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WO2015026114A1 - 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2015026114A1
WO2015026114A1 PCT/KR2014/007631 KR2014007631W WO2015026114A1 WO 2015026114 A1 WO2015026114 A1 WO 2015026114A1 KR 2014007631 W KR2014007631 W KR 2014007631W WO 2015026114 A1 WO2015026114 A1 WO 2015026114A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
palmitoyl
composition
rheumatoid arthritis
oleoyl
stearoyl
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/KR2014/007631
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김재화
오세량
안경섭
강호범
박범수
이태석
강종구
정영식
한용해
손기영
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Enzychem Lifesciences Corp
Original Assignee
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Enzychem Lifesciences Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to AU2014309637A priority Critical patent/AU2014309637B2/en
Priority to US14/912,049 priority patent/US20160199338A1/en
Priority to ES14837360T priority patent/ES2751495T3/es
Priority to RU2016109975A priority patent/RU2646823C2/ru
Priority to CN201480050098.XA priority patent/CN105530930A/zh
Priority to JP2016536022A priority patent/JP6081024B2/ja
Application filed by Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB, Enzychem Lifesciences Corp filed Critical Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority to EP14837360.8A priority patent/EP3037090B1/en
Priority to CA2921845A priority patent/CA2921845C/en
Publication of WO2015026114A1 publication Critical patent/WO2015026114A1/ko
Priority to US15/048,732 priority patent/US9895337B2/en
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    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition, nutraceutical composition and quasi-drug composition for the prevention, treatment or improvement of rheumatoid arthritis containing a monoacetyldiacylglycerol compound as an active ingredient.
  • Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that causes inflammation by attacking a part of one's joints or body due to an abnormal immune system and causes pain and swelling of various joints such as fingers, hands, feet, wrists, ankles and knees.
  • a systemic chronic inflammatory disease that can cause abnormalities in many other organs such as muscles, skin, lungs, and eyes. Since the direct cause of such arthritis is not clear yet, research on it is ongoing. As of now, no effective treatment or prevention method for arthritis such as rheumatoid arthritis has been well known. There are many ways left.
  • Hormones such as steroid hormones
  • Arthritis especially chronic rheumatoid arthritis, causes severe pain in patients, so must take anti-inflammatory drugs, etc.
  • Aspirin has been widely used for a long time to alleviate such pain. However, since aspirin has a fatal effect on the stomach of the person, it is considered difficult to continue taking the amount needed to treat arthritis.
  • EC-18 is a type of monoacetyletyldiglyceride, isolated from antler. EC-18 has been shown to significantly increase the survival rate of animals in sepsis animal models using cecal-ligation-puncture, and is not toxic in good laboratory practice (GLP) toxicity studies. However, the effect of such monoacetyldiacylglycerol compounds including EC-18 on rheumatoid arthritis has not been disclosed yet. Accordingly, the present inventors have made intensive efforts to develop a therapeutic agent for rheumatoid arthritis of natural products or new compounds.
  • the monoacetyldiacylglycerol compound inhibits the activity of STAT-3, which is a therapeutic target of rheumatoid arthritis, to prevent or prevent rheumatoid arthritis.
  • the present invention has been accomplished by confirming that it can be usefully used for treatment.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition, a nutraceutical composition and quasi-drug composition for the prevention, treatment or improvement of rheumatoid arthritis, containing a monoacetyldiacylglycerol compound represented by the following formula (1) as an active ingredient will be.
  • R1 and R2 are each a fatty acid group having 14 to 20 carbon atoms.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating rheumatoid arthritis, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject having or possibly suffering from rheumatoid arthritis.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of rheumatoid arthritis, containing a monoacetyldiacylglycerol compound represented by the following formula (1) as an active ingredient.
  • R1 and R2 are each a fatty acid group having 14 to 20 carbon atoms.
  • the fatty acid group refers to the remainder of which the -OH group is excluded from the carboxyl group of the fatty acid.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating rheumatoid arthritis of the present invention may include a monoacetyldiacylglycerol compound represented by Chemical Formula 1.
  • a monoacetyldiacylglycerol compound represented by Chemical Formula 1.
  • the term "monoacetyldiacylglycerol compound” refers to a derivative of glycerol having one acetyl group and two acyl groups, also referred to as monoacetyldiglycerol (MADG).
  • R1 and R2 may each be a fatty acid group having 14 to 20 carbon atoms, preferably palmitoyl, palmoyl, linoleoyl, or linoleoyl. , Linolenoyl, stearoyl, myristoyl or arachidonoyl, or arachidonoyl, and the like, but is not limited thereto.
  • R1 and R2 is oleoyl / palmitoyl, palmitoyl / oleoyl, palmitoyl / linoleyl, palmitoyl / linolenoyl, palmitoyl / arachidonoyl, palmi Soil / Stearoyl, Palmitoyl / Palmitoyl, Oleoyl / Stearoyl, Linoleoyl / Palmitoyl, Linoleoyl / Stearoyl, Stearoyl / Linooleyl, Stearoyl / Oleoyl, Miri It may be, but is not limited to, stolen / linoleoyl or myristoyl / oleoyl.
  • the monoacetyldiacylglycerol compound may be (R) -type, (S) -type or racemate in optical
  • the monoacetyldiacylglycerol compound may be preferably a compound represented by the following formula (2).
  • the compound represented by the formula (2) is called 1-palmitoyl-2-linoleyl (linoleoyl) -3-acetylglycerol (acetylglycerol), may also be named EC-18.
  • R1 and R2 of the compound correspond to palmitoyl and linoleyl, respectively.
  • the monoacetyldiacylglycerol compound may be extracted / separated from antler, or may be prepared by a known organic synthesis method (Korea Patent No. 10-0789323). Specifically, the antler is extracted with hexane, the extraction residue is extracted again with chloroform, and the obtained extract is distilled under reduced pressure to obtain the chloroform extract of the antler.
  • the amount of hexane and chloroform, which are the extraction solvents used in the extraction, is sufficient to cover the amount of deer antler used, and in general, hexane and chloroform may be used in a ratio of about 4 to 5 L with respect to 1 kg of deer antler, respectively. The type and amount of use is not limited to this.
  • the chloroform extract of antler obtained in this manner was subsequently fractionated and purified by a series of silica gel column chromatography and TLC method to obtain the monoacetyldiacylglycerol compound used in the present invention.
