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WO2015067871A1 - Purification de protéines en utilisant un acide pectique - Google Patents

Purification de protéines en utilisant un acide pectique Download PDF

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Publication number
WO2015067871A1
WO2015067871A1 PCT/FR2014/052659 FR2014052659W WO2015067871A1 WO 2015067871 A1 WO2015067871 A1 WO 2015067871A1 FR 2014052659 W FR2014052659 W FR 2014052659W WO 2015067871 A1 WO2015067871 A1 WO 2015067871A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
complex
salts
aqueous medium
molecules
pectic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2014/052659
Other languages
English (en)
Inventor
François ROLIN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHANGEXPLORER PRODUCTION
Original Assignee
CHANGEXPLORER PRODUCTION
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHANGEXPLORER PRODUCTION filed Critical CHANGEXPLORER PRODUCTION
Publication of WO2015067871A1 publication Critical patent/WO2015067871A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C07K1/32—Extraction; Separation; Purification by precipitation as complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to a method for forming a complex, said complex being rendered insoluble in an aqueous medium at acidic pH, between at least one molecule and / or cell having one or more positive charge groups and at least one pectic acid and / or or its salts.
  • Such a method then allows several applications, including the extraction or purification of such molecules and / or cells, or the protection of molecules and / or cells in a given medium thanks to the formation of the complex, not soluble in this medium .
  • This method also allows the delivery of said molecules and / or cells in another medium where the complex is soluble, or else the coating of cells in biological processes.
  • EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
  • Methods using EDTA are also known for complexing minerals, but EDTA is not suitable for food or pharmaceutical applications because of its toxicity.
  • Methods are also known which use synthetic ion exchange resins or adsorbent resins, which must also not be present in the final product and therefore require a final desorption step. Moreover, they are used in columns, which implies low adsorption yields.
  • a process is also known which consists in adding sodium hydroxide to extract proteins from a plant, then centrifuging or filtering to remove the fibers and other insoluble parts, and finally acidifying to precipitate the proteins, and recover them.
  • JP09107886 discloses a method of forming a complex with pectic acid.
  • pectic acid is used at acidic pH.
  • the molecule of interest in this document a protein
  • the precipitation should preferably be done once the complex is formed, in order to have a maximum fixation of the molecule of interest on the pectic acid.
  • the molecule used is a weakly methylated pectin, allowing the partial precipitation of the protein
  • the present invention proposes to remedy at least some of the aforementioned drawbacks.
  • the invention provides a solution which makes it possible to extract or purify molecules and / or cells which have positively charged groups and are soluble in an aqueous medium at a determined pH, by a simple method.
  • the present invention consists in a process for forming a complex, said complex being insoluble in an aqueous medium at acidic pH, and said complex comprising, on the one hand, one or more molecules and / or cells, and, d on the other hand, one or more pectic acids and / or its salts, said method comprising contacting, in an aqueous medium, the one or more molecules and / or cells, and, on the other hand, the one or more pectic acids and / or its salts, characterized in that:
  • said aqueous medium is given a specific pH for which, on the one hand, said one or more molecules and / or cells, on the other hand, said pectic acid (s) and / or its salts are soluble; said determined pH being the pH of formation of the complex;
  • said one or more molecules and / or cells have one or more positively charged groups in an aqueous medium at the determined pH;
  • the pectic acid (s) and / or its salts are more than 95% demethylated.
  • pectic acid (s) and / or its salts are demethylated to at least 98%;
  • said aqueous medium is at a determined pH of formation of the complex greater than or equal to 6.5.
  • the molecule (s) and / or cell (s) comprise amino groups, and are chosen from the list consisting of:
  • the molecule or molecules are a mineral.
  • the present invention also relates to a process for obtaining a complex, said complex being insoluble in an aqueous medium at acidic pH, and said complex comprising, on the one hand, one or more molecules and / or cells, and, on the other hand, one or more pectic acids and / or its salts, characterized in that:
  • Such a complex is formed by carrying out the method of forming a complex according to any one of the preceding claims;
  • the coating, of the molecule (s) and / or cells, by the pectic acid (s) and / or its salts is ensured.
  • the present invention also relates to a complex, insoluble in an aqueous medium at acidic pH, said complex comprising, on the one hand, one or more molecules and / or cells, and, on the other hand, one or more pectic acids and / or its salts, said complex being in particular formed by the implementation of the method of forming a complex and / or obtained by the implementation of the process for obtaining a complex, characterized in that it comprises:
  • pectic acid and / or its more than 95% demethylated salts the latter being soluble in aqueous medium at the determined pH of formation of the complex
  • the present invention also relates to a medicinal product characterized in that it comprises at least one complex of the invention, and wherein the one or more molecules and / or cells constitute the active ingredient of said medicament.
  • the invention therefore relates to a process for forming a complex, rendered insoluble in an acid medium, between a pectic acid and / or its salts, and molecules and / or cells having one or more positively charged groups, comprising the step contacting an aqueous medium of said molecule and / or cells with a pectic acid and / or its salts.
  • This process is particular in that said pectic acid is more than 95% demethylated, or more preferably at least 98% demethylated.
  • the invention relates to a process for forming a complex, said complex being insoluble in an aqueous medium at acidic pH, and said complex comprising, on the one hand, one or more molecules and / or cells, and on the other hand, one or more pectic acids and / or its salts.
  • the said method of forming a complex comprising contacting, in an aqueous medium, the one or more molecules and / or cells and, on the other hand, the pectic acid (s) and / or its salts, is characterized in that :
  • said aqueous medium is given a specific pH for which, on the one hand, said one or more molecules and / or cells, on the other hand, said pectic acid (s) and / or its salts are soluble; said determined pH being the pH of formation of the complex;
  • the one or more molecules and / or cells have one or more positively charged groups, in an aqueous medium at the determined pH;
  • the pectic acid (s) and / or its salts are more than 95% demethylated.
  • the molecule (s) and / or cell (s) comprise amino groups, for example: serum proteins, in particular albumin, globulin and in particular enzymes; amino acids and derivatives; peptides; alkaloids; betaines; cyanogenic glycosides; nucleoproteins and chlorophyll nucleic acids; organic acids and derivatives; purines; hormones; monoclonal antibodies; flavines; bacteria and microorganisms.
  • the molecule or molecules are metals in ionic form plus, more generally named minerals such as magnesium, calcium, or iron.
  • the pectic acid (s) and / or its salts are demethylated to at least 98%.
  • said aqueous medium is at a determined pH, of formation of the complex, greater than or equal to 6.5.
  • a solution is thus obtained containing complexes which become insoluble when they are placed in an acidic medium, more particularly at a pH equal to or less than 6.5, by the sole use of a natural product such as pectic acid and / or one of its salts. And that allows to consider then many applications.
  • a pectic acid with 5% of methyl group such as a pectic acid which can be found commercially as a "commercially” demethylated pectic acid
  • a pectic acid with 5% of methyl group such as a pectic acid which can be found commercially as a "commercially” demethylated pectic acid
  • a "fully demethylated” pectic acid and / or its salts is soluble around pH 7 and higher, and insoluble at acidic pH, preferably below pH 6 or even more preferably below pH 5. This property allows it to form a complex in a neutral medium, that is to say at pH around 7, with a soluble molecule positively charged under the same conditions, and then to precipitate the complex by lowering the pH below ivv below 5 .
  • the invention also relates to a process for obtaining a complex, said complex being insoluble in an aqueous medium at acidic pH, and said complex comprising, on the one hand, one or more molecules, and on the other hand, one or more pectic acids and / or its salts, characterized in that:
  • pectic acid and / or its salts in a process for obtaining a complex as an emulsion stabilizer and thickener in the pharmaceutical and cosmetic industry is also possible.
  • This functionality of the pectic acid and / or its salts comes from the richness of the latter in carboxylic groups.
  • the invention also relates to the use of pectic acid and / or its salts in such a process for obtaining a complex for coating molecules, allowing them to be transported and delivered on target.
  • the process for obtaining a complex makes it possible to ensure the coating of the molecule (s) and / or cells with the pectic acid (s) and / or with its salts.
  • pectic acid and / or its salts in such a process to ensure the coating of cells, for example enzymes and / or microorganisms to immobilize them for use in columns, by example in biological processes.
  • the invention also relates to an insoluble complex in aqueous medium at acidic pH, said complex comprising, on the one hand, one or more molecules and / or cells, and, on the other hand, one or more pectic acids and / or its salts.
  • said complex being in particular formed by the implementation of the process of forming a complex and / or obtained by the implementation of the process for obtaining a complex mentioned above, characterized in that it comprises:
  • pectic acid and / or its more than 95% demethylated salts the latter being soluble in an aqueous medium at the determined pH of formation of the complex, and one or more molecules and / or cells having one or more positively charged moieties and being soluble in aqueous medium at the determined pH of complex formation.
  • the invention finally relates to a medicament containing an active ingredient associated in the form of a complex with at least one pectic acid and / or a salt thereof, said complex being obtained by a process according to the invention.
  • said medicament is characterized in that it comprises at least one complex of the invention, in which the one or more molecules and / or cells constitute the active principle of said medicament.
  • the advantage of the present invention is that it provides a method easy to implement allowing various applications not accessible in the state of the art, or even more expensive or more polluting in the prior art .
  • Figure 1 shows a flowchart of an exemplary method of forming a complex according to the invention.
  • the invention relates to a method of forming a complex.
  • Said complex being insoluble in an aqueous medium at acidic pH.
  • Said complex comprising, on the one hand, one or more molecules and / or cells, and, on the other hand, one or more pectic acids and or its salts.
  • the method comprises contacting, in an aqueous medium, the one or more molecules and / or cells, and, on the other hand, the pectic acid (s) and / or its salts, characterized in that:
  • the said aqueous medium is given a specific pH for which, on the one hand, said one or more molecules and / or cells, on the other hand, said pectic acid (s) and / or its salts are soluble; said determined pH being the pH of formation of the complex,
  • the one or more molecules and / or cells have one or more positively charged groups in an aqueous medium at the determined pH
  • pectic acid (s) and / or its salts are more than 95% demethylated.
  • Pectic acid and / or its salts is a natural product of the "pectin" type, which is extracted from plants such as, for example, beet or citrus fruits, or directly from pectin.
  • pectin refers to polysaccharides attached to carbohydrates.
  • Said “pectins” are polymers of heteropolysaccharides, that is to say a combination of several different polysaccharides.
  • these polysaccharides are homogalacturonans, rhamnogalacturonans, or arabinane.
  • these polysaccharides are acidic.
  • Said heteropolysaccharide polymers are composed of a main chain of uronic acid.
  • “Uronic acids” are chemical compounds obtained by oxidation of the last carbon of the so-called “acidic dares”. These acidic oses have as main characteristic an alcohol group called "- OH” which has been oxidized to an acidic group.
