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WO2015046229A1 - 多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法 - Google Patents

多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法 Download PDF

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WO2015046229A1
WO2015046229A1 PCT/JP2014/075248 JP2014075248W WO2015046229A1 WO 2015046229 A1 WO2015046229 A1 WO 2015046229A1 JP 2014075248 W JP2014075248 W JP 2014075248W WO 2015046229 A1 WO2015046229 A1 WO 2015046229A1
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protein
sendai virus
vector
mutation
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浩志 伴
章博 飯田
長谷川　護
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Dnavec Corp
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    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system

Definitions

  • the present invention relates to a method for improving the induction efficiency of pluripotent stem cells.
  • the present invention also relates to a gene transfer vector, a gene transfer composition used in the induction of pluripotent stem cells, and use thereof.
  • the present invention increases the induction efficiency of pluripotent stem cells in the induction of pluripotent stem cells including the step of introducing a vector containing the KLF gene, OCT gene, and SOX gene in one vector in this order. It is related to the technology.
  • induced pluripotent stem (iPS) cells also called induced pluripotent stem cells or induced pluripotent stem cells
  • IPS cells have been produced by introducing reprogramming factors in various mammalian cells including mice
  • iPS cells use retroviral vectors to introduce reprogramming factors, but retroviral vectors are limited in their use due to the risk of tumor development due to integration into the host genome (Non-Patent Documents).
  • adenoviral vectors and plasmids To solve this problem, attempts have been made to induce iPS cells using adenoviral vectors and plasmids. However, as long as DNA-type vectors are used, the concern for integration into the genome should be completely eliminated. I can't. Moreover, the induction efficiency of iPS cells by these vectors is extremely low (Non-Patent Document 10-13).
  • the present inventors have previously developed a system for inducing iPS cells using a Sendai virus vector, which is one of RNA-type viruses (Patent Documents 1, 2). ).
  • the induction efficiency of iPS cells using the Sendai virus vector was significantly higher than when other vectors were used.
  • Sendai virus vectors do not have a DNA phase in the life cycle and have no concern of being integrated into the host genome, so that they are excellent in safety and easy to remove after induction of iPS cells.
  • the technique of the present invention that further increases the induction efficiency of iPS cells is not known.
  • the present invention relates to a method for improving the induction efficiency of pluripotent stem cells.
  • Another object of the present invention is to provide a gene transfer vector, a gene transfer composition used in the induction of pluripotent stem cells, and use thereof.
  • the present invention increases the induction efficiency of pluripotent stem cells in the induction of pluripotent stem cells including the step of introducing a vector containing the KLF gene, OCT gene, and SOX gene in one vector in this order. And a gene transfer vector and a composition used therefor.
  • the present inventors include a step of introducing a vector comprising a KLF gene, an OCT gene, and a SOX gene, which are reprogramming factors, into one vector in this order.
  • a temperature-sensitive vector as this vector
  • culturing at a low temperature (36 ° C.) after introducing the vector leads to pluripotent stem cells with relatively high efficiency
  • 37 ° C. which is a normal cell culture temperature
  • the induction efficiency of pluripotent stem cells may be significantly reduced.
  • temperature-sensitive vectors are excellent in that they can be removed rapidly after induction of pluripotent stem cells, in order to efficiently induce pluripotent stem cells in this way, it is necessary to culture at low temperature after introducing the vector There was a problem that there was.
  • the inventors diligently searched for a method that can induce pluripotent stem cells with high efficiency without using a temperature-sensitive Sendai virus vector and without culturing at a low temperature after introducing the vector.
  • a vector containing the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene in one vector in this order is introduced, a vector that contains the KLF gene but does not contain the OCT gene and the SOX gene is introduced at a low temperature. It has been found that the induction efficiency of pluripotent stem cells can be significantly increased without culturing in the above.
  • the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene are contained in these vectors, rather than the combination of a vector containing the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene in this order in combination with a vector that expresses only the MYC gene.
  • the present invention relates to a method for improving the induction efficiency of pluripotent stem cells in the induction of pluripotent stem cells including the step of introducing a vector comprising a KLF gene, an OCT gene, and a SOX gene in one vector in this order, and The present invention relates to gene transfer vectors and compositions used for that purpose, and more specifically to the inventions described in the respective claims.
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector containing the KLF gene, OCT gene, and SOX gene in this order in one vector is a mutation of G69E, T116A, and A183S in the M protein, and A262T, G264R, and K461G in the HN protein.
  • Sendai virus vector containing the KLF gene but not the OCT gene and SOX gene is a mutation of G69E, T116A, and A183S in the M protein, A262T, G264R, and K461G mutations in the HN protein, and L511F mutation in the P protein.
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector into which the MYC gene is inserted is a mutation of G69E, T116A, and A183S in the M protein, a mutation of A262T, G264R, and K461G in the HN protein, and D433A, R434A, K437A, and The method according to [5], wherein the L511F mutation is an F gene-deleted Sendai virus vector containing the L1361C, L1558I, N1197S, and K1795E mutations in the L protein.
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector containing the KLF gene, OCT gene, and SOX gene in this order in one vector is a mutation of G69E, T116A, and A183S in the M protein, and A262T, G264R, and K461G in the HN protein.
  • Sendai virus vector containing KLF gene but not OCT gene and SOX gene is a mutation of G69E, T116A, and A183S in M protein, A262T, G264R, and K461G mutation in HN protein, L511F mutation in P protein
  • the L protein is an F gene-deficient Sendai virus vector containing N1197S and K1795E mutations.
  • a composition for inducing pluripotent stem cells (A) a temperature-sensitive Sendai virus vector containing a KLF gene, an OCT gene, and a SOX gene in this order in one vector; and (b) a Sendai virus vector containing the KLF gene but not the OCT gene and SOX gene.
  • composition for inducing pluripotent stem cells, (A) A temperature-sensitive Sendai virus vector containing a KLF gene, an OCT gene, and a SOX gene in this order in one vector, wherein the M protein has G69E, T116A, and A183S mutations, and the HN protein has A262T, G264R, and K461G mutation, P433 protein D433A, R434A, K437A, and L511F mutation, and L protein N1197S and K1795E mutation-containing Sendai virus vector, and (b) KLF gene, OCT gene and SOX gene Sendai virus vector that does not contain G, mutations of G69E, T116A, and A183S in the M protein, mutations of A262T, G264R, and K461G in the HN protein, mutations of L511F in the P protein, and mutations of N1197S and K1795E in the L protein F gene deletion type Sendai virus vector,
  • a kit for inducing pluripotent stem cells (A) a temperature-sensitive Sendai virus vector containing a KLF gene, an OCT gene, and a SOX gene in this order in one vector; and (b) a Sendai virus vector containing the KLF gene but not the OCT gene and SOX gene.
  • kit [17] A kit for inducing pluripotent stem cells, (A) A temperature-sensitive Sendai virus vector containing a KLF gene, an OCT gene, and a SOX gene in this order in one vector, wherein the M protein has G69E, T116A, and A183S mutations, and the HN protein has A262T, G264R, and K461G mutation, P433 protein D433A, R434A, K437A, and L511F mutation, and L protein N1197S and K1795E mutation-containing Sendai virus vector, and (b) KLF gene, OCT gene and SOX gene Sendai virus vector that does not contain G, mutations of G69E, T116A, and A183S in the M protein, mutations of A262T, G264R, and K461G in the HN protein, mutations of L511F in the P protein, and mutations of N1197S and K1795E in the L protein F gene deletion type Sendai virus vector,
  • the kit according to [18] further comprising an F gene-deleted Sendai virus vector comprising the L511F mutation, and the L protein containing the L1361C, L1558I, N1197S, and K1795E mutations in the L protein.
  • the induction efficiency of pluripotent stem cells using a vector containing the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene in this order can be significantly improved.
  • the use of temperature-sensitive vectors enables rapid removal of vectors after induction of pluripotent stem cells, and can induce pluripotent stem cells with high efficiency without performing culture at low temperatures. It is useful in.
  • the induction efficiency of pluripotent stem cells from human adult skin-derived fibroblasts was shown. Each condition is the same as FIG. It is a figure which shows the induction
  • the result of infecting human fetal lung cell-derived fibroblast (MRC-5) vector and staining cells on day 28 with alkaline phosphatase is shown. It is a figure which shows the induction
  • Each condition is the same as FIG.
  • the present invention includes a KLF gene and does not include an OCT gene and a SOX gene in the induction of pluripotent stem cells including a step of introducing a vector comprising a KLF gene, an OCT gene, and a SOX gene in one vector in this order.
  • the present invention relates to a method for increasing the induction efficiency of pluripotent stem cells, which further comprises the step of introducing a vector. More specifically, the method of the present invention relates to a pluripotent stem cell in a method of inducing a pluripotent stem cell by introducing a temperature sensitive viral vector containing a KLF gene, an OCT gene, and a SOX gene in one vector in this order.
  • the method further comprises the step of further introducing a viral vector containing the KLF gene and not containing the OCT gene and the SOX gene.
  • the culture after the introduction of the vector need not be performed at a low temperature (eg, less than 36.5 ° C., more specifically, eg, 36 ° C. or less). That is, the method of the present invention can induce pluripotent stem cells with high efficiency without using low-temperature culture (eg, culturing at less than 36.5 ° C.) while using a temperature-sensitive mutant vector. It is excellent in that the vector disappears promptly after induction.
  • the present invention provides a pluripotent stem cell in a method for introducing a temperature-sensitive Sendai virus vector containing a KLF gene, an OCT gene, and a SOX gene in one vector in this order and inducing pluripotent stem cells without low-temperature culture.
  • induction of pluripotent stem cells includes production of pluripotent stem cells, and improvement of induction efficiency of pluripotent stem cells includes improvement of production efficiency of pluripotent stem cells.
  • the MYC gene can be introduced using, for example, a temperature sensitive virus vector, preferably a temperature sensitive Sendai virus vector.
  • a vector containing a KLF gene, an OCT gene, and a SOX gene in this order in one vector, and a vector containing the KLF gene and not containing the OCT gene and the SOX gene are differentiated into differentiated cells such as somatic cells.
  • a method of reprogramming a cell comprising the step of introducing or contacting is provided.
  • the present invention is also a method for introducing the above-mentioned reprogramming factor gene in cell reprogramming, wherein the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene are combined into one vector in this order.
  • a method comprising introducing these reprogramming factor genes using a vector comprising a KLF gene and not comprising an OCT gene and a SOX gene, and a composition comprising the vector for use in the method provide.
  • a pluripotent stem cell refers to a stem cell produced from an inner cell mass of an embryo at the blastocyst stage of an animal or a cell having a phenotype similar to it.
  • the pluripotent stem cell induced in the present invention is a cell that expresses alkaline phosphatase, which is an indicator of ES-like cells.
  • ES-like cells refer to pluripotent stem cells having properties and / or morphology similar to ES cells.
  • the pluripotent stem cells are cultured to form a flat colony composed of cells having a higher nucleus capacity ratio than the cytoplasm. You may culture
  • pluripotent stem cells can be passaged for a long time, for example, 15 times or more, preferably 20 times or more every 3 days. It can be confirmed that the growth is not lost even after passage 25 times or more, 30 times or more, 35 times or more, or 40 times or more.
  • the pluripotent stem cells preferably express endogenous OCT3 / 4 or Nanog, more preferably both.
  • the pluripotent stem cell preferably expresses TERT and exhibits telomerase activity (activity for synthesizing telomeric repeat sequences).
  • the pluripotent stem cell preferably has the ability to differentiate into three germ layers (endoderm, mesoderm, ectoderm) (for example, it can be confirmed in teratoma formation and / or embryoid body formation). More preferably, pluripotent stem cells generate germline chimeras by transplanting into blastocysts. A pluripotent stem cell capable of Germline transmission is called a germline-competent pluripotent stem cell. Confirmation of these phenotypes can be performed by a well-known method (WO2007 / 69666; Ichisaka T et al., Nature 448 (7151): 313-7, 2007).
  • the term “differentiated” means that the differentiation stage has progressed more than before, for example, it may be differentiated more than pluripotent stem cells, and it still has the ability to differentiate into multiple cell lineages. State (for example, somatic stem cells) and a terminally differentiated state. Differentiated cells are cells derived from pluripotent stem cells (other than pluripotent stem cells). Differentiated cells may have no ability to differentiate into, for example, three germ layers (endoderm, mesoderm, ectoderm). Such cells do not have the ability to form three germ layers unless reprogrammed. The differentiated cells may be cells that cannot generate cells other than the germ layer type to which the cells belong, for example. Differentiated cells may be somatic cells, for example, cells other than germ cells.
  • reprogramming means that a certain cell is differentiated from the undifferentiated state.
  • a differentiated cell is dedifferentiated, for example, has pluripotency. Inducing cells with no cells, such as pluripotent stem cells.
  • dedifferentiation means that a certain cell is in an immature (eg, undifferentiated) state. Dedifferentiation may mean returning to the initial or developing state in which a cell has differentiated.
  • dedifferentiation may be a state in which cells that cannot generate cells other than the germ layer type to which they belong can be differentiated into cells of other germ layers. Dedifferentiation includes, for example, that a cell having no ability to differentiate from three germ layers acquires the ability to differentiate from three germ layers. Dedifferentiation also includes the generation of pluripotent stem cells.
  • somatic cells are cells other than pluripotent stem cells and germ cells, for example.
  • Somatic cells include, for example, cells other than pluripotent stem cells among cells constituting multicellular organisms, and cultured cells thereof.
  • Somatic cells include, for example, somatic stem cells and terminally differentiated cells.
  • low temperature culture means culturing at a temperature lower than 36.5 ° C.
  • the low temperature culture is less than 36.4 ° C, more preferably 36.3 ° C, 36.2 ° C, 36.1 ° C, 36 ° C, 35.9 ° C, 35.8 ° C, 35.7 ° C, 35.6 ° C, 35.5 ° C, 35.4 ° C, 35.3 ° C, 35.2 ° C, 35.1
  • the lower limit is, for example, 30 ° C, preferably 31 ° C, more preferably 32 ° C, 33 ° C, or 34 ° C.
  • about 37 ° C. means specifically 36.5 to 37.5 ° C., preferably 36.6 to 37.4 ° C., more preferably 36.7 ° C. to 37.3 ° C.
  • the temperature sensitivity means that the activity is significantly reduced at a normal cell culture temperature (for example, 37 to 38 ° C.) as compared with a low temperature kit (for example, 30 to 36 ° C.). More preferably, it means that the activity is significantly reduced at 37 ° C compared to 36 ° C.
  • a temperature-sensitive vector means that the expression level at a normal cell culture temperature (eg, 37-38 ° C.) is significantly lower than the expression level under low temperature (eg, 30-36 ° C.).
  • Sendai virus TS 7 (L protein Y942H / L1361C / L1558I mutation), TS 12 (P protein D433A / R434A / K437A mutation, TS 13 (P protein D433A / R434A / K437A mutation and L protein L1558I mutation, Mutations such as TS 14 (P protein D433A / R434A / K437A mutation and L protein L1361C), TS 15 (P protein D433A / R434A / K437A mutation and L protein L1361C / L1558I) are temperature-sensitive mutations.
  • the vector is preferably a viral vector.
  • a viral vector is a vector having a genomic nucleic acid derived from the virus and capable of expressing the gene by incorporating a transgene into the nucleic acid.
  • the Sendai virus vector is a non-chromosomal viral vector, and since the vector is expressed in the cytoplasm, there is no risk that the transgene is integrated into the host chromosome (nucleus-derived chromosome). Therefore, it is highly safe and the vector can be removed after reprogramming is completed.
  • the Sendai virus vector is an infectious virus particle, a virus core, a complex of a virus genome and a virus protein, or a complex composed of a non-infectious virus particle.
  • Complexes with the ability to express the onboard gene are included.
  • a ribonucleoprotein virus core
  • NP, P, and L proteins Sendai virus proteins
  • NP, P, and L proteins Sendai virus proteins
  • the introduction into the cells may be appropriately performed using a transfection reagent or the like.
  • RNP ribonucleoprotein
  • Sendai virus belongs to the Paramyxoviridae family (including Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, and Pneumovirus), and is a single negative chain (encoding a viral protein).
  • RNA of the sense strand (antisense strand) is included as a genome.
  • Negative strand RNA is also called negative strand RNA.
  • Paramyxoviridae viruses other than Sendai virus include Newcastle disease virus, Mumps virus, Measles virus, RS virus (Respiratory syncytial virus), Rinderpest virus (rinderpest virus), distemper virus (distemper virus), simian parainfluenza virus (SV5), human parainfluenza virus type 1,2,3, orthomyxoviridae influenza virus (Influenza virus), rhabdoviridae ( Rhabdoviridae) vesicular stomatitis virus (Vesicular stomatitis virus), rabies virus (Rabies virus) and the like, more specifically, for example, Sendai virus (SeV), human parainfluenza virus-1 (HPIV-1), human parainfluenza virus-3 (HPIV-3), phocine distemper virus (PDV), canine distemper vi rus (CDV), dolphin molbillivirus (DMV), peste-des-petits-ruminants virus (PD
  • Sendai virus SeV
  • human parainfluenza virus-1 HPIV-1
  • human parainfluenza virus-3 HPIV-3
  • phocine distemper virus PDV
  • canine distemper virus CDV
  • dolphin molbillivirus DMV
  • Peste-des-petits-ruminants virus PDPR
  • melesles virus MV
  • rinderpest virus RSV
  • Hendra virus Hendra
  • accession number of the nucleotide sequence database of each gene of Sendai virus is M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218 for the NP gene, M30202, M30203, M30204, M55565, M69046 X00583, X17007, X17008, M gene D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056 , X02131, HN gene, D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131, and L gene are D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, and X58886.
  • viral genes encoded by other viruses are as follows: CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025 Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; SV5, M81442; SV5, M81442; DMV, Z47758; HPIV-l, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, V68311 M30202; SV5, AF052755; and Tu
  • the Sendai virus vector of the present invention has 90% or more, preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity with the coding sequence of any of the above viral genes.
  • Including a nucleotide sequence having The Sendai virus vector of the present invention is, for example, 90% or more, preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, with the amino acid sequence encoded by any of the above viral gene coding sequences, Or a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having 99% or more identity.
  • Sendai virus vector of the present invention for example, in the amino acid sequence encoded by the coding sequence of any of the above viral genes, preferably within 10, preferably within 9, within 8, within 7, within 6, A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence in which 5 amino acids, 4 amino acids, 3 amino acids, 2 amino acids, or 1 amino acid is substituted, inserted, deleted, and / or added is included.
  • sequences to which database accession numbers such as base sequences and amino acid sequences described in this specification are referenced refer to, for example, sequences on the filing date and priority date of the present application. It is possible to specify as a sequence at any point of time, preferably as a sequence as of the filing date of the present application. The sequence at each time point can be specified by referring to the revision history of the database.
  • the Sendai virus vector used in the present invention may be a derivative, and the derivative includes a virus whose virus gene has been modified, a virus that has been chemically modified, and the like so as not to impair the gene transfer ability by the virus.
  • Sendai virus may also be derived from natural strains, wild strains, mutant strains, laboratory passage strains, and artificially constructed strains.
  • the Z strain Medical Journal Osaka University Vol.6, No.1, March 1955 p1-15. That is, as long as the target reprogramming can be induced, the virus may be a virus vector having the same structure as a virus isolated from nature, or a virus artificially modified by genetic recombination. .
  • any gene possessed by the wild-type virus may be mutated or defective. It is also possible to use incomplete viruses such as DI particles (J. Virol. 68: 8413-8417, 1994).
  • a virus having a mutation or deletion in at least one gene encoding a viral envelope protein or outer shell protein can be preferably used.
  • a viral vector is, for example, a viral vector that can replicate the genome in infected cells but cannot form infectious viral particles.
  • Such a transmission ability-deficient virus vector is highly safe because there is no concern of spreading infection around it.
  • viral vectors that do not contain at least one gene encoding an envelope protein or spike protein such as F and / or HN, or combinations thereof can be used (WO00 / 70055 and WO00 / 70070; Li, H -O. Et al., J. Virol. 74 (14) 6564-6569 (2000)).
  • proteins necessary for genome replication are encoded in genomic RNA
  • the genome can be amplified in infected cells.
  • a defective virus for example, a defective gene product or a protein capable of complementing it is supplied exogenously in virus-producing cells (WO00 / 70055 and WO00 / 70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74 (14) 6654-6569 (2000)).
  • a method for recovering a viral vector as a non-infectious viral particle (VLP) without completely complementing a defective viral protein is also known (WO00 / 70070).
  • VLP non-infectious viral particle
  • the vector can be produced without complementing the envelope protein.
  • the present invention provides a method for gene transfer in reprogramming, a method for producing reprogrammed cells, a composition therefor, and a kit, particularly using a Sendai virus vector having a mutation and / or deletion in the viral gene.
  • a large number of mutations including an attenuation mutation and a temperature-sensitive mutation are known in envelope proteins and outer shell proteins.
  • Sendai virus having these mutant protein genes can be preferably used in the present invention.
  • a vector with reduced cytotoxicity can be desirably used. Cytotoxicity can be measured, for example, by quantifying the release of lactate dehydrogenase (LDH) from cells.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • a vector whose cytotoxicity is significantly attenuated compared to the wild type can be used.
  • the degree of attenuation of cytotoxicity is, for example, a culture in which human-derived HeLa cells (ATCC CCL-2) or monkey-derived CV-1 cells (ATCC CCL 70) are infected with MOI (infection titer) 3 and cultured for 3 days.
  • a vector in which the amount of LDH released in the liquid is significantly reduced compared to the wild type, for example, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 40% or more, or 50% or more can be used.
  • mutations that reduce cytotoxicity include temperature-sensitive mutations.
  • a temperature-sensitive mutation is a mutation whose activity is significantly reduced at a normal temperature (eg, 37 ° C. to 38 ° C.) of a virus host compared to a low temperature cocoon (30 ° C. to 36 ° C., eg, 30 ° C. to 32 ° C.). .
  • a protein having a temperature-sensitive mutation is convenient because a virus can be produced at an allowable temperature (low temperature).
  • a viral vector having a temperature-sensitive mutation useful in the present invention has a growth rate or gene expression level of at least 1/2 or less when infected at 37 ° C., for example, compared to when cultured cells are infected at 32 ° C. It is preferably 1/3 or less, more preferably 1/5 or less, more preferably 1/10 or less, and more preferably 1/20 or less.
  • the Sendai virus vector used in the present invention may be wild type as long as it does not inhibit reprogramming, expresses a reprogramming factor, and thereby induces or assists in reprogramming, and preferably at least one, more Preferably there are deletions or mutations in at least 2, 3, 4, 5, or more viral genes. Deletions and mutations may be introduced in any combination for each gene.
  • the mutation may be a reduced function mutation or a temperature-sensitive mutation, and preferably, at least at 37 ° C., the virus particle-forming ability (non-propagation type) compared to a wild type or a virus not having the mutation.
  • NTVLP nontransmissible virus-like particle
  • the mutation reduces the expression level of the gene to 1/2 or less, more preferably 1/3 or less, more preferably 1/5 or less, more preferably 1/10 or less, more preferably 1/20 or less.
  • Use of such modified viral vectors can be particularly useful for the induction of pluripotent stem cells.
  • the Sendai virus vector suitably used in the present invention at least two viral genes are deleted or mutated.
  • Such viruses have at least two viral genes deleted, at least two viral genes mutated, at least one viral gene mutated and at least one viral gene deleted Is included.
  • the at least two viral genes that are mutated or deleted are preferably genes that encode envelope-constituting proteins.
  • a vector lacking the F gene and further lacking the M and / or HN gene or further having a mutation in the M and / or HN gene (for example, an NTVLP formation-inhibiting mutation and / or a temperature sensitive mutation) It is suitably used in the invention.
  • a vector in which the F gene is deleted, the M or HN gene is further deleted, and the remaining M and / or HN gene is further mutated is also present. It is suitably used in the invention.
  • At least three viral genes are deleted or mutated.
  • Such viral vectors have at least 3 genes deleted, at least 3 genes mutated, at least 1 gene mutated and at least 2 genes deleted And those in which at least two genes are mutated and at least one gene is deleted.
  • a vector that lacks the F gene and further lacks the M and HN genes, or further has a mutation in the M and HN genes (for example, an NTVLP formation-suppressing mutation and / or a temperature sensitive mutation) Is preferably used in the present invention.
  • a vector in which the F gene is deleted, the M or HN gene is further deleted, and the remaining M or HN gene further has a mutation is preferable in the present invention. Used for.
  • a mutant virus can be prepared according to a known method.
  • preferable mutations in the M gene of Sendai virus include amino acid substitution at a site arbitrarily selected from the group consisting of positions 69 (G69), 116 (T116), and 183 (A183) in the M protein.
  • Sendai virus M protein has a genome encoding a mutant M protein in which any of the above three sites, preferably a combination of any two sites, and more preferably all of the three sites are replaced with other amino acids.
  • Viruses are preferably used in the present invention.
  • the amino acid mutation is preferably a substitution with another amino acid having a different side chain chemistry, such as BLOSUM62 matrix (Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) is substituted with an amino acid having a value of 3 or less, preferably 2 or less, more preferably 1 or less, more preferably 0.
  • Sendai virus M protein G69, T116, and A183 can be replaced with Glu (E), Ala (A), and Ser (S), respectively.
  • the introduction of mutation may be carried out according to a known mutation introduction method using, for example, an oligonucleotide.
  • Examples of preferable mutations in the HN gene include amino acid substitution at a site arbitrarily selected from the group consisting of positions 262 (A262), 264 (G264), and 461 (K461) of the Sendai virus HN protein. (Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246).
  • a virus having a genome encoding a mutant HN protein in which any one of the three sites, preferably a combination of any two sites, more preferably amino acids in all three sites are substituted with other amino acids, is used in the present invention.
  • the substitution of amino acids is preferably substitution with other amino acids having different side chain chemical properties.
  • A262, G264, and K461 of Sendai virus HN protein are replaced with Thr) (T), Arg (R), and Gly (G) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , respectively.
  • mutations can be introduced into amino acids 464 and 468 of the HN protein (Wright, K. E. et al., Virus Res. 2000: 67 ; 49-57).
  • Sendai virus may have a mutation in the P gene and / or L gene.
  • mutations include mutation of the 86th Glu (E86) of the SeV P protein and substitution of the SeV P protein with the other amino acid of the 511st Leu (L511).
  • the substitution of amino acids is preferably substitution with other amino acids having different side chain chemical properties.
  • Specific examples include substitution of the 86th amino acid with Lys and substitution of the 511st amino acid with Phe.
  • the substitution of the 1197th Asn (N1197) and / or the 1795th Lys (K1795) of the SeV L protein with other amino acids can be mentioned. Substitution with other amino acids having different chemical properties is preferred.
  • the L gene includes substitution of the SeV L protein with the other amino acids of the 1214th Tyr (Y1214) and / or the 1602nd Met (M1602). Substitution with other amino acids with different chemical properties is preferred. Specific examples include substitution of amino acid 1214 with Phe, substitution of amino acid 1602 with Leu, and the like.
  • the mutations exemplified above can be arbitrarily combined.
  • Sendai virus vector in which at least L at position 1, N at position 1197 and K at position 1795 of each protein are substituted with other amino acids, and F gene is deleted or deleted, and cytotoxicity is F gene-deficient or deleted Sendai virus vectors that are similar to or less than and / or suppress NTVLP formation at 37 ° C. or more are expressed in this invention as nuclear reprogramming factors Therefore, it is particularly suitable.
  • substitutions include, for example, substitution of G69E, T116A, and A183S for M protein, substitution of A262T, G264R, and K461G for HN protein, substitution of L511F for P protein, and L As for proteins, N1197S and K1795E substitutions can be mentioned.
  • L protein mutations include substitution of amino acids at sites arbitrarily selected from positions 942 (Y942), 1361 (L1361), and 1558 (L1558) of SeV L protein. .
  • the substitution of amino acids is preferably substitution with other amino acids having different side chain chemical properties. Specific examples include substitution of the 942nd amino acid with His, substitution of the 1361st amino acid with Cys, substitution of the 1558th amino acid with Ile, and the like.
  • L protein substituted at least at positions 942 or 1558 can be used preferably.
  • a mutant L protein in which the 1361 position is substituted with another amino acid in addition to the 1558 position is also suitable.
  • a mutant L protein in which positions 1558 and / or 1361 are substituted with other amino acids is also suitable. These mutations can increase the temperature sensitivity of the L protein.
  • mutations in the P protein include substitution of an amino acid at a site arbitrarily selected from positions 433 (D433), 434 (R434), and 437 (K437) of the SeV P protein with another amino acid.
  • the substitution of amino acids is preferably substitution with other amino acids having different side chain chemical properties.
  • Specific examples include substitution of the 433th amino acid with Ala (A), substitution of the 434th amino acid with Ala (A), substitution of the 437th amino acid with Ala (A), and the like.
  • a P protein in which all of these three sites are substituted can be preferably used. These mutations can increase the temperature sensitivity of P protein.
  • Sendai virus vector lacking or deleting the F gene which encodes a mutant L protein (preferably a mutant L protein in which at least L at position 1361 is also substituted with another amino acid), and cytotoxicity is the same or less
  • a Sendai virus vector that lacks or deletes the F gene having the same or higher temperature sensitivity as described below and / or higher is also preferably used in the present invention.
  • Each viral protein may have a mutation in other amino acids (for example, within 10, within 5, within 4, within 3, 2, or 1 amino acid) in addition to the above mutation.
  • the cells are allowed to reach normal temperature (eg, about 37 ° C., specifically 36.5-37.5 ° C., preferably 36.6-37.4 ° C.
  • the vector can be easily removed by culturing preferably at 36.7 ° C. to 37.3 ° C.). In removing the vector, the culture may be performed at a slightly high temperature (for example, 37.5 to 39 ° C, preferably 38 to 39 ° C, or 38.5 to 39 ° C).
  • TS 7 L (Y942H / L1361C / L1558I)
  • TS 12 P (D433A / R434A / K437A)
  • TS 13 P (D433A / R434A / K437A), L (L1558I)
  • TS 14 P (D433A / R434A / K437A), L (L1361C)
  • TS 15 P (D433A / R434A / K437A), L (L1361C)
  • Sendai virus vectors having such mutations can be preferably used (International Publication No. WO2010 / 008054).
  • Examples of specific vectors include, for example, mutations of G69E, T116A, and A183S in the M protein, mutations of A262T, G264R, and K461G in the HN protein, L511F mutation in the P protein, and N1197S and K1795E in the L protein.
  • F gene deletion type Sendai virus vector (for example, Z strain) having a mutation may be used, and a vector in which the above mutation of TS 7, TS 12, TS 13, TS 14, or TS 15 is further introduced into this vector is more preferable.
