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WO2014017319A1 - フィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生低下に伴う疾患治療剤及び当該治療剤のスクリーニング方法 - Google Patents

フィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生低下に伴う疾患治療剤及び当該治療剤のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2014017319A1
WO2014017319A1 PCT/JP2013/069163 JP2013069163W WO2014017319A1 WO 2014017319 A1 WO2014017319 A1 WO 2014017319A1 JP 2013069163 W JP2013069163 W JP 2013069163W WO 2014017319 A1 WO2014017319 A1 WO 2014017319A1
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WO
WIPO (PCT)
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gpr142
flg
production
compound
therapeutic agent
Prior art date
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PCT/JP2013/069163
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English (en)
French (fr)
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健治 椛島
篤司 大塚
形平 江川
博美 土居
明子 前川
周 成宮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Astellas Pharma Inc
Kyoto University NUC
Original Assignee
Astellas Pharma Inc
Kyoto University NUC
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Publication date
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Priority to US14/414,940 priority patent/US20150190416A1/en
Priority to JP2014526853A priority patent/JPWO2014017319A1/ja
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    • G01N2800/202—Dermatitis

Definitions

  • the present invention relates to a filaggrin (FLG) production promoter comprising a specific G protein-coupled receptor (GPR) agonist as an active ingredient, a therapeutic agent for a disease associated with a decrease in filaggrin production, and the treatment
  • FLG filaggrin
  • GPR G protein-coupled receptor
  • the stratum corneum (stratum corneum) regularly layered from several layers to several tens of layers located on the outermost layer of the epidermis functions as a barrier layer against intrusion of substances and allergens from outside, ultraviolet rays and the like.
  • the stratum corneum has an action of suppressing the release of moisture from the body and a function of retaining the moisture of the stratum corneum itself in order to protect itself from drying of the external environment.
  • a natural moisturizing factor (NMF) is known as one having an action of retaining moisture in the stratum corneum itself.
  • the amino acid which is the main component of NMF, is known to have a high correlation with the amount of water in the stratum corneum, and is extremely important for retention of water in the stratum corneum.
  • This amino acid is produced by the degradation of filaggrin from keratohyalin granules in the stratum corneum. Filaggrin is expressed as profilagrin in epidermal keratinocytes, phosphorylates immediately and accumulates in keratohyalin granules.
  • profilagrin is a histidine-rich protein of about 400 KDa, and binds 10-12 tandems using filaggrin consisting of 324 amino acids (hereinafter also simply referred to as “FLG” or “FLG monomer”) as a repeating unit. Is. Thereafter, profilagrin (proFLG) is decomposed into FLG through dephosphorylation and hydrolysis, and transferred to the stratum corneum. In the stratum corneum, FLG increases the efficiency of keratin filament aggregation and is involved in the internal organization of keratinocytes (J. Invest. Dermatol. (1994) 103 (5): 731-740, J. Cell Science (2009) 122 (9): 1285-1294). Thus, FLG plays an important role in the barrier function of the skin.
  • Atopic dermatitis is a frequent intractable allergic disease found in about 20% of children in developed countries.
  • the cause of atopic dermatitis is still unclear, and in addition to genetic factors, various factors such as environmental factors, food, mental stress, systemic and local infection are considered to be involved.
  • Atopic dermatitis can be classified into a type in which the amount of IgE antibody is elevated (exogenous atopic dermatitis) and a normal type (endogenous atopic dermatitis). Endogenous atopic dermatitis is caused by factors such as mental stress, and this type often has no change in the FLG gene.
  • exogenous atopic dermatitis is often associated with the above-described mutation of the FLG gene.
  • the basic treatment of such atopic dermatitis is performed by a combination of removal of onset / deteriorating factors, correction of abnormal skin function, and drug therapy for suppressing inflammation.
  • main skin function abnormalities in atopic dermatitis include a decrease in water retention ability and barrier function of the stratum corneum, a decrease in itch threshold, and easy infectivity.
  • Pharmacological treatment for the decrease in water retention ability / barrier function of the stratum corneum, stagnation threshold, and susceptibility to infection is distinguished by the prescription subject and prescription time.
  • itching includes peripheral itching involving histamine and itch substance produced by eosinophils and central itching involving opioid receptors.
  • a drug for treating such itch is prescribed according to the level of itch.
  • the degree of itch is diagnosed in stages from “I don't feel itch” to “I can't stand itch”, and an antipruritic agent is prescribed when an itch that doesn't stand can be developed.
  • patients with atopic dermatitis are susceptible to skin infections such as contagious impetigo, herpes simplex, molluscum contagiosum, that is, if they are diagnosed as easily infectious, there are drugs for those infections. To be prescribed.
  • drugs for lowering the water retention ability and barrier function of the stratum corneum are related to the water retention ability and barrier function of the stratum corneum by reducing FLG production, regardless of the degree of itching, the onset of itching, or the onset of infection It is prescribed for patients with atopic dermatitis that has decreased.
  • Patent Document 1 JP 2009-256269 A
  • Patent Document 2 JP 2003-146886 A
  • glycolipids Patent Document 3
  • Naturally occurring components such as rosmarinic acid and eriodictyol-7-O-rutinoside
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2010-90037
  • Development of a safe and highly effective substance having a FLG production promoting action that can be used for the treatment / prevention of skin diseases such as atopic dermatitis is desired.
  • the target receptor of such a substance is unknown, and therefore, it is not possible to screen for a substance having a FLG production promoting action systematically.
  • G protein-coupled receptor 142 (hereinafter simply referred to as “GPR142”) is an orphan G protein-coupled receptor (orphan GPR) belonging to the rhodopsin family.
  • Human GPR142 is a protein consisting of a 462 amino acid sequence (FEBS Letters 554 (2003) 381-388). It has been reported that mouse Pgr (GPR142) is expressed on the islets of Langerhans (Cell 135, 561-571, Supplemental Data (2008)). In addition, it has been reported that mRNA of mouse GPR142 is expressed in the brain, spleen, liver, kidney and testis (Neuropharmacology 50 (2006): 512-520).
  • Patent Document 6 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-175687 discloses that cells are applied by applying a cyclic AMP (cyclic AMP or cAMP) antagonist after applying tape stripping to the skin of a hairless mouse to physically destroy the skin barrier. It has been described to reduce the level of internal calcium and restore the barrier. However, there is no description that cAMP antagonists restore skin barrier destruction associated with decreased production of FLG, nor that FLG production is promoted via GPR142.
