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WO2014038641A1 - アミノ酸およびステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体 - Google Patents

アミノ酸およびステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体 Download PDF

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WO2014038641A1
WO2014038641A1 PCT/JP2013/073995 JP2013073995W WO2014038641A1 WO 2014038641 A1 WO2014038641 A1 WO 2014038641A1 JP 2013073995 W JP2013073995 W JP 2013073995W WO 2014038641 A1 WO2014038641 A1 WO 2014038641A1
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WO
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hyaluronic acid
chol
sample
group
acid derivative
Prior art date
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Application number
PCT/JP2013/073995
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English (en)
French (fr)
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貴士 中井
朋子 八杉
佳弘 反保
健司 八杉
剛 下房地
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to JP2014534410A priority patent/JP6275044B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/08—Chitin; Chondroitin sulfate; Hyaluronic acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a hyaluronic acid derivative modified with an amino acid and further introduced with a steryl group, a complex of the hyaluronic acid derivative and a drug, and a pharmaceutical composition containing the hyaluronic acid derivative and the drug.
  • the pharmacological activity of proteins and peptides is largely attributed to their higher order structures, and the pharmacological activity of proteins and peptides is impaired by denaturation and aggregation caused by external environments such as contact with organic solvents and air interfaces, pressure, temperature, and pH. It is known that It is also known that the risk of antigenicity is increased by administering a denatured or aggregated protein into the body. In sustained-release preparations containing protein or peptide as the active ingredient, the stability of the protein or peptide is ensured from the formulation process until the active ingredient is released in vivo after administration through the storage period of the preparation. Is required.
  • the base material used for the preparation must be non-antigenic, non-mutagenic, non-toxic and biodegradable.
  • HA hyaluronic acid
  • hyaluronic acid as a physiologically active substance related to the induction of cell adhesion, proliferation, and migration has attracted attention. Furthermore, from the viewpoint of production, high-molecular-weight hyaluronic acid can be mass-produced by microorganisms, and DDS research is actively conducted. There is a report that by conjugating a drug with hyaluronic acid, targeting of the drug to cancer tissue (Patent Document 1), targeting to the liver (Patent Document 2), reduction of antigenicity, etc. (Patent Document 3) can be achieved. Has been made.
  • CD44, RHAMM (Receptor for Hyaluronic Acid-Mediated Motility), LYVE-1 (Lymphe Vessel Endothelial Receptor), and HARE (Hyperonic Receptor) are HARE (Hyperonic Receptor).
  • Non-Patent Document 7 and Non-Patent Document 8 are overexpressed in many cancer cells, and therefore, attempts have been made to use HA as a substrate for cancer targeting carriers.
  • Non-Patent Documents 9 to 11 and Patent Document 12 examples include paclitaxel-HA conjugates (Non-Patent Documents 9 to 11 and Patent Document 12), camptothecin-HA conjugates (Patent Document 13), doxorubicin-HPMA [N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide] -HA. Conjugate (Non-patent document 12), Butyric acid-HA conjugate (Non-patent document 13), Doxorubicin-encapsulated HA-PEG-PLGA nanoparticles (Non-patent document 14), siRNA-encapsulated HA gel (Non-patent document 15), Doxorubicin encapsulated HA-coated liposome (Non-patent Document 16) and the like can be mentioned.
  • Non-Patent Document 17 reports an HA derivative conjugated with cholic acid via an ethylenediamine linker introduced by an amide bond. It has been reported that these HA-based carriers are efficiently taken up in cells expressing CD44 in vitro (for example, Non-Patent Document 9). However, HA is known to be instantaneously taken up and metabolized by the HARE receptor present in the sinusoidal endothelium such as the liver when systemically administered, and rapidly disappears from the blood (Non-Patent Documents 18 to 20). ). Thus, when hyaluronic acid is used as a DDS substrate for extended retention or targeting, its short retention in blood is a drawback. It is thought that the continuous 6-saccharide of hyaluronic acid is a receptor recognition site, and attempts have been made to extend the residence time in blood (Patent Documents 4, 5 and 6) by modifying carboxy.
  • a hyaluronic acid derivative has been developed and its usefulness has been demonstrated by highly modifying the carboxy of the glucuronic acid moiety of hyaluronic acid to realize prolonged retention in blood (Patent Document 7).
  • Patent Document 7 the retention of the hyaluronic acid derivative in the blood is prolonged by increasing the carboxy modification rate of the glucuronic acid moiety.
  • the two do not correlate linearly and change abruptly at a certain threshold.
  • An example of modification of carboxy in hyaluronic acid with an amino acid is, for example, produced by using 2-chloro-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine in the presence of N-methylmorpholine.
  • Modification of glycine with ethyl ester using 4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine) -4-methylmorpholium (hereinafter also referred to as DMT-MM) as a condensing agent is possible. Is 20% at the maximum (Non-Patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 hyaluronic acid into which alanine is introduced has enhanced resistance to enzymatic degradation and can be expected to be used as a viscous supplement.
  • Non-patent Document 3 and Patent Document 9 modifications have been reported for other amino acids.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • leucine methyl ester hydrochloride valine methyl ester hydrochloride
  • Water-insoluble biocompatible modified with hydrochloride, proline methyl ester hydrochloride, phenylalanine methyl ester hydrochloride, arginine methyl ester hydrochloride and histidine methyl ester hydrochloride, gelled without deprotection
  • the modification rate is unknown (Patent Document 8).
  • Patent Document 15 published after the priority date of the present application discloses that a hyaluronic acid derivative obtained by modifying carboxy of hyaluronic acid with a specific amino-carboxylic acid or its amide has biodegradability and blood concentration. It has been reported that it has characteristics in both retention properties and is effective in the release of drugs from endosomes into the cytoplasm.
  • pullulan derivatives into which cholesteryl groups are introduced can form nano-sized fine particles in aqueous solution and function as host molecules that are complexed with hydrophobic small molecules, peptides, proteins, etc. It has been reported (Non-Patent Document 4). Thermodynamic evaluation of the pullulan derivative after protein incorporation indicates that the incorporated protein is stabilized by hydrogen bonding with the hydroxy group of pullulan (Non-patent Document 5).
  • Patent Document 10 carboxymethyl cellulose
  • Non-Patent Document 6 Non-Patent Document 6
  • Patent Document 11 discloses a composition comprising a hyaluronic acid derivative having a crosslinkable group and a hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group, wherein the hyaluronic acid derivative having a crosslinkable group is a hydrophilic polysaccharide.
  • Patent Document 14 discloses a group having a cholesteryl group as a hydrophobic group. It has been reported that a hyaluronic acid derivative introduced into hyaluronic acid forms fine particles by association in water to form a complex with a drug.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a hyaluronic acid derivative having both biodegradability and blood retention characteristics.
  • a further problem to be solved by the invention is to provide a complex of the hyaluronic acid derivative and a drug and a pharmaceutical composition containing the hyaluronic acid derivative, particularly a complex of the hyaluronic acid derivative and a drug. .
  • the present inventor has conducted extensive research to solve such problems, and has been obtained by converting carboxy of the glucuronic acid moiety of hyaluronic acid or a salt thereof into an amide by reacting with a specific amino acid or amino acid amide.
  • the hyaluronic acid derivative obtained by further introducing a steryl group into the carboxy of the glucuronic acid moiety and / or the carboxy of the amino acid moiety of the intermediate has both biodegradability and blood retention properties.
  • the complex of the hyaluronic acid derivative and the drug was found to have good properties as a pharmaceutical composition, thereby completing the present invention.
  • the present invention has a hyaluronic acid derivative having both biodegradability and retention in blood, a hyaluronic acid derivative that is more dispersed in water by introducing a steryl group, and these hyaluronic acid derivatives and pharmacological activities.
  • the present invention relates to a complex containing a compound. Furthermore, the present invention relates to a method for producing these hyaluronic acid derivatives, a pharmaceutical composition containing the drug and these hyaluronic acid derivatives, and a method for producing the same.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl;
  • R 5 is a hydrogen atom, formyl, or C 1-6 alkylcarbonyl;
  • X 1 is hydroxy, C 1-6 alkoxy, —O ⁇ Q + , —NR 7 R 8 , or —NR 9 —Z 1 —Z 2 ;
  • Q + represents a counter cation;
  • R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 are independently selected from a hydrogen atom and C 1-6 alkyl;
  • R a is a hydrogen atom or C 1-6 alkyl, wherein the alkyl is independently one or more groups selected from hydroxy, carboxy, carbamoyl, C 1-6 alkylthio, aryl, and heteroaryl.
  • Z 1 is C 2-30 alkylene, or — (CH 2 CH 2 O) m —CH 2 CH 2 —, wherein the alkylene is independently —O—, —NR g —, and —S—.
  • Z 2 has the following formula: -NR b -Z 3 , —NR b —COO—Z 3 , —NR b —CO—Z 3 , -NR b -CO-NR c -Z 3 , -COO-Z 3 , -CO-NR c -Z 3 , -O-CO-NR c -Z 3 , -O-COO-Z 3 , -SZ 3 , -CO-Z a -SZ 3 , -O-CO-Z b -SZ 3 , —NR b —CO—Z b —SZ 3 , and —S—SZ 3 , Selected from the group represented by R b and R c are independently selected from a hydrogen atom, C 1-20 alkyl, amino C 2-20 alkyl and hydroxy C 2-20 alkyl, wherein the alky
  • R g is independently selected from a hydrogen atom, C 1-20 alkyl, amino C 2-20 alkyl or hydroxy C 2-20 alkyl, wherein the alkyl portion of the group is independently —O— and —NH—.
  • 1 to 3 groups selected from may be inserted;
  • Z 3 is a steryl group;
  • Z a is C 1-5 alkylene;
  • Z b is C 2-8 alkylene or C 2-8 alkenylene]
  • R 1a , R 2a , R 3a and R 4a are independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl;
  • R 5a is a hydrogen atom, formyl, or C 1-6 alkylcarbonyl;
  • X 2 is —NR 9 —Z 1 —Z 2 where R 9 , Z 1 , and Z 2 are as previously defined];
  • R 1b , R 2b , R 3b , and R 4b are independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl;
  • R 5b is selected from a hydrogen atom, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl;
  • X b is selected from hydroxy and —O ⁇ Q + , where Q + represents a counter cation]
  • the hyaluronic acid derivative according to (1) further including a repeating unit represented by: (3) The hyaluronic acid derivative according to the above (1) or (2), wherein X 1 is —NR 9 —Z 1 —Z 2 in formula (I).
  • X a is selected from hydroxy, —O ⁇ Q + , C 1-6 alkoxy, and —NR 7 R 8 , and R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , Q + and R a are as defined in (1) above]
  • Hyaluronic acid derivatives each containing a repeating unit represented by the formula HNR 9 -Z 1 -Z 2 [Wherein R 9 , Z 1 and Z 2 are as defined in (1) above]
  • compositions (11) and (12) are provided.
  • (11) A pharmaceutical composition comprising the hyaluronic acid derivative according to any one of (1) to (10) above and a drug.
  • (12) The pharmaceutical composition according to the above (11), wherein the drug is carried by forming a complex with the hyaluronic acid derivative.
  • a hyaluronic acid derivative-drug complex in which a drug is supported on the hyaluronic acid derivative according to any one of (1) to (10) above.
  • a hyaluronic acid derivative-drug complex is provided in which the hyaluronic acid derivative forms a fine particle by association in water to carry the drug.
  • biodegradable drug carrier containing the hyaluronic acid derivative according to any one of (1) to (10) above.
  • a method for administering a drug comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the drug together with the hyaluronic acid derivative according to any one of (1) to (10) above.
  • Hyaluronic acid derivative of the present invention it is possible to provide a sustained-release preparation encapsulating a large amount of a drug, particularly a low molecular weight compound or a protein or peptide having medicinal properties while maintaining its biological activity.
  • Hyaluronic acid derivatives are also superior in terms of safety, both as a drug formulation carrier and as a base material for sustained injections for subcutaneous administration, both in the retention and biodegradability of drugs. It has particularly excellent characteristics.
  • the degree of carboxy modification of the hyaluronic acid derivative of the present invention that is, the ratio of the introduced group —NR 9 —Z 1 —Z 2 and / or amino acid (including amino acid amide), the derivative It is also possible to control the pharmacokinetics of the preparation to be produced.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of hydrochloride of cholesteryl 6-aminohexyl carbamate (Chol-C 6 ) prepared in Example 1-1.
  • 1 is an example of a 1 H-NMR spectrum (solvent: D 2 O) of a TBA salt of hyaluronic acid (HA-TBA) starting from 99 kDa HA-Na prepared in Example 1-3.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Ala using 99 kDa HA—Na prepared in Example 1-4 as a starting material.
  • FIG. 3 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Ala-Chol / FL using 99 kDa HA—Na prepared in Example 1-4 as a starting material (introduction rate of cholesteryl group: 7%).
  • FIG. 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-ThrNH 2 / Chol / FL using 99 kDa HA—Na prepared in Example 1-5 as a starting material (introduction rate of cholesteryl group: 6%).
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Ser-OEt prepared in Example 1-6.
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Ser prepared in Example 1-6.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Ser-Chol / FL prepared in Example 1-6 (introduction rate of cholesteryl group: 6%).
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Gly-OEt prepared in Example 1-7.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Gly prepared in Example 1-7.
  • It is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Gly-Chol / FL prepared in Example 1-7 (introduction rate of cholesteryl group: 6%).
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Thr prepared in Example 1-8.
  • 1 H-NMR spectrum of HA-Thr-Chol / FL prepared in Example 1-8 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Asn prepared in Example 1-9. It is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Asn-Chol / FL prepared in Example 1-9 (introduction rate of cholesteryl group: 7%).
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Asp prepared in Example 1-10.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Asp-Chol / FL prepared in Example 1-10 (introduction rate of cholesteryl group: 6%).
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Ile prepared in Example 1-11.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Ile-Chol / FL prepared in Example 1-11 (introduction rate of cholesteryl group: 6%).
  • 2 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Leu prepared in Example 1-12. It is an example of the 1 H-NMR spectrum of HA-Leu-Chol / FL prepared in Example 1-12 (introduction rate of cholesteryl group: 6%).
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Val prepared in Example 1-13.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Val-Chol / FL prepared in Example 1-13 (introduction rate of cholesteryl group: 6%).
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Phe prepared in Example 1-14. It is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Phe-Chol / FL prepared in Example 1-14 (introduction rate of cholesteryl group: 6%).
  • Example 1 is an example of 1 H-NMR spectrum (solvent: D 2 O) of HA-SerNH 2 / Chol / FL prepared in Example 1-15 (introduction rate of cholesteryl group: 6%).
  • Example of 1 H-NMR spectrum of HA-GlyNH 2 / Chol / FL prepared in Example 1-16 (solvent: 0.02N DCl DMSO-d 6 / D 2 O mixed solution) (introduction ratio of cholesteryl group: 6%)
  • 1 is an example (cholesteryl group introduction rate: 6%) of 1 H-NMR spectrum (solvent: D 2 O) of HA-GlyNH 2 / Chol / FL prepared in Example 1-16.
  • 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-LeuNH 2 / Chol / FL prepared in Example 1-17 (introduction rate of cholesteryl group: 6%). It is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-ValNH 2 / Chol / FL prepared in Example 1-18 (introduction rate of cholesteryl group: 6%). It is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Ala / Chol / FL prepared in Example 1-19 (introduction rate of cholesteryl group: 6%). 1 is an example of 1 H-NMR spectrum of HA-Ser-OEt / Chol / FL prepared in Example 1-20.
  • a graph showing changes in plasma concentrations of 99k HA-ThrNH 2 / Chol-24% / FL (Table 9: Sample 2-9) and 99k HA-Chol-24% / FL (Table 9: Comparative Sample 2-2) (Example 2-2).
  • a graph showing changes in plasma concentrations of 99k HA-ThrNH 2 / Chol-31% / FL (Table 9: Sample 2-10) and 99k HA-Chol-25% / FL (Table 9: Comparative Sample 2-3) (Example 2-2). It is a graph which shows a plasma concentration transition of 99k HA-Ser-Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-11) and 99k HA-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative sample 2-1). (Example 2-2).
  • Example 2-2 It is a graph which shows the plasma concentration transition of 99k HA-Asp-Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-15) and 99k HA-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative sample 2-1). (Example 2-2). It is a graph which shows a plasma concentration transition of 99k HA-Ile-Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-16) and 99k HA-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative sample 2-1). (Example 2-2).
  • Example 2-2 A graph showing changes in plasma concentrations of 99k HA-ValNH 2 / Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-20) and 99k HA-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative Sample 2-1) (Example 2-2). A graph showing changes in plasma concentrations of 99k HA-SerNH 2 / Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-21) and 99k HA-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative Sample 2-1) (Example 2-2).
  • Example 2-2 It is a graph which shows the plasma concentration transition of 99k HA-Ser / Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-25) and 99k HA-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative sample 2-1). (Example 2-2). A graph showing changes in plasma concentrations of 99k HA-Tyr-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative sample 2-8) and 99k HA-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative sample 2-1) (Example 2-2).
  • Results of size-exclusion chromatography analysis of 50k HA-Ala-Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-4) and mouse liver sample administered with the sample, confirming metabolism in the liver of the administered sample (Example 2-3).
  • Results of size exclusion chromatography analysis of 50k HA-Ala-Chol-22% / FL (Table 9: Sample 2-5) and mouse liver sample to which the sample was administered, confirming metabolism in the liver of the administered sample (Example 2-3).
  • Results of size-exclusion chromatography analysis of 50k HA-Ala-Chol-26% / FL (Table 9: Sample 2-6) and mouse liver sample administered with the sample, confirming metabolism in the liver of the administered sample (Example 2-3).
  • Example 2-3 99k HA-ThrNH 2 / Chol-31% / FL (Table 9: Sample 2-10) and the results of size exclusion chromatography analysis of the mouse liver sample to which the sample was administered, and the metabolism of the administered sample in the liver was confirmed. (Example 2-3). 99k HA-Ser-Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-11) and the results of size-exclusion chromatography analysis of the mouse liver sample to which the sample was administered. Metabolism in the liver of the administered sample was confirmed. (Example 2-3).
  • Example 2-3 99k HA-SerNH 2 / Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-21) and the results of size exclusion chromatography analysis of the mouse liver sample to which the sample was administered, and the metabolism of the administered sample in the liver was confirmed. (Example 2-3). 99k HA-LeuNH 2 / Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-22) and the results of size exclusion chromatography analysis of the mouse liver sample to which the sample was administered, and the metabolism of the administered sample in the liver was confirmed. (Example 2-3).
  • FIG. 6 shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Fig. 6 shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Results of size exclusion chromatography analysis of mouse urine samples administered with 50k HA-Ala-Chol-22% / FL Table 9: Sample 2-5).
  • Fig. 6 shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Fig. 6 shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Fig. 6 shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Size exclusion chromatography analysis results of a mouse urine sample administered with 99k HA-ThrNH 2 / Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-8), and the chromatogram at each time point is shown in the same range on the left.
  • the right side shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Size exclusion chromatography analysis results of a mouse urine sample administered with 99k HA-ThrNH 2 / Chol-24% / FL Table 9: Sample 2-9), and the chromatogram at each time point is shown in the same range on the left.
  • the right side shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Size exclusion chromatography analysis results of a mouse urine sample administered with 99k HA-ThrNH 2 / Chol-31% / FL (Table 9: Sample 2-10), and the chromatogram at each time point is shown in the same range on the left. The right side shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Results of size exclusion chromatography analysis of mouse urine samples administered with 99k HA-Ser-Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-11).
  • Fig. 6 shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • FIG. 6 shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Results of size exclusion chromatography analysis of mouse urine samples administered with 99k HA-Asp-Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-15).
  • Fig. 6 shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Results of size-exclusion chromatography analysis of mouse urine samples administered with 99k HA-Ile-Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-16).
  • Fig. 6 shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Example 6 shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Results of size exclusion chromatography analysis of a mouse urine sample administered with 99k HA-ValNH 2 / Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-20).
  • the right side shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • the right side shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Size exclusion chromatography analysis results of a mouse urine sample administered with 99k HA-LeuNH 2 / Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-22), and the chromatogram at each time point is shown in the same range on the left. The right side shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Size exclusion chromatography analysis results of a mouse urine sample administered with 99k HA-GlyNH 2 / Chol-6% / FL Table 9: Sample 2-23), and the chromatogram at each time point is shown in the same range on the left.
  • the right side shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • FIG. 9 shows the results of size exclusion chromatography analysis of a mouse urine sample administered with 99k HA-Ala / Chol-6% / FL (Table 9: Sample 2-24).
  • Fig. 6 shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • Results of size exclusion chromatography analysis of mouse urine samples administered with 99k HA-Ser / Chol-6% / FL Table 9: Sample 2-25).
  • Fig. 6 shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • FIG. 9 shows the results of size exclusion chromatography analysis of a mouse urine sample administered with 99k HA-EDOBEA-Ac / FL (Comparative Example 1-2).
  • Example 2-4 A graph obtained by normalizing the gram with the strongest peak is shown (Example 2-4).
  • 99k HA-Tyr-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative sample 2-8) is a result of size exclusion chromatography analysis of a mouse urine sample, and the chromatogram at each time point is shown in the same range on the left. The right side shows a graph obtained by normalizing the chromatogram at each time point with the strongest peak (Example 2-4).
  • 3 is an example of an NMR spectrum of HA-Gln prepared in Example 3-1. It is an example of an NMR spectrum of HA-Gln-Chol / FL prepared in Example 3-1 (introduction rate of cholesteryl group: 6%).
  • Example 3 is an example of an NMR spectrum of HA-Met prepared in Example 3-2. It is an example of the NMR spectrum of HA-Met-Chol / FL prepared in Example 3-2 (introduction rate of cholesteryl group: 6%). It is an example of the NMR spectrum of HA-AlaNH 2 / Chol / FL prepared in Example 3-3 (introduction rate of cholesteryl group: 6%). It is an example of the NMR spectrum of HA-AsnNH 2 / Chol / FL prepared in Example 3-4 (introduction rate of cholesteryl group: 6%).
  • FIG. 3 is an example of an NMR spectrum of HA-Glu prepared in Comparative Example 3-1. It is an example of the NMR spectrum of HA-Glu-Chol / FL prepared in Comparative Example 3-1 (introduction rate of cholesteryl group: 6%). It is an example of the NMR spectrum of HA-Trp prepared in Comparative Example 3-2. It is an example of the NMR spectrum of HA-Trp-Chol / FL prepared in Comparative Example 3-2 (introduction rate of cholesteryl group: 6%). It is a graph which shows a plasma concentration transition of 99k HA-Gln-Chol-6% / FL (Table 15: Sample 4-1) and 99k HA-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative sample 2-1).
  • Example 4-2 It is a graph which shows a plasma concentration transition of 99k HA-Met-Chol-6% / FL (Table 15: Sample 4-2) and 99k HA-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative sample 2-1). (Example 4-2). A graph showing changes in plasma concentrations of 99k HA-AlaNH 2 / Chol-6% / FL (Table 15: Sample 4-3) and 99k HA-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative Sample 2-1) (Example 4-2).
  • a graph showing changes in plasma concentrations of 99k HA-GlnNH 2 / Chol-6% / FL (Table 15: Sample 4-6) and 99k HA-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative Sample 2-1) (Example 4-2).
  • a graph showing changes in plasma concentrations of 99k HA-MetNH 2 / Chol-6% / FL (Table 15: Sample 4-7) and 99k HA-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative Sample 2-1) (Example 4-2).
  • a graph showing changes in plasma concentrations of 99k HA-Glu-Chol-6% / FL (Table 15: Comparative sample 4-1) and 99k HA-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative sample 2-1) (Example 4-2).
  • a graph showing changes in plasma concentrations of 99k HA-Trp-Chol-6% / FL (Table 15: Comparative sample 4-2) and 99k HA-Chol-6% / FL (Table 9: Comparative sample 2-1) (Example 4-2).
  • a graph showing changes in plasma concentrations of 10k HA-Tyr-Chol-7% / FL (Table 15: Comparative sample 4-3) and 10k HA-Chol-15% / FL (Table 9: Comparative sample 2-7) (Example 4-2).
  • 99k HA-Gln-Chol-6% / FL (Table 15: Sample 4-1) and the results of size exclusion chromatography analysis of the mouse liver sample to which the sample was administered, and metabolism in the liver of the administered sample was confirmed (Example 4-3).
  • Example 4-3 99k HA-IleNH 2 / Chol-6% / FL (Table 15: Sample 4-5) and the results of size exclusion chromatography analysis of a mouse liver sample to which the sample was administered, and the metabolism of the administered sample in the liver was confirmed. (Example 4-3). 99k HA-GlnNH 2 / Chol-6% / FL (Table 15: Sample 4-6) and the results of size exclusion chromatography analysis of the mouse liver sample to which the sample was administered, and the metabolism of the administered sample in the liver was confirmed. (Example 4-3).
  • Example 6-1 is a graph showing the results of encapsulation of paclitaxel, which is a poorly soluble drug, into the hyaluronic acid derivative of the present invention (combination of the hyaluronic acid derivative of the present invention and paclitaxel), and the vertical axis is The paclitaxel concentration (solubility) in the supernatant, which is improved by the coexistence of the hyaluronic acid derivative of the present invention, is shown. The larger the value on the vertical axis, the higher the encapsulation effect.
  • Example 6-1 is a graph showing the results of encapsulation of paclitaxel, which is a poorly soluble drug, into the hyaluronic acid derivative of the present invention (combination of the hyaluronic acid derivative of the present invention and paclitaxel), and the vertical axis is The paclitaxel concentration (solubility) in the supernatant, which is improved by the coexistence of the hyaluronic acid derivative of the present invention, is shown. The larger the value on the vertical axis, the higher the encapsulation effect.
  • Example 6-1 is a graph showing the results of encapsulation of paclitaxel, which is a poorly soluble drug, into the hyaluronic acid derivative of the present invention (combination of the hyaluronic acid derivative of the present invention and paclitaxel), and the vertical axis is The paclitaxel concentration (solubility) in the supernatant, which is improved by the coexistence of the hyaluronic acid derivative of the present invention, is shown. The larger the value on the vertical axis, the higher the encapsulation effect.
  • Example 6-1 is a graph showing the results of encapsulation of paclitaxel, which is a poorly soluble drug, into the hyaluronic acid derivative of the present invention (combination of the hyaluronic acid derivative of the present invention and paclitaxel), and the vertical axis is The paclitaxel concentration (solubility) in the supernatant, which is improved by the coexistence of the hyaluronic acid derivative of the present invention, is shown. The larger the value on the vertical axis, the higher the encapsulation effect.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is a graph showing the results of encapsulation of cyclosporine, which is a poorly soluble drug (complexing of the hyaluronic acid derivative of the present invention with cyclosporine), and the vertical axis is The cyclosporin concentration (solubility) in the supernatant, which is improved by the coexistence of the hyaluronic acid derivative of the present invention, is shown. The larger the value on the vertical axis, the higher the encapsulation effect.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is a graph showing the results of encapsulation of cyclosporine, which is a poorly soluble drug (complexing of the hyaluronic acid derivative of the present invention with cyclosporine), and the vertical axis is The cyclosporin concentration (solubility) in the supernatant, which is improved by the coexistence of the hyaluronic acid derivative of the present invention, is shown. The larger the value on the vertical axis, the higher the encapsulation effect.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is a graph showing the results of encapsulation of cyclosporine, which is a poorly soluble drug (complexing of the hyaluronic acid derivative of the present invention with cyclosporine), and the vertical axis is The cyclosporin concentration (solubility) in the supernatant, which is improved by the coexistence of the hyaluronic acid derivative of the present invention, is shown. The larger the value on the vertical axis, the higher the encapsulation effect.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is a graph showing the results of encapsulation of cyclosporine, which is a poorly soluble drug (complexing of the hyaluronic acid derivative of the present invention with cyclosporine), and the vertical axis is The cyclosporin concentration (solubility) in the supernatant, which is improved by the coexistence of the hyaluronic acid derivative of the present invention, is shown. The larger the value on the vertical axis, the higher the encapsulation effect.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of paclitaxel release from HA-Ala-Chol-41% in Example 7-1, where the horizontal axis is time (Hour) and the vertical axis is not released but HA-Ala-Chol- The amount of paclitaxel as encapsulated in 41% (complexed with HA-Ala-Chol-41%) is shown respectively.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of paclitaxel release from HA-Ala-Chol-41% in Example 7-1, where the horizontal axis is time (Hour) and the vertical axis is not released but HA-Ala-Chol- The amount of paclitaxel as encapsulated in 41% (complexed with HA-Ala-Chol-41%) is shown respectively.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of cyclosporine release from HA-Ala-Chol-41% in Example 7-2, where the horizontal axis is time (Hour) and the vertical axis is not released but HA-Ala-Chol— The amount of cyclosporine remains encapsulated in 41% (complexed with HA-Ala-Chol-41%), respectively.
  • FIG. 4 is an example of an NMR spectrum of HA-Ala-C 2 -Chol prepared in Example 8 (introduction rate of cholesteryl group: 6%). It is an example of the NMR spectrum of HA-Ala-C 2 -Chol prepared in Example 8 (introduction rate of cholesteryl group: 7%).
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is a hyaluronic acid derivative containing one or more disaccharide units (also repeating units) represented by the formula (I).
  • the hyaluronic acid derivative comprises (a) the above formula (I), (b) the above formula (I) and (II), (c) the above formula (I) and (IIb), or ( d) Consists substantially of the repeating units of the above formula (I), formula (II) and formula (IIb).
  • the hyaluronic acid derivative is, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% of the disaccharide repeating units composed of D-glucuronic acid and N-acetylglucosamine contained in the derivative.
  • the above is the repeating unit of formula (I), (II) or formula (IIb).
  • the hyaluronic acid derivative comprises (a) the above formula (I), (b) the above formula (I) and formula (II), (c) the above formula (I) and formula (IIb), Or (d) composed only of repeating units represented by the above formula (I), formula (II) and formula (IIb).
  • the ratio of the specific disaccharide unit to the repeating unit of the disaccharide present in the hyaluronic acid derivative of the present invention is the total amount included in a certain amount of the hyaluronic acid derivative of the present invention which is a polysaccharide having the disaccharide unit as a repeating unit. It means the ratio of specific disaccharide units to disaccharide units.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are all hydrogen atoms.
  • R 5 is preferably a hydrogen atom or C 1-6 alkylcarbonyl, more preferably a hydrogen atom or acetyl, and even more preferably acetyl.
  • R 1a , R 2a , R 3a and R 4a , and R 1b , R 2b , R 3b and R 4b are preferably all hydrogen atoms.
  • R 5a and R 5b are preferably a hydrogen atom or C 1-6 alkylcarbonyl, more preferably a hydrogen atom or acetyl, and more preferably acetyl.
  • R a in the formula (I) include a hydrogen atom, methyl, hydroxymethyl, 1-hydroxyethyl, carbamoylmethyl, carboxymethyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, isopropyl, 2-carboxyethyl, 2 -Methylthioethyl, 2-carbamoylethyl, phenylmethyl, (4-hydroxyphenyl) methyl, indol-3-ylmethyl and the like.
  • each optically active substance and a mixture thereof are also included, but when described as H 2 N—CHR a —COOH (amino acid), the L form (natural type) It is preferable that
  • R 6 , R 7 , R 8 and R 9 are, for example, independently a hydrogen atom or methyl, preferably all hydrogen atoms.
  • Examples of the group —CHR a —CO—X 1 in formula (I) include the group —CHR a —COOH. Specific examples of the group include the following groups.
  • Preferred examples of the group —CHR a —COOH include the following groups:
  • Preferred examples of the group —CHR a —COOH include the following groups:
  • Preferred examples of the group —CHR a —COOH include the following groups:
  • Preferred examples of the group —CHR a —COOH include the following groups:
  • Preferred examples of the group —CHR a —COOH include the following groups:
  • Any one or all of the above-described groups —CHR a —COOH may be converted to the group —CHR a —CONH—Z 1 —Z 2 .
  • Examples of the group -Z 1 -Z 2 are as described below.
  • Another embodiment of the group —CHR a —CO—X 1 in formula (I) includes, for example, the group —CHR a —CONH 2 .
  • Specific examples of the group include the following groups.
  • Preferred examples of the group —CHR a —CONH 2 include the following groups:
  • Preferred examples of the group —CHR a —CONH 2 include the following groups:
  • Preferred examples of the group —CHR a —CONH 2 include the following groups:
  • Preferred examples of the group —CHR a —CONH 2 include the following groups:
  • These groups are also preferable groups from the viewpoint of having both biodegradability and blood retention properties.
  • preferred examples of the group —CHR a —CONH 2 include the following groups.
  • preferred examples of the group —CHR a —CONH 2 include the following groups.
  • preferred examples of the group —CHR a —CONH 2 include the following groups.
  • R 7 a hydrogen atom and methyl are more preferable, and a hydrogen atom is more preferable.
  • Carboxy as defined in formulas (I), (II) and (IIb) may form a salt represented by the formula —COO ⁇ Q + .
  • Q + is not particularly limited as long as it is a counter cation that forms a salt with carboxy in water.
  • Examples of the counter cation include a lithium ion, sodium ion, rubidium ion, cesium ion, magnesium ion, metal ions such as calcium ion; formula: N + R j R k R l R m (wherein, R j, R k , R 1 and R m are each independently selected from a hydrogen atom and C 1-6 alkyl), preferably sodium ion, potassium ion, tetraalkylammonium ion ( For example, tetra n-butylammonium ion).
  • R j , R k , R 1 and R m are preferably the same group selected from C 1-6 alkyl, and are preferably n-butyl.
  • Another embodiment of the group —CHR a —CO—X 1 in formula (I) includes, for example, the group —CHR a —CONH—Z 1 —Z 2 .
  • Specific examples of the group include the following groups.
  • Preferred examples of the group —CHR a —CONH—Z 1 —Z 2 include the following groups:
  • Preferred examples of the group —CHR a —CONH—Z 1 —Z 2 include the following groups:
  • Preferred examples of the group —CHR a —CONH—Z 1 —Z 2 include the following groups:
  • Preferred examples of the group —CHR a —CONH—Z 1 —Z 2 from the viewpoint of having both biodegradability and blood retention properties include the following groups.
  • Examples of the group -Z 1 -Z 2 include the group-(C 2-10 alkylene) -NH-COO-Z 3 . There may also be mentioned the group-(C 2-12 alkylene) -NH-COO-Z 3 .
  • Examples of C 2-12 alkylene — (CH 2 ) 2 —, — (CH 2 ) 6 —, — (CH 2 ) 8 —, — (CH 2 ) 10 — and — (CH 2 ) are preferred.
  • ) 12 - and the like more preferably - (CH 2) 2 - and - (CH 2) 6 - and the like.
  • group —Z 1 —Z 2 include the group — (CH 2 CH 2 O) m —CH 2 CH 2 —NH—Z 3 .
  • m is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 3.
  • preferable m include 2.
  • the group -Z 1 -Z 2 the group-(hexane-1,6-diyl) -NH-COO-Z 3 , the group-(ethanene-1,2-diyl) -NH-COO-Z 3 are preferred.
  • the group — (CH 2 CH 2 O) 2 —CH 2 CH 2 —NH—Z 3 more preferably the group — (hexane-1,6-diyl) -NH—COO-cholesteryl, the group — (ethane -1,2-diyl) -NH-COO-cholesteryl and the group-(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 -NH-coranoyl, more preferably the group-(hexane-1,6-diyl ) -NH-COO-cholesteryl.
  • Z 1 , Z 2 and group —Z 1 —Z 2 those corresponding to Y, X 1 and group —Y—X 1 of International Publication No. 2010/053140 can also be mentioned.
  • Examples of the group —CO—NR c —Z 3 and the group —O—CO—NR c —Z 3 include groups in which R c is a hydrogen atom, respectively.
  • a hyaluronic acid derivative containing a repeating unit of the formula (II) is also preferable.
  • X 1 and X 2 of formula (II) of formula (I) are identical.
  • X 1 is —NR 9 —Z 1 —Z 2 and the repeating unit represented by the formula (I), the repeating unit represented by the formula (II) and the formula (IIb) Hyaluronic acid derivatives comprising such repeating units are provided.
  • steryl group referred to in the present specification is not particularly limited as long as it is a group having a steroid skeleton.
  • Specific examples of steroids include cholesterol, dehydrocholesterol, coprostenol, coprosterol, cholestanol, campestanol, ergostanol, stigmasterol, coprostanol, stigmasterol, sitosterol, lanosterol, ergosterol, simianenol , Bile acids (cholanic acid, lithocholic acid, hyodeoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, deoxycholic acid, apocholic acid, cholic acid, dehydrocholic acid, glycocholic acid, taurocholic acid), testosterone, estradiol, pro Guestron, cortisol, cortisone, aldosterone, corticosterone, deoxycortisosterone and the like can be mentioned.
  • Examples of the steryl group include a cholesteryl group, a stigmasteryl group, a lanosteryl group, an ergosteryl group, a coranoyl group, and a coroyl group, and preferably a cholesteryl group (particularly, a cholester-5-en-3 ⁇ -yl group represented by the following formula). And a coranoyl group (particularly, a 5 ⁇ -chorane-24-oil group represented by the following formula).
  • C 1-20 alkyl referred to in the present specification means a linear or branched alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl. , n- butyl, s- butyl, i- butyl, it includes "C 1-4 alkyl” such as t- butyl, furthermore, n- pentyl, 3-methylbutyl, 2-methylbutyl, 1-methylbutyl, 1-ethyl Examples include propyl, n-hexyl, 4-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-methylpentyl, 1-methylpentyl, 3-ethylbutyl, 2-ethylbutyl and the like.
  • the C 1-20 alkyl also includes “C 1-12 alkyl” having 1 to 12 carbon atoms and “C 1-6 alkyl” having 1 to 6 carbon atoms.
  • C 1-6 alkyl referred to in this specification means a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl. , “C 1-4 alkyl” such as n-butyl, s-butyl, i-butyl, t-butyl and the like.
  • C 1-6 alkoxy referred to in the present specification means a linear or branched alkyloxy group having 1 to 6 carbon atoms, such as methoxy, ethoxy, n-propoxy, i- “C 1-4 alkoxy” such as propoxy, n-butoxy, s-butoxy, i-butoxy, t-butoxy and the like are included.
  • C 1-6 alkylcarbonyl refers to an alkylcarbonyl group in which the alkyl moiety is a C 1-6 alkyl already mentioned, eg, acetyl, propionyl, n-propylcarbonyl, i “C 1-4 alkylcarbonyl” such as -propylcarbonyl, n-butylcarbonyl, s-butylcarbonyl, i-butylcarbonyl, t-butylcarbonyl and the like are included.
  • C 1-6 alkoxy means an alkyloxy group in which the alkyl moiety is a C 1-6 alkyl as already mentioned, eg, methoxy (H 3 C—O—), ethoxy N-propoxy, i-propoxy, n-butoxy, s-butoxy, i-butoxy, t-butoxy and the like.
  • C 1-6 alkylthio as referred to herein means an alkylthio group in which the alkyl moiety is a C 1-6 alkyl already mentioned, eg, methylthio (H 3 C—S—), ethylthio, Examples include n-propylthio, i-propylthio, n-butylthio, s-butylthio, i-butylthio, t-butylthio, and preferably methylthio.
  • amino C 2-20 alkyl referred to in this specification means a linear or branched alkyl having 2 to 20 carbon atoms having amino as a substituent, for example, amino is the terminal of the alkyl. It may be located on a carbon atom.
  • Amino C 2-20 alkyl includes “amino C 2-12 alkyl” having 2 to 12 carbon atoms.
  • hydroxy C 2-20 alkyl referred to in the present specification means a linear or branched alkyl group having 2 to 20 carbon atoms having hydroxy as a substituent, for example, hydroxy is a terminal of alkyl. It may be located on the carbon atom. Hydroxy C 2-20 alkyl also includes “hydroxy C 2-12 alkyl” having 2 to 12 carbon atoms.
  • C 2-30 alkylene referred to in the present specification means a linear or branched divalent saturated hydrocarbon group having 2 to 30 carbon atoms, and includes, for example, ethylene, propylene and the like. , C 2-20 alkylene, C 2-8 alkylene, the group — (CH 2 ) n —, where n is 2-30, preferably 2-20 , more preferably 2-15 .
  • C 1-5 alkylene referred to in the present specification means a linear or branched divalent saturated hydrocarbon group having 1 to 5 carbon atoms, such as ethylene (ethane-1, 2-diyl, ethane-1,1-diyl), propylene (propane-1,1-diyl, propane-1,2-diyl, propane-1,3-diyl), butane-1,4-diyl, and pentane Including 1,5-diyl.
  • ethylene ethane-1, 2-diyl, ethane-1,1-diyl
  • propylene propane-1,1-diyl, propane-1,2-diyl, propane-1,3-diyl
  • butane-1,4-diyl propane-1,4-diyl
  • pentane Including 1,5-diyl.
  • C 2-10 alkylene referred to in the present specification means a linear or branched divalent saturated hydrocarbon group having 2 to 10 carbon atoms, such as ethylene (ethane-1, 2-diyl, ethane-1,1-diyl), propylene (propane-1,1-diyl, propane-1,2-diyl, propane-1,3-diyl), butane-1,4-diyl, pentane- 1,5-diyl, hexane-1,6-diyl, heptane-1,7-diyl, octane-1,8-diyl and the like.