  • SeV18 + / TS ⁇ F (WO2010 / 008054, WO2003 / 025570) and SeV (PM) / TS ⁇ F, and mutations of TS 7, TS 12, TS 13, TS 14, or TS 15 were further introduced into these.
  • Examples include, but are not limited to, vectors.
  • ⁇ TS ⁇ F '' has mutations of G69E, T116A, and A183S in the M protein, mutations of A262T, G264R, and K461G in the HN protein, L511F mutation in the P protein, and N1197S and K1795E mutations in the L protein, Deletion of the F gene.
  • a F gene-deficient Sendai virus vector having an L511F mutation in the P protein and an N1197S and K1795E mutation in the L protein, and further comprising the above TS 7, TS 12, TS 13, TS 14, or TS 15 A vector having the following mutation is preferred.
  • the M protein has G69E, T116A, and A183S mutations
  • the HN protein has A262T, G264R, and K461G mutations
  • the P protein has L511F mutations
  • the L protein has N1197S and K1795E mutations
  • TS This is a F gene-deficient Sendai virus vector with 12 mutations.
  • Sendai virus containing KLF gene, OCT gene, and SOX gene preferably KLF gene, OCT gene, and SOX gene are in this order immediately after Sendai virus P gene, ie immediately downstream of P gene (minus strand RNA). Integrated immediately 5 'of the genome).
  • SeV (PM) KOS / TS7 ⁇ F SeV (PM) KOS / TS12 ⁇ F, and the like are preferable, and SeV (PM) KOS / TS12 ⁇ F is more preferable, but it is not limited thereto.
  • Sendai virus vector that expresses the KLF gene (a vector that carries the KLF gene but not the OCT gene and SOX gene).
  • Sendai virus vector encoding KLF gene may or may not be temperature sensitive, but preferably the vector forms NTVLP at 37 ° C. Have mutations that are suppressed. NTVLP formation can be measured according to the literature Inoue et al., J. Virol. 77: 3238-3246, 2003.
  • Preferred vectors include, for example, the G protein with G69E, T116A, and A183S mutations in the M protein, the A262T, G264R, and K461G mutations in the HN protein, the L511F mutation in the P protein, and the F gene having the N1197S and K1795E mutations in the L protein.
  • a deletion-type Sendai virus vector can be mentioned.
  • a Sendai virus vector carrying the KLF gene but not the OCT gene or SOX gene can express the carried gene (KLF gene) at 37 ° C.
  • As the vector a vector having higher expression efficiency of the loaded gene at 37 ° C. than the Sendai virus vector containing the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene in one vector in this order is used.
  • the temperature sensitive Sendai virus vector containing the above KLF gene, OCT gene, and SOX gene in one vector in this order (high resistance even at 37 ° C., and the expression level of the loaded gene is low). (Relatively high) is preferable.
  • the KLF gene can be inserted, for example, upstream of the N gene in the Sendai virus vector (3 ′ side of the N gene on the genome), and SeV18 + KLF4 / TS ⁇ F can be mentioned as a preferred vector.
  • a temperature sensitive virus vector encoding the MYC gene examples include a temperature sensitive Sendai virus vector encoding the MYC gene. More specifically, mutations of G69E, T116A,, and A183S in the M protein, A262T, G264R,, and K461G mutations in the HN protein, an L511F mutation in the P protein, and an F gene deletion having the N1197S and K1795E mutations in the L protein It is preferably a Sendai virus vector, and further a vector having the mutation of TS ⁇ 7, TS 12, TS 13, TS ⁇ ⁇ 14, or TS 15.
  • the M protein has G69E, T116A, and A183S mutations
  • the HN protein has A262T, G264R, and K461G mutations
  • the P protein has the L511F mutation
  • the L protein has the N1197S and K1795E mutations
  • the TS This is a F gene-deficient Sendai virus vector with a mutation of 15.
  • the MYC gene is incorporated, for example, immediately after the HN gene, that is, immediately downstream of the HN gene (immediately 5 ′ of the minus-strand RNA genome), for example, between the HN gene and the L gene.
  • SeV (HNL) c-rMYC / TS12 ⁇ F, SeV (HNL) c-rMYC / TS13 ⁇ F, SeV (HNL) c-rMYC / TS15 ⁇ F, and the like, particularly SeV (HNL) c-rMYC / TS15 ⁇ F is preferred.
  • a suitable result can be obtained by combining SeV (PM) KOS / TS12 ⁇ F, SeV (HNL) c-rMYC / TS15 ⁇ F, and SeV18 + KLF4 / TS ⁇ F.
  • the cytotoxicity of the vector can be measured, for example, by quantifying the release of lactate dehydrogenase (LDH) from the cells. Specifically, for example, the amount of LDH released in a culture solution obtained by infecting HeLa (ATCC CCL-2) or monkey CV-1 (ATCC CCL 70) with MOI 3 and culturing for 3 days is measured. The smaller the amount of LDH released, the lower the cytotoxicity.
  • the temperature sensitivity can be determined by measuring the virus growth rate or the expression level of the loaded gene at the normal temperature of the virus host (eg, 37 ° C. to 38 ° C.).
  • the mutation is judged to be a temperature-sensitive mutation, and as the growth rate and / or expression level decreases, Temperature sensitivity is judged to be high.
  • a virus containing a protein in the envelope that is different from the envelope protein inherent in the virus may be used.
  • a virus containing this can be produced by expressing a desired foreign envelope protein in a virus-producing cell during virus production.
  • Proteins such as a desired adhesion factor, a ligand, and a receptor which provide the infectious ability to a mammalian cell, can be used.
  • Specific examples include G protein (VSV-G) of vesicular stomatitis virus (VSV).
  • VSV-G protein may be derived from any VSV strain.
  • a VSV-G protein derived from a Indiana serotype strain J. Virology 39: 519-528 (1981)
  • the Sendai virus vector used in the present invention can contain any combination of envelope proteins derived from other viruses.
  • Recombination of recombinant Sendai virus having nuclear reprogramming factors may be performed using a known method.
  • a cDNA encoding Sendai virus genomic RNA (minus strand) or its complementary strand (plus strand) is used as a viral protein (NP, P, and L) can be produced by a step of transcription in cells expressing (b), and a step of collecting a culture supernatant containing the produced virus.
  • Viral proteins necessary for particle formation may be expressed from transcribed viral genomic RNA, or may be supplied to trans from other than genomic RNA.
  • expression plasmids encoding NP, P, and L proteins can be introduced into cells and supplied.
  • the virus gene can be separately expressed in virus-producing cells to complement particle formation.
  • a vector in which DNA encoding the protein or genomic RNA is linked downstream of an appropriate promoter that functions in the host cell is introduced into the host cell.
  • the transcribed genomic RNA is replicated in the presence of viral proteins to form infectious viral particles.
  • the defective virus or another viral protein capable of complementing its function can be expressed in the virus-producing cell.
  • Sendai virus can be produced using the following known methods (WO97 / 16539; WO97 / 16538; WO00 / 70055; WO00 / 70070; WO01 / 18223; WO03 / 025570; WO2005 / 071092 ; WO2006 / 137517; WO2007 / 083644; WO2008 / 007581; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997, Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 and Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Durbin, A. P.
  • the KLF gene, OCT gene, and SOX gene are incorporated into Sendai virus in this order.
  • Another Sendai virus incorporates the KLF gene (this vector does not incorporate the OCT and SOX genes).
  • These foreign genes can generally be inserted immediately before (3 'side of the genome) or immediately after (5' side of the genome) any viral gene (NP, P, M, F, HN, or L). it can.
  • KLF gene, OCT gene, and SOX gene are in this order immediately after Sendai virus P gene, ie immediately downstream of P gene (minus strand RNA). Integrated immediately 5 'of the genome).
  • a transcription initiation signal (S sequence), a transcription termination signal (E sequence), and a spacer sequence (such as an intervening sequence (I sequence)) may be included between the P gene and the KLF gene, but other transcription units ( For example, a transcription unit encoding a gene encoding a protein) is not included. Since Sendai virus has minus-strand RNA in the genome, the 3 'side of the genome is upstream and the 5' side is downstream.
  • the KLF gene is located most 3 'of the three genes, and the SOX gene is located 5' most. . Since minus-strand RNA encodes genes as antisense, the KLF gene, OCT gene, and SOX gene on the genome are encoded as antisense strands rather than protein coding strands (sense strands).
  • an antigenomic RNA is generated using this genome as a template. The antigenome is a plus strand, and the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene are loaded with a protein-coding strand (sense strand).
  • the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene are arranged most 5 ′ among the three genes and the SOX gene is arranged most 3 ′ among the three genes.
  • the three genes are preferably adjacent to each other (ie no other gene is between the three genes). Each gene may be appropriately sandwiched between Sendai virus S (Start) sequence and E (End) sequence.
  • the S sequence is a signal sequence that initiates transcription, and transcription ends at the E sequence.
  • the region sandwiched between the S and E sequences is one transcription unit.
  • a sequence serving as a spacer (intervening sequence) can be appropriately inserted between the E sequence of one gene and the S sequence of the next gene.
  • S - KLF gene -EIS- OCT gene -EIS- SOX gene -E S, I, and E is S sequences, respectively, I (i ntervening) sequences, and represents the E sequence
  • a Sendai virus vector can be suitably used.
  • the P gene and KLF gene on the Sendai virus genome are linked as follows: P gene -EIS- KLF gene-.
  • S-OCT gene -EIS- SOX gene -EIS- KLF gene -E S, I, and E are the S sequence, I ( i ntervening) and a Sendai virus vector containing a nucleic acid having a constitution of E
  • P gene and SOX gene on the Sendai virus genome are combined as P gene -EIS- SOX gene-.
  • a desired S sequence of Sendai virus can be used.
  • Arrays can be used preferably.
  • 3′-UCCCAGUUUC-5 ′ SEQ ID NO: 2
  • 3′-UCCCACUUAC-5 ′ SEQ ID NO: 3
  • 3′-UCCCACUUUC-5 ′ SEQ ID NO: 4 are preferable.
  • sequences are expressed as DNA sequences encoding positive strands, 5'-AGGGTCAAAG-3 '(SEQ ID NO: 5), 5'-AGGGTGAATG-3' (SEQ ID NO: 6), and 5'-AGGGTGAAAG-, respectively. 3 '(SEQ ID NO: 7).
  • E sequence of the Sendai virus vector for example, 3′-AUUCUUUU-5 ′ ((5′-TAAGAAAAA-3 ′ in the DNA encoding a plus strand) is preferable.
  • the I sequence may be, for example, any three bases, and specifically, 3′-GAA-5 ′ (5′-CTT-3 ′ in plus strand DNA) may be used.
  • the wild-type Sendai virus genome follows the 3 'short leader region, followed by the nucleocapsid (NP) gene, phospho (P) gene, matrix (M) gene, fusion (F) gene, hemagglutinin-neuraminidase (HN) gene, And the large (L) gene and the short 5 'trailer region in this order.
  • viral genes can be arranged in this order. Production of recombinant vectors corresponding to wild-type viruses and various mutant vectors is already known. Furthermore, it has been shown that gene transfer is possible with only RNP excluding the envelope (WO00 / 70055). Therefore, reprogramming can be performed using Sendai virus RNP as a viral vector.
  • Sendai virus can function as a vector with the NP gene, P gene, and L gene, and can replicate the genome in cells and express the foreign genes (KLF, OCT, SOX, etc.) .
  • Sendai virus containing three genes, NP gene, P gene, and L gene, as a viral gene a set of KLF, OCT, and SOX genes is inserted, for example, between P gene and L gene.
  • a set of KLF, OCT, and SOX genes is inserted, for example, between the P gene and the M gene (WO97 / 16539).
  • Sendai virus vector contains the F gene
  • a set of KLF, OCT, and SOX genes is inserted between the P gene and the F gene (WO00 / 70070).
  • M and F gene deletion type it is inserted between P gene and HN gene
  • F, M and HN gene deletion type it is inserted between P gene and L gene (WO2003 / 025570, WO2006 / 137517) ).
  • a vector lacking a viral gene is preferred because of its high safety.
  • a vector lacking at least the F gene can be preferably used.
  • the KLF gene is inserted, for example, upstream of the NP gene (between the 3 ′ leader sequence and the NP gene).
  • the Sendai virus vector containing the KLF, OCT and SOX genes and the Sendai virus vector containing the KLF gene and not containing the OCT gene and SOX gene can be used for gene transfer in reprogramming as appropriate using only them. More preferably, it is used in reprogramming to further introduce the MYC gene. Instead of the MYC gene, a vector expressing the Glis1 gene (Maekawaeet al.,. Nature, 474: 225-229,2292011) may be combined. The MYC gene or Glis1 gene can be inserted into the Sendai virus vector containing the KLF, OCT and SOX genes or the Sendai virus vector not containing the OCT gene and SOX gene. It may be inserted and used.
  • a desired vector such as a plasmid, a viral vector, or a non-viral vector (for example, a liposome) can be used.
  • viral vectors include adenovirus vectors and retrovirus vectors, but are not limited thereto.
  • the MYC gene or Glis1 gene is inserted into the Sendai virus vector.
  • the Sendai virus vector containing the KLF, OCT and SOX genes, and the Sendai virus vector containing the KLF gene and not containing the OCT gene and the SOX gene are different Sendai viruses into which the MYC gene or Glis1 gene is inserted. More preferably, it is used in combination with a vector.
  • the Sendai virus vector described above can be used as a Sendai virus vector from which the MYC gene or Glis1 gene is inserted.
  • a desired site can be selected as the insertion position of the gene in the vector.
  • the MYC gene or the Glis1 gene is located behind (5 ′ side) of the minus-strand RNA genome, for example, 5 ′ end from the center of the minus-strand RNA virus genome (5 ′ end from the middle gene in the order), that is, In a plurality of protein coding sequences arranged on the genome, it is preferable to arrange them at a position earlier counted from the 5 ′ side than from the 3 ′ side (see Examples).
  • the MYC gene or the Glis1 gene can be arranged, for example, on the most 5 ′ side (that is, the first from the 5 ′ side), or the second or third from the 5 ′ side.
  • the MYC gene or the Glis1 gene is, for example, the second from the 5 ′ side of the genome, specifically, the L gene at the most 5 ′ side of the genome, and then the HN gene, followed by the HN gene and the L gene. It may be arranged between (HN-L).
  • the MYC gene or Glis1 gene is located immediately upstream of the L gene on the Sendai virus genome (3 ', eg, between the HN gene and the L gene), or immediately downstream (eg, between the L gene and the 5' trailer sequence). ).
  • a Sendai virus vector in which the MYC gene is inserted between the HN gene and the L gene is most preferred.
  • Sendai virus vectors include, for example, G69E, T116A, and A183S mutations in the M protein, A262T, G264R, and K461G mutations in the HN protein, the L511F mutation in the P protein, and the N1197S and K1795E mutations in the L protein.
  • An F gene-deficient Sendai virus vector (for example, Z strain) may be used, and a vector in which a mutation of TS 7, TS 12, TS 13, TS 14, or TS 15 is further introduced into this vector is more preferable.
  • the MYC gene can induce pluripotent stem cells not only in wild-type c-MYC but also in T58A mutant, N-MYC, and L-MYC (WO2007 / 69666; Blelloch R. et al., Cell Stem Cell, 1 : 245-247, 2007).
  • the MYC gene can be substituted with a continuous A or T base sequence by appropriately introducing a silent mutation so as not to change the encoded amino acid sequence.
  • wild-type c-MYC was found to have less expression from RNA virus vectors such as Sendai virus vectors.
  • RNA virus vectors such as Sendai virus vectors.
  • by introducing one or more, preferably 2, or more, 3 or more, 4 or more, or all 5 mutations selected from a378g, t1122c, t1125c, a1191g, and a1194g into wild-type c-MYC Therefore, it is possible to stably and highly express the gene.
  • the modified c-MYC gene (referred to as “c-rMYC”) shown in SEQ ID NO: 8 (the amino acid sequence is SEQ ID NO: 9) can be preferably used.
  • SeV (HNL) c-rMYC / TS ⁇ F SeV (L) c-rMYC / TS ⁇ F
  • SeV (HNL) c-rMYC / TS15 ⁇ F (WO2010 / 008054; Fusaki et al., Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. Vol. 85, p348-362 (2009))
  • SeV (HNL) c-rMYC / TS15 ⁇ F is particularly preferred, but is not limited thereto.
  • Sendai virus vector containing the KLF, OCT and SOX genes Sendai virus vector containing the KLF gene but not the OCT gene and SOX gene, and / or Sendai virus vector containing the MYC gene are appropriately reprogrammed for cells.
  • the gene to be mounted may be a desired gene involved in induction of various stem cells such as pluripotent stem cells from differentiated cells. For example, a gene that increases the efficiency of reprogramming can be mounted.
  • the present invention provides the use of the Sendai virus vector of the present invention for introducing a gene in cell reprogramming, and for expressing a reprogramming factor in the cell and inducing the reprogramming of the cell. .
  • the present invention also provides an agent (introduction agent, gene introduction agent) for introducing a gene in cell reprogramming and an agent for expressing a reprogramming factor in the cell, comprising the Sendai virus vector of the present invention.
  • the present invention also relates to an agent for expressing a reprogramming factor in a cell and inducing reprogramming of the cell, comprising the Sendai virus vector of the present invention.
  • the vector of the present invention is also useful for further expressing a desired gene in the cell when performing nuclear reprogramming of the cell.
  • the Sendai virus vector of the present invention can be used for cell reprogramming according to the present invention.
  • the induction of reprogramming may specifically be induction of pluripotent stem cells.
  • the present invention can be used for medical and non-medical applications and is useful in medical and non-medical embodiments.
  • the present invention can be used for therapeutic, surgical, and / or diagnostic, or non-therapeutic, non-surgical, and / or non-diagnostic purposes.
  • a nuclear reprogramming factor is a gene used to induce a differentiation state of a cell to a more undifferentiated state, or a product thereof, alone or in combination with a plurality of factors.
  • a gene or product thereof used to induce dedifferentiation of differentiated cells includes a factor essential for nuclear reprogramming and an auxiliary factor (cofactor) that increases the efficiency of nuclear reprogramming.
  • a desired gene for use in nuclear reprogramming may be mounted on a vector. For example, a gene for use in the production of pluripotent stem cells can be further loaded.
  • nuclear reprogramming factors for inducing pluripotent stem cells are expressed in, for example, ES cells and early embryos, but not expressed in many differentiated somatic cells or expressed.
  • Eg, ES cell-specific gene can be used.
  • Such a gene is preferably a gene encoding a transcription factor, a nuclear protein or the like.
  • Methods for identifying nuclear reprogramming genes are already known (WO2005 / 80598). In fact, genes identified using this method are useful for reprogramming into pluripotent stem cells Is shown (WO2007 / 69666).
  • genes include DPPA5 (developmental pluripotency associated 5, ES cell specific gene 1 (ESG1); accession numbers NM_001025290, NM_025274, XM_236761), F-box protein 15 (Fbx15, NM_152676, NM_798 NM_024865, AB093574), ECAT1 (ES cell associated transcript 1; AB211062, AB211060), ERAS (ES cell expressed Ras; NM_181532, NM_181548), DNMT3L (DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3-like; NM_013369, NM_194348, ECAT8 (AB211063, AB211061), GDF3 (growth differentiation factor 3; NM_020634, NM_008108), SOX15 (SRY (sex determining region Y) -box 15; NM_006942, NM_009235), DPPA4 (developmental pl4 (NM_)-
  • Sendai virus vector containing KLF, OCT and SOX genes Sendai virus vector containing KLF gene and not containing OCT gene and SOX gene, and / or Sendai virus vector containing MYC gene, Genes not loaded on the vector can be further loaded, or other vectors carrying those genes can be used in combination.
  • Each of these genes may be incorporated into another vector, or a plurality of genes may be integrated into one vector.
  • each gene may be incorporated into one type of vector, or different types of vectors (including chromosomally integrated viral vectors and / or non-viral vectors) may be combined with the above-mentioned book containing the KLF gene, OCT gene, and SOX gene. It may be used in combination with the Sendai virus vector of the invention and the Sendai virus vector containing the KLF gene but not the OCT gene and SOX gene. Individual virus vectors are packaged separately and can be used in combination at the time of use. Alternatively, a plurality of viral vectors having different genes to be mounted may be combined in advance as a kit or mixed to form a composition.
  • One or more non-integrating viral vectors containing any combination (or all) of these genes, and kits or compositions further comprising the vectors also reprogram cells, particularly pluripotent stem cells It can use suitably in manufacture of this.
  • the vector may be appropriately combined with a pharmaceutically acceptable carrier and / or vehicle, for example, mixed in sterilized water, pH buffer solution, physiological saline, culture solution, etc. Good.
  • a part or most of the nuclear reprogramming gene can be replaced with a protein that is an expression product thereof.
  • composition and kit of the present invention include the Sendai virus vector containing at least the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene, and the Sendai virus vector containing the KLF gene but not the OCT gene and the SOX gene,
  • Other vectors chromosomally integrated viral vectors and / or non-viral vectors
  • All of the factors necessary for reprogramming are preferably expressed from the Sendai virus vector, but only a part is expressed from the Sendai virus vector, and the others are expressed by other vectors and / or compounds (for example, proteins and low molecular weight compounds). You may supply by.
  • the method for producing a reprogrammed cell of the present invention is not limited to a method in which all gene transfer is performed using a Sendai virus vector. That is, the method of the present invention may use the Sendai virus vector containing at least the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene, and the Sendai virus vector containing the KLF gene but not the OCT gene and the SOX gene. This includes using in combination with other vectors to be expressed (chromosomally integrated viral vectors and / or non-viral vectors) and / or compounds that induce reprogramming.
  • the Sendai virus vector containing the MYC gene or Glis1 gene is further used in combination.
  • the present invention also provides the following inventions.
  • the method according to [1] wherein the vector containing the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene in this order is a temperature sensitive virus vector.
  • the temperature sensitive virus vector is a temperature sensitive Sendai virus vector.
  • Temperature-sensitive Sendai virus vectors are TS 7 (L protein Y942H, L1361C, and L1558I mutations), TS 12 (P protein D433A, R434A, and K437A mutations, TS 13 (P protein D433A, R434A, and K437A mutation and L protein L1558I mutation, TS 14 (P protein D433A, R434A, and K437A mutation and L protein L1361C mutation), and TS 15 (P protein D433A, R434A, and K437A mutation and L protein L1361C and The method according to [3], which is an F gene-deficient Sendai virus vector containing a mutation selected from the group consisting of (L1558I mutation).
  • the temperature-sensitive Sendai virus vector has mutations of G69E, T116A, and A183S in the M protein, A262T, G264R, and K461G mutations in the HN protein, L511F mutation in the P protein, and N1197S and K1795E in the L protein.
  • the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene are incorporated immediately after the Sendai virus P gene in this order (5 ′ side of the P gene in the minus-strand RNA genome) [3] to [5] The method in any one of. [7] The method according to [3], wherein the temperature sensitive Sendai virus vector is selected from the group consisting of SeV (PM) KOS / TS7 ⁇ F and SeV (PM) KOS / TS12 ⁇ F. [8] The method according to any one of [1] to [7], wherein the vector containing the KLF gene and not containing the OCT gene and the SOX gene is a Sendai virus vector.
  • Sendai virus vector containing the KLF gene and not containing the OCT gene and the SOX gene is a Sendai virus vector having a mutation that suppresses NTVLP formation at 37 ° C.
  • Sendai virus vector containing KLF gene but not OCT gene and SOX gene has mutations of G69E, T116A, and A183S in M protein, mutations of A262T, G264R, and K461G in HN protein, and P protein
  • the method according to [8] which is an F gene-deleted Sendai virus vector containing the L511F mutation and the N protein containing the N1197S and K1795E mutations in the L protein.
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector into which the MYC gene has been inserted is an F gene deletion-type Sendai virus vector containing a mutation selected from the group consisting of TS 7, TS 12, TS 13, TS 14, and TS 15. The method according to [15].
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector into which the MYC gene is inserted is a mutation of G69E, T116A, and A183S in the M protein, a mutation of A262T, G264R, and K461G in the HN protein, a L511F mutation in the P protein, and
  • the L protein contains N1197S and K1795E mutations, and further includes a TS 15 mutation (mutations of P protein D433A, R434A and K437A, and L protein L1361C and L1558I mutations).
  • the present invention also provides the following inventions.
  • Induction efficiency of pluripotent stem cells in the method (including the method of production) for introducing pluripotent stem cells by introducing a vector containing the KLF gene, OCT gene, and SOX gene in this order in one vector Use of a vector containing a KLF gene and not an OCT gene and a SOX gene in the manufacture of a drug for improvement (including improvement of production efficiency).
  • the use according to [1], wherein the vector containing the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene in this order is a temperature sensitive virus vector.
  • the temperature sensitive virus vector is a temperature sensitive Sendai virus vector.
  • the temperature-sensitive Sendai virus vector is an F gene-deficient Sendai virus vector containing a mutation selected from the group consisting of TS 7, TS 12, TS 13, TS 14, and TS 15; Use of description.
  • the temperature-sensitive Sendai virus vector has mutations of G69E, T116A, and A183S in the M protein, A262T, G264R, and K461G mutations in the HN protein, L511F mutation in the P protein, and N1197S and K1795E in the L protein.
  • Sendai virus vector containing KLF gene but not OCT gene and SOX gene has mutations of G69E, T116A, and A183S in M protein, mutations of A262T, G264R, and K461G in HN protein, and P protein
  • the use according to [8], wherein the L511F mutation is an F gene-deficient Sendai virus vector containing the N1197S and K1795E mutations in the L protein.
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector into which the MYC gene has been inserted is an F gene deletion-type Sendai virus vector containing a mutation selected from the group consisting of TS 7, TS 12, TS 13, TS 14, and TS 15. The use according to [15].
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector into which the MYC gene is inserted is a mutation of G69E, T116A, and A183S in the M protein, a mutation of A262T, G264R, and K461G in the HN protein, a L511F mutation in the P protein, and
  • the L protein contains N1197S and K1795E mutations, and further includes a TS 15 mutation (mutations of P protein D433A, R434A and K437A, and L protein L1361C and L1558I mutations). Use as described in [16].
  • a pluripotency including (a) a vector containing the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene in this order in one vector, and (b) a vector containing the KLF gene and not containing the OCT gene and the SOX gene.
  • Compositions and kits for inducing stem cells including manufacturing).
  • the temperature-sensitive virus vector is a temperature-sensitive Sendai virus vector.
  • the temperature-sensitive Sendai virus vector is an F gene-deficient Sendai virus vector containing a mutation selected from the group consisting of TS 7, TS 12, TS 13, TS 14, and TS 15; The composition and kit described.
  • the temperature-sensitive Sendai virus vector has mutations of G69E, T116A, and A183S in the M protein, A262T, G264R, and K461G mutations in the HN protein, L511F mutation in the P protein, and N1197S and K1795E in the L protein.
  • composition and kit according to [4] which is an F gene-deficient Sendai virus vector containing a mutation and further comprising a TS 12 mutation (mutation of P protein D433A, R434A, and K437A).
  • the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene are incorporated immediately after the Sendai virus P gene in this order (5 ′ side of the P gene in the minus-strand RNA genome) [3] to [5]
  • the temperature sensitive Sendai virus vector is selected from the group consisting of SeV (PM) KOS / TS7 ⁇ F and SeV (PM) KOS / TS12 ⁇ F.
  • the Sendai virus vector containing the KLF gene and not containing the OCT gene and the SOX gene is a Sendai virus vector having a mutation that inhibits NTVLP formation at 37 ° C.
  • Sendai virus vector containing KLF gene but not OCT gene and SOX gene has mutations of G69E, T116A, and A183S in M protein, mutations of A262T, G264R, and K461G in HN protein, and P protein
  • the composition and kit according to [8] which is an F gene-deleted Sendai virus vector containing the L511F mutation and the L protein containing the N1197S and K1795E mutations.
  • composition and kit according to [8], wherein the Sendai virus vector containing the KLF gene and not containing the OCT gene and the SOX gene is SeV18 + KLF4 / TS ⁇ F.
  • the composition and kit according to [13], wherein the vector into which the MYC gene is inserted is a Sendai virus vector.
  • the Sendai virus vector into which the MYC gene is inserted is a temperature sensitive Sendai virus vector.
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector into which the MYC gene has been inserted is an F gene deletion-type Sendai virus vector containing a mutation selected from the group consisting of TS 7, TS 12, TS 13, TS 14, and TS 15.
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector into which the MYC gene is inserted is a mutation of G69E, T116A, and A183S in the M protein, a mutation of A262T, G264R, and K461G in the HN protein, a L511F mutation in the P protein, and
  • the L protein contains N1197S and K1795E mutations, and further includes a TS 15 mutation (mutations of P protein D433A, R434A and K437A, and L protein L1361C and L1558I mutations).
  • the composition and kit according to [14], wherein the temperature-sensitive Sendai virus vector into which the MYC gene is inserted is SeV (HNL) c-rMYC / TS15 ⁇ F.
  • a pluripotency including (a) a vector containing the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene in this order in one vector, and (b) a vector containing the KLF gene and not containing the OCT gene and the SOX gene.
  • Compositions and kits for improving stem cell induction efficiency including improvement of production efficiency).
  • the composition and kit according to [1] wherein the vector containing the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene in this order is a temperature sensitive virus vector.
  • the temperature-sensitive virus vector is a temperature-sensitive Sendai virus vector.
  • the temperature-sensitive Sendai virus vector is an F gene-deficient Sendai virus vector containing a mutation selected from the group consisting of TS 7, TS 12, TS 13, TS 14, and TS 15; The composition and kit described.
  • the temperature-sensitive Sendai virus vector has mutations of G69E, T116A, and A183S in the M protein, A262T, G264R, and K461G mutations in the HN protein, L511F mutation in the P protein, and N1197S and K1795E in the L protein.
  • composition and kit according to [4] which is an F gene-deficient Sendai virus vector containing a mutation and further comprising a TS 12 mutation (mutation of P protein D433A, R434A, and K437A).
  • the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene are incorporated immediately after the Sendai virus P gene in this order (5 ′ side of the P gene in the minus-strand RNA genome) [3] to [5]
  • the temperature sensitive Sendai virus vector is selected from the group consisting of SeV (PM) KOS / TS7 ⁇ F and SeV (PM) KOS / TS12 ⁇ F.
  • the Sendai virus vector containing the KLF gene and not containing the OCT gene and the SOX gene is a Sendai virus vector having a mutation that inhibits NTVLP formation at 37 ° C.
  • Sendai virus vector containing KLF gene but not OCT gene and SOX gene has mutations of G69E, T116A, and A183S in M protein, mutations of A262T, G264R, and K461G in HN protein, and P protein
  • the composition and kit according to [8] which is an F gene-deleted Sendai virus vector containing the L511F mutation and the L protein containing the N1197S and K1795E mutations.
  • composition and kit according to [8], wherein the Sendai virus vector containing the KLF gene and not containing the OCT gene and the SOX gene is SeV18 + KLF4 / TS ⁇ F.
  • the composition and kit according to [13], wherein the vector into which the MYC gene is inserted is a Sendai virus vector.
  • the Sendai virus vector into which the MYC gene is inserted is a temperature sensitive Sendai virus vector.
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector into which the MYC gene has been inserted is a F gene-deficient Sendai virus vector containing a mutation selected from the group consisting of TS 7, TS 12, TS 13, TS 14, and TS 15 [15] The composition and kit according to [15].
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector into which the MYC gene is inserted is a mutation of G69E, T116A, and A183S in the M protein, a mutation of A262T, G264R, and K461G in the HN protein, a L511F mutation in the P protein, and
  • the L protein contains N1197S and K1795E mutations, and further includes a TS 15 mutation (mutations of P protein D433A, R434A and K437A, and L protein L1361C and L1558I mutations).
  • the composition and kit according to [14], wherein the temperature-sensitive Sendai virus vector into which the MYC gene is inserted is SeV (HNL) c-rMYC / TS15 ⁇ F.
  • a vector (preferably SeV (PM) KOS / TS12 ⁇ F) in which the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene are inserted in this order into one Sendai virus vector is contained in the OCT containing the KLF4 gene. It is preferably used in combination with a Sendai virus vector (preferably SeV18 + KLF4 / TS ⁇ F) that does not contain the gene and SOX gene.
  • a Sendai virus vector that expresses the MYC gene preferably SeV (HNL) c-rMYC / TS15 ⁇ F It is more preferable to further combine).
  • KLF gene may be appropriately selected in accordance with the origin of the cell to be reprogrammed. It may be derived from primates such as rats, rabbits, pigs and monkeys. Further, the gene and protein sequences do not necessarily have to be wild-type sequences, and may have mutations as long as reprogramming can be induced. Examples of producing pluripotent stem cells using mutant genes are already known (WO2007 / 69666). For example, 1 or a small number (for example, several, within 3, within 5, within 10, within 15, within 20, within 25) added, deleted, substituted, and / or inserted.
  • a gene encoding an amino acid sequence and capable of inducing reprogramming can be used in the present invention.
  • biological activity for example, 1 to several residues (for example, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15 or 20 at the N-terminus and / or C-terminus)
  • Variants that can be used include, for example, fragments of natural proteins, analogs, derivatives, and fusion proteins with other polypeptides (eg, those added with heterologous signal peptides or antibody fragments).