  • a cyclic AMP cyclic AMP or cAMP
  • Patent Document 7 International Publication WO2002 / 074341 pamphlet describes N-quinolylbenzamide containing N- (4-amino-2-methyl-6-quinolyl) -2-[(4-ethylphenoxy) methyl] benzamide. It is described that a nociceptin antagonist such as a derivative is used as an antipruritic agent for the prevention and treatment of itch caused by a number of diseases such as pruritus-related diseases, local pruritus, and nodular prurigo. And atopic dermatitis is mentioned as one of the many diseases accompanied by pruritus.
  • Patent Document 7 discloses that the N-quinolylbenzamide derivative has an effect of promoting FLG production, describes GPR142, and improves skin moisture retention ability and barrier function deterioration, thereby causing skin diseases such as atopic dermatitis. There is no description or suggestion that predicts that it can be used as a drug for the treatment. Further, Patent Document 7 does not have a test example using a model of itch that occurs specifically with atopic dermatitis.
  • Patent Document 8 Patent No. 3013989, JP-A-11-335355 discloses N- (4-amino-2-methyl-6-quinolyl) -2-[(4-ethylphenoxy) as a nociceptin antagonist. Although N-quinolylbenzamide derivatives containing methyl] benzamide have been disclosed, analgesics are listed as their uses, but there is no description of GPR142 or FLG production promoting effect.
  • Ivermectin is sold under the trade name stromecitol as a therapeutic agent for intestinal fecal nematosis and scabies.
  • stromecitol a therapeutic agent for intestinal fecal nematosis and scabies.
  • ivermectin has been reported to have an effect on a mouse model of allergic asthma (Inflammation Research (2011) 60 (6): 589-596), there is no description of GPR142 or FLG production promoting effect.
  • JP 2009-256269 A Japanese Patent Laid-Open No. 2003-146886 JP 2006-241095 A JP 2010-90037 gazette International Publication WO2010 / 093849 Pamphlet JP 2004-175687 A International Publication WO2002 / 074341 Pamphlet Japanese Patent No. 3013989, Japanese Patent Laid-Open No. 11-335355
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent useful for the treatment of filaggrin (FLG) production promoter and diseases associated with decreased FLG production, particularly skin diseases such as atopic dermatitis. It is another object of the present invention to provide a screening method for a substance useful as the therapeutic agent.
  • FLG filaggrin
  • the present inventors diligently searched for a FLG production promoter and searched for a target receptor of the FLG production promoter. As a result, a specific G protein-coupled receptor (GPR) was obtained. It was found that the production of FLG is promoted. Furthermore, the present inventors have found that a compound having an agonistic action of a specific GPR promotes the production of FLG in the skin and improves the water retention ability and / or barrier function of the stratum corneum, thereby completing the present invention.
  • GPR G protein-coupled receptor
  • this invention consists of the following. 1. A therapeutic agent for diseases associated with a decrease in filaggrin (FLG) production comprising a GPR142 agonist as an active ingredient. 2. 2. The disease therapeutic agent according to 1 above, wherein the disease associated with decreased FLG production is a skin disease. 3. 3. The disease therapeutic agent according to 2 above, wherein the skin disease is atopic dermatitis. 4). 3. The disease therapeutic agent according to 2 above, wherein the skin disease is ichthyosis vulgaris. 5. Any of 1 to 4 above, wherein the GPR142 agonist is N- (4-amino-2-methyl-6-quinolyl) -2-[(4-ethylphenoxy) methyl] benzamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • FLG filaggrin
  • R 1 and R 2 each represent a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 3 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 4 represents 1 to 3 carbon atoms
  • 3 represents an alkoxycarbonyl group or a hydroxycarbonyl group
  • R 5 , R 6 and R 7 each represent a hydrogen atom or a halogen atom.
  • R 1 and R 2 represent a hydrogen atom
  • R 3 represents a methyl group
  • R 4 represents an ethoxycarbonyl group or a hydroxycarbonyl group
  • R 5 , R 6 and R 7 represents a hydrogen atom. 8).
  • a therapeutic agent for a disease associated with a decrease in FLG production comprising a GPR142 agonist as an active ingredient, the therapeutic agent for a disease associated with a decrease in FLG production for improving symptoms of a disease associated with a decrease in FLG production. 10. 10.
  • the disease therapeutic agent according to 9 above, wherein the disease associated with decreased FLG production is a skin disease.
  • Atopic dermatitis therapeutic agent for improving water retention ability and / or barrier function deterioration of the horny layer of skin associated with atopic dermatitis characterized by containing GPR142 agonist as an active ingredient Dermatitis treatment agent.
  • a FLG production promoter containing a GPR142 agonist as an active ingredient characterized by administering an effective amount of a drug containing a GPR142 agonist as an active ingredient to a patient who exhibits symptoms of a disease associated with a decrease in FLG production, and improving the symptoms of the patient Method.
  • An effective amount of a drug containing a GPR142 agonist as an active ingredient is administered to atopic dermatitis patients with reduced FLG production to improve the skin's stratum corneum abnormalities associated with atopic dermatitis And a method of treating atopic dermatitis.
  • the screening method according to item 15 above which comprises the following steps (a) to (c): (a) contacting GPR142-expressing cells or a membrane fraction thereof with a test substance, (b) measuring the activity or expression of GPR142 in the cell or its membrane fraction after contact with the test substance, and (c) A step of selecting a substance that can promote the activity or expression of GPR142 in the cell or its membrane fraction. 17.
  • the screening method according to 15 or 16 above, wherein the disease associated with decreased FLG production is a skin disease. 18.
  • the skin disease is atopic dermatitis. 19. 19.
  • a pharmaceutical composition for promoting FLG production comprising a GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt, and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • B A pharmaceutical composition for improving stratum corneum abnormality comprising a GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt, and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • C A skin moisturizing pharmaceutical composition comprising a GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt, and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • D A pharmaceutical composition for improving skin barrier function, comprising a GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt, and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • (E) The pharmaceutical composition according to the above (A) to (D), which is used for prevention or treatment of atopic dermatitis.
  • (F) The pharmaceutical composition according to the above (A) to (D), wherein the disease is used for prevention or treatment of ichthyosis vulgaris.
  • G) A pharmaceutical composition for preventing or treating a disease associated with decreased FLG production, comprising a GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • (H) A pharmaceutical composition for preventing or treating a disease associated with horny layer abnormality, comprising a GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease accompanied by a decrease in the ability to retain skin moisture comprising a GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • J A pharmaceutical composition for preventing or treating a disease associated with a decrease in skin barrier function, comprising a GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt, and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • K The pharmaceutical composition according to the above (G) to (J), wherein the disease is atopic dermatitis.
