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WO2015016036A1 - 卵子の受精可能性の検査のためのバイオマーカーおよびそれを用いた判定 - Google Patents

卵子の受精可能性の検査のためのバイオマーカーおよびそれを用いた判定 Download PDF

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Publication number
WO2015016036A1
WO2015016036A1 PCT/JP2014/068506 JP2014068506W WO2015016036A1 WO 2015016036 A1 WO2015016036 A1 WO 2015016036A1 JP 2014068506 W JP2014068506 W JP 2014068506W WO 2015016036 A1 WO2015016036 A1 WO 2015016036A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
seq
amino acid
fertilization
egg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2014/068506
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
薫 宮本
哲也 水谷
誠 折坂
憲次 田中
良子 李
大輔 野中
恭一 麻田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Fukui NUC
Protosera Inc
Original Assignee
University of Fukui NUC
Protosera Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Fukui NUC, Protosera Inc filed Critical University of Fukui NUC
Priority to JP2015529492A priority Critical patent/JP6470178B2/ja
Publication of WO2015016036A1 publication Critical patent/WO2015016036A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads

Definitions

  • the present invention relates to a novel biomarker for examining the fertilization potential of an egg, and a method for examining or determining the fertilization potential of an egg using the same.
  • in vitro fertilization In Japan, where there is a declining birthrate and an aging population, 1 in 50 live births, about 20,000 a year, are born by in vitro fertilization, and in vitro fertilization has recently become a popular medical technology that will stop the aging population with a declining birthrate. Have been doing. On the other hand, the success rate of in vitro fertilization depends on the quality or state of an egg to be collected, such as fertility, but there is currently no method for discriminating an egg having a quality or state suitable for fertilization.
  • An object of the present invention is to provide a novel biomarker for examining the fertilization potential of an ovum and a method for examining or judging the fertilization potential of an ovum using the same.
  • the present inventors have found a specific peptide whose amount in the follicular fluid varies depending on the degree of maturation of the follicle. These peptides were newly identified as markers for the test or determination of fertilization potential of eggs, and the present invention was completed.
  • the amount of one or more peptides selected from the peptide group consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 in the follicular fluid collected from the subject is measured.
  • a test method for fertilization possibility of an egg in the subject is provided.
  • subjecting the follicular fluid to mass spectrometry subjecting the follicular fluid to mass spectrometry.
  • the amount of peptide obtained by the measurement is compared with a threshold set based on the amount of peptide in the control sample, and the amount of peptide obtained by the measurement is compared to the peptide in the control sample.
  • the method further includes determining that the fertilization probability of the egg is high when the variation is statistically significantly compared to a threshold set based on the amount of the egg.
  • a biomarker for examining fertilization potential of an egg comprising a peptide selected from the peptide group consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • a method for examining fertilization potential of an egg which specifically recognizes a peptide selected from a peptide group consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4. Methods using antibodies are provided.
  • a determination kit for examining fertilization potential of an egg containing an antibody wherein the antibody comprises a peptide group consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • a determination kit is provided that is an antibody that specifically recognizes the selected peptide.
  • an apparatus for immunodiagnosis or determination in which an antibody against a peptide selected from the peptide group consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 is fixed.
  • a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4.
  • the fertility of an egg can be determined quickly and with high accuracy without damaging the egg, so that an egg suitable for fertilization, particularly in vitro fertilization can be distinguished, and as a result, the success rate of in vitro fertilization is greatly improved. Can be made.
  • the AUC value, sensitivity (SN; prevalence rate of prevalence) and specificity (SP; prevalence rate of non-morbidity) are shown in FIG. 3A.
  • A Plot diagram of peak intensity between unfertilized group (group 1) and fertilized group (group 2) of biomarker (molecular weight 2862) obtained in Example 1, and
  • B ROC curve diagram.
  • the AUC value, sensitivity (SN; prevalence rate of prevalence) and specificity (SP; prevalence rate of non-morbidity) are shown in FIG. 4A.
  • A Plot diagram of peak intensity between unfertilized group (group 1) and fertilized group (group 2) of biomarker (molecular weight 2941) obtained in Example 1, and (B) ROC curve diagram.
  • the AUC value, sensitivity (SN; prevalence rate of disease prevalence) and specificity (SP; prevalence rate of disease prevalence) are shown in the upper part of FIG. 5A.
  • A (b) Examples of immunochromat chips.
  • the present invention provides a novel and useful marker peptide for examining or determining the fertilization potential of an egg.
  • Ovulation is the process by which mature oocytes, ie ova, are discharged from the ovarian follicle.
  • the present inventors have found that the expression level of each of the following four peptides of the present invention contained in the follicular fluid of the follicle is related to the fertilization potential of the ovum.
  • Peptide 1 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence corresponds to the 341st to 367th fragments of human ⁇ -2-HS-glycoprotein.
  • Peptide 2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence corresponds to the 25th to 48th fragments of human serum albumin.
  • Peptide 3 consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is the same as that of 27 amino acids, but in peptide 3, cysteine is further bonded to the 18th cysteine by a disulfide bond.
  • Peptide 4 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. It corresponds to the 25th to 50th fragments of human serum albumin.
  • TVVQPSVGAAAGPVVPPCPGRIRHFKV SEQ ID NO: 1
  • DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL SEQ ID NO: 2
  • TVVQPSVGAAAGPVVPPCPGRIRHFKV Cysteinylation at position 18 SEQ ID NO: 3
  • DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIA SEQ ID NO: 4
  • the expression levels of peptides 1, 2, and 4 are increased, and the expression level of peptide 3 is low. Therefore, by confirming that the expression levels of peptides 1, 2, and 4 are high and / or that peptide 3 is low, it is possible to determine whether the egg is fertilized or has high fertility.
  • Peptides 1 to 4 have average molecular weights of 2743, 2757, 2862, and 2941, respectively, but precise molecular weights of protonated molecules ([M + H + ]) are 2738.52, 2752.43, 2875.52, and 2936.44, respectively (FIG. 1). ).
  • the actual measurement value of the molecular weight may slightly vary depending on the measurement method / measurement apparatus used. For example, in the case of a method using a mass spectrometer, it is preferable to measure the peak intensity that appears at the indicated numerical value ⁇ 0.5% (preferably ⁇ 0.3%, more preferably ⁇ 0.1%).
  • peptides 1 to 4 are useful as test or determination markers for fertilization of eggs, peptides containing amino acid residues of these four peptides are also used as test or determination markers for fertilization of eggs. It is possible.
  • the peptide of the present invention includes a peptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence of the four peptides in addition to the peptide having the entire amino acid sequence of the amino acid sequences of the four peptides.
  • “Substantially identical” means that one or a few amino acids are modified as compared with the amino acid sequences of the above four peptides, but can still be used as a test or determination marker for fertilization of an egg. To do. A small number refers to 1 to 3, preferably 1 to 2, more preferably 1.