  • the wild-type amino acid sequence includes a sequence in which one or more amino acids of the wild-type amino acid sequence are substituted, deleted, and / or added, and has a biological activity equivalent to that of the wild-type protein (eg, activity that induces reprogramming). ).
  • a wild-type protein fragment is usually 70% or more, preferably 80% or more, 85% or more, more preferably 90% or more, 95% of the wild-type polypeptide (in the case of a secreted protein, the mature form). % Or more than 98% continuous area.
  • Amino acid sequence variants can be prepared, for example, by introducing mutations into DNA encoding a natural polypeptide (Walker and Gaastra, eds. Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York, 1983); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492, 1985; Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382, 1987; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Press, Plainview, NY), 1989; US Pat. No., 4,873,192).
  • Guidance for substitution of amino acids so as not to affect biological activity includes, for example, Dayhoff et al. (Dayhoffhet al.,. In Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl.NaBiomed. Res. Found., Washington, ingtonDC ), 1978).
  • the number of amino acids to be modified is not particularly limited, but for example, within 30%, preferably within 25%, more preferably within 20%, more preferably within 15%, more preferably within the total amino acids of a natural mature polypeptide. It is within 10%, within 5%, or within 3%, for example, within 15 amino acids, preferably within 10 amino acids, more preferably within 8 amino acids, more preferably within 5 amino acids, more preferably within 3 amino acids.
  • substituting an amino acid it can be expected to maintain the activity of the protein by substituting an amino acid having a similar side chain property. Such substitution is referred to as conservative substitution in the present invention.
  • Conservative substitutions include, for example, basic amino acids (eg, lysine, arginine, histidine), acidic amino acids (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non- Each of polar amino acids (eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ -branched amino acids (eg threonine, valine, isoleucine), and aromatic amino acids (eg tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine) Examples include substitution between amino acids in the group.
  • basic amino acids eg, lysine, arginine, histidine
  • acidic amino acids eg, aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar amino acids
  • the modified protein shows high homology with the amino acid sequence of the wild type protein.
  • High homology is, for example, an amino acid sequence having 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 93% or more, 95% or more, or 96% or more identity.
  • Amino acid sequence identity can be determined, for example, using the BLASTP program (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). For example, on the BLAST web page of NCBI (National Center ch Biothchnology Information), search can be performed using default parameters (Altschul SF et al., Nature Genet.
  • Gaps are treated in the same way as mismatches, and for example, the identity value for the entire amino acid sequence of a natural cytokine (the mature form after secretion) is calculated. Specifically, the ratio of the number of matching amino acids in the total number of amino acids of wild type protein cocoon (or mature type in the case of a secreted protein) cocoon is calculated.
  • silent mutations can be introduced into genes so as not to change the encoded amino acid sequence.
  • AT rich genes by replacing 5 or more consecutive A or T bases with G or C so as not to change the encoded amino acid sequence, stable high gene expression can be obtained. Can do.
  • the modified protein or the protein used for reprogramming is a protein encoded by a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with part or all of the coding region of the gene encoding the wild type protein, and is equivalent to the wild type protein.
  • examples thereof include proteins having activity (activity for inducing reprogramming).
  • a probe is prepared from either a nucleic acid containing a sequence of the coding region of a wild-type protein gene or a complementary sequence thereof, or a nucleic acid to be hybridized, and whether it hybridizes to the other nucleic acid. Can be identified by detecting.
  • Stringent hybridization conditions include, for example, 5xSSC, 7% (W / V) SDS, 100 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, 5x Denhardt's solution (1x Denhardt solution is 0.2% polyvinylpyrrolidone, 0.2% bovine serum albumin, and In a solution containing 0.2% Ficoll) at 60 ° C., preferably 65 ° C., more preferably 68 ° C., followed by 2 ⁇ SSC, preferably 1 ⁇ SSC, more preferably 0.5 ⁇ SSC at the same temperature as the hybridization. The condition is that the washing is performed in 0.1 ⁇ SSC for 2 hours while shaking.
  • genes that are particularly preferred for inducing cell reprogramming are F-box protein 15 (Fbx15, NM_152676, NM_015798), Nanog (NM_024865, AB093574), ERAS (ES cell expressed Ras; NM_181532, NM_181548 ), DPPA2 (NM_138815, NM_028615), OCT3 / 4 (also called POU5F1; NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178), SOX2 (NM_003106, NM_011443, XM_574919), TCL1A (T-cell NM 0 KLF4 (Kruppel-like factor 4; NM_004235, NM_010637), catenin ⁇ 1 (cadherin-associated protein beta 1; NM_001904, NM_007614; S33Y mutant included), c-MYC (NM_002467, NM_0
  • Sendai virus vector that further carries any of the above or a combination thereof, and other genes other than the OCT gene and SOX gene in addition to the KLF gene
  • Sendai virus vector of the present invention that carries the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene and the vector that contains the KLF gene and does not contain the OCT gene and the SOX gene
  • Further use of Sendai virus vectors carrying these combinations and combinations of those vectors is useful for use in the induction of cell reprogramming in the present invention, and is particularly suitable for use in the induction of pluripotent stem cells. Can do. Individual viral vectors can be used in combination at the time of use.
  • kits or compositions comprising those vectors are also included in the present invention.
  • the vector of the present invention expressing the KLF gene, OCT gene, and SOX gene and the vector containing the KLF gene but not the OCT gene and SOX gene are particularly preferably combined with a vector expressing the MYC gene and / or Glis1 gene ( Takahashi, K. and Yamanaka S., Cell 126, 663-676, 2006; Lowry WE et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 105 (8): 2883-8, 2008; -8Masaki, H. et al. , Stem Cell Res. 1: 105-115, 2008; Maekawa et al., Nature, 474: 225-229, 2011; WO 2007/69666).
  • the SOX protein, KLF protein, MYC protein, and OCT protein and their genes refer to member proteins and genes belonging to the SOX family, KLF family, MYC family, and OCT family, respectively. It has been reported that pluripotent stem cells can be induced from various differentiated cells by adjusting one or more members of these four families to express each. For example, with regard to the SOX family of genes, it has been reported that pluripotent stem cells can be induced using any of the SOX1, SOX2, SOX3, SOX15, and SOX17 genes (WO2007 / 69666). As for the KLF family, pluripotent stem cells could be induced by either KLF4 or KLF2 (WO2007 / 69666).
  • pluripotent stem cells could be induced not only by wild-type c-MYC but also by T58A mutant, N-MYC, and L-MYC (WO2007 / 69666; Blelloch R. et al. , 1: 245-247, 2007).
  • T58A mutant N-MYC
  • L-MYC L-MYC
  • the KLF family includes KLF1 (NM_006563, NM_010635), KLF2 (NM_016270, NM_008452), KLF4 (NM_004235, NM_010637), KLF5 (NM_001730, NM_009769), and the MYC family includes c-MYC ( NM_002467, NM_010849, T58A mutants included), N-MYC (NM_005378, NM_008709), L-MYC (NM_005376, NM_005806) are included, and OCT1A (NM_002697, NM_198934), OCT3 / 4 (NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178), OCT6 (NM_002699, NM_011141), and SOX families include SOX1 (NM_005986, NM_009233), SOX2 (NM_003106, NM-00
  • a Sendai virus vector carrying any one of these genes according to the order of the present invention is useful for use in the induction of cell dedifferentiation in the present invention, and can be particularly suitably used for the induction of pluripotent stem cells.
  • Most preferred as the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene are the OCT3 / 4 gene, the SOX2 gene, and the KLF4 gene, respectively.
  • MYC family genes are not essential for the induction of pluripotent stem cells, and pluripotent stem cells can be induced with only three family genes except for the MYC family genes (Nakagawa M. et al., Nat Biotechnol. 26 ( 1): 101-6, 2008; Wering M. et al., Cell Stem Cell 2 (1): 10-2, 2008).
  • MYC gene is not expressed, for example, p53 ⁇ siRNA and UTF1 can significantly increase the induction efficiency of pluripotent stem cells (Y. Zhao et al., Cell Stem Cell, 3 (5): 475-479, 2008 ; N. Maherali, and K. Hochedlinger, erCell Stem Cell, 3 (6): 595-605, 2008).
  • pluripotent stem cells can be induced only by genes of three families excluding genes of KLF family (Park IH et al., Nature, 451 (7175): 141-6, 2008). Moreover, by using together with a G9a histone methyltransferase inhibitor (BIX-01294; Kubicek, S. et al., Mol. Cell 25, 473-481, 2007), KLF gene, SOX gene, and fetal-derived NPC, and It has been reported that pluripotent stem cells can be induced with only three genes of MYC gene (Shi Y et al., Cell Stem Cell, 2 (6): 525-8, 2008).
  • BIX-01294 G9a histone methyltransferase inhibitor
  • Viral vectors encoding each gene may be prepared separately as a single unit. They can be used in combination at the time of use. Arbitrary combinations or all may be combined into a kit or mixed to form a composition.
  • the present invention also includes a Sendai virus vector of the present invention carrying the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene, and a Sendai virus vector containing the KLF gene but not the OCT gene and SOX gene, It also relates to a kit or composition comprising any combination (or all) of compounds.
  • the gene may be appropriately loaded on a recombinant vector. Furthermore, some of the recombinant vectors included in this kit can be replaced with proteins having a considerable function, synthetic compounds, and the like.
  • genes include TERT (NM_198253, NM_009354) and / or SV40 large T antigen (NC_001669.1, Fiers, W. (05-11-1978) Nature 273: (5658) 113-120) ( Park IH. Et al., Nature, 451 (7175): 141-6, 2008).
  • TERT NM_198253, NM_009354
  • One or more genes selected from the group consisting of HPV16 E6, HPV16 E7, and Bmil NM_005180, NM_007552
  • Fbx15 Mol Cell Biol.
  • ECAT1 (AB211062, AB211060), DPPA5 (NM_001025290, NM_025274, XM_236761), DNMT3L (NM_013369, NM_019448), ECAT8 (AB211063, AB211061), GDF3 (NM_020634, NM_008108) _0 NM_028610), FTHL17 (NM_031894, NM_031261), SALL4 (NM_020436, NM_175303), Rex-1 (NM_174900, NM_009556), Utf1 (NM_003577, NM_009482), DPPA3 (NM_199286, NM_139218, STAT3, One or more genes selected from the group consisting of GRB2 (NM_002086, NM_008163) may be combined.
  • NM_024865, AB093574 NM_024865, AB093574
  • NM_024674 LIN28 gene
  • a combination of these with the MYC gene is also suitable (Liao J et al., Cell Res. 18 (5): 600-3, 2008). By additionally expressing these genes, induction of pluripotent stem cells can be promoted (WO2007 / 69666).
  • the myeloid transcription factor C / EBP ⁇ (CCAAT / enhancer-binding-protein ⁇ ) (NM_004364) is expressed ectopically, or the B cell transcription factor Pax5 (paired box 5) ; (NM_016734) can be suppressed to promote reprogramming (Hanna J, Cell. 133 (2): 250-64, 2008).
  • these factors can also be expressed using the Sendai virus vector in the present invention.
  • some of the recombinant vectors included in this kit can be replaced with proteins having a considerable function, synthetic compounds, and the like.
  • the efficiency of reprogramming can be improved by combining, for example, addition of a compound.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • SCF stem cell factor
  • PD98056 A MAP kinase inhibitor is also useful for establishing pluripotent stem cells closer to ES cells (WO2007 / 69666).
  • a DNA methylase (Dnmt) inhibitor and / or a histone deacetylase (HDAC) inhibitor improves the induction efficiency of pluripotent stem cells (Huangfu D et al., Nat Biotechnol. (Published online: 22 June 2008, doi: 10.1038 / nbt1418); Nat. Biotechnol. 26, 795-797 (2008)).
  • HDAC histone deacetylase
  • pluripotent stem cells can be induced by introduction of only two genes, OCT4 and SOX2 (Huangfu, D. et al., Nat Biotechnol. 2008 26 (11) : 1269-75).
  • the vector of the present invention is useful as an agent for use in combination with administration of these compounds.
  • Dnmt inhibitor for example, 5-azacytidine and the like
  • HDAC inhibitor for example, suberolanilide hydrozamic acid (SAHA), trichostatin A (TSA), valproic acid (VPA) and the like are useful.
  • SAHA suberolanilide hydrozamic acid
  • TSA trichostatin A
  • VPA valproic acid
  • the efficiency can be increased by using glucocorticoid (dexamethasone) in combination.
  • Sendai virus vector of the present invention containing KLF gene, OCT gene, and SOX gene in this order, Sendai virus vector containing KLF gene but not OCT gene and SOX gene, 2) A combination of the vector of (1) and a Sendai virus vector that expresses the MYC gene or Glis1 gene. (3) The Sendai virus vector that further expresses the NANOG gene in (1) and / or (2), and LIN28.
  • a combination comprising a Sendai virus vector, or a vector carrying the vector according to any one of (4) (1) to (4) and the above-mentioned other desired reprogramming factors and / or a desire to induce reprogramming Combinations with these compounds can be introduced into cells.
  • the introduction is preferably carried out simultaneously. Specifically, within 48 hours, preferably within 36 hours, more preferably after the first vector or compound is added. All vectors and / or encoding reprogramming factors within 24 hours, 18 hours, 12 hours, 10 hours, 8 hours, 6 hours, 3 hours, 2 hours, or 1 hour It is preferred to complete the addition of the compound.
  • the dose of the vector can be appropriately adjusted.
  • the MOI is 0.1 or more, preferably 0.3 or more, 0.5 or more, 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, or 5 or more, and 100 or less, preferably 90.
  • the infection is carried out with, for example, MOI of 0.3 to 100, more preferably MOI of 0.5 to 50, more preferably MOI of 1 to 40, more preferably MOI of 1 to 30, more preferably MOI of 2 to 30, such as MOI of 3 to 30.
  • the induced pluripotent stem cells form a flat colony similar to ES cells and express alkaline phosphatase.
  • the induced pluripotent stem cells may express undifferentiated cell markers such as Nanog, OCT4, and / or SOX2.
  • the induced pluripotent stem cells preferably express TERT and / or exhibit telomerase activity.
  • the present invention relates to a method for producing a cell that expresses alkaline phosphatase, and preferably further expresses Nanog and / or TERT, which are undifferentiated cell markers, and the above Sendai virus in the production of the cell and a drug that induces the cell It also relates to the use of vectors.
  • pluripotent stem cells can be prepared from desired cells including adult skin cells and neonatal foreskin cells.
  • pluripotent stem cell colonies are obtained from at least certain types of cells (eg, adult skin cells and / or neonatal foreskin cells), eg, 0.03 ⁇ 10 ⁇ 5 or more, 0.1 ⁇ 10 ⁇ 5 or more, 0.3 ⁇ Appearance rate of 10 -5 or more, 0.5 ⁇ 10 -5 or more, 0.8 ⁇ 10 -5 or more, or 1 ⁇ 10 -5 or more (for example, 1 ⁇ 10 ⁇ 5 to 1 ⁇ 10 ⁇ 3 ), preferably 1.5 ⁇ 10 -5 above, 1.7 ⁇ 10 -5 or more, 2.0 ⁇ 10 -5 or more, 2.5 ⁇ 10 -5 or more, 3 ⁇ 10 -5 or more, 4 ⁇ 10 -5 or more, 5 ⁇ 10 -5 or more, 8 ⁇ 10 - 5 or more, 1 ⁇ 10 ⁇ 4 or more, 2 ⁇ 10
  • At least 1 ⁇ 10 ⁇ 2 (0.01%), preferably at least 3 ⁇ 10 ⁇ 2 , 5 ⁇ 10 ⁇ 2 , 8 ⁇ 10 ⁇ 2 , 1 ⁇ 10 2 -1 , 2 ⁇ 10 ⁇ 1 , 3 ⁇ 10 ⁇ 1 , 4 ⁇ 10 ⁇ 1 , or 5 ⁇ 10 ⁇ 1 can induce pluripotent stem cells, and at least 1 from human peripheral blood monocytes ⁇ 10 ⁇ 3 (0.001%), preferably at least 3 ⁇ 10 ⁇ 3 , 5 ⁇ 10 ⁇ 3 , 8 ⁇ 10 ⁇ 3 , 1 ⁇ 10 ⁇ 2 , 2 ⁇ 10 ⁇ 2 , 3 ⁇ 10 ⁇ 2 , 4 ⁇ it can induce pluripotent stem cells 10-2 or 5 ⁇ 10 -2 efficiency.
  • the MOI may be appropriately set as described above, for example, 5, 10, or 30.
  • the appearance efficiency of colonies of pluripotent stem cells by the vector of the present invention containing the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene in this order and the Sendai virus vector containing the KLF gene but not the OCT gene and the SOX gene is the KLF gene
  • the Sendai virus vector of the present invention that expresses the OCT gene and the SOX gene is used, but at least 1.2 times or more for a certain cell as compared with the case where the Sendai virus vector containing the KLF gene and not the OCT gene and the SOX gene is not used.
  • the method of the present invention is superior to the conventional method in that the introduction efficiency of pluripotent stem cells when cultured at 37 ° C. after introduction of the vector is significantly high, and that the vector is rapidly dropped after induction of pluripotent stem cells. Compared to the remarkable effect.
  • somatic cells there are no particular limitations on the differentiated cells that are the targets for inducing reprogramming, and desired somatic cells can be used. It has been shown that the generation of pluripotent stem cells from somatic cells is possible not only from cells derived from mouse embryos but also from differentiated cells collected from the tail of adult mice, hepatocytes and gastric mucosa cells It is suggested that it does not depend on cell type or differentiation state (WO2007 / 069666; Aoi T. et al., Science [Published Online February 14, 2008]; Science. 2008; 321 (5889): 699-702) .
  • pluripotent stem cells are not dependent on the underlying cells.
  • the method of the present invention can be applied.
  • differentiated cells to be reprogrammed include fibroblasts, synovial cells, mucosal cells such as the oral cavity or stomach, hepatocytes, bone marrow cells, tooth germ cells, blood cells (for example, lymphocytes, White blood cells) and other desired cells.
  • the blood cell may be a peripheral blood cell.
  • fibroblasts are also preferred.
  • the cells may also be derived, for example, from embryonic, fetal, neonatal, child, adult or elderly cells.
  • the origin of the animal is not particularly limited, and includes humans and non-human primates (such as monkeys), rodents such as mice and rats, and mammals including non-rodents such as cows, pigs and goats, etc. It is.
  • cells from which the vector has been removed can be selected as appropriate.
  • a cell from which the vector has been naturally removed may be selected.
  • negative selection can be performed with an antibody specific to a viral vector (for example, an anti-HN antibody).
  • a temperature sensitive vector When a temperature sensitive vector is used, it is cultured at a normal temperature (eg, about 37 ° C., specifically 36.5-37.5 ° C., preferably 36.6-37.4 ° C., more preferably 36.7 ° C.-37.3 ° C.), or The vector can be easily removed by culturing at a slightly high temperature (for example, 37.5 to 39 ° C, preferably 38 to 39 ° C, or 38.5 to 39 ° C).
  • a slightly high temperature for example, 37.5 to 39 ° C, preferably 38 to 39 ° C, or 38.5 to 39 ° C.
  • PM SeV
  • Preferred vectors include, but are not limited to, combining SeV (PM) KOS / TS12 ⁇ F and SeV18 + KLF4 / TS ⁇ F.
  • the MYC gene can be introduced using SeV (HNL) c-rMYC / TS12 ⁇ F, SeV (HNL) c-rMYC / TS13 ⁇ F, SeV (HNL) c-rMYC / TS15 ⁇ F, or the like.
  • the combination of SeV (PM) KOS / TS12 ⁇ F, SeV18 + KLF4 / TS ⁇ F, and SeV (HNL) c-rMYC / TS15 ⁇ F is particularly preferable.
  • the fact that the MYC gene is not loaded on the Sendai virus vector carrying the KLF gene, OCT gene, and SOX gene has the advantage that reprogramming can be performed without using the MYC gene related to canceration.
  • the gene, OCT gene, and SOX gene, c-MYC, L-MYC, or Glis1 can be freely selected and used as the fourth factor.
  • the cells produced by the method of the present invention are useful for differentiating into various tissues and cells, and can be used in desired tests, research, diagnosis, examinations, treatments, and the like.
  • induced stem cells are expected to be used in stem cell therapy.
  • reprogramming is induced using somatic cells collected from a patient, and then somatic stem cells and other somatic cells obtained by inducing differentiation can be transplanted into the patient.
  • the method of inducing cell differentiation is not particularly limited, and differentiation can be induced by, for example, retinoic acid treatment, various growth factor / cytokine treatments, and hormone treatments.
  • the obtained cells can be used to detect the effect of a desired drug or compound, and through this, screening of the drug or compound can be performed.
  • Example 1 Construction of pSeV (PM) / TS ⁇ F A method for preparing Sendai virus vector pSeV (PM) / TS ⁇ F used in this example is shown below.
  • (PM) represents insertion of a reprogramming gene between the P gene and the M gene
  • (HNL) represents a reprogramming gene between the HN gene and the L gene. Is inserted.
  • TS refers to mutations of G69E, T116A, and A183S in the M protein, mutations of A262T, G264R, and K461G in the HN protein, L511F mutation in the P protein, and N1197S and K1795E in the L protein. It represents having a mutation, and “ ⁇ F” represents that the F gene is deleted.
  • SeV (PM) / TS ⁇ F refers to mutations of G69E, T116A, and A183S in the M protein, mutations of A262T, G264R, and K461G in the HN protein, L511F mutation in the P protein, and N1197S and L in the L protein.
  • F gene deletion type Sendai virus vector (Z strain) having K1795E mutation.
  • This vector has a transgene insertion site (NotI site) immediately below the P gene (between the P gene and the M gene).
  • NotI site transgene insertion site immediately below the P gene (between the P gene and the M gene).
  • PMNOTI-F 5'- GAAATTTCACCTAAGCGGCCGCAATGGCAGATATCTATAG -3 ') (SEQ ID NO: 10) and PMNOTI-R (5'-TAGCTGTAGCGTCTC) (SEQ ID NO: 11) PCR was carried out using scissors (94 ° C-3 minutes ⁇ 98 ° C-10 seconds, 55 ° C-15 seconds, 72 ° C-12 minutes, 25 cycles ⁇ 72 ° C-7 minutes). After approximately 11 kb of PCR product obtained was treated with Dpn I, 20 ⁇ l of this reaction solution was transformed with E. coli DH5 ⁇ (ToYoBooCode No.
  • the Not I fragment containing the KLF4 gene was cloned into the Not I site of the pSeV18 + / TS ⁇ F vector, and a clone with the correct sequence was selected by sequencing to obtain pSeV18 + KLF4 / TS ⁇ F.
  • the Sendai virus prepared from the transcription product of the pSeV18 + / TS ⁇ F vector is referred to as SeV18 + / TS ⁇ F
  • the Sendai virus prepared from the transcription product of the pSeV18 + KLF4 / TS ⁇ F vector is referred to as SeV18 + KLF4 / TS ⁇ F.
  • PCR products were mixed, using PrimeSter with F2001 and R3787 primers, and a cycle of 94 ° C for 3 minutes (98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds, 72 ° C for 2 minutes) for 30 cycles, 72 PCR was performed at 5 ° C. for 4 minutes at 4 ° C.
  • the PCR product was purified with a QIAquick PCR purification kit, digested with SalI and NotI, separated by agarose gel electrophoresis, and then a band of about 1.6 kbp was cut out and purified with a QIAquick Gel Extraction kit.
  • pSeV (PM) KOS / TS ⁇ F was digested with Not I, separated by 1% agarose gel electrophoresis, a band of about 3.6 kbp was excised, and purified by Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, catalog number 28706). Elute in 100 ⁇ l of eluate supplied with the kit.
  • the Not I fragment containing the KLF4 gene, OCT3 / 4 gene, and SOX2 gene was cloned into the Not I site of the pSeV (PM) / TS12 ⁇ F vector, and the clone with the correct sequence was selected by sequencing, and pSeV (PM) KOS / TS12 ⁇ F was selected. Obtained.
  • the Sendai virus produced from the transcription product of this vector is referred to as SeV (PM) KOS / TS12 ⁇ F.
  • NotI site of this pSeV (HNL) / TS15 ⁇ F was introduced by digesting NotI from pBS-KS-c-rMyc by NotI digestion and introducing the purified Not I fragment containing c-rMyc gene, and pSeV (HNL) c-rMyc / TS15 ⁇ F Got.
  • the base sequence and amino acid sequence of c-rMyc are shown in SEQ ID NOs: 8 and 9.
  • c-rMyc has the mutations a378g, t1122c, t1125c, a1191g, and a1194g.
  • the Sendai virus prepared from the transcription product of this vector is referred to as SeV (HNL) c-rMyc / TS15 ⁇ F.
  • Example 6 Production of induced pluripotent stem cells using Sendai virus vector carrying cell reprogramming gene 1 (iPS cells) Human neonatal foreskin-derived fibroblasts (BJ) (ATCC (www.atcc.org), CRL-2522) 5 x 10 5 (pieces) with 10% FBS (GIBCO-BRL) and penicillin (100 u / ml) streptomycin (100 ⁇ g 37 ml in DMEM (GIBCO-BRL, 11995), 10% FBS (Cell Culture Bioscience Cat. No.
  • the above-mentioned vector-introduced cells 1.0 ⁇ detached from a mitomycin-treated feeder cell (for example, MEF) 1.25 ⁇ 10 5 (cells) prepared in a gelatin-coated 6-well plate using a 0.25% trypsin-EDTA solution 1.0 ⁇ 10 4 (pieces) were added and cultured in a CO 2 incubator.
  • a mitomycin-treated feeder cell for example, MEF
  • the medium was changed from 10% FBS / PS / DMEM to a medium for primate ES (ReproCell, RCHEMD001) (bFGF added to 4 ng / ml), and cultured at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator .
  • the medium was changed every day or once every two days.
  • the medium may be a feeder cell conditioned medium.
  • the activity of alkaline phosphatase, an undifferentiated marker of ES cells was stained with NBCT / BCIP (PIERCE, NBT / BCIP, 1-Step, # 34042) to observe the induction efficiency of iPS cells ( Figure 1).
  • Example 7 Production of induced pluripotent stem cells (iPS cells) using Sendai virus vectors carrying cell reprogramming genes 2 Human neonatal foreskin-derived fibroblasts (BJ) (ATCC (www.atcc.org), CRL-2522) 5x 10 5 (piece) in a 6-well plate with 10% FBS (GIBCO-BRL) and penicillin (100u / ml) DMEM (GIBCO-BRL, 11995) containing streptomycin (100 ⁇ g / ml) (Nacalai Tesque, Code 26253-84), 10% FBS (Cell Culture Bioscience Cat. No.
  • conditions 1, 2, and 5 were cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • Conditions 3, 4 and 6 were cultured in a 5% CO 2 incubator at 35 ° C.
  • the medium was changed almost daily with 10% FBS / PS / DMEM.
  • 1.25 ⁇ 10 5 mitomycin-treated feeder cells (for example, MEF) prepared in a gelatin-coated 6-well plate were removed from the vector-introduced cells described above using a 0.25% trypsin-EDTA solution.
  • ⁇ 10 4 (pieces) were added and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • the medium was changed from 10% FBS / PS / DMEM to a medium for primate ES (ReproCell, RCHEMD001) (bFGF added to 4 ng / ml), and cultured at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator .
  • the medium was changed every day or once every two days.
  • the medium may be a feeder cell conditioned medium.
  • the activity of alkaline phosphatase, an undifferentiated marker of ES cells was stained with NBCT / BCIP (PIERCE, NBT / BCIP, 1-Step, # 34042) to observe the induction efficiency of iPS cells ( FIG. 3).
  • conditions 1, 2, and 5 were cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • Conditions 3, 4 and 6 were cultured in a 5% CO 2 incubator at 35 ° C.
  • the medium was changed almost daily with 10% FBS / PS / DMEM.
  • 1.25 ⁇ 10 5 mitomycin-treated feeder cells (for example, MEF) prepared in a gelatin-coated 6-well plate were removed from the vector-introduced cells described above using a 0.25% trypsin-EDTA solution.
  • ⁇ 10 5 (pieces) were added and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • the medium was changed from 10% FBS / PS / DMEM to a medium for primate ES (ReproCell, RCHEMD001) (bFGF added to 4 ng / ml), and cultured at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator .
  • the medium was changed every day or once every two days.
  • the medium may be a feeder cell conditioned medium.
  • the activity of alkaline phosphatase, an undifferentiated marker of ES cells was stained with NBCT / BCIP (PIERCE, NBT / BCIP, 1-Step, # 34042) to observe the induction efficiency of iPS cells ( FIG. 5).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • conditions 1, 2, and 5 were cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • Conditions 3, 4 and 6 were cultured in a 5% CO 2 incubator at 35 ° C.
  • the medium was changed almost daily with 10% FBS / PS / DMEM.
  • 1.25 ⁇ 10 5 mitomycin-treated feeder cells (for example, MEF) prepared in a gelatin-coated 6-well plate were removed from the vector-introduced cells described above using a 0.25% trypsin-EDTA solution.
  • ⁇ 10 5 (pieces) were added and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • the medium was changed from 10% FBS / PS / DMEM to a medium for primate ES (ReproCell, RCHEMD001) (bFGF added to 4 ng / ml), and cultured at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator .
  • the medium was changed every day or once every two days.
  • the medium may be a feeder cell conditioned medium.
  • the activity of alkaline phosphatase, an undifferentiated marker of ES cells was stained with NBCT / BCIP (PIERCE, NBT / BCIP, 1-Step, # 34042) to observe the induction efficiency of iPS cells ( FIG. 7).
  • Example 10 Evaluation of in vivo pluripotency of induced induced pluripotent stem cells In vivo pluripotency was confirmed by teratoma formation in immunodeficient mice.
  • BJ cell-derived iPS cell clone BJ-1215K # 1 and HDF cell-derived iPS cell clone HDF-1215K # 1 are inoculated subcutaneously in SCID mice, and tumor formation is confirmed after about 1 month, and specimens are collected after about 2 months After fixing with 10% formalin, it was embedded in paraffin, and the tissue sections were stained with hematoxylin and eosin to confirm the differentiation of the three germ layers (FIG. 9).
  • Example 12 Induction of iPS cells from mouse fibroblasts Fibroblasts derived from 129 + TER / SvJcl mice were seeded in 6-well plates at 5x10 5 cells / well, and CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) Overnight. The cells in the well for measuring the number of cells were detached using a trypsin-EDTA solution, and the number of cells per well was measured. Based on this cell number, the amount of vector was calculated.
  • ESG1106 was added to a final concentration of 1000 U / ml to prepare a mouse ES cell culture medium (hereinafter referred to as 2i / LIF medium)), and added in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ). Cultured. (Subsequently, the cells were cultured while changing the medium in 2i / LIF medium until the fifth day of vector infection. On the fifth day of infection, the feeder cells were placed in a 6-well plate coated with 0.1% gelatin solution at 1.4 ⁇ 10.
  • Example 13 Obtaining clones of mouse iPS cells From Example 10, 10 clones containing 1x10 4 cells / dish and 1x10 5 cells / dish were picked up 6 clones and 18 clones on the 16th day of infection. Culture was performed, and anti-SeV antibody staining was performed to confirm removal of the Sendai virus vector (FIG. 12). As a result, Sendai virus vector negative of 9 clones (clone numbers: 5-2, 5-6, 5-7, 5-11, 5-13, 5-14, 5-15, 5-16, 5-17) A clone was obtained.
  • Example 14 Gene expression analysis by immunostaining Evaluation of mouse iPS cells induced in Example 12 and confirmed to be negative for Sendai virus vector in Example 13 was performed by immunostaining with anti-NANOG antibody and anti-OCT4 antibody ( FIG. 13). As a result, three iPS cell clones (5-2, 5-7, 5-17) were stained in the same manner as mouse ES cells in which NANOG and OCT4 were positive controls. In negative control mouse fibroblasts, NANOG and OCT4 were not stained. Therefore, it was shown that the evaluated iPS cells expressed the NANOG and OCT4 genes at the protein level.
  • Example 15 Multipotency evaluation The mouse iPS cells induced in Example 12 and confirmed to be negative for Sendai virus vector in Example 13 were evaluated for pluripotency.
  • the embryoid body was formed by culturing in a serum medium not containing LIF (FIG. 14). Similar to mouse ES cells. After the formation of the embryoid body, it is subcultured to a gelatin-coated plate and cultured in a serum medium not containing LIF. On the fourth day, the cell nuclei are stained by GATA4 (transcription factor, a marker of endoderm). Stained ( Figure 15).
  • IPS cell induction from human monocytes 1 Induction of iPS cells from human CD14 + monocytes was performed. The monocytes used were purchased from LONZA (catalog number 2W-400C). Monocytes were cultured in IMDM (10% FBS / PS / IMDM) containing 10% fetal bovine serum and penicillin streptomycin. The frozen monocyte cells were thawed in a 37 ° C. water bath, transferred to a 50 ml Falcon tube containing 10 ml of 10% FBS / PS / IMDM medium, and mixed gently.
  • IMDM % FBS / PS / IMDM
  • the cell solution and the vector solution were mixed and added to a 6-well plate, and cultured overnight in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ).
  • 10% FBS / PS / IMDM was added at 1 ml / well and cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 2 days.
  • the medium was changed with 10% FBS / PS / IMDM until the third and fourth days of infection.
  • cells were detached using trypsin-EDTA, suspended in 10% FBS / PS / IMDM, added onto feeder cells, and in a CO 2 incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) Cultured.
  • the medium was changed using a medium for primate ES (ReproCell, RCHEMD001) (bFGF was added to 4 ng / ml). Thereafter, the culture was continued until the 28th day of vector infection while exchanging the medium.
  • the state of the cells in the induction process is shown in FIG. On day 28, alkaline phosphatase staining was performed, and induction of alkaline phosphatase positive colonies was observed (FIG. 20).
  • the induction efficiency of iPS cells increased depending on the amount of vector, and was about 0.01% to 0.03% (FIG. 21).
  • Example 17 Induction of iPS cells from human peripheral blood mononuclear cells Peripheral blood mononuclear cells were prepared from blood provided by two volunteers (referred to as donors 1 and 2) by the Ficoll method. Cytokine (100 ng / mL SCF, 100 ng / mL FLT-3 Ligand, 20 ng / mL Thrombopoetin, 10 ng) in PBMC medium (StemPro-34 SFM with StemPro-34 Nutrient, L-Glutamine, and penicillin streptomycin) / mL IL-6) was added to the culture medium (PBMC + medium). Vector infection was performed on the 4th day of culture.
  • a vector solution was prepared by adding the calculated vector to PBMC + medium.
  • the culture solution of PBMC was removed, a vector solution was added, and the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ).
  • On day 3 of vector infection cells were detached using trypsin-EDTA, suspended in PBMC + medium, added onto feeder cells, and cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). From the next day to the 6th day of infection, the medium was changed using PBMC medium and cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ).
  • Peripheral blood mononuclear cells were prepared by Ficoll method from blood provided by two volunteers (donors 3 and 4).
  • CD14 + cells were separated from the peripheral blood mononuclear cells using EasySep positive selection Human CD14 positive Selection kit (using Veritas, Cat. No. 18058) as a starting material.
  • FACS analysis using an anti-CD14 antibody confirmed that in peripheral blood mononuclear cells, CD14-positive cells were about 15% but were purified to 85% or more after separation.
  • the induction efficiency of pluripotent stem cells using a vector containing the KLF gene, the OCT gene, and the SOX gene in this order can be significantly improved.
  • a temperature-sensitive vector it is possible to induce pluripotent stem cells with high efficiency without culturing at low temperature while enabling rapid removal of the vector for induction of pluripotent stem cells.
  • the method of the present invention is expected to obtain physiologically more preferable pluripotent stem cells because no low temperature stimulation is applied to the cells.