  • the pectin of the invention has a main chain having a high content of "galacturonic acid” or "Gai A” linked to each other by ⁇ -1,4 bonds.
  • Galacturonic acid is the product of the oxidation of carbon 6 of galactose.
  • the pectin of the invention therefore constitutes a "polygalacturonic acid".
  • Each of the monomers of the polygalaturonic acid chain may be partially acetylated or esterified with a "methyl group” or "CH 3 " at its "carboxyl group” or “COOH".
  • the methylation of pectin, more specifically pectic acid gives "methyl ester” or "COO-CH 3 " groups.
  • pectic acid is intended to mean the organic acid resulting from the transformation of pectin by one or more pectinolytic enzymes or "pectinase".
  • pectinases catalyze the hydrolysis of the methyl ester bonds, they transform the "COO-CH” group. 3 "in” COO "and are therefore responsible for the demethylation of pectic acid.
  • salts of pectic acid means an ionic pectic acid composed of cations and anions forming a neutral product and without net charge.
  • the net charge representing an overall charge of the compound that is electrically neutral.
  • the salts of the pectic acid can be sodium pectate, calcium or potassium, for example.
  • the pectic acid When the pectic acid is obtained following demethylation, it contains a maximum concentration of carboxylic acid functional groups "COO " , replacing the "COO-CH 3 " group, ie a maximum negative ionic charge. thus allows, by mixing, the formation of strong and stable complexes, by ionic bonds, with positively charged molecules (for example molecules containing NH 3 + protonated amino functions).
  • pectic acid and / or its salts, demethylated that is to say having a maximum negative ionic charge, has the particularity of modifying its solubility as a function of pH.
  • solubility is understood to mean the ability of a substance, called a solute, to dissolve in another substance, called a solvent, to form a homogeneous mixture called a solution.
  • a pectic acid with 5% or more of methyl groups that is to say having between 5% and 100% of methyl groups, is soluble at any pH, which does not allow implement the present invention.
  • a pectic acid at least 5% methylated is soluble at any pH.
  • a pectic acid containing less than 5%, for example 2% and below, of methyl groups attached to the carboxylic groups is insoluble in an acidic medium, in particular to a pH close to 5 or 6, and soluble for a pH greater than 7.
  • a pectic acid with less than 5% methyl, for example 2% and below is insoluble at a pH even higher as the degree of demethylation increases.
  • a 98% or more demethylated pectic acid begins to precipitate at a pH of 6 and is insoluble below. It is soluble at pH greater than 6.
  • a 97% demethylated pectic acid precipitates only at a pH lower than or equal to 4. It is soluble above 4.
  • a pectic acid demethylated to at least 95%, for example at least 98%, or completely demethylated, that is to say having carboxylic groups "COO " to replace the "COO-CH” group. 3 " is insoluble in acid medium, in particular is insoluble to a pH close to 5 or 6 and soluble for a pH greater than 7.
  • insoluble is used for a solute that is unable to dissolve in the solvent, i.e., the solute precipitates in the solvent.
  • soluble refers to a solute that is capable of dissolving in a solvent so that remains in solution in this solvent without precipitating.
  • the bringing into contact, that is to say the fixing of said molecules and / or cells, with the demethylated pectic acid is carried out in an aqueous medium at a determined pH.
  • the term "determined pH” is understood to mean a pH for which, on the one hand, said molecule (s) and / or cells, on the other hand, said pectic acid (s) and / or its salts are soluble; said determined pH being the pH of formation of the complex.
  • the fixing of said molecules with the demethylated pectic acid of the invention is carried out at a determined pH, preferably at a pH around 7.
  • a "pH around 7" is understood to mean a pH of between 5.5 and 8.
  • said binding is at a pH greater than or equal to 6.5, preferably less than or equal to 7.5.
  • Said fixation generates the formation of a complex in the medium.
  • said complex is constituted at a determined pH.
  • complex is understood to mean the association by ionic bond between the pectic acid and / or its salts, and the compound or compounds having one or more cationic groups or a positive net charge, at a given pH, preferably from above.
  • the complex is formed by bringing the two types into contact with each other. of entities, the contacting thus constitutes the action of mixing the two entities in the same aqueous medium.
  • said formed complex of the invention has the property of being soluble at a pH above the pH determined, more particularly at a pH greater than 7, more specifically at a pH greater than 6.5. This property allows it to be precipitated at a pH below the determined pH, preferably below 6 or 5, pH for which said complex is insoluble.
  • the complex of the invention is insoluble in an aqueous medium at "acidic pH", that is to say at a pH below the determined pH, advantageously at a pH of less than or equal to 6, or at 5.
  • said aqueous medium is at a determined pH, of formation of the complex, greater than or equal to 6.5.
  • said method of forming a complex consisting in bringing into contact, in an aqueous medium, on the one hand, the one or more molecules and / or cells, and on the other hand, the pectic acid (s). and / or its salts, is characterized in that
  • Said aqueous medium has a pH greater than or equal to 6.5, pH for which on the one hand the one or more molecules and / or cells, and on the other hand, the pectic acid (s) and / or its salts are soluble.
  • the molecule (s) and / or cell (s) are soluble and have one or more positively charged groups
  • Said pectic acid and / or its salts is more than 95% demethylated.
  • said method of forming a complex comprising contacting, in an aqueous medium, the one or more molecules and / or cells, and on the other hand, the pectic acid (s) and or its salts, in an aqueous medium characterized in that:
  • Said aqueous medium is at a pH greater than or equal to 6.5, pH for which, on the one hand, said one or more molecules and / or cells, and on the other hand, the pectic acid (s) and / or its salts are soluble.
  • the molecule (s) and / or cell (s) possess one or more positively charged groups
  • pectic acid and / or its salts has a demethylation of at least 98%.
  • Precipitation of the complex formed which is carried out at a pH below the determined pH, preferably below 6 or 5, makes it possible to extract it from the solution.
  • the molecules complexed with pectic acid and / or its salts will be able to be extracted, even if these molecules and / or cells are in themselves soluble in acid medium.
  • Said complex of the invention is therefore constituted at a determined pH, preferably around 7, in an aqueous medium and is soluble at a pH above the determined pH, preferably at a pH greater than or equal to 6.5.
  • a pectic acid demethylated more than 95% has therefore been especially used by the inventor.
  • the present application therefore uses a pectic acid demethylated more than 95% (it does not work at 95% !!!), 96%, 97%, 98% or 99%.
  • the effect of acid precipitation can not be observed with a pectic acid which could be described as "commercially demethylated” as commercially available as demethylated pectic acid.
  • demethylated pectic acid and / or its salts make it possible both to adsorb molecules of interest that are soluble at a given pH, preferably at a pH above 6.5 or around of 7 in an aqueous medium and positively charged, forming a stable complex.
  • Said demethylated pectic acid acts as a cationic resin, said resin being soluble in an aqueous medium at a determined pH, preferably greater than 6.5.
  • the adsorption takes place via the formation of ionic bonds between the positively charged groups and the "COO -" groups of the more than 95% demethylated pectic acid of the invention.
  • the present invention also relates to a process for obtaining a complex, said complex being insoluble in an aqueous medium at acidic pH, and said complex comprising, on the one hand, one or more molecules and / or cells, and, on the other hand, one or more pectic acids and / or its salts, characterized in that:
  • Such a complex is formed by carrying out the method of forming a complex according to any one of the preceding claims;
  • a solid liquid separation material for example a filter, centrifuge or wringer, etc., may be used to separate said precipitated complex (s) from the aqueous medium.
  • the insolubles, in particular the fibers are separated, for example by centrifugation or filtration, if necessary,
  • the pH determined is lowered, preferably below pH 6, so as to precipitate the complexes which are insoluble for a pH range below the determined pH, or, less than or equal to pH 6,
  • the precipitated complexes are separated, for example by centrifugation or filtration
  • the precipitate is washed, preferably at the precipitation pH.
  • a method for extracting a molecule using a process for obtaining a complex as above, and comprising the following step:
  • the process for obtaining a complex of the invention may be continued by an additional step of extracting one or more molecule (s) and / or cell (s) where it is desorbed the molecule and / or cell by modification of the ionic strength and pH, or by solubilization using a solvent after the step of extracting the complex formed.
  • desorption extraction may be with a phosphoric acid or sodium chloride solvent. This desorption step is performed according to a method known to those skilled in the art such as, for example, washing with an aqueous solution of sodium chloride.
  • the complex After recovery of the complex formed in part by the molecules of interest, the complex can be washed and desorbed (if necessary) molecules of interest of pectic acid in the separation material.
  • step c) of claim 3 separating the insoluble particles, in particular the fibers, by centrifugation or by filtration, before the extraction step of the aforementioned complex formed and / or - e) the molecule and / or cell is desorbed by modification of the ionic strength and pH, or, by solubilization using a solvent, after step c) of claim 3.
  • a traditional cationic resin can not precipitate and it must be used in column, which does not allow to use the adsorption capacity of the resin to 100%, and requires large volumes of products for its regeneration.
  • pectin is preferably used, which is treated with sodium hydroxide at pH 12 so as to break the ester bonds between the carboxyls (COO) and the methyl groups (CH 3 ) then by lowering the pH to 2.
  • pectic acid and / or its salts obtained by adding large amounts of sodium hydroxide (NaOH) or potassium hydroxide (KOH), are used, depending on the desired salt.
  • NaOH sodium hydroxide
  • KOH potassium hydroxide
  • the pectic acid then has its carboxyl groups in the form of salts-COONa or COOK.
  • Said molecule is bound to the pectic acid and / or its demethylated salts by more than 95% to form a complex at a pH at which the pectic acid and / or its salts and the molecule are soluble, for example at a pH greater than 6; , 5, complexation or fixation is by ionic bonds;
  • the above steps consist in simplifying, by a simple technique of adsorption, precipitation, washing, desorption, energy consuming, expensive and requiring large quantities of washings.
  • one of the advantages of the process for forming a complex and the process for obtaining a complex of the invention lies in the fact that the pectic acid and / or its salts are a natural product, presenting no contraindication to food consumption, therefore the desorption of the molecule of interest is not always necessary.
  • the state of the art for purification steps proposes, among other things, the use of synthetic chromatography resins, whose adsorption capacity for a molecule of interest is less than 5% and require large volumes of solvents. desorption.
  • the use of the acid pectic and / or its salts allows a adsorption capacity of the molecule greater than 50%, requiring few volumes of desorption solvents.
  • the precipitated complex can be washed, as in a crystallization, very early in the process.
  • the purity of the molecule of interest is increased because it is crystallized twice in the process: Once, as a complex, once in the final phase after desorption.
