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WO2015068253A1 - 肝組織培養用デバイス、肝組織培養用システム、肝組織培の培養方法及び肝機能の評価方法 - Google Patents

肝組織培養用デバイス、肝組織培養用システム、肝組織培の培養方法及び肝機能の評価方法 Download PDF

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WO2015068253A1
WO2015068253A1 PCT/JP2013/080207 JP2013080207W WO2015068253A1 WO 2015068253 A1 WO2015068253 A1 WO 2015068253A1 JP 2013080207 W JP2013080207 W JP 2013080207W WO 2015068253 A1 WO2015068253 A1 WO 2015068253A1
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WO
WIPO (PCT)
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culture
culturing
cells
liver tissue
gel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2013/080207
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
藤山　陽一
陽一 田川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shimadzu Corp
Tokyo Institute of Technology NUC
Original Assignee
Shimadzu Corp
Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to US15/034,031 priority Critical patent/US10336987B2/en
Priority to JP2015546218A priority patent/JP6148738B2/ja
Priority to PCT/JP2013/080207 priority patent/WO2015068253A1/ja
Priority to CN201380080662.8A priority patent/CN105705627A/zh
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    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/28—Vascular endothelial cells

Definitions

  • the present invention relates to a liver tissue culture device, a liver tissue culture system, a liver tissue culture method, and a liver function evaluation method.
  • the present inventors have reported that high liver function is expressed in a co-culture system of endothelial cells and liver parenchymal cells that form a network structure by selecting a scaffold (see Non-Patent Documents 1 and 2). ).
  • Non-Patent Document 2 The inventors of the present application have already reported that a co-culture system of networked endothelial cells and hepatocytes has high liver function (see Non-Patent Document 2). However, this structure begins to collapse about 3 days after construction. Therefore, there is a problem that long-term testing is difficult.
  • the object of the present invention is to maintain the structure of a co-culture system of networked skin cell and hepatocyte cells for a longer period of time.
  • the device for culturing liver tissue includes a culture chamber to which at least two flow paths for introducing and discharging a medium are connected, and a gel serving as a cell scaffold is contained in the culture chamber.
  • a co-culture system containing endothelial cells, hepatocyte cells, and mesenchymal cells is co-cultured on the gel so as to have a tubular structure. It is.
  • the system for culturing hepatocytes according to the present invention has a function of continuously feeding the medium into the culture chamber or a continuous suction of the medium from the culture chamber by connecting a pump to the device for culturing hepatocytes of the present invention. It is characterized by having a function.
  • the endothelium is obtained by seeding and co-culturing at least endothelial cells, hepatocyte cells and mesenchymal cells on a gel serving as a cell scaffold.
  • a co-culture system comprising at least a cell line cell, the hepatocyte cell line and the mesenchymal cell line and having a tubular structure is cultured.
  • the method for evaluating liver function according to the present invention is characterized in that liver function is evaluated using a co-culture system cultured by the method for culturing hepatocytes of the present invention.
  • the device for culturing liver tissue, the system for culturing hepatocytes, the method for culturing hepatocytes, and the method for evaluating liver function according to the present invention include a structure of a co-culture system of networked skin cell cells and hepatocyte cells. It can be maintained for a longer period.
  • FIG. 2 is a schematic perspective view and a schematic cross-sectional view showing a partial cross-sectional view of a structure of a co-culture system including a network-formed endothelial cell line cell, hepatocyte cell line, and mesenchymal cell line.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of co-culturing endothelial cells and hepatocytes using the device for culturing liver tissue shown in FIG. 1, and the results when stellate cells are added thereto.
  • the gel preferably contains at least laminin, collagen and entactin.
  • the gel preferably contains at least EHS (Engelbreth-Holm-Swarm) -gel.
  • the mesenchymal cells include at least stellate cells or fibroblasts.
  • the culture chamber portion and the lid portion of the culture chamber can be opened and closed, and a filter is disposed in the outlet side flow channel which is one of the two flow channels.
  • a filter is disposed in the outlet side flow channel which is one of the two flow channels.
  • liver tissue culture device of the present invention examples in which PDMS or silicone rubber is used in at least a part of the culture chamber can be given.
  • the structure of the device for culturing liver tissue of the present invention is not limited to this.
  • the gel preferably contains at least laminin, collagen and entactin.
  • the gel preferably contains at least EHS-gel.
  • the mesenchymal cells preferably contain at least stellate cells or fibroblasts.
  • the method for culturing hepatocytes of the present invention it is preferable to continuously supply a medium to the co-culture system.
  • the method for culturing hepatocytes of the present invention includes a configuration in which the medium is intermittently supplied to the co-culture system instead of continuous supply.
  • examples in which the device for culturing hepatocytes of the present invention or the system for culturing hepatocytes of the present invention can be used in the method for culturing hepatocytes of the present invention.
  • the method for culturing hepatocytes of the present invention is not limited to this.
  • endothelial cells when endothelial cells are cultured using a special scaffold such as EHS-gel, the endothelial cells form a tubular network structure.
  • the liver parenchymal cells migrate to the network of endothelial cells, take a structure close to the liver tissue in the living body, and express high liver function.
  • this structure could only be maintained for about 3 days.
  • the present inventors have found that by adding mesenchymal cells such as stellate cells to this tubular structure, a tubular structure close to liver tissue in the living body can be maintained for a long time.
  • the device for culturing liver tissue or the system for culturing liver tissue of the present invention is used, a good culture environment is maintained by continuous supply or intermittent supply of the medium from the flow path to the culture chamber.
  • the liver tissue culturing device and the liver tissue culturing system of the present invention can realize an environment very close to the living body, which is impossible on a petri dish. Therefore, the liver tissue culture device and the liver tissue culture system of the present invention can be a device and system that can maintain a tubular structure having a high liver function for a long period of time.