  • the modification means that the amino acid is deleted, added, or substituted with another amino acid, or the amino sequence is changed by a combination thereof.
  • the modification includes addition and phosphorylation of sugar chains and / or fatty acids.
  • the detection is performed. It is obvious to those skilled in the art that the amino acid sequence of the peptide should be interpreted as “the amino acid sequence having the polymorphism or allelic variation in each amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 4.”
  • the present invention also provides for fertilization of an ovum in the subject by measuring the amount of one or more peptides of the present invention in a follicular fluid from the subject in need of testing for fertilization of the ovum.
  • the peptide to be measured is not particularly limited as long as it is selected from the above four types of peptides of the present invention. Moreover, in order to improve the measurement accuracy, as long as the peptide of the present invention is included, the amount of one or more biological substances that can serve as a test or determination marker for eggs other than the peptide of the present invention may be further measured. .
  • the body fluid derived from the subject as the test sample is follicular fluid.
  • the follicular fluid is advantageous in that it can be collected from the follicle without damaging the ovum in the case of artificial insemination.
  • the peptide of the present invention to be detected may be directly used for inspection or determination without pretreatment such as protein removal of the sample, that is, without purification, and if necessary, using a spin column or the like, It is also possible to lightly separate and remove a high molecular weight protein fraction from the sample in advance.
  • the detection of the peptide of the present invention in the follicular fluid can be carried out, for example, by measuring various molecular weights of the follicular fluid, such as gel electrophoresis or various separation and purification methods (eg, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity).
  • various molecular weights of the follicular fluid such as gel electrophoresis or various separation and purification methods (eg, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity).
  • a method of purifying the peptides of the present invention to produce antibodies that recognize them and detecting the peptides by ELISA, RIA, immunochromatography, Western blotting, immunomass spectrometry or various immunoassays can also be preferably used. Furthermore, a hybrid detection method with the above detection method is also effective.
  • One of the particularly preferable measurement methods in the inspection method of the present invention is that a test sample is brought into contact with the surface of a plate used for time-of-flight mass spectrometry, and the mass of the component captured on the plate surface is measured.
  • the method of measuring by is mentioned.
  • a plate compatible with a time-of-flight mass spectrometer has a surface structure (for example, functional group-added glass, Si, Ge, GaAs, GaP, SiO 2 , SiN 4) that can efficiently adsorb the peptide of the present invention to be detected , Modified silicon, various gels or polymer coatings).
  • the support used as a plate for mass spectrometry is a substrate coated with a thin layer of polyvinylidene difluoride (PVDF), nitrocellulose or silica gel, particularly preferably PVDF (WO 2004/031759 See).
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • nitrocellulose or silica gel particularly preferably PVDF (WO 2004/031759 See).
  • a substrate is not particularly limited as long as it is used in a plate for mass spectrometry, and examples thereof include insulators, metals, conductive polymers, and composites thereof.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • nitrocellulose or silica gel particularly preferably PVDF (WO 2004/031759 See).
  • Such a substrate is not particularly limited as long as it is used in a plate for mass spectrometry, and examples thereof include insulators, metals, conductive polymers, and composites thereof.
  • Such a plate for mass spectrometry coated with a thin layer with PVDF
  • Mass spectrometry using this BLOTCHIP is the world's first peptome analysis method that enables analysis without pretreatment of specimens (body fluids such as blood and tissue extracts).
  • body fluids such as blood and tissue extracts.
  • test sample-derived follicular fluid from the subject After pretreatment of the test sample-derived follicular fluid from the subject or by simply removing the high molecular weight protein using an antibody column or other method, the test sample is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis or isoelectric focusing. After electrophoresis, the gel is transferred to a plate for mass spectrometry and transferred (blotted).
  • the transfer method itself is known and preferably electrotransfer is used.
  • a known buffer having a pH of 7 to 9 and a low salt concentration is preferably used (for example, Tris buffer, phosphate buffer, borate buffer, acetate buffer, etc.).
  • a peptide adsorbed to a protein is dissociated by electrophoresis in the presence of a surfactant (SDS), transferred to BLOTCHIP®, and then the chip is analyzed at high speed by MALDI-MS.
  • SDS surfactant
  • MALDI-MS MALDI-MS
  • the presence and amount of the peptide of the present invention can be identified from the information on the molecular weight by mass spectrometry of the molecules in the test sample captured on the support surface by the above method. It is also possible to output information from the mass spectrometer as differential information by using an arbitrary program and comparing it with mass spectrometry data in follicular fluid when fertilization is impossible. It will be appreciated that such programs are well known and those skilled in the art can easily construct or modify such programs using known information processing techniques.
  • a stable isotope-labeled peptide of the target molecule is synthesized and mixed with a test sample as a known amount of internal standard, and Protocera's BLOTCHIP® system is used. Measurement data with a CV value of 5% or less can be acquired.
  • mass spectrometry can be performed by a mass spectrometry system other than the BLOTCHIP (registered trademark) system, and this method can be clinically used as a diagnostic apparatus that does not use an antibody.
  • peptides can be identified using a tandem mass spectrometry (MS / MS) method.
  • an identification method an amino acid sequence is determined by analyzing an MS / MS spectrum.
  • a method of identifying a peptide by performing a database search using partial sequence information (mass tag) contained in the MS / MS spectrum.
  • the amino acid sequence of the peptide of the present invention is directly identified, and all or a part of the peptide is synthesized based on the sequence information. It can also be used as
  • the present invention includes a method for examining fertilization ability of an egg using an antibody that specifically recognizes a peptide, and a determination kit for examining fertilization ability of an egg containing an antibody containing such an antibody.
  • a test method can detect the peptide with high sensitivity and high accuracy without using a special apparatus such as the mass spectrometer, if an optimized immunoassay system is constructed and a kit is prepared. It is useful in that it can.
  • the present invention also includes an apparatus for immunodiagnosis or determination using an antibody against a peptide.
  • an apparatus for immunodiagnosis or determination using an antibody against a peptide examples include, but are not limited to, an immunochromatography diagnosis or determination chip in which an antibody against a peptide is fixed in a determination region of the chip.
  • a preferred embodiment of such a chip is an immunochromatographic diagnostic or determination chip in which an antibody against the peptide of the present invention is immobilized.
  • the antibody against the peptide of the present invention can be prepared, for example, by isolating and purifying the peptide of the present invention from a follicular fluid derived from a patient expressing the peptide and immunizing an animal using the peptide as an antigen.
  • the peptide can be prepared in a large amount by a well-known genetic engineering technique such as amplification of a cDNA fragment encoding the peptide by RT-PCR.
  • the peptide of the present invention can also be obtained using a cell-free transcription / translation system as a template. Further, it can be prepared in a large amount by an organic synthesis method.
  • the antibody against the peptide of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be prepared by a known immunological technique.
  • the antibody includes not only a complete antibody molecule but also a fragment thereof, and examples thereof include Fab, F (ab ′) 2, ScFv, and minibody.