  • the invention also relates to an insoluble complex in aqueous medium at acidic pH, said complex comprising, on the one hand, one or more molecules and / or cells, and, on the other hand, one or more pectic acids and / or or its salts, said complex being in particular formed by the implementation of the process of forming a complex and / or obtained by the implementation of the process for obtaining a complex mentioned above, characterized in that it comprises:
  • the invention also relates to an insoluble complex in an aqueous medium at acidic pH, said complex comprising, on the one hand, one or more molecules and / or cells, and, on the other hand, one or more pectic acids and or its salts, said complex being in particular formed by the implementation of the process of forming a complex and / or obtained by the implementation of the process for obtaining a complex mentioned above, characterized in that it comprises :
  • the invention also relates to an insoluble complex in an aqueous medium at acidic pH, said complex comprising, on the one hand, one or more molecules and / or cells, and, on the other hand, one or more pectic acids and / or its salts, said complex being in particular formed by the implementation of the process of forming a complex and / or obtained by the implementation of the method of obtaining a complex mentioned above, characterized in that it comprises:
  • a pectic acid demethylated to more than 95% and soluble in an aqueous medium at a pH greater than or equal to 6.5
  • a further advantage of the present invention is to allow the realization of the process in "batch", in a tank, while with the resins it is necessary to use columns, less effective.
  • the process for obtaining a complex according to the invention also makes it possible to ensure the coating of the molecule (s) and / or cells by the pectic acid (s) and / or its salts.
  • This coating of the molecule (s) and / or cells makes it possible to convey them and to deliver them on target.
  • the invention also relates to the use of pectic acid and / or its salts to ensure the coating of cells, for immobilizing cells and / or microorganisms and / or enzymes for use in columns in biological processes or in treatment plant.
  • the invention finally relates to a medicament containing an active ingredient associated in the form of a pectic acid complex and / or a salt thereof, said complex being obtained by a process according to the invention.
  • said medicament is characterized in that it comprises at least one complex of the invention, in which the one or more molecules and / or cells constitute the active principle of said medicament.
  • Said complex does not dissolve in the acidic environment of the stomach, but will dissolve in the basic environment of the intestine.
  • Such a drug is able to pass the stomach without dissolving, the formed complex is not soluble in acidic medium. It can then dissolve in the intestines, where the pH is higher, and the active ingredient can thus make its effect.
  • ambient temperature means a temperature of between 20 and 25 ° C, preferably 21 ° C.
  • the pH of a solution of 1 L of water at pH 7.7 at room temperature is adjusted to a value of 3 by means of a phosphoric acid solution.
  • the pH of solution 2 is adjusted to a value of 3 with the aid of a phosphoric acid solution.
  • the pH of solution 3 is adjusted to a value of 3, using a phosphoric acid solution.
  • Betaglucan is fully soluble at pH 3 and between pH 3 and pH 7.5.
  • Solution 4 10 g of commercial pure albumin are completely solubilized in 1 L of water at pH 7.5 at room temperature.
  • the pH of solution 4 is adjusted to a value of 3, using a phosphoric acid solution.
  • Solution 5 100 g of a 1% solution of "fully demethylated" pectic acid salts of the invention is fully solubilized in 1 L of water at pH 7.5. A homogeneous solution is obtained.
  • the pH of the solution is adjusted to a value of 3, using a phosphoric acid solution.
  • Solution 6 100 g of a 1% solution of 98% demethylated pectic acid salts of the invention is completely solubilized in 1 L of water at pH 7.5. A homogeneous solution is obtained. Conclusion: The 98% demethylated pectic acid salt is soluble at pH 7.5.
  • the pH of the solution 6 is adjusted to a value of 3, using a phosphoric acid solution.
  • Solution 7 100 g of a 1% solution of pectic acid salts at 5% methylation in 1 L of water at pH 7.5 are introduced. A homogeneous solution is obtained.
  • the pH of solution 7 is adjusted to a value of 3, using a phosphoric acid solution.
  • Solution 8 100 g of a 1% solution of pectic acid salts at 10% methylation in 1 L of water at pH 7.5 are introduced. A homogeneous solution is obtained.
  • the pH of solution 8 is adjusted to a value of 5, using a phosphoric acid solution.
  • Control 9 Solution 9 Introduce 100 g of a 1% solution of 96% demethylated pectic acid salts of the invention in 1 L of water at pH 5. A homogeneous solution is obtained.
  • the pH of solution 9 is adjusted to a value of 3, using a phosphoric acid solution.
  • Solution 2 and solution 5 are mixed at pH 7.5.
  • the pH of the mixture is adjusted to a value of 3, using a phosphoric acid solution.
  • the precipitate is filtered by a technique known to those skilled in the art. Then the composition of the flocculate is analyzed by a technique known to those skilled in the art.
  • the flocculate consists of acacia gum arabic and pectic acid salts.
  • the flocculate is therefore a salt complex of pectic acid binding acacia gum arabic.
  • Solution 3 and solution 5 are mixed at pH 7.5.
  • the pH of the mixture is adjusted to a value of 3, using a phosphoric acid solution.
  • the precipitate is filtered by a technique known to those skilled in the art. Then the composition of the precipitate is analyzed by a technique known to those skilled in the art. Result of the analysis of the precipitate: the precipitate consists of beta-glucan and pectic acid salts. The precipitate is therefore a pectic acid salt complex binding betaglucane.
  • Solution 4 and solution 5 are mixed at pH 7.5.
  • the pH of the mixture is adjusted to a value of 3, using a phosphoric acid solution.
  • the precipitate is filtered by a technique known to those skilled in the art. Then the composition of the precipitate is analyzed by a technique known to those skilled in the art.
  • the precipitate consists of albumin and pectic acid salts.
  • the precipitate is therefore a pectic acid salt complex binding albumin.
  • the pH of solution 4 is adjusted to a value of 5 with the aid of a phosphoric acid solution.
  • the pH of the solution is adjusted to a value of 5, using a phosphoric acid solution.
  • Solution 4 and solution 5 are mixed to pH 5.
  • the pH of the mixture is adjusted to a value of 3, using a phosphoric acid solution.
  • the precipitate is filtered by a technique known to those skilled in the art.
  • the composition of the precipitate and the supernatant are then analyzed by techniques known to those skilled in the art.
  • the precipitate consists of pectic acid salts.
  • the supernatant contains proteins, it is composed of albumin.
  • albumin / pectic acid salt complex could not be formed since one of the components, demethylated pectic acid, is insoluble at pH 5 in an aqueous medium. .
  • the pH of solution 4 is adjusted to a value of 5 with the aid of a phosphoric acid solution.
  • the pH of solution 7 is adjusted to a value of 5, using a phosphoric acid solution.
  • Solution 4 and solution 5 are mixed to pH 5.
  • the pH of the mixture is adjusted to a value of 3, using a phosphoric acid solution.
  • the pH of solution 4 is adjusted to a value of 5 with the aid of a phosphoric acid solution.
  • Solution 4 is mixed with solution 8 at pH 5.
  • the pH of the mixture is adjusted to a value of 3, using a phosphoric acid solution.
  • the pH of solution 2 is adjusted to a value of 5 with the aid of a phosphoric acid solution.
  • the pH of the solution 9 is adjusted to a value of 5, using a phosphoric acid solution.
  • the pH of the mixture is adjusted to a value of 3, using a phosphoric acid solution.
  • the precipitate is filtered by a technique known to those skilled in the art. Then the composition of the precipitate is analyzed by a technique known to those skilled in the art.
  • the precipitate is composed of acacia gum arabic and pectic acid salts.
  • the precipitate is therefore a salt complex of pectic acid binding acacia gum arabic.
  • the 96% demethylated pectic acid salts and the implementation of the process of the invention allowed the precipitation of acacia gum arabic at a pH of 3.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de formation d'un complexe insoluble en milieu aqueux à p H acide, et ledit complexe comportant, d'une part une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et, d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels, ledit procédé consistant à mettre en contact, en milieu aqueux, d'une part la ou les molécules et/ou cellules, et, d'autre part, le ou les acides pectiques et/ou ses sels, caractérisé en ce que: on confère audit milieu aqueux un p H déterminé pour lequel, d'une part, la ou lesdites molécules et/ou cellules, d'autre part, le ou lesdits acides pectiques et/ou ses sels sont solubles; ledit p H déterminé étant le p H de formation du complexe; la ou lesdites molécules et/ou cellules possèdent un ou plusieurs groupements chargés positivement en milieu aqueux au p H déterminé; le ou les acides pectiques et/ou ses sels sont déméthylés à plus de 95%.

Description

PURIFICATION DE PROTÉINES EN UTILISANT UN ACIDE PECTIQUE
L'invention concerne un procédé de formation d'un complexe, ledit complexe étant rendu insoluble en milieu aqueux à pH acide, entre au moins une molécule et/ou cellule possédant un ou plusieurs groupements à charges positives et au moins un acide pectique et/ou ses sels.
Le complexe cité ci-dessus se définit comme l'association, par le biais de force ionique, de l'acide pectique et/ou ses sels, et, des molécules possédant des groupements chargés positivement. L'acide pectique ou acide polygalacturonique est un acide organique polymère non hydrosoluble de l'acide galacturonique. C'est le produit de la dégradation de la pectine par une pectinase. L'acide pectique est un polymère végétal riche en fonctions carboxyliques (COOH) libres. Il fonctionne comme une résine cationique.
Un tel procédé permet alors plusieurs applications, dont l'extraction ou la purification de telles molécules et/ou cellules, ou encore la protection de molécules et/ou cellules dans un milieu donné grâce à la formation du complexe, non soluble dans ce milieu donné. Ce procédé permet également la livraison desdites molécules et/ou cellules dans un autre milieu où le complexe est soluble, ou encore, l'enrobage de cellules dans des procédés biologiques.
Le document WO201 1 /146394 divulgue l'utilisation de produits chimiques floculants pour obtenir la précipitation d'une molécule, en particulier d'une protéine. Ces produits chimiques, par exemple des phosphates, présentent cependant des risques de toxicité dans certaines applications et doivent être éliminés du produit final.
On connaît également des procédés utilisant l'EDTA (Acide Ethylène Diamine Tétra- acétique) pour complexer les minéraux, mais l'EDTA n'est pas utilisable pour des applications alimentaires ou pharmaceutiques, du fait de sa toxicité. On connaît également des procédés utilisant des résines synthétiques échangeuses d'ions ou des résines adsorbantes, qui doivent également ne pas être présentes dans le produit final et nécessitent donc une étape finale de désorption. Par ailleurs, elles sont utilisées en colonnes, ce qui implique de bas rendements d'adsorption. On connaît également un procédé qui consiste à ajouter de la soude pour extraire des protéines d'un végétal, puis à centrifuger ou filtrer pour enlever les fibres et autres parties insolubles, et enfin à acidifier pour précipiter les protéines, et les récupérer.
Néanmoins par un tel procédé connu, on n'arrive pas à récupérer l'ensemble des protéines solubles par simple précipitation. Des étapes supplémentaires de purification par ultrafiltration, par exemple, très coûteuses, sont nécessaires. On connaît également des procédés utilisant des acides tels que l'acide caprylique ou citrique, pour précipiter des molécules, dont des protéines, mais le rendement d'extraction n'est pas maximum.
