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WO2015046463A1 - ガラクトオリゴ糖の検出・定量方法 - Google Patents

ガラクトオリゴ糖の検出・定量方法 Download PDF

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WO2015046463A1
WO2015046463A1 PCT/JP2014/075718 JP2014075718W WO2015046463A1 WO 2015046463 A1 WO2015046463 A1 WO 2015046463A1 JP 2014075718 W JP2014075718 W JP 2014075718W WO 2015046463 A1 WO2015046463 A1 WO 2015046463A1
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WO
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galactooligosaccharide
detecting
sample
quantifying
buffer
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PCT/JP2014/075718
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水越晴美
木村一雅
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Yakult Honsha Co Ltd
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Yakult Honsha Co Ltd
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Priority to JP2015539394A priority patent/JP6285944B2/ja
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    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting and quantifying a galactooligosaccharide and a galactooligosaccharide in a sample containing dextrin.
  • Galacto-oligosaccharide is a mixture of oligosaccharides composed mainly of galactose and having different binding modes, and is generally produced by performing a transfer reaction on lactose with ⁇ -galactosidase.
  • Galacto-oligosaccharides have been reported to have physiological effects such as increasing the number of bifidobacteria inhabiting the intestine, adjusting the intestinal environment, and contributing to the prevention of lifestyle-related diseases through the reduction of mesenteric fat. It has been invaluable as a food for specified health use and various functional foods or their materials.
  • galactooligosaccharide is often used as a functional ingredient in foods and drinks rich in nutritional components, such as infant formula milk and fermented milk products. Since a sugar source having a molecular size equivalent to that of -GL is often included, gel filtration chromatography cannot separate the sugar source from 4'-GL. For example, when 4'-GL in a food or drink containing maltotriose, which is a kind of saccharide contained in dextrin, is to be separated and quantified by gel filtration chromatography, maltotriose and 4'-GL have molecular sizes. Since they are the same, both peaks after elution from the column overlap, which hinders the determination of 4′-GL, that is, the determination of galactooligosaccharide.
  • Patent Document 1 As a method for detecting oligosaccharides by reverse phase chromatography, a method using a column for C8 or C18 reverse phase chromatography is known (Patent Document 1). However, when separation of galactooligosaccharides in foods and drinks using these columns is attempted, other components of the foods and drinks and galactooligosaccharide components cannot be separated.
  • an object of the present invention is to provide a method for separating 4′-GL easily and at low cost from a sample containing galactooligosaccharide and dextrin and accurately quantifying 4′-GL and galactooligosaccharide.
  • the present inventors have reacted a sample containing galactooligosaccharide and dextrin with a derivatization reagent, derivatized dextrin and galactooligosaccharide in the sample, and then C30 reverse phase It was found that the galactooligosaccharide component in the sample can be sufficiently separated by subjecting it to high performance liquid chromatography using a chromatography column, and the present invention has been completed.
  • the present invention is a method for detecting and quantifying galactooligosaccharide in a sample containing galactooligosaccharide and dextrin, wherein the sample is reacted with a derivatization reagent, derivatized dextrin and galactooligosaccharide in the sample,
  • the present invention provides a method for detecting and quantifying a galactooligosaccharide characterized by separating a galactooligosaccharide component in the sample by high performance liquid chromatography using a C30 reverse phase chromatography column.
  • the galactooligosaccharide and other components in the sample can be separated easily and at low cost, and the galactooligosaccharide can be accurately quantified.
  • the method of the present invention by detecting and quantifying galactooligosaccharides of foods and drinks, etc., the amount of galactooligosaccharides contained in the foods and drinks can be accurately managed, quality can be assured, and various efficacy test data Acquisition, display, etc. can be performed accurately.
  • the detection / quantification method of the present invention is derivatized galactooligosaccharide contained in a sample such as food or drink, and then subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) using a C30 reverse phase chromatography column. And galactooligosaccharides are separated and quantified.
  • Galactooligosaccharides are represented by the general formula: Gal- (Gal) n-Glc (where Gal is a galactose residue, Glc is a glucose residue, and n is an integer of 0 to 4). It is a mixture of 2 to 6 sugars containing one or more molecules. However, lactose is not included in galactooligosaccharide.
  • the main component of galactooligosaccharide is trisaccharide 4′-galactosyl lactose (4′-GL) in which one galactose is bonded to the non-reducing end of lactose.
  • Other specific components include Gal ⁇ 1-3Glc, Gal ⁇ 1-2Glc, Gal ⁇ 1-6Glc, Gal ⁇ 1-6Gal ⁇ 1-4Glc, Gal ⁇ 1-6Gal ⁇ 1-4Gal ⁇ 1-4Glc, Gal ⁇ 1-4Gal ⁇ 1-4Glc, Gal ⁇ 1-4Gal ⁇ 1-4Gal ⁇ 1-4Glc, and the like.
  • galactooligosaccharides may be detected and quantified as a mixture, or individual galactooligosaccharide components may be detected and quantified, but after 4′-GL is separated, It is preferable to calculate the total amount of galactooligosaccharide by quantifying and calculating back from the amount, from the viewpoint of accuracy of quantification.
  • the galactooligosaccharide may be obtained by any method.
  • a galactooligosaccharide produced using lactose as a raw material and utilizing a transfer reaction with lactose-degrading enzyme can be used.
  • ⁇ -galactosidase lactose-degrading enzyme
  • a microorganism that produces an enzyme may act on the raw material.
  • raw materials containing lactose include commercially available lactose, milk, milk powder, and cheese whey.
  • the enzyme to be used is not particularly limited as long as it is an enzyme capable of obtaining galactooligosaccharide.
  • an enzyme capable of hydrolyzing lactose in a raw material and transferring galactose produced by the decomposition to lactose or glucose include ⁇ -galactosidase and ⁇ -galactosidase. These enzymes can be used alone or in combination of two or more.
  • the enzyme treatment conditions are not particularly limited. Generally, the raw material concentration is 10 to 70%, the pH is 3 to 8, the enzyme concentration is 0.01 to 100 units / ml, the temperature is 20 to 70 ° C., and the reaction time is 2 hours. ⁇ 3 days is appropriate.
  • Commercially available galactooligosaccharide liquid sugar can also be used, and examples thereof include Oligomate 55N (Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the sample to be detected and quantified for galactooligosaccharide is not particularly limited as long as it contains galactooligosaccharide and dextrin, food for specified health use, functional food, health food, dietary supplement, infant Foods such as foods for infants, infants, pregnant women, sick people, foods for people with difficulty in swallowing, infant formulas and their raw materials, and pharmaceuticals.
  • infant Foods such as foods for infants, infants, pregnant women, sick people, foods for people with difficulty in swallowing, infant formulas and their raw materials, and pharmaceuticals.
  • Dextrin is a general term for substances in which 3 or more molecules of glucose are polymerized.
  • Maltodextrin is a kind of dextrin, which is a polymer in which D-glucose is polymerized by ⁇ -1,4 bonds, and has a dextrose equivalent of less than 20 and is obtained by hydrolysis of starch. is there.
  • Maltodextrin includes maltotriose composed of three molecules of glucose, a tetrasaccharide obtained by polymerizing four molecules of glucose, or a polysaccharide obtained by polymerizing more than one glucose.
  • Maltotriose is a polymer of 3 molecules of glucose, has the same molecular weight and molecular size as 4'-GL, and has some steric structures of some hydroxyl groups.
  • the dextrose equivalent is a value obtained by expressing the reducing sugar in the sample as glucose and as a percentage of the solid content.
  • the maximum dextrose equivalent is 100, meaning that all solids are glucose.
  • the dextrose equivalent is an index representing the hydrolysis rate from starch, and dextrose with a small dextrose equivalent, that is, a dextrose with a low hydrolysis rate contains a large amount of polysaccharide components.
