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WO2015160089A1 - 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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WO2015160089A1
WO2015160089A1 PCT/KR2015/002472 KR2015002472W WO2015160089A1 WO 2015160089 A1 WO2015160089 A1 WO 2015160089A1 KR 2015002472 W KR2015002472 W KR 2015002472W WO 2015160089 A1 WO2015160089 A1 WO 2015160089A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bacteriophage
φcj27
kccm11465p
coli
active ingredient
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/KR2015/002472
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English (en)
French (fr)
Inventor
김재원
신은미
배기덕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
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Publication date
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Priority to CN201580020154.XA priority patent/CN106232806B/zh
Priority to BR112016023613-0A priority patent/BR112016023613B1/pt
Priority to JP2016561664A priority patent/JP6324535B2/ja
Priority to EP15780499.8A priority patent/EP3133152B1/en
Publication of WO2015160089A1 publication Critical patent/WO2015160089A1/ko
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    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences

Definitions

  • the present invention relates to a novel bacteriophage that exhibits specific killing ability against enterotoxin E. coli, a composition comprising the same, and a method for preventing or treating an infectious disease in an animal using the new bacteriophage or the composition.
  • Escherichia coli (referred to as Escherichia coli, hereinafter, 'E.coli') is a single rod of the Gram-negative enterobacteria belonging to the (Enterobacteriaceae) in Escherichia (Escherichia), top views of existing in a variety of animals, including mammals, One of the bacterial guns. E. coli is most non-pathogenic and can cause opportunistic infections. However, some highly pathogenic strains are known to cause various intestinal diseases and sepsis in animals including humans.
  • E. coli Enterotoxigenic E. coli , ETEC), Enteropathogenic E. coli (EPEC), Enterohemorrhagic E. coli (EHEC), Enteroaggregative E. coli (EAEC) ), Enteroinvacive E. coli (EIEC), and necrotoxigenic E. coli (NTEC), among which enterotoxin E. coli is known to cause E. coli infectious diseases in pigs.
  • bacteriophage refers to a bacterial specific virus that infects certain bacteria to inhibit and inhibit the growth of infected bacteria. Bacteriophage not only has stronger host specificity than antibiotics, but also recently, the problem of the emergence of resistant bacteria to antibiotic use and the residual problem of antibiotics in meat have increased interest in its use.
  • the inventors of the present invention have repeatedly studied to solve the emergence of resistant bacteria by the use of antibiotics and the problem of residual meat in antibiotics, and to effectively prevent and treat E. coli infectious diseases.
  • Bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) has been separated from nature.
  • An object of the present invention is to provide a novel bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) having a specific killing ability to enterococci.
  • an object of the present invention is to provide a composition for the prevention and / or treatment of infectious diseases caused by enterotoxin Escherichia coli, comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide an antibiotic, feed additives, drinking water additives, feed, drinking water, disinfectant or cleaning agent containing the bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide a method for preventing and / or treating E. coli infectious diseases of animals other than humans by using the bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) or a composition comprising the same as an active ingredient.
  • One aspect of the present invention provides a novel bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) having a killing ability specific to enterococci.
  • the bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) comprising an active ingredient, it provides a composition for the prevention or treatment of infectious diseases caused by enterococci E. coli.
  • an antibiotic, feed additive, drinking water additives, feed, drinking water, disinfectant or cleaning agent comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) as an active ingredient.
  • the method comprising the step of administering the bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) or a composition comprising the same as an active ingredient to an animal other than a human, a method for preventing or treating an infectious disease caused by enterococci E. coli To provide.
  • Bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) of the present invention has the effect of specifically killing enterococci E. coli.
  • the bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) of the present invention is excellent in acid resistance and heat resistance can be utilized as a material for the prevention or treatment of infectious diseases caused by enterocoliosis E. coli in a variety of temperature and pH range, the bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) ) As an active ingredient, has an effect that can be utilized as antibiotics, feed additives, drinking water additives, feed, drinking water, disinfectant or cleaning agent.
  • the present invention provides an antibiotic comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) or an active ingredient thereof, highly specific to pathogenic Escherichia coli compared to conventional antibiotics can kill only certain pathogens without killing the fungi, drug resistance Does not induce has the effect of extending the product life compared to conventional antibiotics.
  • the present invention has the effect of preventing or treating infectious diseases caused by enterotoxin Escherichia coli by administering the bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) or a composition comprising the same as an active ingredient to animals other than humans.
  • KCCM11465P novel bacteriophage ⁇ CJ27
  • Figure 2 shows the PFGE results of the novel bacteriophage ⁇ CJ27.
  • Figure 3 shows the SDS-PAGE results of the novel bacteriophage ⁇ CJ27.
  • Figure 4 is a graph showing the acid resistance test results of the novel bacteriophage ⁇ CJ27.
  • 5 is a graph showing the results of the heat resistance test at 60 °C of novel bacteriophage ⁇ CJ27.
  • One aspect of the present invention provides a novel bacteriophage ⁇ CJ27 (KCCM11465P) (hereinafter, ' ⁇ CJ27') having a killing ability specific to Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC).
  • KCCM11465P novel bacteriophage ⁇ CJ27
  • ETEC Enterotoxigenic Escherichia coli
  • Enterotoxin Escherichia coli is a gram-negative bacillus that breaks down lactose and fructose into acid and gaseous anaerobes. Enterotoxin Escherichia coli grows well in normal medium and can be grown at a temperature of about 7 ° C. to 48 ° C., and an optimal growth temperature may be about 35 ° C. to 37 ° C. In addition, enterotoxin E. coli can be developed in the range of pH 4.5 to pH 9.
  • E. coli produces toxins similar to cholera bacteria ( Vibrio cholerae ), so if you are infected with E. coli, you may have a similar condition to cholera.
  • the toxin produced is classified into two types, a heat-labile enterotoxin (LT) and a heat-stable enterotoxin (ST).
  • the dither toxin is a toxin that loses activity when heated at about 60 ° C. for about 10 minutes and the heat resistant toxin refers to a toxin that does not lose activity even when heated at about 100 ° C. for about 30 minutes.
  • Enterocoliogenic Escherichia coli grows in the upper part of the small intestine, and enterococci infectious diseases including Escherichia coli occur when the concentration of enterococci Escherichia coli reaches from about 10 7 cfu (colony formation unit) to 10 8 cfu per unit volume (1 ml) of serous fluid. It can be triggered.
  • Bacteriophage is a bacteria-specific virus that infects certain bacteria to inhibit and inhibit the growth of the bacteria.
  • a bacteriophage means a virus that contains single or double-chain DNA (Deoxyribonucleic acid) or RNA (Ribonucleic acid) as a genetic material. do.
  • bacteriophage ⁇ CJ27 of one embodiment of the present invention is a bacteriophage having species specificity that selectively infects enterotoxin pathogenic E. coli, and has a structure in which an elongated head and a contractile tail are observed.
  • a bacteriophage belonging to morphological myoviridae (see FIG. 1).
  • the result of comparing the homology of the base sequence of bacteriophage ⁇ CJ27 with the translational base sequence of other bacteriophages is shown in [Table 1].
  • the acid resistance of bacteriophage ⁇ CJ27 was stable without loss of activity from pH 2.0 to pH 5.0 (FIG. 4), and the heat resistance showed a decrease in activity of less than 1 log until exposed for 1 hour at 60 ° C. (FIG. 5).