Ainsi, le document JP09107886 divulgue un procédé de formation d'un complexe avec de l'acide pectique. Toutefois l'acide pectique y est utilisé à pH acide. En outre, à pH acide, la molécule d'intérêt (dans ce document une protéine) est insoluble donc la formation du complexe, en tant que tel, ne peut pas se faire, ou, ne se fait que très partiellement. En effet, un complexe ne peut bien se réaliser que si les deux molécules le formant sont sous forme solubles. La précipitation ne doit de préférence se faire qu'une fois le complexe formé, afin d'avoir une fixation maximum de la molécule d'intérêt sur l'acide pectique. Dans ce brevet, la molécule utilisée est une pectine faiblement méthylée, permettant la précipitation partielle de la protéine
La présente invention se propose de remédier à au moins une partie des inconvénients précités. L'invention propose une solution qui permet d'extraire ou de purifier des molécules et/ou cellules qui présentent des groupements à charge positive et sont solubles en milieu aqueux à un pH déterminé, par un procédé simple.
A cet effet, la présente invention consiste en un procédé de formation d'un complexe, ledit complexe étant insoluble en milieu aqueux à pH acide, et ledit complexe comportant, d'une part une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et, d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels, ledit procédé consistant à mettre en contact, en milieu aqueux, d'une part la ou les molécules et/ou cellules, et, d'autre part, le ou les acides pectiques et/ou ses sels, caractérisé en ce que :
on confère audit milieu aqueux un pH déterminé pour lequel, d'une part, la ou lesdites molécules et/ou cellules, d'autre part, le ou lesdits acides pectiques et/ou ses sels sont solubles; ledit pH déterminé étant le pH de formation du complexe ;
la ou lesdites molécules et/ou cellules possèdent un ou plusieurs groupements chargés positivement en milieu aqueux au pH déterminé ;
le ou les acides pectiques et/ou ses sels sont déméthylés à plus de 95%. De plus, selon d'autres caractéristiques du procédé de formation d'un complexe:
- le ou les acides pectiques et/ou ses sels sont déméthylés à au moins 98% ;
- ledit milieu aqueux est à un pH déterminé de formation du complexe supérieur ou égal à 6,5.
- la ou les molécules et/ou cellules comprennent des groupements aminés, et sont choisies dans la liste constituée de :
protéines sériques, en particulier albumine, globuline et enzymes ; acides aminés et dérivés ; peptides ; alcaloïdes ; bétaïne ; nucléo-protéines et nucléotides ; acides organiques et dérivés ; purines ; hormones ; anticorps monoclonaux ; flavines ; bactéries et micro-organismes.
■ la ou les molécules sont un minéral.
La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'un complexe, ledit complexe étant insoluble en milieu aqueux à pH acide, et, ledit complexe comportant, d'une part, une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et, d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels, caractérisé en ce que :
1 ) On forme un tel complexe en mettant en œuvre le procédé de formation d'un complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes ;
2) On extrait le complexe formé.
De plus, selon d'autres caractéristiques du procédé d'obtention d'un complexe :
- lorsqu'on extrait le complexe formé:
a) on abaisse le pH déterminé, de manière à précipiter le ou lesdits complexes formés dans ledit milieu aqueux;
b) on sépare le ou lesdits complexes précipités du milieu aqueux,
c) on lave le précipité, au pH de précipitation.
- l'on assure l'enrobage, de la ou des molécules et/ou cellules, par le ou les acides pectiques et/ou par ses sels.
La présente invention concerne également un complexe, insoluble en milieu aqueux à pH acide, ledit complexe comportant, d'une part, une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et, d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels, ledit complexe étant notamment formé par la mise en œuvre du procédé de formation d'un complexe et/ou obtenu par la mise en œuvre du procédé d'obtention d'un complexe, caractérisé en ce qu'il comprend :
au moins un acide pectique et/ou ses sels déméthylé à plus de 95%, ce dernier étant soluble en milieu aqueux au pH déterminé de formation du complexe,
- et une ou plusieurs molécules et/ou cellules possédant un ou plusieurs groupements chargés positivement et étant soluble en milieu aqueux au pH déterminé de formation du complexe .
La présente invention concerne également un médicament caractérisé en ce qu'il comporte au moins un complexe de l'invention, et dans lequel la ou les molécules et/ou cellules constituent le principe actif dudit médicament.
L'invention concerne donc un procédé de formation d'un complexe, rendu insoluble en milieu acide, entre un acide pectique et/ou ses sels, et, des molécules et/ou cellules possédant un ou plusieurs groupements chargés positivement, comportant l'étape de mise en contact en milieu aqueux desdites molécule et/ou cellules avec un acide pectique et/ou ses sels. Ce procédé est particulier en ce que ledit acide pectique est déméthylé à plus de 95 %, ou encore de préférence à au moins 98 %.
En d'autres termes, l'invention concerne un procédé de formation d'un complexe, ledit complexe étant insoluble en milieu aqueux à pH acide, et ledit complexe comportant, d'une part une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et, d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels. Ledit procédé de formation d'un complexe consistant à mettre en contact, en milieu aqueux, d'une part la ou lesdites molécules et/ou cellules, et d'autre part, le ou les acides pectiques et/ou ses sels, est caractérisé en ce que :
- on confère audit milieu aqueux un pH déterminé pour lequel, d'une part, la ou lesdites molécules et/ou cellules, d'autre part, le ou lesdits acides pectiques et/ou ses sels sont solubles; ledit pH déterminé étant le pH de formation du complexe ;
- la ou lesdites molécules et/ou cellules possèdent un ou plusieurs groupements chargés positivement ;en milieu aqueux au pH déterminé ;
- le ou les acides pectiques et/ou ses sels sont déméthylés à plus de 95%. Selon l'invention, la ou les molécules et/ou cellules comprennent des groupements aminés comme par exemple : protéines sériques, en particulier albumine, globuline et en particulier enzymes ; acides aminés et dérivés ; peptides ; alcaloïdes ; bétaïnes ; glycosides cyanogéniques ; nucléo- protéines et acides nucléiques chlorophylles ; acides organiques et dérivés ; purines ; hormones ; anticorps monoclonaux ; flavines ; bactéries et micro-organismes.
Selon l'invention, la ou les molécules sont des métaux sous forme ionique plus, plus généralement nommés minéraux tel que le magnésium, le calcium, ou encore le fer.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le ou les acides pectiques et/ou ses sels sont déméthylés à au moins 98%.
Selon un autre mode de réalisation particulier, ledit milieu aqueux est à un pH déterminé, de formation du complexe, supérieur ou égal à 6,5.
On obtient ainsi une solution contenant des complexes qui deviennent insolubles lorsqu'on les met en milieu acide, plus particulièrement à un pH égal ou inférieur à 6,5, par la seule utilisation d'un produit naturel tel que l'acide pectique et/ou un de ses sels. Et cela permet d'envisager ensuite de nombreuses applications.
On observe en effet de manière très surprenante qu'un acide pectique avec 5% de groupement méthyle, tel qu'un acide pectique qu'on peut trouver dans le commerce en tant qu'acide pectique « commercialement » déméthylé, est soluble à tout pH. Contrairement à ceci, un acide pectique « entièrement déméthylé » et/ou ses sels est soluble autour de pH 7 et plus, et insoluble à pH acide, de préférence en dessous de pH 6 ou encore plus préférentiellement en dessous de pH 5. Cette propriété lui permet de former un complexe en milieu neutre, c'est-à-dire à pH autour de 7, avec une molécule soluble chargée positivement dans les mêmes conditions, puis de précipiter le complexe en baissant le pH en dessous de 6voireen dessous de 5.
L'invention concerne également un procédé d'obtention d'un complexe, ledit complexe étant insoluble en milieu aqueux à pH acide, et ledit complexe comportant, d'une part, une ou plusieurs molécules, et d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels caractérisé en ce que :
1 ) On forme un tel complexe en mettant en œuvre le procédé de formation d'un complexe;
2) On extrait le complexe formé.
Selon un mode préféré d'obtention d'un complexe, lorsqu'on extrait le complexe formé : a) on abaisse le pH déterminé, de préférence on abaisse le pH en dessous de 6, de manière à précipiter ledit ou lesdits complexe(s) formés dans ledit milieu aqueux;
b) on sépare ledit ou lesdits complexe(s) précipités du milieu aqueux, par exemple par centrifugation ou filtration ;
c) on lave le précipité, au pH de précipitation.
Grâce à ces dispositions, on obtient un procédé simple à mettre en œuvre, permettant de fixer des molécules et/ou cellules solubles chargées positivement avec un polymère végétal pour former un complexe soluble en milieu aqueux au pH déterminé, de préférence soluble en milieu neutre, autour d'un pH = 7. Par la suite, on peut insolubiliser ledit complexe en acidifiant le pH du milieu, pour faciliter des étapes ultérieures de purification, un lavage par exemple.
L'utilisation de l'acide pectique et/ou ses sels dans un procédé d'obtention d'un complexe comme stabilisant d'émulsions et agent épaississant dans l'industrie pharmaceutique et cosmétique est également possible. Cette fonctionnalité de l'acide pectique et/ou ses sels vient de la richesse de ce dernier en groupements carboxyliques.
L'invention concerne encore l'utilisation de l'acide pectique et/ou ses sels dans un tel procédé d'obtention d'un complexe pour assurer l'enrobage de molécules, permettant de les véhiculer et de les délivrer sur cible. En d'autres termes, le procédé d'obtention d'un complexe permet d'assurer l'enrobage de la ou des molécules et/ou cellules par le ou les acides pectiques et/ou par ses sels. Elle concerne par ailleurs l'utilisation de l'acide pectique et/ou ses sels dans un tel procédé pour assurer l'enrobage de cellules, par exemple des enzymes et/ou micro-organismes permettant de les immobiliser pour les utiliser en colonnes, par exemple dans des procédés biologiques.
L'invention concerne également un complexe insoluble en milieu aqueux à pH acide, ledit complexe comportant, d'une part, une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et, d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels, ledit complexe étant notamment formé par la mise en œuvre du procédé de formation d'un complexe et/ou obtenu par la mise en œuvre du procédé d'obtention d'un complexe susmentionné, caractérisé en ce qu'il comprend :
- au moins un acide pectique et/ou ses sels déméthylé à plus de 95%, ce dernier étant soluble en milieu aqueux au pH déterminé de formation du complexe, et une ou plusieurs molécules et/ou cellules possédant un ou plusieurs groupements chargés positivement et étant soluble en milieu aqueux au pH déterminé de formation du complexe .