  • dextrose with a large dextrose equivalent that is, with a high hydrolysis rate, contains a large amount of oligosaccharides.
  • a derivatization reagent is first reacted with a sample to derivatize a carbohydrate in the sample.
  • the derivatization reagent is not particularly limited as long as it can derivatize galactooligosaccharide, and examples thereof include hydrophobic derivatives capable of ultraviolet, visible absorption, or fluorescence detection.
  • hydrophobic derivatives capable of ultraviolet, visible absorption, or fluorescence detection.
  • 1-phenyl-3 -Methyl-5-pyrazolone (PMP), 2-aminopyridine, 2-aminobenzamide, 3-aminoquinone, ethyl 4-aminobenzoate, butyl 4-aminobenzoate, 4-trimethylammonium aniline Can be used.
  • PMP in order to sufficiently separate galactooligosaccharide components.
  • a methanol solution of 0.5 M PMP and a 0.6 M NaOH solution are added to the sample and reacted at 70 ° C. for 30 minutes, and 0.1 M hydrochloric acid and chloroform are added to the reaction solution. Is added, and after stirring, the lower chloroform layer is removed.
  • Carbohydrates such as galactooligosaccharides are hydrophilic, but derivatized with a hydrophobic derivatization reagent makes the derivatized part hydrophobic so that the stationary phase contains an alkyl group for high performance liquid chromatography. When used in a column, it will be retained in the column for a longer time than a hydrophilic component.
  • the sample after the derivatization treatment is subjected to high performance liquid chromatography to separate the galactooligosaccharide component in the sample.
  • a column used for high performance liquid chromatography a column for C30 reverse phase chromatography, that is, a column containing a C30 alkyl group (triacontyl group) in the stationary phase is used. This is because it is necessary to use a column with 30 carbon atoms in order to sufficiently separate the galactooligosaccharides in the sample.
  • Develosil RPAQUEOUS Nomura Chemical Co., Ltd.
  • Develosil C30-UG Nomura Chemical Co., Ltd.
  • Intersil C30 S-Select GL Science Co., Ltd.
  • those having a stationary phase having a cis-type alkyl group having a double bond are preferable from the viewpoint of separation ability of galactooligosaccharide, and specifically, Develosil RPAQUEOUS (Nomura Chemical Co., Ltd.) is preferable.
  • the reason why the C30 reverse phase chromatography column is suitable for separating galactooligosaccharide components is that the length of the alkyl group and its three-dimensional structure contribute to the change in retention time of galactooligosaccharide and maltotriose. It is done.
  • the eluent used for the high-performance liquid chromatography mobile phase can be used without particular limitation as long as it does not adversely affect the column or the apparatus.
  • the eluent consists of water only, the eluate consists only of buffer, water or
  • a mixed solution of a buffer solution and a polar organic solvent can be mentioned, and it is particularly preferable to use a mixed solution of a buffer solution and a polar organic solvent.
  • the pH of the buffer is preferably 4 to 8, and more preferably 5 to 6.
  • at least one selected from a potassium phosphate buffer, a potassium citrate buffer, an ammonium formate buffer and a potassium acetate buffer as a buffer, and selected from acetonitrile, methanol, ethanol, propanol and butanol as a polar organic solvent It is preferable to use a mixed solution containing at least one selected from the group consisting of potassium phosphate buffer and acetonitrile, and the pH of the potassium phosphate buffer is preferably 5 to 6, and potassium phosphate.
  • High performance liquid chromatography can be performed using a commercially available HPLC apparatus, and various conditions such as column equilibration and flow rate may be appropriately set based on the volume of the sample.
  • the obtained fraction can be detected and quantified using various detectors.
  • an absorbance detector such as an ultraviolet absorbance detector or a visible absorbance detector, various optical rotation detectors, a fluorescence detector, or the like can be used.
  • an ultraviolet absorbance detector is simple and the quantitative accuracy is high.
  • Examples of the method for detecting and quantifying galactooligosaccharide in a sample include the following means. First, after adding a solvent such as water to a sample containing a galactooligosaccharide having a known 4′-GL content, an appropriate amount of an internal standard substance is added to prepare a sample solution. Separately, the same galactooligosaccharide and an internal standard substance are dissolved in water or the like to prepare a standard test solution. The standard test solution is prepared by serial dilution, for example, 10, 20, or 40-fold dilution. Next, the sample solution and the standard test solution are derivatized with a derivatizing reagent such as PMP. The sample solution and standard test solution after derivatization are each subjected to high performance liquid chromatography, and a chromatogram is obtained by a detector. The conditions for high performance liquid chromatography are as described above.
  • a calibration curve is created from the results of the standard test solution obtained.
  • a calibration curve was obtained by the least square method with the galactooligosaccharide content as the horizontal axis and the area ratio of 4'-GL and the internal standard substance as the vertical axis, and the following formula (calibration curve) Can be obtained.
  • Area ratio (y) constant (a) ⁇ galactooligosaccharide content (x)
  • the area ratio between 4′-GL and the internal standard substance is calculated, and the area ratio is substituted into the calibration curve, thereby calculating the galactooligosaccharide content in the sample. It becomes possible.
  • An accurate galactooligosaccharide content is quantified by appropriately performing a supplementary calculation on the calculation result in accordance with the dilution rate of the sample in the pretreatment stage.
  • Comparative Example 1 Determination of 4′-GL Using Gel Filtration Chromatography (1) Preparation of Sample Solution
  • Galactooligosaccharide liquid sugar (Oligomate 55N: Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.) is 2.3 g / 100 g as galactooligosaccharide content.
  • Ingredients for infant formula include lactose, whey protein digest, palm oil, whole milk powder, palm kernel fractionated oil, soybean white oil, galactooligosaccharide liquid sugar, calcium caseinate, maltodextrin (starch saccharified product), Refined fish oil, Ca carbonate, Mg chloride, lecithin, phosphate K, chloride K, phosphate Na, hydroxide K, lactoferrin, V. C, Ca chloride, iron pyrophosphate, taurine, V.I. E, zinc sulfate, cystine, Na cytidylate, niacin, Ca pantothenate, V.V.
  • Table 1 contains B12 and its nutritional components.
  • the carbohydrates in Table 1 include lactose, galactooligosaccharides, dextrins and monosaccharides.
  • Powdered milk 101 (with GOS) contains 4.7 g / 100 g of lactose derived from galactooligosaccharide liquid sugar, galactooligosaccharide, and monosaccharide in total. Powdered milk 101 (with GOS added) and powdered milk 102 (placebo) are carbohydrates The amount is the same.
  • test solution placebo test solution
  • galactooligosaccharide standard test solution galactooligosaccharide standard test solution
  • maltodextrin standard test solution were filtered through a 0.45 ⁇ m filter and analyzed under the following HPLC conditions.
  • the trisaccharide (maltotriose: Mal-3) contained in maltodextrin and the 4′-GL of the trisaccharide contained in the standard test solution (OM55N) have the same retention time. It was eluted from the column. In gel filtration chromatography, maltotriose in maltodextrin and 4′-GL peak in galactooligosaccharide overlapped, and 4′-GL could not be quantified.
  • Example 1 PMP derivative using a C30 column-HPLC reverse phase chromatogram
  • a sample solution of infant formula milk, a placebo sample solution, a galactooligosaccharide standard test solution, and a maltodextrin standard test solution were prepared.
  • a diluted solution was further diluted 10, 20, or 40 times with distilled water.
  • the concentration of the galactooligosaccharide liquid sugar in the diluted solution is 0.2 g / 100 ml, 0.1 g / 100 ml, and 0.05 g / 100 ml, respectively.
