing each process of the incubator 11 (observation apparatus) in the embodiment of the present invention is recorded on a computer-readable recording medium, and the program recorded on the recording medium is read into a computer system.
  • the various processes described above may be performed by executing.
  • the “computer system” referred to here may include an OS and hardware such as peripheral devices. Further, the “computer system” includes a homepage providing environment (or display environment) if a WWW system is used.
  • the “computer-readable recording medium” means a flexible disk, a magneto-optical disk, a ROM, a writable nonvolatile memory such as a flash memory, a portable medium such as a CD-ROM, a hard disk built in a computer system, etc. This is a storage device.
  • the “computer-readable recording medium” means a volatile memory (for example, DRAM (Dynamic DRAM) in a computer system that becomes a server or a client when a program is transmitted through a network such as the Internet or a communication line such as a telephone line. Random Access Memory)), etc., which hold programs for a certain period of time.
  • the program may be transmitted from a computer system storing the program in a storage device or the like to another computer system via a transmission medium or by a transmission wave in the transmission medium.
  • the “transmission medium” for transmitting the program refers to a medium having a function of transmitting information, such as a network (communication network) such as the Internet or a communication line (communication line) such as a telephone line.
  • the program may be for realizing a part of the functions described above. Furthermore, what can implement

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Abstract

観察装置は、細胞のコロニーが撮像された画像に基づいて、コロニーの面積を算出する面積算出部と、前記面積算出部が面積を算出した対象コロニーに含まれる細胞の数を、前記画像に基づいて算出する細胞数算出部と、前記面積算出部が算出する前記対象コロニーの面積と、前記細胞数算出部が算出する前記対象コロニーに含まれる細胞の数とに基づいて、前記対象コロニーに含まれる細胞の密度を算出する密度算出部とを備える。

Description

観察装置、観察方法、観察システム、そのプログラム、および細胞の製造方法
　本発明は、観察装置、観察方法、観察システム、そのプログラム、および細胞の製造方法に関するものである。
　一般的に、細胞の培養状態を評価する技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングを含む幅広い分野での基盤技術となっている。例えば、再生医療分野では、インビトロで細胞を増殖、分化させるプロセスが存在する。そして、上記のプロセスでは、細胞の分化の成否、細胞の癌化や感染の有無を管理するために、細胞の培養状態を的確に評価することが不可欠である。一例として、マーカーとして転写因子を用いたがん細胞の評価方法が開示されている（特許文献１参照）。
　ＥＳ（Embryonic Stem、胚性幹）細胞またはｉＰＳ（induced Pluripotent Stem、誘導多能性幹）細胞などの幹細胞は、理論上、ほぼすべての組織に分化する分化多能性を保ちつつ、ほぼ無限に増殖させる事ができるため、医薬開発および再生医療への応用に注目が集まっている。
米国特許第７０６０４４５号明細書
　そのような幹細胞を創薬研究や再生医療に応用する際には、状態が良い（コロニーの大きさが適度の大きさであり、コロニー内に存在する細胞の密度が適度な密度）幹細胞を培養する必要があり、そのためには、培養中の細胞株の成熟度を正確に判定することが求められる。しかしながら、従来、研究者の目視によって細胞株の成熟度を判定していたため、細胞株の成熟度の判定精度を向上させることができないという問題があった。
　そこで本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、細胞株の成熟度の判定精度を向上することを可能とする観察装置、観察方法、観察システム、そのプログラム、および細胞の製造方法を提供することを課題とする。
　［１］上記問題を解決するために、本発明の一態様は、細胞のコロニーが撮像された画像に基づいて、コロニーの面積を算出する面積算出部と、前記面積算出部が面積を算出した対象コロニーに含まれる細胞の数を、前記画像に基づいて算出する細胞数算出部と、前記面積算出部が算出する前記対象コロニーの面積と、前記細胞数算出部が算出する前記対象コロニーに含まれる細胞の数とに基づいて、前記対象コロニーに含まれる細胞の密度を算出する密度算出部とを備えることを特徴とする観察装置である。
　［２］また、上記問題を解決するために、本発明の一態様は、培養中の細胞の画像を撮像する撮像部と、上述の観察装置とを備える観察システムである。
　［３］また、上記問題を解決するために、本発明の一態様は、細胞のコロニーが撮像された画像に基づいて、コロニーの面積を算出する面積算出手順と、前記面積算出手順によって面積が算出された対象コロニーに含まれる細胞の数を、前記画像に基づいて算出する細胞数算出手順と、前記面積算出手順によって算出される前記対象コロニーの面積と、前記細胞数算出手順によって算出される前記対象コロニーに含まれる細胞の数とに基づいて、前記対象コロニーに含まれる細胞の密度を算出する密度算出手順とを有する観察方法である。
　［４］また、上記問題を解決するために、本発明の一態様は、コンピュータに、細胞のコロニーが撮像された画像に基づいて、コロニーの面積を算出する面積算出手順と、前記面積算出手順によって面積が算出された対象コロニーに含まれる細胞の数を、前記画像に基づいて算出する細胞数算出手順と、前記面積算出手順によって算出される前記対象コロニーの面積と、前記細胞数算出手順によって算出される前記対象コロニーに含まれる細胞の数とに基づいて、前記対象コロニーに含まれる細胞の密度を算出する密度算出手順とを実行させるためのプログラムである。
　［５］また、上記問題を解決するために、本発明の一態様は、細胞を培養する細胞の培養手順と、前記培養手順において培養される細胞のコロニーを撮像し、撮像されたコロニーの画像に基づいて、コロニーの面積を算出する面積算出手順と、前記面積算出手順によって面積が算出された対象コロニーに含まれる細胞の数を、前記画像に基づいて算出する細胞数算出手順と、前記面積算出手順によって算出される前記対象コロニーの面積と、前記細胞数算出手順によって算出される前記対象コロニーに含まれる細胞の数とに基づいて、前記対象コロニーに含まれる細胞の密度を算出する密度算出手順とを有することを特徴とする細胞の製造方法である。
