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WO2015159700A1 - 動物プランクトン用餌料組成物、その製造方法、及び動物プランクトンの養殖方法 - Google Patents

動物プランクトン用餌料組成物、その製造方法、及び動物プランクトンの養殖方法 Download PDF

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WO2015159700A1
WO2015159700A1 PCT/JP2015/060043 JP2015060043W WO2015159700A1 WO 2015159700 A1 WO2015159700 A1 WO 2015159700A1 JP 2015060043 W JP2015060043 W JP 2015060043W WO 2015159700 A1 WO2015159700 A1 WO 2015159700A1
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WO
WIPO (PCT)
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microalgae
nannochloropsis
composition
rotifer
artemia
Prior art date
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PCT/JP2015/060043
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English (en)
French (fr)
Inventor
重樹 團
昌一 芦立
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Fisheries Research and Education Agency
Original Assignee
Fisheries Research Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to JP2015516347A priority Critical patent/JPWO2015159700A1/ja
Publication of WO2015159700A1 publication Critical patent/WO2015159700A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/158—Fatty acids; Fats; Products containing oils or fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K40/00—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs

Definitions

  • the present invention relates to a feed composition for zooplankton, a method for producing the same, a method for culturing zooplankton, and the like.
  • Rotifer rotifer (hereinafter referred to as rotifer) is essential as an initial feed in many seafood seedling production, and rotifers are cultured in almost all seedling production facilities.
  • the culture of rotifers has become remarkably stable and easy to mass cultivate because a commercially available freshwater chlorella concentrate can be used as a feed.
  • freshwater chlorella containing n-3 highly unsaturated fatty acids (n-3HUFA) such as eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA), which are essential fatty acids for many fish and shellfish larvae.
  • n-3HUFA highly unsaturated fatty acids
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • Nannochloropsis which is commercialized and contains a large amount of EPA, it is also used as a nutrient enhancer for rotifers or as an additive to seedling production tanks.
  • Microorganisms such as bacteria and protozoa present in the culture tank for microalgae are concentrated in the same way as microalgae in the process of concentrating microalgae, so many microbes are mixed in the microalgae concentrate.
  • these microorganisms there are bacteria that break down the cell walls of microalgae (Non-Patent Document 1), and when the microalgae decomposes and rots by such bacteria, the value of feed is significantly reduced and rotifer culture and It causes the seedling production failure (Non-Patent Document 2).
  • the microalgae concentrate In order to prevent the growth and decay of microorganisms, the microalgae concentrate must be refrigerated at 4 ° C, and the expiration date for refrigerated storage is 20 days after production.
  • the expiration date for refrigerated storage is 20 days after production.
  • due to the deterioration in quality over time under refrigerated storage and the short expiration date it is difficult to export high-quality microalgae concentrates produced in Japan to overseas.
  • the microalgae concentrate that has exceeded its expiration date is deteriorated in quality due to the growth of microorganisms, causing rotifer culture failure and seed
  • Nannochloropsis (Patent Document 1), in which cell walls are disrupted with a high-pressure homogenizer so that Artemia can be digested, is commercially available from Marine Tech Co., Ltd. (trade name: Marine Alpha).
  • Non-Patent Document 3 describes changes due to heat treatment of chlorella.
  • Non-Patent Document 4 describes the influence of algal bacteria on fish farming.
  • the object of the present invention is to provide a microalgae concentrate that can be stored at room temperature for a long period of time and has a feed value for zooplankton that is equal to or higher than that of an untreated one.
  • the present inventors diligently studied a method for removing microorganisms mixed in the microalgae concentrate while maintaining the feed value against rotifers and artemia.
  • autoclave high-pressure steam sterilization
  • the autoclaved microalgae concentrate was stored in a closed container such as a bottle or pouch, and could be stored at room temperature for a long time without causing rot due to microorganisms.
  • the present invention is as follows:
  • a feed composition for zooplankton comprising microalgae subjected to high-pressure steam sterilization at 105 to 135 ° C. and 0.12 to 0.32 MPa for 1 to 60 minutes.
  • the composition according to [1] or [2], wherein the number of general bacteria in the composition is 1.0 (log CFU / ml) or less.
  • the composition according to [3], wherein the number of general bacteria in the composition is 0 (log CFU / ml).
  • the composition of the present invention can be stored at room temperature for a long period of time without rot due to microorganisms by high pressure steam sterilization treatment of microalgae. Furthermore, despite the fact that microalgae are subjected to high-pressure steam sterilization, the composition of the present invention is a feed equivalent to or higher than untreated microalgae against zooplankton such as rotifers and artemia. Have value. In particular, for Nannochloropsis, cell walls are destroyed by high-temperature and high-pressure treatment, and good digestion and absorption by Artemia or the like becomes possible.
  • high-pressure steam sterilization is defined as a method for sterilizing retort pouch foods, it is possible to develop retort pouch products that can be stored at room temperature for a long time for zooplankton feed. Since the composition of the present invention is aseptic, there is no fear of bringing the cause of zooplankton culture failure or seedling disease into the aquaculture facility. Since long-term storage at room temperature is possible, it is possible to reduce the cost of refrigerated transport and refrigerated storage and to export microalgae concentrates overseas.
  • the number of general bacteria in the freshwater chlorella and Nannochloropsis concentrate after heat sterilization is shown.
  • the cell photograph of the freshwater chlorella and Nannochloropsis concentrate which were heat-sterilized is shown.
  • the effect of high-pressure steam sterilization of freshwater chlorella and Nannochloropsis on the transition of the specific growth rate of rotifers is shown.
  • the effect of high-pressure steam sterilization of freshwater chlorella and Nannochloropsis on the transition of egg-bearing rate in rotifers is shown.
  • Figure 6 shows the effect of feeding an autoclave sterilized Nannochloropsis on artemia total lipids, EPA, and n-3 polyunsaturated fatty acid content.
  • the influence of the difference in sterilization temperature and pressure of freshwater chlorella on the transition of the specific growth rate of rotifers is shown.
  • the effect of the difference in sterilization temperature and pressure of freshwater chlorella on the transition of egg-bearing rate in rotifers is shown.
  • the effect of the difference in the sterilization time of freshwater chlorella on the transition of the specific growth rate of rotifers is shown.
  • the present invention provides a feed composition for zooplankton containing microalgae subjected to high-pressure steam sterilization.
  • the microalgae is a general term for microalgae and has a photosynthetic pigment, so it is also called phytoplankton.
  • the microalgae include green algae, diatoms, cyanobacterium, haptoalgae, brown algae and the like.
  • the microalgae used in the present invention is not particularly limited as long as it can be a marine feed, and specific examples include, but are not limited to, chlorella, Nannochloropsis, spiruna, Donariella, Euglena and the like. .
  • the microalgae is preferably chlorella or Nannochloropsis.
  • composition of the present invention can be produced by subjecting microalgae to high-pressure steam sterilization.
  • the present invention also provides a method for producing such a feed composition for zooplankton.
  • the microalgae includes cultured microalgae, dried cultured microalgae, treated cultured microalgae, and culture solutions containing microalgae and culture supernatant.
  • the microalga includes, in addition to the microalga itself, for example, a microalga suspension, freeze-dried product, spray-dried product, and the like.