  • the culture method for culturing liver tissue of the present invention can maintain a tubular structure of a co-culture system including network-formed endothelial cell line cells, hepatocyte line cells and mesenchymal cells for a longer period of time.
  • the method for culturing liver tissue culture according to the present invention using the device for culturing liver tissue or the system for culturing liver tissue according to the present invention includes an endothelial cell system cell, hepatocyte system cell and A co-culture system containing mesenchymal cells can be cultured.
  • the liver function evaluation method of the present invention uses a co-culture system including endothelial cell line cells, hepatocyte line cells and mesenchymal cells cultured by the liver tissue culture method of the present invention. Can be evaluated.
  • the liver function evaluation method of the present invention using the co-culture system cultured by the liver cell culture method of the present invention using the liver tissue culture device or the liver tissue culture system of the present invention is very useful in vivo.
  • the liver function can be evaluated in an environment close to.
  • the present invention is a technique for cell culture, and particularly useful for an artificial organ such as an artificial liver or a drug metabolism test.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view for explaining one embodiment of a device for culturing liver tissue.
  • FIG. 2 is a plan view of the embodiment.
  • the cross section in FIG. 1 corresponds to the position AA in FIG.
  • the liver tissue culture device 1 is roughly composed of a culture chamber portion 3 and a lid portion 5.
  • the culture chamber portion 3 includes a base plate 7 and a PDMS structure 9.
  • the lid portion 5 includes a filter holding layer 11 and a PDMS structure 13.
  • the base plate 7 is made of synthetic quartz, for example.
  • the PDMS structure 9 and the PDMS structure 13 are made of, for example, SILPOT184 (manufactured by Toray Dow Corning).
  • the filter holding layer 11 has a structure in which, for example, a filter 11a made of a porous film is sandwiched between silicone rubber sheets 11b.
  • the filter 11a is, for example, a commercially available polycarbonate filter (manufactured by Whatman, CYCLOPORE 7062-2513).
  • These members all have a flat plate shape with a width of 20 mm (millimeters) and a length of 20 mm.
  • the thickness of the base plate 7 is 1 mm, for example.
  • the thickness of the PDMS structure 9 is 3 mm, for example.
  • the thickness of the porous film constituting the filter 11a is, for example, 0.25 mm.
  • the thickness of the silicone rubber sheet 11b is, for example, 0.2 mm.
  • the thickness of the PDMS structure 13 is 3 mm, for example.
  • a culture chamber 15 composed of a through hole is formed in the center of the PDMS structure 9.
  • the diameter of the culture chamber 15 is, for example, 10 mm.
  • a groove 9a provided on the side wall of the culture chamber 15 and a groove 9b connected to the groove 9a are also formed.
  • the depth of the groove 9a and the groove 9b is, for example, 0.1 mm.
  • the width of the groove 9b is, for example, 1 mm.
  • the length of the groove 9b is, for example, about 5 mm.
  • the PDMS structure 9 has, for example, a two-layer structure.
  • the grooves 9 a and 9 b are formed by recesses formed by molding on the surface of one of the two layers of PDMS constituting the PDMS structure 9.
  • the grooves 9a and 9b are disposed on the bonding surface of the two layers of PDMS.
  • the filter 11 a is arranged in the center of the filter holding layer 11.
  • the diameter of the filter 11a is 11 mm, for example.
  • the filter 11a is disposed at a position covering the top of the culture chamber 15.
  • a through hole is formed in the center of the silicone rubber sheet 11b.
  • a filter 11a is disposed in the through hole.
  • the silicone rubber sheet 11 b holds the filter 11 a so as to be in close contact with the PDMS structure 13.
  • a circular recess 13 a is formed in the center of the PDMS structure 13.
  • the diameter of the recess 13a is, for example, 8 mm.
  • the depth of the recess 13a is, for example, 0.1 mm.
  • the PDMS structure 13 is also formed with a groove 13b connected to the recess 13a.
  • the groove 13b is formed by PDMS molding.
  • the depth of the groove 13b is, for example, 0.1 mm.
  • the width of the groove 13b is, for example, 1 mm.
  • the length of the groove 13b is, for example, about 5 mm.
  • a through hole 17 connected to the groove 9b is formed in the PDMS structure 9, the silicone rubber sheet of the filter holding layer 11, and the PDMS structure 13, a through hole 17 connected to the groove 9b is formed.
  • the PDMS structure 13 is formed with a through hole 19 connected to the groove 13b.
  • the diameters of the through hole 17 and the through hole 19 are, for example, 1.5 mm.
  • the through hole 17 and the through hole 19 are formed by, for example, through hole processing.
  • the inlet side channel 21 of the culture medium is formed by the groove 9a, the groove 9b, and the through hole 17.
  • a culture medium outlet-side flow path 23 is formed by the recess 13 a, the groove 13 b, and the through hole 19.
  • the culture chamber portion 3 is formed by bonding the base plate 7 and the PDMS structure 9 together. Further, the filter holding layer 11 and the PDMS structure 13 are bonded together to form the lid portion 5. When bonding the members, it is preferable to activate and bond the bonding surfaces of the members with oxygen plasma or ultraviolet rays in order to obtain strong adhesion.
  • the liver tissue culture device 1 By overlapping the lid portion 5 on the upper part of the culture chamber portion 3, the liver tissue culture device 1 according to the present embodiment is formed. Since the silicone rubber constituting a part of the filter holding layer 11 has self-adsorption property, the lid portion 5 can be easily attached to and detached from the culture chamber portion 3. Such a structure of the liver tissue culture device 1 is disclosed in Patent Document 1, for example.
  • a gel 25 serving as a cell scaffold is accommodated.
  • the gel 25 is, for example, EHS-gel.
  • EHS-gel is a basement membrane preparation isolated from EHS mouse sarcoma cells and is rich in laminin, type IV collagen and proteoglycans. This EHS-gel liquefies at a low temperature and becomes solid at a normal temperature. Accordingly, the EHS-gel is poured into the culture chamber 15 in a state where the liver tissue culture device 1 is cooled, and the EHS-gel is fixed to the bottom surface of the culture chamber 15 by, for example, standing in a 37 ° C. incubator or at room temperature. Can do.