  • “C 2-10 alkylene” includes “C 2-8 alkylene” having 2 to 8 carbon atoms and “C 2-6 alkylene” having 2 to 6 carbon atoms.
  • C 2-8 alkylene referred to in the present specification means a linear or branched divalent saturated hydrocarbon group having 2 to 8 carbon atoms, such as ethylene (ethane-1, 2-diyl, ethane-1,1-diyl), propylene (propane-1,1-diyl, propane-1,2-diyl, propane-1,3-diyl), butane-1,4-diyl, pentane- 1,5-diyl, hexane-1,6-diyl, heptane-1,7-diyl, octane-1,8-diyl and the like.
  • ethylene ethane-1, 2-diyl, ethane-1,1-diyl
  • propylene propane-1,1-diyl, propane-1,2-diyl, propane-1,3-diyl
  • butane-1,4-diyl pentane- 1,5-d
  • C 2-8 alkenylene referred to in the present specification means a divalent hydrocarbon group having one or more double bonds of straight or branched chain having 2 to 8 carbon atoms.
  • geometric isomerism exists, each isomer and a mixture thereof are also included.
  • aryl means an aromatic carbocyclic group, for example, an aromatic carbocyclic group having 6 to 14 carbon atoms.
  • aryl include phenyl, naphthyl (1-naphthyl, and 2-naphthyl).
  • Etc examples of aryl substituted with one or more hydroxy include 4-hydroxyphenyl.
  • heteroaryl means an aromatic ring group containing one or more heteroatoms selected from a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom in the atoms constituting the ring. And may be partially saturated.
  • the ring may be a single ring or a bicyclic heteroaryl fused with a benzene ring or a monoheteroaryl ring.
  • the number of atoms constituting the ring is, for example, 4 to 15, preferably 5 to 14, and more preferably 6 to 10.
  • heteroaryl examples include, for example, furyl, thienyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, oxadiazolyl, thiadiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, pyridyl, pyrimidyl, pyridazinyl, pyrazinyl, triazinyl, benzofuranyl, benzothienyl, Benzothiadiazolyl, benzothiazolyl, benzoxazolyl, benzooxadiazolyl, benzimidazolyl, indolyl, isoindolyl, indazolyl, quinolyl, isoquinolyl, cinnolinyl, quinazolinyl, quinoxalinyl, benzodioxolyl, indolizinyl, imida
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention can be used as a drug carrier, and the drug carrier is biodegradable.
  • biodegradable as used herein means that the drug carrier detected in the liver has undergone a decrease in molecular weight between 15 days after intravenous administration to rats and / or humans. “Low molecular weight” can be determined by measuring the size of a drug carrier present in the liver by subjecting it to size exclusion column chromatography (see Example 2-3 of the present specification). ).
  • the carrier is determined to be biodegradable.
  • Biodegradable drug carriers are excreted outside the body through routes such as urine and feces, so it may be possible to detect the occurrence of low molecular weight in urine.
  • the hyaluronic acid derivative of the invention can be easily suppressed in urine due to its hydrophobicity, so it can detect low molecular weight in the liver, which is the main metabolic organ of hyaluronic acid, although there are problems of complexity and the number of detections. Is more preferable in directly determining the biodegradability of the drug carrier.
  • a hyaluronic acid derivative as defined herein, a group -NR 9 -Z 1 -Z 2 (hereinafter referred to as a hydrophobic group) for a disaccharide repeating unit present in the derivative.
  • the hyaluronic acid derivative is provided in which the ratio of repeating units of formula (I) and / or formula (II) having a formula (II) (introduction rate of hydrophobic group) is 3 to 50%.
  • the “disaccharide repeating unit present in the derivative” includes the repeating unit of the formula (I) and the formula (II) and the repeating unit of the formula (IIb).
  • the introduction rate can be controlled by reaction conditions, for example, the ratio of reagents, and can be determined by, for example, NMR measurement.
  • the introduction rate of the hydrophobic group is 3 to 50%, preferably 5 to 40%, more preferably 5 to 35%, still more preferably 5 to 25%, more preferably 5 to 20%. %, More preferably 5 to 10%.
  • X 1 is —NR 9 —Z 1 —Z 2 in the formula (I).
  • the ratio of the disaccharide unit of the formula (I) to the disaccharide repeating unit present in the hyaluronic acid derivative of the present invention is, for example, 70 from the viewpoint of having both biodegradability and blood retention properties. % Or more, preferably 75% or more, more preferably 90% or more. The upper limit may be 100% or less. The range of the ratio is, for example, 70 to 100%, preferably 75 to 100%, and more preferably 90 to 100%.
  • the hyaluronic acid derivative may further contain a repeating unit represented by the formula (II).
  • the hyaluronic acid derivative is a repeat represented by the formula (I) wherein X 1 is —NR 9 —Z 1 —Z 2 as exemplified in Example 1-5 described below. Does not include units.
  • the sum of the proportion of the repeating unit represented by (I) and the proportion of the repeating unit represented by formula (II) in the disaccharide repeating unit present is 70 to 100%, preferably 80 to 100%. More preferably, it is 90 to 100%.
  • the proportion of the repeating unit represented by the formula (II) in the disaccharide repeating unit present is preferably 3 to 50%, more preferably 5 to 40%, still more preferably 5 to 35%, and still more preferably. It is 5 to 25%, more preferably 5 to 20%, and further preferably 5 to 10%.
  • the proportion of the repeating unit represented by (I) in the repeating unit of the disaccharide present is preferably 20 to 97%, more preferably 30 to 95%, more preferably 35 to 95%, and still more preferably 45 to 95%. It is 95%, more preferably 50 to 95%, still more preferably 60 to 95%.
  • the proportion of the repeating unit represented by the formula (II) in the disaccharide repeating unit present is 5 to 10%
  • the proportion of the repeating unit represented by (I) is preferably 60 to 95%, more preferably 70. It is ⁇ 95%, more preferably 75 to 95%.
  • the proportion of the repeating unit represented by the formula (II) in the disaccharide repeating unit present is 20 to 40%, preferably 20 to 35%
  • the proportion of the repeating unit represented by (I) is preferably 30 to 40%. 80%, more preferably 45 to 80%, still more preferably 60 to 80%.
  • the proportion of the repeating unit represented by the formula (II) in the disaccharide repeating unit present is 10 to 20%
  • the proportion of the repeating unit represented by the formula (I) is preferably 50 to 90%, more preferably 60 to 90%, more preferably 70 to 90%.
  • hyaluronic acid or a salt thereof can be used as a raw material for producing the hyaluronic acid derivative of the present invention.
  • the hyaluronic acid salt include alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and lithium salt, and a particularly preferable salt is a sodium salt frequently used as a pharmaceutical product.
  • HA or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be produced using various known methods such as a method for extracting a biological product such as a chicken crown or a pig subcutaneous, or a biological fermentation method, or a commercially available product. It is also possible to purchase (for example, from Electrochemical Industry Co., Ltd., Shiseido Co., Ltd., Seikagaku Corporation, R & D system, etc.).
  • the weight average molecular weight of hyaluronic acid (including salt) composed of only the disaccharide unit represented by the formula (IIb) used as a raw material is preferably 1 kDa to 2,000 kDa, more preferably 3 kDa to 1,500 kDa. More preferably, it is 5 kDa to 1000 kDa. More preferably, it is 10 kDa to 500 kDa, more preferably 10 kDa to 200 kDa, more preferably 45 kDa to 200 kDa, and further preferably 50 kDa to 99 kDa.
  • the weight average molecular weight is preferably 1 kDa to 100 kDa, more preferably 2 kDa to 70 kDa, further preferably 3 kDa to 50 kDa, and further preferably 5 kDa to 30 kDa.
  • the weight average molecular weight is preferably 45 kDa to 2000 kDa, more preferably 50 kDa to 2000 kDa, further preferably 100 kDa to 1000 kDa, further preferably 200 kDa to 1000 kDa. Is more preferable.
  • the weight average molecular weight is preferably 5 kDa to 200 kDa.
  • Specific examples of the weight average molecular weight include, for example, 5 kDa, 10 kDa, 50 kDa, 99 kDa, 230 kDa, and 1058 kDa.
  • KDa is an abbreviation for “kilo dalton”.
  • the weight average molecular weight of hyaluronic acid (including a salt) composed only of the disaccharide unit represented by the formula (IIb) is the formula (IIb) while maintaining the main chain structure of the hyaluronic acid derivative of the present invention.
  • R 1b , R 2b , R 3b , and R 4b are all hydrogen atoms
  • R 5b is acetyl
  • X b is —O ⁇ Na + .
  • Xb is —O ⁇ (tetra n-butylammonium ion) in some or all of the disaccharide units in the raw material actually used, and the weight average molecular weight is calculated as 45 kDa to 200 kDa in accordance with the above. If included, it will be included in a preferred embodiment of the present invention.
  • hyaluronic acid including a salt
  • its molecular weight is calculated as a number average molecular weight or a weight average molecular weight.
  • the weight average molecular weight is calculated.
  • the method for measuring the weight average molecular weight for example, the light scattering method, the osmotic pressure method, the viscosity method, etc. described in Seiichi Nakahama et al., “Essential Polymer Science” (published by Kodansha, ISBN4-06-153310-X), etc.
  • the viscosity average molecular weight shown in the present specification can also be measured by a method usually used in the technical field to which the present invention belongs, such as using an Ubbelohde viscometer. Therefore, the molecular weight of hyaluronic acid (including salt) used as a raw material and the hyaluronic acid derivative of the present invention is also calculated as a weight average molecular weight.
  • the specified numerical value can be used as the molecular weight.
  • the molecular weight of the hyaluronic acid derivative of the present invention is not particularly limited, but hyaluronic acid having a high viscosity and molecular weight is preferable when expecting a sustained release function derived from diffusion delay in local administration, and when the final dosage form is a solution formulation, Hyaluronic acid with low viscosity and molecular weight is preferred for smooth administration.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention containing a disaccharide unit represented by the formula (I) can be produced by converting carboxy in the glucuronic acid moiety into an amide.
  • a raw material hyaluronic acid (including a salt), preferably a hyaluronic acid composed only of a disaccharide unit represented by the formula (IIb) is converted into a tetraalkylammonium salt (for example, a tetrabutylammonium (TBA) salt ),
  • TSA tetrabutylammonium
  • the hyaluronate and the formula: HNR 6 —CHR a —COOR z where R z is an ester-forming group for protecting carboxy) , R 6 , and R a are as previously defined herein
  • the ester forming group is not particularly limited, and is not particularly limited as long as it is a group usually used for protecting carboxy. Examples of the ester forming group, C 1-6 alkyl, benzyl, C 1-6 alkoxy C 1-6 alkyl, and benzyloxy C 1-6 alkyl.
  • the groups in formula (I): —NR 6 —CHR a —COOR z and —NR 6 —CHR a —CONR 7 R 8 may be the same or different in each of a plurality of disaccharide units.
  • the above reaction may be performed using different types of compounds represented by the formula: HNR 6 —CHR a —COOR z and / or HNR 6 —CHR a —CONR 7 R 8 .
  • the condensing agent that can be used in the above reaction is not particularly limited.
  • DMT-MM 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine) -4-methylmorpholium
  • CDI N , N′-carbonyldiimidazole
  • DCC N, N′-dicyclohexylcarbodiimide
  • EEDQ N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline
  • PyBOP 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine) -4-methylmorpholium
  • CDI N , N′-carbonyldiimidazole
  • DCC N, N′-dicyclohexylcarbodiimide
  • DMT-MM is preferable in that the reaction proceeds with high efficiency even in a mixed solvent of water and an organic solvent.
  • DMT-MM as a condensing agent, it is possible to highly selectively form an amide bond with amino and carboxy while suppressing the formation of an ester bond in a system in which many hydroxy groups coexist.
  • this condensing agent for example, alcohol as a solvent reacts with carboxy of the hyaluronic acid moiety, or carboxy and hydroxy simultaneously present in the hyaluronic acid moiety are bonded within the molecule or between the molecules, which is undesirable. It is possible to prevent the formation of a crosslink.
  • Solvents used in the above reaction include water, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMAc), 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (DMI), sulfolane (SF), N- Mention may be made of methylpyrrolidone (NMP), dioxane (for example, 1,4-dioxane), methanol, ethanol, propanol, butanol, acetonitrile, tetrahydrofuran, dichloromethane, chloroform, hexane, diethyl ether, ethyl acetate, and mixed solvents thereof. .
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF dimethylformamide
  • DMAc dimethylacetamide
  • DI 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone
  • SF sulfolane
  • NMP methylpyrrolidone
  • dioxane
  • DMSO dimethyl methacrylate
  • water / DMSO mixed solvent it is preferable to use DMSO alone or a water / DMSO mixed solvent.
  • amino-carboxylic acid it may be used in the reaction as a methanol solution or dioxane solution.
  • Examples of the compound represented by the formula: HNR 6 —CHR a —COOR z include alanine ester, serine ester, glycine ester, threonine ester, asparagine ester, aspartic acid diester, valine ester, leucine ester, isoleucine ester, glutamic acid diester, Examples include methionine ester, glutamine ester, phenylalanine ester, tyrosine ester, and tryptophan ester.
  • ester is, for example, C 1-6 alkyl ester, aryl ester, C 1-6 alkoxy C 1-6 alkyl ester, aryl C 1-6 alkyl ester, etc., preferably methyl ester, ethyl ester Benzyl ester and the like.
  • Examples of the compound represented by the formula: HNR 6 —CHR a —CONR 7 R 8 include alanine amide, serine amide, glycinamide, threonine amide, asparagine amide, aspartic acid diamide, valine amide, leucine amide, isoleucine amide, glutamic acid diamide, Examples include methionine amide, glutamine amide, phenylalanine amide, tyrosine amide, and tryptophan amide.
  • Hydrophobic groups can be introduced by converting the carboxy of glucuronic acid or the group of formula (I) —NR 6 —CHR a —COOH to an amide (step 2).
  • the raw material hyaluronic acid or a derivative thereof is ion-exchanged with a tetraalkylammonium salt (for example, tetrabutylammonium (TBA) salt), and the hyaluronic acid salt with the formula: HNR 9 in a solvent in the presence of a suitable condensing agent.
  • TSA tetrabutylammonium
  • HNR 9 tetrabutylammonium
  • a hydrophobic group represented by -Z 1 -Z 2 (wherein R 9 , Z 1 and Z 2 are as defined herein).
  • the condensing agent that can be used in the above reaction is not particularly limited.
  • DMT-MM 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine) -4-methylmorpholium
  • CDI N , N′-carbonyldiimidazole
  • DCC N, N′-dicyclohexylcarbodiimide
  • EEDQ N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline
  • benzotriazole-1-oxy -Tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) benzotriazol-1-yl-oxy-tris (di Chiruamino) and the like phosphonium he
  • Examples of the solvent used in the hydrophobic group introduction reaction include water, DMSO, methanol, ethanol, propanol, butanol, acetonitrile, DMF, THF, dichloromethane, chloroform, hexane, diethyl ether, ethyl acetate, and mixed solvents thereof. it can.
  • the carboxy of glucuronic acid or the carboxy of the group —NR 6 —CHR a —COOH of formula (I) is ion-exchanged to a tetraalkylammonium salt (eg, tetrabutylammonium (TBA) salt) and a suitable condensing agent is present. Then, the hyaluronate and the spacer moiety are reacted in a solvent (protection and deprotection may be performed as necessary) to convert carboxy (—COOH), and then an appropriate reagent and You may make it react. Examples of combinations of groups converted from carboxy and reaction reagents are shown below.
  • reaction mode examples include dehydrohalogenation reaction, condensation reaction, dehydration reaction, nucleophilic addition reaction such as Michael addition, oxidative disulfide formation reaction, etc., and these are well-known reactions and are appropriately selected by those skilled in the art. And it can carry out by finding preferable reaction conditions.
  • the converter or the reaction product may be reacted as an N-hydroxysuccinimide (hereinafter also referred to as “NHS”) ester.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • carboxy of glucuronic acid or carboxy of the group —NR 6 —CHR a —COOH of formula (I) is reacted with 2-aminoethyl 2-pyridyl disulfide to have a mercapto modified with a leaving group at the terminal.
  • An example is a method in which a hyaluronic acid derivative having a spacer introduced therein is prepared, and thiocholesterol is subjected to nucleophilic substitution reaction to form a disulfide bond.
  • glucuronic acid carboxy or a group of the formula (I) —NR 6 —CHR a —COOH in which a part of the spacer is introduced and a part in which the spacer is introduced into the steryl group are prepared, The method of making this react can also be mentioned. Some of the specific examples have been described above.
  • a raw material hyaluronic acid (including a salt), preferably a hyaluronic acid composed only of a disaccharide unit represented by the formula (IIb) is converted into a tetraalkylammonium salt (eg, tetrabutylammonium (TBA) ),
  • TSA tetrabutylammonium
  • the hyaluronate and the formula: HNR 9 -Z 1 -Z 2 (wherein R 9 , Z 1 , and Z 2 are already defined herein)
  • a suitable condensing agent in the presence of a suitable condensing agent and the reaction product with the formula: HNR 6 —CHR a —COOR z ( Wherein R z is an ester-forming group for protecting carboxy and R 6 and R a are as previously defined herein) or formula: HNR 6 —CHR a —CONR 7 R
  • the hyaluronic acid derivative is a repeating unit represented by the formula (IIb) and the formula (Ia)
  • X a is selected from hydroxy, —O ⁇ Q + , C 1-6 alkoxy and —NR 7 R 8 , and R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , Q + , and R a are as previously defined herein]
  • Hyaluronic acid derivatives each containing a repeating unit represented by the formula HNR 9 -Z 1 -Z 2 [Wherein R 9 , Z 1 and Z 2 are as previously defined herein] It can be obtained by reacting with a compound represented by the formula:
  • the reaction is performed by condensing carboxy (including a salt) and amino and converting carboxy to amide, and the same method as in Step 2 can be used.
  • the present invention may contain a repeating unit represented by the following formula (III). Accordingly, in one embodiment of the invention, (a) Formula (I) and Formula (III), (b) Formula (I) and Formula (II) and Formula (III), (c) Formula (I) and Formula Provided are hyaluronic acid derivatives each comprising one or more disaccharide units represented by (IIb) and formula (III) or (d) formula (I) and formula (II) and formula (IIb) and formula (III) Is done.
  • R 1c , R 2c , R 3c , and R 4c are each independently selected from a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, formyl, and C 1-6 alkylcarbonyl;
  • R 5c is a hydrogen atom, formyl or C 1-6 alkylcarbonyl;
  • R e is a hydrogen atom or C 1-6 alkyl;
  • R d is a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, —CO—C (R 10 ) ⁇ CH 2 , or —CO—G 4 —X c ;
  • R 10 is a hydrogen atom or methyl;
  • G 4 is selected from phenylene, C 3-8 cycloalkylene, or -G 5- (C 1-10 alkylene) -G 6- , wherein the C 1-10 alkylene moiety is 1-3 phenylene or C 3-8 cycloalkylene may be inserted;
  • G 5 and G 6 are each independently selected from a direct bond, pheny
  • a group represented by: Y b is —CH 2 — (CHR 15 ) 1 -2 —CH 2 —NH—, —CH 2 — (CHR 16 ) p-2 —CH 2 —O—, — (CH 2 ) j —S— or -(CH 2 ) a- (Y 1- (CH 2 ) b ) c -G-; l, p, and j are each independently an integer selected from 2 to 10, and R 15 and R 16 are each independently a hydrogen atom or hydroxy; a is an integer selected from 2 to 10; b is an integer independently selected from 2 to 10; c is an integer selected from 1 to 200; Y 1 is an oxygen atom or —NR n —; G is an oxygen atom, a sulfur atom or —NH—; R n represents a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, —CO— (CH 2 ) d —R o , — (CH 2 ) e —R
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention containing the disaccharide unit represented by the formula (III), for example, the above-mentioned tetrabutylammonium salt of hyaluronic acid and a suitable condensing agent in the presence of the solvent.
  • R e , Y b , R 10 , G 4 , and X c are as previously defined herein
  • a method of reacting with a compound to be removed and deprotecting when a protecting group is present In the above reaction, the condensing agent and the solvent already described in the present specification can be used.
  • protecting groups used in the above reaction include, for example, T.M. W. Greene, P.M. G. M.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Third Edition, John Wiley & Sons, Inc. , New York, 1999.
  • hydroxy protecting groups include C 1-6 alkylcarbonyl, arylcarbonyl, heteroarylcarbonyl, C 1-6 alkoxycarbonyl, C 1-6 alkoxy C 1-6 alkyl, C 1-6 alkylaminocarbonyl, di (C 1-6 alkyl) aminocarbonyl, aryl C 1-6 alkyl, heteroaryl C 1-6 alkyl, aryl C 1-6 alkylaminocarbonyl, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkylsulfonyl, ((amino C 1-6 alkyl) carbonyloxy) C 1-6 alkyl, unsaturated heterocyclic carbonyloxy C 1-6 alkyl, aryldi (C 1-6 alkyl) silyl, tri (C 1-6 alkyl) silyl and the like.
  • Preferred hydroxy protecting groups include acetyl and the like.
  • Examples of —NH— or amino protecting groups include C 1-6 alkylcarbonyl, aryl C 1-6 alkylcarbonyl, arylcarbonyl, heteroarylcarbonyl, C 1-6 alkoxycarbonyl, C 1-6 alkylaminocarbonyl, Examples include di (C 1-6 alkyl) aminocarbonyl, aryl C 1-6 alkyl, heteroaryl C 1-6 alkyl, (arylC 1-6 alkyl) aminocarbonyl, and the like.
  • Preferred amino protecting groups include acetyl, t-butoxycarbonyl, 9-fluorenylmethoxycarbonyl and the like.
  • amino may be protected to form a saturated or unsaturated heterocyclic group such as phthalic imide, succinimide, glutaric imide, and 1-pyrrolyl.
  • Examples of mercapto protecting groups include C 1-6 alkylthio such as ethylthio and t-butylthio, substituted phenylthio such as 2-nitrophenylthio and 2-carboxyphenylthio, and heteroarylthio such as 2-pyridylthio. .
  • a preferred example is 2-pyridylthio.
  • Examples of groups represented by —NR e —Y b —R d in the above formula (III) include those represented by the formula: -NH-CH 2- (CHR 15 ) 1 -2 -CH 2 -NH 2 ; —NH—CH 2 —CH 2 — (Y 1 —CH 2 —CH 2 ) c —NH 2 ; —NH—CH 2 — (CHR 16 ) p-2 —CH 2 —OH; —NH—CH 2 —CH 2 — (Y 1 —CH 2 —CH 2 ) c —OH; —NH— (CH 2 ) j —SH; —NH—CH 2 —CH 2 — (Y 1 —CH 2 —CH 2 ) c —SH; —NH— (CH 2 ) p —O—CO—C (R 10 ) ⁇ CH 2 ; —NH— (CH 2 ) 1 —NHCO—C (R 10 ) ⁇ CH 2 ; —NH—
  • the number of CHR 15 and CHR 16 in which R 15 and R 16 are hydroxy in the molecule of the hyaluronic acid derivative is 0 to 8, respectively, preferably 0 to 3, more preferably 0 and 1.
  • the solubility of the hyaluronic acid derivative of the present invention in water can be adjusted.
  • l is preferably 2 to 6, and specific examples thereof include 2 and 6.
  • one of R 15 is hydroxy a specific example of l is 3.
  • Y 1 is an oxygen atom
  • 2 is given as a specific example of c.
  • specific examples of c include 1 to 3.
  • Specific examples of l and p include 3.
  • — (CH 2 ) a — (Y 1 — (CH 2 ) b ) c —G— include, for example, — (CH 2 ) 2 — (O—CH 2 —CH 2 ) c —O—, — (CH 2 ) 2 — (O—CH 2 —CH 2 ) c —NH—, — (CH 2 ) 3 — (O—CH 2 —CH 2 —CH 2 ) c —O—, — (CH 2 ) 3 — (O—CH 2 —CH 2 —CH 2 ) c —NH—, — (CH 2 ) 2 —NR n — (CH 2 ) 2 —O—, — (CH 2 ) 2 —NR n — (CH 2 ) 2 —NH—, — (CH 2 ) 3 —NR n — (CH 2 ) 4 —O—, — (CH 2 ) 3 —NR n — (CH 2 )
  • R d bonded to these — (CH 2 ) a — (Y 1 — (CH 2 ) b ) c —G— include, for example, a hydrogen atom, —CO—CH ⁇ CH 2 , —CO—C (CH 3 ) ⁇ CH 2 , —CO—CH 2 —Cl, —CO—CH 2 —Br, —CO—CH 2 —I, —CO—CH 2 —SH, —CO—CH 2 —CH 2 —SH Etc.
  • —NR e —Y b —R d examples include the following groups: —NH— (CH 2 ) p1 —O—CO—CH (R 17 ) —CH 2 —S—CH 2 —CH (OH) —CH (OH) —CH 2 —SH; —NH— (CH 2 ) p1 —NH—C ( ⁇ NH) — (CH 2 ) 3 —SH; —NH— (CH 2 ) p1 —NH—CO—CH (R 17 ) —CH 2 —S—CH 2 —CH (OH) —CH (OH) —CH 2 —SH; —NH— (CH 2 ) p1 —NH—CO—CH (NH 2 ) —CH 2 —SH; —NH— (CH 2 ) p1 —NH—CO—CH (NH 2 ) —CH 2 —SH; —NH— (CH 2 ) p1 —NH—CO—CH (NH 2 ) —CH 2
  • the ratio of the repeating unit represented by the formula (III) to the existing disaccharide repeating unit is, for example, 0.1 to 99.5%, preferably 1 to 30%.
  • carboxy (—COOH) of the glucuronic acid moiety of hyaluronic acid is represented by the formula: H 2 N—CH 2 — (CHR 15) is reacted with diamine represented by l-2 -CH 2 -NH 2 wherein: -CONH-CH 2 - (CHR 15) is converted to an amide represented by l-2 -CH 2 -NH 2, Further, there is a method (step 3a) in which the terminal amino is modified to convert it to an amide represented by the group: —CONH—CH 2 — (CHR 15 ) 1 ⁇ 2 —CH 2 —NHR d .
  • diamine examples include, for example, H 2 N— (CH 2 ) 2 —NH 2 , H 2 N— (CH 2 ) 3 —NH 2 , H 2 N— (CH 2 ) 4 —NH 2 , H 2 N— (CH 2 ) 5 —NH 2 , H 2 N— (CH 2 ) 6 —NH 2 , H 2 N— (CH 2 ) 7 —NH 2 , H 2 N— (CH 2 ) 8 —NH 2 H 2 N— (CH 2 ) 9 —NH 2 , H 2 N— (CH 2 ) 10 —NH 2 , H 2 N—CH 2 —CHOH—CH 2 —NH 2 , H 2 N—CH 2 —CHOH — (CH 2 ) 2 —NH 2 , H 2 N—CH 2 — (CHOH) 2 —CH 2 —NH 2 , H 2 N—CH 2 —CHOH— (CH 2 ) 3 —NH 2 , H 2 N— (CH 2) 2 -CHOH-CH-
  • step 3b carboxy (—COOH) of the glucuronic acid moiety of hyaluronic acid is represented by the formula: H 2 N—CH 2 — (CHR 16) was reacted with hydroxylamine represented by p-2 -CH 2 -OH formula: -CONH-CH 2 - (CHR 16) is converted to an amide represented by p-2 -CH 2 -OH, further There is a method (step 3b) in which the terminal amino is modified to convert it to an amide represented by the group: —CONH—CH 2 — (CHR 16 ) p-2 —CH 2 —OR d .
  • Process 3a and process 3b are collectively referred to as process 3.
  • hydroxyamine examples include, for example, H 2 N— (CH 2 ) 2 —OH, H 2 N— (CH 2 ) 3 —OH, H 2 N— (CH 2 ) 4 —OH, H 2 N — (CH 2 ) 5 —OH, H 2 N— (CH 2 ) 6 —OH, H 2 N— (CH 2 ) 7 —OH, H 2 N— (CH 2 ) 8 —OH, H 2 N— ( CH 2 ) 9 —OH, H 2 N— (CH 2 ) 10 —OH, H 2 N—CH 2 —CHOH—CH 2 —OH, H 2 N—CH 2 —CHOH— (CH 2 ) 2 —OH, H 2 N—CH 2 — (CHOH) 2 —CH 2 —OH, H 2 N—CH 2 —CHOH— (CH 2 ) 3 —OH, H 2 N— (CH 2 ) 2 —CHOH— (CH 2 ) 2- OH, H 2 N—CH 2 — (CHOH)
  • the group: —NR e —Y b —R d in formula (III) may be the same or different in each of a plurality of disaccharide units.
  • the above reaction may be performed using different types of compounds represented by the formula: HNR e —Y b —R d .
  • Preferable orders include the order of Step 1, Step 2, and Step 3, the order of Step 2, Step 1, and Step 3, and the order of Step 1, Step 3, and Step 2.
  • a hyaluronic acid derivative containing a carbon-carbon double bond reactive in the disaccharide unit represented by the formula (III) is a crosslinking agent having two or more mercaptos (for example, dithiothreitol: DTT, butanedithiol, polyethylene glycol) Dithiol) can be subjected to a crosslinking reaction.
  • a hyaluronic acid derivative containing a mercapto in the disaccharide unit represented by the formula (III) is disulfide formed with a cross-linking agent having two or more mercaptos (for example, dithiothreitol: DTT, butanedithiol, polyethylene glycol dithiol).
  • a crosslinking reaction using a crosslinking agent containing two or more reactive carbon-carbon double bonds for example, divinylsulfone.
  • a hyaluronic acid derivative modified with amino and a crosslinking agent having succinimidyl ester or other imide ester at both ends of C 2-20 alkylene for example, bis [sulfosuccinimidyl] Crosslinking by condensation reaction with suberate (BS 3 ), ethylene glycol-bis [sulfosuccinimidyl] succinate (Sulfo-EGS), dimethyl adipimidate hydrochloride (DMA), etc .
  • Hyaluronic acid derivative modified by amino And a crosslinking agent having formyl at both ends of C 2-20 alkylene eg, glutaraldehyde
  • oxidation conditions of a hyaluronic acid derivative modified with mercapto eg, in the presence of sodium tetrathionate (STT))
  • STT sodium tetrathionate
  • the conditions may be appropriately selected.
  • the crosslinking conditions include crosslinking method, polymer concentration, crosslinking agent concentration, solvent, solvent pH, salt concentration, temperature, time and the like.
  • the cross-linking of the gel formed by increasing the polymer concentration during chemical cross-linking and the introduction rate of groups capable of cross-linking, for example, in the cross-linking reaction conditions It is possible to increase the density.
  • the ratio of the cross-linking agent to the hyaluronic acid derivative is such that when a group having groups capable of forming a cross-link at both ends is used, the group rapidly undergoes a cross-linking reaction without excess or deficiency. It is preferable to add at a ratio (for example, molar ratio) that can be involved.
  • a ratio for example, molar ratio
  • the solvent in the step of gelling the hyaluronic acid derivative of the present invention is preferably one that can sufficiently dissolve the polymer and the cross-linking agent, and is not particularly limited, but water, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylacetamide (DMAc), It is preferable to use dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP) and a mixed solvent selected from these. It is also possible to use a mixture of organic solvents that are miscible with these solvents. Although it does not specifically limit, As an organic solvent to mix, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetone, acetonitrile etc. are mentioned, for example.
  • the chemical cross-linking structure of the gel of the hyaluronic acid derivative of the present invention may include a structure that decomposes in vivo.
  • a group having an ester bond and methacryloyl may be used as a group for the crosslinking reaction.
  • the crosslinking agent a compound having an ester bond, such as Sulfo-EGS or EDMA, or a compound having a peptide spacer that is degraded by an enzyme in a living body may be used.
  • the gel crosslinked by the disulfide bond formed by the oxidation of mercapto is decomposed in a living body by a disulfide exchange reaction or a reduction reaction.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention forms nanoparticles in an aqueous solution, it can form nano-sized particle gels by crosslinking under dilute conditions, and is used as a blood release carrier and targeting carrier. be able to.
  • the dilute condition is 10 mg / mL or less, preferably 5 mg / mL or less, more preferably 1 mg / mL or less.
  • a high concentration condition is 5 mg / mL or more, preferably 20 mg / mL or more, and more preferably 40 mg / mL.
  • the step of gelling the hyaluronic acid derivative of the present invention may be performed in bulk or in a discontinuous phase such as in an emulsion or spray droplets.
  • a discontinuous phase such as in an emulsion or spray droplets.
  • an aqueous phase in which a polymer or a crosslinking agent is dissolved is emulsified in a solvent immiscible with water, and a gelation reaction may be carried out.
  • the solvent immiscible with water is not particularly limited, and examples thereof include hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, medium chain fatty acid triglyceride (MCT), liquid paraffin, and soybean oil.
  • a surfactant for stabilizing the emulsification may be added. Further, for example, it may be performed in a solvent capable of desolvation such as in supercritical carbon dioxide or PEG. In this case, the concentration of the polymer accompanying desolvation (solvent diffusion) is achieved by emulsifying and dispersing the aqueous phase or organic solvent phase in which the polymer or crosslinking agent is dissolved in the solvent of the previous example. It becomes possible to obtain a gel with a higher crosslinking density.
  • the step of gelling the hyaluronic acid derivative of the present invention and then the operation of stopping the crosslinking reaction and the operation of deactivating or washing the remaining crosslinkable functional groups may be performed.
  • Crosslinkable functional groups that were not involved in the reaction groups in which only one end of the crosslinker was bonded, residual crosslinkers, etc. were used for safety, storage stability, side reactions with encapsulated drugs, etc. It is preferable to remove from the viewpoint. Although not particularly limited, for example, when unreacted crosslinking agent remains, it may be removed by washing with excess water or the like.
  • excess mercaptoethanol or the like may be added to inactivate methacryloyl, and then the excess mercaptoethanol may be removed by washing with excess water or the like.
  • excess 3-maleimidopropionic acid, iodoacetic acid, etc. is added to deactivate the mercapto, and then excess 3-maleimidopropionic acid, iodoacetic acid is added with excess water, etc. It may be removed by washing.
  • a pulverization step may be performed after the step of gelling the hyaluronic acid derivative of the present invention.
  • Examples of the pulverization method include pulverization using a pestle and mortar and pulverization using a mill, but pulverization using a mill is preferred.
  • rotating disc type crusher such as centrifugal crusher (Nippon Seiki Seisakusho) and impact mill (Dalton Co., Ltd.), atomizer (Tokyo Atomizer Manufacturing Co., Ltd.), sample mill (Tokyo Atomizer Manufacturing Co., Ltd.) ), Bantam mill (Tokyo Atomizer Manufacturing Co., Ltd.), screen mill crusher such as SK mill (Tokken), jet crusher such as ultra-small lab jet mill (AO jet mill, Seishin company), and ultra-low temperature Linlex mill (Liquid Gas Co., Ltd.) and the like that can be pulverized with SK are preferable, but SK mill and Linlex mill are preferable.
  • SK mill and Linlex mill are preferable.
  • a drying step may be performed after the step of gelling the hyaluronic acid derivative of the present invention.
  • the drying method include ventilation drying, drying in a thermostatic bath, vacuum drying, hot air circulation drying and the like.
  • the wind speed, drying time, temperature, pressure and the like are appropriately selected within a range where the gel of the present invention does not decompose or deteriorate.
  • a pharmaceutical composition can be obtained by encapsulating a drug in the gel of the hyaluronic acid derivative of the present invention.
  • a pharmaceutical composition can be obtained by encapsulating a drug in the gel of the hyaluronic acid derivative of the present invention.
  • (a) Formula (I) and Formula (III), (b) Formula (I) and Formula (II) and Formula (III), (c) Formula (I) and Formula (IIb) ) And formula (III), or (d) a hyaluronic acid derivative containing one or more disaccharide units represented by formula (I), formula (II), formula (IIb) and formula (III), respectively Can be cross-linked, gelled, and used as a carrier for encapsulating drugs (low molecular compounds, proteins, peptides, or nucleic acids).
  • a method for encapsulating a drug a method in which a drug solution is added to a pre-crosslinked hyaluronic acid derivative gel can be mentioned.
  • the drug is absorbed by diffusion into the swollen gel, and the absorbed drug is held in the physical cross-linking domain by the hydrophobic interaction of the hyaluronic acid derivative gel, thereby encapsulating the drug.
  • conditions such as solvent, salt concentration, pH, temperature, time, addition of a denaturant, and the like may be appropriately selected so that the drug is stably encapsulated in a high yield.
  • the swelling degree and density of the hyaluronic acid derivative gel change depending on the salt concentration and pH at the time of drug encapsulation, and the ionization state of the drug also changes. Therefore, appropriate conditions may be used depending on the combination.
  • the electrostatic repulsion between the carboxyls of the hyaluronic acid derivative is utilized to reduce the gel density, increase the amount of drug encapsulated, and encapsulate higher molecular weight drugs. be able to.
  • the electrostatic repulsion is weakened, the gel density is increased, and the gel network is made smaller than the drug size, so that the drug can be firmly held and the release can be delayed.
  • the salt concentration may be a physiological salt concentration.
  • a method for encapsulating a drug there is a method in which a drug is combined with the hyaluronic acid derivative of the present invention and then gelled by crosslinking.
  • conditions such as solvent, salt concentration, pH, temperature, time, addition of denaturing agent, concentration of hydrophilic polysaccharide derivative, drug concentration, HP to drug ratio, etc. during the conjugation are stable. And may be appropriately selected so as to be combined with the nanogel in a high yield.
  • the free drug that has not been complexed may be separated and removed by dialysis or size exclusion chromatography (SEC).
  • SEC size exclusion chromatography
  • cross-linking it is preferable to use cross-linking conditions in which the encapsulated drug is not denatured.
  • the drug encapsulated in the gel of the hyaluronic acid derivative of the present invention is released by simple diffusion in the gel of the drug, decomposition of the gel of the hyaluronic acid derivative, and substitution of the biological component with the drug.
  • the rate can be controlled by the cross-linking density of the gel, the amount of cross-linking domains, and the strength of the hydrophobicity.
  • gel decomposition include decomposition of a chemical cross-linking domain and decomposition of a skeleton of a hyaluronic acid derivative. These decompositions cause a decrease in crosslink density (increase in swelling rate).
  • a gel when a gel is administered into a living body such as subcutaneous or blood, plasma proteins such as albumin and lipids exist, and these are infiltrated and encapsulated in the gel. It means the case where the drug is released by substitution.
  • the gel of the hyaluronic acid derivative of the present invention can suppress substitution with a drug accompanying infiltration of a biological component by the chemical crosslinking as well as physical crosslinking by hydrophobic groups.
  • the rate of infiltration of biological components can be controlled by the crosslink density of the gel, the charge in the gel, and the like.
  • the encapsulation is performed so that the drug is easily absorbed into the gel at the time of encapsulation and infiltration of biological components is suppressed in vivo.
  • Conditions can be selected as appropriate.
  • the electrostatic repulsion between the hyaluronic acid derivative and the drug can be suppressed by performing the encapsulation step near the isoelectric point.
  • the negative charge of the gel can be weakened by performing the encapsulation step at a pKa (about 4.0) or less of the carboxylic acid derived from glucuronic acid contained in hyaluronic acid, the negative charge is charged under that condition.
  • the electrostatic repulsion with the protein is suppressed, and the encapsulation efficiency can be improved.
  • the gel swelling rate becomes higher than in the living body, so that the encapsulation becomes easy.
  • the gelation by chemical crosslinking of the hyaluronic acid derivative into which the hydrophobic group and the crosslinkable functional group of the present invention are simultaneously introduced can be performed in the presence of a hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group.
  • a hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group in which a hydrophobic group and a functional group having an unsaturated bond are introduced, and a hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group are mixed and crosslinked to form a hydrophobic group.
  • a hyaluronic acid derivative gel can be prepared in which the hydrophilic polysaccharide derivative is physically encapsulated.
  • the hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group is a hydrophilic polysaccharide that can be obtained by introducing at least one or more hydrophobic groups per molecule of polysaccharide into the hydrophilic polysaccharide and its derivatives.
  • the hydrophilic polysaccharide is not particularly limited, but is preferably pullulan, amylopectin, amylose, dextran, mannan, levan, inulin, chitin, chitosan, hyaluronic acid, dextrin, which are commercially available or according to methods described in the literature. Those having various average molecular weights can also be obtained.
  • hydrophilic polysaccharides are pullulan, hyaluronic acid and dextrin.
  • cluster dextrin (registered trademark) is preferable.
  • Cluster dextrin (registered trademark) can be purchased and used from Ezaki Glico Co., Ltd.
  • the hydrophobic group is not particularly limited, but is preferably a C 8-50 hydrocarbon group, a steryl group, a polylactic acid (PLA) group, a polylactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA) group, or a group thereof. And particularly preferably a group containing a cholesteryl group, a C 8-30 linear or branched alkyl, or a group containing the group.
  • the hydrophobic group may be introduced via a spacer.
  • the hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group includes the hyaluronic acid derivative of the present invention. That is, fine particles comprising the hyaluronic acid derivative of the present invention may be encapsulated in a suitable gel.