　本発明によれば、細胞株の成熟度の判定精度を向上することができる。
本発明の実施形態による観察装置の構成の一例を示すブロック図である。 本実施形態の観察装置が備える制御装置の構成の一例を示すブロック図である。 本実施形態の観察装置の正面図である。 本実施形態の観察装置の平面図である。 本実施形態の細胞株毎のコロニー面積の時間変化の一例を示すグラフである。 本実施形態の細胞株毎のコロニー面積と細胞数との関係の一例を示すグラフである。 本実施形態の細胞のコロニー面積とこのコロニーに含まれる細胞の密度との関係の一例を示すグラフである。 本実施形態の撮像装置が撮像した全体観察画像の一例を示す模式図である。 本実施形態のコロニー面積の時間変化と第１の検量線との関係の一例を示すグラフである。 本実施形態の観察装置による検量線登録の動作の一例を示すフローチャートである。 本実施形態の観察装置による細胞数推定動作の一例を示すフローチャートである。
　［実施形態］
　以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。初めに、図１～図４を参照して、本発明の実施形態によるインキュベータ（観察装置）の構成の概要について説明する。図１は、本発明の実施形態によるインキュベータ１１の構成の一例を示すブロック図である。図２は、本実施形態のインキュベータ１１が備える制御装置４１の構成の一例を示すブロック図である。また、図３、図４は、本実施形態のインキュベータ１１の正面図および平面図である。
　このインキュベータ１１とは、細胞を培養するとともに、培養した細胞を顕微鏡カメラによって撮像して、細胞の状態を観察するための装置である。インキュベータ１１は、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３とを有している。インキュベータ１１の組立状態において、上部ケーシング１２は下部ケーシング１３の上に載置される。なお、上部ケーシング１２と下部ケーシング１３との内部空間は、ベースプレート１４によって上下に仕切られている。
　まず、上部ケーシング１２の構成の概要を説明する。上部ケーシング１２の内部には、細胞の培養を行う恒温室１５が形成されている。この恒温室１５は温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂを有しており、恒温室１５内は細胞の培養に適した環境（例えば温度３７℃、湿度９０％の雰囲気）に維持されている（なお、図３、図４での温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂの図示は省略する）。
　恒温室１５の前面には、大扉１６、中扉１７、小扉１８が配置されている。大扉１６は、上部ケーシング１２および下部ケーシング１３の前面を覆っている。中扉１７は、上部ケーシング１２の前面を覆っており、大扉１６の開放時に恒温室１５と外部との環境を隔離する。小扉１８は、細胞を培養する培養容器１９を搬出入するための扉であって、中扉１７に取り付けられている。この小扉１８から培養容器１９を搬出入することで、恒温室１５の環境変化を抑制することが可能となる。なお、大扉１６、中扉１７、小扉１８は、パッキンＰ１、Ｐ２、Ｐ３によりそれぞれ気密性が維持されている。
　また、恒温室１５には、ストッカー２１、観察ユニット２２、容器搬送装置２３、搬送台２４が配置されている。ここで、搬送台２４は、小扉１８の手前に配置されており、培養容器１９を小扉１８から搬出入する。
　ストッカー２１は、上部ケーシング１２の前面（図４の下側）からみて恒温室１５の左側に配置される。ストッカー２１は複数の棚を有しており、ストッカー２１の各々の棚には培養容器１９を複数収納することができる。なお、各々の培養容器１９には、培養の対象となる細胞が培地とともに収容されている。ストッカー２１は、必須のもではない。
　観察ユニット２２は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の右側に配置される。この観察ユニット２２は、培養容器１９内の細胞のタイムラプス観察を実行することができる。
　ここで、観察ユニット２２は、上部ケーシング１２のベースプレート１４の開口部に嵌め込まれて配置される。観察ユニット２２は、試料台３１と、試料台３１の上方に張り出した照明光源を配置するスタンドアーム３２と、観察光学系および撮像装置３４を内蔵した本体部分３３とを有している。そして、試料台３１およびスタンドアーム３２は恒温室１５に配置される一方で、本体部分３３は下部ケーシング１３内に収納される。
　試料台３１は透光性の材質で構成されており、その上に培養容器１９を載置することができる。この試料台３１は水平方向に移動可能に構成されており、上面に載置した培養容器１９の位置を調整できる。また、スタンドアーム３２にはＬＥＤ光源３９が内蔵されている。そして、撮像装置３４は、スタンドアーム３２によって試料台３１の上側から透過照明された培養容器１９の細胞を、顕微光学系を介して撮像することで細胞の顕微鏡画像を取得できる。
　容器搬送装置２３は、上部ケーシング１２の前面からみて恒温室１５の中央に配置される。この容器搬送装置２３は、ストッカー２１、観察ユニット２２の試料台３１および搬送台２４との間で培養容器１９の受け渡しを行う。上記のようにストッカー２１を有しない場合、容器搬送装置２３も不要である。
　図４に示すように、容器搬送装置２３は、多関節アームを有する垂直ロボット３８と、回転ステージ３５と、ミニステージ３６と、アーム部３７とを有している。回転ステージ３５は、垂直ロボット３８の先端部に回転軸３５ａを介して水平方向に１８０°回転可能に取り付けられている。そのため、回転ステージ３５は、ストッカー２１、試料台３１および搬送台２４に対して、アーム部３７をそれぞれ対向させることができる。
　また、ミニステージ３６は、回転ステージ３５に対して水平方向に摺動可能に取り付けられている。ミニステージ３６には培養容器１９を把持するアーム部３７が取り付けられている。
　次に、下部ケーシング１３の構成の概要を説明する。下部ケーシング１３の内部には、観察ユニット２２の本体部分３３や、インキュベータ１１の制御装置４１が収納されている。
　制御装置４１は、温度調整装置１５ａ、湿度調整装置１５ｂ、観察ユニット２２および容器搬送装置２３とそれぞれ接続されている。この制御装置４１は、所定のプログラムに従ってインキュベータ１１の各部を統括的に制御する。
　一例として、制御装置４１は、温度調整装置１５ａおよび湿度調整装置１５ｂをそれぞれ制御して恒温室１５内を所定の環境条件に維持する。また、制御装置４１は、所定の観察スケジュールに基づいて、観察ユニット２２および容器搬送装置２３を制御して、培養容器１９の観察シーケンスを自動的に実行する。さらに、制御装置４１は、観察シーケンスで取得した画像に基づいて、細胞の培養状態の評価を行う培養状態評価処理を実行する。
［細胞のコロニー面積の時間変化を示す検量線（第１の検量線）］
　ここで、図５を参照して、細胞のコロニー面積の時間変化について説明する。
　図５は、細胞株毎のコロニー面積の時間変化の一例を示すグラフである。時間が経過すると細胞が増殖するため、これらの細胞を含むコロニーの面積（以下、単にコロニー面積とも称する。）は、時間の経過によって増大する。このコロニー面積の時間変化は、細胞株毎に異なる。一例として、細胞株Ａのコロニー面積の時間変化は、同図の検量線Ｌ１Ａによって示される。また、細胞株Ｂのコロニー面積の時間変化は、同図の検量線Ｌ１Ｂによって示される。これら検量線Ｌ１Ａと検量線Ｌ１Ｂとを総称して、第１の検量線Ｌ１と称する。細胞株が特定されれば、図５に示す所定の関係、すなわち第１の検量線Ｌ１に基づいて、時間の経過に伴う細胞株のコロニー面積の変化を推定することができる。
　ここで、コロニー面積の時間変化を観察することにより、コロニーが正常に増殖しているか否かを判定することができる。すなわち、あるコロニーのコロニー面積の時間変化量が、標準的なコロニー面積の時間変化量に比べて大きい場合（例えば、コロニー面積が異常に増加している場合）には、このコロニーに含まれる細胞が分化している可能性がある。すなわち、コロニー面積が異常に増加しているコロニーは、細胞が分化しているとみなして異常なコロニーと判定することができる。また、あるコロニーのコロニー面積の時間変化量が、標準的なコロニー面積の時間変化量に比べて小さい場合（例えば、コロニー面積が時間変化しない場合）には、このコロニーに含まれる細胞が死滅している可能性がある。すなわち、コロニー面積が時間変化しないコロニーは、細胞が死滅しているとみなして異常なコロニーと判定することができる。本実施形態のインキュベータ１１は、細胞株毎に、この第１の検量線Ｌ１を予め登録（記憶）しておくことにより、コロニーが正常に増殖しているか否かを判定する。