  • Such coating with a scaffold may be performed at the stage of manufacturing the liver tissue culture device 1 or may be performed by a user who has purchased the liver tissue culture device 1.
  • a co-culture system 27 containing endothelial cells, hepatocyte cells, and mesenchymal cells is co-cultured on the gel 25 so as to have a tubular structure.
  • Endothelial cells are, for example, hippocampal endothelial cells, human umbilical vein (arterial) endothelial cells, TD2, GH7, and the like.
  • hepatocyte cells include hepatocytes, HepaRG, Huh-7, Hep G2, TLR2, Hepa1-6, and hepatic progenitor cells.
  • mesenchymal cells include stellate cells, fibroblasts, HFO, NIH-3T3, mouse fetal fibroblasts, and the like.
  • stellate cells include stellate cells, TWNT-4, LX-2, LI90, and RI-T.
  • FIG. 3 is a schematic diagram for explaining an embodiment of a hepatocyte culture system using the liver tissue culture device 1 according to the present embodiment.
  • the hepatocyte culture system 31 is a combination of the liver tissue culture device 1 and a liquid feeding mechanism for continuously feeding a medium to the liver tissue culture device 1.
  • the liquid feeding mechanism includes a culture medium storage part 33, a culture medium supply pipe 35, a culture medium discharge pipe 37, a waste liquid storage part 39, a liquid supply pump 41, and a control part 43.
  • the medium supply pipe 35 is inserted into the medium containing part 33.
  • the other end of the medium supply pipe 35 is connected to the inlet-side channel 21 of the liver tissue culture device 1.
  • One end of the medium discharge pipe 37 is connected to the outlet-side flow path 23 of the liver tissue culture device 1.
  • the other end of the medium discharge pipe 37 is inserted into the waste liquid storage unit 39.
  • the liquid feed pump 41 is connected to the culture medium supply pipe 35.
  • the controller 43 controls the operation of the liquid feed pump 41.
  • the medium accommodated in the medium accommodating part 33 is sucked by the liquid feeding pump 41 and sent to the liver tissue culture device 1 through the medium supply pipe 35.
  • the medium supplied to the liver tissue culture device 1 is introduced into the culture chamber 15 from the peripheral surface of the culture chamber 15 through the inlet-side flow path 21 as indicated by an arrow in FIG.
  • the culture medium in the culture chamber 15 With the introduction of the culture medium into the culture chamber 15, a part of the culture medium in the culture chamber 15 passes from the culture chamber 15 to the filter portion of the filter holding layer 11 and the outlet-side flow path 23 as indicated by the arrows in FIG. 1. It is discharged to the outside through.
  • the medium discharged to the outside of the liver tissue culture device 1 is discharged to the waste liquid storage unit 39 through the medium discharge pipe 37.
  • the liver tissue culturing device 1 passes the filter portion of the filter holding layer 11 when the medium in the culture chamber 15 is discharged from the outlet side channel 23, so that the outlet side channel 23 is clogged by the peeled gel 25. The probability that it will end up can be reduced.
  • the recess 13a constituting the channel end of the outlet channel 23 has a larger area than the end of the groove 13b. , Local strong liquid flow is less likely to occur. Thereby, the effect 1 which suppresses peeling of the gel 25 is also acquired for the device 1 for liver tissue culture.
  • the liver tissue culture device 1 is advantageous for long-term culture of cells.
  • the hepatocyte culture system 31 shown in FIG. 3 includes a liquid feed pump 41 in the medium supply pipe 35 and a function of continuously feeding the medium into the culture chamber 15, but the hepatocyte culture of the present invention.
  • the system for use is not limited to this.
  • the hepatocyte culture system 45 includes a liquid feed pump 41 in the medium discharge pipe 37 and a function of continuously sucking the medium from the culture chamber 15. You may be allowed to.
  • the hepatocyte culture system of the present invention is not limited to the configuration shown in FIG. 3 or FIG.
  • the culture chamber portion 3 and the lid portion 5 are sterilized with an autoclave, alcohol, or the like.
  • the sterilized culture chamber part 3 and the lid part 5 are bonded together.
  • the cooled EHS-gel is poured into the culture chamber 15, and the EHS-gel is spread over the bottom surface of the culture chamber 15.
  • EHS-gel is gelled at 37 ° C., for example, and gel 25 made of EHS-gel is fixed in culture chamber 15.
  • Sinusoidal endothelial cells are seeded on the gel 25 to form an endothelial cell network.
  • a stellate cell is seed
  • stellate cells are incorporated into the endothelial cell network, and hepatocytes migrate around them to form a co-culture system 27 having a structure close to the actual liver structure.
  • endothelial cell line cells may be seeded simultaneously.
  • the cells may be seeded in the order of endothelial cell line, hepatocyte line, and mesenchymal line.
  • FIG. 5 is a photograph showing the state of the epithelial endothelial cells and liver parenchymal cells formed on the EHS-gel network using the liver tissue culture device 1 according to the present example.
  • mesenchymal cells are not co-cultured.
  • FIG. 6 is a schematic perspective view and a schematic cross-sectional view partially showing a cross-sectional view of a structure of a co-culture system including networked endothelial cell cells, hepatocyte cells, and mesenchymal cells. It is.
  • Endothelial endothelial cells were seeded in a culture chamber 15 coated with EHS-gel to form an endothelial cell network, and then hepatocytes were seeded on the endothelial cells to perform cell culture.
  • hepatocytes were seeded on the endothelial cells to perform cell culture.
  • liver parenchymal cells 49 migrate in the network of endothelial cells 47 and have a structure close to liver tissue in the living body.
  • the results of the liver function evaluation test using the above hepatocytes are shown in FIG.