  • Chloroform / methanol, hexane / ethyl acetate, hexane / ethyl acetate / acetic acid, etc. may be used as the eluent in the chromatography purification step, but is not limited thereto.
  • a method for chemically synthesizing the monoacetyldiacylglycerol compound used in the present invention is disclosed in Korean Patent No. 10-0789323. Specifically, (a) attaching a protecting group at position 3 of 1-R1-glycerol to prepare 1-R1-3-protecting group-glycerol; (b) preparing 1-R1-2-R2-3-protecting group-glycerol by introducing an R2 group at position 2 of 1-R1-3-protecting group-glycerol; (c) a step of simultaneously performing the deprotection reaction and the acetylation reaction of 1-R1-2-R2-3-protecting group-glycerol, and purifying as needed, and the desired monoacetyldiacylglycerol compound It may be synthesized, and may be obtained by other method of acetic acid decomposition (phosphatodylcholine), but is not limited thereto. In addition, all stereoisomers of the compound of Formula 1 may be included within the scope of the present invention
  • the monoacetyldiacylglycerol compound can inhibit phosphorylation of STAT-3, and thus it can be effectively used for the prevention or treatment of rheumatoid arthritis.
  • rheumatic arthritis is an unexplained chronic inflammatory disease characterized by polyarthritis, which initially causes inflammation in the synovial envelope surrounding the joint, but gradually spreads to the surrounding cartilage and bones to destroy and deform the joint. This disease is caused. In addition to joints as well as extra-articular symptoms, it can invade the whole body such as anemia, dry syndrome, subcutaneous nodules, pulmonary fibrosis, vasculitis, and skin ulcers. Drugs used for rheumatoid arthritis include nonsteroidal anti-inflammatory drugs, steroids, anti-rheumatic drugs, and TNF blockers, but are known to have risks of various side effects.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of rheumatoid arthritis by administration of the composition of the present invention
  • treatment means that the symptoms caused by rheumatoid arthritis are improved or beneficial by the composition of the present invention. Means any behavior that changes.
  • Th17 cells producing interleukin-17 have been shown to play a leading role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis, in particular directly inducing arthritis and bone destruction.
  • STAT-3 known as a key transcription factor in the differentiation and activity of Th17 cells, can directly regulate the locus of IL-17 and play a role as an essential factor in the expression of many transcription factors related to Th17 differentiation. It is known. STAT-3 can be activated by phosphorylation. Inhibiting the activity of this STAT-3 in Th17 cells is known that Th17 cells are controlled and the activity of immunoregulatory T cells is increased, preventing or treating rheumatoid arthritis. As a result, STAT-3 has been identified as a therapeutic target for rheumatoid arthritis.
  • EC937 is treated with STAT-3 activated by treating IL937 and PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) to U937 cells and NK-92 cells, respectively.
  • IL937 and PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate
  • the effect of inhibiting phosphorylation of STAT-3 in a concentration-dependent manner of -18 was confirmed (Experimental Examples 1 and 2, FIGS. 1 and 2), and ii) to STAT-3 activated by treating IL-10 with A549 and HepG2 cells.
  • FIGS. 1 and 2 When treated with EC-18, it was confirmed that the activity of STAT-3 was reduced (Experimental Example 3, Figure 3). This shows that the monoacetyldiacylglycerol compound is effective for the treatment of rheumatoid arthritis.
  • compositions comprising the monoacetyldiacylglycerol compounds of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients or diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the content of the monoacetyldiacylglycerol compound included in the composition is not particularly limited, but is 0.0001 to 100.0% by weight, preferably 0.001 to 50.0% by weight, more preferably 0.01 to 20% based on the total weight of the composition. It may be included in weight percent.
  • the pharmaceutical composition is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilizers and suppositories. It can have a formulation of, and can be a variety of oral or parenteral formulations. When formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose (at least one compound). lactose) and gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc and the like are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solution solutions, emulsions, and syrups, and various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be included. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level is determined by the type and severity, age, sex, disease of the individual. It may be determined according to the type, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations.
  • the preferred dosage of the composition of the present invention depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration of time, and the suitable total daily dosage can be determined by the practitioner within the correct medical judgment. Generally, an amount of 0.001 to 1000 mg / kg, preferably 0.05 to 200 mg / kg, more preferably 0.1 to 100 mg / kg, may be administered once to several times daily.
  • the composition is not particularly limited as long as it is an individual for the purpose of preventing or treating rheumatoid arthritis, and any individual may be applied.
  • it can be applied to any individual, such as monkeys, dogs, cats, rabbits, marmots, rats, mice, cows, sheep, pigs, goats, and the like, and to humans, and the mode of administration is conventional in the art. If not included.
  • it may be administered by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or cerebrovascular injections.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving rheumatoid arthritis, containing a monoacetyldiacylglycerol compound represented by the following formula (1) as an active ingredient.
  • R1 and R2 may each be a fatty acid group having 14 to 20 carbon atoms, but are not limited thereto.
  • the monoacetyldiacylglycerol compound of the present invention may be included in the dietary supplement composition for the purpose of preventing or improving rheumatoid arthritis.
  • the monoacetyldiacylglycerol compound and rheumatoid arthritis are as described above.
  • the term "improvement” refers to all the acts that improve or benefit the symptoms of a suspicious and onset individual with rheumatoid arthritis using the composition.
  • the composition of the present invention When the composition of the present invention is used in a health functional food, the composition may be added as it is or used with other health functional foods or health functional food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the intended use.
  • the composition of the present invention may be added in an amount of preferably 15 parts by weight or less, more preferably 10 parts by weight or less based on 100 parts by weight of the raw material in the manufacture of food or beverage.
  • the amount may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety.
  • health functional food may include the composition of the present invention
  • specific examples include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, and ice cream.
  • Dairy products, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, etc. may include all of the health functional foods in the conventional sense, and may include foods used as feed for animals.
  • the health functional food composition of the present invention when used in the form of a beverage, it may contain various sweetening agents, flavoring agents or natural carbohydrates, etc. as additional ingredients, as in the usual beverage.
  • the natural carbohydrate may be glucose, monosaccharides such as fructose, maltose, disaccharides such as sucrose, polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, erythritol.
  • the ratio of the natural carbohydrate is not limited thereto, but may be preferably about 0.01 to 0.04 g, more preferably 0.02 to 0.03 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the sweetener may be a natural sweetener such as taumartin, stevia extract and a synthetic sweetener such as saccharin, aspartame.