  • a polyclonal antibody is administered about 2 to 4 times every 2 to 3 weeks subcutaneously or intraperitoneally in an animal together with a commercially available adjuvant (for example, complete or incomplete Freund's adjuvant) using the peptide of the present invention as an antigen, It can be obtained by collecting whole blood after the final immunization and purifying the antiserum.
  • adjuvant for example, complete or incomplete Freund's adjuvant
  • animals to which the antigen is administered include mammals capable of obtaining the target antibody, such as rats, mice, rabbits, goats, guinea pigs, and hamsters.
  • a monoclonal antibody can be prepared by a cell fusion method. Description of techniques for the preparation of a monoclonal antibody, Stites et al, Basic and Clinical Immunology. (Lang Medical Publications Los Altos. CA. 4 th Edition) and references therein,, in particular Koehler, G. & Milstein, C. Nature 256, 495-497 (1975).
  • the peptide of the present invention is administered to a mouse subcutaneously or intraperitoneally 2-4 times together with a commercially available adjuvant, and after the final administration, the spleen or lymph node is collected, and white blood cells are collected.
  • This leukocyte and myeloma cells are cell-fused to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the peptide.
  • a hybridoma producing a desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to an antigen from the culture supernatant using a known EIA or RIA method or the like.
  • the culture of the hybridoma producing the monoclonal antibody can be performed in vitro or in vivo such as mouse or rat, or preferably mouse ascites, and the antibody can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma and the ascites of the animal, respectively. .
  • the test method of the present invention using an antibody is not particularly limited, and detects the amount of an antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen in a test sample by chemical or physical means, Any measurement method may be used as long as it is a measurement method calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used.
  • the antibody or antigen can be bound with a labeling agent such as a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, or a luminescent substance.
  • a biotin-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen and a labeling agent.
  • the follicular fluid is immunoaffinity purified with an antibody, and the fraction bound to the antibody is subjected to mass spectrometry in the second step, and so-called immunomass spectrometry, in which identification and quantification are performed based on the precise molecular weight.
  • immunomass spectrometry In contrast to immunomass spectrometry, undegraded proteins and similar peptides are completely separated by a mass spectrometer, and can be quantified with high specificity and sensitivity based on the exact molecular weight of a biomarker.
  • the antibody is immobilized on the surface of a chip that can be adapted to a mass spectrometer as described above, and a test sample is applied to the antibody on the chip.
  • a test sample is applied to the antibody on the chip. Examples include a method in which a component in a sample captured by the antibody is contacted and subjected to mass spectrometry, and a peak corresponding to the molecular weight of the marker peptide recognized by the antibody is detected.
  • the level of the peptide of the present invention in the subject-derived sample measured by any of the above methods varies statistically significantly compared to a threshold set based on the amount of peptide in the control sample. If so, it can be diagnosed or determined that the egg of the subject is highly fertilized.
  • the threshold value set based on the amount of peptide in the control sample may be the amount of peptide in the control sample itself, or in the control sample as long as the reliability of the test or determination method of the present invention is ensured. Another reference value set based on the amount of the peptide may be used.
  • control sample refers to a sample serving as a reference for comparison, and includes a sample in the case of unfertilized.
  • the level of the peptide of the present invention in the control sample may be detected in parallel with the level of the peptide of the present invention in the biological sample of the subject, or the level of the peptide of the present invention in a number of control samples in advance.
  • the level may be measured and the standard expression level in the control sample may be determined statistically. Specifically, for example, the average value ⁇ 2 ⁇ standard deviation (S.D.), or the average value ⁇ ⁇ standard deviation (S.D.) or the average value ⁇ 3 ⁇ standard deviation (S.D.) can be used as the standard value.
  • the expression level of the peptide of the present invention in the control sample may be set using an ROC curve.
  • An ROC curve (receiver operating characteristic curve) is a graph showing detection sensitivity on the vertical axis and false positive rate (that is, “1-specificity”) on the horizontal axis.
  • An ROC curve can be obtained by plotting changes in sensitivity and false positive rate when the reference value for determining the expression level of the peptide in the biological sample is continuously changed.
  • a standard value statistically set by an ROC curve or the like is also called a cut-off value.
  • the level of the peptide of the present invention in the subject-derived sample is compared with the cutoff value. Then, when the level of the peptide of the present invention in the sample derived from the subject varies with respect to the cut-off value, the fertility of the egg is detected or determined.
  • the cut-off value is a criterion value that is predicted to have a high risk of suffering from the disease if it is greater than or equal to that value. Determined as negative. If the cut-off value is set low, the sensitivity is high and the specificity is low, and if the cut-off value is set high, the sensitivity is low and the specificity is high.
  • the cut-off value is a reference range (95% confidence interval, normal distribution) obtained by measuring the number of individuals of a reference value that is a measurement value in a control sample and obtaining a central value including 95% of the reference value. In this case, the upper limit value of the measurement average value ⁇ 2 standard deviations in the control sample).
  • another value may be set as the cut-off value as long as the sensitivity and specificity required by the determination are satisfied.
  • the peptide of the invention is either peptide 1, 2, or 4, and the level of the peptide in the sample is statistically significantly increased compared to the peptide level in the control sample And / or if the level of Peptide 3 in the sample is statistically significantly lower than the level of the peptide in the control sample, it is diagnosed or determined that the egg is likely to be fertilized can do.
  • the peptide of the present invention more specifically, the four peptides of the present invention can be used alone or as a diagnostic marker for fertilization potential of an egg. (Correct diagnosis rate) and specificity (no disease correct diagnosis rate) can be further increased.
  • 2 or 4 peptides of the present invention are determined by a population learning method, or the measured values of each peptide in a sample of a known patient and a control-derived sample in a corresponding number of samples are two-dimensional or three-dimensional.
  • a population learning method By plotting the coordinates and creating a scatter plot, it is visualized in which region each of the two groups is distributed, and then the measured values of each peptide in the sample derived from the subject are plotted on the scatter plot.
  • the determination can also be made by determining the cutoff value of each peptide based on the scatter diagram and comparing the measured value of each peptide in the subject-derived sample with this.
  • Example 1 Profiling Analysis Using BLOTCHIP (Registered Trademark) Eight female patients who visited Fukui University Obstetrics and Gynecology Department and obtained informed consent were used as subjects. From the follicle collected by in vitro fertilization treatment of the subject, the follicular fluid is sucked by pointing to the injection needle, and the follicular fluid containing the eggs that were not fertilized by in vitro fertilization (unfertilized group, 4 samples of 1-F1 to 1-F4) ) And follicular fluid containing the eggs fertilized by in vitro fertilization (fertilization group, 4 samples of 2-F1 to 2-F4). Confirmation of fertilization was confirmed by a conventional method of microscopic observation of the start of cell division in the fertilized egg. The collected follicular fluid was associated with each ovum on a one-to-one basis, immediately frozen at -80 ° C., and used for subsequent profiling analysis.