  • a microalgae suspension is used.
  • the microalgae suspension can be prepared by suspending the microalgae in an appropriate physiological aqueous solution such as water, saline, buffered aqueous solution, medium or the like.
  • concentration of the micro algae in a micro algae suspension is not specifically limited, It is preferable that it is a density
  • the cell concentration is usually 10 8 to 10 12 cells / ml, preferably 10 9 to 10 11 cells / ml.
  • the conditions for the high-pressure steam sterilization treatment can be appropriately set as long as the microalgae can reduce the number of mixed microorganisms while maintaining the feed value.
  • the sterilization temperature is usually 105 to 135 ° C, preferably 115 to 130 ° C, more preferably 119 to 123 ° C (eg, 121 ° C).
  • the pressure during sterilization is usually 0.12 to 0.32 MPa, preferably 0.17 to 0.27 MPa, and more preferably 0.20 to 0.22 MPa (eg, 0.21 MPa).
  • the sterilization time is usually 1 to 60 minutes, preferably 5 to 45 minutes, more preferably 15 to 25 minutes (eg, 20 minutes).
  • the pressure at the time of a sterilization process is shown as an absolute pressure.
  • the combination of high-pressure steam sterilization conditions is for example, 105 to 135 ° C., 0.12 to 0.32 MPa, 1 to 60 minutes; Preferably, 115 ° C. to 130 ° C., 0.17 to 0.27 MPa, 5 to 45 minutes; More preferably, they are 119 to 123 ° C. (eg, 121 ° C.), 0.20 to 0.22 MPa (eg, 0.21 MPa), and 15 to 25 minutes (eg, 20 minutes).
  • the high-pressure steam sterilization treatment of microalgae can be carried out by placing the microalgae in a suitable container and placing it under predetermined conditions using a high-pressure steam sterilizer.
  • the container is preferably a container that is resistant to high temperatures and high pressures.
  • a container made of glass, heat-resistant resin, porcelain, metal, or the like is preferable.
  • a retort pouch encapsulating the composition of the present invention can be produced by enclosing a microalgae (preferably a microalgae suspension) in a retort pouch and subjecting it to autoclaving. it can.
  • a retort pouch is a plastic film or metal foil, or a container formed by combining these layers into a bag or other shape, filled with the desired composition, sealed by heat melting, and pressurized. This is heat-sterilized.
  • the container is preferably hermetic.
  • it is preferable that the said container has light-shielding property.
  • the composition of the present invention encapsulated in a retort pouch can be stored for a long time at room temperature, and is lighter, thus contributing to cost reduction of refrigerated transport and refrigerated storage, and can be exported overseas. .
  • the number of general bacteria in the microalgae suspension subjected to autoclave sterilization is usually 3.0 (log CFU / ml) or less, preferably 2.0 (log CFU / ml) or less, more preferably 1 0.0 (log CFU / ml) or less, more preferably 0.1 (log CFU / ml) or less, and most preferably 0 (log CFU / ml).
  • the number of general bacteria in the microalgae suspension is determined by smearing a predetermined volume of microalgae suspension on an agar medium (MarinegAgar 2216, manufactured by Diffco) and culturing at 25 ° C. for 4 to 6 days. It can be calculated by counting the number of colonies.
  • the composition of the present invention includes excipients, extenders, nutritional supplements, feed additives, antioxidants, buffers, as long as the effects of the present invention are not impaired. You may mix
  • the composition of the present invention can be provided with any properties regardless of properties. For example, it can be provided as a solid (solid, powder), paste, liquid (solution, solution) or suspension (suspension). The composition of the present invention is preferably provided as a suspension (suspension).
  • the content of microalgae subjected to high-pressure steam sterilization in the composition of the present invention is usually 0.1 to 100% (w / w) of the solution.
  • the content of microalgae in the suspension is usually 10 8 to 10 12 cells / ml, preferably 10 9 to 10 11 cells / ml. It is.
  • the general bacterial count in the composition of the present invention is usually 3.0 (log CFU / ml) or less, preferably 2.0 (log CFU). / Ml) or less, more preferably 1.0 (log CFU / ml) or less, still more preferably 0.1 (log CFU / ml) or less, most preferably 0 (log CFU / ml).
  • the composition of the present invention comprises a microalgae suspension that has been subjected to the above-mentioned high-pressure steam sterilization treatment.
  • the composition of the present invention is useful as a feed for marine feed and as a feed for zooplankton.
  • Zooplankton means rotifer, artemia, daphnia and the like that are generally used as biological feed in seed production.
  • the rotifer is a microscopic organism belonging to the saccharid, the rotifer, and the subclass of the true rotifer.
  • Rotifers include large rotifers, L-type rotifers (Brachinus worm), and small-sized rotifers, S-type rotifer (B. rotundiformis).
  • Artemia is an organism of the crustacean, scorpion, Sarsostraca, shellless, and horned shrimp.
  • the present invention also provides a method for cultivating a rotifer or artemia, comprising feeding the above-mentioned autoclave-sterilized microalgae or the composition of the present invention to a rotifer or artemia.
  • Methods for cultivating rotifers and artemia are known, and are sufficient in size and amount as feed for seedling fish while feeding the above-mentioned microalgae or the composition of the present invention subjected to autoclaving under appropriate artificial conditions. Raise a rotifer or Artemia until it becomes.
  • the composition of the present invention can be stored at room temperature for a long period of time without rot due to microorganisms by high pressure steam sterilization treatment of microalgae. Furthermore, despite the fact that microalgae are subjected to high-pressure steam sterilization, the composition of the present invention has a feed value equivalent to or higher than that of untreated microalgae against rotifers and artemia. ing. In particular, with respect to Nannochloropsis, cell walls are destroyed by high-temperature and high-pressure treatment, and good digestion and absorption by zooplankton such as Artemia becomes possible.
  • the present invention also provides a kit for cultivating a rotifer or artemia comprising the above-mentioned microalgae subjected to high-pressure steam sterilization or the composition of the present invention, and a rotifer or artemia.
  • a kit for cultivating a rotifer or artemia comprising the above-mentioned microalgae subjected to high-pressure steam sterilization or the composition of the present invention, and a rotifer or artemia.
  • Example 1 Sterilization of freshwater chlorella and Nannochloropsis by heating treatment
  • Super Raw Chlorella V12 manufactured by EPA, DHA, and vitamin B12 in cells of freshwater chlorella, cells Yanmarine K-1 (13.7 billion cells / ml) manufactured by Chlorella Kogyo Co., Ltd. was used as a concentrated solution of Nannochloropsis. Each concentrated solution was heated or heated and pressurized according to the method shown in Table 1.
  • Super Raw Chlorella V12 is described as freshwater chlorella
  • Yanmarine K-1 is described as Nannochloropsis.
  • Example 2 Bactericidal effect of freshwater chlorella and Nannochloropsis by heating treatment Untreated freshwater chlorella and Nannochloropsis, freshwater chlorella and Nannochloropsis treated by each sterilization method obtained in Example 1, and 48 at 4 ° C after treatment. Each of the samples stored for a period of time was smeared on an agar medium (Marine Agar 2216, manufactured by Diffco) and cultured at 25 ° C. for 4 to 6 days, and then the colonies on the medium were counted as the number of general bacteria. The experiment was performed twice.