  • the nutraceutical composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin , Alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. Others may contain pulp for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks.
  • the present invention provides a quasi-drug composition for the prevention or improvement of rheumatoid arthritis, containing a monoacetyldiacylglycerol compound represented by the following formula (1) as an active ingredient.
  • R1 and R2 may each be a fatty acid group having 14 to 20 carbon atoms, but are not limited thereto.
  • the monoacetyldiacylglycerol compound of the present invention can be added to the quasi-drug composition for the purpose of preventing or improving rheumatoid arthritis.
  • the monoacetyldiacylglycerol compound and rheumatoid arthritis are as described above.
  • the term "quasi drug” refers to a fiber, a rubber product or the like used for the purpose of treating, alleviating, treating or preventing a disease of a human or animal, has a weak action on the human body or does not directly act on the human body, Or non-machinery and the like, or any of the agents used for sterilization, insecticide, and similar purposes for the prevention of infection, for the purpose of diagnosing, treating, reducing, treating or preventing human or animal diseases.
  • articles to be used which are not instruments, machines or devices, and articles which are used for the purpose of pharmacologically affecting the structure and function of humans or animals, except those which are not instruments, machines or devices. Also includes supplies.
  • the composition of the present invention When the composition of the present invention is included in a quasi-drug for the purpose of preventing or improving rheumatoid arthritis, the composition may be used as it is or may be used together with other quasi-drug components, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient can be suitably determined depending on the intended use.
  • the external skin preparations are not particularly limited thereto, but may be prepared and used, for example, in the form of an ointment, lotion, spray, patch, cream, powder, suspension, gel or gel.
  • the present invention provides a method for preventing or treating rheumatoid arthritis, comprising administering the pharmaceutical composition to a susceptible subject to rheumatoid arthritis.
  • the suspicious subject of rheumatoid arthritis means all animals including humans having or may develop rheumatoid arthritis, and by administering a pharmaceutical composition comprising the compound of the present invention to a suspicious rheumatoid arthritis subject, Can be treated.
  • Rheumatoid arthritis is as described above.
  • the term "administration" refers to the introduction of the pharmaceutical composition of the present invention to a subject suspected of rheumatoid arthritis by any suitable method, and the route of administration is through various routes of oral or parenteral as long as the target tissue can be reached. May be administered.
  • the method of treatment of the present invention may include administering a pharmaceutical composition comprising the monoacetyldiacylglycerol compound of Formula 1 in a pharmaceutically effective amount.
  • Suitable total daily doses may be determined by the practitioner within the correct medical judgment and are generally in amounts of 0.001 to 1000 mg / kg, preferably 0.05 to 200 mg / kg, more preferably 0.1 to 100 mg / The amount of kg may be administered once to several times daily.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient is determined by the specific composition, including the type and extent of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health of the patient, It is desirable to apply differently depending on various factors and similar factors well known in the medical field, including sex and diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, drugs used with or co-specific with the specific composition.
  • the monoacetyldiacylglycerol compound of the present invention has an excellent effect of inhibiting the phosphorylation of STAT-3, which is known as a therapeutic target for rheumatoid arthritis, and overcomes the side effects of currently used rheumatoid arthritis therapeutics, and is excellent in treatment effect without toxicity.
  • STAT-3 which is known as a therapeutic target for rheumatoid arthritis
  • As a compound it can be usefully used as a composition for preventing, treating and improving rheumatoid arthritis.
  • FIG. 1 is a diagram showing Western blot results showing the phosphorylation inhibitory effect according to the EC-18 concentration of STAT-3 phosphorylated by IL-6 in U937 cells.
  • A shows the result of treating EC-18 for 15 minutes
  • B shows the result of treating EC-18 for 60 minutes.
  • Figure 2 is a Western showing the phosphorylation inhibitory effect according to the EC-18 concentrations of STAT-3 (A) and STAT-1 (B) phosphorylated by PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) in NK-92 cells A diagram showing blot results.
  • Figure 3 is a diagram showing the luminescence value of luciferase according to the EC-18 concentration-specific treatment of STAT-3 activated by IL-10 in A549 cells (A) and HepG2 cells (B).
  • 4 is a graph showing the results of interleukin-6 concentration measurement in serum collected on the day of tissue extraction for the normal control group, the negative control group, the EC-18 administration group, and the positive control group.
  • Figure 5 is a graph showing the gross arthritis index over time of the normal control, negative control, EC-18 administration group and positive control group.
  • Figure 6 is a graph showing the histopathological results of arthritis symptoms for the normal control group, negative control group, EC-18 administration group and positive control group.
  • 7 and 8 are photographs of the normal control group, negative control group, EC-18 administration group and positive control group stained arthritis tissue and magnified under a microscope.
  • NK-92, U937, A549, HepG2 American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD
  • NK-92 cell line alphal- including 20% elegant serum (Fetal Calf Serum, FCS, HyClone, Logan, UT), 2 mM L-glutamate, 100 ⁇ g / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin (Life Technologies)
  • MEM Life Technologies, Düsseldorf, Germany
  • U937, A549, and HepG2 cell lines were cultured in RPMI medium containing 10% elegant serum.
  • Cold SDS-soluble buffer [(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.1% SDS, 1 mM Na 3 VO 4 , 10) in cells treated with EC-18 and IL-6 cytokines. mM NaF, and complete Protein Inhibitor Cocktail (Roche)] were dissolved in ice for 30 min. The lysed cell solution was spun at 13,000 rpm for 30 min using a high speed rotor to precipitate the insoluble portion and separate the aqueous solution.
  • the separated cell aqueous solution was quantified and subjected to electrophoresis using SDS-PAGE at a concentration of about 10 to 12%
  • the cell protein isolated on the gel was transferred to PVDF membrane (Millipore, Billerica, MA, USA) at 100 V for 2 hours. .
  • the membrane was reacted with an ECL reagent (Millipore, Billerica, Mass., USA) and exposed to an X-ray film to confirm the degree of phosphorylation of STAT-3 as a band on the film.
  • ECL reagent Millipore, Billerica, Mass., USA
  • Cold SDS-soluble buffer [(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.1% SDS, 1 mM) in cells treated with EC-18 and Phorbol 12-myristate 13-acetate Na 3 VO 4 , 10 mM NaF, and complete Protein Inhibitor Cocktail (Roche)] were dissolved in ice for 30 minutes, and the dissolved cell solution was spun at 13,000 rpm for 30 minutes using a high speed rotor to precipitate the insoluble portion. The aqueous solution was separated, and the aqueous cell solution was quantified and electrophoresed using SDS-PAGE at a concentration of about 10 to 12%. Transcription was carried out for 2 hours.