  • PMP derivatization 100 ⁇ l of each of the sample solution, the galactooligosaccharide standard test solution, and the maltodextrin standard test solution was placed in a screw test tube, and 100 ⁇ l of 0.6 M NaOH aqueous solution was added and stirred. Next, 200 ⁇ l of 0.5 M PMP methanol solution was added and stirred. PMP derivatization was performed by heating at 70 ° C. for 30 minutes. After cooling to room temperature, 0.7 ml of 0.1 M HCl aqueous solution was added to make it weakly acidic, and extracted with chloroform to remove excess reagent.
  • the same preparation process as powdered milk 101 was performed as the infant formula powdered milk which does not contain galactooligosaccharides, and a placebo sample solution (milk powder 102 (placebo)) was prepared.
  • the infant formula used for the preparation does not contain galactooligosaccharide and maltodextrin is included at a ratio of 6.2 g / 100 g.
  • the composition of the raw materials is the infant that created the sample solution (milk powder 101 (with GOS added)) It is the same as the formula for milk.
  • PMP derivatization 100 ⁇ l of each of the sample solution, the galactooligosaccharide standard test solution, and the maltodextrin standard test solution was placed in a screw-cap test tube, and 100 ⁇ l of 0.6 M NaOH aqueous solution was added and stirred. Subsequently, 200 ⁇ l of 0.5 M PMP methanol solution was added and stirred. PMP derivatization was performed by heating at 70 ° C. for 30 minutes. After cooling to room temperature, 0.7 ml of 0.1 M HCl aqueous solution was added to make it weakly acidic, and extracted with chloroform to remove excess reagent.
  • HPLC analysis conditions (1) HPLC using C18 column Column: Inertosil ODS-3 (4.6 ⁇ 250 mm) (C18 reverse phase column) Eluent: Potassium phosphate buffer (pH 6) / CH 3 CN (80/20) Flow rate: 1.0 ml / min Detection: UV245nm Column temp: 35 ° C (2) HPLC using C8 column Column: Imtakt UK-8 (4.6 ⁇ 150 mm) (C8 reverse phase column) Eluent: Potassium phosphate buffer (pH 6) / CH 3 CN (80/20) Flow rate: 1.0 ml / min Detector: UV245nm Column temp: 35 ° C
  • Example 2 Examination of eluate in HPLC As in Comparative Example 2, sample solutions (milk powder 101 (with GOS added), milk powder 102 (placebo)), galactooligosaccharide standard test liquid and maltodextrin standard test liquid were prepared. Was converted to PMP in the same manner as in Comparative Example 2 and analyzed under the following 6 types of HPLC conditions.
  • Example 3 PMP derivative-reverse phase HPLC chromatogram (C30) using nutritional food as a sample
  • the raw materials shown in Table 4 were mixed to prepare a nutritional food. Distilled water was added to 10 g of this nutritional food to make 50 ml, and then centrifuged at 20000 g ⁇ 30 minutes, and further centrifuged at 20000 g ⁇ 30 minutes. After centrifugation, the nutritional food was separated into three layers, a lower layer, an intermediate layer, and an upper layer. The intermediate layer was separated, and the collected sample was filtered with a 0.45 ⁇ m filter.
  • a galactooligosaccharide standard test solution was prepared in the same manner as Comparative Example 1 using Oligomate 55 (Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.) as a standard sample.
  • 100 ⁇ l each of the filtered sample and the galactooligosaccharide standard test solution were placed in a screw-cap test tube and dried under reduced pressure.
  • 100 ⁇ l of an aqueous solution containing 0.02% of an internal standard substance was added, and 200 ⁇ l of 0.5 M PMP methanol solution was added and stirred. Subsequently, it heated at 70 degreeC for 30 minute (s), PMP derivatized, and analyzed on the following HPLC conditions.
  • the galactooligosaccharide and other components in the sample can be separated easily and at low cost, and the galactooligosaccharide can be accurately quantified.
  • the amount of sugar can be accurately managed, and various efficacy test data can be acquired and displayed accurately.