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Abstract

　本発明は、多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法およびそのために用いられるベクターおよび組成物を提供する。KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を、この順序で含むベクターを導入する工程を含む多能性幹細胞の誘導において、KLF遺伝子を含みOCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターをさらに導入することにより、多能性幹細胞の誘導効率を有意に上昇させることに成功した。本発明の方法は、より生理環境に近い温度条件で効率よく多能性幹細胞を誘導することが可能で、多能性幹細胞を誘導後は、速やかにベクターが除去されるという優れた特徴を有する。本発明により、一段と効率的に多能性幹細胞の誘導を行うことが可能となった。

Description

多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法
　本発明は、多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法に関する。また本発明は、多能性幹細胞の誘導において用いられる遺伝子導入ベクター、遺伝子導入用組成物およびその使用に関する。本発明は具体的には、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含むベクターを導入する工程を含む多能性幹細胞の誘導において、多能性幹細胞の誘導効率を上昇させる技術に関する。
　体細胞からの多能性幹細胞（induced pluripotent stem (iPS) cells）（人工多能性幹細胞あるいは誘導多能性幹細胞とも言う）の誘導が報告されて以来（非特許文献1）、これまでヒトやマウスを含む様々な哺乳動物細胞において、リプログラミング因子の導入によりiPS細胞が作製されてきた（非特許文献1-9）。その多くはレトロウイルスベクターを用いてリプログラミング因子を導入するものであるが、レトロウイルスベクターは宿主ゲノムへのインテグレーションにより腫瘍発生のリスクがあることで、その使用は制限されてしまう（非特許文献3）。この問題を解決するために、これまでアデノウイルスベクターやプラスミドを用いてiPS細胞を誘導する試みが行われているが、DNA型のベクターを使う限りゲノムへのインテグレーションの懸念を完全に払拭することはできない。また、これらのベクターによるiPS細胞の誘導効率は極めて低い（非特許文献10-13）。
　このような問題を解決することを目指して、本発明者らは以前、RNA型ウイルスの１つであるセンダイウイルスベクターを用いてiPS細胞を誘導する系を開発している（特許文献1, 2）。センダイウイルスベクターを用いたiPS細胞の誘導効率は、それまでの他のベクターを用いた場合と比べて有意に高いものであった。またセンダイウイルスベクターは、ライフサイクルにおいてDNAフェーズを持たず、宿主ゲノムにインテグレーションされる懸念がないため安全性に優れ、またiPS細胞の誘導後にベクターを除去することも簡単である。しかしiPS細胞の誘導効率をさらに高める本発明の技術は知られていない。
国際公開WO 2010/008054 国際公開WO 2012/029770
Takahashi, K. and Yamanaka, S. (2006) Cell 126, 663-676 Maherali, N. et al. (2007) Cell Stem Cell 1, 55-70 Okita, K. et al. (2007) Nature 448, 313-317 Wernig, M. et al. (2007) Nature 448, 318-324 Takahashi, K. et al. (2007) Cell 131, 861-872 Yu, J. et al. (2007) Science 318, 1917-1920 Lowry, W.E. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 2883-2888 Park, I.H. et al. (2008) Nature 451, 141-146 Masaki, H. et al. (2008) Stem Cell Res. 1, 105-115 Stadtfeld, M. et al. (2008) Science 322, 945-949 Okita, K. et al. (2008) Science 322, 949-953 Yu, J. et al. (2009) Science 324, 797-801 Zhou, W. et al. (2009) Stem Cells 27, 2667-2674
　本発明は、多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法に関する。また本発明は、多能性幹細胞の誘導において用いられる遺伝子導入ベクター、遺伝子導入用組成物およびその使用を提供することを課題とする。本発明は具体的には、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含むベクターを導入する工程を含む多能性幹細胞の誘導において、多能性幹細胞の誘導効率を上昇させる方法およびそのために用いられる遺伝子導入ベクターおよび組成物を提供することを課題とする。
　本発明者らは、リプログラミング因子であるKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を、この順序で１つのベクターに含むベクターを導入する工程を含む多能性幹細胞の誘導において、多能性幹細胞の誘導効率をさらに改善する方法の探索を行った。特に、このベクターとして温度感受性ベクターを用いて多能性幹細胞の誘導を行う場合、ベクターを導入後に低温（36℃）で培養すれば、比較的高い効率で多能性幹細胞が誘導されるものの、通常の細胞の培養温度である37℃で培養すると、多能性幹細胞の誘導効率が著しく低下してしまう場合がある。温度感受性ベクターは、多能性幹細胞の誘導後にベクターを迅速に除去できる点では優れているものの、このように多能性幹細胞を効率的に誘導するためにはベクターを導入後に低温で培養する必要があるという問題があった。
　本発明者らは、温度感受性センダイウイルスベクターを用い、かつベクターを導入後に低温で培養することなく高い効率で多能性幹細胞を誘導できる方法を鋭意探索した。その結果、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を、この順序で１つのベクターに含むベクターを導入する際に、KLF遺伝子を含みOCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターをさらに導入することにより、低温で培養することなく多能性幹細胞の誘導効率を有意に上昇させることが可能であることを見出した。具体的には、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を、この順序で１つのベクターに含むベクターと、MYC遺伝子を発現するベクターだけを組み合わせて用いた場合よりも、これらのベクターに、KLF遺伝子を含みOCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターをさらに組み合わせることで、低温培養することなく顕著に高い効率でiPS細胞を誘導することが可能であった。
　これにより、細胞を低温培養することなく高効率で多能性幹細胞を誘導することが可能で、かつ多能性幹細胞の誘導後は速やかにベクターが除去される系を確立させることができた。
　すなわち本発明は、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含むベクターを導入する工程を含む多能性幹細胞の誘導において、多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法およびそのために用いられる遺伝子導入ベクターおよび組成物等に関し、より具体的には請求項の各項に記載の発明に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の２つまたはそれ以上の任意の組み合わせからなる発明も、本明細書において意図された発明である。すなわち本発明は、以下の発明に関する。
〔１〕　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターを導入し、低温培養せずに、多能性幹細胞を誘導する方法における多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法であって、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターをさらに導入する工程を含む方法。
〔２〕　約37℃で培養される、〔１〕に記載の方法。
〔３〕　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にD433A, R434A, K437A, 及びL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターを導入する工程をさらに含む、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にD433A, R434A, K437A, 及びL511F変異、そしてL蛋白質にL1361C, L1558I, N1197S, 及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔５〕に記載の方法。
〔７〕　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターを導入し、低温培養せずに、多能性幹細胞を誘導する方法における多能性幹細胞の誘導効率を改善するための薬剤の製造における、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターの使用。
〔８〕　多能性幹細胞を誘導する方法が、約37℃で培養する方法である、〔７〕に記載の使用。
〔９〕　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にD433A, R434A, K437A, 及びL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔７〕または〔８〕に記載の使用。
〔１０〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔７〕から〔９〕のいずれかに記載の使用。
〔１１〕　多能性幹細胞を誘導するための組成物であって、
（ａ）KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクター、および
（ｂ）KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクター、を含む組成物、
〔１２〕　多能性幹細胞を誘導するための組成物であって、
（ａ）KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターであって、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にD433A, R434A, K437A, 及びL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター、および
（ｂ）KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターであって、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター、
を含む組成物。
〔１３〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターをさらに含む、〔１１〕または〔１２〕に記載の組成物、
〔１４〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターであって、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にD433A, R434A, K437A, 及びL511F変異、そしてL蛋白質にL1361C, L1558I, N1197S, 及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターをさらに含む、〔１３〕に記載の組成物。
〔１５〕　低温培養せずに培養して多能性幹細胞を誘導するための組成物である、〔１１〕から〔１４〕のいずれかに記載の組成物。
〔１６〕　多能性幹細胞を誘導するためのキットであって、
（ａ）KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクター、および
（ｂ）KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクター、を含むキット、
〔１７〕　多能性幹細胞を誘導するためのキットであって、
（ａ）KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターであって、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にD433A, R434A, K437A, 及びL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター、および
（ｂ）KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターであって、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター、
を含むキット。
〔１８〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターをさらに含む、〔１６〕または〔１７〕に記載のキット、
〔１９〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターであって、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にD433A, R434A, K437A, 及びL511F変異、そしてL蛋白質にL1361C, L1558I, N1197S, 及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターをさらに含む、〔１８〕に記載のキット。
〔２０〕　低温培養せずに培養して多能性幹細胞を誘導するためのキットである、〔１６〕から〔１９〕のいずれかに記載のキット。
　なお、本明細書に記載した任意の技術的事項およびその任意の組み合わせは、本明細書に意図されている。また、それらの発明において、本明細書に記載の任意の事項またはその任意の組み合わせを除外した発明も、本明細書に意図されている。また本発明に関して、明細書中に記載されたある特定の態様は、それを開示するのみならず、その態様を含むより上位の本明細書に開示された発明から、その態様を除外した発明も開示するものである。
　本発明により、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で含むベクターを用いた多能性幹細胞の誘導効率を有意に向上させることが可能となる。特に温度感受性ベクターを利用することにより、多能性幹細胞の誘導後の速やかなベクターの除去を可能としつつ、培養を低温で行うことなく高い効率で多能性幹細胞の誘導を行うことができる点で有用である。
アルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導効率を示す図である。ヒト新生児包皮由来繊維芽細胞 (BJ) にベクターを感染させて28日目のアルカリホスファターゼ染色像を示した。 アルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導効率を示す図である。各条件は図３と同じである。 アルカリホスファターゼ染色したコロニーを示した図である。条件1、2においてアルカリホスファターゼ陽性コロニーの出現数は有意に高かった。 アルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導効率を示した図である。BJ細胞からの多能性幹細胞の誘導効率を示した。各条件は図３と同じである。 アルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導効率を示す図である。ヒト成人皮膚由来繊維芽細胞（HDF）にベクターを感染させ28日目の細胞をアルカリホスファターゼ染色した結果を示した。 アルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導効率を示す図である。ヒト成人皮膚由来繊維芽細胞（HDF）からの多能性幹細胞の誘導効率を示した。各条件は図５と同じである。 アルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導効率を示す図である。ヒト胎児肺細胞由来繊維芽細胞（MRC-5）ベクターを感染させ28日目の細胞をアルカリホスファターゼ染色した結果を示した。 アルカリホスファターゼ陽性iPS様細胞の誘導効率を示す図である。アルカリホスファターゼ陽性コロニーの誘導効率を示した図である。各条件は図７と同じである。 誘導された人工多能性幹細胞のin vivo多分化能の評価を示す図である。 誘導された人工多能性幹細胞の核型解析を示す図である。 マウス線維芽細胞からのiPS細胞誘導（アルカリホスファターゼ染色結果）を示す図である。 抗センダイウイルス抗体染色によるベクター除去の確認を示す図である。 免疫染色によるマーカー遺伝子発現確認を示す図である。 マウスiPS細胞の評価（胚葉体形成）の結果を示す図である。 マウスiPS細胞の評価（内胚葉への試験管内分化）を示す図である。 マウスiPS細胞の評価（中胚葉への試験管内分化）を示す図である。 マウスiPS細胞の評価（外胚葉への試験管内分化）を示す図である。 マウスiPS細胞の評価（外胚葉への試験管内分化）を示す図である。 ヒト単球からのiPS細胞誘導を示す図である。 ヒト単球からのiPS細胞誘導（アルカリホスファターゼ染色像）を示す図である。 ヒト単球からのiPS細胞誘導（iPS細胞の誘導効率）を示す図である。 ヒト末梢血単核球からのiPS細胞誘導（ドナー1の細胞の様子）を示す図である。 ヒト末梢血単核球からのiPS細胞誘導（ドナー2の細胞の様子）を示す図である。 ヒト末梢血単核球からのiPS細胞誘導（アルカリホスファターゼ染色）を示す図である。 ヒト末梢血単核球からのiPS細胞誘導（誘導効率）を示す図である。 ヒト単球からのiPS細胞誘導（ドナー3の細胞の様子）を示す図である。 ヒト単球からのiPS細胞誘導（ドナー4の細胞の様子）を示す図である。 ヒト単球からのiPS細胞誘導（アルカリホスファターゼ染色）を示す図である。 ヒト単球からのiPS細胞誘導（誘導効率）を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明は、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含むベクターを導入する工程を含む多能性幹細胞の誘導において、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターをさらに導入する工程を含む、多能性幹細胞の誘導効率を上昇させる方法に関する。より具体的には本発明の方法は、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性ウイルスベクターを導入して多能性幹細胞を誘導する方法における多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法であって、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないウイルスベクターをさらに導入する工程を含む方法である。
　ベクターを導入後の培養は、低温下（例えば36.5℃未満、より具体的には例えば36℃、またはそれ未満）で行う必要はない。すなわち本発明の方法は、温度感受性変異体ベクターを用いながら、低温培養（例えば36.5℃未満での培養）をせずに高い効率で多能性幹細胞を誘導することができ、かつ多能性幹細胞の誘導後、速やかにベクターが消失する点で優れている。例えば本発明は、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターを導入し、低温培養せずに多能性幹細胞を誘導する方法における多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法であって、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターをさらに導入する工程を含む方法に関する。細胞の培養温度は適宜選択することができるが、例えば約37℃、具体的には、36.5～37.5℃、好ましくは36.6～37.4℃、より好ましくは36.7℃～37.3℃で行うことができる。なお本発明において多能性幹細胞の誘導とは、多能性幹細胞の製造を含み、多能性幹細胞の誘導効率の改善には、多能性幹細胞の製造効率の改善を含む。
　多能性幹細胞の誘導においてMYC遺伝子を導入することは必須ではないが、MYC遺伝子を導入することで多能性幹細胞の誘導効率を上昇させることができる。MYC遺伝子は、例えば温度感受性ウイルスベクター、好ましくは温度感受性センダイウイルスベクターを用いて導入することができる。
　また本発明は、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含むベクター、およびKLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターを、体細胞等の分化した細胞に導入または接触させる工程を含む、細胞をリプログラムする方法を提供する。また本発明は、細胞のリプログラミングにおいて上記のリプログラミング因子遺伝子を導入するための方法であって、その必要のある細胞に、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含むベクター、およびKLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターを用いてこれらのリプログラミング因子遺伝子を導入することを含む方法、およびその方法における使用のための当該ベクターを含む組成物を提供する。
　本発明において多能性幹細胞とは、動物の胚盤胞期の胚の内部細胞塊より作られる幹細胞またはそれと類似した表現型を有する細胞を言う。具体的には、本発明において誘導される多能性幹細胞は、ES様細胞の指標であるアルカリホスファターゼを発現する細胞である。ここでES様細胞とは、ES細胞と類似した性質および/または形態を有する多能性幹細胞を言う。また好ましくは、多能性幹細胞は、培養することにより、細胞質に比べ核の容量の比率が高い細胞からなる扁平なコロニーを形成する。培養は、適宜フィーダーと共に培養してもよい。またMEFなどの培養細胞が数週間で増殖が停止するのに対し、多能性幹細胞は長期間の継代が可能であり、例えば３日ごとの継代で１５回以上、好ましくは２０回以上、２５回以上、３０回以上、３５回以上、または４０回以上継代しても、増殖性が失なわれないことにより確認することができる。また多能性幹細胞は、好ましくは内在性のOCT3/4またはNanog、より好ましくはその両方を発現する。また多能性幹細胞は、好ましくはTERTを発現し、テロメラーゼ活性（テロメリックリピート配列を合成する活性）を示す。また多能性幹細胞は、好ましくは三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に分化する能力（例えばテラトーマ形成および／または胚様体形成において確認できる）を持つ。より好ましくは、多能性幹細胞は、胚盤胞に移植することにより生殖系列キメラを生成する。Germline transmissionが可能な多能性幹細胞は、germline-competentな多能性幹細胞と言う。これらの表現型の確認は、周知の方法により実施することができる（WO2007/69666; Ichisaka T et al., Nature 448(7151):313-7, 2007）。
　また本発明において分化したとは、それ以前よりも分化段階が進んだことを言い、例えば多能性幹細胞よりも分化していることであってよく、複数の細胞系列に分化する能力をまだ持っている状態（例えば体性幹細胞など）、および最終分化した状態を含む。分化した細胞とは、多能性幹細胞から由来する（多能性幹細胞以外の）細胞である。分化した細胞は、例えば三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に分化する能力を持たないものであってよい。このような細胞は、初期化（reprogramming）されなければ三胚葉を形成する能力を持たない。また分化した細胞は、例えば自身が属する胚葉型以外の細胞を生成できない細胞であってよい。分化した細胞は体細胞であってよく、例えば生殖細胞以外の細胞であってよい。
　本発明において初期化（リプログラミング；reprogramming）とは、ある細胞の分化状態を、それより未分化な状態にすることを言い、例えば分化した細胞が脱分化すること、例えば分化多能性を持たない細胞から持つ細胞、例えば多能性幹細胞を誘導することが含まれる。また本発明において脱分化とは、ある細胞が、より未熟な（例えば未分化な）状態になることを言う。脱分化とは、ある細胞が分化して来た最初または途上の状態に戻ることであってよい。また脱分化とは、自身が属する胚葉型以外の細胞を生成できない細胞から、他の胚葉の細胞にも分化できる状態になることであってよい。脱分化には、例えば三胚葉分化能を持たない細胞が、三胚葉分化能を獲得することが含まれる。また脱分化には、多能性幹細胞の生成が含まれる。
　また本発明において体細胞とは、例えば多能性幹細胞や生殖細胞以外の細胞である。体細胞には、例えば多細胞生物を構成する細胞のうち多能性幹細胞以外の細胞、およびその培養細胞が含まれる。体細胞には、例えば体性幹細胞および最終分化した細胞が含まれる。
　本発明において低温培養とは、36.5℃より低い温度で培養することを言う。好ましくは低温培養は、36.4℃未満、より好ましくは36.3℃、36.2℃、36.1℃、36℃、35.9℃、35.8℃、35.7℃、35.6℃、35.5℃、35.4℃、35.3℃、35.2℃、35.1℃、より好ましくは35℃より低い温度で培養することを言う。下限は例えば30℃、好ましくは31℃、より好ましくは32℃、33℃、または34℃である。また、本発明において約37℃とは、具体的には、36.5～37.5℃、好ましくは36.6～37.4℃、より好ましくは36.7℃～37.3℃を言う。
　また本発明において温度感受性とは、低温 (例えば30～36℃) に比べ、通常の細胞培養温度（例えば37～38℃）において有意に活性が低下することである。より好ましくは、36℃に比べ、37℃において有意に活性が低下することをいう。例えば発現ベクターの場合、温度感受性ベクターとは、低温 (例えば30～36℃) 下での発現量に比べ、通常の細胞培養温度（例えば37～38℃）での発現量が有意に低いことを言う。例えばセンダイウイルスのTS 7（L蛋白質のY942H/L1361C/L1558I変異）、TS 12（P蛋白質のD433A/R434A/K437A変異、TS 13（P蛋白質のD433A/R434A/K437A変異および L蛋白質のL1558I変異、TS 14（P蛋白質のD433A/R434A/K437A変異および L蛋白質のL1361C）、TS 15（P蛋白質のD433A/R434A/K437A変異および L蛋白質のL1361C/L1558I）などの変異は、温度感受性変異である。
　本発明においてベクターは、好ましくはウイルスベクターである。また本発明においてウイルスベクターは、当該ウイルスに由来するゲノム核酸を有し、該核酸に導入遺伝子を組み込むことにより、該遺伝子を発現させることができるベクターである。センダイウイルスベクターは、染色体非組み込み型ウイルスベクターであって、ベクターは細胞質中で発現されるので、導入遺伝子が宿主の染色体（核由来染色体）に組み込まれる危険性がない。従って安全性が高く、またリプログラミングの完了後にベクターを除去することが可能である。本発明においてセンダイウイルスベクターには、感染性ウイルス粒子の他、ウイルスコア、ウイルスゲノムとウイルス蛋白質との複合体、または非感染性ウイルス粒子などからなる複合体であって、細胞に導入することにより搭載する遺伝子を発現する能力を持つ複合体が含まれる。例えばセンダイウイルスにおいて、センダイウイルスゲノムとそれに結合するセンダイウイルス蛋白質（NP、P、およびL蛋白質）からなるリボヌクレオ蛋白質（ウイルスのコア部分）は、細胞に導入することにより細胞内で導入遺伝子を発現することができる（WO00/70055）。細胞への導入は、適宜トランスフェクション試薬等を用いて行えばよい。このようなリボヌクレオ蛋白質（RNP）も本発明においてセンダイウイルスベクターに含まれる。
　センダイウイルスは、モノネガウイルス目(Mononegavirales)ウイルスの１つでパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, および Pneumovirus属等を含む）に属し、一本のマイナス鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖に対するアンチセンス鎖）のRNAをゲノムとして含んでいる。マイナス鎖RNAはネガティブ鎖RNAとも呼ばれる。
　モノネガウイルス目(Mononegavirales)には、パラミクソウイルス（パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ウイルス）の他に、ラブドウイルス（Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus, および Ephemerovirus属等を含む）、フィロウイルス（Filoviridae）などの科に属するウイルスが含まれる（ウイルス　第57巻　第１号、pp29-36、2007; Annu. Rev. Genet. 32, 123-162, 1998; Fields virology fourth　edition, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1305-1340,2001; Microbiol. Immunol. 43, 613-624, 1999; Field Virology, Third edition pp1205-1241 1996）。センダイウイルス以外のパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)ウイルスの例としては、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、おたふくかぜウイルス(Mumps virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、RSウイルス(Respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(rinderpest virus)、ジステンパーウイルス(distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、ヒトパラインフルエンザウイルス1,2,3型、オルトミクソウイルス科 (Orthomyxoviridae)のインフルエンザウイルス(Influenza virus)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)の水疱性口内炎ウイルス(Vesicular stomatitis virus)、狂犬病ウイルス(Rabies virus)等が挙げられ、さらに具体的に例示すれば、例えば Sendai virus (SeV)、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)、phocine distemper virus (PDV)、canine distemper virus (CDV)、dolphin molbillivirus (DMV)、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、rinderpest virus (RPV)、Hendra virus (Hendra)、Nipah virus (Nipah)、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)、simian parainfluenza virus 5 (SV5)、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)、human parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)、mumps virus (Mumps)、およびNewcastle disease virus (NDV) などが含まれる。より好ましくは、Sendai virus (SeV)、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)、phocine distemper virus (PDV)、canine distemper virus (CDV)、dolphin molbillivirus (DMV)、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MV)、rinderpest virus (RPV)、Hendra virus (Hendra)、および Nipah virus (Nipah) からなる群より選択されるウイルスが挙げられる。
　例えばセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、NP遺伝子については M29343、M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218、P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008、M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、F遺伝子については D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、HN遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131、L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、NP遺伝子（N遺伝子とも言う）については、CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; および Tupaia, AF079780、P遺伝子については、CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-l, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; および Tupaia, AF079780、C遺伝子については CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV-1. M74081; HPIV-3, D00047; MV, ABO16162; RPV, X68311; SeV, AB005796; および Tupaia, AF079780、M遺伝子については CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; および SV5, M32248、F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1. M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3. X05303, HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; および SV5, AB021962、HN（HまたはG）遺伝子については CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, Z81358; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; および SV-5, S76876 が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。これらのいずれかの遺伝子に由来するウイルス遺伝子を持つセンダイウイルスベクターは、本発明のベクターとして有用である。例えば本発明のセンダイウイルスベクターは、上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列と、90％以上、好ましくは95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上の同一性を持つ塩基配列を含む。また、本発明のセンダイウイルスベクターは、例えば上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列がコードするアミノ酸配列と、90％以上、好ましくは95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上の同一性を持つアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。また、本発明のセンダイウイルスベクターは、例えば上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列がコードするアミノ酸配列において、10個以内、好ましくは9個以内、8個以内、7個以内、6個以内、5個以内、4個以内、3個以内、2個以内、または1個のアミノ酸が置換、挿入、欠失、および/または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
　なお本明細書に記載した塩基配列およびアミノ酸配列などのデータベースアクセッション番号が参照された配列は、例えば本願の出願日および優先日における配列を参照するものであって、本願の出願日および優先日のいずれ時点における配列としても特定することができ、好ましくは本願の出願日における配列として特定される。各時点での配列はデータベースのリビジョンヒストリーを参照することにより特定することができる。
　本発明において用いられるセンダイウイルスベクターは誘導体であってもよく、誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。
　またセンダイウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。例えばZ株が挙げられる（Medical Journal of Osaka University Vol.6, No.1, March 1955 p1-15）。つまり、当該ウイルスは、目的とするリプログラミングを誘導できる限り、天然から単離されたウイルスと同様の構造を持つウイルスベクターであっても、遺伝子組み換えにより人為的に改変したウイルスであってもよい。例えば、野生型ウイルスが持ついずれかの遺伝子に変異や欠損があるものであってよい。また、DI粒子（J.Virol. 68: 8413-8417, 1994）などの不完全ウイルスを用いることも可能である。例えば、ウイルスのエンベロープ蛋白質または外殻蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子に変異または欠損を有するウイルスを好適に用いることができる。このようなウイルスベクターは、例えば感染細胞においてはゲノムを複製することはできるが、感染性ウイルス粒子を形成できないウイルスベクターである。このような伝搬能欠損型のウイルスベクターは、周囲に感染を拡大する懸念がないので安全性が高い。例えば、Fおよび/またはHNなどのエンベロープ蛋白質またはスパイク蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないウイルスベクターを用いることができる （WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。ゲノム複製に必要な蛋白質（例えば NP、P、およびL蛋白質）をゲノムRNAにコードしていれば、感染細胞においてゲノムを増幅することができる。欠損型ウイルスを製造するには、例えば、欠損している遺伝子産物またはそれを相補できる蛋白質をウイルス産生細胞において外来的に供給する（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。また、欠損するウイルス蛋白質を完全に相補することなく、非感染性のウイルス粒子（VLP）としてウイルスベクターを回収する方法も知られている（WO00/70070）。また、ウイルスベクターをRNP（例えば N、L、P蛋白質、およびゲノムRNAからなるRNP）として回収する場合は、エンベロープ蛋白質を相補することなくベクターを製造することができる。