［細胞のコロニー面積と、このコロニーに含まれる細胞数との関係を示す検量線（第２の検量線）］
　ここで、図６を参照して、細胞のコロニー面積と細胞数との関係について説明する。図６中横軸の単位はμｍ２（マイクロ・平方メートル）であり、縦軸の単位は個である。
　図６は、細胞株毎の１つのコロニーのコロニー面積（以下、コロニー面積）と１つのコロニー内の細胞数（以下、コロニー内の細胞数）との関係の一例を示すグラフである。なお、検量線を作成する際の対象とするコロニーは、ユーザーが見た目で検量線にふさわしいコロニーを選択する。選択する際のポイントは、例えばコロニー同士が接着しておらず、個々のコロニーが独立して存在している者が好ましく選択される。また、コロ二―の大きさが目視で判断し、小さいものから大きいコロニーまで幅広く選択する。これらは目視によりユーザー判断で実施してもよいし、予め選択条件を記憶しておき画像解析により自動判別することも可能である。
細胞のコロニー面積と、このコロニーに含まれる細胞数との間には、所定の関係がある。また、この所定の関係は、細胞株毎に異なる。一例として、細胞株Ａのコロニー面積と、このコロニーに含まれる細胞数との関係は、同図の検量線Ｌ２Ａによって示される。また、細胞株Ｂのコロニー面積と、このコロニーに含まれる細胞数との関係は、同図の検量線Ｌ２Ｂによって示される。これら検量線Ｌ２Ａと検量線Ｌ２Ｂとを総称して、第２の検量線Ｌ２と称する。細胞株が特定されれば、同図に示す第２の検量線Ｌ２に基づいて、この細胞株のコロニー面積から、このコロニーに含まれる細胞数を推定することができる。本実施形態のインキュベータ１１は、細胞株毎に、第２の検量線Ｌ２を予め登録（記憶）しておくことにより、コロニーの画像からこのコロニーに含まれる細胞数を推定（算出）する。具体的には、ある細胞株について、位相差画像と蛍光染色した細胞株の画像である蛍光画像とに基づいて、細胞数とコロニー面積との関係を計測する。また、計測した細胞数とコロニー面積との関係を、第２の検量線Ｌ２として、予め記憶する。
　細胞数を計測するために使用する画像は、例えばコロニー内の細胞を蛍光染色した状態で撮像した画像である。そして取得した画像に対し、予め定めた輝度値を示す細胞を対象として細胞数を計測する。このとき画像から得られた輝度値のデータに対してスムージング処理を施し、このデータを基に予め定めた輝度値を示した細胞を計数する細胞として特定することが可能である。このスムージング処理を行う際の処理レベルを制御することで、細胞を特定するための感度を調整することが可能である。
［細胞のコロニー面積と、このコロニーに含まれる細胞の密度との関係を示す検量線（第３の検量線）］
　ここで、図７を参照して、細胞のコロニー面積とこのコロニーに含まれる細胞の密度との関係について説明する。
　図７は、細胞のコロニー面積とこのコロニーに含まれる細胞の密度との関係の一例を示すグラフである。コロニーに含まれる細胞の密度は、時間の経過に伴う細胞の成熟度に応じて上昇する。また、コロニーに含まれる細胞の密度は、ある成熟度に達すると、時間の経過に伴う変化が少なくなる。これは、コロニーの面積が大きくなるにつれコロニー内の細胞数が増えるが、コロニー内の個々の１細胞あたりの面積の変化は少なることを意味する。
　従って、コロニーに含まれる細胞の密度を観察することにより、細胞の成熟度を判定することができる。
　このコロニーに含まれる細胞の密度は、具体的には、コロニー面積と、このコロニーに含まれる細胞１つあたりの面積との関係によって表す。時間の経過に伴い、細胞が増殖するため、コロニー面積が増加する。このコロニーに含まれる細胞の成熟度が上昇すると、コロニー内部がパッキングされた状態になる。すなわち、コロニーに含まれる細胞が成熟すると、コロニー内部の細胞の密度が上昇する。また、コロニー内部がパッキングされた状態で細胞がさらに増殖すると、細胞の密度が上限に達して密度の上昇が抑えられるとともに、コロニー面積が増大する。したがって、コロニー内部の細胞の密度の時間変化を観察することにより、このコロニーに含まれる細胞の成熟度を判定することができる。
　このコロニーに含まれる細胞の密度は、細胞株毎に異なる。一例として、細胞株Ａのコロニー面積と、このコロニーに含まれる細胞１つあたりの面積との関係は、同図の検量線Ｌ３Ａによって示される。また、細胞株Ｂのコロニー面積と、このコロニーに含まれる細胞１つあたりの面積との関係は、同図の検量線Ｌ３Ｂによって示される。これら検量線Ｌ３Ａと検量線Ｌ３Ｂとを総称して、第３の検量線Ｌ３と称する。細胞株が特定されれば、同図に示す第３の検量線Ｌ３に基づいて、この細胞の成熟度を判定することができる。具体的には、細胞株Ａについて、コロニーに含まれる細胞１つあたりの面積が、同図に示す検量線Ｌ３Ａのしきい値ＴｈＡに達した場合に、この細胞株Ａが成熟したと判定する。また、細胞株Ｂについて、コロニーに含まれる細胞１つあたりの面積が、同図に示す検量線Ｌ３Ｂのしきい値ＴｈＢに達した場合に、この細胞株Ｂが成熟したと判定する。
　すなわち、本実施形態のインキュベータ１１は、細胞株毎に、第３の検量線Ｌ３を予め登録（記憶）しておくことにより、コロニーの画像から細胞の成熟度を判定する。具体的には、検量線を作成するに際し、ある細胞株について、位相差画像と蛍光染色した細胞株の画像である蛍光画像とに基づいて、コロニー面積と、このコロニーに含まれる細胞の密度との関係を計測する。また、計測したコロニー面積と、このコロニーに含まれる細胞の密度との関係を、第３の検量線Ｌ３として、予め記憶する。
　図１に戻り、制御装置４１の構成について説明する。この制御装置４１は、制御部４２、記憶部４３および入力部４４を有している。
　記憶部４３は、ハードディスクや、フラッシュメモリなどの不揮発性の記憶媒体、およびＤＲＡＭやＳＲＡＭなどの揮発性の記憶媒体などにより構成される。この記憶部４３には、ストッカー２１に収納されている各培養容器１９に関する管理データ、撮像装置で撮像された全体観察画像のデータ、および顕微鏡画像のデータが記憶されている。さらに、記憶部４３には、制御部４２によって実行されるプログラムが記憶されている。また、記憶部４３には、制御部４２による種々の演算結果が一時的に記憶される。
　なお、上記の管理データには、（ａ）個々の培養容器１９を示すインデックスデータ、（ｂ）ストッカー２１での培養容器１９の収納位置、（ｃ）培養容器１９の種類および形状（ウェルプレート、ディッシュ、フラスコなど）、（ｄ）培養容器１９で培養されている細胞の種類（細胞株を識別する情報）、（ｅ）培養容器１９の観察スケジュール、（ｆ）タイムラプス観察時の撮像条件（対物レンズの倍率、容器内の観察地点等）、などが含まれている。また、ウェルプレートのように複数の小容器で同時に細胞を培養できる培養容器１９については、各々の小容器毎にそれぞれ管理データが生成される。
　なお、本実施例では、観察対象となる細胞株として異なる種類の細胞株を観察する実施例としている。この場合は、細胞株を識別する情報が必要となるが、観察する細胞株が１つであり、細胞株を識別する必要が無い場合は、細胞株識別情報は必須ではない。もちろん、観察する細胞株が１つでも細胞株を示す情報を入力してもよい。
　また、記憶部４３には、コロニーの面積と当該コロニーに含まれる細胞数との関係を示す検量線情報とが関連付けて記憶されている。
　また、異なる種類の細胞株を観察する場合は、細胞の細胞株を識別する細胞株情報を記憶部４３に記憶し、各情報と関連付けされて記憶することが好ましい。また、当該コロニーの面積の特徴量を示す特徴量情報を記憶し、各情報と関連付けされて記憶することが好ましい。
　入力部４４は、キーボードやマウスなどの入力デバイスを備えている。この入力部４４には、ユーザの操作によって細胞株の情報など様々な情報が入力される。
　次に、図２を参照して制御部４２の構成について説明する。制御部４２は、画像読込部４２０３と、面積算出部４２１１と、書込制御部４２２１と、細胞数算出部４２２２と、密度算出部４２２３とを備えている。
　なお、同図では、第１の検量線Ｌ１に基づいてコロニーの良否を判定する場合を想定し、良否判定部４２２４を備える構成を示している。また、同図では、第３の検量線Ｌ３に基づいて細胞の成熟度を判定する場合を想定し、成熟度判定部４２２５を備える構成を示している。本実施形態のインキュベータ１１において、これら良否判定部４２２４と成熟度判定部４２２５とは必須ではない。