  • agar medium Marine Agar 2216, manufactured by Diffco
  • Example 3 Changes in cell shape and aggregation rate of freshwater chlorella and Nannochloropsis by autoclave sterilization
  • the freshwater chlorella and Nannochloropsis cells that were untreated or autoclaved were observed under a biological microscope.
  • a cell floating alone and a cell having two or more cells adhered thereto were counted using a hemocytometer, and a ratio of two or more cells adhered was calculated as a cell aggregation rate.
  • the difference in cell aggregation rate before and after treatment was compared by Welch's t-test.
  • Example 4 Effect of high-pressure steam sterilization of freshwater chlorella and Nannochloropsis on the growth and growth of rotifers Inoculate a tank filled with 10 liters of seawater at an average density of 97 individuals / ml (range 84-110 individuals / ml), Untreated or autoclaved sterilized freshwater chlorella 30 billion cells (3 million cells / ml) and Nannochloropsis 60 billion cells (6 million cells / ml) were added once daily and cultured for 5 days. Three water tanks were used for each test section, and the culture water temperature was adjusted to 25 ° C. using a heater.
  • the density of the rotifer and the parthenogenetic egg density of the rotifer was counted under a stereomicroscope once a day at 7 am.
  • the ratio (%) of the rotifer density counted every day to the rotifer individual density at the start of the experiment was calculated and used as the specific growth rate.
  • the egg-bearing rate per individual rotifer was calculated by dividing the parthenogenetic egg density by the number of rotifer individuals. Differences between treatments of the specific growth rate of rotifer on the fifth day of culture were compared by the pairwise-t test.
  • Example 5 Effects of high-pressure steam sterilization of freshwater chlorella and Nannochloropsis on survival and growth of Artemia (method) Artemia naprius (from Salt Lake, USA) hatched in a 1L beaker filled with seawater at 25 ° C for 24 hours at an average density of 10.7 individuals / ml (range 10.0-12.0 individuals / ml) Inoculated and treated with fresh water chlorella 1 billion cells (1 million cells / ml) and Nannochloropsis 2 billion cells (2 million cells / ml) twice daily and cultured for 6 days. Three beakers were provided for each test section, and the culture water temperature was adjusted to 25 ° C. using a heater.
  • the density of Artemia was counted once daily at 8 am, and the total length of 30 Artemia sampled from each beaker was measured every 2 days. The difference in artemia survival rate and total length in each test section on the 6th day of culture was compared by the pairwise-t test.
  • Example 6 Effect of autoclaving on total lipid, EPA, DHA, and n-3 polyunsaturated fatty acid content of freshwater chlorella and Nannochloropsis Untreated or autoclaved freshwater Chlorella and Nannochloropsis at 10,000 rpm And centrifuged for 10 minutes. The supernatant was removed, and the dry weight was determined by evaporating the moisture of a part of the precipitate in a 110 ° C. oven until reaching a constant weight. The mixture was homogenized by adding a chloroform / methanol mixture to the precipitate, the solvent was removed, and the weight of the extracted lipid was measured to determine the total lipid content.
  • Potassium hydroxide was added to the total lipid and heated to saponify, and the saponified product was methylated with methanol trifluoroborate.
  • the purified fatty acid methyl ester was introduced into a gas chromatograph (Shimadzu GC-17A), separated and detected, and each fatty acid was identified by comparison with a commercially available standard sample.
  • the total of n-3 unsaturated fatty acids having 20 or more carbon atoms was calculated as the n-3 highly unsaturated fatty acid (n-3HUFA) content.
  • n-3HUFA highly unsaturated fatty acid
  • Example 7 Effect of high-pressure steam sterilized microalgae concentrate on total artemia lipids, EPA, DHA, and n-3 polyunsaturated fatty acid content Salty Lake Artemia durable eggs in seawater at 25 ° C for 24 hours After hatching, 2 million individuals were housed in a 100 L water tank filled with 25 ° C. seawater. Untreated or autoclaved sterilized Nannochloropsis 2 billion cells (2 million cells / ml) were added twice daily and cultured for 48 hours. As a control, a water tank (no addition) without adding microalgae was also provided. After completion of the culture, Artemia was sampled with plankton net, washed with distilled water, and stored at ⁇ 80 ° C. Later, the total lipid content and fatty acid composition of Artemia were analyzed in the same manner as for microalgae.
  • Example 8 Effect of sterilization temperature and pressure of freshwater chlorella on the growth of rotifer Inoculate a tank filled with 10 L of seawater with an average of 126 individuals / ml (range 116-138 individuals / ml), no addition, untreated, Fresh water chlorella 30 billion cells (3 million cells / cell) that were autoclaved at 105 ° C. (0.12 MPa), 115 ° C. (0.17 MPa), 121 ° C. (0.21 MPa), and 135 ° C. (0.32 MPa) for 20 minutes. ml) was added once daily and cultured for 3 days. Two water tanks were used for each test section, and the culture water temperature was adjusted to 24.7 ° C. using a heater.
  • the density of the rotifer and the parthenogenetic egg density of the rotifer was counted once daily at 8 am under a stereomicroscope.
  • the ratio (%) of the rotifer density counted every day to the rotifer individual density at the start of the experiment was calculated and used as the specific growth rate.
  • the egg-bearing rate per individual rotifer was calculated by dividing the parthenogenetic egg density by the number of rotifer individuals. Differences between treatments of specific growth rate at the end of the experiment were compared by pairwise-t test.
  • Example 9 Effect of sterilization time of freshwater chlorella on growth of rotifer Inoculate a tank filled with 10L of seawater with an average of 98 individuals / ml (range 87-115 individuals / ml), no additive, untreated, 105 ° C
  • Fresh water chlorella 30 billion cells (3 million cells / ml) that had been autoclaved at 135 ° C. for 1 minute or 60 minutes were added once daily and cultured for 4 days. Two water tanks were used for each test section, and the culture water temperature was adjusted to 21.2 ° C. using a heater. The density of the rotifer and the parthenogenetic egg density of the rotifer was counted once daily at 8 am under a stereomicroscope.
  • the ratio (%) of the rotifer density counted every day to the rotifer individual density at the start of the experiment was calculated and used as the specific growth rate.
  • the egg-bearing rate per individual rotifer was calculated by dividing the parthenogenetic egg density by the number of rotifer individuals. Differences between treatments of specific growth rate at the end of the experiment were compared by pairwise-t test.
  • Example 10 Comparison of Digestion Rate of Commercially Digestible Nannochloropsis and High Temperature and High Pressure Treated Nannochloropsis Artemia 10 Individual Artemia Noprius (from Salt Lake, USA) hatched in a 1L beaker filled with seawater at 27 ° C for 24 hours Inoculated at a density of ml, commercially digestible Nannochloropsis (Marine Alpha manufactured by Marinetech), and untreated or high-pressure steam sterilized (121 ° C., 20 minutes) 3 billion cells (3 million cells / ml) was added once and the residual density of Nannochloropsis was measured every 3 hours from immediately after the addition until 24 hours later. Three beakers were used for each test section.