  • the liver tissue culture device 1 of this example (“device” in the figure) and a common cell culture petri dish (“petriette” in the figure) were used as comparative examples. (GH7)) and hepatic parenchymal cells (“hepatocytes" in the figure) were cultivated individually or in a co-culture system of both, and the urea synthesis ability of each cultured cell was evaluated.
  • the medium was supplied continuously at a flow rate of 40 ⁇ L / h (microliter / hour) for 24 hours. In the culture, the medium was changed at regular intervals.
  • the co-culture system shows higher liver function than that in the case of culturing with hepatocytes alone.
  • the cells cultured with the device for culturing liver tissue of the present invention show higher liver function than those cultured with a petri dish. This is presumably because in the culture using the device for culturing liver tissue, since the medium was continuously supplied, the tissue was subjected to shear stress (shear stress), and the culture was performed in an environment closer to the living body.
  • the liver tissue culture device 1 can prevent clogging of the flow path due to the peeling of the scaffold material as described above. Therefore, the liver tissue culturing device 1 can stably cultivate hepatocytes in an environment close to the living body for a long period of time. For this reason, the device 1 for culturing liver tissue can be used for research in various systems such as a drug metabolism test and can be expected to be applied to an artificial liver.
  • FIG. 8 is a photograph showing the results of co-culturing endothelial cells and liver parenchymal cells using the device 1 for culturing liver tissue according to the present example, and the results when stellate cells were added thereto.
  • the liver function can be examined using the liver tissue culture device of the present invention or the liver tissue culture system of the present invention. Specifically, an analysis system capable of searching for a physiologically active substance, such as a pharmacokinetic test, can be considered.
  • stellate cells are added as mesenchymal cells, but long-term network structure maintenance can be realized even when stellate cells other than TWNT-4 are added. . Even when mesenchymal cells other than stellate cells are added, long-term network structure can be maintained.
  • EHS-gel is used as a gel as a scaffold for cells, but the gel used in the present invention is not limited to this.
  • the gel used in the present invention may be a gel in which a co-culture system containing endothelial cell lines, hepatocyte cells and mesenchymal cells forms a tubular structure, preferably a network structure.
  • the gel used in the present invention is not limited to EHS-gel, and may be, for example, a gel containing at least laminin, collagen and entactin, or may be a gel in which other components are mixed with EHS-gel. Good.

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Abstract