　この制御部４２は、たとえば、制御装置４１の各種の演算処理を実行するプロセッサである。なお、制御部４２は、プログラムの実行によって、画像読込部４２０３と、面積算出部４２１１と、良否判定部４２２４と、成熟度判定部４２２５と、書込制御部４２２１と、細胞数算出部４２２２としてそれぞれ機能してもよい。
　書込制御部４２２１は、制御装置４１の各部が出力する情報の記憶部４３への書き込みを制御する。
　画像読込部４２０３は、撮像装置３４が撮像した全体観察画像または顕微鏡画像の画像データを読み込み、読み込んだ画像データを制御装置４１の各部に供給する。また、画像読込部４２０３は、記憶部４３に記憶されている全体観察画像または顕微鏡画像の画像データを読み込み、読み込んだ画像データを制御装置４１の各部に供給する。
　面積算出部４２１１は、第１の検量線Ｌ１を記憶部４３に記憶させる場合、および撮像装置３４が撮像したコロニーの画像と第１の検量線Ｌ１とに基づいて、コロニーの良否を判定する場合の２つの場合において、コロニーの面積を算出する。ここでは、まず、第１の検量線Ｌ１を記憶部４３に記憶させる場合について説明し、次に第１の検量線Ｌ１に基づいてコロニーの良否を判定する場合について説明する。
　面積算出部４２１１は、コロニー面積を算出するとともに、算出したコロニー面積と、このコロニーに含まれる細胞数とを関連付けた第１の検量線Ｌ１を、検量線情報として書込制御部４２２１を介して記憶部４３に記憶させる。すなわち、面積算出部４２１１は、第１の検量線Ｌ１を記憶部４３に記憶させる。細胞株が複数の場合は、入力部４４を介して細胞株の情報（細胞株ＩＤ）を記憶部４３に記憶させ、細胞株毎に検量線情報を記憶させる。
　細胞株の種類が複数の場合は、細胞株の種類を示す情報（細胞株ＩＤ）の入力が必要である。また、細胞株の種類を示す情報の入力は、観察する細胞株の種類を把握しているユーザが入力してもよいし、また観察する細胞の形態、輝度などの細胞を識別し、マッチング技術等により細胞株の種類を自動判断する技術を用いることで、細胞株の種類を示す情報を自動的に作成し入力することも可能である。
　本実施例では、ユーザから入力部４４を介して細胞株を示す情報（細胞株ＩＤ）を入力するケースについて説明する。
　また、面積算出部４２１１は、細胞のコロニーが撮像された画像に基づいて、コロニーの面積を算出する。この面積算出部４２１１がコロニーの面積を算出する対象の画像の具体例について、図８を参照して説明する。
　図８は、本実施形態の撮像装置３４が撮像した全体観察画像の一例を示す模式図である。同図に示す全体観察画像のうち、全体観察画像ＰＩＣ０１とは、培養開始から１日経過後のコロニー検出結果の画像（フレーム１）である。また、全体観察画像ＰＩＣ０２～全体観察画像ＰＩＣ０５（フレーム１～フレーム５）とは、培養開始から２日経過後～５日経過後のコロニー検出結果の画像である。
　この全体観察画像ＰＩＣ０１には、培養開始から１日経過後の第１のコロニーＣＯ１の画像と、第２のコロニーＣＯ２の画像とが含まれている。また、全体観察画像ＰＩＣ０２には、培養開始から２日経過後の第１のコロニーＣＯ１の画像と、第２のコロニーＣＯ２の画像とが含まれている。同図に示すように、培養開始から２日経過後の第１のコロニーＣＯ１は、培養開始から１日経過後の第１のコロニーＣＯ１に比べて増殖しており、その面積が増大している。また、同図に示すように、培養開始から２日経過後の第２のコロニーＣＯ２は、培養開始から１日経過後の第２のコロニーＣＯ２に比べて増殖しており、その面積が増大している。
　また、全体観察画像ＰＩＣ０３には、培養開始から３日経過後の第１のコロニーＣＯ１の画像と、第２のコロニーＣＯ２の画像と、第３のコロニーＣＯ３の画像が含まれている。同図に示すように、培養開始から３日経過後の第１のコロニーＣＯ１は、培養開始から２日経過後の第１のコロニーＣＯ１に比べて増殖しており、その面積が増大している。また、同図に示すように、培養開始から３日経過後の第２のコロニーＣＯ２は、培養開始から２日経過後の第２のコロニーＣＯ２に比べて増殖しており、その面積が増大している。
　ここで、コロニーの面積の時間変化について、全体観察画像ＰＩＣ０１～全体観察画像ＰＩＣ０３を、時系列に並べて比較して説明する。この場合、第１のコロニーＣＯ１の面積は、全体観察画像ＰＩＣ０１～全体観察画像ＰＩＣ０３において単調に増加している。一方、第２のコロニーＣＯ２の面積は、全体観察画像ＰＩＣ０１～全体観察画像ＰＩＣ０２における増加量と、全体観察画像ＰＩＣ０２～全体観察画像ＰＩＣ０３における増加量とが大きく異なっている。すなわち、第２のコロニーＣＯ２の面積は、全体観察画像ＰＩＣ０１～全体観察画像ＰＩＣ０２における増加量に比べて、全体観察画像ＰＩＣ０２～全体観察画像ＰＩＣ０３における増加量が大きい。つまり、第２のコロニーＣＯ２の面積は、培養開始から３日経過後に急激に大きくなっている。このことは、第２のコロニーＣＯ２が培養開始から３日経過後に分化して異常に増殖した可能性があることを示している。
　ここで、図９を参照して、コロニー面積の時間変化と第１の検量線との関係について説明する。
　図９は、本実施形態のコロニー面積の時間変化と第１の検量線との関係の一例を示すグラフである。同図において横軸は時間を、縦軸はコロニー面積を示す。図９（Ａ）に、コロニーの画像を取得して得られた全体観察画像ＰＩＣ０１に含まれるコロニーの面積を示す。すなわち、図９（Ａ）に、培養開始から１日経過後の第１のコロニーＣＯ１の面積と、第２のコロニーＣＯ２の面積とを示す。同図に示されるように、これら第１のコロニーＣＯ１の面積ＣＯ１１、および第２のコロニーＣＯ２の面積ＣＯ２１は、いずれも第１の検量線Ｌ１上にプロットされる。すなわち、培養開始から１日経過後において、第１のコロニーＣＯ１の面積ＣＯ１１、および第２のコロニーＣＯ２の面積ＣＯ２１は、いずれも正常値を示している。
　また、図９（Ｂ）～（Ｅ）に、コロニーの画像を取得して得られた全体観察画像ＰＩＣ０２～全体観察画像ＰＩＣ０５に含まれるコロニーの面積を、それぞれ示す。このうち、図９（Ｂ）に、培養開始から２日経過後の第１のコロニーＣＯ１の面積ＣＯ１２と、第２のコロニーＣＯ２の面積ＣＯ２２とを示す。同図に示されるように、これら第１のコロニーＣＯ１の面積ＣＯ１２、および第２のコロニーＣＯ２の面積ＣＯ２２は、いずれも第１の検量線Ｌ１上にプロットされる。すなわち、培養開始から２日経過後において、第１のコロニーＣＯ１の面積ＣＯ１２、および第２のコロニーＣＯ２の面積ＣＯ２２は、いずれも正常値を示している。
　図９（Ｃ）に、培養開始から３日経過後の第１のコロニーＣＯ１の面積ＣＯ１３と、第２のコロニーＣＯ２の面積ＣＯ２３とを示す。同図に示されるように、これら第１のコロニーＣＯ１の面積ＣＯ１３は、第１の検量線Ｌ１上にプロットされる。一方、第２のコロニーＣＯ２の面積ＣＯ２３は、第１の検量線Ｌ１上にプロットされない。すなわち、培養開始から３日経過後において、第１のコロニーＣＯ１の面積ＣＯ１２は正常値を示し、第２のコロニーＣＯ２の面積ＣＯ２３は、異常値を示している。このことは、第２のコロニーＣＯ２が培養開始から３日経過後に分化して異常に増殖した可能性があることを示している。つまり、コロニー面積が第１の検量線Ｌ１上に存在するか否かに基づいて、このコロニーの面積が正常値であるのか、異常値であるのかを判定することができる。この例において、第２のコロニーＣＯ２は、コロニー面積が正常なコロニーに比べて大きい状態になっており、培養開始から３日経過後に分化して異常に増殖した可能性があるため、第２のコロニーＣＯ２について以降の培養を中止（例えば、培地から除去）する対応を行う。
　本実施形態において、このコロニーの良否判断は、良否判定部４２２４が行う。すなわち、良否判定部４２２４は、面積算出部４２１１が算出するコロニーの面積の時間経過による変化に基づいて、当該コロニーの良否を判定する。具体的には、良否判定部４２２４は、面積算出部４２１１が算出したコロニー面積と、記憶部４３に記憶されている第１の検量線Ｌ１とに基づいて、コロニーの良否を判定する。
　図８に戻り、培養開始から３日経過後に、これまで存在していなかった第３のコロニーＣＯ３が生じている。これは、ｉＰＳ細胞が通常の細胞と異なり接着のタイミングが不均一であることによる。具体的には、第１のコロニーＣＯ１、第２のコロニーＣＯ２は、培養開始から１日経過後には接着して増殖している。これに対し、第３のコロニーＣＯ３は、培養開始から２日経過後まで接着しておらず、培養開始から３日経過後に接着して増殖を開始している。このように撮像装置３４は、培養開始から時間経過に伴う複数回の撮像によって全体観察画像を生成する。