  • L The pharmaceutical composition according to the above (G) to (J), wherein the disease is ichthyosis vulgaris.
  • (M) A GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt for the prevention or treatment of diseases associated with decreased FLG production.
  • (N) A GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt for the prevention or treatment of a disease associated with horny layer abnormality.
  • (O) A GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt for the prevention or treatment of diseases associated with decreased skin water retention ability.
  • (P) A GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt for the prevention or treatment of a disease associated with reduced skin barrier function.
  • Q The compound or salt thereof described in (M) to (P) above, wherein the subject of prevention or treatment is included in atopic dermatitis patients.
  • (R) The pharmaceutical composition according to the above (M) to (P), wherein the subject of prevention or treatment is included in a patient with ichthyosis vulgaris.
  • (S) A method for promoting FLG production, comprising administering an effective amount of a GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt to a subject.
  • (T) A method for preventing or treating a disease associated with horny layer abnormality, comprising administering an effective amount of a GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt to a subject.
  • (U) A method for preventing or treating a disease associated with decreased skin water retention capacity, comprising administering an effective amount of a GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt to a subject.
  • (V) A method for preventing or treating a disease associated with decreased skin barrier function, comprising administering an effective amount of a GPR142 agonist or a pharmaceutically acceptable salt to a subject.
  • W The method according to (S) to (V) above, wherein the subject is a patient with atopic dermatitis associated with a decrease in FLG production.
  • X The method according to (S) to (V) above, wherein the subject is a patient with ichthyosis vulgaris.
  • the GPR142 agonist according to the present invention promotes the production of FLG in the skin, improves the water retention ability and barrier function of the stratum corneum, and acts as an active ingredient of the FLG production promoter. It can also act as an active ingredient of a therapeutic agent for diseases associated with decreased FLG production, particularly a therapeutic agent for skin diseases such as atopic dermatitis. Further, by targeting GPR142, it is possible to systematically screen for a therapeutic agent for diseases associated with decreased FLG production.
  • Example 1 It is the figure which confirmed the transcriptional activity effect of the FLG promoter by (a) compound 1, compound 1+ calcium, (b) comparative compound 1, comparative compound 1+ calcium, (c) compound 1 and comparative compound 2 by the luciferase assay.
  • Example 1 It is the figure which confirmed the expression raise effect of FLG * mRNA by the compound 1 and the compound 2 by the real-time PCR in the case where the NHEK cell is calcium-treated beforehand.
  • Example 2 It is the figure which confirmed the expression of GPR142 and GPR22 mRNA in the NHEK cell by the compound 1 or compound 1+ calcium treatment by real-time PCR.
  • Example 4 It is the figure which confirmed the expression level of GPR142 (TM) mRNA and FLG (TM) mRNA in the NHEK cell by the compound 1 or compound 1+ calcium process in presence of RNAi of GPR142 by real-time PCR.
  • Example 5 It is the figure which confirmed the expression level of GPR142 (TM) mRNA and FLG (TM) mRNA in the NHEK cell by the compound 1, compound 2, or compound 3 treatment in presence of RNAi of GPR142 by real-time PCR.
  • Example 6 It is the figure which confirmed the expression level of GPR22 (TM) mRNA and FLG (TM) mRNA in the NHEK cell by the compound 1 or compound 1+ calcium process in presence of RNAi of GPR22 by real-time PCR.
  • Reference Example 1 It is the figure which confirmed the expression of FLG (TM) mRNA and GPR142 (TM) mRNA by Compound 1 in GPR142 overexpressing NHEK cells by real-time PCR.
  • Example 7 It is the figure which confirmed the effect
  • Example 8 It is the figure which confirmed the effect
  • Example 9 It is the figure which confirmed the expression increase effect of FLG (TM) mRNA by the compound 1 or the comparison compound 2 in a three-dimensional cultured skin by real-time PCR.
  • Example 10 It is the photograph which confirmed the production ability of the FLG monomer by the compound 1, the comparison compound 2, or the comparison compound 3 in the three-dimensional cultured skin by the immunoblotting method.
  • Example 11 It is the photograph figure which confirmed the production situation of FLG protein by compound 1 in human normal skin by tissue immunostaining.
  • Example 12 It is the photograph which confirmed the production ability of the FLG monomer when the compound 1 was administered to the FLG gene deficient homo and hetero model mouse by the immunoblotting method.
  • Example 13 It is a figure which shows the time-dependent change of a clinical symptom when a compound 1 is administered to atopic dermatitis onset model mouse (NC / Nga).
  • Example 14 (i)) It is a figure which shows the measurement result of the amount of transdermal water transpiration (TEWL) when the compound 1 is administered to atopic dermatitis onset model mouse (NC / Nga).
  • TEWL transdermal water transpiration
  • Example 14 (ii) It is a photograph figure showing the external appearance of the said mouse
  • (a) shows the result of a control mouse
  • (b) shows the result of a compound 1 administration mouse.
  • Example 14 (iii) The result of having confirmed the production ability of the FLG monomer when the compound 1 was administered to the atopic dermatitis model mouse (NC / Nga) by the immunoblotting method is shown.
  • Example 15 Example 15
  • GPR142 is a kind of G protein-coupled receptor (GPR), as described in the Examples below.
  • GPR142 agonist a substance that can promote the production of FLG through GPR142-dependent intracellular signaling is referred to as a “GPR142 agonist”.
  • GPR142 agonist is effective as a FLG production promoter and can be used as a therapeutic agent for diseases associated with a decrease in FLG production.
  • a FLG production promoter can be systematically screened by identifying a GPR142 agonist using GPR142 as a target receptor.
  • the identified GPR142 agonist is useful as a therapeutic agent for diseases associated with decreased FLG production.
  • the present invention relates to a FLG production promoter and a drug for treating a disease associated with a decrease in FLG production, which comprises a GPR142 agonist as an active ingredient.
  • the GPR142 agonist which is an active ingredient of the drug of the present invention, acts on GPR142 and can promote production of FLGFL mRNA and FLG protein via the receptor.
  • the GPR142 agonist that is an active ingredient of the agent of the present invention can preferably promote the production of FLG protein (ie, FLG monomer).
  • the present invention also includes a method for promoting the production of FLG by contacting a GPR142 agonist with a cell (preferably a skin cell).
  • examples of the GPR142 agonist include N- (4-amino-2-methyl-6-quinolyl) -2-[(4-ethylphenoxy) methyl] benzamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof. .