  • the DNA base sequence of bacteriophage ⁇ CJ27 is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the bacteriophage ⁇ CJ27 is a bacteriophage newly isolated by the present inventors, and was deposited on the Korean Culture Center of Microorganisms (361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea) on October 25, 2013 with the deposit number KCCM11465P.
  • composition for the prevention or treatment of infectious diseases caused by enterotoxin E. coli comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 as an active ingredient.
  • the bacteriophage ⁇ CJ27 can be used for the purpose of preventing or treating diseases caused by infection with enterocoliogenic Escherichia coli, since it exhibits an antimicrobial activity that can specifically kill enterococci.
  • enterotoxin Escherichia coli infectious diseases using the bacteriophage ⁇ CJ27 may include Escherichia coli (Colibacillosis), and specifically, but not limited to, Colibacillosis in pigs.
  • coliform bacterium refers to a disease caused by infection of an Escherichia coli bacterium, and the symptoms include sepsis, diarrhea (neoplastic diarrhea and post-weaning diarrhea), ischemia (edema disease and cerebrospinal vascular disease).
  • sepsis is an acute systemic infection mainly occurring in the neonatal period within 2 to 3 days of life, and mortality is quite high.
  • Diarrhea is the cause of death or developmental disability due to multiple intestinal infections occurring immediately after mammalian and weaning within one to two weeks of age. Toxemia usually occurs in piglets 8 to 12 weeks old after weaning, swelling and neurological symptoms often occur suddenly.
  • prevention means any action that inhibits the disease or delays the disease by providing the animal with a composition comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 and / or the bacteriophage ⁇ CJ27 as an active ingredient.
  • treatment refers to any action that improves or ameliorates the symptoms of a disease that is already infected by providing an animal with a composition comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 and / or the bacteriophage ⁇ CJ27 as an active ingredient.
  • composition for preventing or treating an infectious disease caused by the enterotoxic Escherichia coli of the present embodiment may contain the bacteriophage ⁇ CJ27 at 5 ⁇ 10 2 to 5 ⁇ 10 12 pfu / ml, and specifically, the bacteriophage ⁇ CJ27 at 1 ⁇ 10. 6 to 1 ⁇ 10 10 pfu / ml.
  • composition for preventing or treating an infectious disease caused by the enterotoxic Escherichia coli of the present embodiment may further include a pharmaceutically acceptable carrier, and may be formulated together with the carrier to provide a food, medicine, feed additive or drinking water additive.
  • a pharmaceutically acceptable carrier refers to a carrier or diluent that does not irritate an organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • the kind of the carrier usable in this embodiment is not particularly limited, and any carrier can be used as long as it is a conventionally used and pharmaceutically acceptable carrier in the art.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and the like. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • additives such as antioxidants, buffers and / or bacteriostatic agents may be added and used, and diluents, dispersants, surfactants, binders, and / or lubricants may be added in addition to aqueous solutions, suspensions, emulsions, and the like. It may be formulated into the same injectable formulation, pills, capsules, granules or tablets and the like.
  • the mode of administration of the composition for preventing or treating an infectious disease caused by the enterococcal Escherichia coli of the present embodiment is not particularly limited and may be in accordance with a method commonly used in the art.
  • the composition may be administered by oral or parenteral administration.
  • Non-limiting examples of such oral dosage forms include troches, lozenges, tablets, aqueous suspensions, oily suspensions, prepared powders, granules, emulsions, hard capsules, soft capsules, syrups or elixirs ( elixirs).
  • composition of the present invention into a formulation such as tablets or capsules, lactose, Saccharose, Sorbitol, Mannitol, starch, Amylopectin, Cellulose or Gelatin, etc. Same binder; Excipients such as dicalcium phosphate and the like; Disintegrants such as corn starch or sweet potato starch; Lubricating oils such as magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate, polyethylene glycol wax, and the like; In addition to one substance, it may further contain a liquid carrier such as fatty oil.
  • a liquid carrier such as fatty oil.
  • parenteral administration of the composition of the present embodiment for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration or topical administration may be used, and the method of applying or spraying the composition to a diseased site may also be used. May be used, but is not limited to these.
  • Formulations for parenteral administration include, for example, injectable forms such as subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection; Suppository injection mode; Or it may be formulated for spraying, such as aerosols to enable inhalation through the respiratory tract, but is not limited thereto.
  • injectable formulations the compositions of this embodiment may be mixed in water with stabilizers or buffers to prepare solutions or suspensions and formulated for unit administration of ampoules or vials.
  • a propellant or the like may be combined with the additives to disperse the dispersed concentrate or wet powder.
  • Suitable application, spraying, or dosage of the composition for the prophylaxis or treatment of an infectious disease by the enterococcal Escherichia coli of the present embodiment may be administered, as well as the formulation method, mode of administration, time of administration, and / or route of administration of the composition. It may vary depending on factors such as the age, weight, sex of the animal, the severity of disease symptoms, the foods eaten, the rate of excretion, etc. In general, a skilled veterinarian will readily determine and prescribe a dosage that is effective for the desired treatment. Can be.
  • an antibiotic comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 as an active ingredient.
  • antimicrobial refers to an agent that is provided to an animal including a human in the form of a drug and has an effect of killing bacteria, and corresponds to the concept of a preservative, a fungicide, and an antimicrobial agent.
  • Antibiotics comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 of the present embodiment as an active ingredient has a very high specificity against enterotoxin Escherichia coli as compared to conventional antibiotics and can kill only certain pathogens without killing the fungi, and do not induce drug resistance as compared to conventional antibiotics. There is an advantage that can be used as a new antibiotic with an extended product life.
  • a feed additive or drinking water additive comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 as an active ingredient.
  • the feed additive or drinking water additive of the present embodiment may be prepared by separately preparing the bacteriophage ⁇ CJ27 or a composition containing the same in the form of a feed additive or drinking water additive, or mixing the feed or drinking water, or the bacteriophage ⁇ CJ27 or a composition comprising the same. Or it can be used by adding directly in the preparation of drinking water.
  • composition comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 or the bacteriophage ⁇ CJ27 used as the feed additive or drinking water additive of the present invention may be in a liquid or dry state, for example, may be in the form of a dried powder.
  • the bacteriophage ⁇ CJ27 of the present invention may be mixed in the form of a powder of 0.05 to 10% by weight, specifically 0.1 to 2% by weight of the feed additive weight.
  • the drying method for preparing the feed additive or drinking water additive of the present embodiment in the form of a dried powder is not particularly limited, and a method commonly used in the art may be used.
  • Non-limiting examples of the drying method include ventilation drying, natural drying, spray drying, freeze drying and the like. These may be used alone or in a manner using two or more methods together.
  • the feed additive or drinking water additive of the present embodiment may further include other non-pathogenic microorganisms.
  • the microorganisms that can be added include Bacillus subtilis , such as Bacillus subtilis , which can produce proteolytic enzymes, lipolytic enzymes and / or sugar converting enzymes; Lactic acid bacteria, such as Lactobacillus sp., Which have physiological activity and organic matter degradability under anaerobic conditions such as cattle stomach; Filamentous fungi, such as Aspergillus oryzae , which have the effect of increasing the body weight of the animal, increasing the milk yield of the milk, and increasing the digestion absorption rate of the feed; And yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and the like. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • the feed additive or drinking water additive including the bacteriophage ⁇ CJ27 of the present embodiment as an active ingredient may further include other additives as necessary.