　また、全体観察画像ＰＩＣ０４（フレーム４）には、培養開始から４日経過後の第１のコロニーＣＯ１の画像と、第２のコロニーＣＯ２の画像と、第３のコロニーＣＯ３の画像が含まれている。同図に示すように、培養開始から４日経過後の第１のコロニーＣＯ１は、培養開始から３日経過後の第１のコロニーＣＯ１に比べて増殖しており、その面積が増大している。また、同図に示すように、培養開始から４日経過後の第２のコロニーＣＯ２は、培養開始から２日経過後の第２のコロニーＣＯ２に比べて増殖しており、その面積が増大している。
　すなわち、撮像装置３４は、培養開始からのタイムラプス画像を撮像する。これにより、本実施形態のインキュベータ１１は、ｉＰＳ細胞のように接着のタイミングが不均一である細胞についても、コロニーの状態を精度よく観察することができる。
　図２に戻り、面積算出部４２１１は、撮像装置３４が撮像した全体観察画像を、画像読込部４２０３から取得する。また、面積算出部４２１１は、取得した全体観察画像に基づいて、図８に示すコロニー検出結果画像（全体観察画像ＰＩＣ０１～全体観察画像ＰＩＣ０５）を生成する。
　また、面積算出部４２１１は、生成したコロニー検出結果画像に基づいて、細胞のコロニーの面積を算出する。具体的には、面積算出部４２１１は、既知の学習機能によるオブジェクト検出アルゴリズムを利用してコロニー部分をマスクし、マスクされた部分（図８のコロニー検出結果画像において曲線に囲まれた領域）をコロニーが存在する領域とし、マスクされた領域からコロニー面積を算出する。なお、コロニー面積の算出方法はこれに限られるものではない。
　細胞数算出部４２２２は、ユーザから入力部４４を介して細胞株を示す情報（細胞株ＩＤ）が入力されると、この細胞株ＩＤを検索キーにして記憶部４３が記憶する検量線情報を検索し、検索の結果に基づいて、細胞株ＩＤが一致する第２の検量線Ｌ２（コロニー面積対細胞数の関係）を取得する。また、細胞数算出部４２２２は、取得した第２の検量線Ｌ２を用い、面積算出部４２１１が算出したコロニーの面積に基づいて細胞数を算出する。つまり、細胞数算出部４２２２は、面積算出部４２１１が面積を算出した対象コロニーに含まれる細胞の数を、撮像装置３４が撮像した画像に基づいて算出する。
　密度算出部４２２３は、面積算出部４２１１が算出するコロニーの面積と、細胞数算出部４２２２が算出するコロニーに含まれる細胞の数とに基づいて、このコロニーに含まれる細胞の密度を算出する。具体的には、密度算出部４２２３は、面積算出部４２１１が算出するコロニー面積と、細胞数算出部４２２２が算出した細胞数とに基づいて、このコロニーに含まれる細胞１つあたりの面積を算出する。
　成熟度判定部４２２５は、密度算出部４２２３が算出する細胞の密度に基づいて、コロニーに含まれる細胞の成熟度を判定する。具体的には、成熟度判定部４２２５は、細胞株Ａについて、コロニーに含まれる細胞１つあたりの面積が、同図に示す検量線Ｌ３Ａのしきい値ＴｈＡに達した場合に、この細胞株Ａが成熟したと判定する。また、成熟度判定部４２２５は、細胞株Ｂについて、コロニーに含まれる細胞１つあたりの面積が、同図に示す検量線Ｌ３Ｂのしきい値ＴｈＢに達した場合に、この細胞株Ｂが成熟したと判定する。
[インキュベータ（観察装置）の動作]
　次に、インキュベータ１１の動作の一例について説明する。このインキュベータ１１は、登録されている検量線に基づいて、細胞のコロニーの面積から、このコロニーに含まれる細胞数を推定することにより、細胞数を算出する。ここで、検量線とは、細胞のコロニーの面積と、このコロニーに含まれる細胞数との関係を示す情報である。ここでは、初めに検量線を登録する動作について説明し、次に登録された検量線に基づいて細胞数を算出する動作について説明する。
　[検量線登録の動作]
　まず、検量線登録の動作について図１０を参照して説明する。
　図１０は、本実施形態のインキュベータ１１（観察装置）による検量線登録の動作の一例を示すフローチャートである。インキュベータ１１は、細胞株毎に検量線（第１の検量線Ｌ１、第２の検量線Ｌ２、および第３の検量線Ｌ３）を記憶する。
　一例として、インキュベータ１１は、上述した画像データに基づいて、この画像データ内のコロニーの画像を検出して、コロニーの画像の面積を算出する。インキュベータ１１は、細胞株ごとに、算出したコロニー面積と、培養開始からの経過時間とを関連付けることにより、ある細胞株についての第１の検量線Ｌ１を登録する。
　また、インキュベータ１１は、細胞株ごとに、算出したコロニー面積と、蛍光染色観察画像により計数されたコロニー内の細胞数とを関連付けることにより、ある細胞株についての第２の検量線Ｌ２を検量線情報として登録する。
　また、インキュベータ１１は、細胞株ごとに、算出したコロニー面積と、このコロニー内における細胞１つあたりの面積とを関連付けることにより、ある細胞株についての第３の検量線Ｌ３を検量線情報として登録する。
　ここで、検量線登録の動作開始前において、制御部４２は、ユーザが入力部４４を介して入力する検量線登録動作の指示を予め受け付けている。この検量線登録動作の指示には、検量線を登録する対象の細胞株を示す情報（細胞株ＩＤ）が含まれている（観察する細胞株が１つである場合は、検量線を登録する対象の細胞株を示す情報（細胞株ＩＤ）の入力は必須ではない。また、記憶部４３には、培養開始から１日経過後から、５日経過後までにそれぞれ観察を開始するように、それぞれの観察開始時刻が、管理データの観察スケジュールとして予め記憶されている。また、ユーザがコロニー内の細胞数を計数する方法が、細胞を蛍光染色し、蛍光観察によって細胞を計数する計数方法など、培養容器１９内の細胞を破壊して観察する方法である場合には、観察回数に応じた数の培養容器１９を用意する。例えば、培養開始から１日経過後、２日経過後、３日経過後にそれぞれ観察する場合には、少なくとも３つの培養容器１９が恒温室１５のストッカー２１に収納されている。これらの培養容器１９には、同一の細胞株がそれぞれ培養されている。これらの培養容器１９を１日あたり１つずつ観察することにより、培養開始から１日経過後から５日経過後までの細胞株を観察する。このインキュベータ１１が行う検量線の作製、即ちコロニー面積の算出および検量線の登録の具体的な動作について、以下説明する。なお、本実施の形態では、インキュベータ１１が備える制御部４２で下記を実行するが、インキュベータ１１に外付けされた制御部で実行してもよい。
　ステップＳ１０１：制御部４２は、記憶部４３の管理データの観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器１９の観察開始時刻が到来したか否かを判定する。観察開始時刻となった場合（ＹＥＳ側）、制御部４２はステップＳ１０２に処理を移行させる。一方、観察時間ではない場合（ＮＯ側）には、制御部４２は次の観察スケジュールの時刻まで待機する。
　ステップＳ１０２：制御部４２は、観察スケジュールに対応する培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９をストッカー２１から搬出して観察ユニット２２の試料台３１に載置する。なお、培養容器１９が試料台３１に載置された段階で、スタンドアーム３２に内蔵されたバードビューカメラ（不図示）によって培養容器１９の全体観察画像が撮像される。これにより、コロニーの画像を含む培養容器１９の画像が撮像される。前述のようにスタッカー２１は必須のものではなく、スタッカー２１が無い場合は、容器の搬送に関わるステップは不要である。
　ステップＳ１０３：制御部４２の画像読込部４２０３は、ステップＳ１０２において撮像された全体観察画像を記憶する。制御部４２の面積算出部４２１１は、記憶された全体観察画像から、コロニーの画像を検出して培養容器１９内の各コロニー細胞の面積、または各コロニーの面積の合計をコロニー面積として算出する。
　検量線を作成する際、コロニー画像を含む培養容器の画像を取得し、蛍光観察画像から各コロニーの細胞数をカウント（または各コロニーの細胞数を合計）し、位相差画像からコロニー面積を算出してもよい。または、血球計算板によって各コロニーの細胞数の合計をカウントし、位相差画像からコロニー面積を算出してもよい。
　ステップＳ１０４：制御部４２は、観察スケジュールの終了後に培養容器１９の小扉１８への搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９を観察ユニット２２の試料台３１から小扉１８の位置に搬送する。