L'invention concerne enfin un médicament contenant un principe actif associé sous forme de complexe à au moins un acide pectique et/ou un de ses sels, ledit complexe étant obtenu par un procédé selon l'invention. En d'autres termes, ledit médicament est caractérisé en ce qu'il comporte au moins un complexe de l'invention, dans lequel la ou les molécules et/ou cellules constituent le principe actif dudit médicament.
L'avantage découlant de la présente invention consiste en ce qu'elle propose un procédé facile à mettre en œuvre permettant des applications variées non accessibles dans l'état de la technique, ou encore plus onéreuses ou plus polluantes dans l'état de la technique.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre se rapportant à un exemple de réalisation donné à titre indicatif et non limitatif.
La compréhension de cette description sera facilitée en se référant aux dessins joints, dans lesquels : la figure 1 représente un organigramme d'un exemple de procédé de formation d'un complexe selon l'invention.
L'invention concerne un procédé de formation d'un complexe. Ledit complexe étant insoluble en milieu aqueux à pH acide. Ledit complexe comportant, d'une part une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et d'autre part, un ou plusieurs acides pectique et ou ses sels. Ledit procédé consiste à mettre en contact, en milieu aqueux, d'une part la ou les molécules et/ou cellules, et, d'autre part, le ou les acides pectiques et/ou ses sels, caractérisé en ce que :
- On confère audit milieu aqueux un pH déterminé pour lequel, d'une part, la ou lesdites molécules et/ou cellules, d'autre part, le ou lesdits acides pectiques et/ou ses sels sont solubles; ledit pH déterminé étant le pH de formation du complexe,
la ou lesdites molécules et/ou cellules possèdent un ou plusieurs groupements chargés positivement en milieu aqueux au pH déterminé,
- le ou les acides pectiques et/ou ses sels sont déméthylés à plus de 95%. L'acide pectique et/ou ses sels est un produit naturel de type « pectine », que l'on extrait de végétaux tel que, par exemple, la betterave ou les agrumes, ou directement à partir de pectine.
On entend par le terme « pectine » ou « substances pectiques » des polyosides, rattachées aux glucides. Lesdites « pectines » sont des polymères d'hétéropolysaccharides, c'est-à-dire une association de plusieurs polysaccharides différents. Par exemple ces polysaccharides sont des homogalacturonanes, rhamnogalacturonanes, ou arabinane. Généralement ces polysaccharides sont acides. Lesdits polymères d'hétéropolysaccharides sont composés d'une chaîne principale d'acide uronique.
Les « acides uroniques » sont des composés chimiques obtenus par oxydation du dernier carbone des oses dit « ose acide ». Ces oses acides présentent comme caractéristique principale un groupement alcool dit « - OH » qui a été oxydé en un groupement acide.
Plus particulièrement, la pectine de l'invention possède une chaîne principale présentant une forte teneur en « acide galacturonique » ou « Gai A » liés entre eux par des liaisons a 1 ,4. L'acide galacturonique étant le produit de l'oxydation du carbone 6 du galactose.
La pectine de l'invention constitue donc un « acide polygalacturonique ». Chacun des monomères de la chaîne d'acide polygalaturonique peut être partiellement acétylé ou estérifié par un« groupement méthyle » ou « CH3» au niveau de son« groupement carboxyle » ou « COOH ». En outre, la méthylation de la pectine, plus précisément de l'acide pectique, donne des groupements « ester méthylique » ou « COO- CH3».
On entend par le terme « acide pectique » l'acide organique issu de la transformation de la pectine par une ou plusieurs enzymes pectinolytiques ou « pectinase ».Les pectinases catalysent l'hydrolyse des liaisons esters méthyliques, elles transforment le groupement « COO-CH3 » en « COO » et sont donc responsables de la déméthylation de l'acide pectique.
On entend par le terme de « sels » de l'acide pectique, un acide pectique ionique composé de cations et d'anions formant un produit neutre et sans charge nette.
La charge nette représentant une charge globale du composé qui est électriquement neutre.
Les sels de l'acide pectique peuvent être le pectate de sodium, de calcium ou de potassium par exemple. Lorsque l'acide pectique est obtenu suite à une déméthylation, il contient une concentration maximum de fonctions acides de type carboxylique « COO " » en remplacement du groupement « COO-CH3», c'est à dire une charge ionique négative maximale. Il permet ainsi, par mélange, la formation de complexes forts et stables, par liaisons ioniques, avec des molécules chargées positivement (par exemple des molécules contenant des fonctions aminés protonées NH3 +).
Parallèlement, l'acide pectique et/ou ses sels, déméthylé, c'est-à-dire présentant une charge ionique négative maximale, présente la particularité de modifier sa solubilité en fonction du pH.
En conséquence, la solubilité du complexe, formé par l'acide pectique et/ou ses sels et la molécule chargée positivement ou « cation »,va également varier en fonction du pH. On entend par le terme « solubilité» la capacité d'une substance, appelée soluté, à se dissoudre dans une autre substance, appelée solvant, pour former un mélange homogène appelé solution.
L'inventeur a en effet observé qu'un acide pectique à 5% et plus de groupements méthyle, c'est-à-dire présentant entre 5% et 100 % de groupements méthyle, est soluble à tout pH, ce qui ne permet pas de mettre en œuvre la présente invention. En d'autres termes, un acide pectique méthylé à au moins 5% est soluble à tout pH.
Or un acide pectique à 5% de méthyle, c'est-à-dire un acide pectique déméthylé à 95%, est ce qui est disponible dans le commerce en tant qu' « acide pectique déméthylé »
En revanche un acide pectique à moins de 5%, par exemple 2% et au-dessous, de groupements méthyle fixés sur les groupements carboxyliques est insoluble en milieu acide, en particulier jusqu'à un pH proche de 5 ou 6, et soluble pour un pH supérieur à 7.
Plus spécifiquement, un acide pectique à moins de 5% de méthyle, par exemple 2% et au-dessous, est insoluble à un pH d'autant plus haut que le degré de déméthylation augmente.
Par exemple, un acide pectique déméthylé à 98% et plus commence à précipiter à un pH de 6 et est insoluble en dessous. Il est soluble à pH supérieure à 6. Au contraire, un acide pectique déméthylé à 97% ne précipite qu'à un pH inférieur ou égale à 4. Il est soluble au- delà de 4.
En conséquence, il existe une corrélation entre le degré de déméthylation et le pH d'insolubilisation. En d'autre termes, un acide pectique déméthylé à au moins 95%, par exemple au moins 98%, ou complètement déméthylé, c'est-à-dire présentant des groupements carboxylique « COO " » en remplacement du groupement « COO-CH3 », est insoluble en milieu acide, en particulier est insoluble jusqu'à un pH proche de 5 ou 6 et soluble pour un pH supérieur à 7.
On entend par le terme « complètement déméthylé » un acide pectique déméthylé à un pourcentage le plus proche possible de 100%. En effet, les techniques actuelles ne permettent pas de détecter et de vérifier si un acide pectique est déméthylé à 100%, cette donnée étant limité au seuil minimal de détection des méthyles.
Le terme « insoluble » est utilisé pour un soluté qui est incapable de se dissoudre dans le solvant, c'est-à-dire que le soluté précipite dans le solvant.
Par opposition, le terme « soluble » désigne un soluté qui est capable de se dissoudre dans un solvant donc qui reste en solution dans ce solvant sans précipiter.
L'acide pectique déméthylé à plus de 95%, de préférence au moins 98% permet donc de fixer des molécules et/ou cellules solubles présentant une charge nette positive ou plusieurs groupements cationiques à un pH déterminé, avantageusement autour de 7.
Selon le procédé de l'invention, la mise en contact c'est-à-dire la fixation desdites molécules et/ou cellules, avec, l'acide pectique déméthylé est réalisé dans un milieu aqueux à un pH déterminé. On entend par le terme « pH déterminé » un pH pour lequel d'une part, la ou lesdites molécules et/ou cellules, d'autre part, le ou lesdits acides pectiques et/ou ses sels sont solubles; ledit pH déterminé étant le pH de formation du complexe.
Avantageusement, la fixation desdites molécules avec l'acide pectique déméthylé de l'invention est réalisée à un pH déterminé, de préférence à un pH autour de 7. On entend par un « pH autour de 7 », un pH compris entre 5,5 et 8. De manière spécifique, ladite fixation se fait à un pH supérieur ou égale à 6,5, préférentiellement inférieur ou égale à 7,5. Ladite fixation engendre la formation d'un complexe dans le milieu. En conséquence, ledit complexe est constitué à pH déterminé.
On entend par le terme « complexe » l'association par liaison ionique entre l'acide pectiques et/ou ses sels, et, le ou les composés présentant un ou plusieurs groupements cationiques ou une charge nette positive, à un pH déterminé, de préférenceautour de 7. En d'autres termes, le complexe est formé par la mise en contact des deux types d'entités, la mise en contact constitue donc l'action de mélanger les deux entités dans le même milieu aqueux.
En outre, ledit complexe formé de l'invention a la propriété d'être soluble à un pH supérieur au pH déterminé, plus particulièrement à un pH supérieur à 7, plus spécifiquement à un pH supérieur à 6,5. Cette propriété permet de le faire précipiter à pH inférieur au pH déterminé, de préférence inférieur à 6 ou 5 , pH pour lequel ledit complexe est insoluble. Le complexe de l'invention est insoluble en milieu aqueux à « pH acide » c'est-à-dire à un pH inférieur au pH déterminé, avantageusement à un pH inférieur ou égale à 6, ou à 5.
Selon un autre mode de réalisation particulier, ledit milieu aqueux est à un pH déterminé, de formation du complexe, supérieur ou égal à 6,5.
Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé de formation d'un complexe consistant à mettre en contact, en milieu aqueux, d'une part, la ou lesdites molécules et/ou cellules, et d'autre part, le ou les acides pectiques et/ou ses sels, est caractérisé en ce que
Ledit milieu aqueux a un pH supérieur ou égale à 6,5, pH pour lequel d'une part la ou lesdites molécules et/ou cellules, et d'autre part, le ou les acides pectiques et/ou ses sels sont solubles
La ou lesdites molécule(s) et/ou cellule(s) sont solubles et possèdent un ou plusieurs groupements chargés positivement,
Ledit acide pectique et/ou ses sels est déméthylé à plus de 95%.
Selon un autre mode de réalisation, ledit procédé de formation d'un complexe consistant à mettre en contact, en milieu aqueux, d'une part la ou lesdites molécules et/ou cellules, et d'autre part, le ou les acides pectiques et/ou ses sels, en milieu aqueux caractérisé en ce que :
- Ledit milieu aqueux est à un pH supérieur ou égal à 6,5, pH pour lequel d'une part la ou lesdites molécules et/ou cellules, et d'autre part, le ou les acides pectiques et/ou ses sels sont solubles
- La ou lesdites molécule(s) et/ou cellule(s) possèdent un ou plusieurs groupements chargés positivement,
- Ledit acide pectique et/ou ses sels présente une déméthylation à au moins 98%. La précipitation du complexe formé, qui s'effectue à un pH inférieur au pH déterminé, de préférence inférieur à 6 ou 5, permet par la suite de pouvoir l'extraire de la solution. Les molécules complexées avec l'acide pectiques et/ou ses sels vont pouvoir être extraites, même si ces molécules et/ou cellules sont en elles-mêmes solubles en milieu acide.