  • the additives that can be used include binders, emulsifiers, preservatives, etc., added to prevent deterioration of feed or drinking water; Amino acids, vitamins, enzymes, probiotics, flavors, nonprotein nitrogen compounds, silicates, buffers, colorants, extractants, or oligosaccharides are added to increase the usefulness of feed or drinking water. It can be included as. These may be used alone or two or more kinds may be added together.
  • the feed additive of the present invention may be contained in 0.05 to 10 parts by weight, specifically, 0.1 to 2 parts by weight based on 100 parts by weight of feed.
  • the drinking water additive of the present invention may be contained in an amount of 0.001 to 0.01 parts by weight, specifically 0.001 to 0.005 with respect to 100 parts by weight of drinking water. It may be contained in parts by weight. Within this range there is an advantage that the activity of bacteriophage ⁇ CJ27 to enterotoxin Escherichia coli is fully exhibited.
  • a feed additive or drinking water additive comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 as an active ingredient is added to the feed or drinking water, or the feed or drinking water prepared by adding the bacteriophage ⁇ CJ27 directly to the feed or drinking water.
  • the feed used in this embodiment is not particularly limited and may be used a feed commonly used in the art.
  • Non-limiting examples of the feed include, but are not limited to, vegetable feeds such as cereals, fruits, food processing by-products, algae, fibres, pharmaceutical by-products, oils, starches, gourds or grain by-products; And animal feeds such as proteins, minerals, fats and oils, minerals, fats and oils, single cell proteins, zooplankton or foods. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • the drinking water used in the present embodiment is not particularly limited, and drinking water conventionally used in the art may be used.
  • a bacteriophage ⁇ CJ27 is provided as an active ingredient, and provides a disinfectant or cleaning agent.
  • the formulation of the disinfectant or detergent is not particularly limited and may be prepared and used in a formulation known in the art.
  • the disinfectant may be sprayed to remove enterocoliogenic Escherichia coli and may be applied to an active area of an animal, a slaughterhouse, a dead zone, a cooking place or a cooking facility, but is not limited thereto.
  • the cleaning agent may be used for washing the skin surface or parts of the body of an animal exposed to or likely to be exposed to enterotoxin E. coli, but is not limited thereto.
  • a method for preventing or treating an infectious disease caused by enterotoxin E. coli by using the composition comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 or the bacteriophage ⁇ CJ27 as an active ingredient.
  • the method for preventing or treating the present invention specifically includes a composition comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 or the bacteriophage ⁇ CJ27 as an active ingredient in a pharmaceutically effective amount in a subject other than a human who is infected with or at risk of being infected with enterococci.
  • Administering Suitable daily total use of the bacteriophage ⁇ CJ27 or a composition comprising the same may be determined by a physician within the scope of good medical judgment, which is obvious to those of ordinary skill in the art.
  • the specific pharmaceutically effective amount of the composition comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 or the bacteriophage ⁇ CJ27 as an active ingredient for a particular animal is determined by the type and extent of the reaction to be achieved, the age, weight, general state of health, sex or diet of the individual. , May be determined in consideration of the administration time of the bacteriophage ⁇ CJ27 or a composition comprising the same, the route of administration and the ratio of the composition, the duration of treatment, etc. It may vary according to similar factors well known in the art.
  • composition comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 or the bacteriophage ⁇ CJ27 of the present embodiment as an active ingredient may be administered by spraying nasal to the animal in the form of a pharmaceutical preparation, or added directly to the feed or drinking water of the animal to be fed thereto.
  • the mixture may be administered to the feed or drinking water.
  • the route and mode of administration of the composition comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 or the bacteriophage ⁇ CJ27 of the present embodiment as an active ingredient is not particularly limited, and any bacteriophage ⁇ CJ27 or a composition comprising the same may be reached in the desired tissue.
  • the composition comprising the bacteriophage ⁇ CJ27 or the bacteriophage ⁇ CJ27 as an active ingredient may be administered through various routes of oral or parenteral, non-limiting examples of the route of administration, oral, rectal, topical, intravenous, intraperitoneal And intramuscular, intraarterial, transdermal, nasal or inhaled.
  • the soft agar overlay method refers to a method of observing bacteriophage lysis using host cells grown in top-agar (attached on a solid medium using 0.7% agar).
  • bacteriophage Since one type of bacteriophage is known to exist in one lysate, it was intended to separate a single bacteriophage from the formed lysate. Specifically, the bacteriophage was added to 400 ⁇ l of SM solution (NaCl 5.8 g / L; MgSO 4 7H 2 O 2 g / L; 1M Tris-Cl (pH 7.5) 50 mL) and left at room temperature for 4 hours for bacteriophage. A solution was obtained. Subsequently, 100 ⁇ l of the bacteriophage solution was added to 5 ml of 0.7% (w / v) agar and enterococci coli (UK27) shake culture (OD 600).
  • SM solution NaCl 5.8 g / L
  • MgSO 4 7H 2 O 2 g / L 1M Tris-Cl (pH 7.5) 50 mL
  • the solution was recovered, 1% (v / v) chloroform was added, mixed for 10 minutes and centrifuged at 4,000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant, which was filtered through a 0.45 ⁇ m filter to obtain a final sample.
  • Example 1-1 The bacteriophage obtained in Example 1-1 was cultured in large quantities using enterocoliogenic Escherichia coli (UK27), and the bacteriophage was purified therefrom.
  • enterocoliogenic Escherichia coli UK27
  • enterotoxin Escherichia coli (UK27) was shaken and cultured to 1.5 ⁇ 10 10 cfu, centrifuged at 4,000 rpm for 10 minutes, and resuspended in 4 ml SM solution.
  • chloroform was added to 1% (v / v) of the final volume and stirred for 20 minutes.
  • the restriction enzymes DNase I and RNase A were added to a final concentration of 1 ⁇ g / ml, respectively, Allow to stand for minutes.
  • sodium chloride and polyethylene glycol were added so that the final concentrations were 1 M and 10% (w / v), respectively, and further left at 4 ° C. for 3 hours, and centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. to obtain a precipitate.
  • the obtained precipitate was suspended in a 5 ml SM solution, left to stand at room temperature for 20 minutes, stirred by addition of 1 ml chloroform, and centrifuged at 4,000 rpm at 4 ° C. for 20 minutes to obtain a supernatant.
  • the supernatant was filtered with a 0.45 ⁇ m filter, followed by ultracentrifugation (35,000 rpm, 1 hour, 4 ° C.) using glycerol density gradient (density: 40%, 5% glycerol) to purify the bacteriophage.
  • the present inventors collected a sample from pig nutrients, named the bacteriophage having a specific killing ability against enterotoxin E. coli as "Bacteriophage ⁇ CJ27", and the Korean Culture Center of Microorganisms, October 25, 2013 It was deposited with No. KCCM11465P in 361-221, Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul.