　ステップＳ１０５：ユーザは、小扉１８を開いて培養容器１９を取り出す。また、ユーザは、取り出した培養容器１９について、既知の方法によって細胞数を計数する。例えば、ユーザは蛍光染色により細胞数を計数する。また、ユーザは、計数した細胞数を入力部４４に入力する。また、ここで、ユーザは、コロニー内の細胞の密度を算出し、算出した密度を入力部４４に入力する。
　ステップＳ１０６：制御部４２の書込制御部４２２１は、入力部４４に入力されたコロニー内の細胞数およびコロニー内の細胞の密度と、ステップＳ１０３において算出されたコロニー面積と、細胞株を示す情報（細胞株ＩＤ）とを関連付けて、記憶部４３に記憶させる。これにより、記憶部４３には、コロニー面積と細胞数と細胞株ＩＤとが関連付けられて検量線情報として記憶される（１つの細胞株の観察の場合は細胞株IＤとの関連付けは必須ではない）。その後、制御部４２は、観察シーケンスを終了して処理をステップＳ１０１に処理を戻す。
　このようにしてステップＳ１０１～ステップＳ１０６を繰り返すことにより、検量線情報が記憶部４３に記憶される。また、複数の細胞株について、ステップＳ１０１～ステップＳ１０６を繰り返すことにより、複数の細胞株それぞれについての検量線情報が記憶部４３に記憶される。具体的には、細胞株Ａ、細胞株Ｂのそれぞれについて、ステップＳ１０１～ステップＳ１０６を繰り返すことにより、細胞株Ａの検量線情報、細胞株Ｂの検量線情報が記憶部４３にそれぞれ記憶される。
　[細胞数推定の動作及び細胞の良否判定]
　次に、図１１を参照しつつ、インキュベータ１１の細胞数推定動作の一例を説明する。
　図１１は、本実施形態のインキュベータ１１（観察装置）による細胞数推定動作の一例を示すフローチャートである。本実施例では、観察対象となる特定の細胞株のコロニー面積の変化に対する細胞数に関するデータ（対比データと称する）を取得し、予め記憶しているものとする。このデータからは観察する細胞の良否の判定は不明な状態である。
　インキュベータ１１は、恒温室１５内に搬入された培養容器１９を、登録された観察スケジュールに従ってタイムラプス観察する。この培養容器１９には、特定の複数種類の細胞株が培養されている。例えば、培養容器１９のうち、培養容器１９Ａには、細胞株Ａが培養されている。また、培養容器１９のうち、培養容器１９Ｂには、細胞株Ｂが培養されている。インキュベータ１１は、観察スケジュールに従って、この培養容器１９Ａ、培養容器１９Ｂを順次、垂直ロボット３８観察ユニット２２に搬送して、培養容器１９の全体の画像（全体観察画像）と、培養容器１９の一部を拡大した顕微鏡画像とを撮像する。また、上述した検量線情報の登録手順によって、この細胞株Ａの検量線情報、細胞株Ｂの検量線情報が記憶部４３に予め記憶されている。このインキュベータ１１のタイムラプス観察における細胞数推定の動作について、以下説明する。
　ステップＳ２０１：制御部４２は、記憶部４３の管理データの観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器１９の観察開始時間が到来したか否かを判定する。観察開始時間となった場合（ＹＥＳ側）、制御部４２はステップＳ２０２に処理を移行させる。一方、培養容器１９の観察時間ではない場合（ＮＯ側）には、制御部４２は次の観察スケジュールの時刻まで待機する。
　ステップＳ２０２：制御部４２は、観察スケジュールに対応する培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９をストッカー２１から搬出して観察ユニット２２の試料台３１に載置する。なお、培養容器１９が試料台３１に載置された段階で、スタンドアーム３２に内蔵されたバードビューカメラ（不図示）によって培養容器１９の全体観察画像が撮像される。
　本実施例においては、図１、３、４に示す観察装置は観察する細胞を培養する恒温室を備えた装置である。したがって、ステップＳ２０２で撮像する細胞は、観察装置の恒温室で培養されたものとなる。したがって、本ステップは、細胞を培養するステップから開始することも可能である。また本実施例のように、観察装置内に恒温室が備わったものでなくてもよく、細胞を培養するための恒温室が観察装置とは別体となった装置でもよい。
　ステップＳ２０３：コロニー内の細胞数を算出する細胞数算出部４２２２は、記憶部４３に記憶されている管理データから細胞株を示す情報（細胞株ＩＤ）を取得する。
　ステップＳ２０４：細胞数算出部４２２２は、取得した細胞株ＩＤを検索キーにして記憶部４３が記憶する検量線情報を検索し、細胞株ＩＤが一致する検量線情報を取得する。
　ステップＳ２０５：画像読込部４２０３は、ステップ２０２において撮像された画像を取得する。この画像には、コロニーの画像が含まれている。
　ステップＳ２０６：面積算出部４２１１は、ステップＳ２０５において取得された画像に基づいて、この画像に含まれるコロニーの面積を算出する。
　ステップＳ２０７：細胞数算出部４２２２は、ステップＳ２０６で算出されたコロニーの面積と、ステップＳ２０４で取得された検量線情報のうちの第２の検量線Ｌ２とに基づいて、細胞数を推定（算出）する。
面積算出部４２１１は、取得した画像中の認識されたコロニーの面積を算出する。
　なお、このステップは、観察ユニットへ培養容器が搬送され(Ｓ２０２)た後、観察が可能な状態になったら実行してもよい。この場合は、コロニー面積を算出した後に細胞株を示す情報を取得する。
　ステップＳ２０８：密度算出部４２２３は、ステップＳ２０６で算出されたコロニーの面積と、ステップＳ２０７で算出された細胞数とに基づいて、細胞の密度を算出する。
　ステップＳ２０９：良否判定部４２２４を備える場合には、良否判定部４２２４は、取得した画像から算出されたコロニー面積と、ステップＳ２０４で取得された検量線情報のうちの第１の検量線Ｌ１とに基づいて、コロニーの良否を判定する。なお、良否判定部４２２４を備えない場合には、算出されたコロニー面積と、ステップＳ２０４で取得された検量線情報のうちの第１の検量線Ｌ１とに基づいて、ユーザが、コロニーの良否を判定する。
　また、成熟度判定部４２２５を備える場合には、成熟度判定部４２２５は、取得した画像を用い、ステップＳ２０６で算出されたコロニーの面積と、ステップＳ２０８で算出された細胞の密度と、ステップＳ２０４で取得された検量線情報のうちの第３の検量線Ｌ３とに基づいて、細胞の成熟度を判定する。なお、成熟度判定部４２２５を備えない場合には、ステップＳ２０６で算出されたコロニーの面積と、ステップＳ２０８で算出された細胞の密度と、ステップＳ２０４で取得された検量線情報のうちの第３の検量線Ｌ３とに基づいて、ユーザが、細胞の成熟度を判定する。
　ステップＳ２１０：制御部４２は、観察スケジュールの終了後に培養容器１９の搬送を容器搬送装置２３に指示する。そして、容器搬送装置２３は、指示された培養容器１９を観察ユニット２２の試料台３１からストッカー２１の所定の収納位置に搬送する。その後、制御部４２は、観察シーケンスを終了してＳ２０１に処理を戻す。
　この他、ステップＳ２０９における判定の結果、細胞が良好な状態にあるか否かが把握できた後、良好な状態にあると判定された細胞を観察装置から取り出し、例えば、創薬研究や再生医療に用いる細胞として提供することができる。
　このようにして細胞株毎にステップＳ２０１～ステップＳ２１０を繰り返すことにより、各観察スケジュールにおける細胞数の推定結果が、記憶部４３に記憶される。更に細胞数の推定結果を基に細胞の良否の判定を行うことが可能となる。更に、選別された良好な細胞のみを研究機関等に提供することができる。
　以上説明したように、本実施形態のインキュベータ１１（観察装置）は、検量線情報と、非侵襲により得られた画像を基にしたコロニーの面積とに基づいて、このコロニーに含まれる細胞数を算出する細胞数算出部４２２２を備えている。これにより、インキュベータ１１は、非侵襲的な方法により細胞数を算出することができるとともに、算出する細胞数の精度を向上させることができる。また、成熟度判定や良否判定に際し非侵襲の観察（例えば位相差観察）で得られる画像を用いることから判定された細胞はその後の工程である創薬研究や再生医療に障害なく、継続して使用することが可能となる。
　なお、制御装置４１は、同じ培養容器１９の複数ポイント（例えば５点観察または培養容器１９の全体）を同じ観察時間帯で撮像した複数の顕微鏡画像を、タイムラプス観察の１回分の画像として扱うようにしてもよい。
　なお、面積算出部４２１１は、全体観察画像に基づいてコロニーの画像を検出する例について説明したが、これに限られない。面積算出部４２１１は、位相差顕微鏡画像を画像処理することにより、コロニーの画像を検出してもよい。