Ledit complexe de l'invention est donc constitué à un pH déterminé, de préférence autour de 7, en milieu aqueux et il est soluble à un pH supérieur au pH déterminé, de préférence à un pH supérieur ou égale à 6,5.
Un acide pectique déméthylé à plus de 95% a donc été spécialement utilisé par l'inventeur. La présente demande utilise donc un acide pectique déméthylé à plus de 95% (ça ne marche pas à 95% !!!), 96%,97%,98% ou à 99%. L'effet consistant en la précipitation en milieu acide ne pouvant pas être observé avec un acide pectique qu'on pourrait qualifier de « commercialement déméthylé » tel qu'on peut l'obtenir dans le commerce en tant qu'acide pectique déméthylé.
Ainsi l'utilisation d'acide pectique déméthylé à plus de 95% et/ou ses sels permet à la fois d'adsorber des molécules d'intérêts, solubles à un pH déterminé, de préférence à un pH supérieur à 6,5 ou autour de 7 en milieu aqueux et chargées positivement, en formant un complexe stable. Ledit acide pectique déméthylé agit, comme une résine cationique, ladite résine étant soluble en milieu aqueux à un pH déterminé, de préférence supérieur à 6,5. L'adsorption se fait par l'intermédiaire de la formation de liaisons ioniques entre les groupements chargés positivement et les groupements « COO -» de l'acide pectique déméthylé à plus de 95% de l'invention.
Ainsi, en faisant varier le pH du milieu, on peut précipiter les molécules d'intérêts chargées positivement en précipitant le complexe.
De ce fait, la présente invention concerne également un procédé d'obtention d'un complexe, ledit complexe étant insoluble en milieu aqueux à pH acide, et, ledit complexe comportant, d'une part, une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et, d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels, caractérisé en ce que :
On forme un tel complexe en mettant en œuvre le procédé de formation d'un complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes ;
- On extrait le complexe formé.
Par la suite, il est possible de récupérer le complexe sous forme solide. En récupérant le complexe, on récupère les molécules d'intérêts. La récupération du complexe peut être réalisée par tous moyens ou techniques de séparation connus par l'homme du métier. Par exemple, on peut utiliser un matériel de séparation solide liquide, par exemple un filtre, une centrifugeuse ou une essoreuse, etc .. pour séparer le ou lesdits complexe précipité du milieu aqueux.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé d'obtention du complexe, lorsqu'on extrait le complexe formé :
a) on abaisse le pH déterminé, de manière à précipiter le ou lesdits complexes formés dans ledit milieu aqueux;
b) on sépare le ou lesdits complexes précipités du milieu aqueux,
c) on lave le précipité, au pH de précipitation.
Selon un mode spécifique d'obtention d'un complexe, lorsqu'on extrait le complexe,
- on sépare les insolubles, en particulier les fibres, par exemple par centrifugation ou filtration, si nécessaire,
- on abaisse le pH déterminé, de préférence en dessous de pH 6, de sorte à précipiter les complexes qui sont insolubles pour une gamme de pH inférieur au pH déterminé, ou, inférieur ou égale à pH 6,
- on sépare les complexes précipités, par exemple par centrifugation ou filtration
- on lave le précipité, de préférence au pH de précipitation.
Selon un mode alternatif de réalisation de l'invention, il est proposé un procédé d'extraction d'une molécule, utilisant un procédé d'obtention d'un complexe comme ci- dessus, et comprenant l'étape suivante :
- on désorbe par modification de la force ionique et/ou du pH, ou, par solubilisation à l'aide d'un solvant la molécule et/ou cellule de l'acide pectique et/ou ses sels.
Un tel procédé permet d'obtenir, toujours par un procédé simple et peu coûteux, les molécules et/ou cellules séparées de l'acide pectique et/ou ses sels.
En d'autres termes, le procédé d'obtention d'un complexe de l'invention peut se poursuivre par une étape supplémentaire d'extraction d'une ou plusieurs molécule(s) et/ou cellule(s) où l'on désorbe la molécule et/ou cellule par modification de la force ionique et du pH, ou, par solubilisation à l'aide d'un solvant après l'étape d'extraction du complexe formé. Par exemple, l'extraction par désorption peut se faire avec un solvant de type acide phosphorique ou chlorure de sodium. Cette étape de désorption est effectuée selon un procédé connu de l'homme du métier tel que par exemple un lavage par une solution aqueuse de chlorure de sodium.
Après récupération du complexe formé en partie par les molécules d'intérêts, on peut laver le complexe et désorber (si nécessaire) les molécules d'intérêts de l'acide pectique dans le matériel de séparation.
Selon un autre mode de réalisation particulier du procédé d'obtention du complexe, lorsqu'on extrait le complexe formé :
d) on sépare les particules insolubles, en particulier les fibres, par centrifugation ou par filtration, avant l'étape d'extraction du complexe formé susmentionnée et/ou - e) on désorbe la molécule et/ou cellule par modification de la force ionique et du pH, ou, par solubilisation à l'aide d'un solvant, après l'étape c) de la revendication 3.
Par cette double propriété de formation de complexe stable et précipitation, l'acide pectique et/ou ses sels permet de simplifier le procédé de la chromatographie cationique, et ceci avec un polymère végétal et naturel, non toxique ou dangereux pour la santé.
En effet, une résine cationique traditionnelle ne peut pas précipiter et elle doit être utilisée en colonne, ce qui ne permet pas d'utiliser la capacité d'adsorption de la résine à 100%, et nécessite des volumes importants de produits pour sa régénération.
En outre, une résine cationique traditionnelle est synthétique, et doit obligatoirement être séparée de la molécule fixée par un procédé de désorption, pour rendre celle-ci propre à la consommation alimentaire.
Pour la fabrication d'un tel acide pectique déméthylé, on part de préférence de pectine, qu'on traite à la soude à pH 12 de sorte à rompre les liaisons esters entre les carboxyles (COO) et les groupements méthyle (CH3) puis en abaissant le pH à 2. Dans l'invention, on utilise l'acide pectique et/ou ses sels, obtenus en ajoutant de grandes quantités de soude (NaOH) ou potasse (KOH), selon le sel souhaité. L'acide pectique présente alors ses groupements carboxyles sous forme de sels-COONa ou COOK.
La grande quantité de charges négatives présentes dans un acide pectique déméthylé à plus de 95% lui confère une grande capacité d'adsorption de molécules et/ou cellules solubles comportant des groupements à charges positives, ceci dans un milieu aqueux et dans des conditions de pH déterminé, de préférence supérieur à 6,5. . Plus précisément, cette double propriété intrinsèque à l'acide pectique et/ou ses sels déméthylés, va permettre la purification de molécules avec un ou plusieurs groupements chargés positivement en milieu aqueux à un pH déterminé, de préférence supérieur à 6,5 au travers des étapes suivantes :
- On fixe ladite molécule sur l'acide pectique et/ou ses sels déméthylé àplus de 95% pour former un complexe à un pH où l'acide pectique et/ou ses sels et la molécule sont solubles, par exemple à pH supérieur à 6,5, la complexation ou la fixation se fait par des liaisons ioniques ;
- On précipite le complexe par abaissement du pH en dessous du pH déterminé, plus particulièrement en dessous de 6,5, avantageusement en dessous de 6 ou
5;ceci constitue l'étape de concentration de la molécule d'intérêt
- On sépare le complexe solide du liquide par une technique connu de l'homme du métier,
- On réalise un lavage du complexe précipité, qui forme un gâteau, dans le matériel de séparation, avec de l'eau ou avec un solvant, pour éliminer les impuretés,
- Le cas échéant, on relargue la molécule complexée, en modifiant la force ionique ou le pH, ou, en solubilisant la molécule par ajout éventuel de solvant comme l'alcool par exemple.
Les étapes ci-dessus consistent à simplifier, par une technique simple d'adsorption, précipitation, lavage, désorption, des opérations énergivores, coûteuses et nécessitantes de grandes quantités d'eaux de lavage.
Néanmoins l'un des avantages du procédé de formation d'un complexe et du procédé d'obtention d'un complexe de l'invention réside dans le fait que l'acide pectique et/ou ses sels sont un produit naturel, ne présentant aucune contre-indication à la consommation alimentaire, en conséquence la désorption de la molécule d'intérêt n'est pas toujours nécessaire.
- L'état de la technique, pour des étapes de concentration, propose d'utiliser des technologies de type évaporation, ultra filtration, osmose inverse ou autres techniques coûteuses en énergie. Selon l'invention, cette opération se fait par la précipitation du complexe.
- L'état de la technique, pour des étapes de purification propose, entre autre, d'utiliser des résines synthétiques de chromatographie, dont la capacité d'adsorption de molécule d'intérêt est inférieure à 5% et nécessitent de grands volumes de solvants de désorption. Dans le présent brevet, l'utilisation de l'acide pectique et/ou ses sels permet une capacité d'adsorption de la molécule supérieure à 50%, nécessitant peu de volumes de solvants de désorption.
- L'état de la technique ne permet pas, de façon économique, de réaliser une élimination optimum des impuretés. Selon l'invention, le complexe précipité peut être lavé, comme dans une cristallisation, très tôt dans le processus. Ainsi, on augmente la pureté de la molécule d'intérêt car on la cristallise deux fois dans le procédé : Une fois, sous forme de complexe, une fois en phase finale après désorption.
De plus, l'invention concerne également un complexe insoluble en milieu aqueux à pH acide, ledit complexe comportant, d'une part, une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et, d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels, ledit complexe étant notamment formé par la mise en œuvre du procédé de formation d'un complexe et/ou obtenu par la mise en œuvre du procédé d'obtention d'un complexe susmentionné, caractérisé en ce qu'il comprend :
- - un acide pectique déméthylé à plus de 95% et soluble en milieu aqueux au pH déterminé de formation du complexe,
- - et une ou plusieurs molécules et/ou cellules possédant un ou plusieurs groupements chargés positivement et étant soluble en milieu aqueux au pH déterminé de formation du complexe .
Selon une alternative , l'invention concerne également un complexe insoluble en milieu aqueux à pH acide, ledit complexe comportant, d'une part, une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et, d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels, ledit complexe étant notamment formé par la mise en œuvre du procédé de formation d'un complexe et/ou obtenu par la mise en œuvre du procédé d'obtention d'un complexe susmentionné, caractérisé en ce qu'il comprend :
- - un acide pectique déméthylé à au moins 98% et soluble en milieu aqueux au pH déterminé de formation du complexe,
- - et une ou plusieurs molécules et/ou cellules possédant un ou plusieurs groupements chargés positivement et étant soluble en milieu aqueux au pH déterminé de formation du complexe .