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Abstract

　ガラクトオリゴ糖とデキストリンを含む試料から、簡易かつ低コストに４´－ＧＬを分離し、４´－ＧＬおよびガラクトオリゴ糖を正確に定量する方法を提供する。　ガラクトオリゴ糖とデキストリンを含む試料中のガラクトオリゴ糖を検出・定量する方法であって、前記試料を誘導体化試薬と反応させ、試料中のデキストリンおよびガラクトオリゴ糖を誘導体化し、次いで、Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより当該試料中のガラクトオリゴ糖成分を分離することを特徴とするガラクトオリゴ糖の検出・定量方法。

Description

ガラクトオリゴ糖の検出・定量方法
　本発明は、ガラクトオリゴ糖と、デキストリンを含む試料中のガラクトオリゴ糖を検出・定量する方法に関する。
　ガラクトオリゴ糖は、ガラクトースを主成分とする結合様式の異なるオリゴ糖の混合物であり、一般的には、乳糖にβ－ガラクトシダーゼによる転移反応を行うことで製造される。ガラクトオリゴ糖はその生理効果として、腸に生息しているビフィズス菌を増加させ、腸内環境を整える効果や、腸間膜脂肪の低減を通じ生活習慣病予防に資するなどの効果が報告されており、特定保健用食品や各種機能性食品またはそれらの素材として、以前から重宝されている。特定保健用食品などの成分としてガラクトオリゴ糖を使用する場合には、その品質、規格の保証や機能性成分としての定量分析データの表示等のため、正確性の高い定量法を確立することが求められる。
　飲食品中のガラクトオリゴ糖を定量する方法には、ガラクトオリゴ糖にβ－ガラクトシダーゼを作用させ、酵素分解で生じるガラクトースを定量し、オリゴ糖を算出する方法がある（非特許文献１）。しかし、生成するガラクトースの検出には、高価なパルス型電気化学検出器を装着したアニオン交換高速液体クロマトグラフィーを用いる必要があり、汎用性が低いという問題がある。また、飲食品中に乳糖などの栄養成分が含まれている場合、酵素処理で生じたガラクトースと、乳糖から遊離したガラクトースを判別することができず、結果的にガラクトオリゴ糖の定量の精度が低下してしまう。
　ガラクトオリゴ糖中の特徴的な成分、例えば、４´－ガラクトシルラクトース（４´－ＧＬ；Ｇａｌβ１－４Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）を定量し、その量から逆算して、ガラクトオリゴ糖の全量を算出する方法も存在している。この方法は、使用するガラクトオリゴ糖中の４´－ＧＬの含有量が判明しており、当該含有量がロット差等なく安定している場合に、特に有効である。飲食品試料中の４´－ＧＬを定量する方法としては、従来は主に、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、飲食品中の他の成分と４´－ＧＬとを分子のサイズにより分離する方法が用いられている。
　しかしながら、ガラクトオリゴ糖は、上記のとおり機能性の素材として、栄養成分の豊富な飲食品、例えば育児用調製粉乳や発酵乳製品などに使用されることが多く、当該飲食品中には、４´－ＧＬと分子の大きさが同等な糖質源が含まれることも多いため、ゲルろ過クロマトグラフィーでは、それら糖質源と４´－ＧＬを分離することはできない。例えば、デキストリンに含まれる糖類の一種であるマルトトリオースを含む飲食品中の４´－ＧＬをゲルろ過クロマトグラフィーで分離・定量しようとした場合、マルトトリオースと４´－ＧＬは分子サイズが同一であることから、カラムから溶出後の両者のピークが重なり合ってしまうため、４´－ＧＬの定量、すなわちガラクトオリゴ糖の定量に支障をきたしてしまう。
　オリゴ糖を逆相クロマトグラフィーで検出する方法として、Ｃ８またはＣ１８逆相クロマトグラフィー用カラムを用いる方法が知られている（特許文献１）。しかしながら、これらのカラムを使用して飲食品中のガラクトオリゴ糖の分離を試みた場合、飲食品の他の成分とガラクトオリゴ糖成分とを分離することができない。
特表２００７－５２３３５２号公報
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＡＯＡＣ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　Ｖｏｌｕｍｅ　８５，　Ｎｕｍｂｅｒ　２，　Ｍａｒｃｈ　２００２，　ｐｐ．４１７－４２３（７）
　従って、本発明は、ガラクトオリゴ糖とデキストリンを含む試料から、簡易かつ低コストに４´－ＧＬを分離し、４´－ＧＬおよびガラクトオリゴ糖を正確に定量する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ガラクトオリゴ糖とデキストリンを含む試料を誘導体化試薬と反応させ、前記試料中のデキストリンおよびガラクトオリゴ糖を誘導体化し、次いで、Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーに供することで、当該試料中のガラクトオリゴ糖成分を十分に分離できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、ガラクトオリゴ糖とデキストリンを含む試料中のガラクトオリゴ糖を検出・定量する方法であって、前記試料を誘導体化試薬と反応させ、試料中のデキストリンおよびガラクトオリゴ糖を誘導体化し、次いで、Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより当該試料中のガラクトオリゴ糖成分を分離することを特徴とするガラクトオリゴ糖の検出・定量方法を提供するものである。
　本発明の検出・定量方法によれば、試料中のガラクトオリゴ糖と他の成分とを簡易、低コストに分離し、正確にガラクトオリゴ糖の定量を行うことができる。本発明の方法を用いて、飲食品等のガラクトオリゴ糖を検出・定量することで、当該飲食品等に含まれるガラクトオリゴ糖の量を正確に管理し、品質保証できるとともに、各種有効性試験データの取得、表示などを正確に行うことが可能となる。
ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣのクロマトグラム ＰＭＰ誘導体逆相ＨＰＬＣクロマトグラム（Ｃ３０） ＰＭＰ誘導体－逆相ＨＰＬＣクロマトグラム（Ｃ１８逆相カラム） ＰＭＰ誘導体－逆相ＨＰＬＣクロマトグラム（Ｃ８逆相カラム） ＰＭＰ誘導体逆相ＨＰＬＣクロマトグラム（Ｃ３０）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ４）／ＣＨ３ＣＮ（７８／２２） ＰＭＰ誘導体逆相ＨＰＬＣクロマトグラム（Ｃ３０）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５）／ＣＨ３ＣＮ（７９／２１） ＰＭＰ誘導体逆相ＨＰＬＣクロマトグラム（Ｃ３０）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）／ＣＨ３ＣＮ（８１／１９） ＰＭＰ誘導体逆相ＨＰＬＣクロマトグラム（Ｃ３０）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）／ＣＨ３ＣＮ（８２／１８） ＰＭＰ誘導体逆相ＨＰＬＣクロマトグラム（Ｃ３０）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）／ＣＨ３ＣＮ（８２／１８） ＰＭＰ誘導体逆相ＨＰＬＣクロマトグラム（Ｃ３０）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）／ＣＨ３ＣＮ（８３／１７） ＰＭＰ誘導体逆相ＨＰＬＣクロマトグラム（Ｃ３０）
　本発明の検出・定量方法は、飲食品等の試料中に含まれるガラクトオリゴ糖を誘導体化したうえでＣ３０逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、試料中の他の成分とガラクトオリゴ糖とを分離、定量するものである。ガラクトオリゴ糖は、一般式：Ｇａｌ－（Ｇａｌ）ｎ－Ｇｌｃ（ただし、式中Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇｌｃはグルコース残基、ｎは０～４の整数）で表される、分子内にガラクトースを一分子以上含む２～６糖の混合物である。ただし、乳糖はガラクトオリゴ糖には含まれない。
　ガラクトオリゴ糖の主成分は、乳糖の非還元末端にガラクトースが一つ結合した３糖の４´－ガラクトシルラクトース（４´－ＧＬ）である。その他の具体的な成分としては、Ｇａｌβ１－３Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１－２Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１－６Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１－６Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１－６Ｇａｌβ１－４Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１－４Ｇａｌβ１－４Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃなどが挙げられる。本発明の検出・定量方法では、ガラクトオリゴ糖を混合物として検出・定量してもよく、個々のガラクトオリゴ糖成分を検出・定量してもよいが、４´－ＧＬを対象として分離した後、検出・定量し、その量から逆算して、ガラクトオリゴ糖の全量を算出することが、定量の精度の点から好ましい。