　また、本発明の実施形態におけるインキュベータ１１（観察装置）の各処理を実行するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、当該記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより、上述した種々の処理を行ってもよい。
　なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものであってもよい。また、「コンピュータシステム」は、ＷＷＷシステムを利用している場合であれば、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）も含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、フラッシュメモリ等の書き込み可能な不揮発性メモリ、ＣＤ－ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。
　さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムが送信された場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリ（例えばＤＲＡＭ（Dynamic Random Access Memory））のように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。また、上記プログラムは、このプログラムを記憶装置等に格納したコンピュータシステムから、伝送媒体を介して、あるいは、伝送媒体中の伝送波により他のコンピュータシステムに伝送されてもよい。ここで、プログラムを伝送する「伝送媒体」は、インターネット等のネットワーク（通信網）や電話回線等の通信回線（通信線）のように情報を伝送する機能を有する媒体のことをいう。また、上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良い。さらに、前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるもの、いわゆる差分ファイル（差分プログラム）であってもよい。
　以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
　１１…観察装置、４１…制御装置、４２１１…面積算出部、４２２２…細胞数算出部、４２２３…密度算出部、４２２４…良否判定部、４２２５…成熟度判定部、４３…記憶部
 
 
 
 

Claims (14)

  1. 　細胞のコロニーが撮像された画像に基づいて、コロニーの面積を算出する面積算出部と、
    　前記面積算出部が面積を算出した対象コロニーに含まれる細胞の数を、前記画像に基づいて算出する細胞数算出部と、
    　前記面積算出部が算出する前記対象コロニーの面積と、前記細胞数算出部が算出する前記対象コロニーに含まれる細胞の数とに基づいて、前記対象コロニーに含まれる細胞の密度を算出する密度算出部と、
    　を備えることを特徴とする観察装置。
  2. 　前記密度算出部は、
    　前記対象コロニーに含まれる細胞１つあたりの面積を、前記密度として算出する
    　　　ことを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
  3. 　コロニーの面積と、当該コロニーに含まれる細胞の数との関係を示す情報が予め記憶されている記憶部
    　をさらに備え、
    　　　前記細胞数算出部は、
    　前記画像に含まれる前記対象コロニーの面積と、前記記憶部に記憶されている前記関係を示す情報とに基づいて、前記対象コロニーに含まれる細胞の数を算出する
    　　　ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の観察装置。
  4. 　前記記憶部に記憶される細胞の数に関わる情報は蛍光観察により取得された画像から得られ、前記対象コロニーの面積は位相差観察により取得された画像から得られるものである
    　ことを特徴とする請求項３に記載の観察装置。
  5. 　前記面積算出部が算出するコロニーの面積の時間経過による変化に基づいて、当該コロニーの良否を判定する良否判定部
    　をさらに備えることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の観察装置。
  6. 　前記画像とは、時間経過に伴う複数回の撮像によって生成されるタイムラプス画像である
    　ことを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の観察装置。
  7. 　前記密度算出部が算出する前記密度に基づいて、前記対象コロニーに含まれる細胞の成熟度を判定する成熟度判定部
    　をさらに備えることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の観察装置。
  8. 　前記成熟度判定部は、前記対象コロニーに含まれる細胞１つあたりの面積が予め定められた細胞１つの面積に関わるしきい値を基に前記対象コロニーが成熟したと判定する
    　ことを特徴とする請求項７に記載の観察装置。
  9. 　前記しきい値は、前記対象コロニーに含まれる細胞１つあたりの面積が時間経過によっても変化が少なくなる状態であることに基づき定められる
    　ことを特徴とする請求項８に記載の観察装置。
  10. 　培養中の細胞の画像を撮像する撮像部と、
    　請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の観察装置と
    　を備える観察システム。
  11. 　細胞のコロニーが撮像された画像に基づいて、コロニーの面積を算出する面積算出手順と、
    　前記面積算出手順によって面積が算出された対象コロニーに含まれる細胞の数を、前記画像に基づいて算出する細胞数算出手順と、
    　前記面積算出手順によって算出される前記対象コロニーの面積と、前記細胞数算出手順によって算出される前記対象コロニーに含まれる細胞の数とに基づいて、前記対象コロニーに含まれる細胞の密度を算出する密度算出手順と、
    　を有する観察方法。
  12. 　コンピュータに、
    　細胞のコロニーが撮像された画像に基づいて、コロニーの面積を算出する面積算出手順と、
    　前記面積算出手順によって面積が算出された対象コロニーに含まれる細胞の数を、前記画像に基づいて算出する細胞数算出手順と、
    　前記面積算出手順によって算出される前記対象コロニーの面積と、前記細胞数算出手順によって算出される前記対象コロニーに含まれる細胞の数とに基づいて、前記対象コロニーに含まれる細胞の密度を算出する密度算出手順と、
    　を実行させるためのプログラム。
  13. 　細胞を培養する細胞の培養手順と、
    　前記培養手順において培養される細胞のコロニーを撮像し、撮像されたコロニーの画像に基づいて、コロニーの面積を算出する面積算出手順と、
    　前記面積算出手順によって面積が算出された対象コロニーに含まれる細胞の数を、前記画像に基づいて算出する細胞数算出手順と、
    　前記面積算出手順によって算出される前記対象コロニーの面積と、前記細胞数算出手順によって算出される前記対象コロニーに含まれる細胞の数とに基づいて、前記対象コロニーに含まれる細胞の密度を算出する密度算出手順と、
    　を有することを特徴とする細胞の製造方法。
  14. 　請求項１３に記載の細胞の製造方法により製造された細胞。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019138571A1 (ja) * 2018-01-15 2019-07-18 オリンパス株式会社 細胞解析装置及び細胞解析システム
WO2019138572A1 (ja) * 2018-01-15 2019-07-18 オリンパス株式会社 細胞解析装置及び細胞解析システム
JPWO2018142702A1 (ja) * 2017-01-31 2019-11-14 株式会社ニコン 培養支援装置、観察装置、及びプログラム
WO2020075635A1 (ja) * 2018-10-12 2020-04-16 株式会社ニコン 画像処理装置、画像処理方法、プログラム、及び評価方法
JP2020156419A (ja) * 2019-03-27 2020-10-01 オリンパス株式会社 細胞観察システムおよび細胞観察方法
WO2021059488A1 (ja) 2019-09-27 2021-04-01 株式会社ニコン 情報処理装置、情報処理方法、情報処理プログラム、及び情報処理システム