  • Hydrophilic polysaccharide derivatives having a hydrophobic group can be produced by various known methods.
  • water-hydrophilic polysaccharide derivatives in which N- [6- (cholesteryloxycarbonylamino) hexyl] carbamoyl is introduced as a hydrophobic group into hydroxy of pullulan as a hydrophilic polysaccharide (hereinafter referred to as “cholesterol pullulan”, “CHP”)
  • CHP hydrophilic polysaccharide
  • Hydrophilic polysaccharide derivatives having hydrophobic groups form fine particles (nanogels) having a nano-sized (1 to 1,000 nm) gel structure by spontaneously associating several molecules in aqueous solution by hydrophobic interaction. By doing so, it can be complexed with a hydrophobic drug or a protein or peptide having medicinal properties.
  • the molecular weight of the hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group used in the present invention is not particularly limited, but is preferably 1 kDa to 1,000 kDa, more preferably 10 kDa to 300 kDa.
  • the hydrophilic polysaccharide derivative may be a pharmaceutically acceptable salt.
  • hydroxy contained in the hyaluronic acid derivative of the present invention and the hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group can also be used as a group capable of crosslinking. That is, the hyaluronic acid derivative of the present invention and the hydrophilic polysaccharide derivative having a hydrophobic group are substituted with glycidyl ether at both ends of a specific cross-linking agent such as divinyl sulfone (DVS), carbodiimide, or C 2-20 alkylene.
  • Crosslinking can be performed using a crosslinking agent or the like.
  • substituents to be introduced into the carboxy of hyaluronic acid When there are a plurality of types of substituents to be introduced into the carboxy of hyaluronic acid, these substituents may be introduced simultaneously or sequentially.
  • a hyaluronic acid derivative as defined herein, wherein the hyaluronic acid derivative is characterized by forming fine particles by association in water.
  • the nanoparticle formed by the hyaluronic acid derivative of the present invention is one of the most effective means, and proteins and peptides that are active components in the hydrophobic domain formed inside , And can be used as a capsule to be delivered to a target site while retaining a low molecular weight compound.
  • the drug can be delivered to the target site by conjugating the drug.
  • Nano-scale microparticles can be administered systemically, particularly intravenously, and release the encapsulated (complexed) drug slowly in the blood, and selectively deliver the drug to target organs and cells. It can be used as a carrier for targeting to be delivered. When used as a carrier for targeting, it can be targeted to each organ and cell by adding a target element.
  • the target element include a target tissue-specific peptide, antibody, fragmented antibody, aptamer, RGD peptide for cancer cells, folic acid, anisamide, transferrin, galactose for liver, tocopherol, and the like.
  • the hyaluronic acid derivative can be further chemically crosslinked.
  • polyethylene glycol which is a linear polymer similar to hyaluronic acid, has been reported to undergo renal excretion at a molecular weight of 40 kDa or less (Europian Journal of Cancer. Vol. 31, 766-770, (1995)), molecules below a certain size are known to undergo renal excretion. Therefore, hyaluronic acid and hyaluronic acid derivatives having the same molecular weight or less are also excreted by the kidneys and may disappear from the blood instantly.
  • the HA derivative into which the hydrophobic group of the present invention has been introduced can be used as a carrier for sustained drug release and targeting in the blood by associating even if the PEG has a molecular weight or less that causes renal excretion.
  • the fine particles of the hyaluronic acid derivative are formed by self-association in an aqueous solution, they can be formed by dissolving a solid hyaluronic acid derivative in water or an aqueous salt solution.
  • fine particles can be formed by dissolving in another solvent (for example, DMSO) and then substituting it with water or an aqueous salt solution.
  • ultrasonic treatment may be performed.
  • hyaluronic acid Since hyaluronic acid has carboxy which is a dissociating group, the higher the ionic strength in the system, the lower the solubility. Therefore, by controlling the introduction rate, it is possible to prepare hyaluronic acid derivatives that dissolve under low salt concentrations or salt-free conditions and aggregate and precipitate at physiological saline concentrations. It can be the base material of the preparation.
  • a hyaluronic acid derivative having a hydrophobic group introduced so as to form stable fine particles even under physiological salt concentration can be a systemic administration type drug carrier.
  • the particle size of the formed fine particles is not particularly limited, but is preferably 200 ⁇ m or less, and more preferably 100 ⁇ m or less so that the needle can pass through without clogging during administration by injection.
  • the particle diameter is preferably 500 nm or less, and more preferably 200 nm or less in order not to block the peripheral blood vessel.
  • the thickness is preferably 100 nm or less, and more preferably 50 nm or less.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention can be used as a drug carrier in a pharmaceutical preparation, and a pharmaceutical composition comprising the hyaluronic acid derivative of the present invention and a drug can be provided. Since the hyaluronic acid derivative of the present invention can spontaneously form a complex with a drug in an aqueous solution, no special operation is required, and the hyaluronic acid derivative and the drug are mixed in an aqueous solution and incubated. -Can easily form a drug complex and carry the drug.
  • the driving force for complex formation is mainly the hydrophobic interaction between the hydrophobic group of the hyaluronic acid derivative and the drug, but when the drug is basic, the electrostatic interaction with the carboxylic acid of the hyaluronic acid derivative May contribute.
  • electrostatic interaction is weak and hydrophobic interaction is strong, so it is considered that a complex is formed mainly by hydrophobic interaction.
  • the linker (spacer) moiety in the hydrophobic group is an ester or carbonate (for example, when X 1 or X 2 includes —COO—Z 3 or —O—COO—Z 3 ).
  • the carbonate is decomposed and the hydrophobicity of the hyaluronic acid derivative is lowered, so that the biodegradability is further increased, which is preferable from the viewpoint of safety.
  • the pH is lowered around the tumor tissue.
  • the linker (spacer) moiety has a disulfide bond (for example, when X 1 or X 2 contains —S—S—Z 3 ), the linker is decomposed under reducing conditions, and the hyaluronic acid derivative becomes hydrophobic. By lowering, the aggregate of the hyaluronic acid derivative of the present invention collapses. Since the cytoplasm is known to be a reducing environment, encapsulating and administering a drug in a hyaluronic acid derivative using this linker does not release the drug in the blood, but releases the drug only in the cytoplasm be able to.
  • Conditions such as solvent, salt concentration, pH, temperature, time, and addition of a denaturant when forming a carrier-drug complex can be appropriately changed depending on the drug used.
  • the density of the hyaluronic acid derivative varies depending on the salt concentration and pH at the time of drug encapsulation, and the ionization state of the drug also varies.
  • the modifying agent used include urea, guanidine hydrochloride, sodium dodecyl sulfate and the like.
  • the electrostatic repulsion of the hyaluronic acid derivative and the protein is suppressed by forming the complex near its isoelectric point.
  • the amount of protein contained in the complex can be increased.
  • the negative charge of the hyaluronic acid derivative can be weakened by performing the complex formation step under the condition of pKa (approximately 4.0) or less of the carboxy of the glucuronic acid moiety. In the case of being charged, electrostatic repulsion can be suppressed, and the amount of protein contained in the complex can be increased.
  • the density of the fine particles of the hyaluronic acid derivative formed in the aqueous solution is reduced, so that the amount of protein contained in the complex is increased. Can do. Further, by increasing the salt concentration in this state, the density of the fine particles can be improved and the protein can be firmly encapsulated.
  • the complex formation between the hyaluronic acid derivative and the protein can be influenced by the molecular weight of the protein.
  • the lower the molecular weight of a protein the higher the rate of migration into the fine particles of the hyaluronic acid derivative of the protein.
  • the density of the fine particles depending on the introduction rate of the hydrophobic group can also affect the rate of complex formation with the protein and the amount of protein contained in the complex.
  • Biological components such as plasma proteins and lipids exist in the living body, and when a complex of hyaluronic acid derivative and drug is administered to the living body, such as subcutaneously or in blood, this biological component must replace the drug in the complex. May cause drug release.
  • Albumin is assumed as the main in vivo protein that causes this substitution.
  • the drug and the hyaluronic acid derivative of the present invention are combined. Mention may also be made of the method of conjugation. That is, in another aspect of the present invention, there is provided a hyaluronic acid derivative-drug conjugate in which one or more of the above drugs are bound to a hyaluronic acid derivative containing a disaccharide unit represented by formula (I).
  • the hyaluronic acid derivative comprises (a) Formula (I) and Formula (III), (b) Formula (I) and Formula (II) and Formula (III), (c) Formula (I ) And formula (IIb) and formula (III), or (d) hyaluronic acid comprising one or more disaccharide units represented by formula (I) and formula (II) and formula (IIb) and formula (III), respectively Derivatives can be used.
  • hyaluronic acid derivative-drug conjugate can be prepared by binding a drug to a drug.
  • R s , R t and R u are independently selected from a hydrogen atom and C 1-6 alkyl, i is an integer selected from 1 to 10 and qa is selected from 2 to 10 An integer, k is an integer selected from 1 to 100, and r and ma are independently an integer selected from 1 to 10) A spacer represented by may be inserted.
  • Glucuronic acid 4-position and hydroxy of acetylglucosamine 1-position existing at the end of the main chain of the hyaluronic acid derivative of the present invention may be converted to other groups, for example, C 1-6 alkoxy, formyloxy and C It may be 1-6 alkylcarbonyloxy.
  • a method for preparing a conjugate comprising a hyaluronic acid derivative of the present invention and a drug a method used for preparing a conjugate of a known polymer and drug can be used.
  • the following reaction can be used. Can do.
  • linker spacer containing an ester or carbonate, ⁇ thioester, disulfide, or a peptide that cleaves at a specific site used when introducing the hydrophobic group described above into the HA derivative is used as a linker for conjugation with a drug. It can also be used. These linkers are cleaved at the target site as described above to release the drug.
  • the reagent used for modification of the hyaluronic acid derivative or drug for the preparation of the conjugate is not particularly limited as long as it does not cause an adverse reaction in the preparation of the conjugate.
  • the compound is available as a reagent or may be synthesized with reference to methods known in the literature.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is synthesized, and a drug having amino or a drug into which amino is introduced is reacted using a condensing agent such as DMT-MM, and the drug is conjugated by an amide bond. it can.
  • the drug may be added together with cholesteryl 6-aminohexylcarbamate hydrochloride and the like, and a hydrophobic group may be simultaneously introduced.
  • the compound may be added after or before the drug.
  • the drug may be reacted after synthesizing and purifying the hyaluronic acid derivative of the present invention, or the hydrophobic group derivative may be introduced after synthesizing and purifying the hyaluronic acid derivative into which the drug has been introduced.
  • the hyaluronic acid derivative of the present invention is synthesized, and a drug having hydroxy or a drug into which hydroxy is introduced is reacted with a condensing agent such as DMT-MM, 1,3-dichlorocarbodiimid (DCC), and an ester bond
  • a condensing agent such as DMT-MM, 1,3-dichlorocarbodiimid (DCC)
  • DCC 1,3-dichlorocarbodiimid
  • the drug can be conjugated to the hyaluronic acid derivative.
  • the drug may be added together with cholesteryl 6-aminohexylcarbamate hydrochloride and the like, and a hydrophobic group may be simultaneously introduced.
  • the compound may be added after or before the drug.
  • the above method can be performed with reference to, for example, a report that paclitaxel is introduced into HA as an ester (Bioconju
  • the carboxy of the glucuronic acid moiety is converted to an ester.
  • Can be conjugated In order to avoid hydrolysis of the ester, it is desirable to conjugate the drug after introducing the hydrophobic group.
  • the drug may be added after introducing the hydrophobic group into the HA by cholesteryl 6-aminohexyl carbamate hydrochloride or the like, or may be added before the introduction.
  • the drug may be reacted after synthesizing and purifying the hyaluronic acid derivative of the present invention, or the hydrophobic group derivative may be introduced after synthesizing and purifying the hyaluronic acid derivative into which the drug has been introduced.
  • the hydrophobic group derivative may be introduced after synthesizing and purifying the hyaluronic acid derivative into which the drug has been introduced.
  • the above-mentioned method can be performed with reference to, for example, a report in which camptothecin is introduced into HA as an ester (International Publication No. WO2009 / 074678).
  • carboxy in the glucuronic acid moiety can be dehydrated and condensed with a diamine such as ethylenediamine to introduce amino.
  • a diamine such as ethylenediamine
  • N-succinimidyl iodoacetate (PIERCE) or N-succinimidyl [4-iodoacetyl] aminobenzoate (PIERCE) can be reacted with amino to synthesize a hyaluronic acid derivative into which iodoacetyl is introduced.
  • a drug having a mercapto can be conjugated to the hyaluronic acid derivative.
  • This method is particularly effective because it can be conjugated selectively with a mercapto even in a high molecular drug containing many reactive groups such as amino such as proteins, peptides and nucleic acids.
  • the drug may be introduced before or after the hydrophobic group derivative is introduced into the HA.
  • the length of the linker between the drug and the hyaluronic acid derivative can also be adjusted.
  • a peptide linker that can be cleaved with an enzyme or the like at a specific site in the living body can also be introduced.
  • methotrexate was introduced into HA through a linker containing a peptide (International Publication No. WO2005 / 095464)
  • doxorubicin was introduced through a linker containing HPMA (N- (2-hydroxypropyl) methacrylamide) and a peptide And the like (International Publication No. WO2002 / 090209).
  • the pharmaceutical composition comprising the hyaluronic acid derivative of the present invention and one or more drugs, and the conjugate in which the hyaluronic acid derivative of the present invention and one or more drugs are bonded are nano-particulates, micro-particulates, solutions, emulsions, suspensions. , Gels, micelles, implants, powders, or films.
  • the powder may be produced by pulverizing a solid obtained by freeze drying or spray drying, or may be produced from a dried precipitate.
  • compositions and conjugates of the present invention can be administered by oral, parenteral, intranasal, intravaginal, intraocular, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intraarticular, intracerebral or oral route. It may be administered via.
  • the pharmaceutical composition and conjugate of the present invention are preferably 200 ⁇ m or less, and more preferably 100 ⁇ m or less, in order to allow the needle to pass through without clogging, particularly for the purpose of local sustained release. .
  • the pharmaceutical composition and conjugate of the present invention preferably have a size of 5 ⁇ m or less, particularly when targeting the hyaluronic acid receptor including CD44.
  • the pharmaceutical composition and conjugate of the present invention have a size of preferably 500 nm or less, more preferably 200 nm or less, particularly for the purpose of prolonging blood retention and accumulation in tumor tissue or inflamed tissue. It is. Moreover, in order to avoid uptake into the reticuloendothelial system and improve the blood retention, it is preferably 100 nm or less.
  • the size is preferably 200 ⁇ m or less. From the viewpoint of mucoadhesiveness, it is preferable that the hyaluronic acid derivative used has a lower hydrophobic group introduction rate.
  • the drug that forms a complex with the hyaluronic acid derivative of the present invention is not particularly limited as long as it is a drug that can be carried.
  • the drug to be bound to the hyaluronic acid derivative of the present invention is not particularly limited as long as a conjugate can be prepared.
  • the drug include proteins and / or peptides, polysaccharides, nucleic acids, and low molecular weight compounds, and preferably proteins and / or peptides.
  • low molecular weight compounds include, for example, anticancer agents (eg, alkylating agents, antimetabolites, alkaloids such as paclitaxel), immunosuppressive agents such as cyclosporine, anti-inflammatory agents (steroidal and non-steroidal anti-inflammatory agents) And anti-rheumatic agents, antibacterial agents ( ⁇ -lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, new quinolone antibiotics, sulfa drugs, etc.).
  • anticancer agents eg, alkylating agents, antimetabolites, alkaloids such as paclitaxel
  • immunosuppressive agents such as cyclosporine
  • anti-inflammatory agents steroidal and non-steroidal anti-inflammatory agents
  • anti-rheumatic agents antibacterial agents ( ⁇ -lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, new quinolone antibiotics, sulfa drugs, etc
  • proteins and peptides include, for example, erythropoietin (EPO), granulosite colony stimulating factor (G-CSF), interferon- ⁇ , ⁇ , ⁇ , (INF- ⁇ , ⁇ , ⁇ ), thrombopoietin (TPO), Serially neutropic factor (CNTF), Tumor necrosis factor (TNF), Tumor necrosis factor binding protein (TNFbp), interleukin-10 (IL-10), FMS-like tyrosine kinase (Flt-3), growth hormone (GH), insulin, insulin-like growth factor-1 (IGF-1), platelet-derived growth factor (PDGF), interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra), brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Keratinocyte growth factor (KGF), stem cell factor (SCF), megacaryosite growth differentiation factor (MGDF), osteoprotegerin (OPG), leptin, parathyroid hormone (PTH), basic fibroblast growth factor (b-FGF)
  • nucleic acids examples include DNA, RNA, antisense, decoy, ribozyme, small interfering RNA, RNA aptamer and the like.
  • the drug is encapsulated in the gel of the hyaluronic acid derivative of the present invention, or the hyaluronic acid derivative-drug conjugate of the present invention is one or more pharmaceutically acceptable diluents, wetting agents, emulsifiers.
  • a pharmaceutical composition containing a dispersing agent, adjuvant, preservative, buffer, binder, stabilizer and the like can be administered in any suitable form depending on the intended route of administration.
  • the route of administration may be a parenteral route or an oral route.
  • drugs such as proteins, peptides, nucleic acids, and low molecular weight compounds that cannot be obtained with conventional sustained-release preparations can be sustainedly released for a long period and / or highly safe sustained release with appropriate biodegradability. It is possible to provide sex preparations and pharmaceutical compositions.
  • the HA unit in the following description means a repeating unit (1 unit) of N-acetylglucosamine-glucuronic acid in hyaluronic acid.
  • JNM-ECA500 manufactured by JEOL Ltd. was used for the measurement of 1 H-NMR spectrum.
  • Dialysis membrane made from regenerated cellulose when using hyaluronic acid sodium salt with a molecular weight of 50 kDa and 99 kDa as a starting material, Spectrapore 4: when molecular weight is 12 to 14 kDa and hyaluronic acid sodium salt with a molecular weight of 10 kDa is used as the starting material.
  • Spectrapore 7 molecular weight cut-off 1 kDa or 2 kDa) was used.
  • Example 1 Synthesis of hyaluronic acid derivative (Example 1-1) Preparation of cholesteryl 6-aminohexyl carbamate hydrochloride
  • Triethylamine (TEA, 1.05 mL) was added and stirred under an argon atmosphere.
  • 6- (t-butoxycarbonyl) amino-1-aminohexane (1.12 mL, 5 mmol) was added dropwise, and the mixture was stirred for 30 minutes under ice-cooling and then warmed to room temperature. Was stirred overnight.
  • the reaction mixture was washed with ultrapure water and saturated brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and the solvent was evaporated under reduced pressure.
  • the obtained residue was dissolved in ethyl acetate (40 mL), 4N hydrochloric acid / ethyl acetate solution (40 mL) was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature. The resulting precipitate was collected by centrifugation.
  • Tetrabutylammonium (TBA) chloride cation exchange resin DOWEX (registered trademark) 50WX-8-400 (manufactured by Sigma-Aldrich) was suspended in ultrapure water and the resin was decanted. Washed about 3 times with pure water. About 1.5 mol equivalent of 40 wt% tetrabutylammonium hydroxide aqueous solution (TBA-OH) (manufactured by Sigma-Aldrich) was added to the cation exchange capacity of the resin, and the mixture was stirred for 30 minutes. After the excess TBA-OH solution was removed by decantation, washing with excess ultrapure water was repeated, and finally filtration was performed using a 0.45 ⁇ m filter to obtain a cation exchange resin that had been TBA-chlorinated.
  • TBA-OH tetrabutylammonium hydroxide aqueous solution
  • Example 1-3 Preparation of HA TBA salt Hyaluronic acid sodium salt (HA-Na, manufactured by Shiseido Co., Ltd.) having molecular weights of 10 kDa, 50 kDa and 99 kDa was dissolved in ultrapure water at a concentration of 15 mg / mL.
  • Example 1-2 5 mol equivalent of the TBA salified cation exchange resin suspension was added to the number of moles of HA unit (unit molecular weight 401.3) in terms of ion exchange capacity of the resin. After stirring for 15 minutes, filtration was performed using a 0.45 ⁇ m filter, and the filtrate was freeze-dried to obtain a TBA salt of hyaluronic acid (HA-TBA) as a white solid.
  • HA-TBA TBA salt of hyaluronic acid
  • FIG. 1-2 shows a 1 H-NMR spectrum using 99 kDa HA—Na as a starting material and D 2 O as a solvent.
  • the amount ratio of TBA to HA units was calculated from the integral value of 1.7 ppm; 16H), and the unit average molecular weight of HA-TBA was calculated from this ratio.
  • the unit average molecular weight of HA-TBA starting from 99 kDa HA-Na was 752.6.
  • Example 1-4 Synthesis of fluorescently labeled HA derivative (HA-Ala-Chol / FL) modified with L-alanine (Ala) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate HA-Na synthesized in Example 1-3
  • An anhydrous DMSO solution (5 mg / mL) of HA-TBA starting from (10 kDa, 50 kDa, 99 kDa) was prepared. Thereafter, 5 mol equivalent of L-alanine ethyl ester hydrochloride (manufactured by Aldrich) is added to the HA unit, and then 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) is added.
  • DMT-MM 4-Methylmorpholinium chloride
  • the reaction solution was dialyzed in the order of 0.3 M NaCl aqueous solution and ultrapure water.
  • 2N NaOH was added to adjust the pH to 12.5 or higher, and the mixture was stirred for 1 hour to hydrolyze the ethyl ester, and carboxy was deprotected. Thereafter, neutralization was performed using 2N HCl, dialysis was performed, and lyophilization was performed to obtain HA-Ala as a white solid.
  • FIG. 1 A representative example of a 1 H-NMR spectrum of HA-Ala measured under the same conditions as described in Example 1-3 (a product using 99 kDa HA as a starting material) is shown in FIG. From the integrated value of the peak derived from the acetyl of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from methyl in alanine (—CH 3 , 1.4 ppm; 3H), The introduction rate of alanine (Ala introduction rate) in the HA unit was calculated (Table 1).
  • Example 1-2 About 5 mole equivalent of the suspension of the cation exchange resin TBA-chlorinated in Example 1-2 was added to the HA-Ala aqueous solution, stirred for 15 minutes, and then filtered using a 0.45 ⁇ m filter. The filtrate was lyophilized to give HA-Ala TBA salt (HA-Ala-TBA) as a white solid. From the 1 H-NMR spectrum of HA-Ala-TBA measured under the same conditions as described in Example 1-3, the amount ratio of TBA to HA units was calculated by the same method as described in Example 1-3, and glucosamine was calculated.
  • Example 1-1 An anhydrous DMSO solution of HA-Ala-TBA (10 mg / mL) was prepared, and then Chol-C 6 hydrochloride prepared in Example 1-1 is shown in Table 1 below with respect to the HA-Ala-TBA unit. Added to each solution in proportions. Next, DMT-MM was added to HA-Ala-TBA at the ratio shown in Table 1 below, and 5-aminomethylfluorescein (FL, manufactured by Invitrogen) hydrochloride, DMT-MM was added to HA-Ala-TBA. 0.04 mol equivalent and 0.07 mol equivalent respectively were added with respect to the unit, and it stirred at room temperature overnight.
  • FL 5-aminomethylfluorescein
  • the reaction solution was dialyzed in the order of 0.3 M ammonia acetate / DMSO solution, 0.15 M NaCl aqueous solution and ultrapure water, and the resulting dialysate was freeze-dried to obtain the target product (HA-Ala-Chol / FL). Obtained as a yellow solid.
  • the peak (5H) derived from the cholesteryl group overlaps with the peak near 1.6 to 2.0 ppm including the peak derived from acetyl of glucosamine, the integrated value of the peak near 1.6 to 2.0 ppm is obtained.
  • a value calculated by subtracting 5/3 of the integrated value of the peak (0.7 ppm) derived from methyl cholesteryl group ie, integrated value (1.6 to 2.0 ppm) ⁇ integrated value (0.7 ppm) ⁇ 5) / 3) was used as an integral value of HA-derived acetyl to calculate the introduction rate.
  • examples of the group capable of reacting with amino of Chol-C 6 hydrochloride include both carboxy in the glucuronic acid moiety of hyaluronic acid and carboxy in Ala.
  • a hydrophobic group can be introduced at two kinds of reaction points as described above, the abbreviation of the target substance is represented by a hyphen such as “-Chol”.
  • Example 1-5 Synthesis of L-threonine amide (ThrNH 2 ) and fluorescently labeled HA derivative modified with cholesteryl 6-aminohexyl carbamate (HA-ThrNH 2 / Chol / FL) Prepared in Example 1-3
  • DMT-MM was added to the HA unit in the ratio shown in Table 2 below, and 5-aminomethylfluorescein (FL, manufactured by Invitrogen) hydrochloride and DMT-MM were added to the HA unit in an amount of 0.04. Molar equivalents and 0.07 molar equivalents were added and stirred at room temperature for 7 hours. Thereafter, 3 mol equivalent of L-threonine amide hydrochloride (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) is added to the HA unit, and then 5 mol equivalent of DMT-MM is added to the HA unit at room temperature. Stir overnight.
  • L-threonine amide hydrochloride manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.
  • the reaction solution was dialyzed in the order of 0.3 M ammonia acetate / DMSO solution, 0.15 M NaCl aqueous solution and ultrapure water, and the resulting dialysate was freeze-dried to obtain the desired product (HA-ThrNH 2 / Chol / FL). Was obtained as a yellow solid.
  • the peak (5H) derived from the cholesteryl group overlaps with the peak near 1.6 to 2.0 ppm including the peak derived from acetyl of glucosamine, the integrated value of the peak near 1.6 to 2.0 ppm is obtained.
  • a value calculated by subtracting 5/3 of the integrated value of the peak (0.7 ppm) derived from methyl cholesteryl group ie, integrated value (1.6 to 2.0 ppm) ⁇ integrated value (0.7 ppm) ⁇ 5) / 3) was used as an integral value of HA-derived acetyl to calculate the introduction rate.
  • the introduction rate of threoninamide in the HA unit was calculated from the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine and the integrated value of the methyl-derived peak of threonine amide (—CH 3 , 1.2 ppm; 3H) (Table 2). ).
  • Example 1-6 Synthesis of fluorescently labeled HA derivative modified with L-serine (Ser) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate (HA-Ser-Chol / FL) L-alanine ethyl ester instead of L- HA-Ser was obtained as a white solid in the same manner as in Example 1-4 except that serine ethyl ester hydrochloride (manufactured by Aldrich) was used. A part of the dialysis solution before deprotection of carboxy was taken and freeze-dried to obtain a sample for introduction rate calculation (HA-Ser-OEt).
  • Example 1-6 shows the 1 H-NMR spectrum of the sample for calculating the introduction rate measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak (—COCH 3 , 1.9 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the methyl-derived peak (—CH 3 , 1.2 ppm; 3H) in the ethyl ester of serine, Example In the same manner as in 1-4, the introduction rate of serine in the HA unit was calculated (Table 3). A 1 H-NMR spectrum obtained by measuring the deprotected sample under the same conditions as described in Example 1-3 is shown in FIG. 1-7.
  • HA-Ser TBA salt (HA-Ser-TBA) was obtained as a white solid under the same conditions as described in Example 1-4.
  • it was reacted with Chol-C 6 hydrochloride and FL in the same manner as in Example 1-4 to obtain the desired product (HA-Ser-Chol / FL) as a yellow solid.
  • FIG. 1-8 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-4.
  • the introduction rate of cholesteryl group was calculated by the method described in Example 1-4 (Table 3).
  • Example 1-7 Synthesis of fluorescently labeled HA derivative modified with L-glycine (Gly) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate (HA-Gly-Chol / FL) Glycine ethyl instead of L-alanine ethyl ester hydrochloride HA-Gly was obtained as a white solid in the same manner as in Example 1-4, except that ester hydrochloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. A part of the dialysis solution before deprotection of carboxy was taken and freeze-dried to obtain a sample for introduction rate calculation (HA-Gly-OEt).
  • FIG. 1-9 shows the 1 H-NMR spectrum of the sample for calculating the introduction rate measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak (-COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the methyl-derived peak (-CH 3 , 1.3 ppm; 3H) in the ethyl ester of glycine, In the same manner as in 1-4, the introduction rate of glycine in the HA unit was calculated (Table 3).
  • FIG. 1-10 shows a 1 H-NMR spectrum obtained by measuring the deprotected sample under the same conditions as described in Example 1-3.
  • HA-Gly TBA salt (HA-Gly-TBA) was obtained as a white solid under the same conditions as described in Example 1-4.
  • Chol-C 6 hydrochloride and FL in the same manner as in Example 1-4 to obtain the desired product (HA-Gly-Chol / FL) as a yellow solid.
  • FIG. 1-11 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-4.
  • the introduction rate of cholesteryl group was calculated by the method described in Example 1-4 (Table 3).
  • Example 1-8 Synthesis of fluorescently labeled HA derivative (HA-Thr-Chol / FL) modified with L-threonine (Thr) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate L-alanine in place of L-alanine ethyl ester hydrochloride HA-Thr was obtained as a white solid in the same manner as in Example 1-4, except that threonine methyl ester hydrochloride (manufactured by Bachem) was used.
  • FIG. 1-12 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-3.
  • Example 1-4 From the integrated value of the acetyl-derived peak (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the methyl-derived peak (—CH 3 , 1.2 ppm; 3H) in threonine, Example 1-4 The threonine introduction rate in the HA unit was calculated in the same manner as described above (Table 3). Further, HA-Thr TBA salt (HA-Thr-TBA) was obtained as a white solid under the same conditions as described in Example 1-4. Next, it was reacted with Chol-C 6 hydrochloride and FL in the same manner as in Example 1-4 to obtain the desired product (HA-Thr-Chol / FL) as a yellow solid. A 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-4 is shown in FIG. 1-13. The introduction rate of cholesteryl group was calculated by the method described in Example 1-4 (Table 3).
  • Example 1-9 Synthesis of fluorescently labeled HA derivative (HA-Asn-Chol / FL) modified with L-asparagine (Asn) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate L-alanine ethyl ester hydrochloride instead of L- HA-Asn was obtained as a white solid in the same manner as in Example 1-4, except that asparagine methyl ester hydrochloride (manufactured by Bachem) was used.
  • FIG. 1-14 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-3.
  • FIG. 1-15 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-4.
  • the introduction rate of cholesteryl group was calculated by the method described in Example 1-4 (Table 3).
  • Example 1-10 Synthesis of fluorescently labeled HA derivative modified with L-aspartic acid (Asp) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate (HA-Asp-Chol / FL) L instead of L-alanine ethyl ester hydrochloride -HA-Asp was obtained as a white solid in the same manner as in Example 1-4, except that diethyl aspartate hydrochloride (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 1-16 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-3.
  • Example 1-4 From the integrated value of the acetyl-derived peak (-COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the methylene-derived peak (-CH 2 COOH, 2.7, 2.8 ppm; 2H) in aspartic acid
  • the introduction rate of aspartic acid in the HA unit was calculated (Table 3).
  • HA-Asp TBA salt (HA-Asp-TBA) was obtained as a white solid under the same conditions as described in Example 1-4.
  • Chol-C 6 hydrochloride and FL in the same manner as in Example 1-4 to obtain the desired product (HA-Asp-Chol / FL) as a yellow solid.
  • FIG. 1-17 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-4.
  • the introduction rate of cholesteryl group was calculated by the method described in Example 1-4 (Table 3).
  • Example 1-11 Synthesis of fluorescently labeled HA derivative modified with L-isoleucine (Ile) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate (HA-Ile-Chol / FL) L-alanine ethyl ester instead of L- HA-Ile was obtained as a white solid in the same manner as in Example 1-4, except that isoleucine methyl ester hydrochloride (Watanabe Chemical Co., Ltd.) was used.
  • a 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-3 is shown in FIG. 1-18.
  • acetyl-derived peak of glucosamine is overlapped with the hydrogen peak at the 3-position of isoleucine (—CH (CH 3 ) CH 2 CH 3 , 1.9 ppm; 1H), so 1.8 to 2.2 ppm
  • a value obtained by subtracting a value obtained by multiplying the integrated value of the peak of 0.9 ppm by 1/6 from the integrated value of the peak was used as a peak derived from acetyl of glucosamine, and used for calculation of the introduction rate.
  • HA-Ile TBA salt (HA-Ile-TBA) was obtained as a white solid under the same conditions as described in Example 1-4.
  • FIG. 1-19 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-4.
  • the introduction rate of cholesteryl group was calculated by the method described in Example 1-4 (Table 3).
  • Example 1-12 Synthesis of fluorescently labeled HA derivative (HA-Leu-Chol / FL) modified with L-leucine (Leu) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate L-alanine instead of L-alanine ethyl ester hydrochloride HA-Leu was obtained as a white solid in the same manner as in Example 1-4 except that leucine ethyl ester hydrochloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 1-20 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-3.
  • Example 1-13 Synthesis of fluorescently labeled HA derivative modified with L-valine (Val) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate (HA-Val-Chol / FL) L-alanine ethyl ester instead of L- HA-Val was obtained as a white solid in the same manner as in Example 1-4 except that valine ethyl ester hydrochloride (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) was used.
  • a 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-3 is shown in FIG. 1-22.
  • acetyl peak of glucosamine is overlapped with the hydrogen peak at the 3rd position of valine (—CH (CH 3 ) 2 , 2.1 ppm; 1H), so the peak of 1.8 to 2.2 ppm
  • a value obtained by subtracting a value obtained by multiplying the integrated value of the 0.9 ppm peak by 1/6 from the integrated value was used as a peak derived from acetyl of glucosamine, and used for calculation of the introduction rate.
  • HA-Val TBA salt (HA-Val-TBA) was obtained as a white solid under the same conditions as described in Example 1-4.
  • FIG. 1-23 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-4.
  • the introduction rate of cholesteryl group was calculated by the method described in Example 1-4 (Table 3).
  • Example 1-14 Synthesis of fluorescently labeled HA derivative (HA-Phe-Chol / FL) modified with L-phenylalanine (Phe) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate L-alanine in place of L-alanine ethyl ester hydrochloride HA-Phe was obtained as a white solid in the same manner as in Example 1-4, except that phenylalanine ethyl ester hydrochloride (manufactured by Aldrich) was used.
  • FIG. 1-24 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-3.
  • FIG. 1-25 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-4.
  • the introduction rate of cholesteryl group was calculated by the method described in Example 1-4 (Table 3).
  • Example 1-15 Synthesis of fluorescently labeled HA derivative (HA-SerNH 2 / Chol / FL) modified with L-serine amide (SerNH 2 ) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate L instead of L-threonine amide hydrochloride -HA-SerNH 2 -Chol / FL was obtained as a yellow solid in the same manner as in Example 1-5 except that serine amide hydrochloride (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 1-26 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-5.
  • FIG. 1-27 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the methylene-derived peak of serine amide (—CH 2 —, 3.9 ppm; 2H), Example 1-5 In the same manner as above, the introduction rate of serine amide in the HA unit was calculated (Table 4).
  • the peak derived from methylene of serine amide is overlapped with the peak of 2-5 position of glucuronic acid (4H) and the peak of 2-6 position of glucosamine (6H), so the peak of 3.2-4.2 ppm A value obtained by subtracting a value obtained by multiplying the integrated value of the peak of 2.0 ppm by 10/3 from the integrated value of was used as a peak derived from methylene of serinamide, and used for calculation of the introduction rate.
  • Example 1-16 Synthesis of L-glycinamide (GlyNH 2 ) and Fluorescent Labeled HA Derivative Modified with Cholesteryl 6-aminohexyl Carbamate (HA-GlyNH 2 / Chol / FL) Instead of L-threonine amide hydrochloride HA-GlyNH 2 / Chol / FL was obtained as a yellow solid by the same method as in Example 1-5, except that glycinamide hydrochloride (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 1-28 The 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-5 is shown in FIG. 1-28.
  • the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit was calculated in the same manner as described in Example 1-5 (Table 4).
  • FIG. 1-29 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the methylene-derived peak of glycinamide (—CH 2 —; 2H), the same procedure as in Example 1-5 was performed. Thus, the introduction rate of glycinamide in the HA unit was calculated (Table 4).
  • the peak derived from methylene of glycinamide is overlapped with the peak (4H) at positions 2 to 5 of glucuronic acid and the peak (6H) at positions 2 to 6 of glucosamine, and thus the same as in Example 1-15.
  • the integral value of the peak derived from methylene of serinamide was calculated by the method.
  • Example 1-17 Synthesis of L-Leucinamide (LeuNH 2 ) and Fluorescent Labeled HA Derivative Modified with Cholesteryl 6-aminohexyl Carbamate (HA-LeuNH 2 / Chol / FL) Instead of L-threonine amide hydrochloride HA-LeuNH 2 / Chol / FL was obtained as a yellow solid in the same manner as in Example 1-5, except that L-leucine amide hydrochloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 1-30 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-5.
  • the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit was calculated in the same manner as described in Example 1-5 (Table 4).
  • Example 1-18 Synthesis of L-valine amide (ValNH 2 ) and fluorescently labeled HA derivative (HA-ValNH 2 / Chol / FL) modified with cholesteryl 6-aminohexyl carbamate L instead of L-threonine amide hydrochloride -HA-ValNH 2 / Chol / FL was obtained as a yellow solid in the same manner as in Example 1-5 except that valine amide hydrochloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 1-31 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-5.
  • the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit was calculated in the same manner as described in Example 1-5 (Table 4). From the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 1.9 ppm; 3H) and the integrated value of the two methyl-derived peaks of valineamide (—CH (CH 3 ) 2 , 1.0 ppm; 6H), The introduction rate of valine amide in the HA unit was calculated in the same manner as in Example 1-5 (Table 4).
  • Example 1-19 Synthesis of fluorescently labeled HA derivative (HA-Ala / Chol / FL) modified with L-alanine (Ala) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate L-alanine instead of L-threonine amide hydrochloride
  • HA-Ala / Chol / FL was obtained as a yellow solid.
  • FIG. 1-32 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-5.
  • the introduction rate of cholesteryl group to the HA unit was calculated by the same method as described in Example 1-5 (Table 5). Further, from the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 1.9 ppm; 3H) and the integrated value of the methyl-derived peak (—CH 3 , 1.3 ppm; 3H) in alanine, Example 1 As in -4, the introduction rate of alanine in the HA unit was calculated (Table 5).
  • the integrated value of the peak from 0.8 to 1.6 ppm is 0.
  • a value obtained by subtracting a value obtained by multiplying the integrated value of the peak at 7 ppm by 41/3 was used as a peak derived from methyl alanine for calculation of the introduction rate.
  • Example 1-20 Synthesis of fluorescently labeled HA derivative (HA-Ser / Chol / FL) modified with L-serine (Ser) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate L-serine instead of L-threonine amide hydrochloride Using ethyl ester hydrochloride (manufactured by Aldrich), the same procedure as in Example 1-5 was carried out except that the dialysate was once taken out during ultrapure water dialysis and carboxy was deprotected with 2N NaOH. HA-Ser / Chol / FL was obtained as a yellow solid.
  • FIG. 1-33 shows the 1 H-NMR spectrum of the introduction rate calculation sample measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak (-COCH 3 , 2.3 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the methyl-derived peak (-CH 3 , 1.6 ppm; 3H) in the ethyl ester of serine, Example In the same manner as 1-6, the introduction rate of serine in the HA unit was calculated (Table 5). A 1 H-NMR spectrum obtained by measuring the deprotected sample under the same conditions as described in Example 1-5 is shown in FIG. The introduction rate of cholesteryl group was calculated by the method described in Example 1-5 (Table 5).
  • Example 1-21 Synthesis of non-fluorescently labeled hyaluronic acid derivative Example 1-4 (Ala), Example 1-5 (ThrNH 2 ), Example except that 5-aminomethylfluorescein was not added 1-15 (SerNH 2 ), HA-Ala-Chol, HA-ThrNH 2 / Chol, HA-SerNH 2 / Chol, HA-ValNH 2 / Chol were converted into white by the method described in Example 1-18 (ValNH 2 ). Obtained as a solid.
  • the introduction rate of cholesteryl group and the introduction rate of amino acids and amino acid amides were calculated by the same method as described in the corresponding examples (Table 6).
  • DMT-MM was added to the HA unit at the ratio shown in Table 7 below, and 5-aminomethylfluorescein (FL, manufactured by Invitrogen) hydrochloride and DMT-MM were added to the HA unit in an amount of 0.04. Molar equivalents and 0.07 molar equivalents were added and stirred overnight at room temperature.
  • the reaction solution was dialyzed in the order of 0.3 M ammonia acetate / DMSO solution, 0.15 M NaCl aqueous solution and ultrapure water, and the resulting dialysate was freeze-dried to obtain the target product (HA-Chol / FL) as a yellow solid.
  • FL manufactured by Invitrogen
  • HA unit / BOP manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • EDOBEA 2,2 ′-(ethylenedioxy) bis (ethylamine)
  • Sigma-Aldrich 1 / 2.5 / 50
  • mol / EDOBEA and BOP were added in this order at an equimolar ratio of (mol / mol), and the mixture was stirred overnight at room temperature.