  • Nannochloropsis For the measurement of Nannochloropsis, a Birkelturk hemocytometer was used under a microscope. The residual ratio of each time was calculated with the density at the time of addition being 100. We also compared the effects of different types of Nannochloropsis using a generalized linear mixed model with the difference in measurement time and Nannochloropsis as an explanatory variable and the residual density as a response variable.
  • a feed composition for zooplankton that can be stored at room temperature for a long period of time without causing rot due to microorganisms.

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Abstract

　本発明の目的は、常温で長期間保存が可能であり、未処理の微細藻類と同等又はそれ以上の動物プランクトンに対する餌料価値を有する微細藻類含有動物プランクトン用飼料組成物を提供することにある。　１０５～１３５℃、０．１２～０．３２ＭＰaにて１～６０分間、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類を含む、動物プランクトン用飼料組成物。

Description

動物プランクトン用餌料組成物、その製造方法、及び動物プランクトンの養殖方法
　本発明は、動物プランクトン用餌料組成物、その製造方法、及び動物プランクトンの養殖方法等に関する。
　多くの魚介類の種苗生産においてシオミズツボワムシ（以下、ワムシ）は初期餌料として必須であり、ほぼすべての種苗生産施設でワムシの培養が行われている。ワムシの培養は、市販の淡水クロレラ濃縮液が餌料として利用可能となったことで著しく培養が安定し、大量培養が容易になってきた。また、多くの魚介類の仔稚にとって必須脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などのｎ－３系高度不飽和脂肪酸（ｎ－３ＨＵＦＡ）を細胞内に含有する淡水クロレラが商品化され、ＥＰＡを多く含有するナンノクロロプシスとともに、ワムシの栄養強化剤、又は種苗生産水槽への添加剤としても利用されている。
　本発明者らが実施したキジハタの種苗生産では、全長２９．３ｍｍの種苗１５万尾を生産するために要した経費（光熱水費、人件費を除く）のうち、ワムシ培養と飼育水への添加に要した淡水クロレラの経費は、実に７８％を占めた。このように、淡水クロレラ濃縮液購入費は種苗生産費の中で最も大きい割合を占めており、その市場規模は大きい。近年は韓国で生産された冷蔵淡水クロレラ濃縮液の日本への輸入販売も行われている。
　微細藻類の培養水槽に存在する細菌や原生動物などの微生物は、微細藻類を濃縮する過程で微細藻類と同様に濃縮されるため、微細藻類濃縮液には多くの微生物が混入している。これらの微生物の中には、微細藻類の細胞壁を分解する細菌が存在し（非特許文献１）、このような細菌によって微細藻類の分解と腐敗が進むと餌料価値が著しく低下してワムシ培養や種苗生産の不調の原因となる（非特許文献２）。
　微生物の繁殖と腐敗を防ぐために、微細藻類濃縮液は４℃で冷蔵保存する必要があり、冷蔵保存した場合の使用期限は製造から２０日間とされている。しかし、使用期限内であっても経時的な品質低下によるワムシ培養不調や種苗への悪影響を避けるために、種苗生産現場では可能な限り新鮮な微細藻類濃縮液を使用することが技術的な常識となっている。このため、ワムシ培養担当者と種苗生産担当者は微細藻類濃縮液の在庫管理に細心の注意を払う必要がある。また、このような冷蔵保存下での経時的な品質低下と短い使用期限のため、日本国内で生産された高品質な微細藻類濃縮液を海外へ輸出することは困難である。使用期限を超過した微細藻類濃縮物は微生物の増殖によって品質が低下し、ワムシの培養不調や種苗の疾病を引き起こす。
　淡水クロレラ等の濃縮液が市販されておらず冷蔵輸送技術が十分に発達していない諸外国（特に発展途上国）においては、飼料価値の劣る酵母類や自家培養したナンノクロロプシス等をワムシ培養の餌料として利用しており、不安定なワムシ培養に起因するワムシ給餌量の不足が種苗の大量生産のボトルネックとなっている。
　ワムシと同様に種苗生産の初期餌料として用いられるアルテミアのノープリウスは頑丈な細胞壁を持つ淡水クロレラやナンノクロロプシスを消化することができない。淡水クロレラやナンノクロロプシスをアルテミアが消化できるようになれば、アルテミア養殖の餌料、栄養強化、種苗生産水槽中での飢餓防止などの多くのメリットがある。現在ではアルテミアが消化できるように高圧ホモジナイザーで細胞壁を破砕したナンノクロロプシス（特許文献１）がマリンテック株式会社から市販されている（商品名：マリンアルファ）。
　非特許文献３には、クロレラの加熱処理による変化が記載されている。
　非特許文献４には、魚類養殖への藻類細菌の影響が記載されている。
WO 2005/027651
Org Geochem, 25, 117-130, 1996 Aquaculture, 83, 237-248, 1989 Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 290, 81-91, 2003 Aquaculture, 256, 50-73, 2006
　本発明は、常温で長期間保存が可能であり、未処理のものと同等又はそれ以上の動物プランクトンに対する餌料価値を有する微細藻類濃縮液を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ワムシやアルテミアに対する餌料価値を維持したまま、微藻類濃縮液中に混入した微生物を除去する方法について鋭意検討を行った。その結果、淡水クロレラやナンノクロロプシスの濃縮液を高圧蒸気滅菌（オートクレーブ）処理に付して滅菌すると、微細藻類自体死滅するものの、意外にも、生きた微細藻類の濃縮液と同等のワムシ又はアルテミアに対する餌料価値を維持していることを見出した。オートクレーブ処理した微細藻類濃縮液は、瓶やパウチなどの密閉容器に保存することで、微生物による腐敗が進行することなく、長期間室温で保存することができた。
　発明者らは、上記知見に基づき更に検討を加え、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は下記の通りである：
［１］１０５～１３５℃、０．１２～０．３２ＭＰaにて１～６０分間、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類を含む、動物プランクトン用飼料組成物。
［２］高圧蒸気滅菌処理条件が、１１９～１２３℃、０．２０～０．２２ＭＰa、１５～２５分間である、［１］記載の組成物。
［３］組成物中の一般細菌数が、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下である、［１］又は［２］記載の組成物。
［４］組成物中の一般細菌数が、０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である、［３］記載の組成物。
［５］微細藻類が、クロレラ又はナンノクロロプシスである、［１］～［４］のいずれか記載の組成物。