　ガラクトオリゴ糖は、如何なる方法で得られたものでもよく、例えば、乳糖を原料として、乳糖分解酵素（β－ガラクトシダーゼ）による転移反応を利用して生産されたものを使用できる。転移反応では、原料に酵素を産生する微生物を作用させてもよい。乳糖を含む原料としては、例えば、市販の乳糖、乳汁、粉乳、チーズホエー等が挙げられる。用いる酵素は、ガラクトオリゴ糖を得ることのできる酵素であれば特に限定されるものではなく、例えば、原料中の乳糖を加水分解し、分解により生じたガラクトースを乳糖やグルコースに転移させることができる酵素、具体的にはβ－ガラクトシダーゼやα－ガラクトシダーゼが挙げられる。これらの酵素は単独であるいは２種以上を組み合わせて使用できる。酵素処理条件は特に限定されず、一般的には原料濃度は１０～７０％、ｐＨは３～８、酵素濃度は０．０１～１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、温度は２０～７０℃、反応時間は２時間～３日間が適当である。また、市販のガラクトオリゴ糖液糖を用いることもでき、例えば、オリゴメイト５５Ｎ（ヤクルト薬品工業株式会社）を挙げることができる。また、ガラクトオリゴ糖を含む天然物から定法により単離、精製したものを用いることもできる。ガラクトオリゴ糖を含む天然物の種類は何ら限定されず、例えば哺乳動物の乳汁が挙げられる。
　本発明において、ガラクトオリゴ糖の検出・定量の対象となる試料は、ガラクトオリゴ糖と、デキストリンを含むものであれば特に制限されず、特定保健用食品、機能性食品、健康食品、栄養補助食品、乳児用、幼児用、妊産婦用、病者用特別用途食品、えん下困難者用食品、育児用調製粉乳等の飲食品やそれらの素材、または医薬品等が挙げられる。中でも糖質成分が多く含まれる育児用調製粉乳に本発明の方法を適用した場合に、高精度にガラクトオリゴ糖の検出・定量ができ好ましい。デキストリンとは、３分子以上のグルコースが重合した物質の総称である。また、デキストリンの一種としてマルトデキストリンがあり、マルトデキストリンとは、α－１，４結合によってＤ－グルコースが重合した重合体であり、デキストロース当量が２０未満で、デンプンの加水分解により得られるものである。
　マルトデキストリンには３分子のグルコースからなるマルトトリオースや、４分子のグルコースが重合した４糖、もしくはそれ以上のグルコースが重合した多糖類を含む。マルトトリオースは３分子のグルコースが重合したもので、４´－ＧＬと分子量と分子サイズが同一であり、一部のヒドロキシル基の立体構造が異なっている。飲食品等の試料中に、こうした４´－ＧＬと同じ大きさの分子が存在している場合、ゲルろ過クロマトグラフィー等の従来法では４´－ＧＬとマルトトリオース等を分離し、ガラクトオリゴ糖を定量することができなかったが、本発明の方法によれば、両者を十分に分離することが可能となる。デキストロース当量とは、試料中の還元糖をグルコースとして表し、固形分に対する百分率として求められる値である。デキストロース当量の最大は１００で、固形分のすべてがグルコースであることを意味する。デキストロース当量は、デンプンからの加水分解率を表す指標であり、デキストロース当量が小さい、すなわち加水分解率が小さいデキストリンには多糖成分が多く含まれる。一方、デキストロース当量が大きい、すなわち加水分解率が大きいデキストリンには、少糖類が多く含まれる。
　本発明の検出・定量方法では、まず試料に誘導体化試薬を反応させ、試料中の糖質を誘導体化する。誘導体化試薬は、ガラクトオリゴ糖を誘導体化できるものであれば特に制限されず、例えば、紫外、可視吸収または蛍光検出が可能な疎水性の誘導体が挙げられ、具体的には、１－フェニル－３－メチル－５－ピラゾロン（ＰＭＰ）、２－アミノピリジン、２－アミノベンズアミド、３－アミノキノン、４－アミノ安息香酸エチル、４－アミノ安息香酸ブチル、４－トリメチルアンモニウムアニリンが挙げられ、これらから選ばれる１種を用いることができる。中でも、ＰＭＰを用いることが、ガラクトオリゴ糖成分の分離を十分に行うためには好ましい。
　誘導体化は、例えばＰＭＰによる誘導体化であれば、試料に０．５ＭのＰＭＰのメタノール溶液と０．６ＭのＮａＯＨ溶液を加え、７０℃で３０分間反応させ、反応液に０．１Ｍ塩酸とクロロホルムを添加し、撹拌後、下層のクロロホルムを除去することで行うことができる。ガラクトオリゴ糖等の糖質は親水性であるが、疎水性の誘導体化試薬で誘導体化されたことにより、当該誘導体化部分が疎水性となるため、固定相にアルキル基を含む高速液体クロマトグラフィー用カラムに供した場合、親水性の成分に比べ、長時間カラム内に保持されることとなる。
　誘導体化処理後の試料は、高速液体クロマトグラフィーに供し、試料中のガラクトオリゴ糖成分を分離する。本発明において、高速液体クロマトグラフィーに使用するカラムには、Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラム、すなわち、固定相に炭素数３０のアルキル基（トリアコンチル基）を含むカラムを用いる。試料中のガラクトオリゴ糖を十分に分離するためには、炭素数３０のカラムを用いることが必要なためである。より具体的には、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ（野村化学株式会社）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　Ｃ３０－ＵＧ（野村化学株式会社）、Ｉｎｅｒｔｏｓｉｌ　Ｃ３０　Ｓ－Ｓｅｌｅｃｔ（ジーエルサイエンス株式会社）が挙げられる。これらの中でも二重結合があるシス型のアルキル基を有する固定相を備えるものが、ガラクトオリゴ糖の分離能の点から好ましく、具体的には、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ（野村化学株式会社）が好ましい。Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムが、ガラクトオリゴ糖成分の分離に好適な理由は、アルキル基の長さとその立体構造が、ガラクトオリゴ糖とマルトトリオース等の保持時間の変化に寄与しているものと考えられる。
　高速液体クロマトグラフィーの移動相に用いる溶出液は、カラムや装置に悪影響を与えないものであれば特に制限なく使用でき、例えば、水のみからなる溶出液、緩衝液のみからなる溶出液、水または緩衝液と極性の有機溶媒との混合液を挙げることができ、特に緩衝液と極性の有機溶媒との混合液を用いることが好ましい。緩衝液と極性の有機溶媒の混合比（ｖｏｌ／ｖｏｌ、以下、すべての混合比の単位はｖｏｌ／ｖｏｌとする）は、特に限定されるものではないが、緩衝液／極性の有機溶媒＝７９／２１～８０／２０が好ましい。これらの溶出液を用いることで、ガラクトオリゴ糖の分離が十分になされ、良好なクロマトグラムを得られるためである。また、同様の理由から、緩衝液のｐＨは、ｐＨ４～８が好ましく、特にｐＨ５～６が好ましい。
　また、緩衝液としてリン酸カリウム緩衝液、クエン酸カリウム緩衝液、ギ酸アンモニウム緩衝液および酢酸カリウム緩衝液から選ばれる少なくとも１種と、極性の有機溶媒としてアセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールから選ばれる少なくとも１種とを含む混合液を用いることが好ましく、特に、リン酸カリウム緩衝液とアセトニトリルの混合液を用いることが好ましく、リン酸カリウム緩衝液のｐＨは５～６が好ましく、リン酸カリウム緩衝液とアセトニトリルの混合比は、リン酸カリウム緩衝液／アセトニトリル＝７９／２１～８０／２０が好ましい。
　高速液体クロマトグラフィーは、市販のＨＰＬＣ装置を用いて行うことができ、カラムの平衡化や流速等の諸条件は、試料の容量等に基づき適宜設定すればよい。高速液体クロマトグラフィーを行った後、得られた画分は各種の検出器を用いて検出・定量できる。例えば、紫外吸光度検出器、可視吸光度検出器等の吸光度検出器や、各種旋光度検出器、蛍光検出器等を用いることができる。本発明では、紫外吸光度検出器を用いれば簡便であり定量の精度も高い。
　試料中のガラクトオリゴ糖の検出・定量方法としては、例えば次の手段が挙げられる。まず、４´－ＧＬ含量の判明しているガラクトオリゴ糖を含む試料に水等の溶媒を加え溶解した後、内部標準物質を適量加え、試料溶液を調製する。別途、同一のガラクトオリゴ糖と内部標準物質とを水等に溶解し、標準試験液を調製する。標準試験液は、段階希釈し、例えば１０、２０、４０倍希釈したものを準備する。次いで、試料溶液と標準試験液をＰＭＰ等の誘導体化試薬で誘導体化する。誘導体化後の試料溶液と標準試験液は、それぞれ高速液体クロマトグラフィーに供し、検出器によりクロマトグラムを得る。高速液体クロマトグラフィーの条件は、上記に示したとおりである。