  • Bacteriophage ⁇ CJ27 purified in Example 1 was diluted in 0.01% gelatin solution and fixed with 2.5% glutaraldehyde solution. It was added dropwise to a carbon-coated mica plate (carbon-coated mica plate (ca. 2.5 mm ⁇ 2.5 mm)) for 10 minutes and then washed with sterile distilled water. The carbon film was placed on a copper grid, dyed for 60 seconds in 2% uranyl acetate, dried and examined under a transmission electron microscope (JEM-1011, 120 kV, magnification x 200,000). (FIG. 1).
  • FIG. 1 shows a transmission electron micrograph of bacteriophage ⁇ CJ27, which belongs to Myoviridae because it shows a morphotype consisting of a contractile tail with an elongated head.
  • bacteriophage ⁇ CJ27 which belongs to Myoviridae because it shows a morphotype consisting of a contractile tail with an elongated head.
  • Genomic DNA was extracted from the bacteriophage ⁇ CJ27 purified in Example 1 above.
  • the supernatant was mixed with an equal volume of chloroform and centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at room temperature to obtain the supernatant.
  • 3M sodium acetate was added to the supernatant so that 10% (v / v) of the total volume was added, mixed with 2 times the volume of cold 95% ethanol, and allowed to stand at -20 ° C for 1 hour. .
  • Figure 2 is an electrophoresis picture of genomic DNA of bacteriophage ⁇ CJ27, it can be seen that the genomic DNA of bacteriophage ⁇ CJ27 is more than 98 kb.
  • M is DNA as a standard for measuring size.
  • Figure 3 is an electrophoresis picture showing the SDS-PAGE results performed on the bacteriophage ⁇ CJ27, the major proteins of about 27.9 kDa, 51.8 kDa and 74.5 kDa size can be confirmed.
  • the DNA of the bacteriophage ⁇ CJ27 was analyzed using a genetic analyzer FLX titanium sequencer (Roche). Genes were combined using Macrogen Inc., using GS and de novo assembler software (Roche). An open reading frame was performed using GeneMArk.hmm, Glimmer v3.02 and FGENESB software. The name of the transcription analysis framework was annotated using BLASTP and the InterProScan program.
  • the base sequence of the bacteriophage showed various similarities to the base sequence of the previously reported bacteriophage (Enterobacteria phage HX01, complete genome), but it was confirmed that there is no bacteriophage in which all fragments were 100% identical. As a result, the bacteriophages could be identified as newly isolated bacteriophages.
  • Table 1 shows the result of comparing the homology of the base sequence of bacteriophage ⁇ CJ27 with the translational base sequence of other bacteriophages.
  • the DNA sequence of the prepared bacteriophage ⁇ CJ27 was analyzed using a genetic analyzer.
  • pH solutions sodium acetate buffer solution (pH 4.0 and pH 5.0), sodium citrate buffer solution (pH 2.0 and pH 3.0) were prepared at 0.2 M each for the experiment.
  • Figure 4 shows the acid resistance test results of the bacteriophage ⁇ CJ27. As shown in Figure 4, compared to the control bacteriophage ⁇ CJ27 was confirmed that the stable without losing the activity from pH 2.0 to pH 5.0.
  • Figure 5 shows the heat resistance test results of bacteriophage ⁇ CJ27. As shown in FIG. 5, bacteriophage ⁇ CJ27 showed a decrease in activity of about 1 log or less until exposed for 1 hour at 60 ° C., and activity of 1 log or more was reduced at 120 minutes of exposure.
  • bacteriophage ⁇ CJ27 shows the ability to infect the F-serum type F4, F5, F6, F18, etc., which is a major cause of swine diarrhea in a general pig farm, and has excellent efficiency in the field application. It is expected to indicate.

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Abstract

본 발명은 신규 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) 및 이를 유효 성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) 또는 상기 조성물을 이용하여 인간을 제외한 동물의 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물
본 발명은 장독소성 대장균에 특이적인 사멸능을 나타내는 신규 박테리오파지, 이를 포함하는 조성물 및 상기 신규 박테리오파지 또는 상기 조성물을 이용하여 동물의 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
대장균 (Escherichia coli, 이하, 'E.coli'라 한다)은 장내 세균과 (Enterobacteriaceae) 에스케리키아속 (Escherichia)에 속하는 그람 음성의 단간균으로, 포유동물을 비롯한 다양한 동물의 장관 내에 존재하는 정상 세균총 중의 하나이다. 대장균은 대부분 비병원성으로 기회 감염을 유발할 수 있으나 일부 고병원성 균주는 사람을 비롯한 동물 내에서 다양한 장 질환 및 패혈증 등을 유발하는 것으로 알려져 있다.
대장균의 종류에는 장독소성 대장균 (Enterotoxigenic E.coli, ETEC), 장병원성 대장균 (Enteropathogenic E.coli, EPEC), 장출혈성 대장균 (Enterohemorrhagic E.coli, EHEC), 장응집성 대장균 (Enteroaggregative E.coli, EAEC), 장침입성 대장균 (Enteroinvacive E.coli, EIEC), 괴사소성 대장균 (Necrotoxigenic E.coli, NTEC) 등이 있으며, 이들 중 특히 장독소성 대장균은 양돈에서 대장균 감염성 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다.
현재, 양돈 산업의 대규모 집단 사육 추세에 따라 돼지의 대장균증은 양돈장에서 가장 흔하고 또 문제시되는 질병으로 대두되고 있다. 최근 우리 나라에서도 돼지의 대장균증 발생이 증가하여 설사로 인한 어린 돼지의 성장 지연 및 폐사로 사육 농가에 경제적으로 커다란 손실을 초래하고 있는 실정이다.
이러한 돼지 대장균증을 예방 및 치료하기 위하여 종래에는 돼지에 여러 항생제들을 사용하여 왔으나, 항생제를 오남용하는 경우 돼지에 내성을 유발하거나 항생제들이 돼지 체내에 잔류할 가능성이 있어 현재는 전세계적으로 항생제 투여에 많은 제한을 두고 있다.
한편, 박테리오파지(bacteriophage)는 특정 세균을 감염시켜 감염된 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스를 의미한다. 박테리오파지는 항생제에 비하여 숙주 특이성이 강할 뿐만 아니라, 최근 들어 항생제 사용에 대한 내성균 출현의 문제 및 항생제의 육류 내 잔류 문제 등이 심각해짐에 따라 그 활용에 대한 관심이 높아지고 있다.
이에 세계 여러 나라에서 박테리오파지에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 박테리오파지에 대한 특허 출원은 물론, 이를 활용한 조성물에 대하여 미국식품의약국 (Food and Drug Administration, FDA)의 승인 등을 취득하려는 움직임이 증가하고 있는 추세이다.
그러나, 양돈을 비롯한 축산업에 있어서 중요한 문제가 되고 있는 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 박테리오파지 관련 기술은 여전히 부족한 실정이며, 따라서 이러한 박테리오파지 및 그 관련 기술의 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 항생제 사용에 의한 내성균의 출현 및 항생제의 육류 내 잔류 문제 등을 해결하고 대장균 감염성 질병을 효율적으로 예방 및 치료하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 장독소성 대장균에 대하여 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)를 자연계에서 분리해 내기에 이르렀다.