肝組織培養用デバイスは、少なくとも培地を導入及び排出するための少なくとも２本の流路が接続されている培養室を備えている。その培養室の中に細胞の足場材となるゲルが収容されている。ゲル上で内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系が管状の構造をもつように共培養されている。

Description

肝組織培養用デバイス、肝組織培養用システム、肝組織培の培養方法及び肝機能の評価方法
　本発明は、肝組織培養用デバイス、肝組織培養用システム、肝組織培の培養方法及び肝機能の評価方法に関するものである。
　細胞培養のためには、その細胞に応じた足場材を用いることが有効である。しかし、デバイスを用いる場合には、デバイス作製のプロセスとの関連から制約が多い。
　肝臓以外の臓器の細胞は１細胞につき１機能であることが多い。これに対し、肝臓中の肝細胞は１つで１００以上の特異的機能を有している。
　しかし、これまでの培養肝細胞は、ほとんどの機能を維持したり発揮したりすることはできていない。例えば、人工肝臓に関する研究など多く成されているが、ほとんどの薬物代謝は実現できていない。
　本願発明者らは、足場材の選択によってネットワーク構造を形成する内皮細胞と肝実質細胞との共培養系で高い肝機能が発現することを報告している（非特許文献１，２を参照。）。
特開２０１１－２４４７１３号公報
藤山陽一、田川陽一、他５名、「管化内皮肝細胞培養用システムを用いた肝実質細胞との共培養における肝機能の解析」、第３０回日本分子生物学会年会予稿集、２００７年 Yu Toyoda, Miho Tamai, Kasumi Kashikura, Shunsuke Kobayashi, Yoichi Fujiyama, Tomoyoshi Soga and Yoh-ichi Tagawa, "Acetaminophen-Induced Hepatotoxicity in a Liver Tissue Model Consisting of Primary Hepatocytes Assembling around an Endothelial Cell Network", DRUG METABOLISM AND DISPOSITION, 2012, Vol. 40, 169-177
　本願発明者らは、ネットワーク形成された内皮細胞と肝実質細胞の共培養系が高い肝機能を発現することを報告済みである（非特許文献２を参照。）。しかし、この構造は構築後３日程度で崩壊が始まる。したがって、長期的な試験が困難であるという問題があった。
　本発明は、ネットワーク形成された皮細胞系の細胞と肝細胞系の細胞の共培養系の構造をより長期間維持させることを目的とするものである。
　本発明にかかる肝組織培養用デバイスは、少なくとも培地を導入及び排出するための少なくとも２本の流路が接続されている培養室を備え、上記培養室の中に細胞の足場材となるゲルが収容されており、上記ゲル上で内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系が管状の構造をもつように共培養されていることを特徴とするものである。
　本発明にかかる肝細胞培養用システムは、本発明の肝細胞培養用デバイスにポンプを接続することにより、上記培養室内に上記培地を連続送液する機能又は上記培養室内から上記培地を連続吸引する機能を備えたことを特徴とするものである。
　本発明にかかる肝細胞の培養方法は、細胞の足場材となるゲル上に少なくとも内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を播種して共培養することにより、前記内皮細胞系の細胞、前記肝細胞系の細胞及び前記間葉系の細胞を少なくとも含み、かつ管状の構造をもつ共培養系を培養することを特徴とすることを特徴とする。
　本発明にかかる肝機能の評価方法は、本発明の肝細胞の培養方法によって培養された共培養系を用いて肝機能を評価することを特徴とする。
　本発明の肝組織培養用デバイス、肝細胞培養用システム、肝細胞の培養方法及び肝機能の評価方法は、ネットワーク形成された皮細胞系の細胞と肝細胞系の細胞の共培養系の構造をより長期間維持させることができる。
肝組織培養用デバイスの一実施例を説明するための概略的な断面図である。 同実施例の平面図である。 肝細胞培養用システムの一実施例を説明するための概略図である。 肝細胞培養用システムの他の実施例を説明するための概略図である。 ＥＨＳ－ｇｅｌ上にネットワーク形成された類胴内皮細胞及び肝実質細胞の状態を示す写真である。 ネットワーク形成された内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系の構造を一部断面で示した模式的な斜視図及び模式的な断面図である。 肝細胞を用いた肝機能評価試験の結果を示す図である。 図１に示された肝組織培養用デバイスを用いて、内皮細胞と肝実質細胞を共培養した結果と、これに星細胞を添加した際の結果をそれぞれ示す写真である
　本発明の肝組織培養用デバイスにおいて、上記ゲルはラミニン、コラーゲン及びエンタクチンを少なくとも含んでいることが好ましい。
　また、本発明の肝組織培養用デバイスにおいて、上記ゲルはＥＨＳ（Engelbreth-Holm-Swarm）－ｇｅｌを少なくとも含んでいることが好ましい。
　また、本発明の肝組織培養用デバイスにおいて、上記間葉系の細胞は少なくとも星細胞系の細胞又は線維芽細胞を含んでいることが好ましい。
　また、本発明の肝組織培養用デバイスにおいて、上記培養室の培養室部分と蓋部分が開閉可能であり、かつ上記２本の流路のうちの１つである出口側流路にフィルターが配置されている例を挙げることができる。ただし、本発明の肝組織培養用デバイスの構造はこれに限定されない。
　また、本発明の肝組織培養用デバイスにおいて、上記培養室の少なくとも一部にＰＤＭＳ又はシリコーン系ゴムが用いられている例を挙げることができる。ただし、本発明の肝組織培養用デバイスの構造はこれに限定されない。
　本発明の肝細胞の培養方法において、上記ゲルはラミニン、コラーゲン及びエンタクチンを少なくとも含んでいることが好ましい。
　また、本発明の肝細胞の培養方法において、上記ゲルはＥＨＳ－ｇｅｌを少なくとも含んでいることが好ましい。
　また、本発明の肝細胞の培養方法において、上記間葉系の細胞は少なくとも星細胞系の細胞又は線維芽細胞を含んでいることが好ましい。
　また、本発明の肝細胞の培養方法において、上記共培養系に培地を連続供給することが好ましい。ただし、本発明の肝細胞の培養方法は、上記共培養系に培地を連続供給ではなく間欠的に供給する構成も含む。
　また、本発明の肝細胞の培養方法において、本発明の肝細胞培養用デバイス又は本発明の肝細胞培養用システムが用いられる例を挙げることができる。ただし、本発明の肝細胞の培養方法はこれに限定されない。