　得られた標準試験液の結果から、検量線を作成する。段階希釈した各標準試験液について、ガラクトオリゴ糖の含有量を横軸、４´－ＧＬと内部標準物質の面積比を縦軸として、最小二乗法により検量線を求め、次の式（検量線）を得ることができる。
　　　面積比（ｙ）＝定数（ａ）×ガラクトオリゴ糖含有量（ｘ）
　次に、試料溶液の結果から、４´－ＧＬと内部標準物質の面積比を算出し、当該面積比を上記の検量線に代入することで、試料中のガラクトオリゴ糖含有量を算出することが可能となる。前処理段階での試料の希釈率等に即し、適宜算出結果に補足の計算を行うことで、正確なガラクトオリゴ糖含有量が定量される。
　以下、実施例を挙げて本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。
　比較例１：ゲルろ過クロマトグラフィーを用いた４´－ＧＬの定量
（１）試料溶液の調製
　ガラクトオリゴ糖液糖（オリゴメイト５５Ｎ：ヤクルト薬品工業株式会社）をガラクトオリゴ糖含量として２．３ｇ／１００ｇの割合で含み、マルトデキストリンを１．５ｇ／１００ｇの割合で含む育児用調製粉乳２．６ｇを秤量し、少量の温水を加えて溶解後、室温になるまで放置し、蒸留水を加えて２０ｍｌとし、溶解乳を作製した。溶解乳４ｍｌをメスフラスコに入れ、内部標準物質を０．１％含有する水溶液２ｍｌを正確に加え、蒸留水で２０ｍｌとし、試料溶液（粉乳１０１（ＧＯＳ添加））とした。溶解乳２０ｍｌあたりのガラクトオリゴ糖含量は、２．６ｇ×２．３/１００＝０．０５９８ｇであるから、１００ｍｌあたりでは、０．２９９ｇとなる。
　なお、育児用調製粉乳は、原材料として、乳糖、ホエイたんぱく質消化物、パーム油、全粉乳、パーム核分別油、大豆白絞油、ガラクトオリゴ糖液糖、カゼインカルシウム、マルトデキストリン（でんぷん糖化物）、精製魚油、炭酸Ｃａ、塩化Ｍｇ、レシチン、リン酸Ｋ、塩化Ｋ、リン酸Ｎａ、水酸化Ｋ、ラクトフェリン、Ｖ．Ｃ、塩化Ｃａ、ピロリン酸鉄、タウリン、Ｖ．Ｅ、硫酸亜鉛、シスチン、シチジル酸Ｎａ、ナイアシン、パントテン酸Ｃａ、Ｖ．Ａ、硫酸銅、イノシン酸Ｎａ、ウリジル酸Ｎａ、グアニル酸Ｎａ、Ｖ．Ｂ１、５’－ＡＭＰ、Ｖ．Ｂ６、Ｖ．Ｂ２、葉酸、カロテン、Ｖ．Ｄ、Ｖ．Ｂ１２を含み、その栄養成分は表１のとおりである。表１の炭水化物は、乳糖、ガラクトオリゴ糖、デキストリン、単糖を含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）プラセボ試料溶液の調製
　ガラクトオリゴ糖を含まない育児用調製粉乳として、粉乳１０１（ＧＯＳ添加）と同様の調製工程を行い、プラセボ試料溶液（粉乳１０２（プラセボ））を調製した。調製に用いた育児用調製粉乳は、ガラクトオリゴ糖液糖を含まず、マルトデキストリンを６．２ｇ／１００ｇの割合で含む以外は、原材料の組成は、試料溶液（粉乳１０１（ＧＯＳ添加））を作成した育児用調製粉乳と同じものである。粉乳１０１（ＧＯＳ添加）には、ガラクトオリゴ糖液糖由来の乳糖、ガラクトオリゴ糖、単糖が合計で４．７ｇ／１００ｇ含まれており、粉乳１０１（ＧＯＳ添加）と粉乳１０２（プラセボ）は、炭水化物量が同一である。
（３）ガラクトオリゴ糖標準試験液の調製
　ガラクトオリゴ糖液糖（オリゴメイト５５Ｎ：ヤクルト薬品工業株式会社）をガラクトオリゴ糖液糖として２．０ｇ／１００ｍｌになるように５０ｍｌ容メスフラスコに量りとり、内部標準物質を１％含有する水溶液１ｍｌを正確に加え、蒸留水を加えて５０ｍｌとし、標準試験液（ＯＭ５５Ｎ）とした。
（４）マルトデキストリン標準試験液の調製
　前記育児用調製粉乳の製造に使用したマルトデキストリン液糖（ハイマルトースシロップ）をマルトデキストリン溶液として２．０ｇ／１００ｍｌになるように５０ｍｌ容メスフラスコに量りとり、内部標準物質を１％含有する水溶液１ｍｌを正確に加え、蒸留水を加えて５０ｍｌとし、標準試験液（マルトデキストリン）とした。
（５）フィルター処理
　試験溶液、プラセボ試験溶液、ガラクトオリゴ糖標準試験液およびマルトデキストリン標準試験液を０．４５μｍフィルターで濾過し、以下のＨＰＬＣ条件で分析した。
（６）ＨＰＬＣ分析
　Ｃｏｌｕｍｎ　　　　　：ＧＰＣ（ＫＳ－８０２）（８．０×３００ｍｍ）
　Ｅｌｕｅｎｔ　　　　　：蒸留水
　Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　　：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ　　　：ＲＩ検出器（Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＥ－２０１）
　Ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐ：８０℃
　その結果、図１に示す通り、マルトデキストリンに含まれる３糖（マルトトリオース：Ｍａｌ－３）と、標準試験液（ＯＭ５５Ｎ）に含まれる３糖の４´－ＧＬは、同一の保持時間でカラムから溶出しており、ゲルろ過クロマトグラフィーではマルトデキストリン中のマルトトリオースとガラクトオリゴ糖中の４´－ＧＬのピークが重なってしまい、４´－ＧＬを定量することができなかった。
　実施例１：Ｃ３０カラムを用いたＰＭＰ誘導体―ＨＰＬＣ逆相クロマトグラム
　比較例１と同様に、育児用調製粉乳の試料溶液、プラセボ試料溶液、ガラクトオリゴ糖標準試験液、マルトデキストリン標準試験液を調製した。ガラクトオリゴ糖標準試験液は、さらに蒸留水で１０、２０、４０倍希釈した希釈液を作製した。希釈液のガラクトオリゴ糖液糖の濃度は、それぞれ０．２ｇ／１００ｍｌ、０．１ｇ／１００ｍｌ、０．０５ｇ／１００ｍｌである。
（１）ＰＭＰ誘導体化
　試料溶液、ガラクトオリゴ糖標準試験液、マルトデキストリン標準試験液のそれぞれ１００μｌをネジ口試験管に取り、０．６Ｍ ＮａＯＨ水溶液を１００μｌ加えて攪拌した。次いで、０．５Ｍ　ＰＭＰメタノール溶液を２００μｌ加えて攪拌した。７０℃で３０分加熱し、ＰＭＰ誘導体化した。室温まで冷却した後、０．１Ｍ　ＨＣｌ水溶液０．７ｍｌを加えて弱酸性とし、クロロホルムで抽出して過剰の試薬を除いた。すなわち、クロロホルム約１ｍｌを加えて、３０秒以上攪拌し、２５００ｒｐｍ、５分間遠心分離して下層のクロロホルムを除去した。同様の操作を２回繰り返した。水層を０．４５μｍフィルターで濾過し、以下のＨＰＬＣ条件で分析した。
（２）ＨＰＬＣ分析条件
　Ｃｏｌｕｍｎ　　　　　：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ（４．６×２５０ｍｍ）（Ｃ３０）
　Ｅｌｕｅｎｔ　　　　　：リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）／ＣＨ３ＣＮ（８０／２０）
　Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　　：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　：ＵＶ２４５ｎｍ
　Ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐ：３５℃
　その結果、図２の点線で示す通り、試料溶液（粉乳１０１）で検出された４´－ＧＬのピークは、プラセボ試料溶液（粉乳１０２）では検出されておらず、ＰＭＰでの誘導体化後、Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーに供することにより、４´－ＧＬとマルトトリオースを分離できることが確認された。
（３）ガラクトオリゴ糖含量の算出
　ガラクトオリゴ糖標準試験液から作製した希釈液について、上記と同様の分析条件にてＨＰＬＣに供し、内部標準物質と４´－ＧＬの面積比を用いて、ガラクトオリゴ糖液糖の検量線を作成した。ＨＰＬＣ分析の結果は表２のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ガラクトオリゴ糖液糖の含有量をｘ、面積比をｙとして、最小二乗法により検量線を求めると、検量線は、ｙ＝３．９９０９ｘであった。この検量線のｙとして、試料溶液中の内部標準物質と４´－ＧＬの面積比（０．５５２６）を代入し、試料溶液の希釈率等を勘案して、試料中のガラクトオリゴ糖量を算出した（表３）。具体的には、検量線ｙ＝３．９９０９ｘにｙ＝０．５５２６を代入すると、ｘ（試料溶液中のガラクトオリゴ糖液糖濃度）は０．１３８（ｇ／１００ｍｌ）となった。試料溶液は、溶解乳を５倍希釈したものであるため、溶解乳中のガラクトオリゴ糖液糖量は、０．１３８×５＝０．６９０（ｇ／１００ｍｌ）となる。液糖中の固形分含量は７５％、固形分中のガラクトオリゴ糖含量は、５６．４％であるため、溶解乳中のガラクトオリゴ糖含量は、０．６９０×０．７５×０．５６４＝０．２９２（ｇ／１００ｍｌ）となる。溶解乳中の育児用調製粉乳の濃度は、２．６ｇ／２０ｍｌであるため、溶解乳１００ｍｌには、１３ｇの育児用調製粉乳が含まれており、その中に０．２９２ｇ／１００ｍｌのガラクトオリゴ糖が含まれているから、育児粉乳１００ｇあたり、２．２５ｇ／１００ｇのガラクトオリゴ糖が含まれていることが算出され、ガラクトオリゴ糖の配合量（２．３ｇ／１００ｇ）とほぼ一致した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　比較例２：Ｃ８、Ｃ１８のカラムを用いたＰＭＰ誘導体－逆相ＨＰＬＣクロマトグラム