또한, 상기 신규 박테리오파지의 형태적, 생화학적, 유전적 특성을 동정하고 상기 박테리오파지가 내산성 및 내열성 등이 뛰어남을 확인하여 이를 활용한 항생제, 소독제, 사료 첨가제, 기타 조성물 등을 개발하였고, 나아가 대장균 감염성 질병의 예방 또는 치료를 위한 조성물 및 이를 이용한 질병의 예방 또는 치료 방법을 개발하였다.
본 발명은 장독소성 대장균에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는, 항생제, 사료 첨가제, 음용수 첨가제, 사료, 음용수, 소독제 또는 세척제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) 또는 이를 유효 성분으로 포함하는 조성물을 이용하여, 인간을 제외한 동물의 장독소성 대장균 감염성 질병을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태는, 장독소성 대장균에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)를 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는 항생제, 사료 첨가제, 음용수 첨가제, 사료, 음용수, 소독제 또는 세척제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) 또는 이를 유효 성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)은 장독소성 대장균을 특이적으로 사멸시키는 효과를 갖는다.
또한, 본 발명의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)은 내산성 및 내열성이 우수하여 다양한 온도 및 pH 범위에서 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 물질로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효성분으로 포함하는, 항생제, 사료 첨가제, 음용수 첨가제, 사료, 음용수, 소독제 또는 세척제 등으로 활용될 수 있는 효과를 갖는다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) 또는 이를 유효 성분으로 포함하는 항생제를 제공하여, 종래 항생제에 비하여 병원성 대장균에 대한 특이성이 매우 높아 익균은 죽이지 않고 특정 병원균만을 사멸시킬 수 있으며, 약물 내성을 유도하지 않아 종래의 항생제에 비하여 제품 수명이 연장되는 효과를 갖는다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) 또는 이를 유효 성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 효과를 갖는다.
도 1은 신규 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)(이하, 'ΦCJ27')의 전자 현미경 사진이다.
도 2는 신규 박테리오파지 ΦCJ27의 PFGE 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 신규 박테리오파지 ΦCJ27의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 신규 박테리오파지 ΦCJ27의 내산성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 신규 박테리오파지 ΦCJ27의 60 ℃에서의 내열성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 당해 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 발명의 일 양태는, 장독소성 대장균 (Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)에 특이적인 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) (이하, 'ΦCJ27')을 제공한다.
장독소성 대장균은 그람 음성의 간균으로 락토오스 (Lactose), 프럭토오스 (Fructose)를 분해하여 산과 가스를 생성하는 호기성 또는 통성 혐기성균이다. 장독소성 대장균은 보통의 배지에서도 잘 자라며 약 7℃ 내지 48℃의 온도에서 발육 가능하고 발육 최적 온도는 약 35℃ 내지 37℃일 수 있다. 또한 장독소성 대장균은 pH 4.5 내지 pH 9의 범위에서 발육 가능하다.
장독소성 대장균은 콜레라균 (Vibrio cholerae)과 유사한 독소를 생산하기 때문에 장독소성 대장균에 감염되면 콜레라에 감염된 경우와 유사한 병증을 나타낼 수 있게 된다. 상기 생산되는 독소는 크게 이열성 독소 (heat-labile enterotoxin, LT) 및 내열성 독소 (heat-stable enterotoxin, ST) 두 가지로 구별된다. 상기 이열성 독소는 약 60℃에서 약 10분 동안 가열하는 경우 활성을 잃는 독소이고 상기 내열성 독소는 약 100℃에서 약 30분 동안 가열하여도 활성을 잃지 않는 내성을 나타내는 독소를 말한다.
장독소성 대장균은 소장 상부에서 증식하며, 장독소성 대장균의 농도가 장액의 단위 부피 (1 ml)당 약 107 cfu (colony formation unit) 내지 108 cfu에 도달한 경우에 대장균증을 비롯한 대장균 감염성 질병을 유발할 수 있게 된다.
박테리오파지 (bacteriophage)는 특정 세균에 감염하여 당해 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스로, 단일 혹은 이중 사슬의 DNA (Deoxyribonucleic acid) 또는 RNA (Ribonucleic acid)를 유전 물질로 포함하는 바이러스를 의미한다.
구체적으로, 본 발명의 일 양태의 박테리오파지 ΦCJ27은 장독소성 병원성 대장균을 선택적으로 감염시키는 종 특이성을 갖는 박테리오파지로서, 긴 머리 (elongated head)를 가지며 수축성이 있는 꼬리 (contractile tail)가 관찰되는 구조를 갖는, 형태학상 마이오비리데 (Myoviridae)에 속하는 박테리오파지이다(도 1 참조).
박테리오파지 ΦCJ27의 염기서열과 다른 박테리오파지의 해독 염기 서열의 상동성을 비교한 결과는 [표 1]과 같다. 박테리오 파지 ΦCJ27의 내산성에 있어서는 pH 2.0부터 pH 5.0까지 활성을 잃지 않고 안정적이며(도 4), 내열성에 있어서는 60 ℃에서 1시간 동안 노출되었을 때까지는 1 로그 이하의 활성 감소를 나타내었다(도 5). 박테리오파지 ΦCJ27의 DNA 염기서열은 서열목록상의 서열번호 1과 같다.
상기 박테리오파지 ΦCJ27은 본 발명자들이 신규 분리한 박테리오파지로서, 2013년 10월 25 일자로 한국 미생물 보존 센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 KCCM11465P으로 기탁되었다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 박테리오파지 ΦCJ27은 장독소성 대장균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 항균 활성을 나타내기 때문에 장독소성 대장균에 의한 감염으로 유발되는 질병들을 예방하거나 치료하기 위한 목적으로 이용될 수 있다. 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 이용한 장독소성 대장균 감염성 질병의 예로 대장균증 (Colibacillosis)을 들 수 있고, 구체적으로 돼지 대장균증 (Colibacillosis in pigs)을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "대장균증"이란, 동물에 병원성 대장균이 감염되어 발생하는 질병을 의미하며 그 증상으로 패혈증, 설사 (신생기 설사 및 이유 후 설사), 독혈증 (부종병 및 뇌척수혈관증) 등이 나타난다. 이 중에서 패혈증은 생후 2일 내지 3일 이내의 신생기에 주로 발생하는 급성의 전신 감염증으로 폐사율이 상당히 높다. 설사는 1주 내지 2주령 이내의 포유기 및 이유 직후에 다발하는 장관 감염증으로 폐사 또는 발육 장애의 원인이 된다. 독혈증은 이유 후 8주 내지 12주령의 자돈에서 주로 발병하며 부종 및 신경 증상을 나타내다 급사를 일으키는 경우가 빈번히 발생한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"이란, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 및/또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 동물에 제공하여 해당 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"란, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 및/또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 동물에 제공하여 이미 감염된 해당 질병의 증세를 호전시키거나 개선시키는 모든 행위를 의미한다.
본 양태의 상기 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 5×102 내지 5×1012 pfu/㎖로 함유할 수 있으며, 구체적으로, 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 1×106 내지 1×1010 pfu/㎖로 함유할 수 있다.
본 양태의 상기 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.
본 양태에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 및/또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 양태의 상기 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
상기 경구 투여용 제형의 비제한적인 예로는, 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제(elixirs) 등을 들 수 있다.