  • examples of the GPR142 agonist include phenylalanine derivatives or aminopyrazole phenylalanine or pharmaceutically acceptable salts thereof as described in Patent Document 5 (WO2010 / 093849 pamphlet). Specifically, for example, a compound represented by the following general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is preferable.
  • R 1 and R 2 each represent a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 3 represents an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 4 represents 1 to 3 carbon atoms
  • 3 represents an alkoxycarbonyl group or a hydroxycarbonyl group
  • R 5 , R 6 and R 7 each represent a hydrogen atom or a halogen atom.
  • R 1 and R 2 represent a hydrogen atom.
  • R 3 represents a methyl group.
  • R 4 represents a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group or a hydroxycarbonyl group.
  • R 5 , R 6 and R 7 represent a hydrogen atom.
  • the compound represented by the general formula (I) is most preferably methyl 2- (1- (1-methyl-3- (pyridin-4-yl) -1H-pyrazol-5-ylamino) -1-oxo.
  • ivermectin is mentioned as a GPR142 agonist.
  • a mixture of 22,23-dihydroavermectin B1ame90% or more and 22,23-dihydroavermectin B1bB10% or less can be mentioned.
  • those described in European Patent No. 0000189B1 and US2010 / 0004200A1 can also be used.
  • “pharmaceutically acceptable salts thereof” are GPR142 agonists that can be used in medicines and are active ingredients of the therapeutic agents of the present invention, such as compounds and salts represented by the above general formula (I)
  • Any salt can be used, for example, inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid; or oxalic acid, malonic acid, citric acid, fumaric acid, maleic acid, lactic acid, malic acid, It can be obtained by reacting with an organic acid such as succinic acid, tartaric acid, mandelic acid, acetic acid, propionic acid, gluconic acid, ascorbic acid, methanesulfonic acid and benzenesulfonic acid.
  • hydrochloride is preferable.
  • the hydrates, hydrates, solvates and crystal polymorphs of each compound are also included.
  • prodrugs and metabolites of each compound according to the GPR142 agonist of the present invention are also included.
  • a “prodrug” is a derivative of the compound of the present invention having a group that can be chemically or metabolically decomposed, restored to the original compound after administration to a living body, and exhibiting its original medicinal effect, and is a covalent bond Non-conforming complexes and salts.
  • a GPR142 agonist when used as a pharmaceutical preparation, it is usually known as a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent, extender, disintegrant, stabilizer, preservative, buffer, emulsifier, aroma.
  • compositions examples include solutions, lotions, suspensions, emulsions, ointments, gels, capsules, tablets, dragees, granules, suppositories, and the like. If desired, these preparations may contain adjuvants, stabilizers, wetting or emulsifying agents, buffers, and other conventional additives.
  • the GPR142 agonist which is an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention, has a FLG production promoting action, it is used as a therapeutic agent for diseases associated with a decrease in FLG production, preferably a skin disease.
  • skin diseases associated with decreased FLG production include, for example, atopic dermatitis, ichthyosis vulgaris, metal (nickel) allergic contact dermatitis (J. Investigative Dermatology (2008) 128: 1430-1435), sebum-deficient eczema (Anteroderma dermatosis) (Arch Dermatol Res. (2004) 295: 448-452) and the like, but are not limited to the above as long as they are skin diseases associated with decreased FLG production.
  • main skin function abnormalities in atopic dermatitis include a decrease in water retention ability and barrier function of the stratum corneum, a decrease in itch threshold, and infectivity.
  • the GPR142 agonist is particularly useful as a therapeutic agent for atopic dermatitis for improving the reduction of water retention ability and / or barrier function of the horny layer of the skin associated with atopic dermatitis.
  • an abnormality of the stratum corneum means a state in which the water retention ability of the stratum corneum, that is, a moisture retention function is impaired, a barrier function of the stratum corneum is lowered, and a function to prevent the entry of allergens from the outside is impaired.
  • the stratum corneum becomes the boundary with the outside world, and protects the inside from the outside world (the action of adjusting the water release from the body to protect yourself from the outside environment such as dryness and the action of holding the moisture of the stratum corneum itself) and the inside It has functions such as retention of substances (invasion of substances and allergens from outside, and action as a barrier layer against ultraviolet rays).
  • atopic dermatitis dryness of the skin with a pore-matched papule is observed even in a non-inflamed part of the skin, and the amount of water that evaporates from one square meter of the body surface to one hour from the skin surface. That is, when the transepidermal water loss (TEWL) is measured, it is higher than that of a healthy person (about 7.4 g / h ⁇ m 2 ). Accordingly, in the present invention, confirmation of the water retention ability and / or barrier function of the stratum corneum can be performed by measuring the amount of transdermal moisture transpiration and the degree of dryness of the skin (cattleness).
  • the method for measuring the moisture retention ability and barrier function of human skin can be performed by the following method.
  • the water retention ability can be measured, for example, according to the method described in J. Dermatology (2011) 38: 685-692. Specifically, the following procedure is followed. Place the subject in a room with a room temperature of 21 ° C and a humidity of 50 ⁇ 5% for 20 minutes. At that time, the test subject should wear a test T-shirt. 5 minutes after taking off the test T-shirt, measure the transdermal water transpiration (TEWL) with the moisture transpiration measuring device, or measure the skin conductance (SCWC) with the stratum corneum moisture measuring device. To do.
  • the measurement of the barrier function can be performed, for example, according to the method described in J.
  • the determination of the decrease in FLG production can be made by measuring the amount of FLG mRNA in the skin (for example, PCR method) and the amount of FLG protein (for example, Western blot method).
  • the degree of decrease in FLG production correlates with the amount of moisture transpiration and the degree of skin dryness (J. Invest. Dermatol. (2009) 129 (3): 682-689).
  • it can be performed by a method or a method of evaluating the degree of dryness of the skin by visual inspection, a method of evaluating and examining the degree of dryness of the skin by visual inspection is simple and convenient.
  • the administration method of the drug of the present invention is not particularly limited and is appropriately determined according to the purpose.
  • oral, intraarterial, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intradermal, transdermal, transmucosal, etc. Can be mentioned.
  • the daily dose is 0.001 to 100 mg / kg, preferably 0.1 to 30 mg / kg. It can be administered once to several times a day or once every 2 to 4 days.
  • the daily dose is suitably about 0.0001 to 10 mg / kg, and can be administered once to several times a day.
  • a transdermal agent about 0.001 to 100 mg / kg per body weight can be administered once to several times a day.
  • the dose is appropriately determined according to individual cases in consideration of symptoms, age, sex, and the like.
  • the production of FLG is promoted as shown in Examples described later.