  • Mass spectrometry was performed with a mass spectrometer (Ultra-FlexII manufactured by Bruker Daltnics). The measurement parameters were Detector voltage 1685V, Supression 1000, Laser Intensity 28 to 35 Fuzzy mode, 415 points per chip, 500 times laser irradiation per point, total 207,500 times laser irradiation. Each peak intensity in the obtained spectrum was integrated for each M / z and converted into one integrated spectrum.
  • Peptides giving statistically significant difference (P value less than 0.05) by performing differential profiling analysis between follicular fluid of unfertilized group and fertilized group using ClinProTools 2.2 (Bruker Daltonik GmbH) Groups were selected and four peptides with molecular weights of 2743, 2757, 2862, and 2941 were identified as egg test or decision markers (FIG. 1).
  • FIG. 2A, FIG. 3A, FIG. 4A and FIG. 5A show the peak intensities at molecular weights 2743, 2757, 2862, and 2941, respectively, between the two groups of the four obtained biomarkers
  • FIG. 2B, FIG. 3B, FIG. FIG. 5B shows a plot of peak intensity and an ROC curve of the four biomarkers between 1: fertilized group and 2: fertilized group. From these results, it is understood that the peak intensity at the molecular weights 2743, 2757, and 2941 is significantly higher in the fertilized group and the peak intensity at the molecular weight 2862 is significantly lower than that in the unfertilized group, and the four peptides are unique. It has been shown to be useful as a test or determination marker for fertility of typical eggs.
  • Example 2 Identification of peptides by de novo MS / MS analysis on BLOTCHIP Reflector of MALDI-TOF mass spectrometer Ultraflex II (manufactured by Bruker Daltnics) for the fraction spots with peptides shown in FIGS. Monoisotopic mass [M + H] + was measured in mode. The obtained monoisotopic mass [M + H] + was designated as Parent Mass, and MS / MS measurement was performed in Lift mode (PSD). The measurement result was searched with MASCOT Server, the amino acid sequence was determined by MS / MS analysis, and the peptide was identified (FIG. 1).
  • peptide 1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 corresponding to the 341st to 367th fragments of human ⁇ -2-HS-glycoprotein, and fragments 25 to 48 of human serum albumin
  • Corresponding peptide 2 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence is the same as SEQ ID NO: 1, but peptide 18 in which cysteine is further linked to the 18th cysteine by a disulfide bond, from human serum albumin 25 Peptides 4 corresponding to the 50th fragment and consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 were identified.
  • FIGS. 6A and 6B are schematic diagrams showing an example of an immunochromat chip that is an apparatus for immunodiagnosis or determination of the present invention.
  • the immunochromatography chip 10 is an immunoassay device for analyzing a specimen using an antigen-antibody reaction, also called an immunostrip or an immunoassay strip, and includes a base material and a specimen provided on the base material as a basic structure.
  • An absorption pad for absorbing and developing a biological sample (in this application follicular fluid) is provided.
  • the base material and the absorbent pad may be made of materials known or known in the art.
  • a region 20 is provided along the longitudinal direction of the immunochromatography chip 10 to which an antibody against the peptide of the present invention is bound.
  • FIG. 6 (a) shows that there is no line in region 20 and that the egg is unfertilized or not suitable for fertilization.
  • FIG. 6 (b) shows that there is a line in the region 20 and that the egg is in a state suitable for fertilization or fertilization.
  • the quality or state of the ovum can be determined simply, quickly and accurately.
  • the clinical examination method using the novel ovum test or determination marker of the present invention is useful in that the success rate of fertilization, particularly in vitro fertilization, can be greatly improved because it can quickly and accurately determine the fertility of the ovum. is there.