본 양태의 조성물을 정제 또는 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스 (Saccharose), 솔비톨 (Sorbitol), 만니톨 (Mannitol), 전분, 아밀로펙틴 (Amylopectin), 셀룰로오스 (Cellulose) 또는 젤라틴 (Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 (dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘 (magnesium stearate), 스테아르산 칼슘 (calcium stearate), 스테아릴 푸마르산 나트륨 (sodium stearyl fumarate) 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 (polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 함유할 수 있다.
본 양태의 조성물을 비경구 투여하는 방법으로는 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이들에 제한되는 것은 아니다.
상기 비경구 투여를 위한 제형으로는, 예를 들어 피하 주사, 정맥 주사 또는 근육 내 주사 등의 주사용 형태; 좌제 주입 방식; 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있으나 이에 제한되지 아니한다. 상기 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 양태의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 (ampoule) 또는 바이알 (vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 상기 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 양태의 상기 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물의 적합한 도포, 분무 또는 투여량은, 상기 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로는 물론, 투여 대상이 되는 동물의 나이, 체중, 성별, 질병 증상의 정도, 섭취하는 음식, 배설 속도 등과 같은 요인들에 의해 다양해 질 수 있으며, 일반적으로 숙련된 수의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.
본 발명에 사용되는 용어 "항생제"란, 약제 형태로 인간을 포함한 동물에 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 효능을 갖는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭하는 개념에 해당한다.
본 양태의 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 항생제는 종래 항생제에 비하여 장독소성 대장균에 대한 특이성이 매우 높아 익균은 죽이지 않고 특정 병원균만을 사멸시킬 수 있으며, 약물 내성을 유도하지 않아 종래의 항생제에 비하여 제품 수명이 연장된 신규 항생제로 이용될 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 제공한다.
본 양태의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제는 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 이를 포함하는 조성물을 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료 또는 음용수에 혼합시키는 방식으로 사용되거나, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 이를 포함하는 조성물을 사료 또는 음용수 제조 시 직접 첨가하는 방식으로 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제로 사용되는 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 포함하는 조성물은 액상 또는 건조 상태일 수 있으며, 예를 들어, 건조된 분말 형태일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 박테리오파지 ΦCJ27는 분말 형태로 사료 첨가제 중량의 0.05 내지 10 중량%, 구체적으로 0.1 내지 2 중량%의 성분비로 혼합될 수 있다.
본 양태의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 건조된 분말 형태로 제조하기 위한 건조 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 상기 건조 방법의 비제한적인 예로는, 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조, 동결 건조 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 가지 이상의 방법을 함께 이용하는 방식으로 수행될 수 있다.
본 양태의 상기 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제에는 비병원성의 다른 미생물이 추가로 첨가될 수 있다. 상기 첨가될 수 있는 미생물의 비제한적인 예로는, 단백질 분해 효소, 지질 분해 효소 및/또는 당 전환 효소를 생산할 수 있는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 등과 같은 고초균; 소의 위와 같은 혐기적 조건에서 생리적 활성 및 유기물 분해능을 갖는 락토바실러스 균주 (Lactobacillus sp.)등과 같은 유산균; 가축의 체중을 증가시키며 우유의 산유량을 늘리고 사료의 소화 흡수율을 높이는 효과를 갖는 아스퍼질러스 오리자에 (Aspergillus oryzae) 등과 같은 사상균; 및 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 등과 같은 효모로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 양태의 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제는 필요에 따라 기타 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 사용 가능한 첨가제의 비제한적인 예로는, 사료 또는 음용수의 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등; 사료 또는 음용수의 효용 증대를 위하여 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백질태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제 또는 올리고당 등이 있으며, 그 외에 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 함께 첨가될 수 있다.
본 발명의 상기 사료 첨가제는 사료 100 중량부에 대하여, 0.05 내지 10 중량부로 함유될 수 있으며, 구체적으로, 0.1 내지 2 중량부로 함유될 수 있다. 본 발명의 상기 음용수 첨가제는 음용수 100 중량부에 대하여, O.0001 내지 0.01 중량부로 함유될 수 있으며, 구체적으로 0.001 내지 0.005 중량부로 함유될 수 있다. 상기 범위 내에서 장독소성 대장균에 대한 박테리오파지 ΦCJ27의 활성이 충분히 발휘되는 이점이 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 사료 또는 음용수에 첨가하거나, 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 사료 또는 음용수에 직접 첨가하여 제조된 사료 또는 음용수를 제공한다
본 양태에서 사용되는 사료는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 양태에서 사용되는 음용수는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 음용수를 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는, 소독제 또는 세척제를 제공한다. 상기 소독제 또는 세척제의 제형은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 알려진 제형으로 제조되어 사용될 수 있다.
상기 소독제는 장독소성 대장균을 제거하기 위하여 살포될 수 있으며 동물의 활동 영역, 도축장, 폐사 지역, 조리 장소 또는 조리 설비 등에 살포될 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.
상기 세척제는 장독소성 대장균에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 동물의 피부 표면 또는 신체 각 부위 등을 세척하는 용도로 사용될 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 장독소성 대장균에 의해 감염되었거나 감염될 위험이 있는 인간을 제외한 대상체에 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 이를 포함하는 조성물의 적합한 1일 총 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 의사에 의해 결정될 수 있으며 이는 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명한 사항이다.
특정 동물에 대한 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물의 구체적인 약학적 유효량은, 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 해당 개체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 또는 식이는 물론, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 이를 포함하는 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간 등을 고려하여 결정될 수 있으며, 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있다.
본 양태의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에 분무식 비강 투여되거나, 동물의 사료 또는 음용수에 직접 첨가되어 이를 섭식시키는 방식으로 투여될 수 있으며, 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제의 형태로 사료 또는 음용수에 혼합되어 투여될 수 있다.
본 양태의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 조직에 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 이를 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 즉, 상기 박테리오파지 ΦCJ27 또는 상기 박테리오파지 ΦCJ27을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] - 장독소성 대장균에 감염하는 박테리오파지의 분리
<실시예 1-1>
박테리오파지 스크리닝 및 단일 박테리오파지 분리
충청도 홍성군 광천 지역의 삼화원종 농장 지역의 양돈 분변 및 환경 샘플로부터 수득한 시료 50 ㎖를 4,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 그 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 시료액을 준비하고 이를 이용하여 소프트 아가 오버레이 (soft agar overlay) 방법을 수행하였다. 상기 소프트 아가 오버레이 방법이란 탑-아가 (top-agar, 0.7% 한천을 이용하여 고체 배지 위에 붙이는 것)에서 성장하는 숙주세포를 이용하여 박테리오파지가 용균하는 것을 관찰하는 방법을 말한다.
구체적으로, 건국대학교 수의학과에서 분리한 장독소성 대장균 (UK27) 진탕 배양액 (OD600 = 2) 150 ㎕와 10×LB 배지 (트립토판 (tryptone) 10 g/ℓ; 효모 추출물 5 g/ℓ; NaCl 10 g/ℓ) 2 ㎖에 상기 시료 여과액 18 ㎖를 혼합하고 이를 30℃에서 18시간 동안 배양한 다음, 상기 배양액을 4,000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 그 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하였다. 그 다음, LB 평판 배지 위에 0.7%(w/v) 한천 5㎖와 장독소성 대장균 (UK27) 진탕 배양액 (OD600 = 2) 150 ㎕의 혼합액을 부어 굳힌 후, 그 위에 상기 시료액 10 ㎕를 적가하고 30℃에서 18시간 동안 배양하여 용균반이 형성됨을 확인하였다.