　また、変異型のウイルス蛋白質遺伝子を搭載するウイルスベクターを用いることも好ましい。本発明は、特にウイルス遺伝子に変異および／または欠失を有するセンダイウイルスベクターを用いた、リプログラミングにおける遺伝子導入方法、リプログラムされた細胞の製造方法、そのための組成物、およびキットを提供する。例えば、エンベロープ蛋白質や外殻蛋白質において弱毒化変異や温度感受性変異を含む多数の変異が知られている。これらの変異蛋白質遺伝子を有するセンダイウイルスを本発明において好適に用いることができる。本発明においては、望ましくは細胞傷害性を減弱したベクターを用い得る。細胞傷害性は、例えば細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出を定量することにより測定することができる。例えば細胞傷害性が野生型に比べ有意に減弱化したベクターを用いることができる。細胞傷害性の減弱化の程度は、例えば、ヒト由来　HeLa細胞（ATCC CCL-2）またはサル由来　CV-1細胞（ATCC CCL 70）にMOI（感染価） 3で感染させて３日間培養した培養液中のLDH放出量が野生型に比べ有意に低下したもの、例えば20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、または50％以上低下したベクターを用いることができる。また細胞傷害性を低下させる変異には、温度感受性変異も含まれる。温度感受性変異とは、低温 (30℃ないし36℃、例えば30℃ないし32℃) に比べ、ウイルス宿主の通常の温度（例えば37℃ないし38℃）において有意に活性が低下する変異のことである。このような、温度感受性変異を持つ蛋白質は、許容温度（低温）下でウイルスを作製することができるので便利である。本発明において有用な温度感受性変異を持つウイルスベクターは、例えば培養細胞において32℃で感染させた場合に比べ、37℃で感染させた場合に、増殖速度または遺伝子発現レベルが、少なくとも1/2以下、好ましくは1/3以下、より好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/20以下である。
　本発明において用いられるセンダイウイルスベクターは、リプログラミングを阻害せず、リプログラミング因子を発現させ、それによるリプログラミングを誘導または誘導を補助できる限り野生型でもよく、また、好ましくは少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２、３、４、５、またはそれ以上のウイルス遺伝子に欠失または変異を有する。欠失と変異は、各遺伝子に対して任意に組み合わせて導入してよい。ここで変異とは、機能低下型の変異または温度感受性変異であってよく、好ましくは、少なくとも37℃において、野生型または当該変異を有さないウイルスに比べ、ウイルスの粒子形成能（非伝播型ウイルスにおいては非感染性ウイルス様粒子（Nontransmissible virus-like particle formation; NTVLP）形成能 (Inoue et al., J. Virol. 77:3238-3246, 2003)）、増殖速度および/または搭載するいずれかの遺伝子の発現レベルを好ましくは1/2以下、より好ましくは1/3以下、より好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/20以下に低下させる変異である。このような改変ウイルスベクターを用いることは、特に多能性幹細胞の誘導には有用であり得る。例えば本発明において好適に用いられるセンダイウイルスベクターは、少なくとも２つのウイルス遺伝子が、欠失または変異している。このようなウイルスには、少なくとも２つのウイルス遺伝子が欠失しているもの、少なくとも２つのウイルス遺伝子が変異しているもの、少なくとも１つのウイルス遺伝子が変異しており少なくとも１つのウイルス遺伝子が欠失しているものが含まれる。変異または欠失している少なくとも２つのウイルス遺伝子は、好ましくはエンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子である。例えばF遺伝子を欠失し、Mおよび／またはHN遺伝子をさらに欠失するか、Mおよび／またはHN遺伝子に変異（例えばNTVLP形成抑制型変異および/または温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。また、例えばF遺伝子を欠失し、MまたはHN遺伝子をさらに欠失し、残るMおよび／またはHN遺伝子に変異（例えばNTVLP形成抑制型変異および/または温度感受性変異）をさらに有するベクターも、本発明において好適に用いられる。本発明において用いられるベクターは、より好ましくは、少なくとも３つのウイルス遺伝子（好ましくはエンベロープ構成蛋白質をコードする少なくとも３つの遺伝子；F, HN, およびM）が、欠失または変異している。このようなウイルスベクターには、少なくとも３つの遺伝子が欠失しているもの、少なくとも３つの遺伝子が変異しているもの、少なくとも１つの遺伝子が変異しており少なくとも２つの遺伝子が欠失しているもの、少なくとも２つの遺伝子が変異しており少なくとも１つの遺伝子が欠失しているものが含まれる。より好ましい態様を挙げれば、例えばF遺伝子を欠失し、MおよびHN遺伝子をさらに欠失するか、MおよびHN遺伝子に変異（例えばNTVLP形成抑制型変異および/または温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。また例えばF遺伝子を欠失し、MあるいはHN遺伝子をさらに欠失し、残るMあるいはHN遺伝子に変異（例えばNTVLP形成抑制型変異および/または温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。このような変異型のウイルスは、公知の方法に従って作製することが可能である。
　例えば、センダイウイルスのM遺伝子の好ましい変異としては、M蛋白質における69位（G69）、116位（T116）、および183位（A183）からなる群より任意に選択される部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246）。センダイウイルスのM蛋白質に上記の３つの部位のいずれか、好ましくは任意の２部位の組み合わせ、さらに好ましくは３つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異M蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適に用いられる。
　アミノ酸変異は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましく、例えばBLOSUM62マトリックス（Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）の値が３以下、好ましくは２以下、より好ましくは１以下、より好ましくは０のアミノ酸に置換する。具体的には、センダイウイルスM蛋白質のG69、T116、およびA183を、それぞれGlu (E)、Ala (A)、およびSer (S) へ置換することができる。また、麻疹ウイルス温度感受性株 P253-505（Morikawa, Y. et al., Kitasato Arch. Exp. Med. 1991: 64; 15-30）のM蛋白質の変異と相同な変異を利用することも可能である。変異の導入は、例えばオリゴヌクレオチド等を用いて、公知の変異導入方法に従って実施すればよい。
　また、HN遺伝子の好ましい変異としては、例えばセンダイウイルスのHN蛋白質の262位（A262）、264位（G264）、および461位（K461）からなる群より任意に選択される部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246）。３つの部位のいずれか１つ、好ましくは任意の２部位の組み合わせ、さらに好ましくは３つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異HN蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適に用いられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。好ましい一例を挙げれば、センダイウイルス HN蛋白質のA262、G264、およびK461を、それぞれThr (T)、Arg (R)、およびGly (G) へ置換する。また、例えば、ムンプスウイルスの温度感受性ワクチン株 Urabe AM9を参考に、HN蛋白質の464及び468番目のアミノ酸に変異導入することもできる（Wright, K. E. et al., Virus Res. 2000: 67; 49-57）。
　またセンダイウイルスは、P遺伝子および／またはL遺伝子に変異を有していてもよい。このような変異としては、具体的には、SeV P蛋白質の86番目のGlu（E86）の変異、SeV P蛋白質の511番目のLeu（L511）の他のアミノ酸への置換が挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、86番目のアミノ酸のLysへの置換、511番目のアミノ酸のPheへの置換などが例示できる。またL蛋白質においては、SeV L蛋白質の1197番目のAsn（N1197）および／または1795番目のLys（K1795）の他のアミノ酸への置換が挙げられ、上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、1197番目のアミノ酸のSerへの置換、1795番目のアミノ酸のGluへの置換などが例示できる。P遺伝子およびL遺伝子の変異は、持続感染性、２次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。さらに、エンベロープ蛋白質遺伝子の変異および／または欠損を組み合わせることで、これらの効果を劇的に上昇させることができる。またL遺伝子は、SeV L蛋白質の1214番目のTyr（Y1214）および／または1602番目のMet（M1602）の他のアミノ酸への置換が挙げられ、上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、1214番目のアミノ酸のPheへの置換、1602番目のアミノ酸のLeuへの置換などが例示できる。以上に例示した変異は、任意に組み合わせることができる。
　例えば、SeV M蛋白質の少なくとも69位のG、116位のT、及び183位のA、SeV HN蛋白質の少なくとも262位のA，264位のG，及び461位のK、SeV P蛋白質の少なくとも511位のL、SeV L蛋白質の少なくとも1197位のN及び1795位のKが、それぞれ他のアミノ酸に置換されており、かつF遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクター、ならびに、細胞傷害性がこれらと同様またはそれ以下、および/または37℃におけるNTVLP形成の抑制がこれらと同様またはそれ以上のF遺伝子欠損または欠失センダイウイルスベクターは、本発明において核初期化因子（nuclear reprogramming factors）を発現させるために特に好適である。具体的な置換例を例示すれば、例えばM蛋白質についてはG69E，T116A，及びA183Sの置換を、HN蛋白質についてはA262T，G264R，及びK461Gの置換を、P蛋白質についてはL511Fの置換を、そしてL蛋白質についてはN1197S及びK1795Eの置換を挙げることができる。
　また、L蛋白質の変異としては、SeV L蛋白質の942位（Y942）、1361位（L1361）、および1558位（L1558）から任意に選択される部位のアミノ酸の他のアミノ酸への置換も挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、942番目のアミノ酸のHisへの置換、1361番目のアミノ酸のCysへの置換、1558番目のアミノ酸のIleへの置換などが例示できる。特に少なくとも942位または1558位が置換されたL蛋白質を好適に用いることができる。例えば1558位に加え、1361位も他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質も好適である。また、942位に加え、1558位および/または1361位も他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質も好適である。これらの変異により、L蛋白質の温度感受性を上昇させることができる。
　またP蛋白質の変異としては、SeV P蛋白質の433位（D433）、434位（R434）、および437位（K437）から任意に選択される部位のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、433番目のアミノ酸のAla (A) への置換、434番目のアミノ酸のAla (A) への置換、437番目のアミノ酸のAla (A) への置換などが例示できる。特にこれら３つの部位全てが置換されたP蛋白質を好適に用いることができる。これらの変異により、P蛋白質の温度感受性を上昇させることができる。
　SeV P蛋白質の少なくとも433位のD、434位のR、および437位のKの３箇所が、他のアミノ酸に置換された変異P蛋白質、およびSeV L蛋白質の少なくとも1558位のLが置換された変異L蛋白質（好ましくは少なくとも1361位のLも他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質）をコードする、F遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクター、ならびに、細胞傷害性がこれと同様またはそれ以下、および/または温度感受性がこれと同様またはそれ以上のF遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクターも、本発明において好適に用いられる。各ウイルス蛋白質は、上記の変異以外に他のアミノ酸（例えば10以内、5以内、4以内、3以内、2以内、または1アミノ酸）に変異を有していてもよい。上記に示した変異を有するベクターは高い温度感受性を示すので、リプログラミングが完了した後、細胞を通常温度（例えば約37℃、具体的には36.5～37.5℃、好ましくは36.6～37.4℃、より好ましくは36.7℃～37.3℃）で培養することにより、ベクターを簡便に除去することができる。ベクターの除去においては、やや高温（例えば37.5～39℃、好ましくは38～39℃、または38.5～39℃）で培養してもよい。
　より具体的に例を挙げれば、例えば
TS 7：L (Y942H/L1361C/L1558I)
TS 12：P(D433A/R434A/K437A)
TS 13：P(D433A/R434A/K437A), L(L1558I)
TS 14：P(D433A/R434A/K437A), L(L1361C)
TS 15：P(D433A/R434A/K437A), L(L1361C/L1558I)
などの変異を持つセンダイウイルスベクターを好適に用いることができる(国際公開番号 WO2010/008054)。
　具体的なベクターを例示すれば、例えばM蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（例えばZ strain）であってよく、このベクターにさらに上記の TS 7、TS 12、TS 13、TS 14、またはTS 15の変異を導入したベクターはより好ましい。具体的には、SeV18+/TSΔF（WO2010/008054、WO2003/025570）やSeV(PM)/TSΔF、および、これらにさらにTS 7、TS 12、TS 13、TS 14、またはTS 15の変異を導入したベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　なお「TSΔF」は、M蛋白質にG69E,T116A,及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T,G264R,及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持ち、F遺伝子を欠失することを言う。
　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターとしては、特にM蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターであって、さらに上記の TS 7、TS 12、TS 13、TS 14、またはTS 15の変異を有するベクターが好ましい。より好ましくは、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持ち、さらに TS 12 の変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである。KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を含むセンダイウイルスにおいては、好ましくはKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子は、この順番でセンダイウイルスのP遺伝子の直後、すなわちP遺伝子のすぐ下流（マイナス鎖RNAゲノムのすぐ5'側）に組み込まれる。
　特にSeV(PM)KOS/TS7ΔF、SeV(PM)KOS/TS12ΔFなどが好ましいベクターとして挙げられ、より好ましくはSeV(PM)KOS/TS12ΔFが挙げられるが、これらに限定されない。
　このとき、KLF遺伝子を発現するセンダイウイルスベクター（KLF遺伝子を搭載し、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を搭載しないベクター）を組み合わせることが好ましい。KLF遺伝子をコードする（KLF遺伝子を搭載し、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を搭載しない）センダイウイルスベクターとしては、温度感受性であってもなくてもよいが、好ましくは、当該ベクターは37℃においてNTVLP形成が抑制される変異を有する。NTVLP形成は、文献Inoue et al., J. Virol. 77:3238-3246, 2003に従って測定することができる。好ましいベクターとして、例えばM蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターを挙げることができる。KLF遺伝子を搭載し、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を搭載しないセンダイウイルスベクターは、37℃で搭載遺伝子（KLF遺伝子）を発現できるものである。当該ベクターとしては、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含むセンダイウイルスベクターよりも、37℃における搭載遺伝子の発現効率が高いものが用いられる。具体的には、上記のKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターよりも温度感受性が低い（37℃でも耐性が高く、搭載遺伝子の発現レベルが相対的に高い）ものが好ましい。KLF遺伝子は、例えばセンダイウイルスベクターのN遺伝子の上流（ゲノム上のN遺伝子の3'側）に挿入することができ、特にSeV18+KLF4/TSΔFを好ましいベクターとして挙げることができる。
　またこのとき、MYC遺伝子をコードする温度感受性ウイルスベクターを組み合わせることが好ましい。MYC遺伝子をコードする温度感受性ウイルスベクターとしては、例えばMYC遺伝子をコードする温度感受性センダイウイルスベクターが挙げられる。より具体的には、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターであって、さらに上記の TS 7、TS 12、TS 13、TS 14、またはTS 15の変異を有するベクターが好ましい。より好ましくは、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持ち、さらに TS 15 の変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである。MYC遺伝子は、例えばHN遺伝子の直後、すなわちHN遺伝子のすぐ下流（マイナス鎖RNAゲノムのすぐ5'側）、例えばHN遺伝子とL遺伝子の間に組み込まれる。より具体的には、SeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔF、SeV(HNL)c-rMYC/TS13ΔF、またはSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF等が挙げられ、特にSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFが好ましい。特に、SeV(PM)KOS/TS12ΔF、SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF、およびSeV18+KLF4/TSΔFを組み合わせることで、好適な結果を得ることができる。
　ベクターの細胞傷害性は、例えば細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出を定量することにより測定することができる。具体的には、例えばHeLa（ATCC CCL-2）またはサルCV-1（ATCC CCL 70）にMOI 3で感染させて３日間培養した培養液中のLDH放出量を測定する。LDH放出量が少ないほど細胞傷害性は低い。また温度感受性は、ウイルス宿主の通常の温度（例えば37℃ないし38℃）におけるウイルスの増殖速度または搭載遺伝子の発現レベルを測定することにより決定することができる。変異を有さないものに比べ、ウイルスの増殖速度および/または搭載遺伝子の発現レベルが低下すれば、その変異は温度感受性変異だと判断され、当該増殖速度および/または発現レベルが低下するほど、温度感受性は高いと判断される。
　またエンベロープウイルスを用いる場合は、ウイルスが本来持つエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むウイルスを使用してもよい。例えば、ウイルス製造の際に、所望の外来性エンベロープ蛋白質をウイルス産生細胞で発現させることにより、これを含むウイルスを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はなく、哺乳動物細胞への感染能を付与する所望の接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質を用いることができる。具体的には、例えば水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus; VSV）のG蛋白質（VSV-G）を挙げることができる。VSV-G蛋白質は、任意のVSV株に由来するものであってよく、例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981)）由来のVSV-G蛋白を用いることができるが、これに限定されない。本発明において用いられるセンダイウイルスベクターは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて含むことができる。
　核初期化因子（nuclear reprogramming factors）を持つ組換えセンダイウイルスの再構成は公知の方法を利用して行えばよい。具体的な手順として、典型的には、（ａ）センダイウイルスゲノムRNA（マイナス鎖）またはその相補鎖（プラス鎖）をコードするcDNAを、ウイルス粒子形成に必要なウイルス蛋白質（NP、P、およびL）を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）生成したウイルスを含む培養上清を回収する工程、により製造することができる。粒子形成に必要なウイルス蛋白質は、転写させたウイルスゲノムRNAから発現されてもよいし、ゲノムRNA以外からトランスに供給されてもよい。例えば、NP、P、およびL蛋白質をコードする発現プラスミドを細胞に導入して供給することができる。ゲノムRNAにおいて粒子形成に必要なウイルス遺伝子が欠損している場合は、そのウイルス遺伝子をウイルス産生細胞で別途発現させ、粒子形成を相補することもできる。ウイルス蛋白質やRNAゲノムを細胞内で発現させるためには、該蛋白質やゲノムRNAをコードするDNAを宿主細胞で機能する適当なプロモーターの下流に連結したベクターを宿主細胞に導入する。転写されたゲノムRNAは、ウイルス蛋白質の存在下で複製され、感染性ウイルス粒子が形成される。エンベロープ蛋白質などの遺伝子を欠損する欠損型ウイルスを製造する場合は、欠損する蛋白質またはその機能を相補できる他のウイルス蛋白質などをウイルス産生細胞において発現させることもできる。
　例えば、センダイウイルスの製造は、以下の公知の方法を利用して実施することができる（WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570； WO2005/071092; WO2006/137517; WO2007/083644; WO2008/007581; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 及び Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38、Li, H.-O. et al., J. Virol. 2000: 74; 6564-6569）。またウイルスの増殖方法および組み換えウイルスの製造方法については、ウイルス学実験学 各論、改訂二版（国立予防衛生研究所学友会編、丸善、1982）も参照のこと。
　上記のセンダイウイルスには、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子が、この順番でセンダイウイルスに組み込まれる。また別のセンダイウイルスには、KLF遺伝子が組み込まれる（このベクターにはOCT遺伝子およびSOX遺伝子は組み込まれない）。これらの外来遺伝子は、一般に、いずれかのウイルス遺伝子（NP, P, M, F, HN, または L）の直前（ゲノムの3'側）または直後（ゲノムの5'側）に挿入することができる。
　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を含むセンダイウイルスにおいては、好ましくはKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子は、この順番でセンダイウイルスのP遺伝子の直後、すなわちP遺伝子のすぐ下流（マイナス鎖RNAゲノムのすぐ5'側）に組み込まれる。例えばP遺伝子とKLF遺伝子の間には、転写開始シグナル（S配列）、転写終結シグナル（E配列）、およびスペーサー配列（介在配列 (I配列) など）は含まれうるものの、他の転写単位（例えば蛋白質をコードする遺伝子をコードする転写単位）は含まれない。センダイウイルスはマイナス鎖RNAをゲノムに持つことから、通常とは逆で、ゲノムの3'側が上流にあたり、5'側が下流にあたる。センダイウイルスのゲノム上でKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子がこの順番で並ぶとき、KLF遺伝子が3つの遺伝子の中では最も3'側に配置され、SOX遺伝子が最も5'側に配置される。なおマイナス鎖RNAは遺伝子をアンチセンスにコードすることから、ゲノム上のKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子は、蛋白質のコード鎖（センス鎖）ではなくアンチセンス鎖としてコードされている。センダイウイルスゲノムは、細胞に入るとこのゲノムを鋳型にしてアンチゲノムRNAが生成する。アンチゲノムはプラス鎖であって、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子は、蛋白質をコードする鎖（センス鎖）が搭載されている。アンチゲノムRNAにおいては、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子の配置は、KLF遺伝子が3つの遺伝子の中では最も5'側に配置され、SOX遺伝子が最も3'側に配置されている。
　3つの遺伝子は、好ましくは互いに隣接している（すなわち３つの遺伝子の間に他の遺伝子が入ることはない）。それぞれの遺伝子は、適宜センダイウイルスS（Start）配列とE（End）配列で挟まれていてよい。S配列は転写を開始させるシグナル配列であり、E配列で転写が終結する。S配列とE配列で挟まれた領域は、１つの転写単位となる。ある遺伝子のE配列と次の遺伝子のS配列の間は、適宜スペーサーとなる配列（介在配列；intervening sequence）を挿入することができる。例えば S - KLF遺伝子 -E-I-S- OCT遺伝子 -E-I-S- SOX遺伝子 -E（S, I, およびE はそれぞれS配列、I (intervening) 配列、およびE配列を表す）の構成をもつ核酸をゲノムに含むセンダイウイルスベクターを好適に用いることができる。センダイウイルスゲノム上のP遺伝子とKLF遺伝子は、P遺伝子 -E-I-S- KLF遺伝子 - ... のように結合される。
　OCT遺伝子、SOX遺伝子、およびKLF遺伝子の順番で配置される場合は、例えば S - OCT遺伝子 -E-I-S- SOX遺伝子 -E-I-S- KLF遺伝子 -E（S, I, およびE はそれぞれS配列、I (intervening) 配列、およびE配列を表す）の構成をもつ核酸をゲノムに含むセンダイウイルスベクターを好適に用いることができる。センダイウイルスゲノム上のP遺伝子とSOX遺伝子は、P遺伝子 -E-I-S- SOX遺伝子 - ... のように結合される。
　S配列としては、センダイウイルスの所望のS配列を用いることができるが、例えば 3'-UCCCWVUUWC-5'（W= AまたはU; V= A, C, またはG）（配列番号：1）の配列を好適に用いることができる。特に 3'-UCCCAGUUUC-5'（配列番号：2）、3'-UCCCACUUAC-5'（配列番号：3）、および 3'-UCCCACUUUC-5'（配列番号：4）が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードするDNA配列で表すとそれぞれ 5'-AGGGTCAAAG-3'（配列番号：5）、5'-AGGGTGAATG-3'（配列番号：6）、および 5'-AGGGTGAAAG-3'（配列番号：7）である。センダイウイルスベクターのE配列としては、例えば 3'-AUUCUUUUU-5'（プラス鎖をコードするDNAでは 5'-TAAGAAAAA-3'）が好ましい。I配列は、例えば任意の3塩基であってよく、具体的には 3'-GAA-5'（プラス鎖DNAでは 5'-CTT-3'）を用いればよい。
　野生型センダイウイルスのゲノムは、3'の短いリーダー領域に続き、ヌクレオキャプシド（NP）遺伝子、ホスホ（P）遺伝子、マトリックス（M）遺伝子、フュージョン（F）遺伝子、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ（HN）遺伝子、およびラージ（L）遺伝子、及び短い5'トレイラー領域をこの順序で含んでいる。センダイウイルスベクターにおいても、この順番でウイルス遺伝子を配置することができる。野生型ウイルスに相当する組み換えベクターや、様々な変異型ベクターの作製が既に知られている。さらには、そのエンベロープを除いたRNPのみでも遺伝子導入が可能であることが示されている（WO00/70055）。よって、センダイウイルスRNPをウイルスベクターとして用いてリプログラミングを行うことができる。
　センダイウイルスはNP遺伝子、P遺伝子、およびL遺伝子があればベクターとして十分機能でき、細胞中でゲノムを複製し、搭載されている外来遺伝子（KLF、OCT、およびSOX等）を発現させることができる。ウイルス遺伝子としてNP遺伝子、P遺伝子、およびL遺伝子の３遺伝子を含むセンダイウイルスであれば、KLF、OCT、およびSOX遺伝子のセットは、例えばP遺伝子とL遺伝子の間に挿入される。M遺伝子を含むベクターであれば、KLF、OCT、およびSOX遺伝子のセットは、例えばP遺伝子とM遺伝子の間に挿入される（WO97/16539）。M遺伝子欠失型のセンダイウイルスベクターでF遺伝子を含む場合は、KLF、OCT、およびSOX遺伝子のセットはP遺伝子とF遺伝子の間に挿入される（WO00/70070）。MおよびF遺伝子欠失型であればP遺伝子とHN遺伝子の間に、F、M、HN遺伝子欠失型であればP遺伝子とL遺伝子の間に挿入される（WO2003/025570、WO2006/137517）。ウイルス遺伝子を欠失するベクターは安全性が高いので好ましい。本発明においては、少なくともF遺伝子を欠失したベクターを好適に用いることができる。
　また、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターであれば、KLF遺伝子は、例えばNP遺伝子の上流（3'リーダー配列とNP遺伝子との間）に挿入される。
　KLF、OCTおよびSOX遺伝子を含む上記センダイウイルスベクターおよびKLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターは、それらだけを用いて適宜リプログラミングにおける遺伝子導入に使用することができるが、MYC遺伝子をさらに導入するリプログラミングにおいて使用することがより好ましい。MYC遺伝子の代わりにGlis1遺伝子（Maekawa et al., Nature, 474: 225-229, 2011）を発現するベクターを組み合わせてもよい。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子は上記のKLF、OCTおよびSOX遺伝子を含むセンダイウイルスベクターまたはKLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターの中に挿入することもできるが、別のベクターに挿入して使用してもよい。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子を別のベクターに挿入する場合、ベクターはプラスミド、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えばリポソーム）など所望のベクターを使用することができる。ウイルスベクターとしてはアデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない。より好ましくは、MYC遺伝子またはGlis1遺伝子は、センダイウイルスベクターに挿入される。本発明においては、KLF、OCTおよびSOX遺伝子を含む上記センダイウイルスベクターおよび、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターは、MYC遺伝子またはGlis1遺伝子が挿入された別のセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いることがより好ましい。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子を挿入する元となるセンダイウイルスベクターは、上記に記載したセンダイウイルスベクターを使用することができる。
　MYC遺伝子またはGlis1遺伝子をセンダイウイルスゲノムに挿入する場合、遺伝子のベクター中の挿入位置は所望の部位を選択することができる。例えばMYC遺伝子またはGlis1遺伝子は、マイナス鎖RNAゲノムの後方（5'側）、例えばマイナス鎖RNAウイルスのゲノムの中央よりも5'端側（順番が真中の遺伝子よりも5'端側）、すなわちゲノム上に配置される複数の蛋白質コード配列において、3'側から数えるよりも5'側から数えた方が早い位置に配置することが好ましい（実施例参照）。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子は、例えば最も5'側（すなわち5'側から1番目）、あるいは5'側から2または3番目に配置することができる。MYC遺伝子またはGlis1遺伝子は、例えばゲノムの5'側から2番目、具体的には、ゲノムの最も5'側にL遺伝子があり、その次にHN遺伝子がある場合に、HN遺伝子とL遺伝子の間（HN-L間）に配置してもよい。特にMYC遺伝子またはGlis1遺伝子をセンダイウイルスゲノム上のL遺伝子のすぐ上流（3'側、例えばHN遺伝子とL遺伝子の間）、またはすぐ下流（5'側、例えばL遺伝子と5'トレイラー配列の間）に挿入することが好ましい。HN遺伝子とL遺伝子の間にMYC遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクターが最も好適である。センダイウイルスベクターとしては、例えばM蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（例えばZ strain）であってよく、このベクターにさらにTS 7、TS 12、TS 13、TS 14、またはTS 15の変異を導入したベクターはより好ましい。
　MYC遺伝子は、野生型c-MYCのみならず、T58A変異体や、N-MYC、L-MYCでも多能性幹細胞を誘導できる（WO2007/69666; Blelloch R. et al., Cell Stem Cell, 1: 245-247, 2007）。このように、ファミリーの遺伝子を様々に選択して使用することが可能であるので、MYCファミリー遺伝子を適宜選択して、リプログラミングを誘導することができる。またMYC遺伝子は、コードされるアミノ酸配列を変えないように適宜サイレント変異を導入し、連続したAまたはTの塩基配列を置換することができる。
　例えば野生型c-MYCはセンダイウイルスベクターなどのRNAウイルスベクターからの発現量が少ないことが判明した。しかし野生型c-MYCに、a378g、t1122c、t1125c、a1191g、および a1194g から選択される１つ以上、好ましくは２以上、３以上、４以上、または５つ全ての変異を導入することにより、ベクターから遺伝子を安定して高発現させることが可能となる。本発明においては、例えば配列番号：8（アミノ酸配列は配列番号：9）に示された改変型c-MYC遺伝子（これを「c-rMYC」と称す）を好適に用いることができる。具体的には、SeV(HNL)c-rMYC/TSΔF、SeV(L)c-rMYC/TSΔF、SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF（WO2010/008054; Fusaki et al., Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. Vol. 85, p348-362(2009)）などが挙げられ、特に好ましくはSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFが挙げられるが、これらに限定されない。
　上記のKLF、OCTおよびSOX遺伝子を含むセンダイウイルスベクター、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクター、および/またはMYC遺伝子を含むセンダイウイルスベクターには、適宜、細胞のリプログラミングのための遺伝子などをさらに搭載させることができる。また、それらの遺伝子を搭載した他のベクターを、上記センダイウイルスベクターと組み合わせてもよい。搭載する遺伝子は、分化した細胞からの多能性幹細胞などの種々の幹細胞の誘導等に関与する所望の遺伝子であってよい。例えばリプログラミングの効率を上昇させる遺伝子を搭載させることができる。