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Abstract

卵子の受精可能性を検査するための新規なバイオマーカーの提供。 被検者より採取した卵胞液中の、配列番号１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群より選択される１以上のペプチドの量を測定することを特徴とする、該被検者における卵子の受精可能性の検査方法。

Description

卵子の受精可能性の検査のためのバイオマーカーおよびそれを用いた判定
（関連分野の相互参照）
　本願は、2013年7月29日に出願した特願2013-156672号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）の優先権の利益を主張するものである。
（技術分野）
　本発明は、卵子の受精可能性を検査するための新規なバイオマーカー、並びにそれを利用した卵子の受精可能性の検査または判定方法に関する。
　少子高齢化の進む我が国では、出生児の５０人に１人、年間約２万人は体外受精により出産を迎えており、体外受精は少子高齢化の歯止めとなる核心的な医療技術として近年普及してきている。一方、体外受精の成功率は、受精可能性など、採取する卵子の質または状態に依存しているが、受精に適した質または状態の卵子を判別する方法が無いのが現状である。
　従来は、体外受精処理後の医師の顕微鏡観察による卵子の選択法があったが、この場合、医師の経験に依存し、主観的判断が入ると共に、判定時間もかかっていた。
　最近の研究によれば、高齢化に従って卵子の質が変化し、それが高齢における妊娠・出産の大きなリスクファクターとなっている。体外受精時に卵子を採取する際に同時に得られる卵胞液の成分から、受精可能性などの卵子の質を判定しようとする試みがなされているが（特許文献１および非特許文献１）、迅速に高い精度で検査できる適切なバイオマーカーは現在まで発見されていない。
　今後も高齢出産における体外受精の比率はさらに高まると予測されることから、受精の成功率の上昇が喫緊の課題である。受精可能性の高い卵子を選択または判別する方法が開発されれば、体外受精の成功率の向上につながり、子供を希望するカップルにとって朗報となり、また今後さらに進展すると予想される我が国の超少子高齢化に歯止めをかける一つの手段となり得ると期待される。
特表2007-530030
Wu et al. Reproductive Biology and Endocrinology 2012, 10:116
　本発明の目的は、卵子の受精可能性を検査するための新規なバイオマーカー、並びにそれを利用した卵子の受精可能性の検査または判定方法を提供することである。
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく、患者から採取した卵胞液を質量分析により調べた結果、卵胞の成熟度合いに応じて卵胞液中の量が変動している特定のペプチドを見出し、これらのペプチドを卵子の受精可能性の検査または判定のためのマーカーとして新たに同定して、本発明を完成するに至った。
　本発明の第一の態様によれば、被検者より採取した卵胞液中の、配列番号１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群より選択される１以上のペプチドの量を測定することを特徴とする、該被検者における卵子の受精可能性の検査方法が提供される。
　一つの実施形態において、卵胞液を質量分析にかけることを含む。
　別の実施形態において、前記測定により得られたペプチドの量を、対照試料中のペプチドの量に基づいて設定された閾値と比較し、前記測定により得られたペプチドの量が対照試料中のペプチドの量に基づいて設定された閾値に比べて統計学的に有意に変動している場合に、卵子の受精可能性が高いと判定することをさらに含む。
　本発明の第二の態様によれば、配列番号１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群より選択されるペプチドを含む卵子の受精可能性の検査のためのバイオマーカーが提供される。
　本発明の第三の態様によれば、配列番号１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群より選択されるペプチドからなる卵子の受精可能性の検査のためのバイオマーカーが提供される。
　本発明の第四の態様によれば、卵子の受精可能性を検査する方法であって、　配列番号１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群より選択されるペプチドを特異的に認識する抗体を用いた方法が提供される。
　本発明の第五の態様によれば、抗体を含む卵子の受精可能性を検査するための判定キットであって、当該抗体が、配列番号１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群より選択されるペプチドを特異的に認識する抗体である、判定キットが提供される。
　本発明の第六の態様によれば、配列番号１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群より選択されるペプチドに対する抗体を固定した免疫診断または判定用装置が提供される。
　本発明の第七の態様によれば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが提供される。
　本発明によれば、卵子を傷つけることなく卵子の受精可能性を迅速かつ高い精度で判定できるので、受精、特に体外受精に適した卵子を鑑別でき、結果として体外受精の成功率を大幅に向上させることができる。
実施例１で得られたバイオマーカーペプチド４種の質量分析における分子量、由来するタンパク質名、およびアミノ酸配列を示す表である。 （Ａ）実施例１で得られたバイオマーカー（分子量2743）の、未受精群（グループ１）と受精群（グループ２）間でのピーク強度のプロット図と（Ｂ）ＲＯＣ曲線図である。AUC値、感度（SN;有病正診率）および特異度（SP;無病正診率）を図２Ａの上に示した。 （Ａ）実施例１で得られたバイオマーカー（分子量2757）の、未受精群（グループ１）と受精群（グループ２）間でのピーク強度のプロット図と（Ｂ）ＲＯＣ曲線図である。AUC値、感度（SN;有病正診率）および特異度（SP;無病正診率）を図３Ａの上に示した。 （Ａ）実施例１で得られたバイオマーカー（分子量2862）の、未受精群（グループ１）と受精群（グループ２）間でのピーク強度のプロット図と（Ｂ）ＲＯＣ曲線図である。AUC値、感度（SN;有病正診率）および特異度（SP;無病正診率）を図４Ａの上に示した。 （Ａ）実施例１で得られたバイオマーカー（分子量2941）の、未受精群（グループ１）と受精群（グループ２）間でのピーク強度のプロット図と（Ｂ）ＲＯＣ曲線図である。AUC値、感度（SN;有病正診率）および特異度（SP;無病正診率）を図５Ａの上に示した。 （ａ），（ｂ）イムノクロマットチップの例。
　本明細書において、単数形（a, an, the）は、本明細書で別途明示がある場合または文脈上明らかに矛盾する場合を除き、単数と複数を含むものとする。
　本発明は、新規かつ有用な、卵子の受精可能性の検査または判定のためのマーカーペプチドを提供する。
　排卵は、卵巣の卵胞から成熟した卵母細胞すなわち卵子が排出される過程である。本発明者らは、卵胞の卵胞液に含まれる以下の本発明の４種のペプチドの各々の発現量が卵子の受精可能性と関係があることを見出した。
　ペプチド１：配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる。該アミノ酸配列は、ヒトα-2-HS-glycoproteinの３４１番目から３６７番目までのフラグメントに相当する。
　ペプチド２：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる。該アミノ酸配列は、ヒト血清アルブミンの２５番から４８番目までのフラグメントに相当する。
　ペプチド３：配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる。該アミノ酸配列は配列番号１と２７個のアミノ酸配列はすべて同じであるが、ペプチド３では１８番目のシステインにさらにジスルフィド結合によりシステインが結合している。
　ペプチド４：配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる。ヒト血清アルブミンの２５番から５０番目までのフラグメントに相当する。
TVVQPSVGAAAGPVVPPCPGRIRHFKV　（配列番号１）
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL  （配列番号２）
TVVQPSVGAAAGPVVPPCPGRIRHFKV　 １８番目の位置でシステイン化 （配列番号３）
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIA　（配列番号４）