  • abnormalities of the stratum corneum reduced water retention ability and / or barrier function associated with atopic dermatitis are improved.
  • the present invention also extends to a screening method for a therapeutic agent for a disease associated with a decrease in FLG production.
  • FLG production is promoted through GPR142-dependent intracellular signal transduction. Therefore, by identifying a GPR142 agonist with GPR142 as a target receptor, a FLG production promoter is strained. Screening.
  • the GPR142 agonist identified by the screening method of the present invention is useful as a therapeutic agent for diseases associated with decreased FLG production.
  • the method for screening for a therapeutic agent for a disease associated with decreased FLG production of the present invention comprises a step of evaluating whether the activity or expression of GPR142 can be promoted, for example, a cell expressing GPR142 (also referred to as “GPR142-expressing cell”). ) Can be used.
  • the “GPR142-expressing cell” used in the screening method of the present invention is a natural cell that endogenously expresses GPR142 polypeptide (for example, normal human epidermal keratinocytes (NHEK)) or a GPR142 gene introduced therein. Any of transformed cells may be used, and various methods known in the art can be used as a method for transforming cells. In the method of the present invention, these cells are preferably used, but a membrane fraction of the cells containing GPR142 can also be used.
  • the “GPR142 gene” used for expressing GPR142 in a cell is not particularly limited as long as it is a gene encoding GPR142 derived from any mammal or a functional variant that retains its activity.
  • human GPR142 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 90% or more, preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more.
  • a human GPR142 gene consisting of a base sequence encoding a variant of human GPR142 having an amino acid sequence having the property and retaining the activity of GPR142 can be used.
  • the human GPR142 gene based on the sequence shown in GenBank accession number: NM_181790, AY288421 (FEBS Lett. 554 (3), 381-388 (2003)) can be mentioned.
  • the human GPR142 gene having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 can be particularly preferably used.
  • the “GPR142-expressing cell” into which the GPR142 gene used in the method of the present invention has been introduced can be obtained, for example, by introducing an expression vector containing the GPR142 gene into a host cell and transforming it.
  • host cells any known cells such as yeast, insect cells, animal cells can be used, but CHO cells, COS cells, HEK293 (Human embryonic kidney 293) cells, NHEK (Normal Human Epidermal Keratinocytes) cells, HaCaT (Human Skin) keratinocyte) cells, FreeStyle TM 293-F cells (Invitrogen) and the like can be suitably used.
  • As the expression vector a vector containing a promoter corresponding to the type of host cell to be used is appropriately selected.
  • Examples of the vector include pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pCXN (Gene 108: 193-199 (1991)), pUB110, pTP5, pC194, ⁇ phage, retrovirus, baculovirus and the like.
  • Examples of the promoter include Trp promoter, T7 promoter, lac promoter, SPO1 promoter, penP promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, GAL promoter, SV40 promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, AG promoter and the like.
  • a host cell is transformed according to a known method with an expression vector in which the GPR142 gene is linked downstream of the promoter, and a “GPR142-expressing cell” used for screening can be produced.
  • the culture solution and culture conditions of the “GPR142-expressing cells” thus obtained can be appropriately selected within a known range depending on the type of cells used.
  • “Activity of GPR142” in the screening method of the present invention is a GPR142-dependent intracellular signaling activity, and whether or not a test substance can promote “activity of GPR142” is, for example, described below in the signaling. It can be evaluated by various indicators as exemplified.
  • the signaling activity of GPR142 can be measured using adenylate cyclase activity as an index.
  • Adenylate cyclase activity can be measured, for example, by measuring the concentration (amount) of cAMP in the cell.
  • GPR142-expressing cells are treated with forskolin, NKH-477 (Colforsin daropate), IBMX (1-methyl-3-isobutylxanthine) or the like in advance or treated with them in advance.
  • cAMP EIA System GE Healthcare
  • LANCE R
  • R cAMP Detection Kit
  • Cisbio Cisbio
  • cyclic AMP EIA kit Chemical
  • GPR142-expressing cells were further co-expressed by introducing a vector in which a reporter gene such as luciferase, alkaline phosphatase, or ⁇ -galactosidase was further linked via CRE (cAMP response element).
  • a reporter gene such as luciferase, alkaline phosphatase, or ⁇ -galactosidase was further linked via CRE (cAMP response element).
  • CRE cAMP response element
  • the increase or decrease in the level of ERK1 / 2 phosphorylated by the MAP kinase cascade caused by stimulation of GPR142 is measured by SureFire pERK kit (PerkinElmer), Phospho-ERK (Cisbio), or caused by stimulation of GPR142 PI3K-AKT levels of phosphorylation of AKT in the path PathScan (R) (CST Japan), Phospho-AKT (Cisbio) , Pan Specific Phospho-Akt ELISA Kit (Cayman Chemical) can also be measured and the like.
  • Gqi G protein chimera
  • a G protein chimera which is a chimera of a partial polypeptide having a phospholipase C-promoting activity of Gq protein and a partial polypeptide having a coupling activity of GPR142 receptor of Gi protein.
  • a transformed cell is prepared, the cell is brought into contact with a test substance, and the fluctuation of the calcium ion concentration is measured by, for example, FLEXstation (Molecular Devices), and the calcium concentration can be used as an index.
  • whether or not a test substance can promote “expression of GPR142” can be evaluated by measuring the amount of mRNA or protein of GPR142 in GPR142-expressing cells in contact with the test substance. This can be measured by extracting GPR142 mRNA and protein from the cell and following conventional methods such as quantitative PCR and Western blotting.
  • the test substance when the activity or expression of GPR142 is increased in the presence of the test substance as compared to the absence of the test substance, the test substance exhibits the activity or expression of GPR142. It can be determined that it is a substance that promotes. For example, as a substance that promotes the activity of GPR142, a substance that lowers intracellular cAMP concentration to the same extent as a GPR142 agonist as described in the Examples, specifically, 10% or more under the conditions of Example 9 It is preferable to select a substance that lowers by 20% or more.
  • the present invention may further include a step of determining whether the test substance selected as having GPR142 agonist activity according to the above-mentioned index is effective in treating a disease associated with a decrease in FLG production.
  • the therapeutic effect of the GPR142 agonist having FLG production promoting activity can be confirmed, for example, by the method shown in Examples 10-14.
  • a therapeutic agent for a disease associated with a decrease in FLG production can be screened.
  • the GPR142 agonist of the present invention has an effect of promoting FLG production, it is used as a therapeutic agent for diseases associated with decreased FLG production, preferably skin diseases.