  • the reaction solution was dialyzed in the order of 0.3 M NaCl aqueous solution and ultrapure water and then freeze-dried to obtain HA-EDOBEA with a high introduction rate.
  • FIG. 1-36 shows the 1 H-NMR spectrum of HA-EDOBEA with a high introduction rate measured under the same conditions as described in Example 1-3.
  • NaOD was added to 0.0046 N so that the solution was alkaline.
  • the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from methylene at the end of EDOBEA (—CH 2 NH 2 , 2.8 ppm; 2H)
  • Example 1 The introduction rate of EDOBEA in the HA unit was calculated in the same manner as in -4 and found to be 82%.
  • HA-EDOBEA was dissolved in ultrapure water so as to be 10 mg / mL, and then diluted 2-fold with 100 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) to obtain 5 mg / mL.
  • a solution was prepared.
  • 0.04 molar equivalent of NHS-fluorescein with respect to the HA unit was added as a DMSO solution and stirred at room temperature for 1 hour, and then 40 molar equivalents of acetic anhydride (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • the resulting terminal amino acid of EDOBEA was acetylated.
  • FIG. 1-37 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-3.
  • Example 2 Confirmation of blood retention and biodegradability in vivo (Example 2-1) Collection of biological samples from rats administered with an HA derivative Examples 1-4 to 1-20 and Comparative Example 1 The compounds obtained in -1 and 1-3 were administered as a single dose intravenously in rats at a dose of 10 mg / kg, and heparin was administered 5 minutes, 2, 7, 24, 48, 72, 168, 240 and 336 hours after administration. Blood was collected from the jugular vein using a sodium-treated syringe, and plasma was obtained by centrifugation. Some of the samples of the comparative examples were collected even 96 hours after administration. This plasma sample was stored frozen at ⁇ 20 ° C. or lower until measurement.
  • Example 2-2 Analysis of Rat Plasma Administered with HA Derivatives After thawing a plasma sample, it was diluted 2-fold with an HP- ⁇ -CD (100 mM) / Tris buffer (500 mM, pH 9.0) solution. After incubation at 37 ° C. for 1 hour, the fluorescence-labeled HA derivative concentration was measured with a 96-well plate reader (ARVO) (quantitative limit: 0.4 ⁇ g / mL). Changes in plasma concentrations of fluorescently labeled HA derivatives are shown in FIGS. 2-1-1 to 2-1-26. In addition, pharmacokinetic parameters (plasma concentration-time curve extrapolated value (AUC ⁇ )) were measured using WinNonlin Ver.
  • HP- ⁇ -CD 100 mM
  • Tris buffer 500 mM, pH 9.0
  • Table 9 shows the ratio of AUC ⁇ to a comparative sample in which cholesterol is introduced to the same degree, which is calculated by the following formula.
  • HA derivatives in which an amino acid or amino acid amide is introduced into carboxy and a cholesteryl group is further introduced are HA derivatives in which only a cholesteryl group is introduced into carboxy (Comparative Samples 2-1 to 2-7). It was revealed that the plasma concentration was maintained predominantly compared to
  • Example 2-3 Analysis of liver of rat administered with HA derivative Tris buffer (10 mM, pH 9.0) was added to about 1 g of a liver sample, and homogenized using beads. A 4 mg / mL pronase solution was added and incubated overnight at 37 ° C. After centrifugation, dilute twice with a solution of HP- ⁇ -CD (100 mM) / Tris buffer (500 mM, pH 9.0), further incubate at 37 ° C. for 1 hour, filter, and filter under the following conditions. Size exclusion chromatography analysis was performed. In addition, the liver of the sample non-administration rat was also subjected to the same treatment, and the sample mixed with the pre-administration sample was similarly analyzed as a standard.
  • Tris buffer 10 mM, pH 9.0
  • Example 2-4 Analysis of rat urine administered with HA derivative A urine sample was filtered with a 0.22 ⁇ m filter and doubled with a HP- ⁇ -CD (100 mM) / Tris buffer (500 mM, pH 9.0) solution. Diluted. After incubation at 37 ° C. for 1 hour, the solution was filtered and subjected to size exclusion chromatography analysis under the conditions described in Example 2-3. In addition, the urine sample of the sample non-administered rat was subjected to the same treatment, and the sample mixed with the pre-administration sample was similarly analyzed as a standard.
  • HP- ⁇ -CD 100 mM
  • Tris buffer 500 mM, pH 9.0
  • Example 3 Synthesis of hyaluronic acid derivative (Example 3-1) Synthesis of fluorescently labeled HA derivative (HA-Gln-Chol / FL) modified with L-glutamine (Gln) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate L- Except that L-glutamine methyl ester hydrochloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used instead of alanine ethyl ester hydrochloride, the same procedure as in Example 1-4 was performed to obtain HA-Gln as a white solid. It was. A 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-3 is shown in FIG. 3-1.
  • acetyl peak of glucosamine is overlapped with another methylene peak of glutamine (—CH 2 CH 2 CONH 2 , 2.1 ppm; 2H)
  • the integration of the peak of 1.8 to 2.2 ppm The value obtained by subtracting the integrated value of the peak at 2.3 and 2.4 ppm from the value was used as a peak derived from acetyl of glucosamine and used for calculation of the modification rate.
  • HA-Gln TBA salt (HA-Gln-TBA) was obtained as a white solid under the same conditions as described in Example 1-4.
  • FIG. 3-2 shows a 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-4.
  • the introduction rate of cholesteryl group was calculated by the method described in Example 1-4 (Table 11).
  • Example 3-2 Synthesis of fluorescently labeled HA derivative (HA-Met-Chol / FL) modified with L-methionine (Met) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate L-alanine instead of L-alanine ethyl ester hydrochloride HA-Met was obtained as a white solid in the same manner as in Example 1-4 except that methionine ethyl ester hydrochloride (Watanabe Chemical Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 3-3 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-3.
  • Example 1 From the integrated value of the peak derived from acetyl of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from methylene of methionine (—CH 2 SCH 3 , 2.6 ppm; 2H), Example 1 The introduction rate of methionine in the HA unit was calculated in the same manner as in Table 4 (Table 11). The peak derived from acetyl of glucosamine overlaps with another methylene and methyl derived peak of methionine (—CH 2 CH 2 SCH 3 , 2.1 ppm; 5H).
  • a value obtained by subtracting a value obtained by multiplying the integrated value of the 2.6 ppm peak by 5/2 from the integrated value of the peak was used as a peak derived from acetyl of glucosamine, and used for calculation of the introduction rate.
  • HA-Met TBA salt (HA-Met-TBA) was obtained as a white solid under the same conditions as described in Example 1-4.
  • Chol-C 6 hydrochloride and FL in the same manner as in Example 1-4 to obtain the desired product (HA-Met-Chol / FL) as a yellow solid.
  • a 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-4 is shown in FIG. 3-4.
  • the introduction rate of cholesteryl group was calculated by the method described in Example 1-4 (Table 11).
  • Example 3-3 Synthesis of L-alaninamide (AlaNH 2 ) and fluorescently labeled HA derivative modified with cholesteryl 6-aminohexyl carbamate (HA-AlaNH 2 / Chol / FL) Instead of L-threonine amide hydrochloride HA-AlaNH 2 -Chol / FL was obtained as a yellow solid in the same manner as in Example 1-5 except that L-alaninamide hydrochloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 3-5 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-5.
  • the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit was calculated by the same method as described in Example 1-5 (Table 12). From the integrated value of the peak derived from acetyl of glucosamine (—COCH 3 , 1.8 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from methyl alanamide (—CH 2 —, 1.3 ppm; 3H), Example 1 In the same manner as in 5, the introduction rate of alaninamide in the HA unit was calculated (Table 12).
  • Example 3-4 Synthesis of L-Asparaginamide (AsnNH 2 ) and Fluorescent Labeled HA Derivative Modified with Cholesteryl 6-aminohexyl Carbamate (HA-AsnNH 2 / Chol / FL) Instead of L-threonine amide hydrochloride HA-AsnNH 2 -Chol / FL was obtained as a yellow solid in the same manner as in Example 1-5, except that L-asparagine amide hydrochloride (manufactured by Kokusan Chemical Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 3-6 shows the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-5.
  • FIG. 3-7 shows the 1 H-NMR spectrum of the product, measured under the same conditions as described in Example 1-3. From the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (-COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the methylene-derived peak of asparagine amide (-CH 2 CONH 2 , 2.7, 2.8 ppm; 2H) In the same manner as in Example 1-4, the introduction rate of asparagine amide in the HA unit was calculated (Table 12).
  • Example 3-5 Synthesis of L-isoleucinamide (IleNH 2 ) and fluorescently labeled HA derivative (HA-IleNH 2 / Chol / FL) modified with cholesteryl 6-aminohexyl carbamate instead of L-threonine amide hydrochloride HA-IleNH 2 -Chol / FL was obtained as a yellow solid in the same manner as in Example 1-5 except that L-isoleucinamide hydrochloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 3-8 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-5.
  • the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit was calculated by the same method as described in Example 1-5 (Table 12).
  • the introduction rate of isoleucinamide in the HA unit was calculated in the same manner as in Example 1-4 (Table 3).
  • the acetyl-derived peak of glucosamine is overlapped with the hydrogen peak at the 3-position of isoleucine (—CH (CH 3 ) CH 2 CH 3 , 1.9 ppm; 1H), so 1.8 to 2.2 ppm
  • a value obtained by subtracting a value obtained by multiplying the integrated value of the peak of 0.8 to 1.6 ppm by 1/8 from the integrated value of the peak was used as the peak derived from the acetyl of glucosamine and used for calculation of the introduction rate.
  • Example 3-6 Synthesis of L-glutamine amide (GlnNH 2 ) and fluorescently labeled HA derivative (HA-GlnNH 2 / Chol / FL) modified with cholesteryl 6-aminohexyl carbamate instead of L-threonine amide hydrochloride HA-GlnNH 2 -Chol / FL was obtained as a yellow solid in the same manner as in Example 1-5 except that L-glutamine amide hydrochloride (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 3-9 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-5.
  • the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit was calculated by the same method as described in Example 1-5 (Table 12).
  • the introduction rate of glutamine amide in the HA unit was calculated (Table 12).
  • the peak derived from methyl of glutamine amide overlaps with the peak (2H) derived from cholesteryl, the value obtained by subtracting the value obtained by multiplying the integral value of the 0.7 ppm by 2/3 is methylene of glutamine amide. It was used for calculation of the introduction rate as a peak derived from.
  • the peak derived from acetyl glucosamine peak from methylene glutamine amide (-CH 2 C H 2 CONH 2 , 1.9ppm; 2H) because the overlap, the peak of 1.8 ⁇ 2.0 ppm
  • the value obtained by subtracting the value obtained by multiplying the integrated value of the peak at 2.1 ppm by 2/2 from the integrated value of ⁇ was used as the peak derived from the acetyl of glucosamine and used for calculation of the introduction rate.
  • Example 3-7 Synthesis of L-methionine amide (MetNH 2 ) and fluorescently labeled HA derivative modified with cholesteryl 6-aminohexyl carbamate (HA-MetNH 2 / Chol / FL) Instead of L-threonine amide hydrochloride HA-MetNH 2 -Chol / FL was obtained as a yellow solid in the same manner as in Example 1-5, except that L-methionine amide hydrochloride (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 3-10 shows the 1 H-NMR spectrum obtained by analyzing the product under the same conditions as described in Example 1-5.
  • the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit was calculated by the same method as described in Example 1-5 (Table 12). From the integrated value of the acetyl-derived peak (—COCH 3 , 1.8 ppm; 3H) of glucosamine and the integrated value of the methyl-derived peak (—SCH 3 , 2.1 ppm; 3H) in methionine amide, Example 1 The methionine amide introduction rate in the HA unit was calculated in the same manner as in Table 4 (Table 12).
  • HA-Glu fluorescently labeled HA derivative (HA-Glu-Chol / FL) modified with L-glutamic acid (Glu) and cholesteryl 6-aminohexyl carbamate L-alanine instead of L-alanine ethyl ester hydrochloride HA-Glu was obtained as a white solid in the same manner as in Example 1-4 except that glutamic acid diethyl ester hydrochloride (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 3-11 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-3.
  • Example 1 From the integrated value of the peak derived from the acetyl of glucosamine (—COCH 3 , 2.0 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from the methylene of glutamic acid (—CH 2 CH 2 COOH, 2.4 ppm; 2H), Example 1 As in -4, the glutamic acid introduction rate in the HA unit was calculated (Table 13). The peak derived from acetyl of glucosamine is overlapped with another methylene-derived peak of glutamic acid (—CH 2 CH 2 COOH, 2.1 ppm; 2H).
  • HA-Glu TBA salt (HA-Glu-TBA) was obtained as a white solid under the same conditions as described in Example 1-4.
  • Chol-C 6 hydrochloride and FL in the same manner as in Example 1-4 to obtain the desired product (HA-Glu-Chol / FL) as a yellow solid.
  • FIG. 3-12 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-4.
  • the introduction rate of cholesteryl group was calculated by the method described in Example 1-4 (Table 13).
  • FIG. 3-14 shows the 1 H-NMR spectrum measured under the same conditions as described in Example 1-4.
  • the introduction rate of cholesteryl group was calculated by the method described in Example 1-4 (Table 13).
  • Example 3-8 Synthesis of unlabeled hyaluronic acid derivative Examples 1-4 to 5 except that 5-aminomethylfluorescein was not added and that the molecular weight of HA-Na used as a starting material was different.
  • Various hyaluronic acid derivatives were obtained as white solids by the methods described in Example 1-18 and Examples 3-1 to 3-7 and Comparative Examples 3-1 to 3-3.
  • the introduction rate of cholesteryl group and the introduction rate of amino acids and amino acid amides were calculated by the same method as described in the corresponding examples (Tables 14-1 and 14-2).
  • As the raw material hyaluronic acid only 5 kDa was used by R & D Systems, and other than that by Shiseido.
  • Example 4 Confirmation of blood retention and biodegradability in vivo (Example 4-1) Collection of biological samples from rats administered with an HA derivative Examples 3-1 to 3-7 and Comparative Example 3 Syringes treated with sodium heparin at a dose of 10 mg / kg administered intravenously to rats intravenously at a dose of 10 mg / kg and administered 5 minutes, 2, 7, 24, 48, 72 and 168 hours after administration The blood was collected from the jugular vein and centrifuged to obtain plasma. Some of the samples of the comparative examples were collected even 96 hours after administration. This plasma sample was stored frozen at ⁇ 20 ° C. or lower until measurement. Seven days after administration, the liver was removed and stored frozen at -20 ° C. or lower until measurement.
  • Example 4-2 Analysis of Rat Plasma Administered with HA Derivatives After thawing a plasma sample, it was diluted 2-fold with an HP- ⁇ -CD (100 mM) / Tris buffer (500 mM, pH 9.0) solution. After incubation at 37 ° C. for 1 hour, the fluorescence-labeled HA derivative concentration was measured with a 96-well plate reader (ARVO) (quantitative limit: 0.4 ⁇ g / mL). Changes in plasma concentrations of fluorescently labeled HA derivatives are shown in FIGS. 4-1-1 to 4-1-10. In addition, pharmacokinetic parameters (plasma concentration-time curve extrapolated value (AUC ⁇ )) were measured using WinNonlin Ver. The analysis was performed according to 6.1 (manufactured by Pharsight), and the values are shown in Table 15. Further, Table 16 shows the ratio of AUC ⁇ to a comparative sample into which cholesterol is introduced to the same degree, which is calculated by the following formula.
  • HA derivatives in which an amino acid or amino acid amide is introduced into carboxy and a cholesteryl group is further introduced are compared with HA derivatives in which only a cholesteryl group is introduced into carboxy (Comparative Sample 2-1).
  • HA derivatives in which only a cholesteryl group is introduced into carboxy Comparative Sample 2-1.
  • 10k HA-Tyr-Chol-7% / FL (Comparative Sample 4-3) is the same as 99k HA-Tyr-Chol-6% / FL (Comparative Sample 2-8), HA in which only a cholesteryl group is introduced into carboxy.
  • blood retention was reduced.
  • Example 4-3 Analysis of liver of rat administered with HA derivative Tris buffer (10 mM, pH 9.0) was added to about 1 g of a liver sample and homogenized using beads. A 4 mg / mL pronase solution was added and incubated overnight at 37 ° C. After centrifugation, dilute twice with a solution of HP- ⁇ -CD (100 mM) / Tris buffer (500 mM, pH 9.0), further incubate at 37 ° C. for 1 hour, filter, and filter under the following conditions. Size exclusion chromatography analysis was performed. In addition, the liver of the sample non-administration rat was also subjected to the same treatment, and the sample mixed with the pre-administration sample was similarly analyzed as a standard.
  • Tris buffer 10 mM, pH 9.0
  • Fig. 4-2-1 to Fig. 4-2-10 The results are shown in Fig. 4-2-1 to Fig. 4-2-10.
  • the chromatogram is normalized at each strongest peak.
  • HA derivative of Comparative Example 1-2 HA-EDOBEA-Ac / FL, Fig. 2-226
  • no low molecular weight was observed in the liver
  • HA derivative of the Example In addition, a low molecular weight administration compound was detected. Therefore, it is considered that the HA derivative of the present invention has biodegradability and is excreted outside the body by urine or feces after being decomposed in the body.
  • Example 5 Salt concentration-responsive precipitation sustained release preparation (Example 5-1) L-tyrosine amide (TyrNH 2 ) and a fluorescently labeled HA derivative modified with cholesteryl 6-aminohexyl carbamate (HA-TyrNH 2 / Chol / FL) Synthesis HA-TyrNH 2 was carried out in the same manner as in Example 1-5, except that L-tyrosineamide hydrochloride (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) was used instead of L-threonineamide hydrochloride. -Chol / FL was obtained as a yellow aqueous solution.
  • Example 5-1 shows the 1 H-NMR spectrum of the product obtained by measuring the lyophilized product under the same conditions as described in Example 1-5.
  • the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit was calculated by the same method as described in Example 1-5 (Table 17). Integral value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 1.8 ppm; 3H) and the peak derived from hydroxyphenyl in tyrosine (—C 6 H 4 OH, 6.8, 7.2 ppm; 4H) From the values, the introduction rate of tyrosine amide in the HA unit was calculated in the same manner as in Example 1-4 (Table 17).
  • Example 5-2 Synthesis of L-tryptophanamide (TrpNH 2 ) and fluorescently labeled HA derivative modified with cholesteryl 6-aminohexyl carbamate (HA-TrpNH 2 / Chol / FL) Instead of L-threonine amide hydrochloride HA-TrpNH 2 -Chol / FL was obtained as a yellow aqueous solution by the same method as in Example 1-5 except that L-tryptophanamide hydrochloride (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 5-2 shows the 1 H-NMR spectrum of the product obtained by measuring the lyophilized product under the same conditions as described in Example 1-5.
  • the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit was calculated by the same method as described in Example 1-5 (Table 17). From the integrated value of the peak derived from the acetyl of glucosamine (—COCH 3 , 1.8 ppm; 3H) and the integrated value of the peak derived from the indole ring in tryptophanamide (—C 8 H 6 N, 7.6 ppm; 1H), The introduction rate of tryptophanamide in the HA unit was calculated in the same manner as in Example 1-4 (Table 17).
  • Example 5-3 Synthesis of L-Phenylalaninamide (PheNH 2 ) and Fluorescent Labeled HA Derivative Modified with Cholesteryl 6-aminohexyl Carbamate (HA-PheNH 2 / Chol / FL) Instead of L-threonine amide hydrochloride HA-PheNH 2 -Chol / FL was obtained as a yellow aqueous solution by the same method as in Example 1-5 except that L-phenylalaninamide hydrochloride (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.) was used.
  • FIG. 5-3 shows the 1 H-NMR spectrum of the product obtained by measuring the lyophilized product under the same conditions as described in Example 1-5.
  • the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit was calculated by the same method as described in Example 1-5 (Table 17). From the integrated value of the acetyl-derived peak of glucosamine (—COCH 3 , 1.8 ppm; 3H) and the integrated value of the phenyl-derived peak in phenylalanine (—C 6 H 5 , 7.2 to 7.4 ppm; 5H) In the same manner as in Example 1-4, the introduction rate of phenylalanine amide in the HA unit was calculated (Table 17).
  • DMT-MM -4-Methylmorpholinium chloride
  • Example 5 Table 18 shows the solubility properties of the HA derivatives synthesized in Example 5-1, Example 5-2, Comparative Example 5-1, and Comparative Example 5-2 after dialysis in water.
  • Sample 5-1 and sample 5-2 were compared with comparative sample 5-1 and comparative sample 5-2, which did not introduce a steryl group, when the steryl group was introduced, despite the hydrophobicity of the steryl group, It became clear that it was more dispersed in water.
  • Example 5-5 Evaluation of salt concentration-dependent precipitation performance HA derivatives obtained in Example 5-1, Example 5-2, Example 5-3, and Example 3-3 (99k HA-TyrNH 2 / Chol-6% / FL, 99k HA-TrpNH 2 / Chol-6% / FL, 99k HA-PheNH 2 / Chol-6% / FL, 99k HA-AlaNH 2 / Chol-6% / FL
  • a concentrated buffer was added so that the final buffer composition was 10 mM PB and 150 mM NaCl, and the HA derivative concentration was 4.5 mg / mL. After incubation at 37 ° C.
  • WO 2010/053140 states that 50k HA-Chol-6% / FL (Comparative Sample 5-1) is in a solution state under both low salt concentration conditions (ultra pure water) and physiological salt concentration (150 mM NaCl). It is shown. It was also shown by this experiment that 99k HA-Chol-6% / FL (Comparative Sample 5-3) shows the same behavior. On the other hand, 99k HA-PheNH 2 / Chol-6% / FL (sample 5-3) is dissolved under conditions where the salt concentration is low (ultra pure water) and precipitates under physiological salt concentration (150 mM NaCl). It was confirmed that it showed a typical behavior.
  • the HA derivative of the present invention can be used as a carrier in a preparation that precipitates subcutaneously after administration by preparing a low salt concentration solution made isotonic with sugar or the like. Moreover, its precipitation performance (residual amount: 1% or less) is compared with the value reported so far for HA derivatives (Comparative Sample 5-2: 50k HA-Chol-7% / FL: 22.6%). It was highly expensive.
  • Example 5-6 Precipitation Evaluation in Rat Subcutaneous Fluorescent Labeled HA Derivatives Obtained in Example 5-1, Example 5-2 and Example 5-3 (99k HA-TyrNH 2 / Chol-6% / Compound obtained in FL, 99k HA-TrpNH 2 / Chol-6% / FL, 99k HA-PheNH 2 / Chol-6% / FL), single administration subcutaneously in rats at a dose of 10 mg / kg (sucrose solution) did. Seven days after administration, when the administration site was confirmed, it was confirmed that the fluorescently labeled HA derivative was surely precipitated and existed.
  • Example 5-7 Synthesis of unlabeled hyaluronic acid derivative Examples 5-1 to 5-5 except that 5-aminomethylfluorescein was not added and the molecular weight of HA-Na used as a starting material was different.
  • Various hyaluronic acid derivatives were obtained as white solids by the method described in Example 5-3.
  • the introduction rate of cholesteryl group and the introduction rate of amino acids and amino acid amides were calculated by the same method as described in the corresponding examples (Table 20).
  • Example 6 Evaluation of drug entrapment ability (Example 6-1) Encapsulation of paclitaxel (PTX) HA obtained in Examples 1-4, 1-21, and 3-8 and 5-7 Paclitaxel (10 mg / ml, methanol solution) was added to the aqueous derivative solution (ultra pure water), so that the final paclitaxel concentration was 100 ⁇ g / mL and the HA derivative concentration was 1.0 mg / mL.
  • PTX paclitaxel
  • Reversed phase chromatography analysis condition analysis column PLRP-S 1000 ⁇ (Agilent) Column temperature: 40 ° C Mobile phase A: 0.1% TFA aqueous solution, mobile phase B: 0.1% TFA acetonitrile solution Gradient: B5% ⁇ B95% (3.4 minutes) Flow rate: 2 mL / min Detection: UV254nm Injection volume: 30 ⁇ L
  • Fig. 6-1-1 to Fig. 6-1-4 show the concentration of paclitaxel in the supernatant calculated using the standard.
  • the solubility of paclitaxel in the absence of the HA derivative was 0.6 ⁇ g / mL, whereas an improvement in the solubility of paclitaxel was confirmed in the presence of the HA derivative. This suggests that poorly soluble low molecular weight compounds such as paclitaxel are encapsulated in the HA derivative.
  • Example 6-2 Encapsulation of Cyclosporin (Cyclosporin A: CyA) An aqueous solution (ultra-pure) of the HA derivative obtained in Example 1-4, Example 1-21, Example 3-8, and Example 5-7 Cyclosporine (10 mg / ml, methanol solution) was added to water), the final cyclosporine concentration was 300 ⁇ g / mL, and the HA derivative concentration was 1.0 mg / mL.
  • Example 6-1 After standing overnight at 4 ° C., the mixture was centrifuged at 4700 G for 30 minutes, 100 ⁇ L of 50% acetonitrile and 50 ⁇ L of 100 mM HP- ⁇ -CD were added to 100 ⁇ L of the supernatant, and reversed under the conditions described in Example 6-1. Phase chromatographic analysis was performed. Detection used UV210nm. The concentration of cyclosporine in the supernatant calculated using the standard is shown in FIGS. 6-2-1 to 6-2-4. The solubility of cyclosporine in the absence of the HA derivative was 28 ⁇ g / mL, whereas the improvement in the solubility of cyclosporin was confirmed in the presence of the HA derivative. This suggests that poorly soluble peptides such as cyclosporine are encapsulated in HA derivatives.
  • Example 7 In Vitro Release Test (Example 7-1) Paclitaxel Release Test Paclitaxel (10 mg) was added to the 10 k HA-Ala-Chol-41% aqueous solution (ultra pure water) obtained in Example 1-21. The final paclitaxel concentration was 100 ⁇ g / mL and the HA derivative concentration was 1.0 mg / mL. After standing at 4 ° C. overnight, free paclitaxel was purified with a dialysis membrane (3,000 MWCO) at 4 ° C. The obtained HA derivative / paclitaxel complex was placed in a dialysis membrane (3,000 MWCO) and incubated at 37 ° C. against PBS.
  • a dialysis membrane 3,000 MWCO
  • the paclitaxel concentration in the dialysis membrane was quantified by reverse phase chromatography analysis over time, and release was confirmed.
  • the remaining amount of paclitaxel in the dialysis membrane is shown in FIG. This result indicates that the HA derivative can be used as a sustained release carrier.
  • Example 7-2 Cyclosporin release test
  • the cyclosporin release test was carried out by the method described in Example 7-1 except that cyclosporin A was used instead of paclitaxel, and the release of cyclosporin was confirmed.
  • the remaining amount of cyclosporine in the dialysis membrane is shown in FIG. 7-2. This result indicates that the HA derivative can be used as a sustained release carrier.
  • Example 8 Synthesis of HA-AA-Chol having different linkers
  • cholesteryl 6 -aminohexyl carbamate Chol-C 6
  • cholesteryl 2-aminoethyl carbamate Chol-C 2
  • cholesteryl 12-dodecylaminohexyl carbamate HA-AA having a different linker was carried out in the same manner as in Example 1-4 except that (Chol-C 12 ) and cholesteryl 8-amino-3,6-dioxaoctyl carbamate (Chol-EO 2 ) were used.
  • -Chol was obtained as a solid (Table 20).
  • Cholesteryl 2-aminoethyl carbamate, cholesteryl 12-dodecylaminohexyl carbamate, and cholesteryl 8-amino-3,6-dioxaoctyl carbamate were synthesized by the method described in WO2010 / 053140.
  • the 1 H-NMR spectrum of the product measured under the same conditions as described in Example 1-5 is shown in FIGS. 8-1 to 8-6.
  • the introduction rate of cholesteryl group with respect to the HA unit was calculated by the same method as described in Example 1-5 (Table 21).
  • Example 9 Synthesis of HA-Ala-cholanoic acid (Example 9-1) Synthesis of N- (2-aminoethyl) 5 ⁇ colanic acid amide (N- (2-aminoethyl) 5 ⁇ -cholanoamide) 5 ⁇ methyl colanic acid
  • the ester (steraloids, 100 ⁇ g) was dissolved in ethylenediamine (6 mL) and refluxed at 130 ° C. for 4 hours. After evaporation under reduced pressure, the residue was dissolved in dichloromethane and washed with ultrapure water. The solvent was distilled off under reduced pressure to obtain aminoethyl 5 ⁇ -cholanamide.
  • Example 9-2 Synthesis of HA-Ala-cholanic acid
  • An anhydrous DMSO solution (10 mg / mL) of HA-Ala-TBA synthesized by the same method as in Example 1-4 was prepared.
  • the aminoethyl 5 ⁇ -cholanamide prepared in 9-1 was added to each solution in the ratio shown in Table 22 below with respect to the HA-Ala-TBA unit.
  • DMT-MM was added to HA-Ala-TBA at the ratio shown in Table 22 below.
  • the reaction solution was dialyzed in the order of methanol / water 1/1, 0.15M NaCl aqueous solution, and ultrapure water, and the resulting dialysate was freeze-dried to obtain the target product (HA-Ala-CA) as a white solid. Obtained.
  • FIG. 9 shows a representative example of 1 H-NMR spectrum using DMSO-d 6 as a measurement solvent (a product using 99 kDa HA as a starting material and an introduction rate of colanic acid of 13%).
  • a measurement solvent a product using 99 kDa HA as a starting material and an introduction rate of colanic acid of 13%).
  • the peak around 1.6 to 2.0 ppm which includes the acetyl peak of glucosamine, is overlapped with the peak (7H) derived from the colanic acid group, so the integrated value of the peak around 1.6 to 2.0 ppm
  • the value calculated by subtracting 7/3 of the integrated value of the peak derived from methyl colanate (0.6 ppm) from 7/3 ie, integrated value (1.6 to 2.0 ppm) ⁇ integrated value (0.6 ppm)) ⁇ 7/3) was used for the calculation of the introduction rate as the integral value of acetyl derived from HA.