　ガラクトオリゴ糖液糖（オリゴメイト５５Ｎ：ヤクルト薬品工業株式会社）をガラクトオリゴ糖含量として２．３ｇ／１００ｇの割合で含み、マルトデキストリンを１．５ｇ／１００ｇの割合で含む育児用調製粉乳５ｇを精密に、少量の温水を加えて溶解後、室温になるまで放置した。内部標準物質を１％含有する水溶液１ｍｌを正確に加え、蒸留水を加えて５０ｍｌとし、試料溶液（粉乳１０１（ＧＯＳ添加））とした。
　また、ガラクトオリゴ糖を含まない育児用調製粉乳として、粉乳１０１（ＧＯＳ添加）と同様の調製工程を行い、プラセボ試料溶液（粉乳１０２（プラセボ））を調製した。調製に用いた育児用調製粉乳は、ガラクトオリゴ糖を含まず、マルトデキストリンを６．２ｇ／１００ｇの割合で含む以外は、原材料の組成は、試料溶液（粉乳１０１（ＧＯＳ添加））を作成した育児用調製粉乳と同じものである。
　ガラクトオリゴ糖液糖をガラクトオリゴ糖として３．０ｇ／１００ｍｌになるように５０ｍｌ容メスフラスコに量りとり、内部標準物質を１％含有する水溶液１ｍｌを正確に加え、蒸留水を加えて５０ｍｌとし、ガラクトオリゴ糖標準試験液とした。
　前記育児用調製粉乳の製造に使用したマルトデキストリン液糖（ハイマルトースシロップ）をマルトデキストリン溶液として２．０ｇ／１００ｍｌになるように５０ｍｌ容メスフラスコに量りとり、内部標準物質を１％含有する水溶液１ｍｌを正確に加え、蒸留水を加えて５０ｍｌとし、標準試験液（マルトデキストリン）とした。
　ＰＭＰ誘導体化
　試料溶液、ガラクトオリゴ糖標準試験液、マルトデキストリン標準試験液のそれぞれ１００μｌをネジ口試験管に取り、０．６Ｍ ＮａＯＨ水溶液を１００μｌ加えて攪拌した。次いで０．５Ｍ ＰＭＰ メタノール溶液を２００μｌ加えて攪拌した。７０℃で３０分加熱し、ＰＭＰ誘導体化した。室温まで冷却した後、０．１Ｍ ＨＣｌ水溶液 ０．７ｍｌを加えて弱酸性とし、クロロホルムで抽出して過剰の試薬を除いた。すなわち、クロロホルム約１ｍｌを加えて、３０秒以上攪拌し、２５００ｒｐｍ、５分間遠心分離して下層のクロロホルムを除去した。同様の操作を２回繰り返した。水層を０．４５μｍのフィルターで濾過し、下記の２つのＨＰＬＣ条件で分析した。
　ＨＰＬＣ分析条件
（１）Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣ
　Ｃｏｌｕｍｎ　　　　　：Ｉｎｅｒｔｏｓｉｌ　ＯＤＳ－３（４．６×２５０ｍｍ）（Ｃ１８逆相カラム）
　Ｅｌｕｅｎｔ　　　　　：リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）／ＣＨ３ＣＮ（８０／２０）
　Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　　：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
　Ｄｅｔｅｃｔｏｉｏｎ　：ＵＶ２４５ｎｍ
　Ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐ：３５℃
（２）Ｃ８カラムを用いたＨＰＬＣ
　Ｃｏｌｕｍｎ　　　　　：Ｉｍｔａｋｔ　ＵＫ－８（４．６×１５０ｍｍ）（Ｃ８逆相カラム）
　Ｅｌｕｅｎｔ　　　　　：リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）／ＣＨ３ＣＮ（８０／２０）
　Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　　：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ　　　：ＵＶ２４５ｎｍ
　Ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐ：３５℃
　その結果、Ｃ１８逆相クロマトグラフィー用カラムでは、４´－ＧＬとマルトトリオース（Ｍａｌ―３）は分離しているものの、４´－ＧＬと他のガラクトオリゴ糖成分のピークが重なっており、４´－ＧＬを分離することはできなかった。すなわち、図３に示すとおり、ガラクトオリゴ糖標準試験液（ＯＭ５５Ｎ）と、試料溶液（粉乳１０１）の結果において、４´－ＧＬのピークでは、頂点部の左側に別の物質のピークが重なり、段になってしまっていた。
　Ｃ８逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた場合、４´－ＧＬとマルトトリオース（Ｍａｌ―３）は分離しているものの、４´－ＧＬと他のガラクトオリゴ糖成分のピークが重なり、分離できていないことがわかる（図４）。すなわち、Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた場合（図２）と比較すると、図２では４´－ＧＬの左隣に他のガラクトオリゴ糖成分のピークがあるのに対し、図４では、当該ピークが４´－ＧＬのピークと重なり、結果的にピークが高くなっている。こうした結果から、Ｃ８、Ｃ１８カラムのいずれを用いた場合でも、４´－ＧＬを分離、定量できないことが示された。
　実施例２：ＨＰＬＣにおける溶出液の検討
　比較例２と同様に、試料溶液（粉乳１０１（ＧＯＳ添加）、粉乳１０２（プラセボ））、ガラクトオリゴ糖標準試験液およびマルトデキストリン標準試験液を調製し、それぞれを比較例２と同様にＰＭＰ誘導体化し以下６種類のＨＰＬＣ条件で分析した。
（１）緩衝液ｐＨ４の条件下でのＨＰＬＣ
　Ｃｏｌｕｍｎ　　　　　：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ（４．６×２５０ｍｍ）
　Ｅｌｕｅｎｔ　　　　　：リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ４）／ＣＨ３ＣＮ（７８／２２）
　Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　　：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　：ＵＶ２４５ｎｍ
　Ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐ：３５℃
（２）緩衝液ｐＨ５の条件下でのＨＰＬＣ
　Ｃｏｌｕｍｎ　　　　　：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ（４．６×２５０ｍｍ）
　Ｅｌｕｅｎｔ　　　　　：リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５）／ＣＨ３ＣＮ（７９／２１）
　Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　　：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　：ＵＶ２４５ｎｍ
　Ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐ：３５℃
（３）緩衝液ｐＨ７の条件下でのＨＰＬＣ
　Ｃｏｌｕｍｎ　　　　　：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ（４．６×２５０ｍｍ）
　Ｅｌｕｅｎｔ　　　　　：リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）／ＣＨ３ＣＮ（８１／１９）
　Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　　：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　：ＵＶ２４５ｎｍ
　Ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐ：３５℃
（４）緩衝液ｐＨ７の条件下でのＨＰＬＣ
　Ｃｏｌｕｍｎ　　　　　：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ（４．６×２５０ｍｍ）
　Ｅｌｕｅｎｔ　　　　　：リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）／ＣＨ３ＣＮ（８２／１８）
　Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　　：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　：ＵＶ２４５ｎｍ
　Ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐ：３５℃