En outre, l'invention concerne également un complexe insoluble en milieu aqueux à pH acide, ledit complexe comportant, d'une part, une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et, d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels, ledit complexe étant notamment formé par la mise en œuvre du procédé de formation d'un complexe et/ou obtenu par la mise en œuvre du procédé d'obtention d'un complexe susmentionné, caractérisé en ce qu'il comprend :
- - un acide pectique déméthylé à plus de 95% et soluble en milieu aqueux à un pH supérieur ou égal à 6,5,
- - et une ou plusieurs molécules et/ou cellules possédant un ou plusieurs groupements chargés positivement et étant soluble en milieu aqueux à un pH supérieur ou égal à 6,5.
De manière spécifique, l'invention concerne également un complexe insoluble en milieu aqueux à pH acide, ledit complexe comportant, d'une part, une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et, d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels, ledit complexe étant notamment formé par la mise en œuvre du procédé de formation d'un complexe et/ou obtenu par la mise en œuvre du procédé d'obtention d'un complexe susmentionné, caractérisé en ce qu'il comprend :
- - un acide pectique déméthylé à au moins 98% et soluble en milieu aqueux à un pH supérieur ou égal à 6,5,
- - et une ou plusieurs molécules et/ou cellules possédant un ou plusieurs groupements chargés positivement et étant soluble en milieu aqueux à un pH supérieur ou égal à 6,5.
La formation des complexes, par la seule utilisation d'un produit naturel tel qu'est l'acide pectique et/ou ses sels, et la modification de la solubilité de ces complexes par le seul changement du pH permet d'envisager de nombreuses applications dans les secteurs de l'agro-alimentaire, de la nutrition animale, de la cosmétique, de la pharmacie, de l'environnement et de la chimie, telles que (liste non exhaustive) :
- Extraction des protéines sériques (albumines, globulines) de substrats végétaux (céréales, protéagineux, oléagineux, etc.), animaux (sang, lait, plasma, etc.) et microbien (bactéries, levures, micro-organismes, etc.),
- Extraction, purification et enrobage d'enzyme sans utilisation de sulfate d'ammonium,
- Récupération de vitamines hydrosolubles avec fonctions aminés,
- Floculation de colloïdes, par abaissement du pH du milieu après ajout d'acide pectique et/ou ses sels, - Purification de polymères végétaux (exemple : gommes et mucilages, alginates), par précipitation et élimination d'impuretés,
- Fixation de bases aromatiques organiques,
- Purification de bétaïne,
- Amélioration de la biodisponibilité des minéraux par formation de complexes cations métalliques/acide pectique et ou ses sels, en évitant que ces minéraux ne soient capturés par d'autres molécules, les empêchant d'être absorbées par l'organisme,
- Substitution de résines acryliques, dans le traitement des eaux, par l'utilisation d'un adjuvant végétal floculant des colloïdes, tel que l'est l'acide pectique et/ou ses sels.
De façon plus générale, substitution de résines acryliques, dans ses applications en chimie, par l'apport d'un adjuvant végétal, tel que l'est l'acide pectique et/ou ses sels.
- Purification de molécules pharmaceutiques et biochimiques sans utilisation ou utilisation réduite de solvants (albumines, globulines, anticorps monoclonaux, peptides, alcaloïdes, nucléoprotéines et nucléotides, hormones, bases puriques, minéraux, flavines).
Un avantage complémentaire de la présente invention est de permettre la réalisation du procédé en « batch », dans une cuve, alors qu'avec les résines on est obligé d'utiliser des colonnes, moins efficaces.
Le procédé d'obtention d'un complexe selon l'invention permet également d'assurer l'enrobage de la ou des molécules et/ou cellules par le ou les acides pectiques et/ou ses sels. Cet enrobage de la ou des molécules et/ou cellules permet de les véhiculer et de les délivrer sur cible. Par exemple, on peut enrober de l'insuline ou des stéroïdes, pour les protéger lors du passage de l'estomac et les délivrer dans les intestins, dans ce cas l'enrobage permet d'administrer par voie orale l'insuline ou les stéroïdes.
L'invention concerne également par ailleurs l'utilisation de l'acide pectique et/ou ses sels pour assurer l'enrobage de cellules, permettant d'immobiliser des cellules et/ou micro-organismes et/ou des enzymes pour les utiliser en colonnes dans des procédés biologiques ou en station d'épuration.
Le procédé de formation d'un complexe selon l'invention peut être appliqué à la suppression du calcaire et/ou de métaux lourds dans une conduite d'eau. En introduisant un acide pectique déméthylé à pH neutre, celui-ci va attirer les minéraux ou métaux lourds pour former des complexes qui peuvent alors s'écouler et sortir de la conduite. Ainsi, le procédé de formation d'un complexe de l'invention peut avoir pour application la purification des eaux de consommation. Il peut être utilisé dans une station d'épuration comme un moyen naturel et non polluant de décontamination des eaux impures.
Le procédé selon l'invention peut encore être utilisé pour améliorer la biodisponibilité des minéraux et/ou vitamines.
L'invention concerne enfin un médicament contenant un principe actif associé sous forme de complexe à un acide pectique et/ou un de ses sels, ledit complexe étant obtenu par un procédé selon l'invention. En d'autres termes, ledit médicament est caractérisé en ce qu'il comporte au moins un complexe de l'invention, dans lequel la ou les molécules et/ou cellules constituent le principe actif dudit médicament. Ledit complexe ne se dissout pas dans l'environnement acide de l'estomac, mais va se dissoudre dans l'environnement basique de l'intestin. Un tel médicament est apte à passer l'estomac sans se dissoudre, le complexe formé n'étant pas soluble en milieu acide. Il peut alors se dissoudre dans les intestins, où le pH est plus élevé, et le principe actif peut ainsi faire son effet. Un tel médicament est donc pratique pour acheminer un médicament vers l'intestin sans perdre ses propriétés dans l'environnement acide de l'estomac. Le principe actif peut être de l'insuline, un anticorps monoclonal, une immunoglobuline, une albumine ou tout autre principe actif possédant des charges positives.
Il sera donné dans la suite de la description plusieurs exemples illustrant l'invention. Pour toutes les expériences qui vont suivre, le pH de la solution ou du mélange est vérifié à l'aide d'un pH mètre ou par tout autres méthodes connues de l'homme du métier.
On entend par « température ambiante », une température comprise entre 20 et 25°C, de préférence 21 °C.
Les unités suivantes sont représentées par « g » pour gramme, « L » pour litre, « ml_ » pour millilitre, et « mol/L » pour une concentration molaire en mol par litre. Les termes entièrement et partiellement sont des adverbes décrivant ce que l'expérimentateur est capable de voir à l'œil nu au cours des expériences décrites ci- dessous.
Témoin 1
On ajuste le pH d'une solution de 1 L d'eau à pH 7,7 à température ambiante à une valeur de 3 à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
On vérifie que le pH est à 3.
Résultat: Il n'y a pas de précipitation observée en ajoutant de l'acide phosphorique à de l'eau.
Conclusion : Aucune entité présente dans l'eau utilisée pour les expériences qui vont suivre ne précipite à un pH3 en présence d'acide phosphorique.
REMARQUE : La même eau sera utilisée pour toutes les expériences illustrant l'invention.
Témoin 2
Solution 2 : 10 g de gommes arabique d'acacia pur commercial sont entièrement solubilisés dans 1 L d'eau à pH = 7,5 à température ambiante.
On ajuste le pH de la solution 2 à une valeur de 3, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat: Il n'y a pas de précipitation observée.
Conclusion : La gomme arabique est entièrement soluble à pH = 3 et entre pH = 3 et pH = 7,5. Témoin 3
Solution 3 : 10 g de bétaglucane pur commercial sont entièrement solubilisés dans 1 L d'eau à pH = 7,5 à température ambiante.
On ajuste le pH de la solution 3 à une valeur de 3, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : Il n'y a pas de précipitation observée.
Conclusion : Le bétaglucane est entièrement soluble à pH 3 et entre pH 3 et pH 7,5. Témoin 4
Solution 4 : 10 g d'albumine pur commercial sont entièrement solubilisés dans 1 L d'eau à pH 7,5 à température ambiante.
On ajuste le pH de la solution 4 à une valeur de 3, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : Il n'y a pas de précipitation observée.
Conclusion : L'albumine est entièrement soluble à pH 3 et entre pH 3 et pH 7,5.
Témoin 5 :
Solution 5 : 100 g d'une solution à 1 % de sels d'acide pectique « entièrement déméthylé» de l'invention est entièrement solubilisé dans 1 L d'eau à pH 7,5. On obtient une solution homogène.
Conclusion : Le sel d'acide pectique « entièrement déméthylé » est entièrement soluble à pH 7,5.
On ajuste le pH de la solution 5 à une valeur de 3, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : Une précipitation est observée.
Conclusion : Le sel d'acide pectique « entièrement déméthylé » est insoluble à pH 3. La même expérience est réalisée en abaissant le pH à 5 de la solution 5.
Résultat : Une précipitation est observée.
Conclusion : Le sel d'acide pectique « entièrement déméthylé » est insoluble à pH 5.
Témoin 6
Solution 6 : 100 g d'une solution à 1 % de sels d'acide pectique déméthylé à 98% de l'invention est entièrement solubilisé dans 1 L d'eau à pH 7,5. On obtient une solution homogène. Conclusion : Le sel d'acide pectique déméthylé à 98% est soluble à pH 7,5.
On ajuste le pH de la solution 6 à une valeur de 3, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : Une précipitation est observée.
Conclusion : Le sel d'acide pectique déméthylé à 98% est insoluble à pH 3.
La même expérience est réalisée en abaissant le pH à 5 de la solution 6.
Résultat : Une précipitation est observée.
Conclusion : Le sel d'acide pectique déméthylé à 98% est insoluble à pH 5. Témoin 7
Solution 7 : On introduit 100g d'une solution à 1 % de sels d'acide pectique à 5% de méthylation dans 1 L d'eau à pH 7,5. On obtient une solution homogène.
Conclusion : Le sel d'acide pectique à 5% de méthylation est soluble à pH 7,5.
On ajuste le pH de la solution 7 à une valeur de 3, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : il n'y a pas de précipitation observée.
Conclusion : Le sel d'acide pectique à 5% de méthylation reste soluble à pH 3.
La même expérience est réalisée en abaissant le pH à 5 de la solution 7.
Résultat : il n'y a pas de précipitation observée.
Conclusion : Le sel d'acide pectique à 5% de méthylation reste soluble à pH 5.
Témoin 8
Solution 8 : On introduit 100g d'une solution à 1 % de sels d'acide pectique à 10% de méthylation dans 1 L d'eau à pH 7,5. On obtient une solution homogène.