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Abstract

　本発明により、式（Ｉ）または式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される二糖単位を含む、ヒアルロン酸誘導体、および当該ヒアルロン酸誘導体と薬物により形成される複合体が提供される。

Description

アミノ酸およびステリル基が導入されたヒアルロン酸誘導体
　本発明は、アミノ酸により修飾され、さらにステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体、該ヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体、および該ヒアルロン酸誘導体および薬物を含む医薬品組成物に関する。
　近年、組み換え遺伝子技術や化学合成技術の発展により、タンパク質およびペプチドを活性成分とする製剤が実用化されており、その数は年々増え続けている。しかし、タンパク質やペプチドは消化管あるいは粘膜などからは吸収されにくく、また、体内では不安定で血中半減期が短い。そのため、タンパク質製剤およびペプチド製剤は注射による頻回投与が必要となっており、患者にも医療関係者にも負担が大きくなっている。薬理活性を損なうことなくタンパク質やペプチドをカプセル化するための徐放性もしくはターゲティング機能を有するＤＤＳ（薬物送達システム）基材が望まれている。また、投与の効率の観点から、基材に対してできるだけ多量のタンパク質、ペプチドが封入できることが望ましい。
　タンパク質やペプチドの薬理活性はそれらの高次構造に起因するところが大きく、有機溶媒や空気界面との接触、圧力や温度、ｐＨといった外部環境に起因する変性および凝集によりタンパク質やペプチドの薬理活性が損なわれることが知られている。また、変性や凝集したタンパク質を体内に投与することにより抗原性などのリスクが高まることも知られている。タンパク質またはペプチドを活性成分とする徐放性製剤においては、製剤化工程から、製剤の貯蔵期間を経て、投与後に生体内で当該活性成分が放出されるまで、タンパク質やペプチドの安定性を確保することが求められる。
　低分子薬物においては、薬物の安定性に関する課題はタンパク質・ペプチドと比較すると大きくはないが、依然として、難溶性薬物の溶解性向上機能や、徐放性もしくはターゲティング機能を有するＤＤＳ基材に対するニーズは大きい。
　また、安全性の面から、製剤に用いる基材は、非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持つものでなければならない。
　近年、多糖を薬物担体の基材として用いるという報告がある。その中でも、ヒアルロン酸（ＨＡ）は、１９３４年、Ｋ．Ｍｅｙｅｒによって牛の眼の硝子体から単離された生体材料（多糖）であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。ＨＡは、Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチルグルコサミンとがβ（１→３）グリコシド結合により連結された二糖単位から成るグリコサミノグリカンの一種である。ＨＡは、化学的、物理的構造に種差が無く、ヒトもその代謝系を有しており、免疫性および毒性といった面でも最も安全な医用生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）の一つである。
　上述の安全性という特性に加え、近年、細胞の接着、増殖、移動の誘導に関するヒアルロン酸の生理活性物質としての側面も注目されている。更に製造の観点からも、微生物による高分子量のヒアルロン酸の大量生産が可能となっており、ＤＤＳ研究が盛んに行われている。薬物をヒアルロン酸とコンジュゲートすることで、薬物の癌組織へのターゲティング（特許文献１）、肝臓へのターゲティング（特許文献２）、抗原性の低減等（特許文献３）が達成できるという報告がなされている。また、生体内にはＣＤ４４やＲＨＡＭＭ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ　Ａｃｉｄ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｍｏｔｉｌｉｔｙ）、ＬＹＶＥ－１（Ｌｙｍｐｈｅ　Ｖｅｓｓｅｌ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ＨＡ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１）、ＨＡＲＥ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）などのＨＡレセプターが存在することが報告されている（非特許文献７および非特許文献８）。特にＣＤ４４やＲＨＡＭＭは多くの癌細胞において過剰発現しており、それゆえＨＡを癌ターゲティングキャリアの基材として用いる試みがなされている。その例として、パクリタキセル－ＨＡコンジュゲート（非特許文献９～１１および特許文献１２）、カンプトテシン－ＨＡコンジュゲート（特許文献１３）、ドキソルビシン－ＨＰＭＡ［Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］－ＨＡコンジュゲート（非特許文献１２）、酪酸－ＨＡコンジュゲート（非特許文献１３）、ドキソルビシン封入ＨＡ－ＰＥＧ－ＰＬＧＡナノパーティクル（非特許文献１４）、ｓｉＲＮＡ封入ＨＡゲル（非特許文献１５）、ドキソルビシン封入ＨＡ被覆リポソーム（非特許文献１６）などが挙げられる。さらに非特許文献１７には、アミド結合により導入したエチレンジアミンリンカーを介してコール酸をコンジュゲートしたＨＡ誘導体について報告されている。これらＨＡを基材としたキャリアは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるＣＤ４４高発現細胞において効率良く取り込まれることが報告されている（例えば非特許文献９）。しかし、ＨＡは全身投与した場合、肝臓などの類洞内皮に存在するＨＡＲＥレセプターにより瞬時に取り込まれ、代謝されることが知られており、急速に血中から消失する（非特許文献１８～２０）。このようにヒアルロン酸を滞留性延長やターゲティング用ＤＤＳ基材として用いる場合、その血中滞留性の短さが欠点となる。ヒアルロン酸の連続する６糖がレセプターの認識部位であると考えられており、カルボキシを修飾することで血中滞留時間の延長（特許文献４、５および６）を行う試みがなされている。
　ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシを高度に修飾することにより、血中滞留性の長期化を実現させたヒアルロン酸誘導体が開発され、その有用性が示されてきた（特許文献７）。一般にグルクロン酸部分のカルボキシの修飾率を高めることによりヒアルロン酸誘導体の血中滞留性も長期化する。しかし、両者は直線的に相関するわけではなく、ある閾値を境に急激に変化することが明らかになっている。
　ヒアルロン酸中のカルボキシをアミノ酸で修飾した事例としては、例えば、Ｎ－メチルモルホリンの存在下、２－クロロ－４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジンを用いることにより生成する４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）－４－メチルモルホリウム（以下、ＤＭＴ－ＭＭとも称す）を縮合剤として用いた、グリシンのエチルエステルによる修飾が挙げられるが、修飾率は、最大でも２０％となっている（非特許文献１）。また、トリアジン系化合物を縮合剤として利用した事例としてはアラニンを導入したヒアルロン酸が、酵素分解に対する耐性が増強し、粘性のサプリメントとしての利用が期待できることが報告されており（非特許文献２）、同様の手法で、他のアミノ酸に関しても、修飾が報告されている（非特許文献３、特許文献９）。また、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、ＥＤＣとも称す）を縮合剤として用いて、ロイシンのメチルエステル塩酸塩、バリンのメチルエステル塩酸塩、イソロイシンのメチルエステル塩酸塩、プロリンのメチルエステル塩酸塩、フェニルアラニンのメチルエステル塩酸塩、アルギニンのメチルエステル塩酸塩およびヒスチジンのメチルエステル塩酸塩により修飾し、脱保護せずにゲル化させて、非水溶性の生体適合性フィルムを調製した事例もあるが、修飾率は不明である（特許文献８）。さらに、本願優先日以降に公開された特許文献１５には、ヒアルロン酸のカルボキシを、特定のアミノ－カルボン酸またはそのアミドで修飾することにより得られたヒアルロン酸誘導体が、生分解性と血中滞留性の両方に特性を有すること、また、エンドソームから細胞質内への薬物の放出に有効であることが報告されている。
　その他、多糖由来の薬物担体として、コレステリル基などを導入したプルラン誘導体が、水溶液中においてナノサイズの微粒子を形成し、疎水性低分子、ペプチド、タンパク質などと複合化するホスト分子として機能することが報告されている（非特許文献４）。タンパク質取り込み後の当該プルラン誘導体についての熱力学的評価により、取り込まれたタンパク質が、プルランのヒドロキシ基との水素結合により安定化されることが示されている（非特許文献５）。
　また、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（特許文献１０）およびリノレイン酸を導入したキトサン（非特許文献６）をタンパク質との複合体形成の材料として利用する報告もある。さらに、特許文献１１には、架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体、および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を含む組成物であって、架橋性基を有するヒアルロン酸誘導体が、親水性多糖類誘導体の存在下、ヒアルロン酸または架橋形成が可能な基を有するその誘導体の架橋形成反応により調製される組成物が報告されており、特許文献１４には、疎水性基としてコレステリル基を有する基をヒアルロン酸に導入したヒアルロン酸誘導体が、水中で会合により微粒子を形成し、薬物と複合体を形成することが報告されている。
国際公開ＷＯ９２／０６７１４号パンフレット 特開２００１－８１１０３号公報 特開平２－２７３１７６号公報 特開平５－８５９４２号公報 国際公開ＷＯ０１／０５４３４号パンフレット 国際公開ＷＯ０１／６０４１２号パンフレット 国際公開ＷＯ２００６／０２８１１０号パンフレット 国際公開ＷＯ９２／２０３４９号パンフレット 国際公開ＷＯ２０１１／１４８１１６号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００２／０２２１５４号 国際公開第ＷＯ２００８／１３６５３６号 国際公開第ＷＯ２００４／０３５６２９号 国際公開第ＷＯ２００９／０７４６７８号 国際公開第２０１０／０５３１４０号 国際公開第２０１２／１１８１８９号
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　ヒアルロン酸誘導体の血中滞留性は、グルクロン酸部分のカルボキシの修飾率と相関するものの、ある閾値を境に急激に変化することも明らかになっており、ヒアルロン酸誘導体の血中滞留性を、カルボキシの修飾率を制御することのみによって望ましい範囲内にコントロールすることは困難である。よって、より簡便かつ確実な方法で血中滞留性をコントロールする方法が望まれている。また、ヒアルロン酸のレセプターによる認識が低下すると、生体内での代謝を受けにくくなり、ヒアルロン酸が元来もつ特徴である生分解性が低下することも予想される。したがって、生分解性（安全性）および血中滞留性の両方の特徴を兼ね備えた新規基材が求められている。
　発明が解決しようとする課題は、生分解性と血中滞留性の両方の特徴を兼ね備えたヒアルロン酸誘導体を提供することである。また発明が解決しようとするさらなる課題は、該ヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体および該ヒアルロン酸誘導体を含む医薬品組成物、特に、該ヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体を提供することである。
　本発明者は、かかる課題を解決する為に鋭意研究を進めたところ、ヒアルロン酸またはその塩のグルクロン酸部分のカルボキシを、特定のアミノ酸またはアミノ酸アミドと反応させてアミドに変換することにより得られた中間体の、グルクロン酸部分のカルボキシおよび／またはアミノ酸部分のカルボキシに、さらにステリル基を導入することにより得られたヒアルロン酸誘導体が、生分解性と血中滞留性の両方の特性を有すること、および該ヒアルロン酸誘導体と薬物との複合体が医薬組成物として良好な特性を有することを見出し、本発明を完成させた。また、鋭意研究を進めた過程で、チロシンアミド、トリプトファンアミドといった一部のアミノ酸アミド（後述するＲａが、アリールまたはヘテロアリールで置換されているＣ１－６アルキルであり、該アリールは１以上のヒドロキシで置換されている場合）を用いると、ステリル基を導入しない場合に比べ、ステリル基を導入した場合の方が、ステリル基の有する疎水性にも係わらず、純水中でより分散することを見出し、本発明を完成させた。さらに、フェニルアラニンアミド（後述するＲａが、アリールで置換されているＣ１－６アルキルであり、該アリールは無置換である場合）を用いた上で更に６％以下の導入率でステリル基を導入した場合、フェニルアラニンアミドを用いずに６％以下の導入率でステリル基を導入した場合と比較して、純水中では、いずれの場合も分散するが、生理食塩水中では、後者の場合は分散するのに対し、前者の場合は凝集して沈殿を形成し、前者の場合が、例えば持続性の皮下投与用注射製剤の基材として非常に優れていることも見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、生分解性と血中滞留性とを併せ持つヒアルロン酸誘導体、および、ステリル基を導入することで水中でより分散するヒアルロン酸誘導体、ならびに、これらのヒアルロン酸誘導体および薬理活性を有する化合物を含有する複合体に関する。さらに本発明は、これらのヒアルロン酸誘導体の製造方法、ならびに薬物およびこれらのヒアルロン酸誘導体を含む医薬品組成物およびその製造方法に関する。
　本発明の１つの側面において、以下の（１）～（１０）のヒアルロン酸誘導体が提供される。
　（１）式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル、およびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｒ５は、水素原子、ホルミル、またはＣ１－６アルキルカルボニルであり；
　Ｘ１は、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルコキシ、－Ｏ－Ｑ＋、－ＮＲ７Ｒ８、または－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２であり；
　Ｑ＋は、カウンターカチオンを表し；
　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素原子、およびＣ１－６アルキルから選択され；
　Ｒａは、水素原子、またはＣ１－６アルキルであり、ここで該アルキルは、独立に、ヒドロキシ、カルボキシ、カルバモイル、Ｃ１－６アルキルチオ、アリール、およびヘテロアリールから選択される１以上の基で置換されていてもよく、ここで該アリールは１以上のヒドロキシで置換されていてもよく；
　Ｚ１は、Ｃ２－３０アルキレン、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで該アルキレンは、独立に、－Ｏ－、－ＮＲｇ－および－Ｓ－Ｓ－から選択される１～５の基が挿入されていてもよく、ｍは、１～１００から選択される整数であり；
　Ｚ２は、以下の式：
　－ＮＲｂ－Ｚ３、
　－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｚ３、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｚ３、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｚ３、
　－ＣＯＯ－Ｚ３、
　－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｚ３、
　－Ｏ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｚ３、
　－Ｏ－ＣＯＯ－Ｚ３、
　－Ｓ－Ｚ３、
　－ＣＯ－Ｚａ－Ｓ－Ｚ３、
　－Ｏ－ＣＯ－Ｚｂ－Ｓ－Ｚ３、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｚｂ－Ｓ－Ｚ３、および
　－Ｓ－Ｓ－Ｚ３、
により表される基から選択され；
　ＲｂおよびＲｃは、独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキルおよびヒドロキシＣ２－２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、独立に、－Ｏ－および－ＮＲｆ－から選択される１～３個の基が挿入されていてもよく；
　Ｒｆは、独立に、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル、およびヒドロキシＣ２－１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－および－ＮＨ－から選択される１～２個の基が挿入されていてもよく；
　Ｒｇは、独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキルまたはヒドロキシＣ２－２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、－Ｏ－および－ＮＨ－から選択される１～３個の基が挿入されていてもよく；
　Ｚ３は、ステリル基であり；
　Ｚａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
　Ｚｂは、Ｃ２－８アルキレンまたはＣ２－８アルケニレンである］
で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体であって、Ｘ１が－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２である式（Ｉ）で表される繰り返し単位が含まれない場合、さらに式（ＩＩ）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 ［式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａは、独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル、およびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｒ５ａは、水素原子、ホルミル、またはＣ１－６アルキルカルボニルであり；
　Ｘ２は、－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２であり、ここで、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は既に定義したとおりである］；
で表される繰り返し単位を含む、ヒアルロン酸誘導体。
　（２）式（ＩＩｂ）
［式中、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂは、独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル、およびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｒ５ｂは、水素原子、ホルミル、およびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｘｂは、ヒドロキシ、および－Ｏ－Ｑ＋から選択され、ここでＱ＋は、カウンターカチオンを表す］
で表わされる繰り返し単位をさらに含む、上記（１）に記載のヒアルロン酸誘導体。
　（３）式（Ｉ）においてＸ１が－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２である、上記（１）または（２）に記載のヒアルロン酸誘導体。
　（４）存在する二糖の繰り返し単位における、式（Ｉ）で表わされる二糖単位の割合が、７０～１００％である、上記（１）～（３）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
　（５）存在する二糖の繰り返し単位における、基－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２を含む二糖単位の割合が、３～５０％である、上記（１）～（４）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
　（６）Ｘ１が－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２である式（Ｉ）で表される繰り返し単位が含まれない、上記（１）または（２）に記載のヒアルロン酸誘導体。
　（７）存在する二糖の繰り返し単位における、（Ｉ）で表わされる繰り返し単位の割合、および式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合の和が、７０～１００％である、（１）、（２）、および（６）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
　（８）Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂの全てを水素原子とし、Ｒ５ｂをアセチルとし、かつ、Ｘｂを－Ｏ－Ｎａ＋とした場合の重量平均分子量が３キロダルトン～１５００キロダルトンとなる、上記（２）に定義した式（ＩＩｂ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を用いて製造される、上記（１）～（７）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
　（９）Ｚ１が、Ｃ２－１０アルキレンであり、Ｚ２が、－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｚ３であり、Ｚ３が、コレステリル基である、（１）～（８）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
　（１０）式（ＩＩｂ）で表わされる繰り返し単位および式（Ｉａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、Ｘａは、ヒドロキシ、－Ｏ－Ｑ＋、Ｃ１－６アルコキシ、および－ＮＲ７Ｒ８から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｑ＋、およびＲａは、上記（１）に定義した通りである］
で表わされる繰り返し単位をそれぞれ含むヒアルロン酸誘導体を、以下の式
　　ＨＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２
［式中、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は、上記（１）に定義した通りである］
で表わされる化合物と反応させることにより得られる、上記（１）～（９）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体。
　本発明の別の側面において、以下の（１１）および（１２）の医薬組成物が提供される。
　（１１）上記（１）～（１０）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体と薬物を含む、医薬組成物。
　（１２）薬物がヒアルロン酸誘導体と複合体を形成することにより担持される、上記（１１）に記載の医薬組成物。
　本発明のさらに別の側面において、上記（１）～（１０）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体に薬物が担持された、ヒアルロン酸誘導体－薬物複合体が提供される。好ましくは、ヒアルロン酸誘導体が水中で会合により微粒子を形成して薬物を担持する、ヒアルロン酸誘導体－薬物複合体が提供される。
　さらに本発明の別の側面において、上記（１）～（１０）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を含む、生分解性の薬物担体が提供される。
　さらに本発明の別の側面において、上記（１）～（１０）のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体と共に治療有効量の薬物を対象に投与することを含む、薬物の投与方法が提供される。
　なお、Ｘ１が、ヒドロキシ、－Ｏ－Ｑ＋、または－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２である時、Ｒａ中のアリール（１以上のヒドロキシで置換されていてもよい）は、無置換であるのが好ましい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体を用いることで、薬物、特に低分子化合物や薬効を有するタンパク質やペプチドをその生物活性を維持したまま多量に封入した徐放性製剤を提供することが可能となる。また、ヒアルロン酸誘導体は安全性の面においても優れており、薬物の血中滞留性と生分解性の双方において、医薬製剤の担体として、また、持続性の皮下投与用注射製剤の基材として特に優れた特性を有している。また、本発明のヒアルロン酸誘導体のカルボキシの修飾の程度、すなわち、導入する基－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２および／またはアミノ酸（アミノ酸アミドを含む）の割合を調節することにより、当該誘導体を用いて製造する製剤の体内動態を制御することも可能である。
実施例１－１で調製したコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート（Ｃｈｏｌ－Ｃ６）の塩酸塩の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－３で調製した９９ｋＤａのＨＡ－Ｎａを出発原料とするヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（溶媒：Ｄ２Ｏ）の一例である。 実施例１－４で調製した９９ｋＤａのＨＡ－Ｎａを出発原料とするＨＡ－Ａｌａの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－４で調製した９９ｋＤａのＨＡ－Ｎａを出発原料とするＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：７％）である。 実施例１－５で調製した９９ｋＤａのＨＡ－Ｎａを出発原料とするＨＡ－ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－６で調製したＨＡ－Ｓｅｒ－ＯＥｔの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－６で調製したＨＡ－Ｓｅｒの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－６で調製したＨＡ－Ｓｅｒ－Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－７で調製したＨＡ－Ｇｌｙ－ＯＥｔの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－７で調製したＨＡ－Ｇｌｙの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－７で調製したＨＡ－Ｇｌｙ－Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－８で調製したＨＡ－Ｔｈｒの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－８で調製したＨＡ－Ｔｈｒ－Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－９で調製したＨＡ－Ａｓｎの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－９で調製したＨＡ－Ａｓｎ－Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：７％）である。 実施例１－１０で調製したＨＡ－Ａｓｐの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－１０で調製したＨＡ－Ａｓｐ－Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－１１で調製したＨＡ－Ｉｌｅの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－１１で調製したＨＡ－Ｉｌｅ－Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－１２で調製したＨＡ－Ｌｅｕの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－１２で調製したＨＡ－Ｌｅｕ－Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－１３で調製したＨＡ－Ｖａｌの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－１３で調製したＨＡ－Ｖａｌ－Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－１４で調製したＨＡ－Ｐｈｅの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－１４で調製したＨＡ－Ｐｈｅ－Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－１５で調製したＨＡ－ＳｅｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（溶媒：０．０２Ｎ　ＤＣｌ　ＤＭＳＯ－ｄ６／Ｄ２Ｏ混液）の一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－１５で調製したＨＡ－ＳｅｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（溶媒：Ｄ２Ｏ）の一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－１６で調製したＨＡ－ＧｌｙＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（溶媒：０．０２Ｎ　ＤＣｌ　ＤＭＳＯ－ｄ６／Ｄ２Ｏ混液）の一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－１６で調製したＨＡ－ＧｌｙＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（溶媒：Ｄ２Ｏ）の一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－１７で調製したＨＡ－ＬｅｕＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－１８で調製したＨＡ－ＶａｌＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－１９で調製したＨＡ－Ａｌａ／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 実施例１－２０で調製したＨＡ－Ｓｅｒ－ＯＥｔ／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例１－２０で調製したＨＡ－Ｓｅｒ／Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 比較例１－１で調製したＨＡ－Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 比較例１－２で調製したＨＡ－ＥＤＯＢＥＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－２で調製したＨＡ－ＥＤＯＢＥＡ－Ａｃ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－３で調製したＨＡ－Ｔｙｒの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例１－３で調製したＨＡ－Ｔｙｒ－Ｃｈｏｌ／ＦＬの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの一例（コレステリル基の導入率：６％）である。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－７％／ＦＬ（表９：サンプル２－１）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－２４％／ＦＬ（表９：サンプル２－２）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―２４％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－２）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－３０％／ＦＬ（表９：サンプル２－３）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―２５％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－３）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ５０ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－４）と５０ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－４）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ５０ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－２２％／ＦＬ（表９：サンプル２－５）と５０ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―２０％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－５）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ５０ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－２６％／ＦＬ（表９：サンプル２－６）と５０ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―２７％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－６）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 １０ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－１６％／ＦＬ（表９：サンプル２－７）と１０ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―１５％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－７）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：サンプル２－８）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ―２４％／ＦＬ（表９：サンプル２－９）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―２４％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－２）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ―３１％／ＦＬ（表９：サンプル２－１０）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―２５％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－３）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｓｅｒ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１１）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｇｌｙ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１２）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｔｈｒ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１３）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｓｎ－Ｃｈｏｌ－７％／ＦＬ（表９：サンプル２－１４）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｓｐ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１５）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｉｌｅ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１６）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｌｅｕ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１７）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｖａｌ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１８）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｐｈｅ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１９）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＶａｌＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２０）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＳｅｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２１）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＬｅｕＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２２）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＧｌｙＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２３）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｌａ／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２４）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｓｅｒ／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２５）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｔｙｒ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－８）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例２－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－７％／ＦＬ（表９：サンプル２－１）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－２４％／ＦＬ（表９：サンプル２－２）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－３０％／ＦＬ（表９：サンプル２－３）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ５０ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－４）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ５０ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－２２％／ＦＬ（表９：サンプル２－５）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ５０ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－２６％／ＦＬ（表９：サンプル２－６）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 １０ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－１６％／ＦＬ（表９：サンプル２－７）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－８）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ－２４％／ＦＬ（表９：サンプル２－９）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ－３１％／ＦＬ（表９：サンプル２－１０）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｓｅｒ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１１）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｇｌｙ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１２）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｔｈｒ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１３）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｓｎ－Ｃｈｏｌ－７％／ＦＬ（表９：サンプル２－１４）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｓｐ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１５）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｉｌｅ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１６）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｌｅｕ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１７）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｖａｌ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１８）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｐｈｅ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１９）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＶａｌＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２０）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＳｅｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２１）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＬｅｕＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２２）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＧｌｙＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２３）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｌａ／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２４）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｓｅｒ／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２５）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＥＤＯＢＥＡ－Ａｃ／ＦＬ（比較例１－２）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルが何ら代謝を受けていないことが確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｔｙｒ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－８）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例２－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－７％／ＦＬ（表９：サンプル２－１）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－２４％／ＦＬ（表９：サンプル２－２）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－３０％／ＦＬ（表９：サンプル２－３）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ５０ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－４）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ５０ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－２２％／ＦＬ（表９：サンプル２－５）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ５０ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－２６％／ＦＬ（表９：サンプル２－６）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 １０ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－１６％／ＦＬ（表９：サンプル２－７）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－８）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ－２４％／ＦＬ（表９：サンプル２－９）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ－３１％／ＦＬ（表９：サンプル２－１０）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｓｅｒ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１１）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｇｌｙ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１２）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｔｈｒ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１３）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｓｎ－Ｃｈｏｌ－７％／ＦＬ（表９：サンプル２－１４）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｓｐ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１５）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｉｌｅ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１６）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｌｅｕ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１７）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｖａｌ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１８）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｐｈｅ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－１９）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＶａｌＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２０）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＳｅｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２１）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＬｅｕＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２２）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＧｌｙＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２３）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ａｌａ／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２４）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｓｅｒ／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：サンプル２－２５）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＥＤＯＢＥＡ－Ａｃ／ＦＬ（比較例１－２）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｔｙｒ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－８）を投与したマウス尿サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す（実施例２－４）。 実施例３－１で調製したＨＡ－ＧｌｎのＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例３－１で調製したＨＡ－Ｇｌｎ－Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 実施例３－２で調製したＨＡ－ＭｅｔのＮＭＲスペクトルの一例である。 実施例３－２で調製したＨＡ－Ｍｅｔ－Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 実施例３－３で調製したＨＡ－ＡｌａＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 実施例３－４で調製したＨＡ－ＡｓｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 実施例３－４で調製したＨＡ－ＡｓｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 実施例３－５で調製したＨＡ－ＩｌｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 実施例３－６で調製したＨＡ－ＧｌｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 実施例３－７で調製したＨＡ－ＭｅｔＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 比較例３－１で調製したＨＡ－ＧｌｕのＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例３－１で調製したＨＡ－Ｇｌｕ－Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 比較例３－２で調製したＨＡ－ＴｒｐのＮＭＲスペクトルの一例である。 比較例３－２で調製したＨＡ－Ｔｒｐ－Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｇｌｎ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：サンプル４－１）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｍｅｔ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：サンプル４－２）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＡｌａＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：サンプル４－３）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＡｓｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：サンプル４－４）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＩｌｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：サンプル４－５）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＧｌｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：サンプル４－６）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＭｅｔＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：サンプル４－７）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｇｌｕ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：比較サンプル４－１）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｔｒｐ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：比較サンプル４－２）と９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－１）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４－２）。 １０ｋ　ＨＡ－Ｔｙｒ－Ｃｈｏｌ－７％／ＦＬ（表１５：比較サンプル４－３）と１０ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ―１５％／ＦＬ（表９：比較サンプル２－７）の血漿中濃度推移を示すグラフである（実施例４－２）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｇｌｎ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：サンプル４－１）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｍｅｔ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：サンプル４－２）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＡｌａＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：サンプル４－３）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＡｓｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：サンプル４－４）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＩｌｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：サンプル４－５）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＧｌｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：サンプル４－６）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－ＭｅｔＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：サンプル４－７）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｇｌｕ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：比較サンプル４－１）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４－３）。 ９９ｋ　ＨＡ－Ｔｒｐ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（表１５：比較サンプル４－２）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４－３）。 １０ｋ　ＨＡ－Ｔｙｒ－Ｃｈｏｌ－７％／ＦＬ（表１５：比較サンプル４－３）と該サンプルを投与したマウス肝臓サンプルのサイズ排除クロマトグラフィー分析結果であり、投与サンプルの肝臓における代謝が確認されている（実施例４－３）。 実施例５－１で調製したＨＡ－ＴｙｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 実施例５－２で調製したＨＡ－ＴｒｐＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 実施例５－３で調製したＨＡ－ＰｈｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 実施例６－１における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるパクリタキセルの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とパクリタキセルとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のパクリタキセル濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。 実施例６－１における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるパクリタキセルの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とパクリタキセルとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のパクリタキセル濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。 実施例６－１における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるパクリタキセルの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とパクリタキセルとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のパクリタキセル濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。 実施例６－１における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるパクリタキセルの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とパクリタキセルとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のパクリタキセル濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。 実施例６－２における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるシクロスポリンの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とシクロスポリンとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のシクロスポリン濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。 実施例６－２における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるシクロスポリンの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とシクロスポリンとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のシクロスポリン濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。 実施例６－２における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるシクロスポリンの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とシクロスポリンとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のシクロスポリン濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。 実施例６－２における、本発明のヒアルロン酸誘導体への、難溶性薬物であるシクロスポリンの封入（本発明のヒアルロン酸誘導体とシクロスポリンとの複合化）の結果を示すグラフであり、縦軸は、本発明のヒアルロン酸誘導体を共存させることにより向上する、上清中のシクロスポリン濃度（溶解度）を示す。縦軸の値が大きいほど、封入効果が高いことを指す。 実施例７－１における、ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－４１％からのパクリタキセルの放出結果を示すグラフであり、横軸は、時間（Ｈｏｕｒ）、縦軸は、放出されずにＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－４１％中に封入されたまま（ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－４１％と複合化したまま）のパクリタキセルの量を、それぞれ示す。 実施例７－２における、ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－４１％からのシクロスポリンの放出結果を示すグラフであり、横軸は、時間（Ｈｏｕｒ）、縦軸は、放出されずにＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－４１％中に封入されたまま（ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－４１％と複合化したまま）のシクロスポリンの量を、それぞれ示す。 実施例８で調製したＨＡ－Ａｌａ－Ｃ２－ＣｈｏｌのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 実施例８で調製したＨＡ－Ａｌａ－Ｃ２－ＣｈｏｌのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：７％）。 実施例８で調製したＨＡ－Ａｌａ－Ｃ１２－ＣｈｏｌのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：７％）。 実施例８で調製したＨＡ－Ａｌａ－Ｃ１２－ＣｈｏｌのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：７％）。 実施例８で調製したＨＡ－Ａｌａ－ＥＯ２－ＣｈｏｌのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：５％）。 実施例８で調製したＨＡ－Ａｌａ－ＥＯ２－ＣｈｏｌのＮＭＲスペクトルの一例である（コレステリル基の導入率：６％）。 実施例９－２で調製したＨＡ－Ａｌａ－ＣＡのＮＭＲスペクトルの一例である（コラノイル基の導入率：１３％）。
　本発明のヒアルロン酸誘導体は、式（Ｉ）で表される１以上の二糖単位（繰り返し単位でもある）を含むヒアルロン酸誘導体である。
　本発明の一態様において、ヒアルロン酸誘導体は、（ａ）上記式（Ｉ）、（ｂ）上記式（Ｉ）および（ＩＩ）、（ｃ）上記式（Ｉ）および式（ＩＩｂ）、または（ｄ）上記式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩｂ）の繰り返し単位から実質的に構成される。当該ヒアルロン酸誘導体は、当該誘導体に含まれるＤ－グルクロン酸とＮ－アセチルグルコサミンとから成る二糖の繰り返し単位のうちの、例えば８０％以上が、好ましくは９０％以上が、より好ましくは９５％以上が式（Ｉ）、（ＩＩ）または式（ＩＩｂ）の繰り返し単位である。本発明の１つの態様において、ヒアルロン酸誘導体は、（ａ）上記式（Ｉ）、（ｂ）上記式（Ｉ）および式（ＩＩ）、（ｃ）上記式（Ｉ）および式（ＩＩｂ）、または（ｄ）上記式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩｂ）で表される繰り返し単位のみから構成される。
　本発明のヒアルロン酸誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する特定の二糖単位の割合は、二糖単位を繰り返し単位とする多糖類である本発明のヒアルロン酸誘導体の一定量に含まれる全ての二糖単位に対する特定の二糖単位の割合を意味する。
　本発明のヒアルロン酸誘導体に含まれる二糖単位を表す式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、全て水素原子であるのが好ましい。Ｒ５は、水素原子またはＣ１－６アルキルカルボニルであるのが好ましく、水素原子またはアセチルであるのが更に好ましく、アセチルであるのが更に好ましい。また、本発明のヒアルロン酸誘導体に含まれる二糖単位を表す式（ＩＩ）および（ＩＩｂ）において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａ、並びにＲ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂは、全て水素原子であるのが好ましい。Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、水素原子またはＣ１－６アルキルカルボニルであるのが好ましく、水素原子またはアセチルであるのが更に好ましく、いずれもアセチルであるのが更に好ましい。
　式（Ｉ）におけるＲａの具体例としては、水素原子、メチル、ヒドロキシメチル、１－ヒドロキシエチル、カルバモイルメチル、カルボキシメチル、１－メチルプロピル、２－メチルプロピル、イソプロピル、２－カルボキシエチル、２－メチルチオエチル、２－カルバモイルエチル、フェニルメチル、（４－ヒドロキシフェニル）メチル、およびインドール－３－イルメチルなどが挙げられる。
　基－ＣＨＲａ－が不斉中心となる場合は、それぞれの光学活性体およびそれらの混合物も含まれるが、Ｈ２Ｎ－ＣＨＲａ－ＣＯＯＨ（アミノ酸）として記載した時、Ｌ型（天然型）となるのが好ましい。
　式（Ｉ）において、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、例えば、独立に、水素原子またはメチルであり、好ましくは全て水素原子である。
　式（Ｉ）における基－ＣＨＲａ－ＣＯ－Ｘ１の態様として、例えば、基－ＣＨＲａ－ＣＯＯＨが挙げられる。該基の具体例として以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　ここで、「＊」は、－ＮＲ６－との結合位置を表す（以下同じ）。
　基－ＣＨＲａ－ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　基－ＣＨＲａ－ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　基－ＣＨＲａ－ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　基－ＣＨＲａ－ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　基－ＣＨＲａ－ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　上述した基－ＣＨＲａ－ＣＯＯＨは、いずれも、その一部または全部が、基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ－Ｚ１－Ｚ２に変換されていてもよい。基－Ｚ１－Ｚ２の例は、後述の通りである。
　式（Ｉ）における基－ＣＨＲａ－ＣＯ－Ｘ１の別の態様として、例えば、基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ２が挙げられる。該基の具体例として以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　これらの基は、生分解性と血中滞留性の両方の特性を有する観点で、好ましい基でもある。