  • poly rabbit anti-STAT3, -STAT1, and -phosphor STAT3 were used as primary antibodies at 60 at room temperature. The reaction was carried out for a minute. The secondary antibody was reacted with horseradish peroxidase peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnology, USA) (1: 3000) at room temperature for 60 minutes. The same amount of cellular protein was measured by poly rabbit anti-STAT3.
  • the membrane was reacted with an ECL reagent (Millipore, Billerica, Mass., USA) and exposed to an X-ray film to confirm the degree of phosphorylation of STAT as a band on the film.
  • the pGL4.47 [luc2P / SIE / Hygro] vector (Promega) containing the sis-Inducible Element (SIE) to which STAT-3 binds was introduced into A549 cells and HepG2 cells, and then pretreated with EC-18 and IL. Inhibition of STAT-3 activity was analyzed by -10 treatment.
  • A549 cells and HepG2 cells were separated by treatment with trypsin-EDTA, and then aliquoted in a culture dish, and pGL4.47 [luc2P / SIE / Hygro] vector was introduced into the cells using an Attractene Transfection Reagent (Qiagen). Incubated for one day at 5% CO 2 conditions. The next day, the cells were separated from the culture dish and then dispensed in a 0.1-well plate at a 96-well plate so that the population of 5 ⁇ 10 4 cells / well, and incubated for one day at 37 °C, 5% CO 2 conditions.
  • IL-10 IL-10
  • 0.1-well solution of ONE-Glo TM Luciferase Assay Buffer and Substrate mixed 1: 1 was added to 96-well, and the degree of luminescence after about 3 minutes was measured using VICTOR X Multilabel Plate Reader (PerkinElmer). It was measured for a second.
  • the luminescence value of luciferase was decreased when the EC-18 was treated for each concentration, compared to the IL-10-only value, and the relative activity was decreased (FIGS. 3A and 3B). That is, it was confirmed that the activity of STAT-3 induced by IL-10 was significantly reduced in A549 cells and HepG2 cells treated with EC-18.
  • arthritis was induced by administration of bovine type II collagen to male DBA / 1J mice, followed by repeated oral administration of EC-18 to evaluate the efficacy of treatment (improvement) for arthritis.
  • remichemid was repeatedly administered as 'positive control 1' and methotrexate was administered orally as 'positive control 2'.
  • Group composition was normal control (G1), negative control (G2, negative control), EC-18 (test substance, G3, G4, G5) doses of 125, 500 and 2,000 mg / kg, 20 mg / kg dose
  • Ten groups were set up in each of 7 groups of 'positive control 1' (Remicade, G6) and 'positive control 2' (Methotrexate, G7) of 2.5 mg / kg.
  • FIG. 4 The results of measuring interleukin-6 concentration in the serum collected on the day of tissue extraction are shown in FIG. 4.
  • the interleukin-6 (IL-6) concentration was significantly increased in arthritis-induced arthritis model animals (G2, negative control), and EC-18 treated animals (G3, G4, G5).
  • IL-6 levels in the blood were reduced similarly to those of the positive control group (Remicade, Methothrexate treatment group, G6 and G7).
  • 5 is a graph showing the gross arthritis score (Arthritis Score) over time of the normal control, negative control, EC-18 administration group and positive control (analysis by administration date), as shown in Figure 5, by collagen
  • the gross arthritis index of the EC-18 group was significantly decreased compared to the negative control group (G2).
  • FIG. 6 is a graph showing the results of histopathological examination of arthritis symptoms by extracting knee joints of both hind legs of the normal control group, the negative control group, the EC-18 administration group, and the positive control group.
  • the histopathological Arthritis Score was high in the model animal (G2) induced arthritis by collagen and positive in the histopathological arthritis index in the EC-18 treated animals (G3, G4, G5). It was reduced similarly to the control group (Remicade, Methothrexate treated group, G6 and G7).
  • 7 and 8 shows arthritis tissues for the normal control group (G1), the negative control group (G2, Negative control), the EC-18 administration group of 500 mg / kg dose, and the Remicade administration group (G6) of 20 mg / kg dose.

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Abstract

본 발명은 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는, 류마티스 관절염의 예방, 치료 또는 개선용 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 류마티스 관절염의 치료 표적물질로 알려진 STAT-3의 인산화를 억제하는 효과가 우수한 바, 현재 사용되는 류마티스 관절염 치료제의 부작용을 극복하고, 독성이 없으면서 치료효과가 탁월한 화합물로서 류마티스 관절염 예방, 치료 및 개선용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염의 예방, 치료 또는 개선용 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.
류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)이란, 면역체계의 이상에 의해 자신의 관절이나 몸의 일부를 공격하여 염증을 일으키는 자가면역질환으로서, 손가락, 손, 발, 손목, 발목, 무릎 등 여러 관절이 아프고 붓는 증세를 나타내며, 근육, 피부, 폐, 눈 등 여러 다른 장기에도 이상을 초래할 수 있는 전신적인 만성 염증성 질환을 말한다. 이러한 관절염이 발생하게 되는 직접적인 원인은 아직까지 명확하지 않기 때문에 이에 대한 연구가 계속적으로 진행되고 있으며, 현재까지도 류마티스 관절염 등의 관절염에 대한 효과적인 치료 방법이나 예방 방법 등이 제대로 알려진 바가 없어, 이에 대해 해결방안들이 많이 남아 있는 실정이다. 관절염 치료제로서 스테로이드 호르몬제와 같은 호르몬제가 많이 알려지고 사용되어 왔으나, 이는 근원적인 치료법이라고 보기 어려우며, 부작용들이 보고됨에 따라 그 사용이 어렵게 되었다. 관절염, 특히 만성 류마티스 관절염은 환자에게 심한 통증을 유발하므로 반드시 항염증제 등을 복용하여야만 하는데, 이러한 통증을 완화시키기 위하여 오랫동안 널리 사용되어 온 것이 아스피린이다. 그러나 이러한 아스피린은 사람의 위에 치명적인 영향을 주므로 관절염을 치료하는 데에 필요한 양을 계속적으로 복용하는 것은 어려운 것으로 여겨지고 있다.