　具体的には、卵子が受精しているか又は受精可能性が高い状態にあるときはペプチド１、２、および４の発現量が上昇しており、ペプチド３の発現量は低い。よって、ペプチド１、２、および４の発現量が高く、および／またはペプチド３が低いことを確認することで、卵子が受精しているか又は受精可能性が高いことを判定することができる。
　ペプチド１～４は、平均分子量がそれぞれ2743、2757、2862、2941であるが、プロトン化分子（[M+H+]）による精密な分子量はそれぞれ2738.52、2752.43、2857.52、2936.44である（図１）。このように、分子量の実測値は、用いられる測定方法・測定機器に応じて若干変動し得る。例えば、質量分析計を用いる方法による場合は、示された数値±0.5%（好ましくは±0.3%、より好ましくは±0.1%）の位置に出現するピーク強度を測定することが好ましい。
　上記のペプチド１～４が卵子の受精可能性の検査または判定マーカーとして有用であるので、この４種のペプチドのアミノ酸残基を含むペプチドも同様に卵子の受精可能性の検査または判定マーカーとなることが考えられる。
　また、本発明のペプチドは、上記４種のペプチドのアミノ酸配列の全部のアミノ酸配列を有するぺプチドに加えて、上記４種のペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドも含む。実質的に同一とは、上記４種のペプチドのアミノ酸配列と比較して、１個もしくは少数個のアミノ酸が修飾されているが、なお卵子の受精可能性の検査または判定マーカーとなり得るものを意味する。少数個とは、１～３個、好ましくは１～２個、より好ましくは１個を指す。ここで修飾とは、アミノ酸が欠失、付加、もしくは他のアミノ酸により置換されているか、またはこれらの組み合わせによりアミノ配列が変更されていることを意味する。さらに修飾には、糖鎖および／または脂肪酸の付加やリン酸化も含まれる。
　例えば、被験対象となる患者が、本発明のペプチドのアミノ酸配列内に１もしくは２以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加またはそれらの組合せを含む多型もしくはアレル変異を有する場合、検出すべきペプチドのアミノ酸配列は、「配列番号１～４で表される各アミノ酸配列において、当該多型もしくはアレル変異を有するアミノ酸配列」と解すべきであることは、当業者にとって自明である。
　本発明はまた、卵子の受精可能性の検査を必要とする被検者由来の卵胞液中の、１種以上の本発明のペプチドの量を測定することによる、該被検者における卵子の受精可能性の検査方法を提供する。本発明のペプチドは、卵子の成熟後、さらに受精可能か否かで変動することから、本発明のペプチドを指標とする検査または診断を採用することにより、受精可能な良質の卵子を選択でき、体外受精の成功率を大幅に向上させることが可能となる。本方法により受精可能な卵子を鑑別できるため、１回の対外受精でも患者における１００％に近い確率での妊娠が可能となる。
　測定対象となるペプチドは、上記４種の本発明のペプチドから選択される限り特に制限はない。また、測定精度を高めるために、本発明のペプチドを含む限り、本発明のペプチド以外の卵子の検査または判定マーカーとなりうる１種以上の生体物質の量を、さらに測定してもよい。。
　被験試料となる被検者由来の体液は卵胞液である。卵胞液は、人工授精の場合に、卵子を傷つけることなく卵胞から採取ができる点で有利である。検出対象である本発明のペプチドは、試料のタンパク質除去等の前処理なしに、つまり精製せずに直接、検査または判定に用いてもよいし、必要に応じて、スピンカラムなどを用いて、試料から予め高分子量の蛋白質画分などを軽く分離除去しておくこともできる。
　卵胞液中の、本発明のペプチドの検出は、例えば、卵胞液を各種の分子量測定法、例えば、ゲル電気泳動や、各種の分離精製法（例：イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、表面プラズモン共鳴法、イオン化法（例：電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化法など）、および質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計、免疫質量分析計、安定同位体ペプチドを内部標準にした質量分析計など）を組み合わせる方法等に供し、該ペプチドの分子量と一致するバンドもしくはスポット、あるいはピークを検出することにより行うことができるが、これらに限定されない。
　本発明のペプチドを精製してそれらを認識する抗体を作製し、ELISA, RIA,イムノクロマト法、ウェスタンブロッティング、免疫質量分析法や各種イムノアッセイにより該ペプチドを検出する方法もまた、好ましく用いられ得る。さらに上記の検出方法とのハイブリッド型検出法も有効である。
　本発明の検査方法における特に好ましい測定法の１つは、飛行時間型質量分析に使用するプレートの表面に被験試料を接触させ、該プレート表面に捕捉された成分の質量を飛行時間型質量分析計で測定する方法が挙げられる。飛行時間型質量分析計に適合可能なプレートは、検出対象である本発明のペプチドを効率よく吸着し得る表面構造（例：官能基付加ガラス、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改質シリコン、種々のゲルまたはポリマーのコーティング）を有している限り、いかなるものであってもよい。
　好ましい実施態様においては、質量分析用プレートとして用いられる支持体は、ポリビニリデンジフロリド（PVDF）、ニトロセルロースまたはシリカゲル、特に好ましくはPVDFで薄層コーティングされた基材である（WO 2004/031759を参照）。かかる基材は、質量分析用プレートにおいて使用されているものであれば、特に限定されず、例えば、絶縁体、金属、導電性ポリマー、それらの複合体などが挙げられる。かかるPVDFで薄層コーティングされた質量分析用プレートとして、好ましくはプロトセラ社のブロットチップ（BLOTCHIP，登録商標）などが挙げられる。このBLOTCHIP（登録商標）を用いた質量分析法は検体（血液等の体液や組織抽出液）の前処理無しに分析を可能にした世界初のペプチドーム解析法であり、詳細については日本特許第4447458号、Tanaka, K; BBRC, 379, 110-114. (2009)、Y. Araki; Proteomics, 11 (13), 2727-2737. (2011)などに記載されている。
　被験試料となる被検者由来の卵胞液を前処理せずに、あるいは抗体カラムその他の方法で高分子タンパク質を簡単に除去した後、被験試料をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動もしくは等電点電気泳動に付し、泳動後ゲルを質量分析用プレートと接触させて転写（ブロッティング）させる。転写の方法自体は公知であり、好ましくは電気転写が用いられる。電気転写時に使用する緩衝液としては、pH 7～9、低塩濃度の公知の緩衝液を用いることが好ましい（例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）。
　好ましい実施形態では、タンパク質に吸着したペプチドを、界面活性剤（SDS）存在下に電気泳動によって解離させ、BLOTCHIP(R)へ転写した後、同チップをMALDI－MSで高速解析する。この結果、従来の前処理（タンパク質除去）によるタンパク質複合体ペプチドの喪失等が生じず、どの検体のペプチドームプロファイルも定量的に再現でき、これまで見逃されてきた多くのバイオマーカーペプチドを高い精度と確率で発見できる。
　上記の方法により支持体表面上に捕捉された被験試料中の分子を質量分析することにより、分子量に関する情報から、標的分子である本発明のペプチドの存在および量を同定することができる。質量分析装置からの情報を、任意のプログラムを用いて、受精が不可能な場合の卵胞液における質量分析データと比較して、示差的な（differential）情報として出力させることも可能である。そのようなプログラムは周知であり、また、当業者は、公知の情報処理技術を用いて、容易にそのようなプログラムを構築もしくは改変することができることが理解されよう。
　高精度な質量分析結果を得るためには、標的分子の安定同位体標識ペプチドを合成して、それを既知量の内部標準品として被験試料に混合し、プロトセラ社のBLOTCHIP（登録商標）システムを用いて測定することでCV値が5%以下の実測データを取得できる。もちろんBLOTCHIP（登録商標）システム以外の質量分析システムでも質量分析が実施可能であり、この方法は抗体を使用しない診断装置として臨床使用できる。
　上記の質量分析による検出において、タンデム質量分析（MS/MS）法を用いてペプチドを同定することができ、かかる同定法としては、MS/MSスペクトルを解析してアミノ酸配列を決定するde novo sequencing法と、MS/MSスペクトル中に含まれる部分的な配列情報（質量タグ）を用いてデータベース検索を行い、ペプチドを同定する方法等が挙げられる。また、MS/MS法を用いることにより、直接本発明のペプチドのアミノ酸配列を同定し、該配列情報に基づいて該ペプチドの全部もしくは一部を合成し、これを以下の抗体に対する抗原（ハプテン）として利用することもできる。