［６］動物プランクトンが、ワムシ又はアルテミアである、［１］～［５］のいずれか記載の組成物。
［７］［１］～［６］のいずれか記載の組成物が封入された、レトルトパウチ。
［８］微細藻類を、１０５～１３５℃、０．１２～０．３２ＭＰaにて１～６０分間、高圧蒸気滅菌処理に付し、滅菌処理された微細藻類を得ることを含む、動物プランクトン用飼料組成物の製造方法。
［９］高圧蒸気滅菌処理条件が、１１９～１２３℃、０．２０～０．２２ＭＰa、１５～２５分間である、［８］記載の製造方法。
［１０］組成物中の一般細菌数が、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下である、［８］又は［９］記載の製造方法。
［１１］組成物中の一般細菌数が、０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である、［１０］記載の製造方法。
［１２］微細藻類が、クロレラ又はナンノクロロプシスである、［８］～［１１］のいずれか記載の製造方法。
［１３］動物プランクトンが、ワムシ又はアルテミアである、［８］～［１２］のいずれか記載の製造方法。
［１４］動物プランクトンに対して、１０５～１３５℃、０．１２～０．３２ＭＰaにて１～６０分間、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類を給餌することを含む、動物プランクトンの養殖方法。
［１５］高圧蒸気滅菌処理条件が、１１９～１２３℃、０．２０～０．２２ＭＰa、１５～２５分間である、［１４］記載の養殖方法。
［１６］滅菌処理された微細藻類中の一般細菌数が、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下である、［１４］又は［１５］記載の養殖方法。
［１７］滅菌処理された微細藻類中の一般細菌数が、０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である、［１６］記載の養殖方法。
［１８］微細藻類が、クロレラ又はナンノクロロプシスである、［１４］～［１７］のいずれか記載の養殖方法。
［１９］動物プランクトンが、ワムシ又はアルテミアである、［１４］～［１８］のいずれか記載の養殖方法。
［２０］［１］～［６］のいずれか記載の組成物、及び動物プランクトンを含む、動物プランクトンの養殖用キット。
　本発明の組成物は、微細藻類の高圧蒸気滅菌処理により、微生物による腐敗が進行することなく、長期間常温で保存可能である。さらに、微細藻類を高圧蒸気滅菌処理に付しているにもかかわらず、本発明の組成物は、ワムシやアルテミア等の動物プランクトンに対して、未処理の微細藻類と同等か、それ以上の餌料価値を有している。特に、ナンノクロロプシスについては、高温高圧処理により、細胞壁が破壊され、アルテミア等による良好な消化吸収が可能となる。また、高圧蒸気滅菌処理に付すことにより、微細藻類に含まれる重要な栄養成分である総脂質、ＥＰＡ、ｎ－３ＨＵＦＡ等の含有量が減ずることはない。その結果、高圧蒸気滅菌処理したナンノクロロプシス給餌により養殖したアルテミアは、未処理のナンノクロロプシス給餌により養殖したアルテミアと比較して、総脂質、ＥＰＡ、ｎ－３ＨＵＦＡ等の含有量が増加する等、栄養価の高いアルテミアを得ることができる。
　高圧蒸気滅菌処理はレトルトパウチ食品の殺菌方法として定められていることから、動物プランクトン用飼料についても、常温で長期間保存可能なレトルトパウチ商品の開発が可能となる。本発明の組成物は、無菌のため、動物プランクトン培養不調や種苗の疾病の原因を養殖設備へ持ち込む心配がない。常温での長期保存が可能なため、冷蔵輸送や冷蔵保存のコスト削減や、微細藻類濃縮液の海外への輸出が可能となる。
加熱殺菌処理した淡水クロレラとナンノクロロプシス濃縮液中の一般細菌数を示す。 加熱殺菌処理した淡水クロレラとナンノクロロプシス濃縮液の細胞写真を示す。 淡水クロレラとナンノクロロプシスの高圧蒸気滅菌処理がワムシの比増殖率の推移に及ぼす影響を示す。 淡水クロレラとナンノクロロプシスの高圧蒸気滅菌処理がワムシの携卵率の推移に及ぼす影響を示す。 淡水クロレラとナンノクロロプシスの高圧蒸気滅菌処理がアルテミアの生残率に及ぼす影響を示す。 淡水クロレラとナンノクロロプシスの高圧蒸気滅菌処理がアルテミアの成長に及ぼす影響を示す。 高圧蒸気滅菌処理が微細藻類濃縮液の総脂質、ＥＰＡ、ＤＨＡ、およびｎ－３系高度不飽和脂肪酸含量に及ぼす影響を示す。 高圧蒸気滅菌処理したナンノクロロプシスの給餌がアルテミアの総脂質、ＥＰＡ、およびｎ－３系高度不飽和脂肪酸含量に及ぼす影響を示す。 淡水クロレラの殺菌温度と圧力の違いがワムシの比増殖率の推移に及ぼす影響を示す。 淡水クロレラの殺菌温度と圧力の違いがワムシの携卵率の推移に及ぼす影響を示す。 淡水クロレラの殺菌時間の違いがワムシの比増殖率の推移に及ぼす影響を示す。 淡水クロレラの殺菌時間の違いがワムシの携卵率の推移に及ぼす影響を示す。 ナンノクロロプシスの処理の違いがアルテミアの消化に及ぼす影響（ナンノクロロプシスの残留率の推移）を示す。
　本発明は、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類を含む、動物プランクトン用飼料組成物を提供する。
　微細藻類とは、微小な藻の総称であり、光合成色素を有するため、植物プランクトンとも呼ばれる、微細藻類には、緑藻、珪藻、ラン藻、ハプト藻、褐藻等が包含される。本発明において使用される微細藻類は、水産飼料となり得るものであれば、特に限定されないが、具体的には、クロレラ、ナンノクロロプシス、スピルナ、ドナリエラ、ユーグレナ等が挙げられるが、これらに限定されない。微細藻類は、好ましくは、クロレラ又はナンノクロロプシスである。
　本発明の組成物は、微細藻類を高圧蒸気滅菌処理に付すことにより、製造することができる。本発明はこのような動物プランクトン用飼料組成物の製造方法をも提供する。
　微細藻類には、培養した微細藻類、乾燥した培養微細藻類および処理した培養微細藻類ならびに微細藻類および培養上清を含む培養液が包含される。詳しくは、微細藻類には、微細藻類そのものの他、例えば、微細藻類の懸濁液、凍結乾燥物、スプレー乾燥物などを含む。好ましくは微細藻類懸濁液を用いる。
　微細藻類懸濁液は、微細藻類を、水、食塩水、緩衝水溶液、培地等の適切な生理的水溶液に懸濁することにより調製することができる。微細藻類懸濁液における微細藻類の細胞濃度は、特に限定されないが、水産飼料として使用するのに十分な濃度であることが好ましい。該細胞濃度は、通常、１０８～１０１２細胞／ｍｌ、好ましくは１０９～１０１１細胞／ｍｌである。
　高圧蒸気滅菌処理の条件は、微細藻類が、餌料価値を有したまま、混入微生物数を減ずることができる範囲で適宜、設定することができる。滅菌処理の温度は、通常１０５～１３５℃、好ましくは、１１５℃～１３０℃、より好ましくは１１９～１２３℃（例、１２１℃）である。滅菌処理時の圧力は、通常０．１２～０．３２ＭＰａ、好ましくは、０．１７～０．２７ＭＰａ、より好ましくは、０．２０～０．２２ＭＰａ（例、０．２１ＭＰａ）である。滅菌処理時間は、通常１～６０分、好ましくは５～４５分、より好ましくは１５～２５分（例、２０分）である。尚、本明細書において、滅菌処理時の圧力は、絶対圧として示す。
　高圧蒸気滅菌処理条件の組み合わせは、
例えば、１０５～１３５℃、０．１２～０．３２ＭＰａ、１～６０分であり；
好ましくは、１１５℃～１３０℃、０．１７～０．２７ＭＰａ、５～４５分であり；
より好ましくは、１１９～１２３℃（例、１２１℃）、０．２０～０．２２ＭＰa（例、０．２１ＭＰａ）、１５～２５分（例、２０分）である。
　微細藻類の高圧蒸気滅菌処理は、微細藻類を適切な容器に入れ、これを高圧蒸気滅菌装置を用いて所定の条件におくことで実施することができる。当該容器は、高温、高圧に耐性の容器であることが好ましく、例えば、ガラス、耐熱性の樹脂、磁器、金属等の容器が好ましい。