하나의 용균반에는 한 종류의 박테리오파지가 존재한다고 알려져 있기 때문에, 상기 형성된 용균반으로부터 단일 박테리오파지를 분리하고자 하였다. 구체적으로, 상기 용균반을 400 ㎕의 SM 용액 (NaCl 5.8 g/ℓ; MgSO47H2O 2 g/ℓ; 1M Tris-Cl (pH 7.5) 50 ㎖)에 가하고 실온에서 4시간 동안 방치하여 박테리오파지 용액을 수득하였다. 이어서, 상기 박테리오파지 용액 100 ㎕를 0.7%(w/v) 한천 5 ㎖ 및 장독소성 대장균 (UK27) 진탕 배양액 (OD600 = 2) 150 ㎕와 혼합하고 150 mm 지름의 LB 평판 배지를 이용한 소프트 아가 오버레이 방법을 수행하였으며, 완전히 용균될 때까지 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 LB 평판 배지에 5 ㎖의 SM 용액을 가하고 실온에서 4시간 동안 방치하여 박테리오파지 용액을 수득하였다.
상기 용액을 회수하고, 1%(v/v) 클로로포름을 가한 다음, 10분간 혼합하고 4,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 수득하였으며 상기 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 최종 시료를 수득하였다.
<실시예 1-2>
박테리오파지의 대량 배양 및 정제
상기 실시예 1-1에서 수득한 박테리오파지를 장독소성 대장균 (UK27)을 이용하여 대량으로 배양하고 이로부터 박테리오파지를 정제하였다.
구체적으로, 장독소성 대장균 (UK27)을 진탕 배양하여 1.5×1010 cfu가 되도록 분주하여 4,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 이를 4 ㎖ SM 용액에 재부유시켰다. 여기에 상기 박테리오파지를 1.5×107 pfu로 접종하고 MOI (multiplicity of infection) = 0.001로 적정한 다음, 상온에서 20분간 정치시켰다. 이어서, 이를 150 ㎖ LB 배지에 접종하고 30℃에서 5시간 동안 배양하였다.
배양이 종료된 후, 최종 부피의 1%(v/v)가 되도록 클로로포름을 첨가하고 20 분간 교반하였으며 제한 효소인 DNase I과 RNase A를 각각 최종 농도 1 ㎍/㎖가 되도록 첨가하고 30℃에서 30분 동안 정치시켰다. 그 다음, 최종 농도가 각각 1M과 10%(w/v)가 되도록 염화나트륨과 폴리에틸렌 글리콜을 가하고 4℃에서 3 시간 동안 추가 정치시켰으며 4℃에서 12,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 침전물을 수득하였다.
상기 수득한 침전물을 5 ㎖ SM 용액에 현탁시키고 20 분간 실온에서 정치시킨 다음, 1 ㎖ 클로로포름을 가하여 교반하고 4℃에서 4,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과한 다음, 글리세롤 밀도 구배법 (밀도: 40%, 5% 글리세롤)을 이용한 초원심 분리 (35,000 rpm, 1시간, 4℃)를 수행하여 박테리오파지를 정제하였다.
본 발명자는 양돈분으로부터 시료를 채취하여, 장독소성 대장균에 대한 특이적 사멸능을 갖는 상기 박테리오파지를 "Bacteriophage ΦCJ27"로 명명하고, 2013년 10월 25일 한국미생물 보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221)에 기탁번호 제KCCM11465P호로 기탁하였다.
<실시예 2>
ΦCJ27의 형태 관찰
상기 실시예 1에서 정제한 박테리오파지 ΦCJ27을 0.01% 젤라틴 용액에 희석하고 2.5% 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 이를 탄소 코팅된 운모판 (carbon-coated mica plate (ca. 2.5 mm×2.5 mm))에 적가하여 10분간 적응시킨 다음, 멸균 증류수로 세척하였다. 탄소 피막 (carbon film)을 구리 그리드 (copper grid)에 끼워 2% 우라닐 아세테이트 (uranyl acetate)에서 60 초간 염색하고 건조한 다음, 투과 전자 현미경 (JEM-1011, 120 kV, 배율 ×200,000)으로 검경하였다 (도 1).
도 1은 박테리오파지 ΦCJ27의 투과 전자 현미경 사진을 나타낸 것으로, 긴 머리(elongated head)를 가지며 수축성이 있는 꼬리(contractile tail)로 구성된 형태형(morphotype)을 나타내는 것으로 보아 마이오비리데(Myoviridae)에 속함을 알 수 있었다.
<실시예 3>
ΦCJ27의 전체 게놈 DNA의 크기 분석
상기 실시예 1에서 정제한 박테리오파지 ΦCJ27로부터 게놈 DNA를 추출하였다.
구체적으로, 정제된 박테리오파지 ΦCJ27 배양액에 20 mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), 50 ㎍/㎖ 단백질 분해 효소 (proteinase) K 및 0.5%(w/v) SDS (sodium dodecyl sulfate)를 가하고 50℃에서 1시간 동안 정치하였으며 동일 부피의 페놀 (pH 8.0)을 가하여 교반한 다음, 실온에서 12,000 rpm으로 10 분간 원심 분리하여 상등액을 수득하였다.
상기 상등액을 동일 부피의 PC (페놀: 클로로포름 = 1 : 1)와 혼합하고 실온에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 동일 부피의 클로로포름과 혼합하고 실온에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 그 상등액을 수득하였다. 상기 상등액에 3M 초산 나트륨 (sodium acetate)을 전체 부피의 10%(v/v)가 되도록 가하여 혼합하고, 2배 부피의 차가운 95% 에탄올을 가하여 혼합한 다음, -20℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 이어서, 0℃에서 10분간 12,000 rpm으로 원심 분리한 후 상등액을 제거하여 침전물을 수득한 다음, 이에 50 ㎕ TE 완충액 (Tris-EDTA, pH 8.0)을 가하여 용해하였다. 상기에서 추출된 DNA를 10배 희석하여 OD260에서 흡광도를 측정하여 농도를 측정하였다.
그 다음, 1 ㎍의 DNA를 1% PFGE (pulse-field gel electrophoresis) 아가로스겔에 로딩하고, 바이오래드 (BIORAD) PFGE 시스템 7번 프로그램 (크기 범위 25 kb 내지 100 kb; 스위치 타임 램프 (switch time ramp) 0.4초 내지 2.0초, 선형 (linear shape); 순방향 전압 (forward voltage) 180 V; 역방향 전압 (reverse voltage) 120 V)을 이용하여 상온에서 20 시간 동안 전개하였다 (도 2).
도 2는 박테리오파지 ΦCJ27의 게놈 DNA의 전기 영동 사진으로서, 박테리오파지 ΦCJ27의 게놈 DNA는 98 kb 이상임을 나타냄을 확인할 수 있었다. 도 2에서 M은 크기 측정의 기준이 되는 DNA이다.