（５）緩衝液ｐＨ８の条件下でのＨＰＬＣ
　Ｃｏｌｕｍｎ　　　　　：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ（４．６×２５０ｍｍ）
　Ｅｌｕｅｎｔ　　　　　：リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）／ＣＨ３ＣＮ（８２／１８）
　Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　　：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　：ＵＶ２４５ｎｍ
　Ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐ：３５℃
（６）緩衝液ｐＨ８の条件下でのＨＰＬＣ
　Ｃｏｌｕｍｎ　　　　　：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ（４．６×２５０ｍｍ）
　Ｅｌｕｅｎｔ　　　　　：リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）／ＣＨ３ＣＮ（８３／１７）
　Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　　：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　：ＵＶ２４５ｎｍ
　Ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐ：３５℃
　実施例１の結果から、ｐＨ６のリン酸カリウム緩衝液を用いた場合には、４´－ＧＬが分離できており、ガラクトオリゴ糖の定量が可能であった。これに対し、図５、７～１０に示すとおり、ｐＨ４、７、８のリン酸カリウム緩衝液を用いた場合には、４´－ＧＬと他のガラクトオリゴ糖成分のピークが重なってしまい、４´－ＧＬを分離・定量できなかった。すなわち、図２では４´－ＧＬの左隣に他のガラクトオリゴ糖成分のピークがあるのに対し、ｐＨ４のリン酸カリウム緩衝液を用いた場合には、ＯＭ５５Ｎのクロマトグラムでは、当該ピークが１つであり４´－ＧＬを分離できていない（図５）。
　また、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）とＣＨ３ＣＮを８１／１９の割合とした溶出液を用いた場合（図７）、ＯＭ５５Ｎのクロマトグラムでは、４´－ＧＬのピークの頂点部の右側に他のガラクトオリゴ糖成分のピークが重なり、結果として４´－ＧＬのピークの面積が大きくなっている。
　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）とＣＨ３ＣＮを８２／１８の割合とした溶出液を用いた場合（図８）、ＯＭ５５Ｎのクロマトグラムでは、本来４´－ＧＬの左隣に検出されるピークがなく、当該ピークと４´－ＧＬのピークが重なっている。
　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）とＣＨ３ＣＮを８２／１８の割合とした溶出液を用いた場合（図９）、あるいは８３：１７の割合とした溶出液を用いた場合（図１０）、ＯＭ５５Ｎとマルトデキストリンのクロマトグラムを比較すると、４´－ＧＬは、マルトトリオース、その他のオリゴ糖成分と分離できているが、ＯＭ５５Ｎとプラセボ試料溶液（粉乳１０２）のクロマトグラムを比較すると、４´－ＧＬのピークと、粉乳１０２に含まれている成分のピークが一致しており、４´－ＧＬのみを分離できていないことがわかる。
　一方、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５）とＣＨ３ＣＮを７９／２１の割合とした溶出液を用いた場合（図６）、４´－ＧＬは、マルトトリオースおよび他のガラクトオリゴ糖成分と分離できていた。
　実施例３：栄養食品を試料とした場合のＰＭＰ誘導体－逆相ＨＰＬＣクロマトグラム（Ｃ３０）
　表４に示す原材料を混合し、栄養食品を調製した。この栄養食品１０ｇに蒸留水を加えて５０ｍｌとした後、２００００ｇ×３０分で遠心分離し、さらに２００００ｇ×３０分で遠心分離した。遠心分離後には栄養食品は、下層、中間層、上層の３層に分離していた。その中間層を分取し、当該分取した試料を０．４５μｍのフィルターでろ過した。別途、標準試料としてガラクトオリゴ糖標準試験液をオリゴメイト５５（ヤクルト薬品工業株式会社）を用いて、比較例１と同様に調製した。ろ過した試料とガラクトオリゴ糖標準試験液のそれぞれ１００μｌをネジ口試験管に取り、減圧乾固した。内部標準物質を０．０２％含有する水溶液１００μｌを加え、０．５ＭのＰＭＰメタノール溶液を２００μｌ加えて撹拌した。次いで７０℃で３０分加熱し、ＰＭＰ誘導体化し、以下のＨＰＬＣ条件で分析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＨＰＬＣ分析条件
　Ｃｏｌｕｍｎ　　　　　：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＲＰＡＱＵＥＯＵＳ（４．６×２５０ｍｍ）
　Ｅｌｕｅｎｔ　　　　　：リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）／ＣＨ３ＣＮ（８０／２０）
　Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　　：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　：ＵＶ２４５ｎｍ
　Ｃｏｌｕｍｎ　ｔｅｍｐ：３５℃
　その結果、図１１に示すとおり、４´－ＧＬのピークは、保持時間２４．３２４分で出現し、サンプルに含まれるその他の成分から分離されたことが判明した。なお、４´－ＧＬのピークが、保持時間２４．３２４分に出現することは、同一のＨＰＬＣ分析条件にて、ガラクトオリゴ糖標準試験液を分析し、確認済みである。
　本発明の検出・定量方法によれば、試料中のガラクトオリゴ糖と他の成分とを簡易、低コストに分離し、正確にガラクトオリゴ糖の定量を行うことができるため、当該試料中に含まれるガラクトオリゴ糖の量を正確に管理できるとともに、各種有効性試験データの取得、表示などを正確に行うことが可能となる。

Claims (9)

  1. 　ガラクトオリゴ糖とデキストリンを含む試料中のガラクトオリゴ糖を検出・定量する方法であって、前記試料を誘導体化試薬と反応させ、試料中のデキストリンおよびガラクトオリゴ糖を誘導体化し、次いで、Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより当該試料中のガラクトオリゴ糖成分を分離することを特徴とするガラクトオリゴ糖の検出・定量方法。
  2. 　高速液体クロマトグラフィーで用いる溶出液として、緩衝液と極性の有機溶媒の混合液を用いることを特徴とする請求項１に記載のガラクトオリゴ糖の検出・定量方法。
  3. 　前記緩衝液として、ｐＨ５～６の緩衝液を用いることを特徴とする請求項２に記載のガラクトオリゴ糖の検出・定量方法。
  4. 　前記混合液の緩衝液と極性の有機溶媒の混合比（ｖｏｌ／ｖｏｌ）が、緩衝液／極性の有機溶媒＝７９／２１～８０／２０であることを特徴とする請求項２または３に記載のガラクトオリゴ糖の検出・定量方法。
  5. 　前記混合液の調製に用いる緩衝液として、リン酸カリウム緩衝液、クエン酸カリウム緩衝液、ギ酸アンモニウム緩衝液および酢酸カリウム緩衝液から選ばれる少なくとも１種を用い、極性の有機溶媒として、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールから選ばれる少なくとも１種を用いることを特徴とする請求項２～４のいずれか１項に記載のガラクトオリゴ糖の検出・定量方法。
  6. 　ガラクトオリゴ糖とデキストリンを含む試料が、飲食品である請求項１～５のいずれか１項に記載のガラクトオリゴ糖の検出・定量方法。
  7. 　分離されるガラクトオリゴ糖成分が、４´－ガラクトシルラクトースであることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載のガラクトオリゴ糖の検出・定量方法。
  8. 　誘導体化試薬として、１－フェニル－３－メチル－５－ピラゾロン、２－アミノピリジン、２－アミノベンズアミド、３－アミノキノン、４－アミノ安息香酸エチル、４－アミノ安息香酸ブチル、４－トリメチルアンモニウムアニリンから選ばれる１種を用いることを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載のガラクトオリゴ糖の検出・定量方法。
  9. 　Ｃ３０逆相クロマトグラフィー用カラムが、二重結合があるシス型のアルキル基を有する固定相を備えるものであることを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載のガラクトオリゴ糖の検出・定量方法。
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