  • skin diseases associated with decreased FLG production include, for example, atopic dermatitis, ichthyosis vulgaris, metal (nickel) allergic contact dermatitis, sebum-deficient eczema (senile xerosis), It is not limited to the above as long as it is a skin disease associated with a decrease in FLG production.
  • Example 1 Transcriptional activity effect of FLG promoter
  • N-quinolylbenzamide derivative compound 1
  • NHEK cells normal human neonatal epidermal keratinocytes
  • the transcriptional activity of the FLG promoter was performed by luciferase assay.
  • NHEK cells (Kurabo) 1.2 ⁇ 10 5 cells / ml are seeded in a 96-well plate at 80 ⁇ l / well (9.6 ⁇ 10 3 cells / well), and normal human epidermal keratinocyte growth medium (HuMedia-KG2, Kurabo Industries) HEGF (human Epidermal Growth Factor) (0.1 ng / ml), insulin (10 ⁇ g / ml), hydrocortisone (0.5 ⁇ g / ml), gentamicin (50 ⁇ g / ml), amphotericin B (50 ng / ml) and BPE 100 ⁇ l of a culture solution supplemented with (bovine brain pituitary extract) (0.4%, v / v) was added and cultured under conditions of 37 ° C.
  • HEGF human Epidermal Growth Factor
  • a promoter region from the FLG transcription start point (“CTTTTGGTGAACAAG” on exon 1) to about 2.2 Kb upstream is incorporated into the cloning site of the luciferase reporter vector (pGL4 Luciferase Reporter Vectors, Promega), and the 2.2 Kb FLG promoter and Plasmid DNA containing luciferase was prepared.
  • a sequence including a promoter region 5 ′ upstream from the FLG transcription start site is described in, for example, FLG-001 (ENST00000368799) of Ensembl Genome Browser 64: Homo sapiens-Exons-Transcript, and can be confirmed on the following homepage.
  • luciferase activity was measured using a luciferase assay reagent (Bright-Glo (R) Luciferase Assay System, Promega) according to the protocol. After drug treated cells washed twice with phosphate-buffered saline (PBS), DMEM medium (Invitrogen) was added 50 [mu] l, then the Bright-Glo (R) Reagent was added 50 [mu] l. After standing for 2 minutes, the absorbance of luciferase was measured for 70 ⁇ l. From the results of FIGS.
  • Example 2 Effect of increasing FLG mRNA expression in NHEK cells
  • the effect of increasing FLG mRNA expression by Compound 1 or Compound 2 was confirmed using NHEK cells.
  • NHEK cells (Invitrogen) 5 ⁇ 10 4 cells / well are seeded in a 24-well plate, and then hEGF (0.1 ng / ml) is added to normal human epidermal keratinocyte growth medium (HuMedia-KG2, Kurabo Industries).
  • Insulin (10 ⁇ g / ml), hydrocortisone (0.5 ⁇ g / ml), gentamicin (50 ⁇ g / ml), amphotericin B (50 ng / ml), and BPE (bovine brain pituitary extract) (0.4%, v / v) was added culture solution 500 [mu] l, 37 ° C., it was cultured in a 5% C0 2 conditions.
  • RNA was prepared according to the protocol.
  • a reverse transcriptase reagent Prime Script (R) , Takara
  • cDNA of total RNA was prepared according to the protocol.
  • SYBR (R) Premix Ex Taq Takara
  • real-time PCR was performed with a CFX96 real-time PCR apparatus (Bio-Rad) according to the protocol, and the amount of FLG mRNA was measured.
  • the measurement results are shown as GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) ratio.
  • the primer sequences used are shown below.
  • FLG Forward primer 5'-GCTGAAGGAACTTCTGGAAAAGG-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • FLG Reverse primer 5'-GTTGTGGTCTATATCCAAGTGATC-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • GAPDH Forward primer 5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • GAPDH Reverse primer 5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • FIG. 2 it was confirmed that Compound 1 and Compound 2 increase the expression of FLG mRNA in NHEK cells.
  • the FLG mRNA expression was further increased by calcium priming.
  • GPCR G Protein-Coupled Receptor
  • NHEK cells (Invitrogen) 5 ⁇ 10 4 cells / well are seeded in a 24-well plate, and then hEGF (0.1 ng / ml) is added to normal human epidermal keratinocyte growth medium (HuMedia-KG2, Kurabo Industries).
  • Insulin (10 ⁇ g / ml), hydrocortisone (0.5 ⁇ g / ml), gentamicin (50 ⁇ g / ml), amphotericin B (50 ng / ml), and BPE (bovine brain pituitary extract) (0.4%, v / v) Then, 500 ⁇ l of the culture broth was added, and the cells were cultured under the conditions of 37 ° C.
  • RNA was prepared according to the protocol.
  • TaqMan (R) human GPCR array (AB 4365295, Applied Biosystems) was used and analyzed by ABI PRISM (R) 7900HT gene analyzer (Applied Biosystems). The measurement results were shown by comparing the number of cycles with the control 18S ribosomal RNA ( ⁇ Ct value) (comparative Ct method).
  • Table 1 shows the results of GPCR in which expression was significantly increased by treatment with Compound 1 and / or calcium compared to the control. As shown in Table 1, calcium was found to induce GPR142 mRNA expression in NHEK cells. Moreover, it was confirmed that the combined system of Compound 1 and Compound 1 and calcium induces the expression of GPR142 mRNA and GPR22 mRNA.
  • Example 4 Confirmation of expression of GPR142 and GPR22 in NHEK cells
  • the effect of inducing the expression of GPR142 mRNA and GPR22 mRNA by Compound 1 was confirmed for NHEK cells.
  • NHEK cells (Invitrogen) 5 ⁇ 10 4 cells / well are seeded in a 24-well plate, and then hEGF (0.1 ng / ml) is added to normal human epidermal keratinocyte growth medium (HuMedia-KG2, Kurabo Industries).
  • Insulin (10 ⁇ g / ml), hydrocortisone (0.5 ⁇ g / ml), gentamicin (50 ⁇ g / ml), amphotericin B (50 ng / ml), and BPE (bovine brain pituitary extract) (0.4%, v / v) It was added to the culture solution 500 [mu] l, and incubated at 37 ° C., of 5% C0 2 conditions. 2) After 1 day of culturing under the conditions of 1) above, the medium was changed every 1 day and cultured for 3 days in the culture solution of 1) above in which a DMSO solution of Compound 1 was added to 1 ⁇ M per well.
  • BPE bovine brain pituitary extract
  • a system using CaCl 2 (Ca in terms of 1.2 mM) instead of Compound 1 and a combined system of Ca (1.2 mM in terms of Ca) and Compound 1 (1 ⁇ M per well) are similarly used.