기존의 이러한 화학 요법적 약제는 약제의 장기간 사용을 방해하는 부작용, 항염증 효과의 결핍 및 이미 발생한 관절염에 대한 효능의 부족과 같은 결점을 가지고 있어, 이러한 문제에 대한 해결책으로서 효과적인 관절염 치료제의 개발에 대한 요구가 끊임없이 지속되고 있으며, 현재 사용되고 있는 대부분의 관절염 치료제는 정도의 차이나 개인적인 차이가 있기는 하지만 모두 어느 정도의 부작용을 가지고 있고, 특히 류마티스 관절염의 치료를 위해서는 약제를 장기간 복용할 필요가 있기 때문에, 부작용이 적은 약재를 개발하는 것이 매우 중요하고 시급한 문제가 되고 있다.
EC-18은 모노아세틸디글리세라이드(monoaetyldiglyceride)의 일종으로서, 녹용으로부터 분리되었다. EC-18은 cecal-ligation-puncture를 이용한 패혈증 동물모델에서 동물의 생존률을 크게 증가시켰음이 개시되었으며, GLP(Good Laboratory Practice) 독성시험에서도 독성이 없는 것으로 나타났다. 그러나 이러한 EC-18을 포함한 모노아세틸디아실글리세롤류 화합물이 류마티스 관절염에 있어서 어떠한 효과를 나타낼지에 대하여는 아직까지 개시된 바가 없다. 이에 본 발명자들은, 천연물 유래 혹은 새로운 화합물의 류마티스 관절염 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 모노아세틸디아실글리세롤류 화합물이 류마티스 관절염의 치료 표적물질인 STAT-3의 활성을 억제하여 류마티스 관절염의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은, 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는, 류마티스 관절염의 예방, 치료 또는 개선용 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 및 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2014007631-appb-I000001
상기 식에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 20의 지방산기이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 약학적 조성물을 류마티스 관절염의 발병 가능성이 있거나 류마티스 관절염을 앓고 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2014007631-appb-I000002
상기 식에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 20의 지방산기이다. 본 명세서에서 지방산기는 지방산의 카르복실기에서 -OH기가 제외된 나머지 부분을 의미한다.
구체적으로, 본 발명의 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, “모노아세틸디아실글리세롤 화합물”은 하나의 아세틸기와 2개의 아실기를 갖는 글리세롤의 유도체를 의미하며, 모노아세틸디글리세롤(MADG)이라고도 한다.
상기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤류 화합물에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 20의 지방산기일 수 있으며, 바람직하게는 팔미토일(palmitoyl), 올레오일(oleoyl), 리놀레오일(linoleoyl), 리놀레노일(linolenoyl), 스테아로일(stearoyl), 미리스토일(myristoyl) 또는 아라키도노일(arachidonoyl) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게는 상기 R1 및 R2의 조합(R1/R2)은 올레오일/팔미토일, 팔미토일/올레오일, 팔미토일/리놀레오일, 팔미토일/리놀레노일, 팔미토일/아라키도노일, 팔미토일/스테아로일, 팔미토일/팔미토일, 올레오일/스테아로일, 리놀레오일/팔미토일, 리놀레오일/스테아로일, 스테아로일/리놀레오일, 스테아로일/올레오일, 미리스토일/리놀레오일 또는 미리스토일/올레오일 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 광학활성에 있어, (R)-형, (S)-형 또는 라세미체일 수 있다.
상기 모노아세틸디아실글리세롤류 화합물은 바람직하게는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2014007631-appb-I000003
상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 1-팔미토일(palmitoyl)-2-리놀레오일(linoleoyl)-3-아세틸글리세롤(acetylglycerol)이라고 하며, EC-18이라 명명되기도 한다. 상기 화합물의 R1과 R2는 각각 팔미토일과 리놀레오일에 해당한다.
상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 녹용으로부터 추출/분리되거나, 공지의 유기합성법(대한민국등록특허 제10-0789323호)으로 제조될 수 있다. 구체적으로, 녹용을 헥산으로 추출하고, 그 추출잔사를 다시 클로로포름으로 추출한 다음, 수득된 추출액을 감압증류하여 녹용의 클로로포름 추출물을 수득할 수 있다. 상기 추출에서 사용되는 추출용매인 헥산 및 클로로포름의 양은 각각 사용된 녹용이 잠길 정도의 양이면 충분하며, 일반적으로는 녹용 1kg에 대하여 헥산 및 클로로포름을 각각 4~5ℓ정도의 비로 사용할 수 있으나, 추출용매의 종류와 사용량이 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 방법으로 수득한 녹용의 클로로포름 추출물을 계속해서 일련의 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 및 TLC 방법에 의해 더 분획화하고 정제하여, 본 발명에 사용되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 얻을 수 있다. 상기 크로마토그래피 정제 단계의 용리액으로는 클로로포름/메탄올, 헥산/에틸아세테이트, 헥산/에틸아세테이트/아세트산 등을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명에 사용되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 화학적으로 합성하는 방법은 대한민국등록특허 제10-0789323호에 공개되어 있다. 구체적으로, (a) 1-R1-글리세롤의 3번 위치에 보호기를 붙여 1-R1-3-보호기-글리세롤을 제조하는 과정; (b) 1-R1-3-보호기-글리세롤의 2번 위치에 R2기를 도입하여 1-R1-2-R2-3-보호기-글리세롤을 제조하는 과정 및; (c) 1-R1-2-R2-3-보호기-글리세롤의 탈보호 반응 및 아세틸화 반응을 동시에 수행하는 과정을 포함할 수 있고, 필요에 따라 정제하여, 목적하는 모노아세틸디아실글리세롤류 화합물을 합성할 수 있으며, 다른 방법으로는 포스파티딜콜린을 가아세트산 분해(acetolysis)하여 얻을 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 화학식 1의 화합물의 입체이성질체도 모두 본 발명의 범주 내로 포함할 수 있다.
본 발명에 의해 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 STAT-3의 인산화를 억제시킬 수 있음이 확인됨으로써, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있음이 확인되었다.