　本発明は、本発明のセンダイウイルスベクターの、細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための使用、そして、細胞においてリプログラミング因子を発現させ、該細胞のリプログラミングを誘導するための使用を提供する。また本発明は、本発明のセンダイウイルスベクターを含む、細胞のリプログラミングにおいて遺伝子を導入するための剤（導入剤、遺伝子導入剤）、細胞においてリプログラミング因子を発現させるための剤を提供する。また本発明は、本発明のセンダイウイルスベクターを含む、細胞においてリプログラミング因子を発現させ、該細胞のリプログラミングを誘導するための剤に関する。また本発明のベクターは、細胞の核初期化を行う際に、所望の遺伝子を該細胞においてさらに発現させるためにも有用である。本発明のセンダイウイルスベクターは、本発明に従い、細胞のリプログラミングのために利用することができる。リプログラミングの誘導とは、具体的には多能性幹細胞の誘導であってよい。本発明は、医学的用途および非医学的用途のために用いることができ、メディカルおよびノンメディカルの態様において有用である。例えば本発明は、治療、手術、および/または診断、あるいは非治療、非手術、および/または非診断の目的に用いることができる。
　本発明において核初期化因子（a nuclear reprogramming factor）とは、単独で、または複数の因子と共同して、ある細胞の分化状態をより未分化な状態に誘導するために用いられる遺伝子またはその産物を言い、例えば分化した細胞の脱分化を誘導するために用いられる遺伝子またはその産物が含まれる。本発明において核初期化因子（a nuclear reprogramming factor）には、核の初期化（reprogramming）に必須の因子、および核初期化の効率を上昇させる補助的な因子（補助因子）が含まれる。本発明においては、核初期化（nuclear reprogramming）に用いるための所望の遺伝子をベクターに搭載してよい。例えば多能性幹細胞の製造に用いるための遺伝子をさらに搭載することができる。多能性幹細胞を誘導するための核初期化因子（nuclear reprogramming factors）としては、具体的には、例えばＥＳ細胞や初期胚などで発現するが、分化した多くの体細胞では発現しないか、発現が低下する遺伝子（ＥＳ細胞特異的遺伝子など）を用いることができる。このような遺伝子は、好ましくは転写因子や核蛋白質等をコードする遺伝子である。核初期化遺伝子（nuclear reprogramming factors）を同定する方法は既に知られており（WO2005/80598）、実際、この方法を用いて同定された遺伝子は、多能性幹細胞へのreprogrammingに有用であることが示されている（WO2007/69666）。
　そのような遺伝子の例を挙げれば、DPPA5 (developmental pluripotency associated 5, ES cell specific gene 1 (ESG1); accession numbers NM_001025290, NM_025274, XM_236761）、F-box protein 15 (Fbx15, NM_152676, NM_015798)、Nanog（NM_024865, AB093574）、ECAT1（ES cell associated transcript 1； AB211062, AB211060）、ERAS（ES cell expressed Ras; NM_181532, NM_181548)、DNMT3L（DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3-like; NM_013369, NM_019448)、ECAT8 （AB211063, AB211061）、GDF3（growth differentiation factor 3; NM_020634, NM_008108）、SOX15（SRY (sex determining region Y)-box 15; NM_006942, NM_009235）、DPPA4（developmental pluripotency associated 4; NM_018189, NM_028610）、DPPA2（NM_138815, NM_028615）、FTHL17（ferritin, heavy polypeptide-like 17; NM_031894, NM_031261）、SALL4（sal-like 4; NM_020436, NM_175303）、OCT3/4（POU5F1とも呼ばれる; NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178）、SOX2（NM_003106, NM_011443, XM_574919）、Rex-1（ZFP42 (zinc finger protein 42 homolog); NM_174900, NM_009556）、Utf1（undifferentiated embryonic cell transcription factor 1; NM_003577, NM_009482）、TCL1A（T-cell leukemia/lymphoma 1A; NM_021966, NM_009337）、DPPA3（Stellaとも呼ばれる, NM_199286, NM_139218, XM_216263)、KLF4（Kruppel-like factor 4; NM_004235, NM_010637）、cateninβ1（cadherin-associated protein beta 1; NM_001904, NM_007614; S33Y変異体を含む）、c-MYC（NM_002467, NM_010849; T58A変異体を含む）、STAT3（signal transducer and activator of transcription 3; NM_139276, NM_213659）、GRB2（growth factor receptor-bound protein 2; NM_002086, NM_008163）、Glis1遺伝子（Maekawa et al., Nature, 474: 225-229, 2011; NM_147193, NM_147221）ならびにこれらの遺伝子が属するファミリーの他のメンバーの遺伝子などが挙げられる。これらの遺伝子は、細胞に導入することにより多能性幹細胞を誘導する（WO2007/69666）。従って、KLF、OCTおよびSOX遺伝子を含むセンダイウイルスベクター、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクター、および/またはMYC遺伝子を含むセンダイウイルスベクターに、上記の遺伝子のうち、まだベクターに搭載されていない遺伝子をさらに搭載させたり、あるいはそれらの遺伝子を搭載する他のベクターを組み合わせて用いることができる。これらの遺伝子は、１つずつ別のベクターに組み込んでもよいし、複数の遺伝子をまとめて１つのベクターに組み込むこともできる。また、それぞれの遺伝子を一種類のベクターに組み込んでもよく、あるいは異なる種類のベクター（染色体組み込み型ウイルスベクターおよび／または非ウイルスベクターを含む）を、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を含む上記本発明のセンダイウイルスベクターおよびKLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターと組み合わせて用いてもよい。また個々のウイルスベクターは、別々にパッケージされており使用時に組み合わせて用いることができる。あるいは搭載する遺伝子が異なる複数のウイルスベクターを、予めまとめてキットとしたり、混合して組成物としてもよい。また、これらの遺伝子の任意の組み合わせ（または全て）を含む、１つまたはそれ以上の非組み込み型ウイルスベクター、および該ベクターをさらに含むキットまたは組成物も、細胞のリプログラミング、特に多能性幹細胞の製造において好適に用いることができる。組成物の場合は、ベクターは適宜、薬学的に許容される担体および/または媒体と組み合わせてよく、例えば、滅菌水、ｐＨ緩衝液、生理的食塩水、培養液等の中に混合されていてよい。尚、これらの系は、核初期化遺伝子の一部または大部分をその発現産物であるタンパク質に置き換えることもできる。すなわち本発明の組成物およびキットは、少なくともKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を含む上記センダイウイルスベクターと、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターとを含む限り、リプログラミング因子を発現する他のベクター（染色体組込み型ウイルスベクターおよび／または非ウイルスベクター）および／またはリプログラムを誘導する化合物、蛋白質等を含んでもよい。リプログラミングに必要な因子は、その全てをセンダイウイルスベクターから発現させることが好ましいが、一部のみをセンダイウイルスベクターから発現させ、その他を他のベクターおよび／または化合物（例えば蛋白質や低分子化合物）により供給してもよい。また、本発明のリプログラムされた細胞の製造方法は、全ての遺伝子導入をセンダイウイルスベクターを用いて行う方法に限定されない。すなわち本発明の方法は、少なくともKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を含む上記センダイウイルスベクターと、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターを用いればよく、リプログラミング因子を発現する他のベクター（染色体組込み型ウイルスベクターおよび／または非ウイルスベクター）および／またはリプログラムを誘導する化合物等を併用することが含まれる。好ましくは、MYC遺伝子またはGlis1遺伝子を含む上記センダイウイルスベクターをさらに組み合わせて用いられる。
　また本発明は、以下の発明も提供する。
〔1〕　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含むベクターを導入して多能性幹細胞を誘導する方法（製造する方法を含む）における多能性幹細胞の誘導効率を改善（製造効率の改善を含む）する方法であって、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターをさらに導入する工程を含む方法。
〔2〕　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で含むベクターが温度感受性ウイルスベクターである、〔1〕に記載の方法。
〔3〕　温度感受性ウイルスベクターが温度感受性センダイウイルスベクターである、〔2〕に記載の方法。
〔4〕　温度感受性センダイウイルスベクターが、TS 7（L蛋白質のY942H, L1361C, およびL1558I変異）、TS 12（P蛋白質のD433A, R434A, およびK437A変異、TS 13（P蛋白質のD433A, R434A, およびK437A変異および L蛋白質のL1558I変異、TS 14（P蛋白質のD433A, R434A, およびK437A変異および L蛋白質のL1361C変異）、および TS 15（P蛋白質のD433A, R434A, およびK437A変異および L蛋白質のL1361C および L1558I変異）からなる群より選択される変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔3〕に記載の方法。
〔5〕　温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含み、さらに TS 12の変異（P蛋白質のD433A、R434A、およびK437Aの変異）を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔4〕に記載の方法。
〔6〕　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子が、この順番でセンダイウイルスのP遺伝子の直後（マイナス鎖RNAゲノムにおいてP遺伝子の5'側）に組み込まれている、〔3〕から〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔7〕　温度感受性センダイウイルスベクターが、SeV(PM)KOS/TS7ΔF、およびSeV(PM)KOS/TS12ΔFからなる群より選択される、〔3〕に記載の方法。
〔8〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターがセンダイウイルスベクターである、〔1〕から〔7〕のいずれかに記載の方法。
〔9〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターが37℃におけるNTVLP形成が抑制される変異を有するセンダイウイルスベクターである、〔8〕に記載の方法。
〔10〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔8〕に記載の方法。
〔11〕　KLF遺伝子が、N遺伝子の上流（マイナス鎖RNAゲノムにおいてN遺伝子の3'側）に組み込まれている、〔8〕から〔10〕のいずれかに記載の方法。
〔12〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターがSeV18+KLF4/TSΔFである、〔8〕に記載の方法。
〔13〕　MYC遺伝子が挿入されたベクターを導入する工程をさらに含む、〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔14〕　MYC遺伝子が挿入されたベクターがセンダイウイルスベクターである、〔13〕に記載の方法。
〔15〕　MYC遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクターが温度感受性センダイウイルスベクターである、〔14〕に記載の方法。
〔16〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターが、TS 7、TS 12、TS 13、TS 14、および TS 15 からなる群より選択される変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔15〕に記載の方法。
〔17〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含み、さらに TS 15 の変異（P蛋白質のD433A、R434A、K437Aの変異、並びにL蛋白質のL1361CおよびL1558Iの変異）を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔16〕に記載の方法。
〔18〕　MYC遺伝子が、L遺伝子の直前（マイナス鎖RNAゲノムの3'側）に組み込まれている、〔14〕から〔17〕のいずれかに記載の方法。
〔19〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターがSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFである、〔14〕に記載の方法。
〔20〕　MYC遺伝子がc-rMycである、〔13〕から〔19〕のいずれかに記載の方法。
〔21〕　低温で培養しない、〔1〕から〔20〕のいずれかに記載の方法。
〔22〕　約37℃で培養する、〔21〕に記載の方法。
　また本発明は、以下の発明も提供する。
〔1〕　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含むベクターを導入して多能性幹細胞を誘導する方法（製造する方法を含む）における多能性幹細胞の誘導効率を改善（製造効率の改善を含む）するための薬剤の製造における、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターの使用。
〔2〕　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で含むベクターが温度感受性ウイルスベクターである、〔1〕に記載の使用。
〔3〕　温度感受性ウイルスベクターが温度感受性センダイウイルスベクターである、〔2〕に記載の使用。
〔4〕　温度感受性センダイウイルスベクターが、TS 7、TS 12、TS 13、TS 14、および TS 15 からなる群より選択される変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔3〕に記載の使用。
〔5〕　温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含み、さらに TS 12 の変異（P蛋白質のD433A、R434A、およびK437Aの変異）を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔4〕に記載の使用。
〔6〕　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子が、この順番でセンダイウイルスのP遺伝子の直後（マイナス鎖RNAゲノムにおいてP遺伝子の5'側）に組み込まれている、〔3〕から〔5〕のいずれかに記載の使用。
〔7〕　温度感受性センダイウイルスベクターが、SeV(PM)KOS/TS7ΔF、およびSeV(PM)KOS/TS12ΔFからなる群より選択される、〔3〕に記載の使用。
〔8〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターがセンダイウイルスベクターである、〔1〕から〔7〕のいずれかに記載の使用。
〔9〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターが37℃におけるNTVLP形成が抑制される変異を有するセンダイウイルスベクターである、〔8〕に記載の使用。
〔10〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔8〕に記載の使用。
〔11〕　KLF遺伝子が、N遺伝子の上流（マイナス鎖RNAゲノムにおいてN遺伝子の3'側）に組み込まれている、〔8〕から〔10〕のいずれかに記載の使用。
〔12〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターがSeV18+KLF4/TSΔFである、〔8〕に記載の使用。
〔13〕　MYC遺伝子が挿入されたベクターを導入する工程をさらに含む、〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の使用。
〔14〕　MYC遺伝子が挿入されたベクターがセンダイウイルスベクターである、〔13〕に記載の使用。
〔15〕　MYC遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクターが温度感受性センダイウイルスベクターである、〔14〕に記載の使用。
〔16〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターが、TS 7、TS 12、TS 13、TS 14、および TS 15 からなる群より選択される変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔15〕に記載の使用。
〔17〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含み、さらに TS 15 の変異（P蛋白質のD433A、R434A、K437Aの変異、並びにL蛋白質のL1361CおよびL1558Iの変異）を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔16〕に記載の使用。
〔18〕　MYC遺伝子が、L遺伝子の直前（マイナス鎖RNAゲノムの3'側）に組み込まれている、〔14〕から〔17〕のいずれかに記載の使用。
〔19〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターがSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFである、〔14〕に記載の使用。
〔20〕　MYC遺伝子がc-rMycである、〔13〕から〔19〕のいずれかに記載の使用。
〔21〕　該誘導および/または製造において低温で培養しない、〔1〕から〔20〕のいずれかに記載の使用。
〔22〕　約37℃で培養する、〔21〕に記載の使用。
　また本発明は、以下の発明も提供する。
〔1〕（ａ）KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含むベクター、および（ｂ）KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクター、を含む多能性幹細胞を誘導（製造を含む）するための組成物およびキット。
〔2〕　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で含むベクターが温度感受性ウイルスベクターである、〔1〕に記載の組成物およびキット。
〔3〕　温度感受性ウイルスベクターが温度感受性センダイウイルスベクターである、〔1〕に記載の組成物およびキット。
〔4〕　温度感受性センダイウイルスベクターが、TS 7、TS 12、TS 13、TS 14、および TS 15 からなる群より選択される変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔3〕に記載の組成物およびキット。
〔5〕　温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含み、さらに TS 12 の変異（P蛋白質のD433A、R434A、およびK437Aの変異）を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔4〕に記載の組成物およびキット。
〔6〕　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子が、この順番でセンダイウイルスのP遺伝子の直後（マイナス鎖RNAゲノムにおいてP遺伝子の5'側）に組み込まれている、〔3〕から〔5〕のいずれかに記載の組成物およびキット。
〔7〕　温度感受性センダイウイルスベクターが、SeV(PM)KOS/TS7ΔF、およびSeV(PM)KOS/TS12ΔFからなる群より選択される、〔3〕に記載の組成物およびキット。
〔8〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターがセンダイウイルスベクターである、〔1〕から〔7〕のいずれかに記載の組成物およびキット。
〔9〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターが37℃におけるNTVLP形成が抑制される変異を有するセンダイウイルスベクターである、〔8〕に記載の組成物およびキット。
〔10〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔8〕に記載の組成物およびキット。
〔11〕　KLF遺伝子が、N遺伝子の上流（マイナス鎖RNAゲノムにおいてN遺伝子の3'側）に組み込まれている、〔8〕から〔10〕のいずれかに記載の組成物およびキット。
〔12〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターがSeV18+KLF4/TSΔFである、〔8〕に記載の組成物およびキット。
〔13〕　MYC遺伝子が挿入されたベクターをさらに含む、〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の組成物およびキット。
〔14〕　MYC遺伝子が挿入されたベクターがセンダイウイルスベクターである、〔13〕に記載の組成物およびキット。
〔15〕　MYC遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクターが温度感受性センダイウイルスベクターである、〔14〕に記載の組成物およびキット。
〔16〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターが、TS 7、TS 12、TS 13、TS 14、および TS 15 からなる群より選択される変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔15〕に記載の組成物およびキット。
〔17〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含み、さらに TS 15 の変異（P蛋白質のD433A、R434A、K437Aの変異、並びにL蛋白質のL1361CおよびL1558Iの変異）を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔16〕に記載の組成物およびキット。
〔18〕　MYC遺伝子が、L遺伝子の直前（マイナス鎖RNAゲノムの3'側）に組み込まれている、〔14〕から〔17〕のいずれかに記載の組成物およびキット。
〔19〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターがSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFである、〔14〕に記載の組成物およびキット。
〔20〕　MYC遺伝子がc-rMycである、〔13〕から〔19〕のいずれかに記載の組成物およびキット。
〔21〕　該誘導および/または製造において低温で培養しない、〔1〕から〔20〕のいずれかに記載の組成物およびキット。
〔22〕　約37℃で培養する、〔21〕に記載の組成物およびキット。
　また本発明は、以下の発明も提供する。
〔1〕（ａ）KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含むベクター、および（ｂ）KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクター、を含む多能性幹細胞の誘導効率を改善（製造効率の改善を含む）するための組成物およびキット。
〔2〕　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で含むベクターが温度感受性ウイルスベクターである、〔1〕に記載の組成物およびキット。
〔3〕　温度感受性ウイルスベクターが温度感受性センダイウイルスベクターである、〔1〕に記載の組成物およびキット。
〔4〕　温度感受性センダイウイルスベクターが、TS 7、TS 12、TS 13、TS 14、および TS 15 からなる群より選択される変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔3〕に記載の組成物およびキット。
〔5〕　温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含み、さらに TS 12 の変異（P蛋白質のD433A、R434A、およびK437Aの変異）を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔4〕に記載の組成物およびキット。
〔6〕　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子が、この順番でセンダイウイルスのP遺伝子の直後（マイナス鎖RNAゲノムにおいてP遺伝子の5'側）に組み込まれている、〔3〕から〔5〕のいずれかに記載の組成物およびキット。
〔7〕　温度感受性センダイウイルスベクターが、SeV(PM)KOS/TS7ΔF、およびSeV(PM)KOS/TS12ΔFからなる群より選択される、〔3〕に記載の組成物およびキット。
〔8〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターがセンダイウイルスベクターである、〔1〕から〔7〕のいずれかに記載の組成物およびキット。
〔9〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターが37℃におけるNTVLP形成が抑制される変異を有するセンダイウイルスベクターである、〔8〕に記載の組成物およびキット。
〔10〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔8〕に記載の組成物およびキット。
〔11〕　KLF遺伝子が、N遺伝子の上流（マイナス鎖RNAゲノムにおいてN遺伝子の3'側）に組み込まれている、〔8〕から〔10〕のいずれかに記載の組成物およびキット。
〔12〕　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターがSeV18+KLF4/TSΔFである、〔8〕に記載の組成物およびキット。
〔13〕　MYC遺伝子が挿入されたベクターをさらに含む、〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の組成物およびキット。
〔14〕　MYC遺伝子が挿入されたベクターがセンダイウイルスベクターである、〔13〕に記載の組成物およびキット。
〔15〕　MYC遺伝子が挿入されたセンダイウイルスベクターが温度感受性センダイウイルスベクターである、〔14〕に記載の組成物およびキット。
〔16〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターがTS 7、TS 12、TS 13、TS 14、および TS 15 からなる群より選択される変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔15〕に記載の組成物およびキット。
〔17〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含み、さらに TS 15 の変異（P蛋白質のD433A、R434A、K437Aの変異、並びにL蛋白質のL1361CおよびL1558Iの変異）を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、〔16〕に記載の組成物およびキット。
〔18〕　MYC遺伝子が、L遺伝子の直前（マイナス鎖RNAゲノムの3'側）に組み込まれている、〔14〕から〔17〕のいずれかに記載の組成物およびキット。
〔19〕　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターがSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFである、〔14〕に記載の組成物およびキット。
〔20〕　MYC遺伝子がc-rMycである、〔13〕から〔19〕のいずれかに記載の組成物およびキット。
〔21〕　該誘導および/または製造において低温で培養しない、〔1〕から〔20〕のいずれかに記載の組成物およびキット。
〔22〕　約37℃で培養する、〔21〕に記載の組成物およびキット。
　本明細書記載の発明においては、特にKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で１つのセンダイウイルスベクターに挿入したベクター（好ましくはSeV(PM)KOS/TS12ΔF）を、KLF4遺伝子を含みOCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクター（好ましくはSeV18+KLF4/TSΔF）と組み合わせて用いることが好ましく、このとき、MYC遺伝子を発現するセンダイウイルスベクター（好ましくはSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF）をさらに組み合わせることはより好ましい。
　導入する因子（KLF遺伝子、OCT遺伝子、SOX遺伝子、およびMYC遺伝子など）は、リプログラムしたい細胞の由来に合わせて適宜選択すればよく、ヒト由来であっても、その他の哺乳動物由来、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等の霊長類由来であってもよい。また、遺伝子および蛋白質の配列は必ずしも野生型の配列でなくてもよく、リプログラミングを誘導できる限り、変異を有していてもよい。変異型遺伝子を用いて多能性幹細胞を作製した例は既に知られている（WO2007/69666）。例えば、１または少数（例えば数個、３個以内、５個以内、１０個以内、１５個以内、２０個以内、２５個以内）のアミノ酸が付加、欠失、置換、および／または挿入されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、リプログラミングを誘導できる遺伝子は、本発明において使用することができる。また生物学的活性（リプログラミングの誘導能）を維持している限り、例えばＮ末端および／またはＣ末端の１～数残基（例えば２、３、４、５、６、１０、１５または２０残基）のアミノ酸が欠失または付加されたポリペプチド、及び１～数残基（例えば２、３、４、５、６、１０、１５または２０残基）のアミノ酸が置換されたポリペプチドなども使用できる。使用し得るバリアントとしては、例えば天然の蛋白質の断片、アナログ、派生体、及び他のポリペプチドとの融合蛋白質（例えば異種シグナルペプチドまたは抗体断片を付加したもの等）が含まれる。具体的には、野生型のアミノ酸配列の１またはそれ以上のアミノ酸を置換、欠失、および／または付加した配列を含み、野生型蛋白質と同等の生物学的活性（例えばリプログラミングを誘導する活性）を有するポリペプチドが含まれる。野生型蛋白質の断片を用いる場合は、通常、野生型ポリペプチド（分泌蛋白質の場合は成熟型の形態）の70％以上、好ましくは80%以上、85%以上、より好ましくは90％以上、95％以上または98％以上の連続領域を含む。
　アミノ酸配列のバリアントは、例えば天然のポリペプチドをコードするDNAに変異を導入することにより調製することができる（Walker and Gaastra, eds. Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York, 1983); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492, 1985 ; Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382, 1987; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.), 1989; U.S. Pat. No. 4,873,192）。生物学的活性に影響を与えないようにアミノ酸を置換するためのガイダンスとしては、例えばDayhoffら（Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), 1978）が挙げられる。
　改変されるアミノ酸数に特に制限はないが、例えば天然の成熟型ポリペプチドの全アミノ酸の30％以内、好ましくは25％以内、より好ましくは20％以内、より好ましくは15％以内、より好ましくは10％以内、5％以内、または3％以内であり、例えば15アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは8アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、より好ましくは3アミノ酸以内である。アミノ酸を置換する場合は、側鎖の性質が似たアミノ酸に置換することにより蛋白質の活性を維持することが期待できる。このような置換は、本発明において保存的置換という。保存的置換は、例えば塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などの各グループ内のアミノ酸間の置換などが挙げられる。また、例えば、BLOSUM62置換マトリックス（S. Henikoff and J.G. Henikoff, Proc. Acad. Natl. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992）において、正の値の関係にあるアミノ酸間の置換が挙げられる。
　改変された蛋白質は、野生型蛋白質のアミノ酸配列と高いホモロジーを示す。高いホモロジーとは、例えば70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、93%以上、95%以上、または96%以上の同一性を有するアミノ酸配列である。アミノ酸配列の同一性は、例えばBLASTPプログラム（Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990）を用いて決定することができる。例えばNCBI（National Center for Biothchnology Information）のBLASTのウェブページにおいて、デフォルトのパラメータを用いて検索を行うことができる（Altschul S.F. et al., Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden, T.L. et al., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul S.F. et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang J. & Madden T.L., Genome Res. 7:649-656, 1997）。例えば２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana A et al., FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, 1999）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、例えば天然型サイトカイン（分泌後の成熟型の形態）のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。具体的には、野生型蛋白質 (分泌蛋白質の場合は成熟型) の全アミノ酸数における一致するアミノ酸数の割合を計算する。
　また遺伝子は、コードされるアミノ酸配列を変えないようにサイレント変異を導入することができる。特にAT richな遺伝子においては、5個以上の連続したAまたはTの塩基について、コードされるアミノ酸配列を変えないようにGまたはCに置換することにより、安定して遺伝子の高発現を得ることができる。
　また改変蛋白質あるいはリプログラミングに用いるタンパク質は、野生型蛋白質をコードする遺伝子のコード領域の一部または全部とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質であって、野生型蛋白質と同等の活性（リプログラミングを誘導する活性）を有する蛋白質が挙げられる。ハイブリダイゼーションにおいては、例えば野生型蛋白質遺伝子のコード領域の配列またはその相補配列を含む核酸、またはハイブリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダイズするかを検出することにより同定することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば 5xSSC、7%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5xデンハルト液（１xデンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、及び0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、60℃、好ましくは65℃、より好ましくは68℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度で2xSSC中、好ましくは1xSSC中、より好ましくは0.5xSSC中、より好ましくは0.1xSSC中で、振蘯しながら２時間洗浄する条件である。