　一態様において、微細藻類（好ましくは、微細藻類懸濁液）をレトルトパウチに封入し、これを高圧蒸気滅菌処理に付すことにより、本発明の組成物が封入されたレトルトパウチを製造することができる。本明細書において、レトルトパウチとは、プラスチックフィルム若しくは金属はく又はこれらを多層に合わせたものを袋状その他の形に成形した容器に所望の組成物を詰め、熱溶融により密封し、加圧加熱殺菌したものをいう。当該容器は、気密性であることが好ましい。また、当該容器は遮光性を有することが好ましい。レトルトパウチに封入された本発明の組成物は、常温での長期保存が可能であり、さらに軽量であるため、冷蔵輸送や冷蔵保存のコスト削減に寄与し、さらに海外への輸出が可能となる。
　高圧蒸気滅菌処理された微細藻類懸濁液中の一般細菌数は、通常、３．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、好ましくは、２．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、より好ましくは、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、更に好ましくは０．１（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、最も好ましくは０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である。微細藻類懸濁液中の一般細菌数は、所定容量の微細藻類懸濁液を寒天培地（Ｍａｒｉｎｅ Ａｇａｒ ２２１６、Ｄｉｆｆｃｏ社製）上に塗抹し、２５℃で４～６日間培養した後に、培地上のコロニー数をカウントすることにより算出することができる。
　本発明の組成物には、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類に加え、本発明の効果を損なわない範囲で、賦形剤、増量剤、栄養補強剤、飼料添加物、抗酸化剤、緩衝剤、キレート剤等を配合してもよい。本発明の組成物は、性状は問わず、いかなる性状でも提供できる。例えば、固体（固形状、粉末状）、ペースト、液体（溶液、溶液状）または懸濁液（懸濁状）として提供できる。本発明の組成物は、好ましくは、懸濁液（懸濁状）として提供される。
　本発明の組成物中の、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類の含有量は、通常、溶液０．１～１００％（ｗ／ｗ）である。本発明の組成物が、懸濁液として提供される場合、該懸濁液中の微細藻類の含有量は、通常、１０８～１０１２細胞／ｍｌ、好ましくは１０９～１０１１細胞／ｍｌである。本発明の組成物が、懸濁液として提供される場合、本発明の組成物中の一般細菌数は、通常、３．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、好ましくは、２．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、より好ましくは、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、更に好ましくは０．１（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下、最も好ましくは０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である。
　好ましい態様において、本発明の組成物は、上述の高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類懸濁液からなる。
　本発明の組成物は、水産飼料用として、動物プランクトン用の餌料として有用である。動物プランクトンとは、ワムシ、アルテミア、ミジンコなどの一般に種苗生産において生物餌料として利用されているものをいう。ワムシは、袋形動物門、輪虫綱、真正輪毛虫亜綱に属する微小な生物である。ワムシには大型のワムシであるＬ型ワムシ（シオミズツボワムシ、Ｂｒａｃｈｉｏｎｕｓ ｐｌｉｃａｔｉｌｉｓ）及び小型のワムシであるＳ型ワムシ（Ｂ. ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｒｍｉｓ）が含まれる。アルテミアは、甲殻亜門、鰓脚綱、サルソストラカ亜綱、無甲目、ホウネンエビモドキ科の生物である。本発明は、ワムシ又はアルテミアに対して、上述の高圧蒸気滅菌処理した微細藻類又は本発明の組成物を給餌することを含む、ワムシ又はアルテミアの養殖方法をも提供する。ワムシやアルテミアの養殖方法は、公知であり、適切な人為的な条件下で上述の高圧蒸気滅菌処理した微細藻類又は本発明の組成物を給餌しながら、種苗魚の餌料として十分な大きさ及び量になるまでワムシ又はアルテミアを飼育する。
　本発明の組成物は、微細藻類の高圧蒸気滅菌処理により、微生物による腐敗が進行することなく、長期間常温で保存可能である。さらに、微細藻類を高圧蒸気滅菌処理に付しているにもかかわらず、本発明の組成物は、ワムシやアルテミアに対して、未処理の微細藻類と同等か、それ以上の餌料価値を有している。特に、ナンノクロロプシスについては、高温高圧処理により、細胞壁が破壊され、アルテミア等の動物プランクトンによる良好な消化吸収が可能となる。また、高圧蒸気滅菌処理に付すことにより、微細藻類に含まれる重要な栄養成分である総脂質、ＥＰＡ、ｎ－３ＨＵＦＡ等の含有量が減ずることはない。その結果、高圧蒸気滅菌処理したナンノクロロプシス給餌により養殖したアルテミアは、未処理のナンノクロロプシス給餌により養殖したアルテミアと比較して、総脂質、ＥＰＡ、ｎ－３ＨＵＦＡ等の含有量が増加する等、栄養価の高いアルテミアを得ることができる。
　また、本発明は、上述の高圧蒸気滅菌処理した微細藻類又は本発明の組成物、及びワムシ又はアルテミアを含む、ワムシ又はアルテミアの養殖用キットを提供する。本発明のキットを用いることにより、上記本発明の養殖方法により、ワムシ又はアルテミアを容易に養殖することができる。
　以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
［実施例１］
加温処理による淡水クロレラとナンノクロロプシスの殺菌
　市販の淡水クロレラ濃縮液として、クロレラ工業（株）製スーパー生クロレラＶ１２（淡水クロレラの細胞にＥＰＡ、ＤＨＡ、及びビタミンＢ１２を取り込ませたもの、細胞密度１２４億細胞／ｍｌ）、ナンノクロロプシス濃縮液としてクロレラ工業（株）製ヤンマリンＫ－１（１３７億細胞／ｍｌ）を用いた。各濃縮液を表１の方法に従って加熱、または加熱加圧処理した。以後、スーパー生クロレラＶ１２を淡水クロレラ、ヤンマリンＫ－１をナンノクロロプシスと記述する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例２］
加温処理による淡水クロレラとナンノクロロプシスの殺菌効果
　未処理の淡水クロレラ及びナンノクロロプシス、実施例１において得られた各殺菌方法で処理した淡水クロレラ及びナンノクロロプシス、並びに処理後４℃で４８時間保存したものを、それぞれ、寒天培地（Ｍａｒｉｎｅ Ａｇａｒ ２２１６、Ｄｉｆｆｃｏ社製）上に塗抹し、２５℃で４～６日間培養した後に、培地上のコロニーを一般細菌数として計数した。実験は２回実施した。
　結果を表２及び図１に示す。処理温度が高くなるほど殺菌効果が高い傾向があった。高圧蒸気滅菌（ＨＴＨＰ）処理した場合にのみ、すべての細菌が完全に殺菌された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例３］
高圧蒸気滅菌処理による淡水クロレラとナンノクロロプシスの細胞形状と凝集率の変化