Conclusion : Le sel d'acide pectique à 10% de méthylation est soluble à pH 7,5.
On ajuste le pH de la solution 8 à une valeur de 5, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : il n'y a pas de précipitation observée.
Conclusion : Le sel d'acide pectique à 10 % de méthylation reste soluble à pH 5. La même expérience est réalisée en abaissant le pH à 3 de la solution 8.
Résultat : il n'y a pas de précipitation observée.
Conclusion : Le sel d'acide pectique à 10% de méthylation reste soluble à pH 5. Témoin 9 Solution 9 : On introduit 100 g d'une solution à 1 % de sels d'acide pectique déméthylé à 96% de l'invention dans 1 L d'eau à pH 5. On obtient une solution homogène.
Conclusion : Le sel d'acide pectique déméthylé à 96%est soluble à pH 5.
On ajuste le pH de la solution 9 à une valeur de 3, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : une précipitation est observée.
Conclusion : Le sel d'acide pectique déméthylé à 96% est insoluble à pH 3 Expériences:
Les expériences ont été réalisées avec les solutions susmentionnées. Expérience 1
On mélange la solution 2 et la solution 5 à pH 7,5.
Résultat : A l'issue du mélange aucune précipitation n'est observée.
On ajuste le pH du mélange à une valeur de 3, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : une précipitation est observée.
On filtre par une technique connue de l'homme du métier le précipité. Puis on analyse la composition du floculat par une technique connue de l'homme du métier.
Résultat de l'analyse du floculat : le floculat est constitué de gomme arabique d'acacia et des sels d'acide pectique. Le floculat est donc un complexe sel d'acide pectique liant de la gomme arabique d'acacia.
Conclusion : le sel d'acide pectique « entièrement déméthylé » de l'invention a permis la précipitation de la gomme arabique d'acacia à un pH = 3.
Expérience 2
On mélange la solution 3 et la solution 5 à pH 7,5.
Résultat : A l'issue du mélange aucune précipitation n'est observée.
On ajuste le pH du mélange à une valeur de 3, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : une précipitation est observée.
On filtre par une technique connue de l'homme du métier le précipité. Puis on analyse la composition du précipité par une technique connue de l'homme du métier. Résultat de l'analyse du précipité : le précipité est constitué de bétaglucane et des sels d'acide pectique. Le précipité est donc un complexe sel d'acide pectique liant le bétaglucane.
Conclusion : le sel d'acide pectique « entièrement déméthylé » de l'invention a permis la précipitation du bétaglucane à un pH 3.
Expérience 3
On mélange la solution 4 et la solution 5 à pH 7,5.
Résultat : A l'issue du mélange aucune précipitation n'est observée.
On ajuste le pH du mélange à une valeur de 3, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : une précipitation est observée.
On filtre par une technique connu de l'homme du métier le précipité. Puis on analyse la composition du précipité par une technique connue de l'homme du métier.
Résultat de l'analyse du précipité : le précipité est constitué d'albumine et des sels d'acide pectique. Le précipité est donc un complexe sel d'acide pectique liant l'albumine.
Conclusion : le sel d'acide pectique « entièrement déméthylé » de l'invention a permis la précipitation de l'albumine à un pH 3.
Remarques : Les mêmes résultats expérimentaux ont été obtenus en remplaçant dans les expériences 1 , 2, 3 susmentionnées la solution 5 par la solution 6.
Conclusion : le sel d'acide pectique déméthylé à 98% de l'invention a permis la précipitation de la gomme arabique d'acacia, de la bétaglucane ou de l'albumine à un pH 3.
Expérience 4
On ajuste le pH de la solution 4 à une valeur de 5, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : pas de précipitation l'albumine de la solution 4 reste soluble à pH 5.
On ajuste le pH de la solution 5 à une valeur de 5, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : précipitation des sels d'acide pectique « entièrement déméthylé » de la solution 5
On mélange la solution 4 et la solution 5 à pH 5. On ajuste le pH du mélange à une valeur de 3, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : il y a une précipitation observée.
On filtre par une technique connu de l'homme du métier le précipitât. Puis on analyse la composition du précipité et le surnageant par des techniques connues de l'homme du métier.
Résultat de l'analyse du précipité : le précipité est constitué des sels d'acide pectique. Résultat de l'analyse du surnageant : le surnageant contient des protéines, il se compose d'albumine.
Interprétation : Le complexe albumine/sels d'acides pectique n'a pas pu se former puisque l'un des composants, à savoir l'acide pectique déméthylé est insoluble à pH 5 en milieu aqueux. .
Expérience 5
On ajuste le pH de la solution 4 à une valeur de 5, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : pas de précipitation l'albumine de la solution 4 reste soluble à pH 5.
On ajuste le pH de la solution 7 à une valeur de 5, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : pas précipitation des sels d'acide pectique à 5% de méthylation de la solution 5 à pH 5
On mélange la solution 4 et la solution 5 à pH 5.
On ajuste le pH du mélange à une valeur de 3, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : il n'y a pas de précipitation observée.
Interprétation : Toutes les entités du mélange sont solubles à pH 3.
Le complexe et la précipitation du complexe albumine/sels d'acides pectiques à 5% de méthylation n'ont pas pu avoir lieu puisque les deux composants sont solubles à pH 3, et le complexe est soluble à pH 3.
Expérience 6
On ajuste le pH de la solution 4 à une valeur de 5, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : pas de précipitation l'albumine de la solution 4 reste soluble à pH 5. On ajuste le pH de la solution 8 à une valeur de 5, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : pas précipitation des sels d'acide pectique à 10% de méthylation de la solution 8 à pH 5
On mélange la solution 4 et la solution 8 à pH 5.
On ajuste le pH du mélange à une valeur de 3, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : il n'y a pas de précipitation observée.
Interprétation : Toutes les entités du mélange sont solubles à pH 3.
Le complexe et la précipitation du complexe albumine/sels d'acides pectiques à 10% de méthylation n'ont pas pu avoir lieu puisque les deux composants sont solubles à pH 3, et le complexe est soluble à pH 3.
Expérience 6
On ajuste le pH de la solution 2 à une valeur de 5, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : pas de précipitation, la gomme arabique d'acacia de la solution 2 reste soluble à pH 5.
On ajuste le pH de la solution 9 à une valeur de 5, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : précipitation des sels d'acide pectique déméthylé à 96% de la solution 9 à pH 5.
On mélange la solution 2 et la solution 9 à pH 5
Résultat : il n'y a pas de précipitation observée
On ajuste le pH du mélange à une valeur de 3, à l'aide d'une solution d'acide phosphorique.
Résultat : une précipitation est observée.
On filtre par une technique connue de l'homme du métier le précipité. Puis on analyse la composition du précipité par une technique connue de l'homme du métier.
Résultat de l'analyse du précipité : le précipité est composé de gomme arabique d'acacia et des sels d'acide pectique. Le précipité est donc un complexe sel d'acide pectique liant de la gomme arabique d'acacia. Conclusion : le sels d'acide pectique déméthylé à 96% et la mise en œuvre du procédé de l'invention a permis la précipitation de la gomme arabique d'acacia à un pH de 3. Remarque :
L'ensemble des expériences susmentionnées ont également été réalisées en utilisant de l'acide acétique en remplacement de l'acide phosphorique. Les résultats sont identiques dans tous les cas. En conséquence, l'acide utilisé pour changer le pH de la solution n'influence pas les résultats obtenus en appliquant le procédé de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de formation d'un complexe, ledit complexe étant insoluble en milieu aqueux à pH acide, et ledit complexe comportant, d'une part une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et, d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels, ledit procédé consistant à mettre en contact, en milieu aqueux, d'une part la ou les molécules et/ou cellules, et, d'autre part, le ou les acides pectiques et/ou ses sels, caractérisé en ce que :
- on confère audit milieu aqueux un pH déterminé pour lequel, d'une part, la ou lesdites molécules et/ou cellules, d'autre part, le ou lesdits acides pectiques et/ou ses sels sont solubles; ledit pH déterminé étant le pH de formation du complexe ;
- la ou lesdites molécules et/ou cellules possèdent un ou plusieurs groupements chargés positivement en milieu aqueux au pH déterminé ;
- le ou les acides pectiques et/ou ses sels sont déméthylés à plus de 95%.
2. Procédé de formation d'un complexe, selon la revendication 1 caractérisé en ce que le ou les acides pectiques et/ou ses sels sont déméthylés à au moins 98%.
3. Procédé de formation d'un complexe, selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit milieu aqueux est à un pH déterminé de formation du complexe supérieur ou égal à 6,5.
4. Procédé de formation d'un complexe, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la ou les molécules et/ou cellules comprennent des groupements aminés, et sont choisies dans la liste constituée de :
- Protéines sériques, en particulier albumine, globuline et enzymes
- Acides aminés et dérivés
- Peptides
- Alcaloïdes
- Bétaïne
- Nucléo-protéines et nucléotides
- Acides organiques et dérivés Purines
Hormones
Anticorps monoclonaux
Flavines
Bactéries et micro-organ
5. Procédé de formation d'un complexe, selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la ou les molécules sont un minéral.
6. Procédé d'obtention d'un complexe, ledit complexe étant insoluble en milieu aqueux à pH acide, et, ledit complexe comportant, d'une part, une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et, d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels, caractérisé en ce que :
1 ) On forme un tel complexe en mettant en œuvre le procédé de formation d'un complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes ;
2) On extrait le complexe formé.
7. Procédé d'obtention d'un complexe selon la revendication précédente, caractérisé en ce que, lorsqu'on extrait le complexe formé:
a) on abaisse le pH déterminé, de manière à précipiter le ou lesdits complexes formés dans ledit milieu aqueux;
b) on sépare le ou lesdits complexes précipités du milieu aqueux,
c) on lave le précipité, au pH de précipitation.
8. Procédé d'obtention d'un complexe, selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisé par le fait que l'on assure l'enrobage, de la ou des molécules et/ou cellules, par le ou les acides pectiques et/ou par ses sels.
9. Complexe, insoluble en milieu aqueux à pH acide, ledit complexe comportant, d'une part, une ou plusieurs molécules et/ou cellules, et, d'autre part, un ou plusieurs acides pectiques et/ou ses sels, ledit complexe étant notamment formé par la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 et/ou obtenu par la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend : au moins un acide pectique et/ou ses sels déméthylé à plus de 95%, ce dernier étant soluble en milieu aqueux au pH déterminé de formation du complexe,
et une ou plusieurs molécules et/ou cellules possédant un ou plusieurs groupements chargés positivement et étant soluble en milieu aqueux au pH déterminé de formation du complexe .
10. Médicament caractérisé en ce qu'il comporte au moins un complexe, conforme à la revendication 9, et dans lequel la ou les molécules et/ou cellules constituent le principe actif dudit médicament.
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