　例えばＥＨＳ－ｇｅｌのような特殊な足場材を用いて内皮細胞を培養すると、内皮細胞が管状のネットワーク構造を形成する。これに肝実質細胞を共培養すると、肝実質細胞が内皮細胞のネットワークヘ遊走し、生体内の肝組織に近い構造を取り、高い肝機能を発現する。しかし、この構造は３日程度しか維持できなかった。本発明者らは、この管状の構造に間葉系の細胞、例えば星細胞を加えることにより、長期的に生体内の肝組織に近い管状の構造が維持されることを見いだした。
　本発明の肝組織培養用デバイス又は肝組織培養用システムを用いれば、流路から培養室への培地の連続供給又は間欠供給により、良好な培養環境が維持される。本発明の肝組織培養用デバイス及び肝組織培養用システムはシャーレ上では不可能な生体内に非常に近い環境を実現できる。したがって、本発明の肝組織培養用デバイス及び肝組織培養用システムは高い肝機能をもつ管状の構造を長期間維持できるデバイス及びシステムと成り得る。
　本発明の肝組織培の培養方法は、ネットワーク形成された内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系の管状の構造をより長期間維持させることができる。特に、本発明の肝組織培養用デバイス又は肝組織培養用システムを用いる本発明の肝組織培の培養方法は、生体内に非常に近い環境で、内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系を培養できる。
　本発明の肝機能の評価方法は、本発明の肝組織培の培養方法によって培養された内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系を用いて肝機能を評価できる。特に、本発明の肝組織培養用デバイス又は肝組織培養用システムを用いた本発明の肝細胞の培養方法によって培養された共培養系を用いる本発明の肝機能の評価方法は、生体内に非常に近い環境で肝機能を評価できる。
　本発明は細胞培養のための技術であり、特に人工肝臓など人工臓器又は薬物代謝試験などに用いて有用な技術である。
　図１は、肝組織培養用デバイスの一実施例を説明するための概略的な断面図である。図２は同実施例の平面図である。図１の断面は図２のＡ－Ａ位置に対応している。
　肝組織培養用デバイス１は、大きく分けて培養室部分３と蓋部分５で形成されている。培養室部分３はベースプレート７とＰＤＭＳ構造体９を備えている。蓋部分５はフィルター保持層１１とＰＤＭＳ構造体１３を備えている。
　ベースプレート７は例えば合成石英で形成されている。ＰＤＭＳ構造体９及びＰＤＭＳ構造体１３は例えばＳＩＬＰＯＴ１８４（東レダウコーニング社製）で形成されている。フィルター保持層１１は、例えば、多孔質膜からなるフィルター１１ａがシリコーンゴムシート１１ｂの間に挟み込まれている構造を備えている。フィルター１１ａは例えばポリカーボネートの市販フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ社製、ＣＹＣＬＯＰＯＲＥ７０６２－２５１３）である。
　これらの部材はいずれも幅２０ｍｍ（ミリメートル）、長さ２０ｍｍの平板形状を有している。ベースプレート７の厚みは例えば１ｍｍである。ＰＤＭＳ構造体９の厚みは例えば３ｍｍである。フィルター１１ａを構成する多孔質膜の厚みは例えば０.２５ｍｍである。シリコーンゴムシート１１ｂの厚みは例えば０.２ｍｍである。ＰＤＭＳ構造体１３の厚みは例えば３ｍｍである。
　ＰＤＭＳ構造体９の中央に貫通孔からなる培養室１５が形成されている。培養室１５の直径は例えば１０ｍｍである。ＰＤＭＳ構造体９には、培養室１５の側壁に設けられた溝９ａと、溝９ａに接続された溝９ｂも形成されている。溝９ａ及び溝９ｂの深さは例えば０.１ｍｍである。溝９ｂの幅は例えば１ｍｍである。溝９ｂの長さは例えば５ｍｍ程度である。
　ＰＤＭＳ構造体９は例えば２層構造である。溝９ａ，９ｂは、ＰＤＭＳ構造体９を構成する２層のＰＤＭＳのうち一方の層のＰＤＭＳの表面に型取りによって形成された凹部によって形成されている。溝９ａ，９ｂは２層のＰＤＭＳの貼り合わせ面に配置されている。
　フィルター保持層１１の中央にフィルター１１ａが配置されている。フィルター１１ａの直径は例えば１１ｍｍである。フィルター１１ａは培養室１５の上方を覆う位置に配置されている。シリコーンゴムシート１１ｂの中央に貫通孔が形成されている。その貫通孔にフィルター１１ａが配置されている。シリコーンゴムシート１１ｂはフィルター１１ａをＰＤＭＳ構造体１３に密着させるように保持している。
　ＰＤＭＳ構造体１３の中央に円形の凹部１３ａが形成されている。凹部１３ａの直径は例えば８ｍｍである。凹部１３ａの深さは例えば０.１ｍｍである。ＰＤＭＳ構造体１３には、凹部１３ａに接続された溝１３ｂも形成されている。溝１３ｂはＰＤＭＳの型取りによって形成されたものである。溝１３ｂの深さは例えば０.１ｍｍである。溝１３ｂの幅は例えば１ｍｍである。溝１３ｂの長さは例えば５ｍｍ程度である。
　ＰＤＭＳ構造体９、フィルター保持層１１のシリコーンゴムシート及びＰＤＭＳ構造体１３には、溝９ｂに接続された貫通孔１７が形成されている。ＰＤＭＳ構造体１３には、溝１３ｂに接続された貫通孔１９が形成されている。貫通孔１７及び貫通孔１９の直径は例えば１.５ｍｍである。貫通孔１７及び貫通孔１９は例えば貫通孔加工によって形成されたものである。
　溝９ａ、溝９ｂ及び貫通孔１７によって培地の入口側流路２１が形成されている。凹部１３ａ、溝１３ｂ及び貫通孔１９によって培地の出口側流路２３が形成されている。
　ベースプレート７とＰＤＭＳ構造体９が貼り合わされて培養室部分３が形成されている。また、フィルター保持層１１とＰＤＭＳ構造体１３貼り合わされて蓋部分５が形成されている。各部材を貼り合わせる際には、強固な接着性を得るために、各部材の接合面を酸素プラズマや紫外線により活性化して接合させることが好ましい。
　培養室部分３の上部に蓋部分５が重ね合わせられることにより、本実施例に係る肝組織培養用デバイス１が形成されている。フィルター保持層１１の一部を構成するシリコーンゴムは自己吸着性を有するので、蓋部分５は培養室部分３に対して容易に着脱することができる。
　このような肝組織培養用デバイス１の構造は、例えば特許文献１に開示されている。
　肝組織培養用デバイス１の培養室１５の中に細胞の足場材となるゲル２５が収容されている。ゲル２５は例えばＥＨＳ－ｇｅｌである。ＥＨＳ－ｇｅｌは、ＥＨＳマウス肉腫細胞から単離した基底膜調製物であり、ラミニン、IV型コラーゲン及びプロテオグリカンを豊富に含んでいる。このＥＨＳ－ｇｅｌは低温で液状化し、常温で固体状となる。したがって、肝組織培養用デバイス１を冷却した状態でＥＨＳ－ｇｅｌを培養室１５に流し込み、例えば３７℃のインキュベーター内又は室温で静置することにより培養室１５の底面にＥＨＳ－ｇｅｌを固定させることができる。なお、このような足場材によるコーティングは、肝組織培養用デバイス１の製造段階で行ってもよいし、肝組織培養用デバイス１を購入したユーザが行うようにしてもよい。