  • a reverse transcriptase reagent (Prime Script (R) , Takara ) , cDNA of total RNA was prepared according to the protocol.
  • GPR142 Forward primer 5'-CTTGTCTCAGCCATTCCAGGTG-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • GPR142 Reverse primer 5'-GATCCTTACGCAGACACTGAGC-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • GPR22 Forward primer 5'-CCACACAACATGAGGCTACAGAC-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • GPR22 Reverse primer 5'-CTTTCTCGTCGTTCACGGTGTC-3 '(SEQ ID NO: 10)
  • GAPDH Forward primer 5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • GAPDH Reverse primer 5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • Example 5 Blocking effect of GPR142 by RNAi
  • GPR142 mRNA and FLG mRNA expression-inducing effects of Compound 1 on NHEK cells were blocked by GPR142 RNAi.
  • NHEK cells (Invitrogen) 5 ⁇ 10 4 cells / well are seeded in a 24-well plate, and then hEGF (0.1 ng / ml) is added to normal human epidermal keratinocyte growth medium (HuMedia-KG2, Kurabo Industries).
  • Insulin (10 ⁇ g / ml), hydrocortisone (0.5 ⁇ g / ml), gentamicin (50 ⁇ g / ml), amphotericin B (50 ng / ml), and BPE (bovine brain pituitary extract) (0.4%, v / v) It was added to the culture solution 500 [mu] l, and incubated at 37 ° C., of 5% C0 2 conditions. 2) One day after culturing under the conditions of 1) above, the medium was replaced with a culture solution in which CaCl 2 (1.2 mM in terms of Ca) was further added to the culture solution of 1) above, and the medium was changed to 37 ° C., 5% CO 2.
  • CaCl 2 1.2 mM in terms of Ca
  • the culture was performed under the following conditions. One day after the culture, the medium was changed with the same culture solution containing Ca, and the culture was further continued for one day. 3) The NHEK cells of 2) above were transfected with 50 nM siRNA per well of a 24-well plate using the introduction reagent Lipofectamine RNA Max (Invitrogen) according to the protocol.
  • GPR142-1 (# HSS139493): Sense Sequence: GGCGUCAUCCCUGUCAUCUACUACA; (SEQ ID NO: 11) Antisense Sequence: UGUAGUAGAUGACAGGGAUG; (SEQ ID NO: 12)
  • GPR142-2 (# HSS139494): Sense Sequence: CCAACAUCCUGGAGUUUGCUGCCAA; (SEQ ID NO: 13) Antisense Sequence: UUGGCAGCAAACUCCAGGAUGU; (SEQ ID NO: 14) GPR142-3 (# HSS179846): Sense Sequence: GCUGUCCUGAGUGCUGCCCUGUUGA; (SEQ ID NO: 15) Antisense Sequence: UCAACAGGGCAGCACUCAGGAC; (SEQ ID NO: 16) Control -1 (LOW GC, # 129350-200): Sense Sequence: G
  • GPR142 Forward primer 5'-CTTGTCTCAGCCATTCCAGGTG-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • GPR142 Reverse primer 5'-GATCCTTACGCAGACACTGAGC-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • FLG Forward primer 5'-GCTGAAGGAACTTCTGGAAAAGG-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • FLG Reverse primer 5'-GTTGTGGTCTATATCCAAGTGATC-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • GAPDH Forward primer 5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • GAPDH Reverse primer 5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • Example 6 Blocking effect of GPR142 by RNAi
  • GPR142 mRNA and FLG mRNA expression-inducing effects of Compound 2 or 3 were blocked by GPR142 RNAi on NHEK cells.
  • Examples 5 1) to 3), GPR142 siRNA and GPR142-3 (# HSS139493) and GPR142-3 (# HSS179846) and Control -1 (LOW GC, # 129350-200) were used as the siRNA of GPR142 and control, respectively.
  • NHEK cells were transfected in the same manner as in Example 5, except that two siRNAs of Control-3 (HIGH GC, # 129350-400) were used.
  • a DMSO solution of Compound 1 a DMSO solution of Compound 2 and a methanol solution of Compound 3 were added to a concentration of 10 nM per well. The medium was exchanged with the liquid, and further cultured for 1 day.
  • Example 5 As a control, only the solvent was added.
  • each drug-treated cell was subjected to real-time PCR, and the amounts of GPR142 mRNA and FLG mRNA were measured. The measurement results are shown as GAPDH ratio. As shown in FIG. 5, it was confirmed that the induction of FLG mRNA expression by compound 2 and compound 3 was also via GPR142, as in compound 1.
  • NHEK cells (Invitrogen) 5 ⁇ 10 4 cells / well are seeded in a 24-well plate, and then hEGF (0.1 ng / ml) is added to normal human epidermal keratinocyte growth medium (HuMedia-KG2, Kurabo Industries).
  • Insulin (10 ⁇ g / ml), hydrocortisone (0.5 ⁇ g / ml), gentamicin (50 ⁇ g / ml), amphotericin B (50 ng / ml), and BPE (bovine brain pituitary extract) (0.4%, v / v) the culture broth was 500 ⁇ l added, and cultured at 37 ° C., of 5% C0 2 conditions.
  • siRNA per well of a 24-well plate was transfected into NHEK cells using the introduction reagent Lipofectamine RNA Max (Invitrogen) according to the protocol. The sequence of the siRNA used is shown below.
  • GPR22-1 (# HSS104365): Sense Sequence: UAGUCAUGGCUUAUGGAACAACUAU (SEQ ID NO: 23) Anti Sense Sequence: AUAGUUGUUCCAUAAGCCAUGACUA (SEQ ID NO: 24) GPR22-2 (# HSS104367): Sense Sequence: GAGUUGUUUCUAUAGUAGAAGCUGA (SEQ ID NO: 25) Anti Sense Sequence: UCAGCUUCUACUAUAGAAACAACUC (SEQ ID NO: 26) GPR22-3 (# HSS178711): Sense Sequence: GGCAGAGCUGUAAUGUUAAUGAUAU (SEQ ID NO: 27) Anti Sense Sequence: AUAUCAUUAACAUUACAGCUCUGCC (SEQ ID NO: 28) Control-1 (Low GC, # 129350-200): Sense Sequence: GGAUGUCAACUUGAGCAACUUAUUU (SEQ ID NO: 17) Anti Sense Sequence: AAAUAAGUUGCU
  • Example 7 FLG mRNA production effect of Compound 1 in GPR142 overexpressing NHEK cells
  • Example 7 the effect of inducing FLG mRNA expression by Compound 1 was confirmed for GPR142 overexpressing NHEK cells.