본 발명에서 용어, “류마티스 관절염”은 다발성 관절염을 특징으로 하는 원인불명의 만성 염증성 질환으로서, 초기에는 관절을 싸고 있는 활막에 염증이 발생하지만 점차 주위의 연골과 뼈로 염증이 퍼져 관절의 파괴와 변형을 초래하게 되는 질환이다. 또한 관절뿐만 아니라 관절 외 증상으로 빈혈, 건조증후군, 피하 결절, 폐섬유화증, 혈관염, 피부 궤양 등 전신을 침범할 수 있다. 이러한 류마티스 관절염에 사용되는 약제로는 비스테로이드성 항염제와 스테로이드, 항류마티스약제와 TNF 차단제 등이 있으나, 각종 부작용 등의 위험이 존재하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 류마티스 관절염의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 본 발명의 조성물에 의해 류마티스 관절염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
최근 인터루킨-17(IL-17)을 생산하는 Th17 세포가 류마티스 관절염의 병인에 주도적인 역할을 하며, 특히 관절염증과 골 파괴를 직접 유도하는 것이 밝혀졌다. 구체적으로, Th17 세포의 분화 및 활성에 핵심전사인자로 알려진 STAT-3는 직접적으로 IL-17의 로커스(locus)를 조절할 수 있고, Th17 분화와 관련된 많은 전사인자들의 발현에 필수적인 요소로써 역할을 수행하는 것으로 알려졌다. STAT-3는 인산화됨으로써 활성화될 수 있는데, Th17 세포 내에서 이러한 STAT-3의 활성을 억제하면, Th17 세포는 제어되고 면역 조절 T 세포의 활성은 증가하여, 류마티스 관절염을 예방 또는 치료할 수 있다는 것이 알려지면서, STAT-3가 류마티스 관절염의 치료 표적물질로 밝혀지게 되었다.
본 발명의 실시예에서는, i) U937 세포 및 NK-92 세포에 각각 IL-6 및 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)를 처리하여 활성화시킨 STAT-3에 EC-18을 처리한 경우, EC-18의 농도 의존적으로 STAT-3의 인산화를 억제하는 효과를 확인하였고(실험예 1 및 2, 도 1 및 2), ii) A549 및 HepG2 세포에 IL-10을 처리하여 활성화시킨 STAT-3에 EC-18을 처리한 경우, STAT-3의 활성이 감소되었음을 확인하였다(실험예 3, 도 3). 이는 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물이 류마티스 관절염의 치료에 유효함을 잘 보여주는 것이다. Collagen으로 관절염이 유도된 모델동물의 실시예에서는 육안적 관절염 지수 (실험예 4, 도 5)와 혈중 IL-6 농도(실험예 4, 도 4)에서 음성대조군과 비교하여 유의하게 감소하였고, 조직염색에 의한 검사결과(실험예 4, 도 6,7), collagen 으로 유발된 관절염에 대하여 시험물질인 EC-18 은 125, 500 및 2,000 mg/kg 용량에서 관절염 증상을 개선시키는 효능이 있는 것을 보여주고 있다.
본 발명의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 포함하는 약학적 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 100.0 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 50.0 중량%로, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으나, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 조성물은 류마티스 관절염의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물 및 인간 등 어느 개체에나 적용할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함한다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2014007631-appb-I000004
상기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 20의 지방산기일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 류마티스 관절염의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품 조성물에 포함시킬 수 있다. 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물 및 류마티스 관절염에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명에서 용어, "개선"은 상기 조성물을 이용하여 류마티스 관절염의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 조성물을 건강기능식품에 포함하여 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료 100 중량부에 대하여 바람직하게는 15 중량부 이하, 보다 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물을 포함할 수 있는 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 구체적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 바람직하게는 약 0.01 내지 0.04g, 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.03g일 수 있다. 상기 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제 및 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제일 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2014007631-appb-I000005
상기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 20의 지방산기일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 류마티스 관절염의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 수 있다. 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물 및 류마티스 관절염에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.
본 발명의 조성물을 류마티스 관절염의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품에 포함시킬 경우, 상기 조성물을 그대로 포함하여 사용하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다. 상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 연고제, 로션제, 스프레이제, 패치제, 크림제, 산제, 현탁제, 젤제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 류마티스 관절염의 의심개체에 투여하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명에서 상기 류마티스 관절염의 의심 개체는 류마티스 관절염이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 류마티스 관절염 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 류마티스 관절염에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 류마티스 관절염 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 상기 화학식 1의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 류마티스 관절염의 치료 표적물질로 알려진 STAT-3의 인산화를 억제하는 효과가 우수한 바, 현재 사용되는 류마티스 관절염 치료제의 부작용을 극복하고, 독성이 없으면서 치료효과가 탁월한 화합물로서 류마티스 관절염 예방, 치료 및 개선용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 U937세포에서 IL-6에 의해 인산화된 STAT-3의 EC-18 농도별 처리에 따른 인산화 억제효과를 나타낸 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 도이다. (A)는 EC-18을 15분간 처리한 결과이고, (B)는 EC-18을 60분간 처리하였을 때의 결과이다.
도 2는 NK-92 세포에서 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)에 의해 인산화된 STAT-3(A) 및 STAT-1(B)의 EC-18 농도별 처리에 따른 인산화 억제효과를 나타낸 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 A549 세포(A) 및 HepG2 세포(B)에서 IL-10에 의해 활성화된 STAT-3의 EC-18 농도별 처리에 따른 루시퍼레이즈의 발광값을 나타낸 도이다.
도 4는, 정상대조군, 음성대조군, EC-18 투여군 및 양성대조군에 대하여, 조직 적출일에 채취한 혈청에서 interleukin-6 농도 측정 결과를 보여주는 그래프.
도 5는 정상대조군, 음성대조군, EC-18 투여군 및 양성대조군의 시간에 따른 육안적 관절염 지수를 보여주는 그래프.
도 6은 정상대조군, 음성대조군, EC-18 투여군 및 양성대조군에 대하여, 관절염 증상에 대한 조직병리학적 검사 결과를 보여주는 그래프.
도 7 및 8은 정상대조군, 음성대조군, EC-18 투여군 및 양성대조군에 대하여, 관절염 조직을 염색하여 현미경으로 확대한 사진.
이하, 본 발명을 하기 예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예: 세포 배양
인간 세포주 NK-92, U937, A549, HepG2(American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD)의 배양은 37℃, 5％ CO2의 습화된 조건하에서 수행하였다. NK-92 세포주는 20% 우아혈청(Fetal Calf Serum, FCS, HyClone, Logan, UT), 2 mM L-글루타메이트, 100 ㎍/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(Life Technologies)을 포함하는 alphal-MEM(Life Technologies, Karlsruhe, Germany) 배지에서 배양하였고, U937과 A549, HepG2 세포주는 10% 우아혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 배양하였다.