<실시예 4>
ΦCJ27의 단백질 패턴 분석
1011 pfu/㎖ 타이터 (titer)의 정제된 박테리오파지 ΦCJ27 용액 15 ㎕와 5×SDS 시료 용액 3 ㎕를 혼합하고 5분간 끓인 다음, 12% SDS-PAGE를 수행하였다 (도 3).
도 3은 박테리오파지 ΦCJ27을 대상으로 수행한 SDS-PAGE 결과를 나타내는 전기 영동 사진으로서, 약 27.9 kDa, 51.8 kDa 및 74.5 kDa 크기의 주요 단백질을 확인할 수 있었다.
<실시예 5>
ΦCJ27의 유전적 특성 분석
상기 실시예 1에서 정제한 박테리오파지 ΦCJ27의 유전자적 특성을 알아보기 위하여, 박테리오파지 ΦCJ27의 DNA를 유전자 분석기기 FLX 티타늄 시퀀서 (titanium sequencer)(Roche)를 사용하여 분석하였다. (주)마크로젠 (Macrogen Inc.)에서 GS와 드 노보 어셈블리 소프트웨어 (de novo assembler software)(Roche)를 사용하여 유전자를 조합하였다. 전사 해석틀 (open reading frame)은 GeneMArk.hmm, Glimmer v3.02 및 FGENESB 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. BLASTP와 인터프로스캔 (InterProScan) 프로그램을 사용하여 전사 해석틀의 이름을 명명 (annotation)하였다.
상기 박테리오파지의 염기 서열은 기존에 보고된 박테리오파지(Enterobacteria phage HX01, complete genome)의 염기 서열과 다양한 유사성을 보였으나, 모든 단편이 100% 일치하는 박테리오파지는 없는 것으로 확인되었다. 이에 상기 박테리오파지는 신규 분리된 박테리오파지임을 확인할 수 있었다.
하기 표 1은 박테리오파지 ΦCJ27의 염기 서열과 다른 박테리오파지의 해독 염기 서열의 상동성을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
표 1
Query Subject 　 Identities
Name Length Start End Description E-Value Match/Total Pct.(%)
서열번호 1 171637 144696 167103 Enterobacteria phage HX01, complete genome 0 21905/22425 97
상기 제조된 박테리오파지 ΦCJ27의 DNA를 유전자 분석기기를 사용하여 분석한 염기 서열 전체의 결과는 서열목록상 서열번호 1과 같다.
<실시예6>
pH에 따른 ΦCJ27의 안정성 조사
박테리오파지 ΦCJ27이 위장 내의 조건에서와 같이 낮은 pH에서 안정성을 보유할 수 있는지를 확인하기 위하여 다양한 pH 범위 (pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0)에서 안정성 조사 실험을 실시하였다.
실험을 위하여 다양한 pH 용액 (아세트산 나트륨 완충 용액 (pH 4.0 및 pH 5.0), 시트르산 나트륨 완충 용액 (pH 2.0 및 pH 3.0)을 각각 0.2 M로 제작하였다.
상기 각 pH 용액 180 ㎕와 3.8×109 PFU/㎖ 타이터의 박테리오파지 용액 20㎕를 섞어 각 pH 용액의 농도가 1M이 되게 한 후, 2 시간 동안 상온에서 정치하였다. 대조군은 동일한 방법으로 3.8×109 PFU/㎖ 박테리오파지 용액 20 ㎕를 SM 용액 180 ㎕에 섞어 준 후, 2 시간 동안 상온에서 정치하였다. 그 다음, 이들을 단계 희석하고 소프트 아가 오버레이 방법을 이용하여 각 단계의 희석액을 10 ㎕씩 떨어뜨린 뒤 30℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다 (도 4).
도 4는 박테리오파지 ΦCJ27의 내산성 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 박테리오파지 ΦCJ27는 pH 2.0부터 pH 5.0까지 활성을 잃지 않고 안정적임을 확인할 수 있었다.
<실시예 7>
온도에 따른 ΦCJ27의 안정성 조사
박테리오파지의 제품 제형 중 사료 첨가제로 이용할 경우 박테리오파지의 제형 과정에서 열이 발생할 수 있으므로, 열에 대한 안정성을 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 3.8×108 PFU/㎖ 농도의 박테리오파지 ΦCJ27의 용액 200 ㎕를 60℃의 온도 조건 하에서 각각 0 분, 30분, 60분 및 120분 동안 정치시켰다. 그 다음, 상기 처리한 실험 배양액을 단계 희석하여 소프트 아가 오버레이 방법으로 각 단계의 희석액 10 ㎕씩 떨어뜨린 뒤 30℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다 (도 5).
도 5는 박테리오파지 ΦCJ27의 내열성 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 5에 나타난 바와 같이, 박테리오파지 ΦCJ27는 60℃에서 1 시간 동안 노출되었을 때까지는 약 1 로그 이하 활성 감소를 보였고, 120분 노출 시에는 1 로그 이상의 활성이 감소됨을 알 수 있었다.
<실시예 8>
야생 분리주 장독소성 대장균에 대한 ΦCJ27의 감염 범위 조사
실험에 사용된 장독소성 대장균 (UK27) 이외에 서울대학교 수의과대학, 건국대학교 수의과대학 및 검역원에서 분리한 야생 분리주 장독소성 대장균 99주에 대하여, 박테리오파지 ΦCJ27의 용균 활성이 있는지 여부를 확인하였다. 이 분리주는 F-혈청형 F4 타입(type) 37주, F5 타입 31주, F6 타입 7주, F18 타입 19 주 및 기타 균주 5주이다.
구체적으로, 각 균주의 진탕 배양액 (OD600 = 2) 150 ㎕를 섞어 소프트 아가 오버레이 방법을 진행하여 109 pfu/㎖ 타이터의 박테리오파지 ΦCJ27의 용액 10 ㎕씩 떨어뜨린 뒤 30℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균반 형성 유무를 관찰하였다.
상기 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2
Figure PCTKR2015002472-appb-T000001
Figure PCTKR2015002472-appb-I000001
상기 표 2에서 나타난 바와 같이, 박테리오파지 ΦCJ27은 일반 양돈 농가에서 돼지 설사의 원인균으로 상당 부분을 차지하고 있는 F-혈청형 F4, F5, F6, F18 타입 등에 대한 감염능을 보이고 있어서 현장 적용 시 우수한 효율성을 나타낼 것으로 기대된다.
서열목록제출서에 첨부하여 제출
Figure PCTKR2015002472-appb-I000002

Claims (12)

  1. 장독소성 대장균 (Enterotoxigenic Escherichia coli)에 특이적인 사멸능을 갖는, 신규 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P).
  2. 제1항의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 감염성 질병은 대장균증인, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제1항의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는 항생제.
  5. 제1항의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는, 사료 첨가제.
  6. 제5항의 사료 첨가제를 포함하는, 사료.
  7. 제1항의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)를 유효 성분으로 포함하는, 음용수 첨가제.
  8. 제7항의 음용수 첨가제를 포함하는, 음용수.
  9. 제1항의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는, 소독제.
  10. 제1항의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P)을 유효 성분으로 포함하는, 세척제.
  11. 제1항의 상기 박테리오파지 ΦCJ27 (KCCM11465P) 또는 제2항의 상기 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 감염성 질병은 대장균증인, 장독소성 대장균에 의한 감염성 질병의 예방 또는 치료 방법.
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