　培養室１５の中では、ゲル２５上で内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系２７が管状の構造をもつように共培養されている。内皮細胞系の細胞は、例えば、類胴内皮細胞やヒト臍帯静脈（動脈）内皮細胞、ＴＤ２、ＧＨ７などである。肝細胞系の細胞は、例えば、肝実質細胞やＨｅｐａＲＧ、Ｈｕｈ－７、Ｈｅｐ Ｇ２、ＴＬＲ２、Ｈｅｐａ１－６、肝前駆細胞などである。間葉系の細胞は、例えば、星細胞系の細胞、線維芽細胞、ＨＦＯ、ＮＩＨ－３Ｔ３、マウス胎仔線維芽細胞などである。星細胞系の細胞は、例えば、星細胞や、ＴＷＮＴ－４、ＬＸ－２、ＬＩ９０、ＲＩ－Ｔなどである。
　図３は、本実施例に係る肝組織培養用デバイス１を用いた肝細胞培養用システムの一実施例を説明するための概略図である。
　肝細胞培養用システム３１は、肝組織培養用デバイス１と、肝組織培養用デバイス１に培地を連続送液する送液機構を組み合わせたものである。その送液機構は、培地収容部３３、培地供給管３５、培地排出管３７、廃液収容部３９、送液ポンプ４１及び制御部４３を備えている。
　培地供給管３５の一端は培地収容部３３に挿入されている。培地供給管３５の他端は肝組織培養用デバイス１の入口側流路２１に接続されている。培地排出管３７の一端は肝組織培養用デバイス１の出口側流路２３に接続されている。培地排出管３７の他端は廃液収容部３９に挿入されている。送液ポンプ４１は培地供給管３５に接続されている。制御部４３は送液ポンプ４１の動作を制御する。
　培地収容部３３に収容された培地は、送液ポンプ４１によって吸引され、培地供給管３５を通って肝組織培養用デバイス１に送られる。肝組織培養用デバイス１に供給された培地は、図１中の矢印で示されるように、入口側流路２１を通過して培養室１５の周面から培養室１５内に導入される。
　培養室１５への培地の導入に伴い、培養室１５内の培地の一部は、図１中の矢印で示されるように、培養室１５からフィルター保持層１１のフィルター部分及び出口側流路２３を介して外部へ排出される。肝組織培養用デバイス１の外部へ排出された培地は培地排出管３７を介して廃液収容部３９に排出される。
　肝組織培養用デバイス１は、培養室１５内の培地を出口側流路２３から排出する際にフィルター保持層１１のフィルター部分を通過させるので、剥離したゲル２５によって出口側流路２３が詰まってしまう確率を低減することができる。
　また、肝組織培養用デバイス１では、図２に示されるように、出口側流路２３の流路端部を構成する凹部１３ａは溝１３ｂの端部と比較して広い面積となっているので、局所的な強い液体の流れが発生しにくい。これにより、肝組織培養用デバイス１は、ゲル２５の剥離を抑制する効果も得られる。
　このように、肝組織培養用デバイス１は細胞の長期培養に有利である。
　図３に示された肝細胞培養用システム３１は、送液ポンプ４１を培地供給管３５に備え、培養室１５内に培地を連続送液する機能を備えているが、本発明の肝細胞培養用システムはこれに限定されない。
　例えば、図４に示されるように、本発明の実施例である肝細胞培養用システム４５は、培地排出管３７に送液ポンプ４１を備え、培養室１５内から培地を連続吸引する機能を備えているようにしてもよい。なお、本発明の肝細胞培養用システムは、図３又は図４に示された構成に限定されない。
　次に、肝組織培養用デバイス１を用いて内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系２７の培養を行う工程例を説明する。
　まず、培養室部分３及び蓋部分５をオートクレーブやアルコール等によって滅菌処理する。滅菌処理された培養室部分３と蓋部分５を貼り合わせる。冷却したＥＨＳ－ｇｅｌを培養室１５に流し込み、培養室１５の底面にＥＨＳ－ｇｅｌを行き渡らせる。ＥＨＳ－ｇｅｌを例えば３７℃でゲル化させてＥＨＳ－ｇｅｌからなるゲル２５を培養室１５内に固定する。
　ゲル２５の上に類洞内皮細胞を播種し、内皮細胞ネットワークを形成させる。ネットワーク構造を構築した内皮細胞の上に星細胞を播種し、この上から肝実質細胞も播種する。これにより、内皮細胞ネットワーク内に星細胞が組み込まれ、その周りに肝細胞が遊走し、実際の肝臓の構造に近い構造をもった共培養系２７が形成される。
　なお、内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を播種する順番は上記の順番に限定されない。例えば、内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を同時に播種してもよい。また、内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞、間葉系の細胞の順に播種してもよい。
　次に、肝組織培養用デバイス１を用いた細胞培養実験について説明する。
　図５は、本実施例に係る肝組織培養用デバイス１を用いてＥＨＳ－ｇｅｌ上にネットワーク形成された類胴内皮細胞及び肝実質細胞の状態を示す写真である。なお、図５では間葉系の細胞は共培養されていない。図６は、ネットワーク形成された内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系の構造を一部断面で示した模式的な斜視図及び模式的な断面図である。
　ＥＨＳ－ｇｅｌをコーティングした培養室１５内に類胴内皮細胞を播種して内皮細胞ネットワークを形成させ、その後、その内皮細胞上に肝実質細胞を播種して細胞培養を行った。図５の写真から明らかなように、内皮細胞４７のネットワークの中に肝実質細胞４９が遊走しており、生体内の肝組織に近い構造になっていることが判る。
　上記肝細胞を用いた肝機能評価試験の結果を図７に示す。本実施例の肝組織培養用デバイス１（図中の「デバイス」）と、比較例として一般的な細胞培養用シャーレ（図中の「シャーレ」を使用した。上記の類胴内皮細胞（図中の「ＧＨ７」）と肝実質細胞（図中の「肝細胞」）をそれぞれ単独又は両者の共培養系で培養して各培養細胞の尿素合成能を評価した。尿素合成能はアンモニアを分解して尿素を合成する肝機能である。肝組織培養用デバイスを用いた培養では、培地の供給を流速４０μＬ／ｈ（マイクロリットル／時）で２４時間連続送液して行った。シャーレを用いた培養では一定時間おきに培地交換を行った。
　図７から明らかなように、肝実質細胞単独で培養した場合に比べて共培養系の方が高い肝機能を示している。特に、本発明の肝組織培養用デバイスで培養した細胞の方がシャーレで培養したものに比べて高い肝機能を示している。これは、肝組織培養用デバイスを用いた培養では培地の連続供給を行ったために組織にシェアストレス（ずり応力）が掛かり、より生体内に近い環境での培養が行われたためと考えられる。