실험예 1: U937 세포에서의 EC-18에 의한 STAT-3의 인산화 억제 효과
EC-18과 IL-6 사이토카인을 처리한 세포에 차가운 SDS-용해 버퍼[(50mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.1% SDS, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaF, and complete Protein Inhibitor Cocktail(Roche)]를 사용하여 30분 동안 얼음에 용해하였다. 용해된 세포용액을 고속회전기로 30분 동안 13,000 rpm으로 회전하여 불용성 부분을 침전시키고 수용성 용액을 분리하였다. 분리한 세포수용액을 정량 후 10 내지 12% 정도 농도의 SDS-PAGE를 이용하여 전기영동 하였다. Gel상에서 분리된 세포단백질을 PVDF 멤브레인(Millipore, Billerica, MA, USA)에 100V에서 2시간 동안 전사시켰다.
세포 내에서 인산화된 STAT-3를 확인하기 위하여, poly rabbit anti-(STAT3, STAT1), -phosphor (STAT1, STAT3)(Cell signaling Technology, USA)(1:1000)을 1차 항체로 이용하여 실온에서 60분간 반응시켰다. 2차 항체로는 horseradish peroxidase peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG(Santa Cruz Biotechnology, USA)(1:3000)로 실온에서 60분간 반응시켰다. 세포단백질의 동일량의 측정은 poly rabbit anti-(STAT1, STAT3)로 확인하였다. 면역반응이 끝난 멤브레인은 ECL 시약(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 반응시켜, X-ray 필름에 노출시켜 STAT-3의 인산화 정도를 필름 상에 나타난 밴드로 확인하였다.
그 결과, 면역세포인 U937세포에서 IL-6에 의해서 STAT-3가 인산화되었음을 확인하였고, 상기 인산화된 STAT-3는 전처리한 EC-18에 대하여 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다(도 1A). 또한 1시간이 지난 후에도 EC-18에 의한 STAT-3의 인산화 억제 효과가 유지됨을 확인하였다(도 1B).
실험예 2: NK-92 세포에서의 EC-18에 의한 STAT-3의 인산화 억제 효과
EC-18과 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)을 처리한 세포에 차가운 SDS-용해 버퍼[(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.1% SDS, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaF, and complete Protein Inhibitor Cocktail(Roche)]를 사용하여 30분 동안 얼음에 용해하였다. 용해된 세포용액을 고속회전기로 30분 동안 13,000 rpm으로 회전하여 불용성 부분을 침전시키고 수용성 용액을 분리하였다. 분리한 세포수용액을 정량 후 10 내지 12% 정도 농도의 SDS-PAGE를 이용하여 전기영동 하였다. Gel상에서 분리된 세포단백질을 PVDF 멤브레인(Millipore, Billerica, MA, USA)에 100V에서 2시간 동안 전사시켰다.
세포 내에서 인산화된 STAT-1과 STAT-3를 확인하기 위해 poly rabbit anti-STAT3, -STAT1, -phosphor STAT3 (Cell signaling Technology, USA)(1:1000)을 1차 항체로 이용하여 실온에서 60분간 반응시켰다. 2차 항체로는 horseradish peroxidase peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG(Santa Cruz Biotechnology, USA)(1:3000)으로 실온에서 60분간 반응시켰다. 세포단백질의 동일량의 측정은 poly rabbit anti-STAT3로 확인하였다. 면역반응이 끝난 멤브레인은 ECL 시약(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 반응시켜, X-ray 필름에 노출시켜 STAT의 인산화 정도를 필름 상에 나타난 밴드로 확인하였다.
그 결과, 면역세포인 NK-92 세포에서 PMA에 의해서 STAT-3가 인산화되었음을 확인하였고, 상기 인산화된 STAT-3는 전처리한 EC-18에 대하여 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다(도 2A). 반면, STAT-1은 EC-18에 의한 인산화 억제 효과가 없음을 확인하였다(도 2B).
실험예 3: 루시퍼레이즈 리포터를 이용한 STAT-3 활성 억제
STAT-3가 결합하는 sis-Inducible Element(SIE)를 포함하고 있는 pGL4.47[luc2P/SIE/Hygro] 벡터(Promega)를 이용하여 A549 세포와 HepG2 세포에 도입시킨 후 EC-18을 전처리하고 IL-10을 처리해서 STAT-3의 활성억제를 분석하였다.
먼저 A549 세포와 HepG2 세포를 trypsin-EDTA를 처리하여 분리한 후 배양접시에 분주하고 Attractene Transfection Reagent(Qiagen)를 이용하여 pGL4.47[luc2P/SIE/Hygro] 벡터를 세포에 도입시킨 후 37℃, 5% CO2 조건에서 하루 동안 배양하였다. 다음날 배양접시에서 세포를 분리한 후 96-well plate에 5×104 cell/well의 개체수가 되도록 0.1㎖씩 분주하고 37℃, 5% CO2 조건에서 하루 동안 배양하였다. 다음날 EC-18을 농도별로 1시간동안 전처리한 후 IL-10을 10ng/㎖을 세포에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 6시간 동안 배양하였다. 6시간이 경과한 후 IL-10 신호 전달에 의한 루시퍼레이즈의 활성화 정도를 ONE-Glo Luciferase Assay System(Promega)을 이용하여 확인하였다. 구체적으로, 96-well에 ONE-Glo™ Luciferase Assay Buffer와 Substrate가 1:1로 혼합된 용액 0.1㎖을 첨가하고 약 3분 경과 후 발광되는 정도를 VICTOR X Multilabel Plate Reader(PerkinElmer)를 이용하여 0.5초간 측정하였다.
루시퍼레이즈의 발광값은 IL-10만 처리한 값에 비해, EC-18이 농도별로 처리된 경우의 값이 줄어들어, 상대적 활성 감소를 확인할 수 있었다(도 3A 및 도 3B). 즉, IL-10에 의해 유도된 STAT-3의 활성이 EC-18을 처리한 A549 세포 및 HepG2 세포에서 현저히 감소됨을 확인하였다.