　細胞のリプログラミングを誘導するために特に好ましい遺伝子を一般的に例示すれば、F-box protein 15 (Fbx15, NM_152676, NM_015798)、Nanog（NM_024865, AB093574）、ERAS（ES cell expressed Ras; NM_181532, NM_181548)、DPPA2（NM_138815, NM_028615）、OCT3/4（POU5F1とも呼ばれる; NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178）、SOX2（NM_003106, NM_011443, XM_574919）、TCL1A（T-cell leukemia/lymphoma 1A; NM_021966, NM_009337）、KLF4（Kruppel-like factor 4; NM_004235, NM_010637）、cateninβ1（cadherin-associated protein beta 1; NM_001904, NM_007614; S33Y変異体を含む）、c-MYC（NM_002467, NM_010849; T58A変異体を含む）、およびGlis1遺伝子（Maekawa et al., Nature, 474: 225-229, 2011; NM_147193, NM_147221）、ならびにこれらの遺伝子が属するファミリーの他のメンバーの遺伝子などが挙げられる。これらの遺伝子を導入した場合、多能性幹細胞の形態を示したコロニーの割合は、４種類の遺伝子（OCT3/4、SOX2、KLF4、およびc-MYC）の導入の場合よりも高いことが報告されている（WO2007/69666）。従って、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子に加えて、上記のいずれかまたはそれらの組み合わせをさらに搭載するセンダイウイルスベクターや、KLF遺伝子に加えて、OCT遺伝子およびSOX遺伝子以外の他の遺伝子を搭載するセンダイウイルスベクター、あるいはKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を搭載する本発明のセンダイウイルスベクターとKLF遺伝子を含みOCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターに加えて、上記のいずれかの遺伝子またはそれらの組み合わせを搭載するセンダイウイルスベクターやそれらのベクターの組み合わせをさらに用いることは、本発明において細胞のリプログラミングの誘導に用いるために有用であり、特に、多能性幹細胞の誘導に好適に用いることができる。個々のウイルスベクターは、使用時に組み合わせて用いることができる。また予めまとめてキットとしたり、混合して組成物としてもよい。また、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含むベクターと、KLF遺伝子を含みOCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターに加えて、上記のいずれかの遺伝子の任意の組み合わせ（または全て）を含む、１つまたはそれ以上のセンダイウイルスベクターをさらに導入する方法、およびそれらのベクターを含むキットまたは組成物も本発明に含まれる。
　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を発現する本発明のベクターとKLF遺伝子を含みOCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないベクターは、特にMYC遺伝子および/またはGlis1遺伝子を発現するベクターと組み合わせることが好ましい（Takahashi, K. and Yamanaka S., Cell 126, 663-676, 2006; Lowry WE et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8):2883-8, 2008; Masaki, H. et al., Stem Cell Res. 1:105-115, 2008; Maekawa et al., Nature, 474: 225-229, 2011; WO2007/69666）。ここでSOX蛋白質、KLF蛋白質、MYC蛋白質、およびOCT蛋白質、ならびにそれらの遺伝子とは、それぞれSOXファミリー、KLFファミリー、MYCファミリー、およびOCTファミリーに属するメンバーの蛋白質および遺伝子を言う。これらの４つのファミリーのメンバーをそれぞれ１つ以上発現するように調整することで、分化した様々な細胞から多能性幹細胞を誘導できることが報告されている。例えばSOXファミリーの遺伝子については、SOX1、SOX2、SOX3、SOX15、SOX17 のいずれの遺伝子を用いても、多能性幹細胞を誘導できることが報告されている（WO2007/69666）。またKLFファミリーについても、KLF4でもKLF2でも多能性幹細胞を誘導できた（WO2007/69666）。MYCファミリーについても、野生型c-MYCのみならず、T58A変異体や、N-MYC、L-MYCでも多能性幹細胞を誘導できた（WO2007/69666; Blelloch R. et al., Cell Stem Cell, 1: 245-247, 2007）。このように、ファミリーの遺伝子を様々に選択して使用することが可能であるので、上記の４種のファミリー遺伝子を適宜選択して、リプログラミングを誘導することができる。
　具体的には、KLFファミリーとしては、KLF1（NM_006563, NM_010635）、KLF2（NM_016270, NM_008452）、KLF4（NM_004235, NM_010637）、KLF5（NM_001730, NM_009769）が含まれ、MYCファミリーとしては、c-MYC（NM_002467, NM_010849, T58A変異体を含む）、N-MYC（NM_005378, NM_008709）、L-MYC（NM_005376, NM_005806）が含まれ、OCTファミリーとしては、OCT1A（NM_002697, NM_198934）、OCT3/4（NM_002701, NM_203289, NM_013633, NM_001009178）、OCT6（NM_002699, NM_011141）が含まれ、SOXファミリーとしては、SOX1（NM_005986, NM_009233）、SOX2（NM_003106, NM_011443, XM_574919）、SOX3（NM_005634, NM_009237）、SOX7（NM_031439, NM_011446）、SOX15（NM_006942, NM_009235）、SOX17（NM_022454, NM_011441）、SOX18（NM_018419, NM_009236）が含まれる。これらの遺伝子のいずれかを本発明の順番に従って搭載するセンダイウイルスベクターは、本発明において細胞の脱分化の誘導に用いるために有用であり、特に多能性幹細胞の誘導に好適に用いることができる。KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子として最も好ましいのは、それぞれOCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子、およびKLF4遺伝子である。
　なお、MYCファミリーの遺伝子は多能性幹細胞の誘導に必須ではなく、MYCファミリー遺伝子を除く３つのファミリーの遺伝子だけでも多能性幹細胞は誘導できる（Nakagawa M. et al., Nat Biotechnol. 26(1):101-6, 2008; Wering M. et al., Cell Stem Cell 2(1):10-2, 2008）。MYC遺伝子を発現させない場合、例えばp53 siRNAおよびUTF1により多能性幹細胞の誘導効率を有意に上昇させることができる（Y. Zhao et al., Cell Stem Cell, 3 (5): 475-479, 2008; N. Maherali, and K. Hochedlinger, Cell Stem Cell, 3 (6): 595-605, 2008）。また、KLFファミリーの遺伝子を除く３つのファミリーの遺伝子だけでも多能性幹細胞を誘導できることが報告されている（Park IH et al., Nature, 451(7175):141-6, 2008）。また、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（BIX-01294; Kubicek, S. et al., Mol. Cell 25, 473-481, 2007）を併用することにより、胎児由来のNPCからKLF遺伝子、SOX遺伝子、およびMYC遺伝子の３つの遺伝子のみで多能性幹細胞を誘導できることが報告されている（Shi Y et al., Cell Stem Cell, 2(6):525-8, 2008）。それぞれの遺伝子をコードするウイルスベクターは別々に単体として準備されてもよい。それらは、使用時に組み合わせて用いることができる。また任意の組み合わせまたは全てをまとめてキットとしたり、混合して組成物としてもよい。また本発明は、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を搭載する本発明のセンダイウイルスベクターおよびKLF遺伝子を含みOCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターに加えて、該３遺伝子以外の遺伝子や化合物の任意の組み合わせ（または全て）を含むキットまたは組成物にも関する。遺伝子は、適宜組換えベクターに搭載されていてよい。更には、このキットに含まれる一部の組換えベクターは、相当の機能を有するタンパク質、合成化合物などに置き換えることも可能である。
　以上に記載した遺伝子の組み合わせに、さらに別の遺伝子を組み合わせて、リプログラミングの誘導効率を上昇させることもできる。このような遺伝子としては、TERT（NM_198253, NM_009354）および／またはSV40 large T antigen（NC_001669.1, Fiers,W. (05-11-1978) Nature 273:(5658)113-120）が挙げられる（Park IH. et al., Nature, 451(7175):141-6, 2008）。また、HPV16 E6、HPV16 E7、Bmil（NM_005180, NM_007552）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子をさらに組み合わせてもよい。また、Fbx15（Mol Cell Biol. 23(8):2699-708, 2003）、Nanog（Cell 113: 631-642, 2003）、ERas（Nature 423, 541-545, 2003）、DPPA2（Development 130: 1673-1680, 2003）、TCL1A（Development 130: 1673-1680, 2003）、β-Catenin（Nat Med 10(1): 55-63, 2004）からなる群より選択される１つまたは任意の組み合わせを発現させてもよい。さらに、ECAT1（AB211062, AB211060）、DPPA5 (NM_001025290, NM_025274, XM_236761）、DNMT3L（NM_013369, NM_019448)、ECAT8 （AB211063, AB211061）、GDF3（NM_020634, NM_008108）、SOX15（NM_006942, NM_009235）、DPPA4（NM_018189, NM_028610）、FTHL17（NM_031894, NM_031261）、SALL4（NM_020436, NM_175303）、Rex-1（NM_174900, NM_009556）、Utf1（NM_003577, NM_009482）、DPPA3（NM_199286, NM_139218, XM_216263)、STAT3（NM_139276, NM_213659）、および GRB2（NM_002086, NM_008163）からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を組み合わせてもよい。また、KLF遺伝子、OCT遺伝子、SOX遺伝子に加えて、NANOG遺伝子（NM_024865, AB093574）、および LIN28遺伝子 (NM_024674) の各遺伝子を含む組み合わせも、多能性幹細胞の誘導に有用である（Yu J. et al., Science, 318(5858):1917-20, 2007）。また、これらにMYC遺伝子をさらに組み合わせたものも好適である（Liao J et al., Cell Res. 18(5):600-3, 2008）。これらの遺伝子を付加的に発現させることで、多能性幹細胞の誘導を促進し得る（WO2007/69666）。成熟Ｂ細胞を対象とする場合は、例えば骨髄球系転写因子C/EBPα（CCAAT/enhancer-binding-protein α）（NM_004364）を異所発現させるか、あるいはＢ細胞系転写因子Pax5（paired box 5; NM_016734）の発現を抑制してリプログラミングを促進することができる（Hanna J, Cell. 133(2):250-64, 2008）。これらの因子も、本発明におけるセンダイウイルスベクターを用いて発現させることができる。更には、このキットに含まれる一部の組換えベクターは、相当の機能を有するタンパク質、合成化合物などに置き換えることも可能である。
　また、上記の因子を発現させる以外にも、例えば化合物の添加を組み合わせることでリプログラミングの効率を向上させることができる。例えば、bFGF（basic fibroblast growth factor）および／またはSCF（stem cell factor）は多能性幹細胞の誘導を促進し、さらに多能性幹細胞の誘導におけるc-MYCの機能を代替することができる（WO2007/69666）。またMAPキナーゼ阻害剤（PD98056）も、よりＥＳ細胞に近い多能性幹細胞の樹立等に有用である（WO2007/69666）。また、DNAメチル化酵素（Dnmt）阻害剤および／またはヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤により、多能性幹細胞の誘導効率が改善することが報告されている（Huangfu D et al., Nat Biotechnol. (Published online: 22 June 2008, doi:10.1038/nbt1418); Nat. Biotechnol. 26, 795-797 (2008)）。例えばHDAC阻害剤（VPA）を併用することにより、OCT4とSOX2の2遺伝子のみの導入により多能性幹細胞を誘導することができる（Huangfu, D. et al., Nat Biotechnol. 2008 26(11):1269-75）。本発明のベクターは、これらの化合物の投与と組み合わせて用いるための剤として有用である。Dnmt阻害剤としては、例えば5-アザシチジン等、HDAC阻害剤としては、例えばスベロイラニリド・ハイドロザミック酸（SAHA）、トリコスタチンA（TSA）、バルプロ酸（VPA）等が有用である。また5-アザシチジンを用いる場合、グルココルチコイド（デキサメタゾン）を併用することにより効率を上昇させることができる。
　細胞をリプログラミングさせるには、例えば（１）KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で含む本発明のセンダイウイルスベクターおよびKLF遺伝子を含みOCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクター、（２）（１）のベクターとMYC遺伝子またはGlis1遺伝子を発現するセンダイウイルスベクターとの組み合わせ、（３）（１）および/または（２）にさらにNANOG遺伝子を発現するセンダイウイルスベクター、およびLIN28を発現するセンダイウイルスベクターを加えた組み合わせ、または（４）（１）から（４）のいずれかに記載のベクターと上記の他の所望のリプログラミング因子を搭載するベクターおよび/またはリプログラミングを誘導する所望の化合物との組み合わせ等を、細胞に導入することができる。複数のベクターおよび／または化合物を組み合わせて導入する場合、導入は同時に行うことが好ましく、具体的には、最初のベクターまたは化合物等を添加してから４８時間以内、好ましくは３６時間以内、より好ましくは２４時間以内、１８時間以内、１２時間以内、１０時間以内、８時間以内、６時間以内、３時間以内、２時間以内、または１時間以内にリプログラミング因子をコードする全てのベクターおよび／または化合物の添加を完了することが好ましい。ベクターの用量は適宜調製することができるが、例えばMOIは0.1以上、好ましくは0.3以上、0.5以上、1以上、2以上、3以上、4以上、または5以上、また、100以下、好ましくは90以下、80以下、70以下、60以下、50以下、40以下、30以下、20以下、10以下、または5以下である。好ましくは、例えばMOI 0.3～100、より好ましくはMOI 0.5～50、より好ましくはMOI 1～40、より好ましくはMOI 1～30、より好ましくはMOI 2～30、例えばMOI 3～30 で感染させる。誘導された多能性幹細胞は、ＥＳ細胞とよく似た扁平なコロニーを形成し、アルカリホスファターゼを発現する。また誘導された多能性幹細胞は、未分化細胞マーカーであるNanog、OCT4、および／またはSOX2等を発現してよい。また誘導された多能性幹細胞は、好ましくはTERTを発現および/またはテロメラーゼ活性を示す。本発明は、アルカリホスファターゼを発現し、好ましくは未分化細胞マーカーであるNanogおよび/またはTERTをさらに発現する細胞の製造方法、および該細胞の製造および該細胞を誘導する薬剤の製造における上記センダイウイルスベクターの使用にも関する。
　本発明によれば、成人皮膚細胞および新生児包皮細胞を含む所望の細胞から多能性幹細胞を作製することができる。本発明によれば、多能性幹細胞のコロニーを、少なくともある種の細胞（例えば成人皮膚細胞および/または新生児包皮細胞）から、例えば0.03×10-5 以上、0.1×10-5 以上、0.3×10-5 以上、0.5×10-5 以上、0.8×10-5 以上、または1×10-5 以上（例えば1×10-5 ～ 1×10-3）の出現率で、好ましくは1.5×10-5 以上、1.7×10-5 以上、2.0×10-5 以上、2.5×10-5 以上、3×10-5 以上、4×10-5 以上、5×10-5 以上、8×10-5 以上、1×10-4 以上、2×10-4 以上、3×10-4 以上、5×10-4 以上、8×10-4 以上、1×10-3 以上、1.5×10-3 以上、2×10-3 以上、5×10-3、1×10-2 以上、1.5×10-2 以上、2×10-2 以上、2.5×10-2 以上、3×10-2 以上、4×10-2 以上、または 5×10-2 以上の出現率で誘導することができる。例えば、本発明によれば、ヒト末梢血単核球から少なくとも1×10-2(0.01%)、好ましくは少なくとも3×10-2、5×10-2、8×10-2、1×10-1、2×10-1、3×10-1、4×10-1、または5×10-1の効率で多能性幹細胞を誘導することができ、またヒト末梢血単球から少なくとも1×10-3(0.001%)、好ましくは少なくとも3×10-3、5×10-3、8×10-3、1×10-2、2×10-2、3×10-2、4×10-2、または5×10-2の効率で多能性幹細胞を誘導することができる。MOIは上述の通り適宜設定すればよく、例えば5、10または30で実施すればよい。またKLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順番で含む本発明のベクターおよびKLF遺伝子を含みOCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターによる多能性幹細胞のコロニーの出現効率は、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を発現する本発明のセンダイウイルスベクターは用いるが、KLF遺伝子を含みOCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターは用ない場合に比べて、少なくともある細胞に関して例えば1.2倍以上、好ましくは1.3倍以上、1.5倍以上、1.7倍以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、または5倍以上である。本発明の方法は、ベクターを導入後37℃で培養した場合の多能性幹細胞の導入効率が有意に高く、また、多能性幹細胞誘導後にベクターが速やかに脱落する点で、従来の方法に比べ顕著な効果を発揮する。
　リプログラミングを誘導する対象となる分化した細胞は、特に限定はなく、所望の体細胞等を用いることができる。体細胞からの多能性幹細胞の生成は、マウス胎児由来の細胞からのみならず、成体マウスの尾部から採取した分化した細胞や、肝細胞および胃粘膜細胞からでも可能であることが示されており、細胞型や分化状態によらないことが示唆される（WO2007/069666; Aoi T. et al., Science [Published Online February 14, 2008]; Science. 2008; 321(5889):699-702）。またヒトにおいても、成人の顔皮膚由来線維芽細胞、成人滑膜細胞、新生児包皮由来線維芽細胞、成人間葉系幹細胞、成人の手のひらの皮膚細胞、胎児細胞等の多様な細胞から、多能性幹細胞が誘導できることが確認されている（Takahashi K et al. (2007) Cell 131: 861-872; Park IH et al., Nature, 451(7175):141-6, 2008）。また、膵臓β細胞やBリンパ球のような最終分化した細胞からも、同様に多能性幹細胞が誘導できることが報告されている（Stadtfeld M et al., Curr Biol. 2008 May 21. [PubMed, PMID: 18501604]; Curr Biol. 2008;18(12):890-4; Hanna J. et al., Cell. 133(2):250-64, 2008）。これらの知見は、多能性幹細胞の誘導が、元になる細胞によらないことを示唆している。これらの所望の体細胞からの多能性幹細胞の誘導において、本発明の方法を適用することができる。具体的には、リプログラミングの対象となる分化した細胞としては、線維芽細胞、滑膜細胞、口腔または胃などの粘膜細胞、肝細胞、骨髄細胞、歯胚細胞、血液細胞（例えばリンパ球、白血球）、その他の所望の細胞が含まれる。血液細胞としては、末梢血細胞であってもよい。また、線維芽細胞、単球、および単核球なども好ましい。また細胞は、例えば胚、胎児、新生児、子供、成人または老人の細胞に由来してよい。また、動物の由来は特に制限はなく、ヒトおよび非ヒト霊長類（サルなど）、マウス、ラットなどのげっ歯類、およびウシ、ブタ、ヤギなどの非げっ歯類を含む哺乳動物等が含まれる。
　リプログラミングが完了した細胞のコロニーからは、ベクターが除去された細胞を適宜選択することができる。例えばベクターが自然除去された細胞を選択すればよい。このために、例えばウイルスベクターに特異的な抗体（例えば抗HN抗体）でネガティブ選択を行うことができる。また、温度感受性ベクターを用いた場合は、通常温度（例えば約37℃、具体的には36.5～37.5℃、好ましくは36.6～37.4℃、より好ましくは36.7℃～37.3℃）で培養するか、あるいはやや高温（例えば37.5～39℃、好ましくは38～39℃、または38.5～39℃）で培養することによりベクターを簡便に除去することができる。また、SeV(PM)/TSΔFや、これにさらにTS 7、TS 12、TS 13、TS 14、またはTS 15などの変異を導入したベクターを用いた場合は、継代により自然にベクターを脱落させることができる。好ましいベクターとしては、例えばSeV(PM)KOS/TS12ΔFおよびSeV18+KLF4/TSΔFを組み合わせることが挙げられるが、これに限定されない。またこのとき、SeV(HNL)c-rMYC/TS12ΔF、SeV(HNL)c-rMYC/TS13ΔF、またはSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF等を用いてMYC遺伝子を導入することができる。SeV(PM)KOS/TS12ΔF、SeV18+KLF4/TSΔF、およびSeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFの組み合わせが特に好ましい。また、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子を搭載するセンダイウイルスベクターにMYC遺伝子を搭載させないことは、癌化に関連するMYC遺伝子を用いずにリプログラミングを行うことができる利点がある他、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子に加え、4つ目の因子としてc-MYC、L-MYC、またはGlis1などを自由に選択して用いることが可能となる点でも優れている。
　本発明の方法により製造された細胞は、様々な組織や細胞に分化させるために有用であり、所望の試験、研究、診断、検査、治療等において用いることができる。例えば誘導した幹細胞は、幹細胞療法において利用されることが期待される。例えば患者から採取した体細胞を用いて初期化（reprogramming）を誘導し、その後、分化誘導して得られる体性幹細胞やその他の体細胞を患者に移植することができる。細胞の分化誘導の方法は特に限定されず、例えばレチノイン酸処理や、様々な増殖因子・サイトカイン処理、ホルモンによる処理により分化を誘導することができる。また得られた細胞は、所望の薬剤や化合物の効果を検出するために使用することができ、これを通して薬剤や化合物のスクリーニングを実施することが可能である。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。また、本明細書中に引用された文献およびその他の参照は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
[実施例１]
pSeV(PM)/TSΔFの構築
　本実施例で用いたセンダイウイルスベクターpSeV(PM)/TSΔFの作製方法を以下に示す。尚、本発明において「(PM)」とは、P遺伝子とM遺伝子の間にリプログラミング遺伝子を挿入することを表し、「(HNL)」とは、HN遺伝子とL遺伝子の間にリプログラミング遺伝子を挿入することを表す。また本発明において「TS」とは、M蛋白質にG69E,T116A,及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T,G264R,及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つことを表し、「ΔF」とは、F遺伝子を欠失していることを表す。また下記SeV(PM)/TSΔFとは、M蛋白質にG69E,T116A,及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T,G264R,及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（Z strain）である。このベクターは、P遺伝子の直下（immediate downstream）（P遺伝子とM遺伝子の間）に導入遺伝子挿入部位(NotI部位)を有する。但しこれらは例示であって、本発明はこれらに限定されるものではない。
　pSeV(PM)/TSΔFの構築は以下の通りに行った。Litmus SalINheIfrg PmutMtsHNts ΔF-GFP delGFP(国際公開番号 WO2010/008054)を鋳型にしてPMNOTI-F（5’- GAAATTTCACCTAAGCGGCCGCAATGGCAGATATCTATAG -3’）(配列番号:10) およびPMNOTI-R（5’- CTATAGATATCTGCCATTGCGGCCGCTTAGGTGAAATTTC -3’） (配列番号:11) を用いてPCR反応(94℃-3分→98℃-10秒、55℃-15秒、72℃-12分を25サイクル→72℃-7分)を行った。得られた約11kbのPCR産物をDpn I処理後、この反応液20μlを大腸菌DH5α(ToYoBo Code No. DNA-903)を用いてトランスフォーメーションを行い、NotI消化によりNotI配列の導入されたプラスミドを選択し、次にシークエンスにより配列の正しいクローンを選択しLitmus SalINheIfrg PmutMtsHNts (PM)-dFを得た。次にこのLitmus SalINheIfrg PmutMtsHNts (PM)-dFをSal IおよびNheIで消化して回収したフラグメント（約8kbp）とL遺伝子に二カ所の変異を有するプラスミドpSeV/ΔSalINheIfrg Lmut(国際公開番号:WO2003/025570)をSalI/NheIで消化して回収したフラグメント（約8kbp）をライゲーションして、pSeV(PM)/TSΔFを得た。このベクターは、P遺伝子およびM遺伝子の間に導入遺伝子挿入部位(NotI部位)を有する。このベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(PM)/TSΔFと称す。
[実施例２]
pSeV18+KLF4/TSΔFの構築
　JurkatのcDNAライブラリーからPrimeStar HS DNA polymerase (タカラバイオ株式会社 カタログ番号R010A)を用いてPCRを行なうことによりKIF4遺伝子を増幅し、これをブルースクリプトプラスミドベクターのNot Iサイトに挿入して、プラスミドpBS-KS-KLF4を得た（WO2010/008054）。pBS-KS-KLF4をNot Iで消化（37℃で3時間）し、1％アガロースゲル電気泳動により分離し、約1.5k bpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (キアゲン、カタログ番号28706) で精製した。このKLF4遺伝子を含むNot I断片をpSeV18+/TSΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV18+KLF4/TSΔFを得た。pSeV18+/TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+/TSΔF、pSeV18+KLF4/TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+KLF4/TSΔFと称す。
[実施例３]
pSeV(PM)/TS12ΔFの構築
　pSeV(PM)/TSΔFを鋳型にして、F3208 (5'-AGAGAACAAGACTAAGGCTACC-3' (配列番号：12))及びR3787(5'- ACCTTGACAATCCTGATGTGG-3' (配列番号：13))のプライマーを用いて、PrimeSterを使用し、94℃3分、（98℃10秒、55℃15秒、72℃1.5分）のサイクルを30サイクル、72℃5分、4℃∞の条件でPCRを行い、増幅された約600bpのバンドをQIAquick PCR purification kitにて精製した。pSeV18+Oct3/4/TS12ΔF(WO2010/008054; WO2012/029770)を鋳型にして、F2001 (5'- CCATCAACACTCCCCAAGGACC-3' (配列番号：14)) 及びR3390(5'- AGACGTGATGCGTTTGAGGCCC-3' (配列番号：15)) のプライマーを用いて、PrimeSterを使用し、94℃3分、（98℃10秒、55℃15秒、72℃1.5分） のサイクルを30サイクル、72℃5分、4℃∞の条件でPCRを行い、増幅された約1.4kbpのバンドをQIAquick PCR purification kitにて精製した。これらのPCR産物を混合し、F2001及びR3787のプライマーを用いて、PrimeSterを使用し、94℃3分、（98℃10秒、55℃15秒、72℃2分） のサイクルを30サイクル、72℃5分、4℃∞の条件でPCRを行った。そのPCR産物をQIAquick PCR purification kitにて精製し、SalI及びNot Iで消化後アガロースゲル電気泳動にて分離後、約1.6kbpのバンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction kitにて精製した。pSeV(PM)/TSΔFをSalI及びNot Iで消化後アガロースゲル電気泳動にて分離後、約14.8kbpのバンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction kitにて精製した。この2つのSalI及びNot I消化、精製産物を用いてライゲーションを行い、シークエンスにより配列を正しいクローンを選択し、pSeV(PM)/TS12ΔFを得た。このベクターは、P遺伝子およびM遺伝子の間に導入遺伝子挿入部位(NotI部位)を有する。このベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(PM)/TS12ΔFと称す。
[実施例４]
pSeV(PM)KOS/TS12ΔFの構築
　KLF4-OCT3/4-SOX2遺伝子が搭載されたSeV/TS12ΔFベクター作製用のプラスミドを以下の通り作製した。
　pSeV(PM)/TSΔFをNot Iで消化後、QIAquick PCR purification kit(キアゲンカタログ番号28106)で精製し、BAP処理を行った。その後、QIAquick PCR purification kitで精製した。pSeV(PM)KOS/TSΔFをNot Iで消化し、1%アガロースゲル電気泳動により分離し、約3.6kbpのバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction Kit (キアゲン、カタログ番号28706) で精製した。キットに付属の溶出液100μlに溶出した。このKLF4遺伝子、OCT3/4遺伝子、SOX2遺伝子を含むNot I断片をpSeV(PM)/TS12ΔFベクターのNot Iサイトにクローニングし、シークエンスにより配列の正しいクローンを選択し、pSeV(PM)KOS/TS12ΔFを得た。このベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(PM)KOS/TS12ΔFと称す。
[実施例５]
pSeV(HNL)c-rMyc/TS15ΔFの作製
　Litmus38TSΔF-P2(HNL)ΔGFPおよびpSeV/TSΔF-Linker L1361CL1558I（WO2010/008054; WO2012/029770）をそれぞれSalI-NheI消化後、アガロースゲル電気泳動により分離し、それぞれ8.0kbp、8.3kbpのバンドを切り出し精製した。これらの精製断片のライゲーションを行いpSeV(HNL)/TS15ΔFを得た（SeV(HNL)/TS15ΔFのアンチゲノムをコードするプラスミド）。このpSeV(HNL)/TS15ΔFのNot IサイトにpBS-KS-c-rMycより NotI消化により、切り出し、精製したc-rMyc遺伝子を含むNot I断片を導入し、pSeV(HNL)c-rMyc/TS15ΔFを得た。c-rMycの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号：8および9に示した。c-rMycは、a378g、t1122c、t1125c、a1191g、および a1194gの変異を有する。このベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(HNL)c-rMyc/TS15ΔFと称す。
[実施例６]
細胞初期化用遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターによる人工多能性幹細胞の作製１（iPS細胞）
　ヒト新生児包皮由来線維芽細胞(BJ) (ATCC(www.atcc.org), CRL-2522) 5 x 105(個)を 10 % FBS (GIBCO-BRL) 及びペニシリン(100u/ml)ストレプトマイシン(100μg/ml)（ナカライテスク, Code 26253-84）を含むDMEM (GIBCO-BRL, 11995), 10 % FBS (Cell Culture BioscienceCat. No. 171012) (以下10%FBS/PS/DMEMとする) 中で37℃、5 % CO2インキュベーターにて終夜培養した。その後、以下の条件でベクターを細胞に感染させた。
　　条件１：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=30
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=30
　　　　SeV18+KLF4/TSΔF　　　　　　　MOI=3
　
　　条件２：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=30
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=30
　　　　SeV18+KLF4/TSΔF　　　　　　　MOI=10
　
　　条件３：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+/TSΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=30
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=30
　　　　SeV18+/TSΔF　　　　　　　　　MOI=3
　
　　条件４：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+/TSΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=30
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=30
　　　　SeV18+/TSΔF　　　　　　　　　MOI=10
　
　　条件５：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=30
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=30
　
　　条件６：ベクター非投与群（コントロール群）
　上記ベクターを細胞に投与後、37℃、5 % CO2インキュベータにて培養した。評価はn=2で行った。10%FBS/PS/DMEMでほぼ毎日培地交換を行った。感染6日目に、ゼラチンコート6ウェルプレートに用意したマイトマイシン処理済みフィーダー細胞 (例えばMEF) 1.25×105 (個)に対し、0.25 %トリプシン-EDTA溶液を用いて剥がした上記ベクター導入細胞1.0×104 (個) を添加し、CO2インキュベータにて培養した。翌日、10%FBS/PS/DMEMから霊長類ES用培地 (ReproCell社, RCHEMD001)(4 ng/ml になるようbFGFを添加した) に培地交換し、37℃で5% CO2インキュベータで培養した。培地交換は毎日もしくは二日に一度行った。培地はフィーダー細胞のコンディションドメディウムでも構わない。
　感染28日目に、ES細胞の未分化マーカーであるアルカリホスファターゼの活性をNBCT/BCIP (PIERCE, NBT/BCIP, 1-Step, # 34042) にて染色してiPS細胞の誘導効率を観察した（図1）。SeV18+KLF4/TSΔFベクターを添加していない試験群（上記条件５）と比較して、SeV18+KLF4/TSΔFベクターを添加した試験群（上記条件１,２）において、iPS細胞の誘導効率がSeV18+KLF4/TSΔFベクターの添加量依存的に改善された。図２は、n=2の誘導効率を平均したグラフを示す。SeV18+KLF4/TSΔFベクターをMOI=3で添加した場合は、約6.9倍、MOI=10で添加した場合は、約12倍iPS細胞の誘導効率が改善された。SeV18+ /TSΔFベクターを添加した場合、MOI=3で添加した場合は、約3.2倍、MOI=10で添加した場合は、6倍iPS細胞の誘導効率が改善された。
[実施例７]
細胞初期化用遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターによる人工多能性幹細胞（iPS細胞）の作製2
　ヒト新生児包皮由来繊維芽細胞 (BJ)( ATCC（www.atcc.org）, CRL-2522) 5x 105 (個) を6ウェルプレートに 10 % FBS (GIBCO-BRL) 及びペニシリン (100u/ml) ストレプトマイシン (100μg/ml)（ナカライテスク, Code 26253-84）を含むDMEM (GIBCO-BRL, 11995), 10 % FBS (Cell Culture BioscienceCat. No. 171012) (以下10%FBS/PS/DMEMとする) 中で37℃、5 % CO2インキュベーターにて終夜培養した。その後、以下の条件でベクターを細胞に感染させた。評価はn=2で行った。
　　条件1：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=5
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=5
　　　　SeV18+KLF4/TSΔF　　　　　　　MOI=5