　本発明のペプチドの測定は、それに対する抗体を用いて行うこともできる。よって、本発明は、ペプチドを特異的に認識する抗体を用いた卵子の受精可能性の検査方法、かかる抗体を含む抗体を含む卵子の受精可能性を検査するための判定キットを含む。かかる検査方法は、最適化されたイムノアッセイ系を構築してこれをキット化すれば、上記質量分析装置のような特殊な装置を使用することなく、高感度かつ高精度に該ペプチドを検出することができる点で有用である。
　また、本発明は、ペプチドに対する抗体を用いた免疫診断または判定用装置も含み、かかる装置としては例えば限定ではないがペプチドに対する抗体をチップの判定領域に固定したイムノクロマト診断または判定用チップが挙げられる。このようなチップの好ましい実施形態は、本発明のペプチドに対する抗体を固定したイムノクロマト診断または判定用チップである。
　本発明のペプチドに対する抗体は、例えば、本発明のペプチドを、これを発現する患者由来の卵胞液から単離・精製し、該ペプチドを抗原として動物を免疫することにより調製することができる。あるいは、得られるペプチドの量が少量である場合は、RT-PCRによる該ペプチドをコードするcDNA断片の増幅等の周知の遺伝子工学的手法によりペプチドを大量に調製することができ、あるいはかかるcDNAを鋳型として、無細胞転写・翻訳系を用いて本発明のペプチドを取得することもできる。さらに有機合成法により大量に調製することも可能である。
　本発明のペプチドに対する抗体（以下、「本発明の抗体」と称する場合がある）は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。また、該抗体は完全抗体分子だけでなくそのフラグメントをも包含し、それには例えば、Fab、F(ab')2、ScFv、およびminibody等が挙げられる。
　例えば、ポリクローナル抗体は、本発明のペプチドを抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に2～3週間おきに2～4回程度投与し、最終免疫後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなど、目的の抗体を得ることができる哺乳動物が挙げられる。
　また、モノクローナル抗体は、細胞融合法により作成することができる。モノクローナル抗体を調製するための技法の説明は、Stites et al, Basic and Clinical Immunology. (Lang Medical Publications Los Altos. CA. 4th Edition） and references therein, 、in particular Koehler, G. & Milstein, C. Nature 256, 495-497 (1975).に見出され得る。例えば、本発明のペプチドを市販のアジュバントと共にマウスに2～4回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。
　この白血球と骨髄腫細胞（例えば、NS-1, P3X63Ag8など）を細胞融合して該ペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のEIAまたはRIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、このましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
　抗体を用いる本発明の検査方法は、特に制限されるべきものではなく、被験試料中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体－抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法等が好適に用いられる。測定に際し、抗体または抗原は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、または発光物質等の標識剤と結合され得る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-アビジン系を用いることもできる。
これら個々の免疫学的測定法は、当業者の通常の技能により、本発明の定量方法に適用可能である。
　本発明のペプチドはタンパク質分解産物からなるため、未分解のタンパク質や、切断部位が共通の類似ペプチド等様々な分子が測定値に影響を与える可能性がある。そこで、第１工程において、卵胞液を抗体により免疫アフィニティ精製し、抗体に結合したフラクションを、第２工程において質量分析に付し、精緻な分子量を基準に同定、定量する、いわゆる免疫質量分析法を利用することができる（例えば、Rapid Commun. Mass Spectrom. 2007, 21: 352-358を参照）。免疫質量分析法によれば、未分解のタンパク質も類似ペプチドも、質量分析計で完全に分離され、バイオマーカーの正確な分子量を基準に高い特異性と感度で定量が可能となる。
　あるいは、本発明の抗体を用いる別の本発明の検査方法として、該抗体を上記したような質量分析計に適合し得るチップの表面上に固定化し、該チップ上の該抗体に被検試料を接触させ、該抗体に捕捉された試料中の成分を質量分析にかけ、該抗体が認識するマーカーペプチドの分子量に相当するピークを検出する方法が挙げられる。
　上記のいずれかの方法により測定された被検者由来試料中の本発明のペプチドのレベルが、対照試料中のペプチドの量に基づいて設定された閾値に比べて統計学的に有意に変動している場合、該被検者の卵子の受精可能性が高いと診断または判定することができる。対照試料中のペプチドの量に基づいて設定された閾値は、対照試料中のペプチドの量そのものであってもよいし、本発明の検査または判定方法の信頼性が確保される範囲で対照試料中のペプチドの量に基づいて設定された別の基準値であってもよい。
　本明細書において、対照試料とは、比較の基準となる試料を指し、未受精の場合の試料が含まれる。対照試料中の本発明のペプチドのレベルは、被検者の生体試料における本発明のペプチドのレベルと平行して検出してもよいし、あるいは、予め、多数の対照試料における本発明のペプチドのレベルを測定しておき、対照試料における標準的な発現レベルを統計学的に決定してもよい。具体的には、たとえば、平均値±２×標準偏差(S.D.)、あるいは平均値±×標準偏差(S.D.)または平均値±３×標準偏差(S.D.)を標準値として用いることもできる。
　あるいは、対照試料中の本発明のペプチドの発現レベルを、ＲＯＣ曲線を利用して設定してもよい。ＲＯＣ曲線(receiver　operating　characteristic　curve；受信者操作特性曲線）は、縦軸に検出感度を、横軸に擬陽性率（すなわち"１－特異度"）を示すグラフである。生体試料中のペプチドの発現レベルを判定するための基準値を連続的に変化させたときの、感度と擬陽性率の変化をプロットすることによって、ＲＯＣ曲線を得ることができる。
　得られたＲＯＣ曲線に基づいて、所望の検出感度、並びに精度を期待できる標準値を選択することができる。ＲＯＣ曲線などによって統計学的に設定された標準値は、カットオフ値(cut-off　value)とも呼ばれる。カットオフ値に基づいて卵子の受精可能性を検出する場合、被験者由来試料中の本発明のペプチドのレベルが、カットオフ値と比較される。そして、カットオフ値に対して被験者由来試料中の本発明のペプチドのレベルが変動しているときに、卵子の受精可能性が検出または判定がされる。
　なお、カットオフ値は、病気の診断の分野において、その値以上であると該病気の罹患のリスクが高いと予測される判定基準値であり、カットオフ値以上は陽性、カットオフ値未満は陰性と判定される。カットオフ値を低く設定すれば感度が高く特異度が低くなり、カットオフ値を高く設定すれば感度が低く特異度が高くなる。一実施形態では、カットオフ値は、対照試料における測定値である基準値を、個体数ぶん測定し、そのうちの95％を含む中央部の数値を求めた基準範囲（９５％信頼区間、正規分布の場合は対照試料における測定平均値±２標準偏差）の上限値である。しかしながら、判定で求められる感度と特異度が満たされる限り、別の値をカットオフ値として設定してもよい。
　より具体的には、本発明のペプチドがペプチド１、２、または４のいずれかであり、試料中の該ペプチドのレベルが、対照試料中の該ペプチドレベルに比べて統計学的に有意に上昇している場合、および／または試料中のペプチド３のレベルが、対照試料中の該ペプチドレベルに比べて統計学的に有意に低下している場合、卵子の受精可能性が高いと診断または判定することができる。
　本発明のペプチド、より具体的には本発明の４種のペプチドは、それぞれ単独でも卵子の受精可能性の診断マーカーとして利用することができるが、２種以上を組み合わせることにより、感度（有病正診率）および特異度（無病正診率）をより高めることができる。