　生分解性と血中滞留性の両方の特性を有する観点では、基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基も挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　生分解性と血中滞留性の両方の特性を有する観点で、基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ２のさらに好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　純水中でのより好適な分散性の観点で、基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　これら２つの基は、持続性の皮下投与用注射製剤の基材としての観点でも好ましい例である。
　持続性の皮下投与用注射製剤の基材としての観点で、基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　Ｒ７としては、水素原子およびメチルがさらに好ましく、水素原子がさらに好ましい。
　式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩｂ）において定義されるカルボキシは式－ＣＯＯ－Ｑ＋で表される塩を形成していてもよい。ここで、Ｑ＋はカルボキシと水中で塩を形成するカウンターカチオンであれば特に限定されず、２価以上の場合は価数に応じて複数のカルボキシと塩を形成する。カウンターカチオンの例としては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオン；式：Ｎ＋ＲｊＲｋＲｌＲｍ（式中、Ｒｊ、Ｒｋ、ＲｌおよびＲｍは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ１－６アルキルから選択される）で表されるアンモニウムイオンなどが挙げられ、好ましくは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、テトラアルキルアンモニウムイオン（例えば、テトラｎ－ブチルアンモニウムイオンなど）が挙げられる。Ｒｊ、Ｒｋ、ＲｌおよびＲｍは、Ｃ１－６アルキルから選択される同一の基であるのが好ましく、ｎ－ブチルであるのが好ましい。
　式（Ｉ）における基－ＣＨＲａ－ＣＯ－Ｘ１の別の態様として、例えば、基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ－Ｚ１－Ｚ２が挙げられる。該基の具体例として以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　該基の別の具体例として以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ－Ｚ１－Ｚ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ－Ｚ１－Ｚ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ－Ｚ１－Ｚ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　生分解性と血中滞留性の両方の特性を有する観点で、基－ＣＨＲａ－ＣＯＮＨ－Ｚ１－Ｚ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　基－Ｚ１－Ｚ２の例としては、基－（Ｃ２－１０アルキレン）－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｚ３が挙げられる。また、基－（Ｃ２－１２アルキレン）－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｚ３も挙げられる。ここでＣ２－１２アルキレンの例として、好ましくは、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－、－（ＣＨ２）１０－および－（ＣＨ２）１２－が挙げられ、さらに好ましくは－（ＣＨ２）２－および－（ＣＨ２）６－が挙げられる。さらに、基－Ｚ１－Ｚ２の例としては、基－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－Ｚ３が挙げられる。ここでｍは、１～２０が好ましく、１～１０がさらに好ましく、１～３がさらに好ましい。好ましいｍの具体例として、２が挙げられる。基－Ｚ１－Ｚ２の例として、好ましくは基－（ヘキサン－１，６－ジイル）－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｚ３、基－（エタンン－１，２－ジイル）－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｚ３および基－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－Ｚ３が挙げられ、さらに好ましくは基－（ヘキサン－１，６－ジイル）－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、基－（エタン－１，２－ジイル）－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルおよび基－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－コラノイルが挙げられ、さらに好ましくは基－（ヘキサン－１，６－ジイル）－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルが挙げられる。Ｚ１、Ｚ２、基－Ｚ１－Ｚ２の例としては、国際公開第２０１０／０５３１４０号の、Ｙ、Ｘ１、基－Ｙ－Ｘ１に相当するものを、それぞれ挙げることもできる。基－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｚ３および基－Ｏ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｚ３の例としては、Ｒｃが水素原子である基を、それぞれ挙げることができる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体において、式（ＩＩ）の繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体も好ましい。さらに好ましい態様において、式（Ｉ）のＸ１と式（ＩＩ）のＸ２は同一である。本発明の一つの側面において、Ｘ１が－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２である式（Ｉ）で表される繰り返し単位、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位および式（ＩＩｂ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体が提供される。
　本明細書で言及する用語「ステリル基」とは、ステロイド骨格を有する基であれば特に制限されない。ここでステロイドとしては、具体的には、コレステロール、デヒドロコレステロール、コプロステノール、コプロステロール、コレスタノール、カンペスタノール、エルゴスタノール、スチグマスタノール、コプロスタノール、スチグマステロール、シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール、シミアレノール、胆汁酸（コラン酸、リトコール酸、ヒオデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、アポコール酸、コール酸、デヒドロコール酸、グリココール酸、タウロコール酸）、テストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチステロンなどが挙げられる。ステリル基としては、コレステリル基、スチグマステリル基、ラノステリル基、エルゴステリル基、コラノイル基、コロイル基などが挙げられ、好ましくはコレステリル基（特に、下式で示されるコレスタ－５－エン－３β－イル基）、コラノイル基（特に、下式で示される５β－コラン－２４－オイル基）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 　ここで、「＊＊」は、隣の基との結合位置を表す。
　本明細書で言及する用語「Ｃ１－２０アルキル」とは、炭素数１～２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｉ－ブチル、ｔ－ブチルなどの「Ｃ１－４アルキル」が含まれ、さらに、ｎ－ペンチル、３－メチルブチル、２－メチルブチル、１－メチルブチル、１－エチルプロピル、ｎ－ヘキシル、４－メチルペンチル、３－メチルペンチル、２－メチルペンチル、１－メチルペンチル、３－エチルブチル、および２－エチルブチルなどが含まれる。Ｃ１－２０アルキルには、炭素数が１～１２の「Ｃ１－１２アルキル」、炭素数が１～６の「Ｃ１－６アルキル」も含まれる。
　本明細書で言及する用語「Ｃ１－６アルキル」とは、炭素数１～６の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｉ－ブチル、ｔ－ブチルなどの「Ｃ１－４アルキル」が含まれる。
　本明細書で言及する用語「Ｃ１－６アルコキシ」とは、炭素数１～６の直鎖状、分岐鎖状のアルキルオキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、ｉ－プロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｓ－ブトキシ、ｉ－ブトキシ、ｔ－ブトキシなどの「Ｃ１－４アルコキシ」が含まれる。
　本明細書で言及する用語「Ｃ１－６アルキルカルボニル」とは、アルキル部分が既に言及したＣ１－６アルキルであるアルキルカルボニル基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ｎ－プロピルカルボニル、ｉ－プロピルカルボニル、ｎ－ブチルカルボニル、ｓ－ブチルカルボニル、ｉ－ブチルカルボニル、ｔ－ブチルカルボニルなどの「Ｃ１－４アルキルカルボニル」が含まれる。
　本明細書で言及する用語「Ｃ１－６アルコキシ」とは、アルキル部分が既に言及したＣ１－６アルキルであるアルキルオキシ基を意味し、例えば、メトキシ（Ｈ３Ｃ－Ｏ－）、エトキシ、ｎ－プロポキシ、ｉ－プロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｓ－ブトキシ、ｉ－ブトキシ、ｔ－ブトキシなどが含まれる。
　本明細書で言及する用語「Ｃ１－６アルキルチオ」とは、アルキル部分が既に言及したＣ１－６アルキルであるアルキルチオ基を意味し、例えば、メチルチオ（Ｈ３Ｃ－Ｓ－）、エチルチオ、ｎ－プロピルチオ、ｉ－プロピルチオ、ｎ－ブチルチオ、ｓ－ブチルチオ、ｉ－ブチルチオ、ｔ－ブチルチオなどが含まれ、好ましくはメチルチオが挙げられる。
　本明細書で言及する用語「アミノＣ２－２０アルキル」は、置換基としてアミノを有する炭素数２～２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキルを意味し、例えば、アミノはアルキルの末端の炭素原子上に位置していてもよい。アミノＣ２－２０アルキルには、炭素数が２～１２の「アミノＣ２－１２アルキル」も含まれる。
　本明細書で言及する用語「ヒドロキシＣ２－２０アルキル」は、置換基としてヒドロキシを有する炭素数２～２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、ヒドロキシはアルキルの末端の炭素原子上に位置していてもよい。ヒドロキシＣ２－２０アルキルには、炭素数が２～１２の「ヒドロキシＣ２－１２アルキル」も含まれる。
　本明細書で言及する用語「Ｃ２－３０アルキレン」とは、炭素数２～３０の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン、プロピレンなどを含み、Ｃ２－２０アルキレン、Ｃ２－８アルキレン、基－（ＣＨ２）ｎ－（ここで、ｎは２～３０、好ましくは２～２０、さらに好ましくは２～１５）を含む。
　本明細書で言及する用語「Ｃ１－５アルキレン」とは、炭素数１～５の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン（エタン－１，２－ジイル、エタン－１，１－ジイル）、プロピレン（プロパン－１，１－ジイル、プロパン－１，２－ジイル、プロパン－１，３－ジイル）、ブタン－１，４－ジイル、およびペンタン－１，５－ジイルなどを含む。
　本明細書で言及する用語「Ｃ２－１０アルキレン」とは、炭素数２～１０の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン（エタン－１，２－ジイル、エタン－１，１－ジイル）、プロピレン（プロパン－１，１－ジイル、プロパン－１，２－ジイル、プロパン－１，３－ジイル）、ブタン－１，４－ジイル、ペンタン－１，５－ジイル、ヘキサン－１，６－ジイル、ヘプタン－１，７－ジイル、オクタン－１，８－ジイルなどを含む。「Ｃ２－１０アルキレン」は、炭素数２～８の「Ｃ２－８アルキレン」および炭素数２～６の「Ｃ２－６アルキレン」を含む。
　本明細書で言及する用語「Ｃ２－８アルキレン」とは、炭素数２～８の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン（エタン－１，２－ジイル、エタン－１，１－ジイル）、プロピレン（プロパン－１，１－ジイル、プロパン－１，２－ジイル、プロパン－１，３－ジイル）、ブタン－１，４－ジイル、ペンタン－１，５－ジイル、ヘキサン－１，６－ジイル、ヘプタン－１，７－ジイル、オクタン－１，８－ジイルなどを含む。
　本明細書で言及する用語「Ｃ２－８アルケニレン」とは、炭素数２～８の直鎖状または分岐鎖状の、１以上の二重結合を含む、２価の炭化水素基を意味し、例えば、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ－、２－ブテン－１，４－ジイル、ヘプタ－２，４－ジエン－１，６－ジイルおよびオクタ－２，４，６－トリエン－１，８－ジイルなどを含む。幾何異性が存在する場合は、それぞれの異性体およびそれらの混合物も含まれる。
　本発明において「アリール」とは、芳香族炭素環基、例えば炭素数が６～１４の芳香族炭素環基を意味し、アリールの例としてはフェニル、ナフチル（１－ナフチル、および２－ナフチル）などが挙げられる。１以上のヒドロキシで置換されたアリールの例としては、４－ヒドロキシフェニルが挙げられる。
　本発明において「ヘテロアリール」とは、環を構成する原子中に、１または複数個の、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択されるヘテロ原子を含有する芳香族性の環の基を意味し、部分的に飽和されていてもよい。環は単環、またはベンゼン環または単環へテロアリール環と縮合した２環式ヘテロアリールであってもよい。環を構成する原子の数は、例えば４～１５であり、好ましくは、５～１４、さらに好ましくは、６～１０である。ヘテロアリールの例としては、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられ、好ましくはインドール－２－イルが挙げられる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体は薬物担体として使用することができ、当該薬物担体は生分解性である。ここで生分解性であるとは、ラットおよび／またはヒトに静脈内投与後、１５日後までの間に、肝臓中において検出される薬物担体が低分子化を起こしていることを意味する。「低分子化を起こしていること」は、肝臓中に存在する薬物担体の大きさを、サイズ排除カラムクロマトグラフィーに付して測定することで判定できる（本願明細書実施例２－３を参照）。この時、肝臓由来の薬物担体のピークトップが、投与前の薬物担体のピークトップと比較して低分子側に移行している（すなわち、カラムクロマトグラムにおける保持時間が長くなる）ならば、薬物担体が生分解性であると判定される。なお、生分解性の薬物担体は、尿、糞等の経路にて体外へ排泄されるため、尿中において低分子化を起こしていることが検出できるケースもあるが、疎水性基を有する本発明のヒアルロン酸誘導体はその疎水性により尿への排泄が抑制されやすいため、煩雑さや検出回数の制限の問題はあるものの、ヒアルロン酸の主な代謝臓器である肝臓における低分子化を検出することが、薬物担体の生分解性を直接的に判定する上で、より好ましい。
　本発明のさらに別の側面によれば、本明細書に定義したヒアルロン酸誘導体であって、当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する基－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２（以下疎水性基とも称する）を有する式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）の繰り返し単位の割合（疎水性基の導入率）が３～５０％である、前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。
　ここで、疎水性基の導入率は、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000031
 により算出される。ここで、「当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位」には、式（Ｉ）および式（ＩＩ）の繰り返し単位、ならびに式（ＩＩｂ）の繰り返し単位が含まれる。当該導入率は、反応条件、例えば試薬の比率により制御することができ、例えば、ＮＭＲ測定などにより決定することができる。
　疎水性基の導入率は、３～５０％であり、好ましくは５～４０％であり、より好ましくは５～３５％であり、さらに好ましくは５～２５％であり、より好ましくは５～２０％であり、さらに好ましくは５～１０％である。
　本発明の１つの態様において、後述する実施例１－４に例示されるように、ヒアルロン酸誘導体は、式（Ｉ）においてＸ１が－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２である。この場合、本発明のヒアルロン酸誘導体中に存在する二糖の繰り返し単位に対する式（Ｉ）の二糖単位の割合は、生分解性及び血中滞留性の両方の特性を有する観点で、例えば７０％以上、好ましくは７５％以上、更に好ましくは９０％以上である。上限は１００％以下であればよい。当該割合の範囲は、例えば、７０～１００％、好ましくは７５～１００％、更に好ましくは９０～１００％である。なお、ヒアルロン酸誘導体は、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位をさらに含んでいてもよい。
　本発明の１つの態様において、ヒアルロン酸誘導体は、後述する実施例１－５に例示されるように、Ｘ１が－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２である式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含まない。この場合、存在する二糖の繰り返し単位における、（Ｉ）で表わされる繰り返し単位の割合、および式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合の和は、７０～１００％、好ましくは８０～１００％、より好ましくは９０～１００％である。
　ここで、存在する二糖の繰り返し単位における式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合は、好ましくは３～５０％、さらに好ましくは５～４０％、さらに好ましくは５～３５％、さらに好ましくは５～２５％、さらに好ましくは５～２０％、さらに好ましくは５～１０％である。また、存在する二糖の繰り返し単位における（Ｉ）で表わされる繰り返し単位の割合は、好ましくは２０～９７％、さらに好ましくは３０～９５％、さらに好ましくは３５～９５％、さらに好ましくは４５～９５％、さらに好ましくは５０～９５％、さらに好ましくは６０～９５％である。
　存在する二糖の繰り返し単位における式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合が５～１０％の時、（Ｉ）で表わされる繰り返し単位の割合は、好ましくは６０～９５％、さらに好ましくは７０～９５％、さらに好ましくは７５～９５％である。
　存在する二糖の繰り返し単位における式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合が２０～４０％、好ましくは２０～３５％の時、（Ｉ）で表わされる繰り返し単位の割合は、好ましくは３０～８０％、さらに好ましくは４５～８０％、さらに好ましくは６０～８０％である。
　存在する二糖の繰り返し単位における式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合が１０～２０％の時、式（Ｉ）で表わされる繰り返し単位の割合は、好ましくは５０～９０％、さらに好ましくは６０～９０％、さらに好ましくは７０～９０％である。
　本発明のヒアルロン酸誘導体を製造するための原料としては、ヒアルロン酸またはその塩を使用することができる。ヒアルロン酸塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩を挙げることができ、特に好ましい塩は、医薬品として繁用されているナトリウム塩である。ＨＡまたはその薬学的に許容される塩は、鶏冠や豚皮下等の生物由来のものを抽出する方法や生物発酵法等の各種公知の方法を用いて製造することができ、あるいは市販のものを購入して（例えば、電気化学工業株式会社、株式会社資生堂、生化学工業株式会社、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍ社等から）入手することも可能である。
　原料として用いられる、式（ＩＩｂ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸（塩を含む）の重量平均分子量は、１ｋＤａ～２，０００ｋＤａが好ましく、３ｋＤａ～１，５００ｋＤａがさらに好ましく、５ｋＤａ～１０００ｋＤａがさらに好ましい。さらに好ましくは１０ｋＤａ～５００ｋＤａ、さらに好ましくは１０ｋＤａ～２００ｋＤａ、さらに好ましくは４５ｋＤａ～２００ｋＤａ、さらに好ましくは５０ｋＤａ～９９ｋＤａである。粒子径や粘度を小さくする、または溶解性を高める場合には、該重量平均分子量は、１ｋＤａ～１００ｋＤａが好ましく、２ｋＤａ～７０ｋＤａがさらに好ましく、３ｋＤａ～５０ｋＤａがさらに好ましく、５ｋＤａ～３０ｋＤａがさらに好ましい。粘度を大きくする、または皮下や関節腔内での滞留性を高める場合には、該重量平均分子量は、４５ｋＤａ～２０００ｋＤａが好ましく、５０ｋＤａ～２０００ｋＤａがさらに好ましく、１００ｋＤａ～１０００ｋＤａがさらに好ましく、２００ｋＤａ～１０００ｋＤａがさらに好ましい。持続性の皮下投与用注射製剤の基材としての観点では、該重量平均分子量は、５ｋＤａ～２００ｋＤａが好ましい。重量平均分子量の具体例としては、例えば、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、５０ｋＤａ、９９ｋＤａ、２３０ｋＤａおよび１０５８ｋＤａが挙げられる。「ｋＤａ」は「キロダルトン」の略号である。
　なお、式（ＩＩｂ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸（塩を含む）の重量平均分子量とは、本発明のヒアルロン酸誘導体の主鎖構造を保持したまま、式（ＩＩｂ）における、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂの全てを水素原子とし、Ｒ５ｂをアセチルとし、かつ、Ｘｂを－Ｏ－Ｎａ＋として換算した場合の重量平均分子量を意味する。従って、例えば、実際に用いる原料における一部又は全ての二糖単位においてＸｂが－Ｏ－（テトラｎ－ブチルアンモニウムイオン）であり、その重量平均分子量を上記に従って換算して４５ｋＤａ～２００ｋＤａと算出される場合は、本発明の好ましい１態様に含まれることになる。
　なお、一般的に、ヒアルロン酸（塩を含む）は単一品として得ることが難しいため、その分子量は、数平均分子量または重量平均分子量として算出する。本発明においては、重量平均分子量として算出している。重量平均分子量の測定方法については、例えば、中浜精一他著「エッセンシャル高分子科学」（講談社発行、ＩＳＢＮ４－０６－１５３３１０－Ｘ）に記載された、光散乱法、浸透圧法、粘度法等、各種の公知の方法を利用することができ、本明細書において示される粘度平均分子量もウベローデ粘度計を使用するなど、本発明が属する技術分野において通常用いられる方法により測定することができる。従って、原料として用いられるヒアルロン酸（塩を含む）や本発明のヒアルロン酸誘導体の分子量も、重量平均分子量として算出されることになる。分子量を明示して市販されているヒアルロン酸（塩を含む）を使用する場合は、その明示された数値を分子量とすることもできる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体の分子量は特に限定はされないが、局所投与における拡散遅延由来の徐放機能を期待する場合には粘度および分子量の高いヒアルロン酸が好ましく、最終剤形が溶液製剤の場合、スムーズな投与のため粘度および分子量の低いヒアルロン酸が好ましい。
　式（Ｉ）で表される二糖単位を含む本発明のヒアルロン酸誘導体は、グルクロン酸部分のカルボキシをアミドに変換することにより製造することができる。例えば、原料のヒアルロン酸（塩などを含む）、好ましくは、式（ＩＩｂ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と式：ＨＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＯＲｚ（式中、Ｒｚは、カルボキシを保護するためのエステル形成基であり、Ｒ６、およびＲａは本明細書に既に定義されたとおりである）または式：ＨＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７、およびＲ８は本明細書に既に定義されたとおりである）で表される化合物とを反応させ、保護基が存在する場合は脱保護をおこなう方法が挙げられる(工程１)。ここでエステル形成基は特に限定されず、カルボキシの保護に通常用いられる基であれば特に限定されない。エステル形成基の例としては、Ｃ１－６アルキル、ベンジル、Ｃ１－６アルコキシＣ１－６アルキル、およびベンジルオキシＣ１－６アルキルなどが挙げられる。
　式（Ｉ）における基：－ＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＯＲｚおよび－ＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＮＲ７Ｒ８は、複数存在する二糖単位の各々において同一であっても異なっていてもよい。例えば、異なる種類の式：ＨＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＯＲｚおよび／またはＨＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＮＲ７Ｒ８で表される化合物を用いて上記反応を行ってもよい。
　上記の反応において使用することができる縮合剤は特に限定されず、例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）－４－メチルモルホリウム（ＤＭＴ－ＭＭ）、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２－ベンゾトリアゾール－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール－１－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などを挙げることができる。
　特に、限定はされないが、ＤＭＴ－ＭＭは水および有機溶媒の混合溶媒中でも反応が高効率に進む点において好ましい。また、ＤＭＴ－ＭＭを縮合剤として使用することにより、多数のヒドロキシが共存する系において、エステル結合形成を抑えつつ、高選択的にアミノとカルボキシによるアミド結合形成を行うことができる。この縮合剤の使用により、例えば、溶媒であるアルコールがヒアルロン酸部分のカルボキシと反応することや、ヒアルロン酸部分に同時に存在するカルボキシとヒドロキシとが、分子内もしくは分子間で結合して、望まない架橋を形成してしまうことを防ぐことができる。
　上記反応において用いる溶媒としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、スルホラン（ＳＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジオキサン（例えば１，４－ジオキサン）、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、およびこれらの混合溶媒を挙げることができる。出発物質、修飾物および生成物の溶解性と、縮合剤の反応性の観点からは、ＤＭＳＯ単独もしくは水／ＤＭＳＯ混合溶媒を使用するのが好ましい。修飾物であるアミノ－カルボン酸の種類によっては、それをメタノール溶液やジオキサン溶液として反応に用いてもよい。
　式：ＨＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＯＲｚで表される化合物として、例えば、アラニンエステル、セリンエステル、グリシンエステル、スレオニンエステル、アスパラギンエステル、アスパラギン酸ジエステル、バリンエステル、ロイシンエステル、イソロイシンエステル、グルタミン酸ジエステル、メチオニンエステル、グルタミンエステル、フェニルアラニンエステル、チロシンエステル、およびトリプトファンエステルなどが挙げられる。ここで、上記のエステルは、例えばＣ１－６アルキルエステル、アリールエステル、Ｃ１－６アルコキシＣ１－６アルキルエステル、アリールＣ１－６アルキルエステルなどであり、好ましくは、メチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステルなどである。
　式：ＨＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＮＲ７Ｒ８で表される化合物として、例えば、アラニンアミド、セリンアミド、グリシンアミド、スレオニンアミド、アスパラギンアミド、アスパラギン酸ジアミド、バリンアミド、ロイシンアミド、イソロイシンアミド、グルタミン酸ジアミド、メチオニンアミド、グルタミンアミド、フェニルアラニンアミド、チロシンアミド、およびトリプトファンアミドなどが挙げられる。
　疎水性基は、グルクロン酸のカルボキシまたは式（Ｉ）の基－ＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＯＨをアミドに変換して導入することができる（工程２）。例えば、原料のヒアルロン酸またはその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と式：ＨＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２（式中、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は本明細書で既に定義したとおりである）で表される疎水性基を導入したアミンとを反応させる方法が挙げられる。
　上記の反応において使用することができる縮合剤は特に限定されず、例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）－４－メチルモルホリウム（ＤＭＴ－ＭＭ）、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２－ベンゾトリアゾール－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール－１－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）または１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などを挙げることができる。
　疎水性基導入反応において用いる溶媒としては、水、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、およびこれらの混合溶媒を挙げることができる。
　あるいは、グルクロン酸のカルボキシまたは式（Ｉ）の基－ＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＯＨのカルボキシを、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩とスペーサー部分を反応させ（この際、必要に応じて保護及び脱保護反応を行ってもよい）、カルボキシ（－ＣＯＯＨ）を変換し、その後に適当な試薬と反応させてもよい。カルボキシから変換される基と、反応試薬の組み合わせの例を以下に示す。
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯＺ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＮＲｂＨ　＋　ＨＯＣＯ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＣＯＯＨ　＋　ＨＯ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＯＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＣＯＯＨ　＋　ＮＲｃ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＯＣＯ－Ｈａｌ　＋　ＮＲｃ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＯＣＯＯＨ　＋　ＨＯ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＯＣＯＯＨ　＋　Ｈａｌ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＯＣＯ－Ｈａｌ　＋　ＨＯ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＳＨ　＋　Ｈａｌ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－Ｈａｌ　＋　ＨＳ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＣＯ－Ｙａ－Ｈａｌ　＋　ＨＳ－Ｚ３
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＣＯ－Ｙａ－ＳＨ　＋　Ｈａｌ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ＝ＣＨ２　＋　ＨＳ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２　＋　ＨＳ－Ｚ３、
　－ＣＯＮＲ９－Ｚ１－ＳＨ　＋　ＨＳ－Ｒ、
（式中、Ｒ９、Ｚ１、Ｒｂ、ＲｃおよびＺ３は本明細書で既に定義したとおりであり、Ｈａｌは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素から選択されるハロゲン原子を表す）。
　反応様式としては、脱ハロゲン化水素反応、縮合反応、脱水反応、マイケル付加等の求核付加反応、酸化的なジスルフィド形成反応等が挙げられ、これらは周知な反応であり、当業者が適宜選択し、好ましい反応条件を見出して行うことができる。変換体または反応物がカルボキシを有する場合は、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（以下、「ＮＨＳ」とも称す）エステルとし、反応させてもよい。
　また、グルクロン酸のカルボキシまたは式（Ｉ）の基－ＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＯＨのカルボキシに、２－アミノエチル　２－ピリジル　ジスルフィドを反応させて、末端に脱離基で修飾されたメルカプトを有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体を調製し、これにチオコレステロールを求核置換反応させてジスルフィド結合を形成する方法を挙げることもできる。
　さらに、グルクロン酸のカルボキシまたは式（Ｉ）の基－ＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＯＨのカルボキシにスペーサーの一部を導入したものと、ステリル基にスペーサーの一部を導入したものを調製し、これらを反応させる方法を挙げることもできる。具体例の一部は上述したが、さらに、Ｙに－Ｓ－Ｓ－が挿入されている場合は、グルクロン酸のカルボキシまたは式（Ｉ）の基－ＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＯＨのカルボキシに、末端にメルカプトを有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体と、末端にメルカプトを有するスペーサーが導入されたステリル基をそれぞれ調製し、これらを酸化的に反応させてジスルフィド結合を形成させる方法を挙げることもできる。このとき、一方のメルカプトを２－メルカプトピリジンと反応させてジスルフィドとした後に、他方のメルカプトと置換させることもできる。
　工程１と工程２の順番は問われない。例えば、原料のヒアルロン酸（塩などを含む）、好ましくは、式（ＩＩｂ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と式：ＨＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２（式中、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は本明細書で既に定義したとおりである）で表される疎水性基を導入したアミンとを反応させ、次いで、適当な縮合剤存在下、溶媒中で、当該反応物と式：ＨＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＯＲｚ（式中、Ｒｚは、カルボキシを保護するためのエステル形成基であり、Ｒ６、およびＲａは本明細書に既に定義されたとおりである）または式：ＨＮＲ６－ＣＨＲａ－ＣＯＮＲ７Ｒ８（式中、Ｒ７、およびＲ８は本明細書に既に定義されたとおりである）で表される化合物とを反応させてもよい。
　本発明の１つの態様において、ヒアルロン酸誘導体は、式（ＩＩｂ）で表わされる繰り返し単位および式（Ｉａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 ［式中、Ｘａは、ヒドロキシ、－Ｏ－Ｑ＋、Ｃ１－６アルコキシおよび－ＮＲ７Ｒ８から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｑ＋、およびＲａは、本明細書で既に定義されたとおりである］
で表わされる繰り返し単位をそれぞれ含むヒアルロン酸誘導体を、以下の式
　　ＨＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２
［式中、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は、本明細書で既に定義されたとおりである］
で表わされる化合物と反応させることにより得られる。
　反応は、カルボキシ（塩を含む）とアミノとを縮合させ、カルボキシをアミドに変換することにより行われ、工程２と同様の方法を用いることができる。
　本発明は、以下の式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位を含んでいてもよい。従って、本発明の１つの態様において、（ａ）式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）、（ｂ）式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）、（ｃ）式（Ｉ）および式（ＩＩｂ）および式（ＩＩＩ）、または（ｄ）式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩｂ）および式（ＩＩＩ）で表される１以上の二糖単位をそれぞれ含むヒアルロン酸誘導体が提供される。
　式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 ［式中、Ｒ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃ、およびＲ４ｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
　Ｒ５ｃは、水素原子、ホルミルまたはＣ１－６アルキルカルボニルであり；
　Ｒｅは、水素原子またはＣ１－６アルキルであり；
　Ｒｄは、水素原子、Ｃ１－６アルキル、－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１０）＝ＣＨ２、または－ＣＯ－Ｇ４－Ｘｃであり； 
　Ｒ１０は、水素原子またはメチルであり；
　Ｇ４は、フェニレン、Ｃ３－８シクロアルキレン、または－Ｇ５－（Ｃ１－１０アルキレン）－Ｇ６－から選択され、ここでＣ１－１０アルキレン部分は、１～３のフェニレンまたはＣ３－８シクロアルキレンが挿入されていてもよく；
　Ｇ５およびＧ６は、それぞれ独立に、直接結合、フェニレン、またはＣ３－８シクロアルキレンから選択され；
　Ｘｃは、メルカプト、ハロゲン原子または式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 で表される基であり；
　Ｙｂは、－ＣＨ２－（ＣＨＲ１５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ－、－ＣＨ２－（ＣＨＲ１６）ｐ－２－ＣＨ２－Ｏ－、－（ＣＨ２）ｊ－Ｓ－または－（ＣＨ２）ａ－（Ｙ１－（ＣＨ２）ｂ）ｃ－Ｇ－であり；
　ｌ、ｐ、およびｊは、それぞれ独立に２～１０から選択される整数であり、Ｒ１５およびＲ１６は、それぞれ独立に、水素原子またはヒドロキシであり；
　ａは、２～１０から選択される整数であり；
　ｂは、それぞれ独立に２～１０から選択される整数であり；
　ｃは、１～２００から選択される整数であり；
　Ｙ１は、酸素原子または－ＮＲｎ－であり；
　Ｇは、酸素原子、硫黄原子または－ＮＨ－であり；
　Ｒｎは、水素原子、Ｃ１－６アルキル、－ＣＯ－（ＣＨ２）ｄ－Ｒｏ、－（ＣＨ２）ｅ－Ｒｐまたは－（ＣＨ２）ｆ－（Ｙ２－（ＣＨ２）ｇ）ｈ－Ｒｑであり；
　ｇは、それぞれ独立に、２～１０から選択される整数であり；
　ｄ、ｅ、ｆおよびｈは、それぞれ独立に、２～１０から選択される整数であり；
　Ｒｏ，ＲｐおよびＲｑは、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシ、カルボキシまたは－ＮＨＲｒであり；
　Ｙ２は、酸素原子または－ＮＨ－であり；
　Ｒｒは、水素原子、ホルミルまたはＣ１－６アルキルカルボニルである］
で表される二糖単位。
　式（ＩＩＩ）で表される二糖単位を含む本発明のヒアルロン酸誘導体を製造する方法としては、例えば、上記のヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩と、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と式：ＨＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｗ（式中、Ｒｗは、水素原子、Ｃ１－６アルキル、－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１０）＝ＣＨ２、－ＣＯ－Ｇ４－Ｘｃ、ヒドロキシの保護基、アミノの保護基、またはメルカプトの保護基であり、Ｒｅ、Ｙｂ、Ｒ１０、Ｇ４、およびＸｃは本明細書に既に定義されたとおりである）で表される化合物とを反応させ、保護基が存在する場合は脱保護をおこなう方法が挙げられる。上記反応では本明細書に既に記載した縮合剤および溶媒を使用することができる。
　－ＣＯ－Ｇ４－Ｘｃの具体例としては、以下の式で表される基が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　上記反応において用いられる保護基の具体例は、例えばＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９９に記載されている。
　ヒドロキシの保護基の例としては、Ｃ１－６アルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、Ｃ１－６アルコキシカルボニル、Ｃ１－６アルコキシＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１－６アルキル）アミノカルボニル、アリールＣ１－６アルキル、ヘテロアリールＣ１－６アルキル、アリールＣ１－６アルキルアミノカルボニル、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキルスルホニル、（（アミノＣ１－６アルキル）カルボニルオキシ）Ｃ１－６アルキル、不飽和ヘテロ環カルボニルオキシＣ１－６アルキル、アリールジ（Ｃ１－６アルキル）シリル、トリ（Ｃ１－６アルキル）シリルなどが挙げられる。好ましいヒドロキシの保護基としては、アセチルなどが挙げられる。
　－ＮＨ－またはアミノの保護基の例には、Ｃ１－６アルキルカルボニル、アリールＣ１－６アルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、Ｃ１－６アルコキシカルボニル、Ｃ１－６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１－６アルキル）アミノカルボニル、アリールＣ１－６アルキル、ヘテロアリールＣ１－６アルキル、（アリールＣ１－６アルキル）アミノカルボニルなどが含まれる。好ましいアミノの保護基としては、アセチル、ｔ－ブトキシカルボニル、９－フルオレニルメトキシカルボニルなどが挙げられる。また、アミノは保護されることにより、フタル酸イミド、コハク酸イミド、グルタル酸イミド、１－ピロリルなどの飽和または不飽和へテロ環基を形成していてもよい。
　メルカプトの保護基としては、例えば、エチルチオおよびｔ－ブチルチオ等のＣ１－６アルキルチオ、２－ニトロフェニルチオおよび２－カルボキシフェニルチオ等の置換フェニルチオ、並びに２－ピリジルチオ等のヘテロアリールチオが挙げられる。好ましい例は、２－ピリジルチオである。
　上記式（ＩＩＩ）の－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄで表される基の例としては、式：
　－ＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ１５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ２；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨ２；
　－ＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ１６）ｐ－２－ＣＨ２－ＯＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＯＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｊ－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１０）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｌ－ＮＨＣＯ－Ｃ（Ｒ１０）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ１５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｕ－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｌ－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２）ｕ－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ１５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｂｒ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｉ；
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨＣＯ－Ｃ（Ｒ１０）＝ＣＨ２；または
　－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－（Ｙ１－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１０）＝ＣＨ２
［式中、Ｒ１０、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｙ１、ｃ、ｊ、ｌ、およびｐは、本明細書で定義されるとおりであり、ｕは、１～３の整数である］
で表される基が挙げられる。
　ここで、ヒアルロン酸誘導体の分子中に含まれる、Ｒ１５およびＲ１６がヒドロキシであるＣＨＲ１５およびＣＨＲ１６の個数は、それぞれ０～８であるが、好ましくは０～３、さらに好ましくは０および１である。Ｒ１５およびＲ１６がヒドロキシであるＣＨＲ１５およびＣＨＲ１６の個数を調節することで、本発明のヒアルロン酸誘導体の、水に対する溶解度を調節することができる。Ｒ１５がすべて水素原子の場合、ｌとしては２～６が好ましく、その具体例として２および６が挙げられる。Ｒ１５の１つがヒドロキシである場合、ｌの具体例としては３が挙げられる。Ｙ１が酸素原子の場合、ｃの具体例としては２が挙げられる。Ｙ１が－ＮＨ－の場合、ｃの具体例としては１～３が挙げられる。ｌおよびｐの具体例としては３が挙げられる。
　－（ＣＨ２）ａ－（Ｙ１－（ＣＨ２）ｂ）ｃ－Ｇ－の具体例としては、例えば、－（ＣＨ２）２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）３－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２）ｃ－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－、－（ＣＨ２）３－ＮＲｎ－（ＣＨ２）４－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－ＮＲｎ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－、－（ＣＨ２）６－ＮＲｎ－（ＣＨ２）６－Ｏ－、－（ＣＨ２）６－ＮＲｎ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－、－（ＣＨ２）３－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）３－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－、－（ＣＨ２）３－ＮＲｎ－（ＣＨ２）４－ＮＲｎ－（ＣＨ２）３－Ｏ－、－（ＣＨ２）３－ＮＲｎ－（ＣＨ２）４－ＮＲｎ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（スペルミン型）、－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－Ｏ－、－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＲｎ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－、が挙げられる。ここで、Ｒｎとしては、全てが水素原子であるのが好ましい。
　これら－（ＣＨ２）ａ－（Ｙ１－（ＣＨ２）ｂ）ｃ－Ｇ－に結合するＲｄの具体例としては、例えば、水素原子、－ＣＯ－ＣＨ＝ＣＨ２、－ＣＯ－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、－ＣＯ－ＣＨ２－Ｃｌ、－ＣＯ－ＣＨ２－Ｂｒ、－ＣＯ－ＣＨ２－Ｉ、－ＣＯ－ＣＨ２－ＳＨ、－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ等が挙げられる。
　また、－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄで表される基の具体例として、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－Ｎ（－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨＣＯＣＨ３）－（ＣＨ２）２－ＳＨ、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨＣＯＣＨ３）－（ＣＨ２）３－ＳＨおよび－ＮＨ－（ＣＨ２）５－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨＣＯＣＨ３）－（ＣＨ２）２－ＳＨが挙げられる。
　さらにまた、－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄで表される基の具体例として、以下の基も挙げられる：
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）４－ＣＯ－ＮＨ－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；および
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＣＯＮＨ－ＣＨ（ＣＯＮＨ－ＣＨ２－ＣＯ２Ｈ）－ＣＨ２－ＳＨ
（ここで、Ｒ１７は、水素原子またはＣ１－６アルキルであり、ｐ１は２～１０の整数、ｑは１～２００の整数を、それぞれ表す。）
　存在する二糖の繰り返し単位における、式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位の割合は、例えば０．１～９９．５％であり、好ましくは１～３０％である。
　式（ＩＩＩ）で表される二糖単位を含む本発明のヒアルロン酸誘導体を製造する方法として、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシ（－ＣＯＯＨ）を、式：Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＲ１５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ２で表されるジアミンと反応させて式：－ＣＯＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ１５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨ２で表されるアミドに変換し、さらに末端のアミノを修飾して基：－ＣＯＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ１５）ｌ－２－ＣＨ２－ＮＨＲｄで表されるアミドに変換する方法（工程３ａ）が挙げられる。
　上記ジアミンの具体例としては、例えば、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）３－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）４－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）５－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）６－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）７－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）８－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）９－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）１０－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－ＣＨ２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ）２－ＣＨ２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）３－ＣＨ２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－（ＣＨ２）３－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－（ＣＨＯＨ）２－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）３－（ＣＨ２）２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）３－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ２、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ２およびＨ２Ｎ－（ＣＨ２）５－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ２が挙げられる。
　式（ＩＩＩ）で表される二糖単位を含む本発明のヒアルロン酸誘導体を製造する方法として、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシ（－ＣＯＯＨ）を、式：Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＲ１６）ｐ－２－ＣＨ２－ＯＨで表されるヒドロキシアミンと反応させて式：－ＣＯＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ１６）ｐ－２－ＣＨ２－ＯＨで表されるアミドに変換し、さらに末端のアミノを修飾して基：－ＣＯＮＨ－ＣＨ２－（ＣＨＲ１６）ｐ－２－ＣＨ２－ＯＲｄで表されるアミドに変換する方法（工程３ｂ）が挙げられる。工程３ａと工程３ｂとを併せて工程３と称する。
　上記ヒドロキシアミンの具体例としては、例えば、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）３－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）４－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）５－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）６－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）７－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）８－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）９－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）１０－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－ＣＨ２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）３－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－（ＣＨ２）２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２－ＣＨＯＨ）２－ＣＨ２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）３－ＣＨ２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）３－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－（ＣＨ２）３－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－（ＣＨＯＨ）２－（ＣＨ２）２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）３－（ＣＨ２）２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－ＣＨ２－（ＣＨＯＨ）２－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）３－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＯＨ、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）２－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）６－ＯＨおよびＨ２Ｎ－（ＣＨ２）５－ＣＨＯＨ－（ＣＨ２）４－ＯＨが挙げられる。
　なお、これらの化合物は例えばシグマ－アルドリッチ社などから市販されており、適宜購入して利用することができる。また、文献記載の方法に従い、もしくは文献記載の方法を参考にして合成してもよい。
　式（ＩＩＩ）における基：－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄは、複数存在する二糖単位の各々において同一であっても異なっていてもよい。例えば、異なる種類の式：ＨＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄで表される化合物を用いて上記反応を行ってもよい。
　式（Ｉ）におけるＸ１がヒドロキシ、－Ｏ－Ｑ＋またはＣ１－６アルコキシである場合、基－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄは、式（ＩＩＩ）で表される二糖単位中に示した位置に存在するばかりでなく、その一部又は全部が、式（Ｉ）におけるＸ１と置換して、Ｘ１が、－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄとなってもよい。
　工程１、工程２及び工程３の順番は問われない。好ましい順番としては、工程１、工程２、そして工程３の順番、工程２、工程１、そして工程３の順番、及び、工程１、工程３、そして工程２の順番が挙げられる。
　式（ＩＩＩ）で表される二糖単位において反応性の炭素－炭素二重結合を含むヒアルロン酸誘導体は、２以上のメルカプトを有する架橋剤（例えば、ジチオスレイトール：ＤＴＴ、ブタンジチオール、ポリエチレングリコールジチオール）との架橋反応に供することができる。また、式（ＩＩＩ）で表される二糖単位においてメルカプトを含むヒアルロン酸誘導体は、２以上のメルカプトを有する架橋剤（例えば、ジチオスレイトール：ＤＴＴ、ブタンジチオール、ポリエチレングリコールジチオール）とのジスルフィド形成による架橋反応、または反応性の炭素－炭素二重結合を２以上含む架橋剤（例えばジビニルスルホン）を使用する架橋反応に供することができる。架橋反応を行うことで、本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化することができる。
　架橋反応の他の事例としては、アミノにより修飾したヒアルロン酸誘導体と、Ｃ２－２０アルキレンの両端にスクシンイミジルエステルやその他のイミドエステルを有する架橋剤（例えば、ビス［スルフォスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ３）、エチレングリコール－ビス［スルフォスクシンイミジル］スクシネート（Ｓｕｌｆｏ－ＥＧＳ）、ジメチルアジピミデート塩酸塩（ＤＭＡ）など）とので縮合反応による架橋；アミノにより修飾したヒアルロン酸誘導体と、Ｃ２－２０アルキレンの両端にホルミルを有する架橋剤（例えば、グルタルアルデヒドなど）との架橋；メルカプトにより修飾したヒアルロン酸誘導体の酸化条件下（例えば、テトラチオネートナトリウム（ＳＴＴ）存在下など）での酸化反応による架橋；メルカプトにより修飾したヒアルロン酸誘導体と、Ｃ２－２０アルキレンの両端にマレイミド（ＭＡＬ）やメタクリロイルなどの不飽和結合を有する架橋剤（例えば、１，４－ビス－マレイミドブタン（ＢＭＢ）、ジメタクリル酸エチレン（ＥＤＭＡ）など）とのマイケル付加反応による架橋；アルクロイルおよびメタクリロイルなどの不飽和結合により修飾したヒアルロン酸誘導体と各種重合開始剤（例えば、ペルオキソ二硫酸カリウム（ＫＰＳ）／Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９など）とのラジカル重合による架橋；ジアミン化合物（例えば、ＥＤＡ、２，２’－（エチレンジオキシ）ビス（エチレンジアミン）など）共存下、縮合剤（例えば、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）－４－メチルモルホリウムクロライド（ＤＭＴ-ＭＭ）、２－ベンゾトリアゾール－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール－１－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）など）による架橋が挙げられる。上記の架橋形成は、ヒアルロン酸誘導体の分子内であっても、複数のヒアルロン酸誘導体の分子間であってもよい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体を、化学架橋によりゲル化させる工程は、適宜その条件を選択してもよい。架橋の条件とは、架橋方法、ポリマー濃度、架橋剤濃度、溶媒、溶媒ｐＨ、塩濃度、温度、時間などがある。
　本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程において、架橋形成の反応条件の中で、例えば化学架橋時のポリマー濃度および架橋形成が可能な基の導入率を高くすることで、生成するゲルの架橋密度を高くすることが可能である。
　本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程における、ヒアルロン酸誘導体に対する架橋剤の比は、両端に架橋形成が可能な基を有するものを使用する場合、当該基が過不足なく速やかに架橋反応に関与できるような比（例えばモル比）で添加することが好ましい。例えば、メタクリロイル（ＭＡ基）を導入したポリマーをＤＴＴを用いてマイケル付加反応により架橋する場合のモル比は、ＭＡ基：ＳＨ基＝３：１～１：３が好ましく、２：１～１：２が特に好ましい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程における溶媒は、ポリマーおよび架橋剤を充分に溶解することができるものが好ましく、特に限定されないが、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）およびこれらから選択される混合溶媒を用いることが好ましい。また、これらの溶媒に混和する有機溶媒を混合して使用することも可能である。特に限定されないが、混和する有機溶媒としては例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルが有する化学架橋構造は生体内で分解する構造を含んでいてもよい。特に限定されないが、例えば架橋反応に供する基として、エステル結合およびメタクリロイルを有する基を用いてもよい。また、架橋剤として、Ｓｕｌｆｏ－ＥＧＳやＥＤＭＡなど、エステル結合を有する化合物、または生体内の酵素によって分解されるペプチドスペーサーを有する化合物を用いてもよい。また、メルカプトの酸化によって形成するジスルフィド結合によって架橋したゲルは、ジスルフィド交換反応や還元反応によって、生体で分解される。分解性の化学架橋構造を有することで、本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルの生体内での分解速度を制御することができ、これによって薬物の放出速度も制御することが可能である。
　本発明のヒアルロン酸誘導体は、水溶液中においてナノ微粒子を形成するため、希薄な条件化において架橋することにより、ナノサイズの微粒子ゲルを形成することができ、血中除放キャリア、ターゲティングキャリアとして用いることができる。希薄な条件とは１０ｍｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以下である。一方、高濃度な条件下において架橋することにより、微粒子同士が架橋した、バルク状のゲルを形成することができる。これは皮下徐放型のキャリアとして有用である。高濃度な条件とは５ｍｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｍＬである。
　本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程は、バルクで行ってもよく、エマルション中や噴霧液滴中などの不連続相中で行ってもよい。例えば、Ｗ／Ｏエマルション中で行う場合は、ポリマーや架橋剤などを溶解させた水相を、水に混和しない溶媒中に乳化し、ゲル化反応を行えばよい。水に混和しない溶媒とは、特に限定されないが、例えばヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）、流動パラフィン、大豆油などが挙げられる。乳化を安定化するための界面活性剤を添加してもよい。また、例えば、超臨界二酸化炭素中やＰＥＧ中など脱溶媒が可能な溶媒中で行ってもよい。この場合は、ポリマーや架橋剤などを溶解させた水相や有機溶媒相を、前例の溶媒中に乳化、分散することで、脱溶媒（溶媒拡散）に伴うポリマーの濃縮が成されることから、より高い架橋密度のゲルを得ることが可能になる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程、およびその後に、架橋反応を停止する操作および残存した架橋性官能基を失活もしくは洗浄する操作を行ってもよい。反応に関与しなかった架橋性官能基、架橋剤の片端のみが結合した基、残存した架橋剤などは、安全性の観点、保存中安定性の観点、封入される薬物との副反応などの観点から除去した方が好ましい。特に限定されないが、例えば、未反応の架橋剤が残存している場合は、過剰の水などで洗浄することで除去してもよい。また、例えばポリマーに置換したメタクリロイルが残存する場合は、過剰のメルカプトエタノールなどを添加し、メタクリロイルを失活させた後、過剰の水などで余剰のメルカプトエタノールを洗浄することで除去してもよい。さらには、例えばメルカプトが残存する場合は、過剰の３－マレイミドプロピオン酸、ヨード酢酸などを添加し、メルカプトを失活させた後、過剰の水などで余剰の３－マレイミドプロピオン酸、ヨード酢酸を洗浄することで除去してもよい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程の後に、粉砕工程を行ってもよい。粉砕方法としては、乳棒と乳鉢を用いる粉砕やミルを用いる粉砕が挙げられるが、ミルを用いる粉砕が好ましい。ミル粉砕装置としては、遠心式粉砕機（日本精機製作所）およびインパクトミル（株式会社ダルトン）等の回転円板型の粉砕装置、アトマイザー（東京アトマイザー製造株式会社）、サンプルミル（東京アトマイザー製造株式会社）、バンタムミル（東京アトマイザー製造株式会社）、およびＳＫミル（トッケン）等のスクリーンミルの粉砕装置、超微少量ラボジェットミル（Ａ－Ｏジェットミル、セイシン企業）等のジェット粉砕装置、並びに、超低温での粉砕が可能なリンレックスミル（リキッドガス株式会社）等が挙げられるが、ＳＫミルおよびリンレックスミルが好ましい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程の後に、乾燥工程を行ってもよい。乾燥方法としては、例えば通風乾燥、恒温槽中での乾燥、減圧乾燥、熱風循環式乾燥などが挙げられる。風速、乾燥時間、温度、圧力などは本発明のゲルが分解や変質を生じない範囲で適宜選択される。
　本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルに薬物を封入することで医薬組成物とすることができる。本発明の１つの側面において、（ａ）式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）、（ｂ）式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）、（ｃ）式（Ｉ）および式（ＩＩｂ）および式（ＩＩＩ）、または（ｄ）式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩｂ）および式（ＩＩＩ）で表される１以上の二糖単位をそれぞれ含むヒアルロン酸誘導体を、架橋剤を用いて架橋し、ゲル化して、薬物（低分子化合物、タンパク質、ペプチド、または核酸）を封入するための担体として使用することができる。薬物封入方法として、あらかじめ架橋されたヒアルロン酸誘導体ゲルに薬物溶液を添加する方法が挙げられる。当該方法では、まず、膨潤したゲル内部へ拡散によって薬物が吸収され、吸収された薬物は、ヒアルロン酸誘導体ゲルの疎水性相互作用による物理架橋ドメインに保持されることによって薬物が封入される。特に限定されないが、溶媒、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、変性剤の添加などの条件は、薬物が安定でかつ高収率で封入されるように適宜選択してよい。例えば、薬物封入時の塩濃度やｐＨによって、ヒアルロン酸誘導体ゲルの膨潤度や密度が変化し、薬物の電離状態なども変わるため、その組み合わせによって適宜、適した条件を使用すればよい。薬物の封入を低塩濃度下で行うことで、ヒアルロン酸誘導体のカルボキシ同士の静電反発を利用し、ゲル密度を減少させ、薬物封入量を増加させることや、より高分子量の薬物を封入することができる。薬物封入後、塩濃度を上昇させることにより静電反発を弱め、ゲル密度を上昇させ、ゲル網目を薬物サイズより小さくすることにより、強固に薬物を保持し、放出を遅らせることが可能となる。この際、塩濃度を生理塩濃度とすることもできる。