　未処理または高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラとナンノクロロプシスの細胞を生物顕微鏡下で観察した。単独で浮遊している細胞と２つ以上の細胞が接着している細胞を血球計算盤を用いて計数し、２つ以上の細胞が接着している割合を細胞凝集率として算出した。処理前と処理後の細胞凝集率の違いを、Ｗｅｌｃｈのｔ検定で比較した。
　結果を表３及び図２に示す。淡水クロレラとナンノクロロプシスともに高温高圧処理により細胞凝集率が有意に上昇し、特にナンノクロロプシスで処理後の凝集率が高くなった。しかし、凝集した細胞はほとんどが２細胞の接着によるものであり、凝集した細胞も水中に浮遊していた。また、生物顕微鏡下（４００倍）では処理による細胞形状の違いは見られなかった。また、高温高圧処理によりクロロフィルａが破壊されて、本来の濃緑色から濃茶色へ変色した（Ｊ Ｅｘｐ Ｍａｒ Ｂｉｏｌ ２９０： ８１－９１, ２００３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例４］
淡水クロレラとナンノクロロプシスの高圧蒸気滅菌処理がワムシの増殖と成長に及ぼす影響
　１０Ｌの海水を満たした水槽にワムシを平均９７個体／ｍｌ（範囲８４～１１０個体／ｍｌ）の密度で接種し、未処理または高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラ３００億細胞（３００万細胞／ｍｌ）、ナンノクロロプシス６００億細胞（６００万細胞／ｍｌ）を毎日1回添加して５日間培養した。試験区ごとに３水槽ずつ使用し、培養水温はヒーターを用いて２５℃に調整した。毎日１回午前７時にワムシの密度とワムシの単為生殖卵密度を実体顕微鏡下で計数した。毎日計数したワムシ密度の実験開始時のワムシ個体密度に対する比率（％）を計算し、比増殖率とした。また、単為生殖卵密度をワムシ個体数で除することで、ワムシ１個体あたりの携卵率を算出した。培養５日目のワムシ比増殖率の処理間の違いをｐａｉｒｗｉｓｅ－ｔ検定で比較した。
　ワムシの密度の結果を表４及び図３に示す。無添加区では３日目からワムシ密度が減少に転じたのに対し、未処理または高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラとナンノクロロプシスを添加した区では、ワムシ密度（比増殖率）は培養期間を通して増加した。培養５日目のワムシ密度は高圧蒸気滅菌処理ナンノクロロプシスを添加した区で他区よりも有意に低かったが、高圧蒸気滅菌処理淡水クロレラは未処理淡水クロレラと同等のワムシ密度が得られた。これらのことから、ナンノクロロプシスについては高圧蒸気滅菌処理によって餌料価値の減少がみられるが、淡水クロレラについては餌料価値が減少しないことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ワムシ携卵率の結果を表５及び図４に示す。ワムシの携卵率の推移は、減少を続けた無添加区を除いて、未処理ナンノクロロプシス区で培養２日目に高くなったほかは、すべての試験区でほぼ同様の推移を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
［実施例５］
淡水クロレラとナンノクロロプシスの高圧蒸気滅菌処理がアルテミアの生残と成長に及ぼす影響
（方法）
　海水を満たした１Ｌビーカーに２５℃で２４時間かけてふ化させたアルテミアノープリウス（アメリカソルトレイク産）を平均１０．７個体／ｍｌ（範囲１０．０～１２．０個体/ｍｌ）の密度で接種し、未処理または高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラ１０億細胞（１００万細胞/ｍｌ）、ナンノクロロプシス２０億細胞（２００万細胞/ｍｌ）を毎日２回添加して６日間培養した。試験区ごとに３ビーカーずつ設け、培養水温はヒーターを用いて２５℃に調整した。毎日1回午前８時にアルテミアの密度を計数し、各ビーカーからサンプリングした３０個体のアルテミアの全長を２日毎に測定した。培養６日目の各試験区間のアルテミアの生残率と全長の違いをｐａｉｒｗｉｓｅ-ｔ検定で比較した。
　結果を表６、表７、図５及び図６に示す。高圧蒸気滅菌処理したナンノクロロプシスを添加した場合に、アルテミアの生残が最も高く、成長も最も早かった。高圧蒸気滅菌処理したナンノクロロプシスはアルテミアが消化可能となることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［実施例６］
高圧蒸気滅菌処理が淡水クロレラとナンノクロロプシスの総脂質、ＥＰＡ、ＤＨＡ、およびｎ－３系高度不飽和脂肪酸含量に及ぼす影響
　未処理または高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラとナンノクロロプシスを１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、沈殿物の一部を１１０℃のオーブンで恒量に達するまで水分を蒸発させて乾燥重量を求めた。沈殿物にクロロホルム・メタノール混液を加えてホモジナイズし、溶媒を除去して抽出された脂質重量を計測して総脂質含量を求めた。総脂質に水酸化カリウムを加えて加熱してケン化し、ケン化物を三フッ化ホウ素酸メタノールによりメチル化した。精製した脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフ（島津製作所ＧＣ－１７Ａ）に導入して分離・検出し、市販の標準試料と比較して各脂肪酸を同定した。また、ｎ－３系の不飽和脂肪酸のうち炭素数２０以上のものの合計をｎ－３系高度不飽和脂肪酸（ｎ－３ＨＵＦＡ）含量として算出した。淡水クロレラとナンノクロロプシスのそれぞれについて、未処理と高温高圧処理したものの乾燥重量当たりの総脂質含量、ＥＰＡ 、およびＤＨＡ含量を算出し、Ｗｅｌｃｈのｔ検定で比較した。
　結果を表８及び図７に示す。高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラとナンノクロロプシスは未処理のものと同程度の総脂質、ＥＰＡ、ＤＨＡ、及びｎ－３ＨＵＦＡ含量を有しており、脂肪酸含有量の観点からは滅菌処理による栄養価の低下はなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［実施例７］
高圧蒸気滅菌処理した微細藻類濃縮液がアルテミアの総脂質、ＥＰＡ、ＤＨＡ、およびｎ－３系高度不飽和脂肪酸含量に及ぼす影響
　ソルトレイク産のアルテミア耐久卵を２５℃で２４時間かけて海水中でふ化させたのち、２５℃の海水を満たした１００Ｌ水槽に２００万個体ずつ収容した。未処理または高圧蒸気滅菌処理したナンノクロロプシス２０億細胞（２００万細胞／ｍｌ）を毎日２回添加して４８時間培養した。対照として、微細藻類を添加しない水槽（無添加）も設けた。培養終了後にプランクトンネットでアルテミアをサンプリングして蒸留水で洗浄後し、－８０℃で保存した。後日、微細藻類と同様の方法でアルテミアの総脂質含量と脂肪酸組成を分析した。
　結果を表９及び図８に示す。高圧蒸気滅菌処理したナンノクロロプシス濃縮液を添加して培養したアルテミアは、未処理のものを添加した区と無添加区と比較して、総脂質含量とＥＰＡ含量が増加していた。アルテミアが高温高圧処理ナンノクロロプシスを消化吸収可能であることが示されるとともに、高圧蒸気滅菌処理ナンノクロロプシスの給餌でアルテミアの栄養価が向上することが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
［実施例８］
淡水クロレラの殺菌温度と圧力がワムシの増殖に及ぼす影響