　　条件２：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=30
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=30
　　　　SeV18+KLF4/TSΔF　　　　　　　MOI=10

　　条件３：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=5
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=5

　　条件４：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=30
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=30

　　条件５：ベクター非投与群1（コントロール群1）

　　条件６：ベクター非投与群2（コントロール群2）
　上記ベクターを細胞に投与後、条件１、２、５は、37℃、5 % CO2インキュベータにて培養した。条件３，４，６は、35℃、5 % CO2インキュベータにて培養した。10%FBS/PS/DMEMでほぼ毎日培地交換を行った。感染6日目に、ゼラチンコート6ウェルプレートに用意したマイトマイシン処理済みフィーダー細胞(例えばMEF) 1.25×105 (個) に対し、0.25 %トリプシン-EDTA溶液を用いて剥がした上記ベクター導入細胞を1.0×104 (個) を添加し、37℃で5% CO2インキュベータにて培養した。翌日、10%FBS/PS/DMEMから霊長類ES用培地 (ReproCell社, RCHEMD001)(4 ng/ml になるようbFGFを添加した) に培地交換し、37℃で5% CO2インキュベータで培養した。培地交換は毎日もしくは二日に一度行った。培地はフィーダー細胞のコンディションドメディウムでも構わない。
　感染28日目に、ES細胞の未分化マーカーであるアルカリホスファターゼの活性をNBCT/BCIP(PIERCE, NBT/BCIP, 1-Step, # 34042)にて染色してiPS細胞の誘導効率を観察した（図３）。SeV18+KLF4/TSΔFベクターを添加していない試験群（上記条件３，４）と比較して、SeV18+KLF4/TSΔFベクターを添加した試験群（上記条件１，２）において、iPS細胞の誘導効率が高かった。ベクター非投与群（上記条件5、6）では、iPS細胞の誘導は認められなかった。図４に、n=2の結果の平均値のグラフを示す。
[実施例８]
細胞初期化用遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターによる人工多能性幹細胞（iPS細胞）の作製3
　ヒト成人皮膚由来繊維芽細胞HDF(Applications, Inc. 106-05A-1388) 5 x 105(個)を6ウェルプレートに 10 % FBS (GIBCO-BRL) 及びペニシリン (100u/ml) ストレプトマイシン (100μg/ml)（ナカライテスク, Code 26253-84）を含むDMEM (GIBCO-BRL, 11995), 10 % FBS (Cell Culture BioscienceCat. No. 171012) (以下10%FBS/PS/DMEMとする) 中で37℃、5 % CO2インキュベーターにて終夜培養した。その後、以下の条件でベクターを細胞に感染させた。評価はn=2で行った。
　　条件1：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=5
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=5
　　　　SeV18+KLF4/TSΔF　　　　　　　MOI=5

　　条件２：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=30
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=30
　　　　SeV18+KLF4/TSΔF　　　　　　　MOI=10

　　条件３：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=30
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=30

　　条件４：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=5
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=5

　　条件５：ベクター非投与群1（コントロール群1）

　　条件６：ベクター非投与群2（コントロール群2）
　上記ベクターを細胞に投与後、条件１、２、５は、37℃、5 % CO2インキュベータにて培養した。条件３，４，６は、35℃、5 % CO2インキュベータにて培養した。10%FBS/PS/DMEMでほぼ毎日培地交換を行った。感染6日目に、ゼラチンコート6ウェルプレートに用意したマイトマイシン処理済みフィーダー細胞(例えばMEF) 1.25×105 (個) に対し、0.25 %トリプシン-EDTA溶液を用いて剥がした上記ベクター導入細胞を1.0×105 (個) を添加し、37℃で5% CO2インキュベータにて培養した。翌日、10%FBS/PS/DMEMから霊長類ES用培地 (ReproCell社, RCHEMD001)(4 ng/ml になるようbFGFを添加した) に培地交換し、37℃で5% CO2インキュベータで培養した。培地交換は毎日もしくは二日に一度行った。培地はフィーダー細胞のコンディションドメディウムでも構わない。
　感染28日目に、ES細胞の未分化マーカーであるアルカリホスファターゼの活性をNBCT/BCIP (PIERCE, NBT/BCIP, 1-Step, # 34042)にて染色してiPS細胞の誘導効率を観察した（図５）。SeV18+KLF4/TSΔFベクターを添加していない試験群（上記条件３，４）と比較して、SeV18+KLF4/TSΔFベクターを添加した試験群（上記条件１，２）において、iPS細胞の誘導効率が高かった。ベクター非投与群（上記条件５、６）では、iPS細胞の誘導は認められなかった。図６に、n=2の結果の平均値のグラフを示す。
[実施例９]
細胞初期化用遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターによる人工多能性幹細胞（iPS細胞）の作製4
　ヒト胎児肺細胞由来繊維芽細胞（MRC-5；ATCC, CCL-171）2x 105(個)を6ウェルプレートに 10 % FBS (GIBCO-BRL) 及びペニシリン(100u/ml)ストレプトマイシン(100μg/ml)（ナカライテスク, Code 26253-84）を含むDMEM (GIBCO-BRL, 11995), 10 % FBS (Cell Culture BioscienceCat. No. 171012) (以下10%FBS/PS/DMEMとする) 中で37℃、5 % CO2インキュベーターにて終夜培養した。その後、以下の条件でベクターを細胞に感染させた。評価はn=2で行った。
　　条件1：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=5
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=5
　　　　SeV18+KLF4/TSΔF　　　　　　　MOI=5

　　条件２：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF+SeV18+KLF4/TSΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=30
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=30
　　　　SeV18+KLF4/TSΔF　　　　　　　MOI=10

　　条件３：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=5
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=5

　　条件４：SeV(PM)KOS/TS12ΔF＋SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF
　　　　SeV(PM)KOS/TS12ΔF　　　　　　MOI=30
　　　　SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔF　　　　MOI=30

　　条件５：ベクター非投与群1（コントロール群1）

　　条件６：ベクター非投与群2（コントロール群2）
　上記ベクターを細胞に投与後、条件１、２、５は、37℃、5 % CO2インキュベータにて培養した。条件３，４，６は、35℃、5 % CO2インキュベータにて培養した。10%FBS/PS/DMEMでほぼ毎日培地交換を行った。感染6日目に、ゼラチンコート6ウェルプレートに用意したマイトマイシン処理済みフィーダー細胞(例えばMEF) 1.25×105 (個) に対し、0.25 %トリプシン-EDTA溶液を用いて剥がした上記ベクター導入細胞を1.0×105 (個) を添加し、37℃で5% CO2インキュベータにて培養した。翌日、10%FBS/PS/DMEMから霊長類ES用培地 (ReproCell社, RCHEMD001)(4 ng/ml になるようbFGFを添加した) に培地交換し、37℃で5% CO2インキュベータで培養した。培地交換は毎日もしくは二日に一度行った。培地はフィーダー細胞のコンディションドメディウムでも構わない。
　感染28日目に、ES細胞の未分化マーカーであるアルカリホスファターゼの活性をNBCT/BCIP(PIERCE, NBT/BCIP, 1-Step, # 34042)にて染色してiPS細胞の誘導効率を観察した（図７）。SeV18+KLF4/TSΔFベクターを添加していない試験群（上記条件３，４）と比較して、SeV18+KLF4/TSΔFベクターを添加した試験群（上記条件１，２）において、iPS細胞の誘導効率が高かった。ベクター非投与群（上記条件５、６）では、iPS細胞の誘導は認められなかった。図８に、n=2の結果の平均値のグラフを示す。
[実施例１０]
誘導された人工多能性幹細胞のin vivo多分化能の評価
　in vivoでの多分化能は免疫不全マウスへのテラトーマ形成で確認を行った。BJ細胞由来iPS細胞のクローンBJ-1215K#1、HDF細胞由来iPS細胞のクローンHDF-1215K#1をSCIDマウス皮下に接種し、約１ヶ月後に腫瘤形成を確認し、約2ヶ月後に検体を回収し、10 %ホルマリン固定後、パラフィン包埋し、組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色を行い、三胚葉分化を確認した (図９)。
[実施例１１]
核型解析
　9継代目のBJ細胞由来iPS細胞のクローンBJ-1215K#1、HDF細胞由来iPS細胞のクローンHDF-1215K#1、MRC-5細胞由来iPS細胞のクローンMRC5-1215K#1の核型解析を（株）日本遺伝子研究所に依頼して行った。その結果、46本の染色体を有し、核型が正常であることが示された (図１０)。
[実施例１２]
マウス線維芽細胞からのiPS細胞の誘導
　129+TER/SvJclマウス由来の線維芽細胞を5x105cells/ウェルになるように6-ウェルプレートへ播種し、CO2インキュベーター（37℃、5% CO2）で1晩培養した。細胞数測定用のウェルの細胞をトリプシン-EDTA溶液を用いて剥がし、1ウェル当たりの細胞数を測定した。この細胞数を基にベクターの量を算出した。SeV(PM)KOS/TS12ΔFベクター、SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター、SeV18+KLF4/TSΔFベクターを10%FBS/PS/DMEM培地に各ベクターをMOI=5になるように添加して、最終溶液が1ｍLとなるようにベクター液を調製した。6-ウェルプレートの培養液を除き、調製したベクター溶液を添加し、CO2インキュベーター（37℃、5% CO２）で約24時間、培養を行った。その後、培養液を除き、10%FBS/PS/DMEMを添加（2 mL/ウェル）し、CO2インキュベーター（37℃、5% CO２）で約24時間、培養を行った。細胞の培養液を除き、ES細胞用の培地（Neurobasal medium(Life technologies. Cat. No.21103-049)を250 ｍｌ、DMEM/F-12, GlutaMAX (Life technologies. Cat. No. 10565-018) を250 ｍｌ、B27 (Life technologies, Cat. No.17504044) を 10 ｍｌ、N2（Life technologies. Cat. No.17502-048）を5 ｍｌ、2-メルカプトエタノール（シグマ, Cat. No. M3148-100ML）を3.5μl、L-Glutamine（Life technologies. Cat. No.25030-0841）を2.5 ｍl、ペニシリンストレプトマイシン（ナカライテスク, Cat. No. 26253-84）を5 ｍl、PD0325901 (5 mMに調製)（フナコシ, Cat. No. Axon1408）を100μl、CT 99021 (15 mMに調製)（フナコシ, Cat. No. Axon1386）を100μlを混合して2i培地を作製。2i培地にLIF（Millipore, Cat. No. ESG1106）を終濃度1000 U/mlになるように添加してマウスES細胞用培地とした（以下2i/LIF培地とする））を添加し、CO2インキュベーター（37℃、5% CO2）で培養した。（この後、さらにベクター感染5日目まで、2i/LIF培地で培地交換を行いながら培養を行った。感染5日目に、フィーダー細胞を、0.1％ゼラチン溶液でコートした6ウェルプレートに1.4x105 cells/ウェル/2 ml 10%FBS/PS/DMEM、10ｃｍディッシュに7x105 cells/ディッシュ/10 ml 10%FBS/PS/DMEMで播種し、CO2インキュベーター（37℃、5% CO2）で培養した。感染6日目に、ベクターを感染させた細胞をトリプシン-EDTAを用いて剥がし、準備したフィーダー上に2i/LIF培地を添加して、1x104 cells/ウェル、1x105 cells/ウェルの割合で6ウェルプレートに、1x104 cells/ディッシュ、1x105 cells/ディッシュの割合で10ｃｍディッシュに撒き、CO2インキュベーター（37℃、5% CO2）で培養した。これ以降は、ほぼ毎日2i/LIF培地で培地交換を行いながらiPS細胞の誘導を行った。感染21日目にアルカリホスファターゼ染色を行った（図１１）。iPS細胞様でアルカリホスファターゼ陽性の細胞を計測し、誘導効率を求めた結果、約0.1％であった。
[実施例１３]
マウスiPS細胞のクローンの取得
　実施例１２で1x104 cells/ディッシュ、1x105 cells/ディッシュの割合で細胞を撒いた10ｃｍディッシュから、感染16日目にそれぞれ6クローン、18クローンをピックアップし、継代培養を行い、抗SeV抗体染色を行いセンダイウイルスベクターの除去の確認を行った（図１２）。その結果、９クローン（クローン番号：5-2、5-6、5-7、5-11、5-13、5-14、5-15、5-16、5-17）のセンダイウイルスベクター陰性クローンを得た。
[実施例１４]
免疫染色による遺伝子発現解析
　実施例１２で誘導し、実施例１３でセンダイウイルスベクターが陰性であることが確認されたマウスiPS細胞の評価を抗NANOG抗体、抗OCT4抗体を免疫染色法により行った（図１３）。その結果、3つのiPS細胞のクローン（5-2、5-7、5-17）は、NANOGおよびOCT4が陽性コントロールであるマウスのES細胞と同様に染色された。陰性コントロールのマウス線維芽細胞では、NANOGおよびOCT4は、染色されなかった。従って、評価したiPS細胞は、NANOGおよびOCT4遺伝子をタンパク質レベルで発現している事が示された。
[実施例１５]
多分化能評価
　実施例１２で誘導し、実施例１３でセンダイウイルスベクターが陰性であることが確認されたマウスiPS細胞の多分化能評価を行った。
　LIFを含まない血清培地で培養することで胚葉体を形成した（図１４）。マウスES細胞と同様であった。
　胚葉体を形成させた後に、ゼラチンコートプレートに継代し、LIFを含まない血清培地で培養することで4日目には、GATA4（内胚葉のマーカーである転写因子）染色により細胞の核が染色された（図１５）。
　LIFを含まない血清培地にて、培養を続けることでゼラチンコートプレートに継代して10日目に拍動する心筋と考えられる組織が観察された。14日目に細胞を固定してα-Actininに対する抗体を用いて免疫染色を行った（図１６）。全体的に染色されていた。その中でもいくつかの領域では、強く染色された細胞が観察された。
　LIFを含まない2i培地で培養することでゼラチンコートに継代して4日目には、βIIIチューブリン陽性（図１７）Tyrosine Hydroxylase陽性（図１８）、の神経細胞に分化できることが示された。これらの結果より、本発明のセンダイウイルスベクターを使用することでマウスの細胞から3胚葉への分化能を有するiPS細胞が誘導可能であることが示された。
[実施例１６]
ヒト単球からのiPS細胞誘導1
　ヒトCD14+単球からのiPS細胞の誘導を行った。使用した単球は、LONZA社より購入した（カタログ番号 2W-400C）。 単球は10％ウシ胎児血清およびペニシリンストレプトマイシンを含むIMDM（10%FBS/PS/IMDMとする）により培養を行った。凍結された単球の細胞を37℃のウォーターバスで融解し、10%FBS/PS/IMDM培地10mlを入れた50mlファルコンチューブに移し、優しく混合した。100g 5分、室温で遠心分離後、上清を取り除き、10 mlの10%FBS/PS/IMDMを添加、混合した。血球計算盤を用いて細胞数をカウントした。5ｘ105cells/ウェル/2ml 10%FBS/PS/IMDMで6-ウェルプレートに播種し、CO2インキュベーター（37℃、5% CO2）で培養した。
　細胞をエッペンドルフチューブに回収し、遠心分離後、上清を除き、500μlの10%FBS/PS/IMDMを添加、混合、細胞数をカウントした。細胞数から必要ベクター量を計算し、SeV(PM)KOS/TS12ΔFベクター、SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター、SeV18+KLF4/TSΔFベクターの3種類のベクターがMOI=5, 10, 30, 50となるようにベクター溶液を10%FBS/PS/IMDMと混合して、最終容量が500μlになるように調製し、ベクター溶液とした。細胞溶液とベクター溶液を混合して6ウェルプレートに添加し、CO2インキュベーター（37℃、5% CO2）で終夜培養した。翌日、10%FBS/PS/IMDMを1ml/ウェルで添加、CO2インキュベーター（37℃、5% CO2）で2日間培養した。感染3日目と4日目まで10%FBS/PS/IMDMで培地交換を行った。感染6日目に細胞をトリプシン-EDTAを用いて細胞を剥がし、10%FBS/PS/IMDMに細胞を懸濁、フィーダー細胞上に添加し、CO2インキュベーター（37℃、5% CO2）で培養した。翌日、霊長類ES用培地 (ReproCell社, RCHEMD001)(4 ng/ml になるようbFGFを添加した)を用いて培地交換を行った。この後、培地交換を行いながら、ベクター感染28日目まで培養を行った。誘導過程の細胞の状態を図１９に示した。28日目にアルカリホスファターゼ染色を行い、アルカリホスファターゼ陽性コロニーの誘導が認められた（図２０）。iPS細胞の誘導効率は、ベクター量依存的に高くなり、約0.01％～0.03％であった（図２１）。
[実施例１７]
ヒト末梢血単核球からのiPS細胞誘導
　2名のボランティア（ドナー1、2とする）から提供された血液からフィコール法により末梢血単核球を調製した。PBMC培地（StemPro-34 SFMにStemPro-34 Nutrient、L-Glutamine、ペニシリンストレプトマイシンを添加した培地）にサイトカイン（100 ng/mL SCF、100 ng/mL FLT-3 Ligand、 20 ng/mL Thrombopoetin、10 ng/mL IL-6）を添加した培地（PBMC+培地とする）を用いて培養を行った。培養4日目にベクターの感染を行った。末梢血単核球の細胞数を計測し、MOIが5、10、30、50となるようにベクター量を計算した。PBMC+培地に計算したベクターを添加してベクター溶液を作製した。PBMCの培養液を除き、ベクター溶液を添加し、CO2インキュベーター（37℃、5% CO２）で培養した。ベクター感染3日目にトリプシン-EDTAを用いて細胞を剥がし、PBMC+培地に懸濁後、フィーダー細胞上に添加、CO2インキュベーター（37℃、5% CO２）で培養した。翌日から感染6日目まで、PBMC培地を用いて培地交換を行い、CO2インキュベーター（37℃、5% CO２）で培養した。感染7日目には、半分の培地を除去し、同量の霊長類ES用培地 (ReproCell社, RCHEMD001)(4 ng/ml になるようbFGFを添加した)を添加、CO2インキュベーター（37℃、5% CO２）で培養した。これ以降は、霊長類ES用培地 (ReproCell社, RCHEMD001)(4 ng/ml になるようbFGFを添加した)を用いて培養を行い感染21日目には、iPS様の細胞が認められた（図２２、図２３）。この後、アルカリホスファターゼ染色を行った（図２４）。アルカリホスファターゼ陽性、iPS細胞様の誘導効率を算出した結果、ドナーやベクター量により誘導効率が異なったが、0.1％～0.8％の誘導効率を達成した（図２５）。
[実施例１８]
ヒト単球からのiPS細胞誘導2
　2名のボランティア（ドナー3、4とする）から提供された血液からフィコール法により末梢血単核球を調製した。この末梢血単核球からEasySep positive selection Human CD14 positive Selection kit (ベリタス, Cat. No. 18058を使用)を用いてCD14+細胞を分離して出発材料とした。抗CD14抗体を用いたFACS解析により、末梢血単核球では、CD14陽性細胞は、約15％であったが、分離後は85％以上にまで純化されたことを確認した。この細胞にSeV(PM)KOS/TS12ΔFベクター、SeV(HNL)c-rMYC/TS15ΔFベクター、SeV18+KLF4/TSΔFベクターの3種類のベクターをMOI=5, 10, 30, 50となるように感染させて、実施例１６で示した方法と同様にiPS細胞の誘導を行った。その結果、アルカリホスファターゼ染色陽性iPS様細胞の誘導が確認され（図２６、図２７、図２８）、誘導効率は、最大で0.12％であった（図２９）。
　本発明により、KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で含むベクターを用いた多能性幹細胞の誘導効率を有意に向上させることが可能となる。特に温度感受性ベクターを利用することにより、多能性幹細胞の誘導に速やかなベクターの除去を可能としつつ、培養を低温で行うことなく高い効率で多能性幹細胞の誘導を行うことができる点で有用である。本発明の方法は、細胞に低温刺激が加わらないことから、生理的により好ましい多能性幹細胞を取得できることが期待される。

Claims (20)

  1. 　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターを導入し、低温培養せずに、多能性幹細胞を誘導する方法における多能性幹細胞の誘導効率を改善する方法であって、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターをさらに導入する工程を含む方法。
  2. 　約37℃で培養される、請求項１に記載の方法。
  3. 　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にD433A, R434A, K437A, 及びL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターを導入する工程をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にD433A, R434A, K437A, 及びL511F変異、そしてL蛋白質にL1361C, L1558I, N1197S, 及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、請求項５に記載の方法。
  7. 　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターを導入し、低温培養せずに、多能性幹細胞を誘導する方法における多能性幹細胞の誘導効率を改善するための薬剤の製造における、KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターの使用。
  8. 　多能性幹細胞を誘導する方法が、約37℃で培養する方法である、請求項７に記載の使用。
  9. 　KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にD433A, R434A, K437A, 及びL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、請求項７または８に記載の使用。
  10. 　KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、請求項７から９のいずれかに記載の使用。
  11. 　低温培養せずに培養して多能性幹細胞を誘導するための組成物であって、
    （ａ）KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクター、および
    （ｂ）KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクター、
    を含む組成物。
  12. 　多能性幹細胞を誘導するための組成物であって、
    （ａ）KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターであって、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にD433A, R434A, K437A, 及びL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター、および
    （ｂ）KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターであって、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター、
    を含む組成物。
  13. 　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターをさらに含む、請求項１１または１２に記載の組成物。
  14. 　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にD433A, R434A, K437A, 及びL511F変異、そしてL蛋白質にL1361C, L1558I, N1197S, 及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、請求項１３に記載の組成物。
  15. 　低温培養せずに培養して多能性幹細胞を誘導するための組成物である、請求項１２から１４のいずれかに記載の組成物。
  16. 　低温培養せずに培養して多能性幹細胞を誘導するためのキットであって、
    （ａ）KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクター、および
    （ｂ）KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクター、
    を含むキット。
  17. 　多能性幹細胞を誘導するためのキットであって、
    （ａ）KLF遺伝子、OCT遺伝子、およびSOX遺伝子をこの順序で１つのベクターに含む温度感受性センダイウイルスベクターであって、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にD433A, R434A, K437A, 及びL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター、および
    （ｂ）KLF遺伝子を含み、OCT遺伝子およびSOX遺伝子を含まないセンダイウイルスベクターであって、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にL511F変異、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター、
    を含むキット。
  18. 　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターをさらに含む、請求項１６または１７に記載のキット。
  19. 　MYC遺伝子が挿入された温度感受性センダイウイルスベクターが、M蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異、P蛋白質にD433A, R434A, K437A, 及びL511F変異、そしてL蛋白質にL1361C, L1558I, N1197S, 及びK1795E変異を含むF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである、請求項１８に記載のキット。
  20. 　低温培養せずに培養して多能性幹細胞を誘導するためのキットである、請求項１７から１９のいずれかに記載のキット。
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