　また、薬物封入方法として、本発明のヒアルロン酸誘導体に薬物を複合化させた後、架橋することでゲル化させる方法が挙げられる。特に限定されないが、複合化の際の溶媒、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、変性剤の添加、前記親水性多糖類誘導体濃度、薬物濃度、ＨＰと薬物の比率などの条件は、薬物が安定でかつ高収率でナノゲルと複合化されるように適宜選択してもよい。複合化されなかったフリーの薬物は、透析法やサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）法などで分離、除去すればよい。架橋の際は、封入された薬物が変性しない架橋条件を用いることが好ましい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルに封入された薬物は、薬物のゲル中における単純拡散、ヒアルロン酸誘導体のゲルの分解、および生体成分と薬物の置換によって放出される。薬物の拡散によって薬物放出がなされる場合には、ゲルの架橋密度、および架橋ドメインの量やその疎水性の強さによってその速度を制御することが可能である。ゲルの分解とは、例えば、化学架橋ドメインの分解、ヒアルロン酸誘導体の骨格の分解などがある。これらの分解により、架橋密度の低下（膨潤率の増大）が生じる。架橋密度が低下すると、ゲル中の薬物の拡散速度が加速されるため放出が促進され、また結合が切れることによっても放出が促進される。このため、化学架橋ドメインの分解性、ポリマー骨格の分解性、スペーサーの分解性などを制御することによって、薬物放出速度を制御することが可能である。
　生体成分との置換とは、例えば、ゲルを皮下や血中などの生体内に投与した場合、アルブミンなどの血漿タンパク質や脂質などが存在し、これらがゲル中に浸潤、封入されている薬物と置換されることにより薬物が放出される場合を意味する。本発明のヒアルロン酸誘導体のゲルは、疎水性基同士による物理的な架橋だけでなく、前記の化学架橋により、生体成分の浸潤に伴う薬物との置換を抑制することが可能である。生体成分の浸潤は、ゲルの架橋密度、ゲル中の電荷などによってその速度を制御することが可能である。なお、前記の架橋によるゲルの形成後に薬物溶液を添加して薬物封入をする場合は、封入時に薬物はゲル中に吸収されやすく、生体内では生体成分の浸潤が抑制されるように、その封入条件を適宜選択することができる。特に限定されないが、例えば、タンパク質を封入する場合、その等電点付近で封入工程行うことで、ヒアルロン酸誘導体と薬物の静電反発を抑制することができる。また、ヒアルロン酸に含まれるグルクロン酸由来のカルボン酸のｐＫａ（およそ４．０）以下で封入工程を行うことで、ゲルが持つ負電荷を弱めることができるので、その条件で負電荷に帯電しているタンパク質との静電反発が抑制され、封入効率の向上が可能となる。また、例えば生体内よりも低い塩濃度において封入工程を行うことで、生体内よりもゲルの膨潤率が高くなるため、封入が容易となる。
　さらに、本発明の疎水性基と架橋性官能基を同時に導入したヒアルロン酸誘導体の化学架橋によるゲル化を、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体の共存下で、行うことができる。具体的には、疎水性基および不飽和結合を有する官能基を導入した本発明のヒアルロン酸誘導体と、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を混合し、架橋することにより、疎水性基を有する親水性多糖類誘導体を物理的に封入した、ヒアルロン酸誘導体ゲルが調製できる。
　疎水性基を有する親水性多糖類誘導体とは、親水性多糖類およびその誘導体に、多糖１分子あたり少なくとも１分子以上の疎水性基を導入して得ることができる親水性多糖類である。親水性多糖類としては特に限定されないが、好ましくはプルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、デキストリンであり、これらは市販されているか、文献記載の方法に従い、種々の平均分子量を有するものを入手することもできる。親水性多糖類として特に好ましいものは、プルラン、ヒアルロン酸、デキストリンである。デキストリンとしてはクラスターデキストリン（登録商標）が好ましい。クラスターデキストリン（登録商標）は、江崎グリコ株式会社から販売されているものを購入して使用することができる。疎水性基としては特に限定されないが、好ましくはＣ８－５０の炭化水素基、ステリル基、ポリ乳酸（ＰＬＡ）基、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）基などの基またはこれらの基を含む基であり、特に好ましくはコレステリル基を含む基、Ｃ８－３０の直鎖または分岐アルキルまたは当該基を含む基である。疎水性基はスペーサーを介して導入されていてもよい。
　疎水性基を有する親水性多糖類誘導体には、本発明のヒアルロン酸誘導体も含まれる。すなわち、本発明のヒアルロン酸誘導体からなる微粒子を適当なゲルに封入しても良い。
　疎水性基を有する親水性多糖類誘導体は各種公知の方法により製造することができる。また、親水性多糖類としてプルランのヒドロキシに、疎水性基としてＮ－［６－（コレステリルオキシカルボニルアミノ）ヘキシル］カルバモイルを導入した水親水性多糖類誘導体（以下、「コレステロールプルラン」、「ＣＨＰ」とも称する）は、市販のものを購入して（例えば、日本油脂株式会社）入手することも可能である。疎水性基を有する親水性多糖類誘導体は、水溶液中において疎水性相互作用により数分子が自発的に会合することでナノサイズ（１～１，０００ｎｍ）のゲル構造を有する微粒子（ナノゲル）を形成することなどにより、疎水性薬物や薬効を有するタンパク質やペプチドと複合化することがきるものである。
　本発明に用いられる疎水性基を有する親水性多糖類誘導体の分子量は、特に限定されないが、好ましくは１ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、さらに好ましくは１０ｋＤａ～３００ｋＤａである。また前記親水性多糖類誘導体は、薬学的に許容される塩であってもよい。
　さらに、例えば、本発明のヒアルロン酸誘導体および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体に含まれるヒドロキシもまた架橋形成が可能な基として利用することができる。すなわち、本発明のヒアルロン酸誘導体および疎水性基を有する親水性多糖類誘導体のヒドロキシを、特定の架橋剤、例えば、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、カルボジイミド、またはＣ２－２０アルキレンの両端にグリシジルエーテルを有する架橋剤などによって架橋することができる。
　ヒアルロン酸のカルボキシに導入される置換基の種類が複数のときは、それらの置換基は、同時導入しても、順次に導入してもよい。
　本発明のさらに別の側面によれば、本明細書に定義したヒアルロン酸誘導体であって、水中で会合により微粒子を形成することを特徴とする前記ヒアルロン酸誘導体が提供される。特に限定はされないが、導入された基－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２の疎水性相互作用により水中において自発的会合が起こり、ナノスケールの微粒子を形成するという特性を有する。望まれるドラッグデリバリーシステムの構築のために、本発明のヒアルロン酸誘導体により形成されるナノ微粒子は非常に有力な手段の一つであり、内部に形成される疎水ドメインに活性成分であるタンパク質、ペプチド、低分子化合物を保持したまま目的の部位に送達するカプセルとして使用することができる。また、薬物をコンジュゲートすることにより目的の部位に薬物を送達することができる。
　ナノスケールの微粒子は、全身投与、特に静脈内投与が可能であり、封入（複合化）した薬物を血中で徐放する血中薬物徐放、また、標的臓器および細胞へ薬物を選択的にデリバリーさせる、ターゲティング用の担体として使用できる。ターゲティング用の担体として使用する場合、ターゲット素子をくわえることにより各臓器ならびに細胞へターゲティングすることもできる。ターゲット素子としては、例えば、標的組織特異的なペプチド、抗体、断片化抗体、アプタマー、がん細胞に対するＲＧＤペプチド、葉酸、アニサミド、トランスフェリン、肝臓に対するガラクトース、トコフェロールなどがある。血中での薬物の保持を強固にするために、さらにヒアルロン酸誘導体を化学架橋させることもできる。
　また、ヒアルロン酸と同様直鎖状のポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、分子量４０ｋＤａ以下で腎排泄を受けることが報告されている（Europian Journal of Cancer. 第31巻、第766-770頁、1995年）など、ある一定の大きさ以下の分子は、腎排泄を受けることが知られている。よって、同程度以下の分子量のヒアルロン酸ならびにヒアルロン酸誘導体も腎排泄され、瞬時に血中から消失する懸念がある。しかし、本発明の疎水性基を導入したＨＡ誘導体は、ＰＥＧが腎排泄を受ける分子量以下であっても、会合化することにより血中薬物徐放およびターゲティング用の担体として用いることができる。
　ヒアルロン酸誘導体による微粒子は、水溶液中で自己会合により形成するので、固体のヒアルロン酸誘導体をから水または塩水溶液に溶解することによって形成することができる。また、別の方法では、他の溶媒（例えばＤＭＳＯ）に溶解させたあと、水、または塩水溶液に置換することによっても微粒子を形成することができる。形成した微粒子のサイズを均一化するために超音波処理を行ってもよい。
　ヒアルロン酸誘導体の疎水性基導入率が高くなるに従って、水への溶解性が減少する。そのため水溶液中で分散性の微粒子を形成させるためには、共有結合により導入する疎水性基は８０％以下、このましくは６０％以下になるように調製されたヒアルロン酸誘導体を用いることがこのましい。
　ヒアルロン酸は解離基であるカルボキシを有するため、系中のイオン強度が高いほど、溶解性が低くなる。したがって、導入率をコントロールすることにより、低塩濃度下あるいは無塩条件下では溶解し、生理食塩濃度にて凝集・沈殿するヒアルロン酸誘導体の調製が可能であり、これは、皮下での徐放製剤の基材となり得る。また、生理塩濃度下においても安定な微粒子を形成する程度の疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体は、全身投与型の薬物担体となり得る。
　形成される微粒子の粒子径は特に限定されないが、注射による投与の際にニードルを詰まらせずに通過できるようにするため２００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以下であることが更に好ましい。また、静脈投与の場合は、抹消血管を閉塞させないために粒子径５００ｎｍ以下であることが好ましく、２００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。また、細網内皮系への取り込みを回避し、血中滞留性を向上させるために１００ｎｍ以下であることが好ましく、さらにより好ましくは５０ｎｍ以下である。
　本発明のヒアルロン酸誘導体は、医薬製剤における薬物担体として使用することができ、本発明ヒアルロン酸誘導体と薬物とを含む、医薬組成物を提供することができる。本発明のヒアルロン酸誘導体は、水溶液中で自発的に薬物と複合体を形成できるため、特別な操作を必要とせず、当該ヒアルロン酸誘導体と薬物を水溶液中で混合し、インキュベートすることにより、担体－薬物の複合体を容易に形成させ、薬物を担持できる。複合体形成の駆動力は、主にヒアルロン酸誘導体の疎水性基と薬物との疎水性相互作用であるが、薬物が塩基性の場合、ヒアルロン酸誘導体のカルボン酸との静電的相互作用が寄与する場合がある。生体塩濃度では、静電的相互作用は弱く、疎水性相互作用は強くなるため、主に疎水性相互作用により複合体が形成すると考えられる。
　上記式（Ｉ）および（ＩＩ）において、Ｚ１がアルキレンの場合、アルキレンの炭素鎖が長いほど、当該基の疎水性が高くなり、強い疎水性相互作用により強固な微粒子を形成することができる。また、アルキレンが長いほど分子間での絡み合いが大きくなり、粘度を上昇させることができる。さらに、アルキレンの長さを変更することで、微粒子のサイズを制御することもできる。
　疎水性基中のリンカー（スペーサー）部分がエステルまたはカーボネートである場合（例えば、Ｘ１またはＸ２に、－ＣＯＯ－Ｚ３または－Ｏ－ＣＯＯ－Ｚ３が含まれる場合）、生体内においてエステルまたはカーボネートが分解し、ヒアルロン酸誘導体の疎水性が低下することによってさらに生分解性が高まり、安全性の面から好ましい。また、腫瘍組織周辺ではｐＨが低下していることが知られており、このようなスペーサーを有している場合、目的薬物を担持した本発明のヒアルロン酸誘導体の会合体は腫瘍周辺にて崩壊し、薬物を腫瘍周辺で放出することができる。
　特に、－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－のようなβチオカルボン酸エステル構造を有するリンカーの場合、わずかなｐＨの低下（ｐＨ６程度）においても分解が促進される。このため、通常のエステルよりもｐＨ応答がシャープである。また、細胞内への薬物の送達を目指す場合、エンドソームにおけるｐＨ低下にも応答し、細胞に取り込まれた後にのみ薬物を放出させることができる。
　リンカー（スペーサー）部分がジスルフィド結合を有する場合（例えば、Ｘ１またはＸ２に、－Ｓ－Ｓ－Ｚ３が含まれる場合）、還元状況下においてリンカーが分解し、ヒアルロン酸誘導体の疎水性が低下することによって本発明のヒアルロン酸誘導体の会合体が崩壊する。細胞質は還元環境であることが知られているため、このリンカーを用いたヒアルロン酸誘導体に薬物を封入し、投与することによって、血中では薬物を放出せず、細胞質内でのみ薬物を放出させることができる。
　担体－薬物複合体を形成するときの、溶媒、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、変性剤の添加などの条件は、用いる薬物により適宜変更することができる。例えば、薬物封入時の塩濃度やｐＨによって、ヒアルロン酸誘導体は密度が変わるとともに、薬物もその電離状態などが変動する。使用する変性剤の例としては、尿素、塩酸グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。変性剤を添加した場合は、複合体形成後に、過剰の水などで洗浄することにより余剰の変性剤を除去することができる。
　特に限定されないが、例えば、本発明のヒアルロン酸誘導体とタンパク質の複合体を形成する場合、その等電点付近で複合体形成を行うことにより、ヒアルロン酸誘導体とタンパク質の静電反発を抑制することが可能なため、複合体に含まれるタンパク質の量を増加させることができる。また、グルクロン酸部分のカルボキシのｐＫａ（およそ４．０）以下の条件で複合体形成工程を行うことにより、ヒアルロン酸誘導体が有する負電荷を弱めることができるので、タンパク質が当該条件下で負電荷に帯電している場合には静電反発を抑制することが可能であり、複合体に含まれるタンパク質の量を増加させることができる。さらに、例えば生体内よりも低い塩濃度において複合体形成工程を行うことにより、水溶液中で形成されるヒアルロン酸誘導体の微粒子の密度が低下するため、複合体に含まれるタンパク質の量を増加させることができる。また、その状態で塩濃度を上げることにより微粒子の密度を向上させ、強固にタンパク質を封入することができる。
　ヒアルロン酸誘導体とタンパク質との複合体形成は、タンパク質の分子量にも影響され得る。一般に、タンパク質が低分子量であるほど、当該タンパク質のヒアルロン酸誘導体の微粒子内部へ移行速度は高い。また、疎水性基の導入率に依存する微粒子の密度も、タンパク質との複合体形成の速度、および複合体に含まれるタンパク質の量に影響を与えうる。
　ヒアルロン酸誘導体と薬物の複合体からの生体内における薬物放出は、複合体からの薬物の拡散に加えて、生体成分が薬物と置換することにより促進される。微粒子の密度を増減させて、この拡散や置換を制御することにより、薬物の徐放性を制御することが可能となる。
　生体内には血漿タンパク質や脂質などの生体成分が存在し、ヒアルロン酸誘導体と薬物の複合体を皮下や血中などの生体内に投与した場合、この生体成分が複合体内の薬物と置換することにより薬物が放出される場合がある。当該置換を生じさせる主な生体内タンパク質としてアルブミンが想定される。本発明のヒアルロン酸誘導体の疎水性基の導入率を低くすることにより、グルクロン酸部分のカルボキシの負電荷を高くすることができ、負電荷を有するアルブミン（ｐＩ＝４．６）との置換を抑制することができる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体を薬物担体として使用する方法としては、前述の水溶性液中で自発的に薬物と複合体を形成させる方法の他、薬物と本発明のヒアルロン酸誘導体とを結合させたコンジュゲートにする方法を挙げることもできる。すなわち、本発明の別の側面において、式（Ｉ）で表される二糖単位を含むヒアルロン酸誘導体に、上記薬物の１以上が結合した、ヒアルロン酸誘導体－薬物結合体が提供される。この側面の１つの態様において、ヒアルロン酸誘導体として、（ａ）式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）、（ｂ）式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）、（ｃ）式（Ｉ）および式（ＩＩｂ）および式（ＩＩＩ）、または（ｄ）式（Ｉ）および式（ＩＩ）および式（ＩＩｂ）および式（ＩＩＩ）で表される１以上の二糖単位をそれぞれ含むヒアルロン酸誘導体を用いることができる。例えば、式（ＩＩＩ）の基－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄに含まれるヒドロキシ、アミノ、メルカプト、ハロゲン原子（ブロモ、ヨードなど）または反応性の炭素－炭素二重結合（メタクリロイル、アクリロイルなど）と薬物を結合させることにより、上記のヒアルロン酸誘導体－薬物結合体を調製することができる。
　なお、基－ＮＲｅ－Ｙｂ－Ｒｄと薬物との間に、更に、式－Ｇ１－Ｇ２－Ｇ３－Ｊ－＊＊＊
（式中、＊＊＊は、薬物との結合部位を表し、
　Ｇ１は、直接結合、－Ｃ（＝Ｏ）－、－ＮＲｓ－および－Ｓ－から選択され、
　Ｇ２は、－（ＣＨ２）ｉ－および－（ＣＨ２）ｑａ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｋ－から選択され、
　Ｇ３は、直接結合、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＲｔ－（ＣＨ２）ｒ－および－ＮＲｕ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｍａ－から選択され、
　Ｊは、以下の式で表される基を表し、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　Ｒｓ、ＲｔおよびＲｕは、独立して、水素原子およびＣ１－６アルキルから選択され、ｉは、１～１０から選択される整数であり、ｑａは、２～１０から選択される整数であり、ｋは、１～１００から選択される整数であり、ｒおよびｍａは、独立して、１～１０から選択される整数である）
で表されるスペーサーが挿入されていてもよい。
　式－Ｇ１－Ｇ２－Ｇ３－Ｊ－＊＊＊の具体例としては、例えば、以下の式が挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　本発明のヒアルロン酸誘導体の主鎖の末端に存在するグルクロン酸４位およびアセチルグルコサミン１位のヒドロキシは、別の基に変換されていてもよく、例えば、Ｃ１－６アルコキシ、ホルミルオキシおよびＣ１－６アルキルカルボニルオキシなどであってもよい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体と薬物とからなるコンジュゲートの調製方法は、既知のポリマーと薬物とのコンジュゲートの調製で使用されている方法を用いることができ、例えば、以下の反応を利用することができる。
　ヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシと、薬物のアミノ、ヒドロキシ、ヨード、ブロモまたは、薬物に導入したアミノ、ヒドロキシ、ブロモ、ヨードとの反応；
　ヒアルロン酸誘導体のＮ－アセチルグルコサミン部分の６位のヒドロキシと、薬物のカルボキシまたは薬物に導入したカルボキシとの反応；
　ヒアルロン酸誘導体に導入したアミノと、薬物のカルボキシまたは薬物に導入したカルボキシとの反応； 
　ヒアルロン酸誘導体に導入したアミノと、修飾によりイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステルおよびエポキシドなどに変換された薬物との反応；
　薬物のアミノまたは薬物に導入したアミノと、修飾によりイソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、カルボニル、ＮＨＳエステルおよびエポキシドに変換されたヒアルロン酸誘導体との反応；
　ヒアルロン酸誘導体のアミノと、カルボニルを有するまたは導入された薬物（アルデヒドおよびケトンなど）とのシッフ塩基形成ならびに還元的アミノ化反応；
　薬物のアミノまたは薬物に導入したアミノと、修飾によりカルボニルが導入されたヒアルロン酸誘導体とのシッフ塩基形成ならびに還元アミノ化反応；
　ヒアルロン酸誘導体に導入したメルカプトと、不飽和結合を有する化合物（マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、アリル化物、ビニルスルホンなど）、ハロゲン化物（クロロ酢酸エステル、ブロモ酢酸エステル、ヨード酢酸エステル、クロロ酢酸アミド、ブロモ酢酸アミド、ヨード酢酸アミドなど）またはチオールである薬物または修飾により当該化合物に変換された薬物との反応；および
　薬物に導入したメルカプトと、修飾により、不飽和結合を有する化合物（マレイミド、アクリルエステル、アクリルアミド、メタクリルエステル、メタクリルアミド、アリル化物、ビニルスルホンなど）、ハロゲン化物（クロロ酢酸エステル、ブロモ酢酸エステル、ヨード酢酸エステル、クロロ酢酸アミド、ブロモ酢酸アミド、ヨード酢酸アミドなど）またはチオールに変換されたヒアルロン酸誘導体との反応。
　さらに、前述の疎水性基をＨＡ誘導体に導入する際に用いたエステルまたはカーボネート、βチオエステル、ジスルフィド、特定の部位で切断するペプチドを含むリンカー（スペーサー）を、薬物とのコンジュゲート用のリンカーとして使用することもできる。これらのリンカーは前述の通り、標的部位において切断され、薬物が放出される。
　コンジュゲートの調製のためにヒアルロン酸誘導体または薬物の修飾に使用する試薬は、コンジュゲートの調製において不都合な反応を生じさせないものであれば、特に限定されない。該化合物は試薬として入手可能であるか、または文献公知の方法を参考にして合成してもよい。
　具体的には、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらにアミノを有する薬物またはアミノを導入した薬物をＤＭＴ－ＭＭなどの縮合剤を用いて反応させ、アミド結合により薬物をコンジュゲートすることができる。この際、薬物をコレステリル　６－アミノへキシルカーバメート塩酸塩などと一緒に加えて、疎水性基を同時に導入してもよい。また、薬物の後もしくは前に当該化合物を加えてもよい。また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に薬物を反応させても、薬物を導入したヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に疎水性基誘導体を導入してもよい。
　また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらにヒドロキシを有する薬物またはヒドロキシを導入した薬物をＤＭＴ－ＭＭ、１，３－ジクロロヘキシルカルボジイミト゛（ＤＣＣ）などの縮合剤を用いて反応させ、エステル結合によりヒアルロン酸誘導体に薬物をコンジュゲートすることができる。この際、薬物をコレステリル　６－アミノへキシルカーバメート塩酸塩などと一緒に加えて、疎水性基を同時に導入してもよい。また、薬物の後もしくは前に当該化合物を加えてもよい。しかし、エステルの加水分解を回避するためには、疎水性基を導入後、薬物をコンジュゲートすることが望ましい。上記の方法は、例えば、パクリタキセルがＨＡにエステルで導入された報告（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　第１９巻、第１３１９－１３２５項、２００８年）などを参考にして行うことができる。
　また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらに臭化物もしくはヨウ化物である薬物または、修飾により臭化物もしくはヨウ化物に変換された薬物を反応させ、グルクロン酸部分のカルボキシをエステルに変換することにより薬物をコンジュゲートすることができる。エステルの加水分解を回避するためには、疎水性基を導入後、薬物をコンジュゲートすることが望ましい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、さらにカルボキシを有する薬物またはカルボキシを導入した薬物をＮＨＳエステルとし、Ｎ－アセチルグルコサミン部分の６位のヒドロキシと反応させ、エステル結合により薬物をコンジュゲートすることができる。この際、コレステリル６－アミノへキシルカーバメート塩酸塩などにより疎水性基をＨＡに導入した後に薬物を加えても、導入の前に加えてもよい。また、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に薬物を反応させても、薬物を導入したヒアルロン酸誘導体を合成・精製後に疎水性基誘導体を導入してもよい。エステル結合の加水分解を回避するためには、疎水性基誘導体を導入後、薬物をコンジュゲートすることが望ましい。上記の方法は、例えば、カンプトテシンがＨＡにエステルで導入された報告（国際公開第ＷＯ２００９／０７４６７８号）などを参考にして行うことができる。
　１つの態様において、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成後、グルクロン酸部分のカルボキシをエチレンジアミンなどのジアミンと脱水縮合させ、アミノを導入することができる。さらに、Ｎ－スクシンイミジル　ヨードアセテート（ＰＩＥＲＣＥ社）やＮ－スクシンイミジル　［４－ヨードアセチル］アミノベンゾエート（ＰＩＥＲＣＥ社）をアミノに反応させ、ヨードアセチルが導入されたヒアルロン酸誘導体を合成することができる。このヒアルロン酸誘導体に対して、メルカプトを有する薬物を、コンジュゲートすることができる。この方法はタンパク質、ペプチド、核酸などのアミノなどの反応性基を多く含む高分子薬物においてもメルカプト選択的にコンジュゲートできるため特に有効である。この際、薬物の導入は疎水基誘導体をＨＡに導入する前でも後でもよい。
　Ｘ１が－ＮＨ２－ＣＯＯ－Ｒである、本発明のヒアルロン酸誘導体を合成し、ここで、グルクロン酸部分のカルボキシの一部を２－アミノエチル　２－ピリジル　ジスルフィド塩酸塩と反応させる。このヒアルロン酸誘導体に対してメルカプトを有する薬物ならびにメルカプトを導入した薬物をジスルフィド結合交換反応、すなわち置換反応により導入することが可能である。
　ここで、当該コンジュゲートの生物活性を有効に保つために、薬物とヒアルロン酸誘導体間のリンカーの長さを調節することもできる。また、生体内の特定部位にて酵素等で切断されるペプチドリンカーを導入することもできる。例えば、メトトレキセートがＨＡにペプチドを含むリンカーを介して導入された報告（国際公開第ＷＯ２００５／０９５４６４号）、ドキソルビシンがＨＰＭＡ（N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide）およびペプチドを含むリンカーを介して導入された報告（国際公開第ＷＯ２００２／０９０２０９号）などを参考にして行うことができる。
　また、抗体に低分子化合物をコンジュゲートさせたＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関する報告（国際公開第ＷＯ２００９／０２６２７４号；Expert Opinion. 第15巻、第1087-1103頁、2005年；Bioconjugate Chem. 第19巻、第1960-1963頁、2008年；Bioconjugate Chem.  in press、Bernhard Stumpら、Antibody-Drug Conjugates: Linking Cytotoxic Payloads to Monoclonal Antibodies）が多数あり、これらを参考にして、ヒアルロン酸誘導体と低分子化合物とのコンジュゲートを調製することもできる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体と１以上の薬物とを含む医薬組成物および本発明のヒアルロン酸誘導体と１以上の薬物とが結合したコンジュゲートは、ナノ微粒子、ミクロ微粒子、溶液、エマルジョン、懸濁液、ゲル、ミセル、インプラント、粉末、またはフィルムの形態にあってよい。粉末は、凍結乾燥または噴霧乾燥により得た固体を粉砕して製造してもよく、沈殿物を乾燥したものから製造してもよい。
　本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、経口、腸管外、鼻腔内、膣内、眼内、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、関節腔内、脳内または口腔内の経路を経て投与されてよい。
　本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、特に局所における徐放を目的とした場合、ニードルを詰まらせずに通過できるようにするため２００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以下であることが更に好ましい。
　本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、特にＣＤ４４をはじめとするヒアルロン酸レセプターへのターゲティングを目的とした場合、そのサイズは５μｍ以下であることが好ましい。
　本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、特に血中滞留性延長、ならびに腫瘍組織または炎症組織への集積性を目的とする場合、そのサイズは５００ｎｍ以下であることが好ましく、さらに好ましくは２００ｎｍ以下である。また、細網内皮系への取り込みを回避し、血中滞留性を向上させるためには１００ｎｍ以下であることが好ましい。
　本発明の医薬組成物およびコンジュゲートは、粘膜付着性を持ち非侵襲投与用途を目的とした場合、そのサイズは２００μｍ以下であることが好ましい。粘膜付着性の観点からは、用いるヒアルロン酸誘導体の疎水性基導入率は低い方が好ましい。
　本発明のヒアルロン酸誘導体と複合体を形成する薬物は、担持可能な薬物であれば特に限定されない。また、本発明のヒアルロン酸誘導体と結合させる薬物は、コンジュゲートが調製可能であれば特に限定されない。当該薬物の例としては、タンパク質および／またはペプチド、多糖類、核酸類、低分子化合物が挙げられ、好ましくは、タンパク質および／またはペプチドが挙げられる。
　低分子化合物の例としては、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、パクリタキセル等のアルカロイドなど）、シクロスポリンなどの免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤など）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β－ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤など）などを挙げることができる。
　タンパク質およびペプチドの例としては、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、グラニュロサイトコロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターフェロン－α、β、γ、（ＩＮＦ－α、β、γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、シリアリーニュートロフィクファクター（ＣＮＴＦ）、チューマーネクローシスファクター（ＴＮＦ）、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、ＦＭＳ類似チロシンカイネース（Ｆｌｔ－３）、成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリン、インシュリン類似成長因子－１（ＩＧＦ－１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン－１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ－１ｒａ）、ブレイン由来ニューロトロフィクファクター（ＢＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、メガカリオサイト成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、レプチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂ－ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、抗体、ダイアボディー、ミニボディー、断片化抗体などを挙げることができる。
　核酸類の例としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、デコイ、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーなどを挙げることができる。
　本発明のヒアルロン酸誘導体のゲル中に、薬物を封入して、あるいは、本発明のヒアルロン酸誘導体－薬物結合体は、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む医薬組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。
　本発明により、従来の徐放性製剤では得られない、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物といった薬物を長期間徐放でき、および／または、適切な生分解性を有する安全性の高い徐放性製剤および医薬組成物を提供することが可能である。
　以下、本発明の好適な具体的態様を実施例として説明する。
　また、以下の記載中のＨＡユニットとは、ヒアルロン酸中のＮ－アセチルグルコサミン－グルクロン酸の繰り返し単位（１ユニット）を意味する。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの測定には、日本電子株式会社製ＪＮＭ－ＥＣＡ５００を用いた。透析には再生セルロース製透析膜（分子量５０ｋＤａおよび９９ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩を出発原料とする時はスペクトラポア４：分画分子量１２ｋ～１４ｋＤａ、分子量１０ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩を出発原料とする時はスペクトラポア７：分画分子量１ｋＤａもしくは２ｋＤａ）を用いた。
〔実施例１〕ヒアルロン酸誘導体の合成
（実施例１－１）コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩の調製
　コレステリル　クロロホルメート（３．３７ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１．０５ｍＬ）を加えて撹拌した。氷冷下で、６－（ｔ－ブトキシカルボニル）アミノ－１－アミノヘキサン（１．１２ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を滴下して加え、そのまま氷冷下で３０分間攪拌後、室温まで昇温し、当該混合物を一晩撹拌した。反応混合物を、超純水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル：ｎ－ヘキサン＝１：４)で精製し、目的物のフラクションを合わせて溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸／酢酸エチル溶液（４０ｍＬ）を加えて室温で一晩撹拌した。生じた沈殿物を遠心分離により回収した。得られた固体を酢酸エチルにて４回洗浄後、減圧下で乾燥し、コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート（Ｃｈｏｌ－Ｃ６）の塩酸塩（１．２ｇ）を得た。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＥｔＯＨ－ｄ６）を図１－１に示す。
（実施例１－２）カチオン交換樹脂のテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩化
　ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ＷＸ－８－４００（シグマ－アルドリッチ社製）を超純水に懸濁させ、デカンテーションにより樹脂を超純水で３回程度洗浄した。４０重量％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド水溶液（ＴＢＡ－ＯＨ）（シグマ－アルドリッチ社製）を樹脂のカチオン交換能に対し約１．５モル等量を加え、３０分間攪拌した。余剰のＴＢＡ－ＯＨ溶液をデカンテーションにより除去した後、さらに過剰の超純水で洗浄を繰り返し、最後に０．４５μｍのフィルターを用いて濾過することによりＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂を得た。
（実施例１－３）ＨＡのＴＢＡ塩の調製
　分子量１０ｋＤａ、５０ｋＤａおよび９９ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ、資生堂株式会社製）をそれぞれ１５ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解させた。実施例１－２でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液をＨＡユニット（ユニット分子量４０１．３）のモル数に対し樹脂のイオン交換能換算で５モル等量添加した。１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ヒアルロン酸のＴＢＡ塩（ＨＡ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。
　代表例として９９ｋＤａのＨＡ－Ｎａを出発原料とする生成物のＤ２Ｏを溶媒とした１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－２に示す。ＨＡのグルコサミンのアセチル由来のシグナル（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＴＢＡの４つのエチレン由来のシグナル（Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）４、１．４、１．７ｐｐｍ；１６Ｈ）の積分値より、ＨＡユニットに対するＴＢＡの量比を算出し、この比からＨＡ－ＴＢＡのユニット平均分子量を算出した。例えば、９９ｋＤａのＨＡ－Ｎａを出発原料とするＨＡ－ＴＢＡのユニット平均分子量は７５２．６であった。
（実施例１－４）Ｌ－アラニン（Ａｌａ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　実施例１－３で合成した、ＨＡ－Ｎａ（１０ｋＤａ、５０ｋＤａ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩（アルドリッチ社製）をＨＡユニットに対して５モル等量添加し、次に４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）をＨＡユニットに対して６モル等量添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析した。得られた透析液に２Ｎ　ＮａＯＨを添加しｐＨ１２．５以上として、１時間攪拌してエチルエステルを加水分解し、カルボキシの脱保護を行った。その後、２Ｎ　ＨＣｌを用いて中和を行い、さらに透析を行った後、凍結乾燥してＨＡ－Ａｌａを白色固体として得た。実施例１－３に記載と同じ条件で測定したＨＡ－Ａｌａの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの代表例（９９ｋＤａのＨＡを出発原料として用いた生成物）を図１－３に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アラニン中のメチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．４ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットにおけるアラニンの導入率（Ａｌａ導入率）を算出した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000038
　ＨＡ－Ａｌａ水溶液に対し、実施例１－２でＴＢＡ塩化したカチオン交換樹脂の懸濁液を約５モル等量添加し、１５分間撹拌した後、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過を行い、濾液を凍結乾燥し、ＨＡ－ＡｌａのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ａｌａ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。実施例１－３に記載と同じ条件で測定したＨＡ－Ａｌａ－ＴＢＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルから、実施例１－３に記載と同じ方法にてＨＡユニットに対するＴＢＡの量比を算出し、グルコサミンのアセチル由来のピークの積分値と、内部標準として用いた３－（トリメチルシリル）プロピオン酸ナトリウム－ｄ４（ＴＳＰ－ｄ４）のメチル由来のピーク（－Ｓｉ（ＣＨ３）３，０．０ｐｐｍ；９Ｈ）の積分値から重量あたりのＨＡユニット含量を定量した。
　ＨＡ－Ａｌａ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製し、その後、実施例１－１で調製したＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩をＨＡ－Ａｌａ－ＴＢＡユニットに対して以下の表１に示す比率で各溶液に添加した。次に、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡ－Ａｌａ－ＴＢＡに対して以下の表１に示す比率で加え、さらに５－アミノメチルフルオレセイン（ＦＬ、インビトロジェン社製）塩酸塩、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡ－Ａｌａ－ＴＢＡユニットに対してそれぞれ０．０４モル等量、０．０７モル等量添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。
　測定溶媒として０．０２Ｎ　ＤＣｌ　ＤＭＳＯ－ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ　ＤＣｌ　Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ－ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの代表例（９９ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が７％の生成物）を図１－４に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６～２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、コレステリル基中のメチル由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１）。なおグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．６～２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．６～２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基メチル由来のピーク（０．７ｐｐｍ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．６～２．０ｐｐｍ）－積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
　なお、ここでは、Ｃｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩のアミノが反応可能な基としては、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシとＡｌａのカルボキシの両方が挙げられる。このように２種類の反応点に疎水性基が導入可能な場合には、目的物の略称において「－Ｃｈｏｌ」のように、ハイフンを用いて表す。
（実施例１－５）Ｌ－スレオニンアミド（ＴｈｒＮＨ２）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　実施例１－３で調製した、ＨＡ－Ｎａ（９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、実施例１－１で調製したＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩をＨＡユニットに対して以下の表２に示す比率で各溶液に添加した。次にＤＭＴ－ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表２に示す比率で加え、さらに５－アミノメチルフルオレセイン（ＦＬ、インビトロジェン社製）塩酸塩、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡユニットに対してそれぞれ０．０４モル等量、０．０７モル等量添加し、室温で７時間撹拌した。その後、Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）をＨＡユニットに対して３モル等量添加し、次にＤＭＴ－ＭＭをＨＡユニットに対して５モル等量を添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ－ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。
　測定溶媒として０．０２Ｎ　ＤＣｌ　ＤＭＳＯ－ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ　ＤＣｌ　Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ－ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの代表例（９９ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が６％の生成物）を図１－５に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６～２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、コレステリル基中のメチル由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表２）。なおグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．６～２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．６～２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基メチル由来のピーク（０．７ｐｐｍ）の積分値を５／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．６～２．０ｐｐｍ）－積分値（０．７ｐｐｍ）×５／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000041
　また、グルコサミンのアセチル由来のピークの積分値と、スレオニンアミドのメチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．２ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、ＨＡユニットにおけるスレオニンアミドの導入率を算出した（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
　なお、ここでは、Ｃｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩のアミノは、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシとのみ反応し、導入されたＴｈｒＮＨ２に更に疎水性基が導入されることはない。このように、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシにのみ疎水性基を導入できる場合を、目的物の略称において「／Ｃｈｏｌ」のように、スラッシュを用いて表す。
（実施例１－６）Ｌ－セリン（Ｓｅｒ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｓｅｒ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－セリンエチルエステル塩酸塩（アルドリッチ社製）を用いたこと以外は、実施例１－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｓｅｒを白色固体として得た。また、カルボキシを脱保護する前の透析溶液の一部を採り凍結乾燥して導入率算出用サンプルとした（ＨＡ－Ｓｅｒ－ＯＥｔ）。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した導入率算出用サンプルの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－６に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、１．９ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、セリンのエチルエステル中のメチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．２ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるセリンの導入率を算出した（表３）。また、脱保護したサンプルを実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－７に示す。さらに実施例１－４の記載と同じ条件でＨＡ－ＳｅｒのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ｓｅｒ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１－４と同様の方法でＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ－Ｓｅｒ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１－４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－８に示す。実施例１－４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。
（実施例１－７）Ｌ－グリシン（Ｇｌｙ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｇｌｙ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにグリシンエチルエステル塩酸塩（和光純薬株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｇｌｙを白色固体として得た。また、カルボキシを脱保護する前の透析溶液の一部を採り凍結乾燥して導入率算出用サンプルとした（ＨＡ－Ｇｌｙ－ＯＥｔ）。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した導入率算出用サンプルの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－９に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、グリシンのエチルエステル中のメチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．３ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるグリシンの導入率を算出した（表３）。また、脱保護したサンプルを実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－１０に示す。さらに実施例１－４の記載と同じ条件でＨＡ－ＧｌｙのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ｇｌｙ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１－４と同様の方法でＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ－Ｇｌｙ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１－４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－１１に示す。実施例１－４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。
（実施例１－８）Ｌ－スレオニン（Ｔｈｒ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｔｈｒ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－スレオニンメチルエステルの塩酸塩（Ｂａｃｈｅｍ社製）を用いたこと以外は、実施例１－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｔｈｒを白色固体として得た。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－１２に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、スレオニン中のメチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．２ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるスレオニンの導入率を算出した（表３）。さらに実施例１－４の記載と同じ条件でＨＡ－ＴｈｒのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ｔｈｒ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１－４と同様の方法でＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ－Ｔｈｒ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１－４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－１３に示す。実施例１－４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。
（実施例１－９）Ｌ－アスパラギン（Ａｓｎ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ａｓｎ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－アスパラギンメチルエステル塩酸塩（Ｂａｃｈｅｍ社製）を用いたこと以外は、実施例１－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ａｓｎを白色固体として得た。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－１４に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アスパラギンのメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＣＯＮＨ２、２．７、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるアスパラギンの導入率を算出した（表３）。さらに実施例１－４の記載と同じ条件でＨＡ－ＡｓｎのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ａｓｎ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１－４と同様の方法でＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ－Ａｓｎ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１－４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－１５に示す。実施例１－４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。
（実施例１－１０）Ｌ－アスパラギン酸（Ａｓｐ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ａｓｐ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－アスパラギン酸ジエチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ａｓｐを白色固体として得た。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－１６に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アスパラギン酸中のメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＣＯＯＨ、２．７、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるアスパラギン酸の導入率を算出した（表３）。さらに実施例１－４の記載と同じ条件でＨＡ－ＡｓｐのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ａｓｐ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１－４と同様の方法でＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ－Ａｓｐ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１－４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－１７に示す。実施例１－４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。
（実施例１－１１）Ｌ－イソロイシン（Ｉｌｅ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｉｌｅ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－イソロイシンメチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｉｌｅを白色固体として得た。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－１８に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、イソロイシン中の２つのメチル由来のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、０．９ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるイソロイシンの導入率を算出した（表３）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、イソロイシンの３位の水素のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、１．９ｐｐｍ；１Ｈ）が重なっているため、１．８～２．２ｐｐｍのピークの積分値から０．９ｐｐｍのピークの積分値に１／６を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、導入率の算出に使用した。さらに実施例１－４の記載と同じ条件でＨＡ－ＩｌｅのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ｉｌｅ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１－４と同様の方法でＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ－Ｉｌｅ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１－４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－１９に示す。実施例１－４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。
（実施例１－１２）Ｌ－ロイシン（Ｌｅｕ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｌｅｕ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－ロイシンエチルエステル塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｌｅｕを白色固体として得た。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－２０に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ロイシン中の２つのメチル由来のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）２、０．９ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるロイシンの導入率を算出した（表３）。さらに実施例１－４の記載と同じ条件でＨＡ－ＬｅｕのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ｌｅｕ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１－４と同様の方法でＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ－Ｌｅｕ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１－４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－２１に示す。実施例１－４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。
（実施例１－１３）Ｌ－バリン（Ｖａｌ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｖａｌ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－バリンエチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｖａｌを白色固体として得た。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－２２に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、バリン中の２つのメチル由来のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）２、０．９ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるバリンの導入率を算出した（表３）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、バリンの３位の水素のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）２、２．１ｐｐｍ；１Ｈ）が重なっているため、１．８～２．２ｐｐｍのピークの積分値から０．９ｐｐｍのピークの積分値に１／６を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、導入率の算出に使用した。さらに実施例１－４の記載と同じ条件でＨＡ－ＶａｌのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ｖａｌ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１－４と同様の方法でＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ－Ｖａｌ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１－４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－２３に示す。実施例１－４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。
（実施例１－１４）Ｌ－フェニルアラニン（Ｐｈｅ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｐｈｅ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－フェニルアラニンエチルエステル塩酸塩（アルドリッチ社製）を用いたこと以外は、実施例１－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｐｈｅを白色固体として得た。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－２４に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、フェニルアラニン中のフェニル由来のピーク（－Ｃ６Ｈ５、７．２～７．４ｐｐｍ；５Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるフェニルアラニンの導入率を算出した（表３）。さらに実施例１－４の記載と同じ条件でＨＡ－ＰｈｅのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ｐｈｅ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１－４と同様の方法でＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ－Ｐｈｅ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１－４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－２５に示す。実施例１－４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
（実施例１－１５）Ｌ－セリンアミド（ＳｅｒＮＨ２）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－ＳｅｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－セリンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－５と同様の方法で行い、ＨＡ－ＳｅｒＮＨ２－Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１－５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－２６に示す。実施例１－５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表４）。また、実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－２７に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、セリンアミドのメチレン由来のピーク（－ＣＨ２－、３．９ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－５と同様にしてＨＡユニットにおけるセリンアミドの導入率を算出した（表４）。なお、セリンアミドのメチレン由来のピークには、グルクロン酸の２～５位のピーク（４Ｈ）、グルコサミンの２～６位のピーク（６Ｈ）が重なっているため、３．２～４．２ｐｐｍのピークの積分値から、２．０ｐｐｍのピークの積分値に１０／３を乗じた値を差し引いた値をセリンアミドのメチレン由来のピークとして、導入率の算出に使用した。
（実施例１－１６）Ｌ－グリシンアミド（ＧｌｙＮＨ２）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－ＧｌｙＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩の代わりにグリシンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－５と同様の方法で行い、ＨＡ－ＧｌｙＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－２８に示す。実施例１－５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表４）。また、実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－２９に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、グリシンアミドのメチレン由来のピーク（－ＣＨ２－；２Ｈ）の積分値より、実施例１－５と同様にしてＨＡユニットにおけるグリシンアミドの導入率を算出した（表４）。なお、グリシンアミドのメチレン由来のピークには、グルクロン酸の２～５位のピーク（４Ｈ）、グルコサミンの２～６位のピーク（６Ｈ）が重なっているため、実施例１－１５と同様の方法でセリンアミドのメチレン由来のピークの積分値を算出した。
（実施例１－１７）Ｌ－ロイシンアミド（ＬｅｕＮＨ２）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－ＬｅｕＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－ロイシンアミド塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－５と同様の方法で行い、ＨＡ－ＬｅｕＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－３０に示す。実施例１－５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表４）。また、グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、１．９ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ロイシンアミドの２つのメチル由来のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）２、０．９ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１－５と同様にしてＨＡユニットにおけるロイシンアミドの導入率を算出した（表４）。