WO2021059487A1 (ja) 2019-09-27 2021-04-01 株式会社ニコン 情報処理装置、情報処理方法、情報処理プログラム、及び情報処理システム

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11609537B2 (en) * 2017-03-02 2023-03-21 Shimadzu Corporation Cell analysis method and cell analysis system using a holographic microscope
CN118840317A (zh) 2018-10-12 2024-10-25 株式会社尼康 传代时期算出装置、传代时期算出系统及传代时期算出方法
CN109669262A (zh) * 2019-02-21 2019-04-23 江苏斯托利仪器仪表有限公司 一种电动智能荧光显微镜

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011024485A (ja) * 2009-07-24 2011-02-10 Olympus Corp 細胞画像解析装置
WO2012117647A1 (ja) * 2011-02-28 2012-09-07 三洋電機株式会社 観察プログラムおよび観察装置
WO2012127879A1 (ja) * 2011-03-24 2012-09-27 株式会社ニコン 培養装置、培養装置システム、培養操作管理方法およびプログラム
JP2012231709A (ja) * 2011-04-28 2012-11-29 Hamamatsu Photonics Kk 細胞解析方法、細胞解析装置、および細胞解析プログラム
JP2014018186A (ja) * 2012-07-23 2014-02-03 Tokyo Electron Ltd 多能性幹細胞の評価方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5989835A (en) 1997-02-27 1999-11-23 Cellomics, Inc. System for cell-based screening
US7796815B2 (en) * 2005-06-10 2010-09-14 The Cleveland Clinic Foundation Image analysis of biological objects
WO2011016189A1 (ja) * 2009-08-07 2011-02-10 株式会社ニコン 細胞の分類手法、この手法を用いた画像処理プログラム及び画像処理装置、並びに細胞塊の製造方法
JP5510463B2 (ja) * 2010-01-20 2014-06-04 株式会社ニコン 細胞観察装置及び細胞培養方法
WO2014132841A1 (ja) * 2013-02-28 2014-09-04 株式会社日立国際電気 人物検索方法及びホーム滞留人物検索装置
EP3008229B1 (en) 2013-06-10 2020-05-27 President and Fellows of Harvard College Early developmental genomic assay for characterizing pluripotent stem cell utility and safety

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011024485A (ja) * 2009-07-24 2011-02-10 Olympus Corp 細胞画像解析装置
WO2012117647A1 (ja) * 2011-02-28 2012-09-07 三洋電機株式会社 観察プログラムおよび観察装置
WO2012127879A1 (ja) * 2011-03-24 2012-09-27 株式会社ニコン 培養装置、培養装置システム、培養操作管理方法およびプログラム
JP2012231709A (ja) * 2011-04-28 2012-11-29 Hamamatsu Photonics Kk 細胞解析方法、細胞解析装置、および細胞解析プログラム
JP2014018186A (ja) * 2012-07-23 2014-02-03 Tokyo Electron Ltd 多能性幹細胞の評価方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3156477A4 *

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2018142702A1 (ja) * 2017-01-31 2019-11-14 株式会社ニコン 培養支援装置、観察装置、及びプログラム
US20190347798A1 (en) * 2017-01-31 2019-11-14 Nikon Corporation Culturing assistance device, observation device and program
EP3578633A4 (en) * 2017-01-31 2020-09-02 Nikon Corporation CULTURE AID DEVICE, OBSERVATION DEVICE, AND PROGRAM
US11640664B2 (en) 2017-01-31 2023-05-02 Nikon Corporation Culturing assistance device, observation device and program
JP7139359B2 (ja) 2018-01-15 2022-09-20 株式会社エビデント 細胞解析装置及び細胞解析システム
WO2019138572A1 (ja) * 2018-01-15 2019-07-18 オリンパス株式会社 細胞解析装置及び細胞解析システム
WO2019138571A1 (ja) * 2018-01-15 2019-07-18 オリンパス株式会社 細胞解析装置及び細胞解析システム
JPWO2019138572A1 (ja) * 2018-01-15 2021-01-21 オリンパス株式会社 細胞解析装置及び細胞解析システム
US11920123B2 (en) 2018-01-15 2024-03-05 Evident Corporation Cell analyzing device and cell analyzing system
US11953498B2 (en) 2018-10-12 2024-04-09 Nikon Corporation Image processing device, image processing method, program, and evaluation method
JPWO2020075635A1 (ja) * 2018-10-12 2021-10-14 株式会社ニコン 画像処理装置、画像処理方法、プログラム、及び評価方法
JP7351311B2 (ja) 2018-10-12 2023-09-27 株式会社ニコン 画像処理装置、画像処理方法、プログラム、及び評価方法
WO2020075635A1 (ja) * 2018-10-12 2020-04-16 株式会社ニコン 画像処理装置、画像処理方法、プログラム、及び評価方法
JP7210355B2 (ja) 2019-03-27 2023-01-23 株式会社エビデント 細胞観察システム、コロニー生成位置推定方法、推論モデル生成方法、およびプログラム
JP2020156419A (ja) * 2019-03-27 2020-10-01 オリンパス株式会社 細胞観察システムおよび細胞観察方法
WO2021059487A1 (ja) 2019-09-27 2021-04-01 株式会社ニコン 情報処理装置、情報処理方法、情報処理プログラム、及び情報処理システム
WO2021059488A1 (ja) 2019-09-27 2021-04-01 株式会社ニコン 情報処理装置、情報処理方法、情報処理プログラム、及び情報処理システム
US12367618B2 (en) 2019-09-27 2025-07-22 Nikon Corporation Information processing device, information processing method, information processing program, and information processing system

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