실험예 4: 모델동물에서 관절염 치료 효능 분석
관절염 모델동물 실험을 위하여, 수컷 DBA/1J 마우스에 bovine type II collagen을 투여하여 관절염을 유발한 후, EC-18을 반복 경구투여하여 관절염에 대한 치료(개선) 효능을 평가하였다. 동시에 비교를 위하여, '양성대조물질 1'로서 레미케미드를 반복 복강투여하고, '양성대조물질 2'로서 메토트렉세이트를 반복 경구투여하였다. 군구성은 정상대조군(G1, Normal), 음성대조군(G2, Negative control), 125, 500 및 2,000 mg/kg 용량의 EC-18 (시험물질, G3, G4, G5) 투여군, 20 mg/kg 용량의 '양성대조군 1'(Remicade, G6) 및 2.5 mg/kg 용량의 '양성대조군 2'(Methotrexate, G7)의 총 7 군으로 각 군당 10 마리씩 설정하였다. 정상대조군 및 음성대조군은 '부형제 1'로서 olive oil을 투여하고, 125, 500 및 2,000 mg/kg 용량의 EC-18, '양성대조군 1'로서 remicade, '양성대조군 2'로서 methotrexate를 1일 1회, 5 주간, 총 35회 투여하되, '양성대조군 1'은 복강투여를, 그 외 나머지 투여군은 위내에 강제 투여하였다. 관절염을 유발하지 않은 동물(정상대조군)을 제외한 모든 동물은 bovine type II collagen 과 complete Freund's adjuvant 또는 incomplete Freund's adjuvant 를 유화한 emulsion 으로 총 2 회 immunization 하여 관절염을 유발하였다. 관찰기간 동안 매일 1회 일반증상 관찰, 주 1회 체중 측정, 주 2회 육안적 관절염 지수 평가 및 주 2회 발등 두께 측정을 실시하였다.
조직 적출일에 채취한 혈청(serum)에서 interleukin-6 농도(concentation)를 측정한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, collagen에 의하여 관절염이 유발된 모델동물에서 Interleukin-6(IL-6) 농도가 유의성 있게 증가하였고(G2, negative control), EC-18 처리 동물(G3, G4, G5)에서 혈액내 IL-6 농도가 양성대조군(Remicade, Methothrexate 처리군, G6 및 G7)과 비슷하게 감소되었다. 도 5는 정상대조군, 음성대조군, EC-18 투여군 및 양성대조군의 시간에 따른 육안적 관절염 지수(Arthritis Score)를 보여주는 그래프로서(투여날짜별 분석), 도 5에 도시된 바와 같이, collagen에 의하여 관절염이 유발된 모델동물에서 EC-18 투여군의 육안적 관절염지수가 음성대조군(G2)과 비교하여 유의하게 감소하였다. 도 6은 정상대조군, 음성대조군, EC-18 투여군 및 양성대조군에 대하여, 양쪽 뒷다리의 무릎관절을 적출하여 관절염 증상에 대한 조직병리학적(histopathological) 검사를 실시한 결과를 보여주는 그래프로서, 도 6에 도시된 바와 같이, collagen에 의하여 관절염이 유발된 모델동물(G2)에서 병리조직학적 관절염지수(histopathological Arthritis Score)가 높았고, EC-18 처리 동물(G3, G4, G5)에서 병리조직학적 관절염지수가 양성대조군(Remicade, Methothrexate 처리군, G6 및 G7)과 비슷하게 감소되었다. 도 7 및 8은 정상대조군(G1, Normal), 음성대조군(G2, Negative control), 500 mg/kg 용량의 EC-18 투여군, 20 mg/kg 용량의 Remicade 투여군(G6)에 대하여, 관절염 조직을 염색하여 현미경으로 확대한 사진이다(도 7; x 40, 도 8; x100). 도 7 및 8에 도시된 바와 같이, 관절염이 유발된 음성대조군(Negative control, G2)에 비하여 EC-18(C) 및 Remicade (D) 투여군에서 연골의 파쇄와 Pannus의 증가 현상이 완화됨을 알 수 있다. 이와 같이, 정상대조군과 비교하여 음성대조군에서 관절염 평가항목인 육안적 관절염지수, 발등 두께, 혈중 interleukin-6 (IL-6) 및 anti-type II collagen (anti-CII) IgG 농도 및 조직병리학적 관절염 점수가 유의하게 증가하여 관절염 모델이 확립되었고, EC-18이 관절염의 치료에 효과적임을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2014007631-appb-I000006
    상기 식에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 20의 지방산기이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 팔미토일(palmitoyl), 올레오일(oleoyl), 리놀레오일(linoleoyl), 리놀레노일(linolenoyl), 스테아로일(stearoyl), 미리스토일(myristoyl), 아라키도노일(arachidonoyl)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 R1 및 R2의 조합(R1/R2)은 올레오일/팔미토일, 팔미토일/올레오일, 팔미토일/리놀레오일, 팔미토일/리놀레노일, 팔미토일/아라키도노일, 팔미토일/스테아로일, 팔미토일/팔미토일, 올레오일/스테아로일, 리놀레오일/팔미토일, 리놀레오일/스테아로일, 스테아로일/리놀레오일, 스테아로일/올레오일, 미리스토일/리놀레오일, 미리스토일/올레오일로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것인 조성물.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2014007631-appb-I000007
  5. 제1항에 있어서, 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은 녹용으로부터 분리된 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 모노아세틸디아실글리세롤 화합물은, STAT-3의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 0.001 내지 50 중량%로 함유하는 것인 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2014007631-appb-I000008
    상기 식에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 20의 지방산기이다.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2014007631-appb-I000009
    상기 식에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 20의 지방산기이다.
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2014007631-appb-I000010
    상기 식에서 R1 및 R2는 각각 탄소수 14 내지 20의 지방산기이다.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 팔미토일(palmitoyl), 올레오일(oleoyl), 리놀레오일(linoleoyl), 리놀레노일(linolenoyl), 스테아로일(stearoyl), 미리스토일(myristoyl), 아라키도노일(arachidonoyl)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 R1 및 R2의 조합(R1/R2)은 올레오일/팔미토일, 팔미토일/올레오일, 팔미토일/리놀레오일, 팔미토일/리놀레노일, 팔미토일/아라키도노일, 팔미토일/스테아로일, 팔미토일/팔미토일, 올레오일/스테아로일, 리놀레오일/팔미토일, 리놀레오일/스테아로일, 스테아로일/리놀레오일, 스테아로일/올레오일, 미리스토일/리놀레오일, 미리스토일/올레오일로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 비인간 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 류마티스 관절염의 예방 또는 치료방법.
PCT/KR2014/007631 2013-08-19 2014-08-18 모노아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 조성물 Ceased WO2015026114A1 (ko)

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