（実施例１－１８）Ｌ－バリンアミド（ＶａｌＮＨ２）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－ＶａｌＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－バリンアミド塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－５と同様の方法で行い、ＨＡ－ＶａｌＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。
　実施例１－５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－３１に示す。実施例１－５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表４）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、１．９ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、バリンアミドの２つのメチル由来のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）２、１．０ｐｐｍ；６Ｈ）の積分値より、実施例１－５と同様にしてＨＡユニットにおけるバリンアミドの導入率を算出した（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
（実施例１－１９）Ｌ－アラニン（Ａｌａ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ａｌａ／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－アラニンエチルエステル塩酸塩（アルドリッチ社製）を用い、超純水透析中に透析液を一度取り出して２Ｎ　ＮａＯＨにてカルボキシの脱保護を行った以外は、実施例１－５と同様の方法で行い、ＨＡ－Ａｌａ／Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１－５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－３２に示す。実施例１－５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表５）。また、グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、１．９ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アラニン中のメチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．３ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるアラニンの導入率を算出した（表５）。なお、アラニンのメチル由来のピークにはコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート由来のピーク（０．８～１．６ｐｐｍ、４１Ｈ）が重なっているため、０．８～１．６ｐｐｍのピークの積分値から０．７ｐｐｍのピークの積分値に４１／３を乗じた値を差し引いた値をアラニンのメチル由来のピークとして、導入率の算出に使用した。
（実施例１－２０）Ｌ－セリン（Ｓｅｒ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｓｅｒ／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－セリンエチルエステル塩酸塩（アルドリッチ社製）を用い、超純水透析中に透析液を一度取り出して２Ｎ　ＮａＯＨにてカルボキシの脱保護を行った以外は、実施例１－５と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｓｅｒ／Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。また、カルボキシを脱保護する前の透析溶液の一部を採り凍結乾燥して導入率算出用サンプルとした（ＨＡ－Ｓｅｒ－ＯＥｔ／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した導入率算出用サンプルの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－３３に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．３ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、セリンのエチルエステル中のメチル由来のピーク（－ＣＨ３、１．６ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－６と同様にしてＨＡユニットにおけるセリンの導入率を算出した（表５）。また、脱保護したサンプルを実施例１－５の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－３４に示す。実施例１－５に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
（実施例１－２１）蛍光標識されていないヒアルロン酸誘導体の合成
　５－アミノメチルフルオレセインを加えていないこと以外は実施例１－４（Ａｌａ）、実施例１－５（ＴｈｒＮＨ２）、実施例１－１５（ＳｅｒＮＨ２）、実施例１－１８（ＶａｌＮＨ２）に記載の方法によりＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ、ＨＡ－ＴｈｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ、ＨＡ－ＳｅｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ、ＨＡ－ＶａｌＮＨ２／Ｃｈｏｌを白色固体として得た。対応する実施例の記載と同じ方法によりコレステリル基の導入率ならびにアミノ酸およびアミノ酸アミドの導入率を算出した（表６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
（比較例１－１）コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　実施例１－３で調製した、ＨＡ－Ｎａ（１０ｋ、５０ｋ、９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの、無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、実施例１－１で調製したＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩をＨＡユニットに対して以下の表７に示す比率で各溶液に添加した。次にＤＭＴ－ＭＭをＨＡユニットに対して以下の表７に示す比率で加え、さらに５－アミノメチルフルオレセイン（ＦＬ、インビトロジェン社製）塩酸塩、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡユニットに対してそれぞれ０．０４モル等量、０．０７モル等量添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　酢酸アンモニア／ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。
　測定溶媒として０．０２Ｎ　ＤＣｌ　ＤＭＳＯ－ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ　ＤＣｌ　Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ－ｄ６＝１：９９）を用いた１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの代表例（９９ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コレステリル基の導入率が６％の生成物）を図１－３５に示す。ＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率は実施例１－４に記載の方法で算出した（表７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
（比較例１－２）ＥＤＯＢＥＡにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－ＥＤＯＢＥＡ－Ａｃ／ＦＬ）の合成
　実施例１－３で合成した、ＨＡ－Ｎａ（９９ｋＤａ）を出発原料とするＨＡ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、ＨＡユニット／ＢＯＰ（和光純薬株株式会社製）／２，２’－（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＯＢＥＡ、シグマ－アルドリッチ社製）＝１／２．５／５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）の等量比でＥＤＯＢＥＡ、ＢＯＰの順で添加し、室温で一晩攪拌した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析した後、凍結乾燥して高導入率のＨＡ－ＥＤＯＢＥＡを得た。
　実施例１－３の記載と同じ条件で測定した高導入率のＨＡ－ＥＤＯＢＥＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－３６に示す。なお測定に際し、ＮａＯＤを０．００４６Ｎとなるように加え、溶液がアルカリ性となるようにした。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、ＥＤＯＢＥＡ末端のメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＮＨ２、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるＥＤＯＢＥＡの導入率を算出したところ、８２％であった。
　次に、得られた高導入率のＨＡ－ＥＤＯＢＥＡを超純水で１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させた後、１００ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）で２倍希釈して５ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。この溶液にＨＡユニットに対して０．０４モル等量のＮＨＳ－フルオレセインをＤＭＳＯ溶液として加えて室温で１時間攪拌した後、ＨＡユニットに対して４０モル等量の無水酢酸（和光純薬株式会社製）を添加してさらに１時間攪拌することにより、余分なＥＤＯＢＥＡの末端アミノをアセチル化した。反応溶液は、０．３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で遮光下で透析を行った後、凍結乾燥してＨＡ－ＥＤＯＢＥＡ－Ａｃ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－３７に示す。
（比較例１－３）Ｌ－チロシン（Ｔｙｒ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｔｙｒ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－チロシンエチルエステル塩酸塩（和光純薬株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｔｙｒを白色固体として得た。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－３８に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、チロシン中のヒドロキシフェニル由来のピーク（－Ｃ６Ｈ４ＯＨ、６．８、７．２ｐｐｍ；４Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるチロシンの導入率を算出した（表８）。さらに実施例１－４の記載と同じ条件でＨＡ－ＴｙｒのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ｔｙｒ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１－４と同様の方法でＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩、ＦＬを反応させ、目的物（ＨＡ－Ｔｙｒ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１－４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図１－３９に示す。実施例１－４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
〔実施例２〕ｉｎ　ｖｉｖｏでの血中滞留性および生分解性の確認
（実施例２－１）ＨＡ誘導体を投与したラットからの生体サンプル採取
　実施例１－４～１－２０および比較例１－１および１－３で得られた化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与後５分、２、７、２４、４８、７２、１６８、２４０および３３６時間でヘパリンナトリウム処理したシリンジを用いて頸静脈採血し、遠心分離により血漿を得た。比較例のサンプルの中には投与後９６時間においても採血したものもある。この血漿サンプルは測定まで－２０℃以下で凍結保存した。また、投与後０～２４時間、２４～４８時間、４８～７２時間、７２～９６時間、１６８～１９２時間、２４０～２６４時間、および３３６～３６０時間で代謝ケージを用いて採尿し、測定まで－２０℃以下で凍結保存した。さらに、投与１５日後に肝臓を摘出し、測定まで－２０℃以下で凍結保存した。比較例１－２で得られた化合物は２０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、採尿ならびに肝臓摘出を行った。
（実施例２－２）ＨＡ誘導体を投与したラットの血漿の分析
　血漿サンプルを融解後、ＨＰ－β－ＣＤ（１００ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）溶液にて２倍希釈し、３７℃にて１時間インキュベート後、９６穴プレートリーダー（ＡＲＶＯ）にて蛍光標識ＨＡ誘導体濃度を測定した（定量限界：０．４μｇ／ｍＬ）。蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度推移を図２－１－１～図２－１－２６に示した。また、薬物動態パラメーター（血漿中濃度－時間曲線下面積外挿値（ＡＵＣ∞））をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ　Ｖｅｒ．６．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）によって解析し、その値を表９に示した。また、以下の式により算出される、同程度にコレステロールが導入された比較サンプルに対するＡＵＣ∞の比率を表１０に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000051
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
　カルボキシにアミノ酸またはアミノ酸アミドを導入し、さらにコレステリル基を導入したＨＡ誘導体（サンプル２－１～２－２５）は、カルボキシにコレステリル基のみを導入したＨＡ誘導体（比較サンプル２－１～２－７）と比較して、優位に血漿中濃度を維持することが明らかとなった。
（実施例２－３）ＨＡ誘導体を投与したラットの肝臓の分析
　約１ｇの肝臓サンプルにトリスバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ９．０）を添加し、ビーズを用いてホモジネートした。４ｍｇ／ｍＬプロナーゼ溶液を添加し、３７℃にて一晩インキュベートした。遠心分離後、ＨＰ－β－ＣＤ（１００ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）溶液にて２倍希釈し、さらに３７℃にて１時間インキュベート後、フィルターろ過し、以下の条件にてサイズ排除クロマトグラフィー分析を行った。なお、サンプル非投与ラットの肝臓も同様の処理を行い、投与前サンプルと混合したものを、スタンダードとして同様に分析を行った。
サイズ排除クロマトグラフィー分析条件
　分析カラム：ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社）
　カラム温度：２５℃
　移動相：ＨＰ－β－ＣＤ（１０ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）
　流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
　検出：Ｅｘ　４９４ｎｍ／Ｅｍ　５１５ｎｍ
　注入量：５０μＬ
　結果を図２－２－１～図２－２－２７に示す。クロマトグラムはそれぞれの最強ピークでノーマライズされている。比較例１－２のＨＡ誘導体（ＨＡ－ＥＤＯＢＥＡ－Ａｃ／ＦＬ、図２－２－２６）では、肝臓中において全く低分子化が観察されなかったのに対し、実施例のＨＡ誘導体は、いずれも低分子化した投与化合物が検出された。これは、本発明のＨＡ誘導体が生分解性を有することを示している。また、体内にて分解後、尿または糞にて体外へ排泄されると考えられる。
（実施例２－４）ＨＡ誘導体投与ラット尿の分析
　尿サンプルを０．２２μｍのフィルターでろ過し、ＨＰ－β－ＣＤ（１００ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）溶液にて２倍希釈した。３７℃にて１時間インキュベート後、フィルターろ過し、実施例２－３に記載の条件にてサイズ排除クロマトグラフィー分析を行った。なお、サンプル非投与ラットの尿サンプルも同様の処理を行い、投与前サンプルと混合したものを、スタンダードとして同様に分析を行った。
　結果を図２－３－１～図２－３－２７に示す。左に各時点のクロマトグラムを同じレンジで示し、右に各時点のクロマトグラムを最強ピークでノーマライズした図を示す。投与後０～２４時間、２４～４８時間、４８～７２時間、７２～９６時間、１６８～１９２時間、２４０～２６４時間、および３３６～３６０時間で採尿したサンプルをそれぞれ０－１ｄ、１－２ｄ、２－３ｄ、３－４ｄ、７－８ｄ、１０－１１ｄ、および１４－１５ｄとして、またそれぞれのスタンダードをＳＴＤとして図中に示す。
　比較例１－２のＨＡ誘導体（ＨＡ－ＥＤＯＢＥＡ－Ａｃ／ＦＬ）では、低分子化した投与化合物が尿中に観察されなかったのに対し、実施例のＨＡ誘導体には、低分子化した投与化合物が尿中に検出されたものもあった。これは、本発明のＨＡ誘導体の生分解性を、尿を調べることで簡便に評価できる場合があることを示している。
〔実施例３〕ヒアルロン酸誘導体の合成
（実施例３－１）Ｌ－グルタミン（Ｇｌｎ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｇｌｎ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－グルタミンメチルエステル塩酸塩（和光純薬株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｇｌｎを白色固体として得た。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、グルタミンのメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、２．３、２．４ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるグルタミンの導入率を算出した（表１１）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、グルタミンの別のメチレンのピーク（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、２．１ｐｐｍ；２Ｈ）が重なっているため、１．８～２．２ｐｐｍのピークの積分値から２．３、２．４ｐｐｍのピークの積分値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、修飾率の算出に使用した。さらに実施例１－４の記載と同じ条件でＨＡ－ＧｌｎのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ｇｌｎ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１－４と同様の方法でＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ－Ｇｌｎ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１－４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－２に示す。実施例１－４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表１１）。
（実施例３－２）Ｌ－メチオニン（Ｍｅｔ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｍｅｔ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－メチオニンエチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｍｅｔを白色固体として得た。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－３に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、メチオニンのメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＳＣＨ３、２．６ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるメチオニンの導入率を算出した（表１１）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、メチオニンの別のメチレンとメチル由来のピーク（－ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、２．１ｐｐｍ；５Ｈ）が重なっているため、１．８～２．２ｐｐｍのピークの積分値から２．６ｐｐｍのピークの積分値に５／２を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、導入率の算出に使用した。
　さらに実施例１－４の記載と同じ条件でＨＡ－ＭｅｔのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ｍｅｔ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１－４と同様の方法でＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ－Ｍｅｔ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１－４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－４に示す。実施例１－４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表１１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
（実施例３－３）Ｌ－アラニンアミド（ＡｌａＮＨ２）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－ＡｌａＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－アラニンアミド塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－５と同様の方法で行い、ＨＡ－ＡｌａＮＨ２－Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１－５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－５に示す。実施例１－５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１２）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、１．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アラニンアミドのメチル由来のピーク（－ＣＨ２－、１．３ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－５と同様にしてＨＡユニットにおけるアラニンアミドの導入率を算出した（表１２）。なお、アラニンアミドのメチル由来のピークには、コレステリル由来のピーク（４１Ｈ）が重なっているため、０．８～１．６ｐｐｍのピークの積分値から、０．７ｐｐｍのピークの積分値に４１／３を乗じた値を差し引いた値をアラニンアミドのメチレン由来のピークとして、導入率の算出に使用した。
（実施例３－４）Ｌ－アスパラギンアミド（ＡｓｎＮＨ２）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－ＡｓｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－アスパラギンアミド塩酸塩（国産化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－５と同様の方法で行い、ＨＡ－ＡｓｎＮＨ２－Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１－５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－６に示す。実施例１－５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１２）。また、実施例１－３の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－７に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、アスパラギンアミドのメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＣＯＮＨ２、２．７、２．８ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるアスパラギンアミドの導入率を算出した（表１２）
（実施例３－５）Ｌ－イソロイシンアミド（ＩｌｅＮＨ２）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－ＩｌｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－イソロイシンアミド塩酸塩（東京化成工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－５と同様の方法で行い、ＨＡ－ＩｌｅＮＨ２－Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１－５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－８に示す。実施例１－５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１２）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、１．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、イソロイシンアミド中のメチレンならびに２つのメチル由来のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、０．９ｐｐｍ；８Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるイソロイシンアミドの導入率を算出した（表３）。なお、イソロイシンアミドのメチル由来のピークには、コレステリル由来のピーク（４１Ｈ）が重なっているため、０．８～１．６ｐｐｍのピークの積分値から、０．７ｐｐｍのピークの積分値に４１／３を乗じた値を差し引いた値をイソロイシンアミドのメチレン由来のピークとして、導入率の算出に使用した。また、グルコサミンのアセチル由来のピークには、イソロイシンの３位の水素のピーク（－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、１．９ｐｐｍ；１Ｈ）が重なっているため、１．８～２．２ｐｐｍのピークの積分値から０．８～１．６ｐｐｍのピークの積分値に１／８を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、導入率の算出に使用した。
（実施例３－６）Ｌ－グルタミンアミド（ＧｌｎＮＨ２）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－ＧｌｎＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－グルタミンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－５と同様の方法で行い、ＨＡ－ＧｌｎＮＨ２－Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１－５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－９に示す。実施例１－５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１２）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、１．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、グルタミンアミド中のメチレン由来のピーク（－ＣＨ ２ ＣＨ２ＣＯＮＨ２、２．１ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるグルタミンアミドの導入率を算出した（表１２）。なお、グルタミンアミドのメチル由来のピークには、コレステリル由来のピーク（２Ｈ）が重なっているため、０．７ｐｐｍのピークの積分値に２／３を乗じた値を差し引いた値をグルタミンアミドのメチレン由来のピークとして、導入率の算出に使用した。また、グルコサミンのアセチル由来のピークには、グルタミンアミド中のメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＣＨ ２ ＣＯＮＨ２、１．９ｐｐｍ；２Ｈ）が重なっているため、１．８～２．０ｐｐｍのピークの積分値から２．１ｐｐｍのピークの積分値に２／２を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、導入率の算出に使用した。
（実施例３－７）Ｌ－メチオニンアミド（ＭｅｔＮＨ２）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－ＭｅｔＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－メチオニンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－５と同様の方法で行い、ＨＡ－ＭｅｔＮＨ２－Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。実施例１－５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１０に示す。実施例１－５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１２）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、１．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、メチオニンアミド中のメチル由来のピーク（－ＳＣＨ３、２．１ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるメチオニンアミドの導入率を算出した（表１２）。グルコサミンのアセチル由来のピークには、メチオニンアミド中のメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＳＣＨ３、１．９ｐｐｍ；２Ｈ）が重なっているため、１．８～２．０ｐｐｍのピークの積分値から２．１ｐｐｍのピークの積分値に２／３を乗じた値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、導入率の算出に使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
（比較例３－１）Ｌ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｇｌｕ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－グルタミン酸ジエチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｇｌｕを白色固体として得た。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１１に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、グルタミン酸のメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、２．４ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるグルタミン酸の導入率を算出した（表１３）。なお、グルコサミンのアセチル由来のピークには、グルタミン酸の別のメチレン由来のピーク（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、２．１ｐｐｍ；２Ｈ）が重なっているため、１．８～２．２ｐｐｍのピークの積分値から２．４ｐｐｍのピークの積分値を差し引いた値をグルコサミンのアセチル由来のピークとして、修飾率の算出に使用した。さらに実施例１－４の記載と同じ条件でＨＡ－ＧｌｕのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ｇｌｕ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１－４と同様の方法でＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ－Ｇｌｕ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１－４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１２に示す。実施例１－４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表１３）。
（比較例３－２）Ｌ－トリプトファン（Ｔｒｐ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｔｒｐ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－アラニンエチルエステル塩酸塩の代わりにＬ－トリプトファンエチルエステル塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－４と同様の方法で行い、ＨＡ－Ｔｒｐを白色固体として得た。実施例１－３の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１３に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、トリプトファンのインドール環由来のピーク（－Ｃ８Ｈ６Ｎ、７．８ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるトリプトファンの導入率を算出した（表１３）。さらに実施例１－４の記載と同じ条件でＨＡ－ＴｒｐのＴＢＡ塩（ＨＡ－Ｔｒｐ－ＴＢＡ）を白色固体として得た。次に、実施例１－４と同様の方法でＣｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩、ＦＬと反応させ、目的物（ＨＡ－Ｔｒｐ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）を黄色固体として得た。実施例１－４の記載と同じ条件で測定した１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図３－１４に示す。実施例１－４に記載の方法によりコレステリル基の導入率を算出した（表１３）。
（比較例３－３）Ｌ－チロシン（Ｔｙｒ）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｔｙｒ－Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　１０ｋＤａのＨＡ－Ｎａを出発原料とするＨＡ－ＴＢＡを用いたこと以外は、比較例１－３と同様の方法で行い、１０ｋのＨＡ－Ｔｙｒ－Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色固体として得た。チロシンならびにコレステリル基の導入率も比較例１－３と同様の方法で算出した（表１３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
（実施例３－８）蛍光標識されていないヒアルロン酸誘導体の合成
　５－アミノメチルフルオレセインを加えていないこと、ならびに出発原料として用いたＨＡ－Ｎａの分子量が異なること以外は実施例１－４～実施例１－１８ならびに実施例３－１～実施例３－７ならびに比較例３－１～比較例３－３に記載の方法により各種ヒアルロン酸誘導体を白色固体として得た。対応する実施例の記載と同じ方法によりコレステリル基の導入率ならびにアミノ酸およびアミノ酸アミドの導入率を算出した（表１４－１、表１４－２）。原料のヒアルロン酸は、５ｋＤａのみＲ＆Ｄシステム社製を用い、それ以外は資生堂社製のものを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
〔実施例４〕ｉｎ　ｖｉｖｏでの血中滞留性および生分解性の確認
（実施例４－１）ＨＡ誘導体を投与したラットからの生体サンプル採取
　実施例３－１～３－７および比較例３－１～３－３で得られた化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与後５分、２、７、２４、４８、７２および１６８時間でヘパリンナトリウム処理したシリンジを用いて頸静脈採血し、遠心分離により血漿を得た。比較例のサンプルの中には投与後９６時間においても採血したものもある。この血漿サンプルは測定まで－２０℃以下で凍結保存した。また、投与７日後に肝臓を摘出し、測定まで－２０℃以下で凍結保存した。
（実施例４－２）ＨＡ誘導体を投与したラットの血漿の分析
　血漿サンプルを融解後、ＨＰ－β－ＣＤ（１００ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）溶液にて２倍希釈し、３７℃にて１時間インキュベート後、９６穴プレートリーダー（ＡＲＶＯ）にて蛍光標識ＨＡ誘導体濃度を測定した（定量限界：０．４μｇ／ｍＬ）。蛍光標識ＨＡ誘導体の血漿中濃度推移を図４－１－１～図４－１－１０に示した。また、薬物動態パラメーター（血漿中濃度－時間曲線下面積外挿値（ＡＵＣ∞））をＷｉｎＮｏｎｌｉｎ　Ｖｅｒ．６．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社製）によって解析し、その値を表１５に示した。また、以下の式により算出される、同程度にコレステロールが導入された比較サンプルに対するＡＵＣ∞の比率を表１６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000059
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000060
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000061
　カルボキシにアミノ酸またはアミノ酸アミドを導入し、さらにコレステリル基を導入したＨＡ誘導体（サンプル４－１～４－７）は、カルボキシにコレステリル基のみを導入したＨＡ誘導体（比較サンプル２－１）と比較して、優位に血漿中濃度を維持することが明らかとなった。なお、１０ｋ　ＨＡ－Ｔｙｒ－Ｃｈｏｌ－７％／ＦＬ（比較サンプル４－３）は９９ｋ　ＨＡ－Ｔｙｒ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（比較サンプル２－８）と同じくカルボキシにコレステリル基のみを導入したＨＡ誘導体と比較して血中滞留性が低下した。一方で、９９ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－７％／ＦＬ（サンプル２－１）、１０ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－１６％／ＦＬ（サンプル２－７）はいずれもカルボキシにコレステリル基のみを導入したＨＡ誘導体と比較して優位にもしくは同等に血漿中濃度を維持した。このことから、カルボキシに導入するアミノ酸の違いによるＨＡ誘導体の血中滞留性の優劣は、原料ヒアルロン酸の分子量には影響されない（依存しない）ことが示唆される。
（実施例４－３）ＨＡ誘導体を投与したラットの肝臓の分析
　約１ｇの肝臓サンプルにトリスバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ９．０）を添加し、ビーズを用いてホモジネートした。４ｍｇ／ｍＬプロナーゼ溶液を添加し、３７℃にて一晩インキュベートした。遠心分離後、ＨＰ－β－ＣＤ（１００ｍＭ）／トリス緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）溶液にて２倍希釈し、さらに３７℃にて１時間インキュベート後、フィルターろ過し、以下の条件にてサイズ排除クロマトグラフィー分析を行った。なお、サンプル非投与ラットの肝臓も同様の処理を行い、投与前サンプルと混合したものを、スタンダードとして同様に分析を行った。
サイズ排除クロマトグラフィー分析条件
　分析カラム：ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー株式会社）
　カラム温度：２５℃
　移動相：ＨＰ－β－ＣＤ（１０ｍＭ）／トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ９．０）
　流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
　検出：Ｅｘ　４９４ｎｍ／Ｅｍ　５１５ｎｍ
　注入量：５０μＬ
　結果を図４－２－１～図４－２－１０に示す。クロマトグラムはそれぞれの最強ピークでノーマライズされている。比較例１－２のＨＡ誘導体（ＨＡ－ＥＤＯＢＥＡ－Ａｃ／ＦＬ、図２－２－２６）では、肝臓中において全く低分子化が観察されなかったのに対し、実施例のＨＡ誘導体は、いずれも低分子化した投与化合物が検出された。　これらのことから、本発明のＨＡ誘導体は生分解性を有しており、体内にて分解後、尿または糞にて体外へ排泄されると考えられる。
〔実施例５〕塩濃度応答型沈殿徐放製剤
（実施例５－１）Ｌ－チロシンアミド（ＴｙｒＮＨ２）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－ＴｙｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－チロシンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－５と同様の方法で行い、ＨＡ－ＴｙｒＮＨ２－Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色水溶液として得た。凍結乾燥品を実施例１－５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－１に示す。実施例１－５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１７）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、１．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、チロシン中のヒドロキシフェニル由来のピーク（－Ｃ６Ｈ４ＯＨ、６．８、７．２ｐｐｍ；４Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるチロシンアミドの導入率を算出した（表１７）
（実施例５－２）Ｌ－トリプトファンアミド（ＴｒｐＮＨ２）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－ＴｒｐＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－トリプトファンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－５と同様の方法で行い、ＨＡ－ＴｒｐＮＨ２－Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色水溶液として得た。凍結乾燥品を実施例１－５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－２に示す。実施例１－５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１７）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、１．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、トリプトファンアミド中のインドール環由来のピーク（－Ｃ８Ｈ６Ｎ、７．６ｐｐｍ；１Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるトリプトファンアミドの導入率を算出した（表１７）。
（実施例５－３）Ｌ－フェニルアラニンアミド（ＰｈｅＮＨ２）ならびにコレステリル　６－アミノヘキシルカーバメートにより修飾した蛍光標識ＨＡ誘導体（ＨＡ－ＰｈｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ／ＦＬ）の合成
　Ｌ－スレオニンアミド塩酸塩の代わりにＬ－フェニルアラニンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１－５と同様の方法で行い、ＨＡ－ＰｈｅＮＨ２－Ｃｈｏｌ／ＦＬを黄色水溶液として得た。凍結乾燥品を実施例１－５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図５－３に示す。実施例１－５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表１７）。グルコサミンのアセチル由来のピーク（－ＣＯＣＨ３、１．８ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、フェニルアラニン中のフェニル由来のピーク（－Ｃ６Ｈ５、７．２～７．４ｐｐｍ；５Ｈ）の積分値より、実施例１－４と同様にしてＨＡユニットにおけるフェニルアラニンアミドの導入率を算出した（表１７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
（比較例５－１）Ｌ－チロシンアミド（ＴｙｒＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＴｙｒＮＨ２）の合成
　実施例１－３で合成した、ＨＡ－Ｎａを出発原料とするＨＡ－ＴＢＡ（９９ｋＤａ）の無水ＤＭＳＯ溶液を調製した。その後、Ｌ－チロシンアミド塩酸塩（渡辺化学株式会社製）をＨＡユニットに対して５モル等量添加し、次に４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）をＨＡユニットに対して３モル等量添加し、室温で一晩撹拌した。反応溶液は、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析した。透析中に沈殿が生じ、目的物を水溶液として回収できなかった。
（比較例５－２）Ｌ－トリプトファンアミド（ＴｒｐＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＴｒｐＮＨ２）の合成
　Ｌ－チロシンアミド塩酸塩の代わりにＬ－トリプトファンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、比較例５－１と同様の方法でおこなった。透析中に沈殿が生じ、目的物を水溶液として回収できなかった。
（比較例５－３）Ｌ－フェニルアラニンアミド（ＰｈｅＮＨ２）により修飾したＨＡ誘導体（ＨＡ－ＰｈｅＮＨ２）の合成
　Ｌ－チロシンアミド塩酸塩の代わりにＬ－フェニルアラニンアミド塩酸塩（渡辺化学工業株式会社製）を用いたこと以外は、比較例５－１と同様の方法でおこなった。ＨＡ－ＰｈｅＮＨ２を白色固体として得た。
（実施例５－４）
　実施例５－１、実施例５－２、比較例５－１、比較例５－２で合成したＨＡ誘導体の水への透析後の溶解性状を表１８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000063
　サンプル５－１ならびにサンプル５－２はステリル基を導入しない比較サンプル５－１ならびに比較サンプル５－２に比べ、ステリル基を導入した場合の方が、ステリル基の有する疎水性にも係わらず、水中でより分散することが明らかとなった。
（実施例５－５）塩濃度依存的沈殿性能評価
　実施例５－１、実施例５－２、実施例５－３、実施例３－３で得られたＨＡ誘導体（９９ｋ　ＨＡ－ＴｙｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ、９９ｋ　ＨＡ－ＴｒｐＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ、９９ｋ　ＨＡ－ＰｈｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ、９９ｋ　ＨＡ－ＡｌａＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ）の水溶液（超純水）に対し、最終緩衝液組成が１０ｍＭ　ＰＢ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌとなるように濃縮緩衝液を加え、ＨＡ誘導体濃度を４．５ｍｇ／ｍＬとした。３７℃にて２０分間インキュベート後、２０００Ｇにて１分間遠心し、上澄みを９６穴プレートリーダー（ＡＲＶＯ）にて蛍光強度を測定した。スタンダードを用いて蛍光標識ＨＡ誘導体濃度を算出し、当初使用量に対する残存率を算出した（表１９）。同様の操作を比較例１－１で得られた９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（比較サンプル５－３）に対しても行った。比較サンプル５－１、５－２の結果はＷＯ２０１０／０５３１４０に記載の結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000064
　５０ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（比較サンプル５－１）は塩の濃度が低い条件（超純水）でも生理塩濃度（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）のいずれにおいても溶液状態であることがＷＯ２０１０／０５３１４０に示されている。また、９９ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（比較サンプル５－３）も同様の挙動を示すことが本実験により示された。一方、９９ｋ　ＨＡ－ＰｈｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（サンプル５－３）は塩の濃度が低い条件（超純水）では溶解し、生理塩濃度（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）では析出するという塩濃度依存的な挙動を示すことが確認された。この結果は、糖などにより等張化した低塩濃度溶液を調製することにより投与後皮下で沈殿する製剤において本発明のＨＡ誘導体が担体として使用されうる可能性を示唆する。また、その沈殿性能（残存量：１％以下）はこれまでＨＡ誘導体で報告されている値（比較サンプル５－２：５０ｋ　ＨＡ－Ｃｈｏｌ－７％／ＦＬ：２２．６％）と比較して優位に高いものであった。
　９９ｋ　ＨＡ－ＴｙｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（サンプル５－１）、９９ｋ　ＨＡ－ＴｒｐＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（サンプル５－２）も９９ｋ　ＨＡ－ＴｒｐＮＨ２／Ｃｈｏｌ－６％／ＦＬ（サンプル５－３）同様に塩濃度依存的な沈殿挙動を示し、塩濃度依存的沈殿製剤として有用であることが示された。
（実施例５－６）ラット皮下における沈殿性評価
　実施例５－１、実施例５－２、実施例５－３で得られた蛍光標識ＨＡ誘導体（９９ｋ　ＨＡ－ＴｙｒＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ、９９ｋ　ＨＡ－ＴｒｐＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ、９９ｋ　ＨＡ－ＰｈｅＮＨ２／Ｃｈｏｌ―６％／ＦＬ）で得られた化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量（スクロース溶液）でラット皮下に単回投与した。投与７日後、投与部位を確認したところ、確かに蛍光標識ＨＡ誘導体が沈殿し、存在していることが確認された。
（実施例５－７）蛍光標識されていないヒアルロン酸誘導体の合成
　５－アミノメチルフルオレセインを加えていないこと、ならびに出発原料として用いたＨＡ－Ｎａの分子量が異なること以外は実施例５－１～実施例５－３に記載の方法により各種ヒアルロン酸誘導体を白色固体として得た。対応する実施例の記載と同じ方法によりコレステリル基の導入率ならびにアミノ酸およびアミノ酸アミドの導入率を算出した（表２０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000065
〔実施例６〕薬物封入能評価
（実施例６－１）パクリタキセル（ＰＴＸ）の封入
　実施例１－４ならびに実施例１－２１ならびに実施例３－８ならびに実施例５－７で得られたＨＡ誘導体の水溶液（超純水）に対し、パクリタキセル（１０ｍｇ／ｍｌ、メタノール溶液）を加え、最終パクリタキセル濃度を１００μｇ／ｍＬ、ＨＡ誘導体濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとした。４℃にて一晩静置後、４７００Ｇにて１０分間遠心し、上澄み１００μＬに対し、５０％アセトニトリル１００μＬ、１００ｍＭ　ＨＰ－β－ＣＤ　５０μＬを加え、以下の条件にて逆相クロマトグラフィー分析を行った。
逆相クロマトグラフィー分析条件
　分析カラム：ＰＬＲＰ－Ｓ　１０００Å（Ａｇｉｌｅｎｔ社）　カラム温度：４０℃
　移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液
　グラジエント：Ｂ５％→Ｂ９５％（３．４分）
　流速：２ｍＬ／ｍｉｎ
　検出：ＵＶ２５４ｎｍ
　注入量：３０μＬ
　スタンダードを用いて算出した上清中パクリタキセル濃度を図６－１－１～図６－１－４に示す。ＨＡ誘導体が存在しない場合のパクリタキセルの溶解度は０．６μｇ／ｍＬであるのに対し、ＨＡ誘導体の存在下において優位にパクリタキセルの溶解度の向上が確認された。これは、パクリタキセルなどの難溶性低分子化合物がＨＡ誘導体に封入されることを示唆している。
（実施例６－２）シクロスポリン（シクロスポリンＡ：ＣｙＡ）の封入
　実施例１－４ならびに実施例１－２１ならびに実施例３－８ならびに実施例５－７で得られたＨＡ誘導体の水溶液（超純水）に対し、シクロスポリン（１０ｍｇ／ｍｌ、メタノール溶液）を加え、最終シクロスポリン濃度を３００μｇ／ｍＬ、ＨＡ誘導体濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとした。４℃にて一晩静置後、４７００Ｇにて３０分間遠心し、上澄み１００μＬに対し、５０％アセトニトリル１００μＬ、１００ｍＭ　ＨＰ－β－ＣＤ　５０μＬを加え、実施例６－１に記載の条件にて逆相クロマトグラフィー分析を行った。検出はＵＶ２１０ｎｍを用いた。スタンダードを用いて算出した上清中シクロスポリン濃度を図６－２－１～図６－２－４に示す。ＨＡ誘導体が存在しない場合のシクロスポリンの溶解度は２８μｇ／ｍＬであるのに対し、ＨＡ誘導体の存在下において優位にシクロスポリンの溶解度の向上が確認された。これは、シクロスポリンなどの難溶性ペプチドがＨＡ誘導体に封入されることを示唆している。
〔実施例７〕 ｉｎ　ｖｉｔｒｏリリース試験
（実施例７－１）パクリタキセルリリース試験
　実施例１－２１で得られた１０ｋ　ＨＡ－Ａｌａ－Ｃｈｏｌ－４１％の水溶液（超純水）に対し、パクリタキセル（１０ｍｇ／ｍｌ、メタノール溶液）を加え、最終パクリタキセル濃度を１００μｇ／ｍＬ、ＨＡ誘導体濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとした。４℃にて一晩静置後、フリーのパクリタキセルを透析膜（３，０００ＭＷＣＯ）にて４℃にて精製した。得られたＨＡ誘導体／パクリタキセル複合体を透析膜（３，０００ＭＷＣＯ）に入れ、ＰＢＳに対して、３７℃にてインキュベートした。経時的に透析膜内のパクリタキセル濃度を逆相クロマトグラフィー分析にて定量し、リリースを確認した。透析膜内のパクリタキセルの残存量を図７－１に示す。この結果はＨＡ誘導体が徐放担体として使用し得ることを示している。
（実施例７－２）シクロスポリンリリース試験
　パクリタキセルの代わりにシクロスポリンＡを用いたこと以外は実施例７－１に記載の方法で実施し、シクロスポリンのリリースを確認した。透析膜内のシクロスポリンの残存量を図７－２に示す。この結果はＨＡ誘導体が徐放担体として使用し得ることを示している。
〔実施例８〕 リンカーの異なるＨＡ－ＡＡ－Ｃｈｏｌの合成
　コレステリル　６－アミノヘキシルカーバメート（Ｃｈｏｌ－Ｃ６）の代わりにコレステリル　２－アミノエチルカーバメート（Ｃｈｏｌ－Ｃ２）、コレステリル　１２－ドデシルアミノヘキシルカーバメート（Ｃｈｏｌ－Ｃ１２）、コレステリル　８－アミノ－３，６－ジオキサオクチルカーバメート（Ｃｈｏｌ－ＥＯ２）を用いたこと以外は実施例１－４と同様の方法で行い、リンカーの異なるＨＡ－ＡＡ－Ｃｈｏｌを固体として得た（表２０）。コレステリル　２－アミノエチルカーバメート、コレステリル　１２－ドデシルアミノヘキシルカーバメート、コレステリル　８－アミノ－３，６－ジオキサオクチルカーバメートはＷＯ２０１０／０５３１４０に記載の方法にて合成した。実施例１－５の記載と同じ条件で測定した生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図８－１～図８－６に示す。実施例１－５の記載と同じ方法でＨＡユニットに対するコレステリル基の導入率を算出した（表２１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000066
〔実施例９〕 ＨＡ－Ａｌａ－コラン酸の合成
（実施例９－１）Ｎ－（２－アミノエチル）５βコラン酸アミド（Ｎ－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）５β－ｃｈｏｌａｎｏａｍｉｄｅ）の合成
　５βコラン酸メチルエステル（ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ社、１００μｇ）をエチレンジアミン（６ｍＬ）に溶解し、１３０℃、４時間、還流した。減圧留去後、ジクロロメタンに溶解し、超純水にて洗浄した。減圧下で溶媒を留去し、アミノエチル５βコラン酸アミドを得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝０．６４（３Ｈ、ｓ、ＣＨ３）、０．９１（３Ｈ、ｓ、ＣＨ３）、０．９２（３Ｈ、ｄ、ＣＨ３）２．０－２．３（２Ｈ、ｍ、ＣＯＣＨ２）、２．８（２Ｈ、ｍ、ＣＨ ２ ＣＨ２ＮＨＣＯ）、３．３（２Ｈ、ｍ、ＣＨ２ＣＨ ２ ＮＨＣＯ）、５．９（１Ｈ、ｂｒ、ＮＨＣＯ）。
（実施例９－２）ＨＡ－Ａｌａ－コラン酸の合成
　実施例１－４と同様の方法で合成されたＨＡ－Ａｌａ－ＴＢＡの無水ＤＭＳＯ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を調製し、その後、実施例９－１で調製したアミノエチル５βコラン酸アミドをＨＡ－Ａｌａ－ＴＢＡユニットに対して以下の表２２に示す比率で各溶液に添加した。次に、ＤＭＴ－ＭＭをＨＡ－Ａｌａ－ＴＢＡに対して以下の表２２に示す比率で加えた。反応溶液は、メタノール／水　１／１混液、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析し、得られた透析液を凍結乾燥して目的物（ＨＡ－Ａｌａ－ＣＡ）を白色固体として得た。
　測定溶媒としてＤＭＳＯ－ｄ６を用いた１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの代表例（９９ｋＤａのＨＡを出発原料として用い、コラン酸の導入率が１３％の生成物）を図９に示す。グルコサミンのアセチル由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６～２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、コラノイル基中のメチル由来のピーク（ＣＨ３、０．６ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値より、下に示す式からＨＡユニットに対するコラン酸の導入率を算出した（表２２）。なおグルコサミンのアセチル由来のピークが含まれる１．６～２．０ｐｐｍ付近のピークにはコラン酸基由来のピーク（７Ｈ）が重なっているため、１．６～２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコラン酸基メチル由来のピーク（０．６ｐｐｍ）の積分値を７／３したものを差し引いて算出した値（即ち、積分値（１．６～２．０ｐｐｍ）－積分値（０．６ｐｐｍ）×７／３）をＨＡ由来のアセチルの積分値として、導入率の計算に使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000067
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000068

Claims (12)

  1. 　式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル、およびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
    　Ｒ５は、水素原子、ホルミル、またはＣ１－６アルキルカルボニルであり；
    　Ｘ１は、ヒドロキシ、－Ｏ－Ｑ＋、Ｃ１－６アルコキシ、－ＮＲ７Ｒ８、または－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２であり；
    　Ｑ＋は、カウンターカチオンを表し；
    　Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素原子、およびＣ１－６アルキルから選択され；
    　Ｒａは、水素原子、またはＣ１－６アルキルであり、ここで該アルキルは、独立に、ヒドロキシ、カルボキシ、カルバモイル、Ｃ１－６アルキルチオ、アリール、およびヘテロアリールから選択される１以上の基で置換されていてもよく、ここで該アリールは１以上のヒドロキシで置換されていてもよく；
    　Ｚ１は、Ｃ２－３０アルキレン、または－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、該アルキレンは、独立に、－Ｏ－、－ＮＲｇ－および－Ｓ－Ｓ－から選択される１～５の基が挿入されていてもよく、ｍは、１～１００から選択される整数であり；
    　Ｚ２は、以下の式：
    　－ＮＲｂ－Ｚ３、
    　－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｚ３、
    　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｚ３、
    　－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｚ３、
    　－ＣＯＯ－Ｚ３、
    　－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｚ３、
    　－Ｏ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｚ３、
    　－Ｏ－ＣＯＯ－Ｚ３、
    　－Ｓ－Ｚ３、
    　－ＣＯ－Ｚａ－Ｓ－Ｚ３、
    　－Ｏ－ＣＯ－Ｚｂ－Ｓ－Ｚ３、
    　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｚｂ－Ｓ－Ｚ３、および
    　－Ｓ－Ｓ－Ｚ３、
    により表される基から選択され；
    　ＲｂおよびＲｃは、独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキルおよびヒドロキシＣ２－２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、独立に、－Ｏ－および－ＮＲｆ－から選択される１～３個の基が挿入されていてもよく；
    　Ｒｆは、独立に、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキルおよびヒドロキシＣ２－１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、－Ｏ－および－ＮＨ－から選択される１～２個の基が挿入されていてもよく；
    　Ｒｇは、独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキルまたはヒドロキシＣ２－２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、－Ｏ－および－ＮＨ－から選択される１～３個の基が挿入されていてもよく；
    　Ｚ３は、ステリル基であり；
    　Ｚａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
    　Ｚｂは、Ｃ２－８アルキレンまたはＣ２－８アルケニレンである］
    で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体であって、Ｘ１が－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２である式（Ｉ）で表される繰り返し単位が含まれない場合、さらに式（ＩＩ）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａは、独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル、およびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
    　Ｒ５ａは、水素原子、ホルミル、またはＣ１－６アルキルカルボニルであり；
    　Ｘ２は、－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２であり、ここで、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は既に定義したとおりである］；
    で表される繰り返し単位を含む、ヒアルロン酸誘導体。
  2. 　式（ＩＩｂ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
    　Ｒ５ｂは、水素原子、ホルミルおよびＣ１－６アルキルカルボニルから選択され；
    　Ｘｂは、ヒドロキシおよび－Ｏ－Ｑ＋から選択され、ここでＱ＋は、カウンターカチオンを表す］
    で表わされる繰り返し単位をさらに含む、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
  3. 　式（Ｉ）においてＸ１が－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２である、請求項１または２に記載のヒアルロン酸誘導体。
  4. 　存在する二糖の繰り返し単位における、式（Ｉ）で表わされる二糖単位の割合が、７０～１００％である、請求項１～３のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  5. 　存在する二糖の繰り返し単位における、基－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２を含む二糖単位の割合が、３～５０％である、請求項１～４のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  6. 　Ｘ１が－ＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２である式（Ｉ）で表される繰り返し単位が含まれない、請求項１または２に記載のヒアルロン酸誘導体。
  7. 　存在する二糖の繰り返し単位における、（Ｉ）で表わされる繰り返し単位の割合、および式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合の和が、７０～１００％である、請求項１、２および６のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  8. 　Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、およびＲ４ｂの全てを水素原子とし、Ｒ５ｂをアセチルとし、かつ、Ｘｂを－Ｏ－Ｎａ＋とした場合の重量平均分子量が３キロダルトン～１５００キロダルトンとなる、請求項２に定義した式（ＩＩｂ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を用いて製造される、請求項１～７のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  9. 　Ｚ１が、Ｃ２－１０アルキレンであり、Ｚ２が、－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｚ３であり、Ｚ３が、コレステリル基である、請求項１～８のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  10. 　式（ＩＩｂ）で表わされる繰り返し単位および式（Ｉａ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式中、Ｘａは、ヒドロキシ、－Ｏ－Ｑ＋、Ｃ１－６アルコキシおよび－ＮＲ７Ｒ８から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｑ＋、およびＲａは、請求項１に定義した通りである］
    で表わされる繰り返し単位をそれぞれ含むヒアルロン酸誘導体を、以下の式
    　　ＨＮＲ９－Ｚ１－Ｚ２
    ［式中、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は、請求項１に定義した通りである］
    で表わされる化合物と反応させることにより得られる、請求項１～９のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体と薬物を含む、医薬組成物。
  12. 　薬物がヒアルロン酸誘導体と複合体を形成することにより担持される、請求項１１に記載の医薬組成物。
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