　また、本実施例に係る肝組織培養用デバイス１は、上述のように足場材の剥離による流路の詰まりを防止することができる。したがって、肝組織培養用デバイス１は生体内に近い環境での肝細胞の培養を長期間にわたって安定して行うことが可能である。このため、肝組織培養用デバイス１は薬物代謝試験等の様々な系における研究に利用可能であると共に、人工肝臓への展開も期待できる。
　しかしながら、類胴内皮細胞と肝実質細胞の共培養系は３日程度で構造が崩れてしまう問題があった。本願発明者らは類胴内皮細胞と肝実質細胞の共培養系に星細胞を添加することにより、ネットワーク構造が長期間維持されることを見いだした。
　図８は、本実施例に係る肝組織培養用デバイス１を用いて内皮細胞と肝実質細胞を共培養した結果と、これに星細胞を添加した際の結果を示す写真である。
　ゲル２５の作製、各細胞の播種、培地の供給については上記実施例での説明と同様にして行った。
　細胞播種の条件は次のとおりである。
　GH7：　　　 ５×１０5セル／φ３.５ｃｍ（10%FBS-DMEM（Invitrogen社の製品））
　Hepatocyte：５×１０5セル／φ３.５ｃｍ（10%FBS-DMEM（Invitrogen社の製品））
　HUVEC：　　 ４×１０5セル／φ３.５ｃｍ（EGM-2：内皮細胞培地キット－２（Lonza社の製品））
　TWNT-4：　　１×１０5セル／φ３.５ｃｍ（10%FBS-DMEM（Invitrogen社の製品））
　図８に示された結果から判るように、内皮細胞と肝実質細胞の共培養系５１に比べて、星細胞（ＴＷＮＴ－４）の添加によって、内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系２７は長期的なネットワーク構造の維持が実現できている。
　本発明の肝組織培養用デバイス又は本発明の肝組織培養用システムを用いれば、肝機能の検討を行うことができる。具体的には、例えば薬物動態試験など、生理活性物質を探索できる分析系が考えられる。
　なお、ここでは間葉系の細胞として星細胞（ＴＷＮＴ－４）が添加されているが、ＴＷＮＴ－４以外の星細胞が添加された場合であっても長期的なネットワーク構造の維持を実現できる。また、星細胞以外の間葉系の細胞が添加された場合であっても長期的なネットワーク構造の維持を実現できる。
　以上、本発明の実施例を説明したが、実施例における構成、配置、数値等は一例であり、本発明はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲内で種々の変更が可能である。
　例えば上記実施例では細胞の足場材となるゲルとしてＥＨＳ－ｇｅｌが用いられているが、本発明で用いられるゲルはこれに限定されない。本発明で用いられるゲルは、内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系が管状の構造、好ましくはネットワーク構造を形成するゲルであればよい。本発明で用いられるゲルは、ＥＨＳ－ｇｅｌに限らず、例えばラミニン、コラーゲン及びエンタクチンを少なくとも含んでいるゲルであってもよいし、ＥＨＳ－ｇｅｌに他の成分が混合されたゲルであってもよい。
１　肝組織培養用デバイス
３　培養室部分
５　蓋部分
１５　培養室
２１　入口側流路
２３　出口側流路
２５　ゲル
２７　内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系
３１，４５　肝組織培養用システム

Claims (15)

  1. 　少なくとも培地を導入及び排出するための少なくとも２本の流路が接続されている培養室を備え、
    　前記培養室の中に細胞の足場材となるゲルが収容されており、
    　前記ゲル上で内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を含む共培養系が管状の構造をもつように共培養されていることを特徴とする肝組織培養用デバイス。
  2. 　前記ゲルはラミニン、コラーゲン及びエンタクチンを少なくとも含んでいることを特徴とする請求項１に記載の肝細胞培養用デバイス。
  3. 　前記ゲルはＥＨＳ－ｇｅｌを少なくとも含んでいることを特徴とする請求項１又は２に記載の肝細胞培養用デバイス。
  4. 　前記間葉系の細胞は少なくとも星細胞系の細胞又は線維芽細胞を含んでいることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の肝細胞培養用デバイス。
  5. 　前記培養室の培養室部分と蓋部分が開閉可能であり、かつ前記２本の流路のうちの１つである出口側流路にフィルターが配置されていることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の肝細胞培養用デバイス。
  6. 　前記培養室の少なくとも一部にＰＤＭＳ又はシリコーン系ゴムが用いられていることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の肝細胞培養用デバイス。
  7. 　請求項１から６のいずれか一項に記載の肝細胞培養用デバイスにポンプを接続することにより、前記培養室内に前記培地を連続送液する機能を備えたことを特徴とする肝細胞培養用システム。
  8. 　請求項１から６のいずれか一項に記載の肝細胞培養用デバイスにポンプを接続することにより、前記培養室内から前記培地を連続吸引する機能を備えたことを特徴とする肝細胞培養用システム。
  9. 　細胞の足場材となるゲル上に少なくとも内皮細胞系の細胞、肝細胞系の細胞及び間葉系の細胞を播種して共培養することにより、前記内皮細胞系の細胞、前記肝細胞系の細胞及び前記間葉系の細胞を少なくとも含み、かつ管状の構造をもつ共培養系を培養することを特徴とする肝細胞の培養方法。
  10. 　前記ゲルはラミニン、コラーゲン及びエンタクチンを少なくとも含んでいることを特徴とする請求項９に記載の肝細胞の培養方法。
  11. 　前記ゲルはＥＨＳ－ｇｅｌを少なくとも含んでいることを特徴とする請求項９又は１０に記載の肝細胞の培養方法。
  12. 　前記間葉系の細胞は少なくとも星細胞系の細胞又は線維芽細胞を含んでいることを特徴とする請求項９から１１のいずれか一項に記載の肝細胞の培養方法。
  13. 　前記共培養系に培地を連続供給することを特徴とする請求項９から１２のいずれか一項に記載の肝細胞の培養方法。
  14. 　請求項１から６のいずれか一項の肝細胞培養用デバイス、又は請求項７もしくは８に記載の肝細胞培養用システムが用いられることを特徴とする請求項９から１３のいずれか一項に記載の肝細胞の培養方法。
  15. 　請求項９から１４のいずれか一項に記載の肝細胞の培養方法によって培養された前記共培養系を用いて肝機能を評価することを特徴とする肝機能の評価方法。
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