　１０Ｌの海水を満たした水槽にワムシを平均１２６個体／ｍｌ（範囲１１６～１３８個体／ｍｌ）の密度で接種し、無添加、未処理、１０５℃（０．１２ＭＰａ）、１１５℃（０．１７ＭＰａ）、１２１℃（０．２１ＭＰａ）、および１３５℃（０．３２ＭＰａ）で２０分間高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラ３００億細胞（３００万細胞／ｍｌ）を毎日１回添加して３日間培養した。試験区ごとに２水槽ずつ使用し、培養水温はヒーターを用いて２４．７℃に調整した。毎日１回午前８時にワムシの密度とワムシの単為生殖卵密度を実体顕微鏡下で計数した。毎日計数したワムシ密度の実験開始時のワムシ個体密度に対する比率（％）を計算し、比増殖率とした。また、単為生殖卵密度をワムシ個体数で除することで、ワムシ１個体あたりの携卵率を算出した。実験終了時の比増殖率の処理間の違いをｐａｉｒｗｉｓｅ－ｔ検定で比較した。
　結果を表１０～１１及び図９～１０に示す。
　無添加区では２日目からワムシ密度（比増殖率）が減少に転じたのに対し、未処理または各温度（圧力）で処理した淡水クロレラを添加した区では、ワムシ密度は培養期間を通して増加した。培養３日目のワムシの比増殖率は未処理または処理温度間で有意差は認められず、１０５℃（０．１２ＭＰａ）～１３５℃（０．３２ＭＰａ）までの高温高圧処理はワムシに対する餌料価値に影響しないことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
［実施例９］
淡水クロレラの殺菌時間がワムシの増殖に及ぼす影響
　１０Ｌの海水を満たした水槽にワムシを平均９８個体／ｍｌ（範囲８７～１１５個体／ｍｌ）の密度で接種し、無添加、未処理、１０５℃および１３５℃で１分間または６０分間高圧蒸気滅菌処理した淡水クロレラ３００億細胞（３００万細胞／ｍｌ）を毎日１回添加して４日間培養した。試験区ごとに２水槽ずつ使用し、培養水温はヒーターを用いて２１．２℃に調整した。毎日１回午前８時にワムシの密度とワムシの単為生殖卵密度を実体顕微鏡下で計数した。毎日計数したワムシ密度の実験開始時のワムシ個体密度に対する比率（％）を計算し、比増殖率とした。また、単為生殖卵密度をワムシ個体数で除することで、ワムシ１個体あたりの携卵率を算出した。実験終了時の比増殖率の処理間の違いをｐａｉｒｗｉｓｅ－ｔ検定で比較した。
　結果を表１２～１３及び図１１～１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
［実施例１０］
市販可消化ナンノクロロプシスと高温高圧処理ナンノクロロプシスのアルテミアの消化速度の比較
　海水を満たした１Ｌビーカーに２７℃で２４時間かけてふ化させたアルテミアノープリウス（アメリカソルトレイク産）を１０個体／ｍｌの密度で接種し、市販可消化ナンノクロロプシス（マリンテック社製マリンアルファ）、および未処理または高圧蒸気滅菌処理（１２１℃２０分間）したナンノクロロプシス３０億細胞（３００万細胞／ｍｌ）を１回添加し、添加直後から２４時間後まで３時間ごとにナンノクロロプシスの残留密度を計測した。試験区ごとにビーカーを３つずつ用いた。ナンノクロロプシスの計測には、顕微鏡下でビルケルチュルク血球計算盤を用いた。添加時の密度を１００とした各時間の残留割合を算出した。また、計測時間とナンノクロロプシスの種類の違いを説明変数、残留密度を応答変数として一般化線形混合モデルを用いて、ナンノクロロプシスの種類の違いの影響を比較した。
　結果を表１４～１５及び図１３に示す。未処理区では２４時間以内のナンノクロロプシス残留密度の低下は見られなかった。高圧蒸気滅菌処理区とマリンアルファ区では時間の経過に伴い残留密度が低下したが、高温高圧処理区が未処理区とマリンアルファ区よりも有意に減少が早かった（Ｐ＜０．０００１）。この結果から、高温高圧処理により、アルテミアがナンノクロロプシスを消化可能になることが再確認されるとともに、市販の可消化ナンノクロロプシスよりもアルテミアによる消化吸収が優れていることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　本発明により、微生物による腐敗が進行することなく、長期間常温で保存可能な、動物プランクトン用飼料組成物が提供される。
　本出願は、日本で出願された特願2014-83934（出願日：2014年4月15日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。 

Claims (20)

  1. 　１０５～１３５℃、０．１２～０．３２ＭＰaにて１～６０分間、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類を含む、動物プランクトン用飼料組成物。
  2. 　高圧蒸気滅菌処理条件が、１１９～１２３℃、０．２０～０．２２ＭＰa、１５～２５分間である、請求項１記載の組成物。
  3. 　組成物中の一般細菌数が、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下である、請求項１又は２記載の組成物。
  4. 　組成物中の一般細菌数が、０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である、請求項３記載の組成物。
  5. 　微細藻類が、クロレラ又はナンノクロロプシスである、請求項１～４のいずれか１項記載の組成物。
  6. 　動物プランクトンが、ワムシ又はアルテミアである、請求項１～５のいずれか１項記載の組成物。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項記載の組成物が封入された、レトルトパウチ。
  8. 　微細藻類を、１０５～１３５℃、０．１２～０．３２ＭＰaにて１～６０分間、高圧蒸気滅菌処理に付し、滅菌処理された微細藻類を得ることを含む、動物プランクトン用飼料組成物の製造方法。
  9. 　高圧蒸気滅菌処理条件が、１１９～１２３℃、０．２０～０．２２ＭＰa、１５～２５分間である、請求項８記載の製造方法。
  10. 　組成物中の一般細菌数が、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下である、請求項８又は９記載の製造方法。
  11. 　組成物中の一般細菌数が、０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である、請求項１０記載の製造方法。
  12. 　微細藻類が、クロレラ又はナンノクロロプシスである、請求項８～１１のいずれか１項記載の製造方法。
  13. 　動物プランクトンがワムシ又はアルテミアである、請求項８～１２のいずれか１項記載の製造方法。
  14. 　動物プランクトンに対して、１０５～１３５℃、０．１２～０．３２ＭＰaにて１～６０分間、高圧蒸気滅菌処理に付した微細藻類を給餌することを含む、動物プランクトンの養殖方法。
  15. 　高圧蒸気滅菌処理条件が、１１９～１２３℃、０．２０～０．２２ＭＰa、１５～２５分間である、請求項１４記載の養殖方法。
  16. 　滅菌処理された微細藻類中の一般細菌数が、１．０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）以下である、請求項１４又は１５記載の養殖方法。
  17. 　滅菌処理された微細藻類中の一般細菌数が、０（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍｌ）である、請求項１６記載の養殖方法。
  18. 　微細藻類が、クロレラ又はナンノクロロプシスである、請求項１４～１７のいずれか１項記載の養殖方法。
  19. 　動物プランクトンが、ワムシ又はアルテミアである、請求項１４～１８のいずれか１項記載の養殖方法。
  20. 　請求項１～６のいずれか１項記載の組成物、及び動物プランクトンを含む、動物プランクトンの養殖用キット。
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