　２もしくは４種の本発明のペプチドをマーカーとして用いる場合、集団学習法により判定するか、あるいは相当サンプル数の既知患者の試料中および対照由来試料中の各ペプチドの測定値を2次元もしくは3次元座標にプロットして散布図を作成することにより、２群のそれぞれがどの領域に分布するかを可視化し、次いで、被検者由来試料中の各ペプチドの測定値を該散布図上にプロットすることにより、被検者の卵子の受精可能性を容易に判定することができる。散布図に基づいて各ペプチドのカットオフ値を決定し、被検者由来試料中の各ペプチドの測定値をこれと比較することによっても判定が可能である。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
　本明細書中に引用されているすべての特許出願および文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
　実施例１　BLOTCHIP（登録商標）を用いたプロファイリング解析
　福井大学産婦人科を受診し、インフォームドコンセントが得られた女性患者８名を被験者とした。被験者の体外受精治療により採取した卵胞から、注射針を指して卵胞液を吸い取り、体外受精で受精しなかった卵子が入っていた卵胞液（未受精群、1-F1～1-F4の４検体）と、体外受精で受精した卵子が入っていた卵胞液（受精群、2-F1～2-F4の４検体）とに群分けした。受精の確認は、受精した卵子における細胞分裂の開始を顕微鏡観察する従来の方法で確認した。採取した卵胞液は、各卵子と１対１に対応付けして、－８０℃で直ちに凍結保存し、後のプロファイリング解析に用いた。
　上記の未受精群4例および受精群4例の卵胞液1.5μLを電気泳動用サンプル処理液（NuPAGE（登録商標）LDS Sample Buffer 4x ;Invitrogen）4.5μLと混合し70℃で10分間、加熱処理した後、4-12％グラジェントポリアクリルアミドゲル（Invitorigen）にアプライし電気泳動を行った。電気泳動終了後、ゲルを切り出しBLOTCHIP（登録商標）（Protosera, Inc.）に積層し電気転写用バッファー（BLOTBufferTM;Protosera, Inc.）中で90mA、120分間転写した。転写終了後、チップの表面を超純水でリンスし、チップ全体にマトリックス（α-Cyano-4-hydroxy cinamic acid）を塗布後、matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometer (Bruker Daltnics社製Ultra-FlexII)で質量分析を行った。測定パラメータは、Detector voltage 1685V, Supression1000, Laser Intensity は28～35のFuzzyモードで、１チップあたり415点、１点あたり500回のレーザー照射で、総計207,500回レーザー照射を行った。得られたスペクトル中の各ピーク強度をM/z 毎に積算し、１個の積算スペクトルに変換した。積算スペクトルをClinProTools 2.2(Bruker Daltonik GmbH) を用いて、未受精群の卵胞液と受精群の卵胞液の間でディファレンシャルプロファイリング解析を行い、統計学的有意差（0.05以下のP値）を与えるペプチド群を選択し、分子量2743、2757、2862、および2941の４種のペプチドが卵子の検査または判定マーカーとして同定された（図１）。
　図２Ａ、図３Ａ、図４Ａおよび図５Ａは得られた４種のバイオマーカーの２群間での分子量2743、2757、2862、および2941それぞれにおけるピーク強度を示し、図２Ｂ、図３Ｂ、図４Ｂおよび図５Ｂは当該４種のバイオマーカーの、１：未受精群と２：受精群間でのピーク強度のプロット図とＲＯＣ曲線図とを示す。これらの結果から、受精群では未受精群と比較して分子量2743、2757、および2941におけるピーク強度が顕著に高く、分子量2862におけるピーク強度が顕著に低いことが理解され、４種のペプチドが特異的な卵子の受精可能性の検査または判定マーカーとして有用であることが示された。
　実施例２　BLOTCHIP上でのde novo MS/MS解析によるペプチドの同定
　図２～５に示したペプチドのあったフラクションのスポットに対し、MALDI-TOF型質量分析計UltraflexII(Bruker Daltnics社製)のReflectorモードでモノアイソトピック質量[M+H]+を測定した。得られたモノアイソトピック質量[M+H]+をParent Massに指定して、Liftモード(PSD)でMS/MS測定を行った。測定結果をMASCOT Serverで検索し、MS/MS解析によりアミノ酸配列を決定し、ペプチドを同定した（図１）。
　その結果、ヒトα-2-HS-glycoproteinの３４１番目から３６７番目までのフラグメントに相当し配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド１、ヒト血清アルブミンの２５番から４８番目までのフラグメントに相当し配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド２、アミノ酸配列は配列番号１と同じだが１８番目のシステインにさらにジスルフィド結合によりシステインが結合しているペプチド３、ヒト血清アルブミンの２５番から５０番目までのフラグメントに相当し配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド４がそれぞれ同定された。
　実施例３　免疫診断または判定用装置の例
　図６（ａ），（ｂ）は、本発明の免疫診断または判定用装置であるイムノクロマットチップの例を示す略図である。イムノクロマトチップ１０は、イムノストリップまたは免疫測定用ストリップとも呼ばれる、抗原抗体反応を利用して検体を分析する免疫 アッセイ装置であり、基本構造として、基材と、基材上に設けられた検体を含む生体試料（本願では卵胞液）を吸収、展開させる吸収パッドを備えている。基材や吸収パッドは当該技術分野における周知又は公知の材料から構成されてよい。
　図６（ａ），（ｂ）において、イムノクロマトチップ１０の長手方向に沿って本発明のペプチドに対する抗体を結合させた領域２０が設けられる。
　イムノクロマトチップ１０の下端から卵胞液を含む生体試料を吸収、展開させる場合、下から上へと生体試料が流れ（図６の矢印の方向）、図６（ａ），（ｂ）におけるように、卵胞液中の卵子の受精可能性を判定できる。図６（ａ）は領域２０のラインが無く、卵子が未受精又は受精に適していないことを示す。図６（ｂ）は領域２０のラインが有り、卵子が受精に適した状態にあるか又は受精していることを示す。
　このように、本発明のペプチドに対する抗体を用いたイムノチップによれば、卵子の質又は状態を簡易、迅速かつ的確に判定できる。
　本発明の新規な卵子の検査または判定マーカーを利用した臨床検査方法は、卵子の受精可能性を迅速且つ的確に判断できるので、受精、特に体外受精の成功率を大幅に向上できる点で有用である。

Claims (9)

  1. 　被検者より採取した卵胞液中の、配列番号１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群より選択される１以上のペプチドの量を測定することを特徴とする、該被検者における卵子の受精可能性の検査方法。
  2. 　卵胞液を質量分析にかけることを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記測定により得られたペプチドの量を、対照試料中のペプチドの量に基づいて設定された閾値と比較し、前記測定により得られたペプチドの量が対照試料中のペプチドの量に基づいて設定された閾値に比べて統計学的に有意に変動している場合に、卵子の受精可能性が高いと判定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 　配列番号１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群より選択されるペプチドを含む卵子の受精可能性の検査のためのバイオマーカー。
  5. 　配列番号１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群より選択されるペプチドからなる卵子の受精可能性の検査のためのバイオマーカー。
  6. 　卵子の受精可能性を検査する方法であって、
    　配列番号１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群より選択されるペプチドを特異的に認識する抗体を用いた方法。
  7. 　抗体を含む卵子の受精可能性を検査するための判定キットであって、当該抗体が、配列番号１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群より選択されるペプチドを特異的に認識する抗体である、判定キット。
  8. 　配列番号１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド群より選択されるペプチドに対する抗体を固定した免疫診断または判定用装置。
  9. 　配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
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