  • NHEK cells (Invitrogen) 5 ⁇ 10 4 cells / well are seeded in a 24-well plate, and then hEGF (0.1 ng / ml) is added to normal human epidermal keratinocyte growth medium (HuMedia-KG2, Kurabo Industries).
  • Insulin (10 ⁇ g / ml), hydrocortisone (0.5 ⁇ g / ml), gentamicin (50 ⁇ g / ml), amphotericin B (50 ng / ml) and BPE (bovine brain pituitary extract) (0.4%, v / v) It was added and culture was incubated at 37 ° C., of 5% C0 2 conditions.
  • a GPR142pCXN mammalian expression vector was constructed by incorporating the human GPR142 gene coding region containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 into the restriction site EcoRI of the cloning site of the mammalian expression vector pCXN (Gene 108: 193-199 (1991)). . 3) After culturing for 1 day under the above conditions 1), 0.5 ⁇ g per well of GPR142 mammalian expression vector pCXN was transfected into NHEK cells using the introduction reagent Fugene (R) HD (Promega) according to the protocol. . As a control, only the mammalian expression vector pCXN was transfected.
  • Example 8 Measurement of action on adenylate cyclase activity In this example, the effect of inhibiting the production of cAMP by Compound 1 was confirmed.
  • Example 9 Measurement of action on adenylate cyclase activity
  • the effect of inhibiting the production of cAMP by compound 2 or 3 was confirmed.
  • Example 8 5 HEK293T sputum cells were cultured in the same manner as in Example 8 1) to 4). Then, in Example 8 5), instead of Compound 1, a methanol solution of Compound 3, a DMSO solution of Compound 2 and a DMSO solution of Comparative Compound 2 were used so that each would be 1000 nM per well. Culture was carried out in the same manner as in Example 8, 5). The cAMP concentration of the cultured cells was measured in the same manner as 6) of Example 8.
  • Example 10 Effect of increasing FLG mRNA expression in three-dimensional cultured skin
  • the effect of increasing FLG mRNA expression by Compound 1 was examined using three-dimensional cultured skin.
  • FLG mRNA expression was measured by real-time PCR.
  • RNA extraction RNA extraction reagent for RNA extraction
  • reverse transcriptase reagent Prime Script (R) , TaKaRa )
  • cDNA was prepared from total RNA according to the protocol.
  • Light Cycler 480 SYBR Green I Master Roche
  • real-time PCR was performed according to the protocol, and the amount of FLG mRNA was measured. The measurement results are shown as GAPDH ratio.
  • Compound 1 and Comparative Compound 2 increase the expression of FLG mRNA in a three-dimensional human skin model.
  • Example 11 Effect of increasing FLG monomer expression in three-dimensional cultured skin
  • the effect of increasing FLG monomer expression by Compound 1 was examined using three-dimensional cultured skin.
  • the expression of FLG monomer was confirmed by Western blotting.
  • Example 10 the same operation as 1) to 3) of Example 10 was first performed.
  • D) Comparative Compound 3 (M344) as a drug was also carried out in the same manner as A) Compound 1 and C) Comparative Compound 2 in Example 10.
  • Lysis buffer 0.1 M Tris-HCl (pH 9.0), 6M Urea, 1%) 100 ⁇ l of 2-mercapto-ethanol, 1% SDS, 1 mM EDTA, protease inhibitor cocktail
  • the homogenized cells were centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C.
  • Example 12 Effect of increasing FLG monomer expression in normal human skin culture
  • Compound 1 N-quinolylbenzamide derivative
  • the expression of FLG monomer was confirmed by tissue immunostaining with anti-human FLG antibody.
  • the medium used was a normal human epidermal keratinocyte growth medium (HuMedia-KG2, Kurabo Industries).
  • Human epidermal keratinocyte growth medium HuMedia-KG2, Kurabo Industries.
  • the part of the normal skin that was surplus with the removal of the skin disease part was used with the consent of the donor through the ethics committee of Kyoto University.
  • an anti-human FLG antibody (anti-human Filaggrin antibody sc-66192, Santa Cruz) is used as a primary antibody
  • a biotinylated anti-mouse IgG antibody (eBioscience) is used as a secondary antibody
  • DAB diaminobenzidine
  • Example 13 Effect of increasing FLG expression in model animals
  • homologous or heterozygous mice Jackson Laboratory, flaky tail mice
  • compound 1 N-quinolylbenzamide derivative
  • Lysis buffer 0.1 M Tris-HCl (pH 9.0), 6 M Urea, 1% 2-mercapto-ethanol, 1% SDS, 1 mM EDTA, Protease inhibitor cocktail.
  • a sample was prepared in the same manner as in Example 11 4), and the expression of FLG monomer was confirmed by Western blotting after electrophoresis.
  • Anti-mouse FLG antibody (anti-mouse Filaggrin antibody, COVANCE) 1 ⁇ g / ml is used as the primary antibody
  • Anti-rabbit IgG-HRP (GE Healthcare) is used as the secondary antibody
  • Amersham ECL Plus Western Blotting as the color former. Detection Reagents (GE Healthcare) was used.
  • Example 14 Dermatitis-improving effect in atopic dermatitis model mouse (NC / Nga) 6-10 weeks old atopic dermatitis-onset NC / Nga mouse (Japan SLC) with ticks is bred under normal environment The experiment was conducted. That is, Compound 1 was added to a methylcellulose solution (0.5 W / V% Methyl Cellulose 400 Solution, Wako, 133-14255) at 0.75 mg / ml in NC / Nga mice with dermatitis appearing mainly in the auricle and head.
  • a methylcellulose solution 0.5 W / V% Methyl Cellulose 400 Solution, Wako, 133-14255
  • 500 ⁇ l of the so-dissolved solution was orally administered every other day (each mouse was dosed with 0.375 mg of Compound 1), and the effect of improving dermatitis was measured.
  • 500 ⁇ l of methylcellulose solution was orally administered every other day.
  • Example 15 FLG monomer production effect in atopic dermatitis model mice (NC / Nga) 6-10 weeks old atopic dermatitis-onset NC / Nga mice (Japan SLC) with ticks are raised in a normal environment
  • NC / Nga mice where dermatitis appears mainly in the auricle and head
  • Compound 1 was added to a methylcellulose solution (0.5 W / V% Methyl Cellulose 400 Solution, Wako, 133-14255) at 1.5 mg / ml.
  • 500 ⁇ l of the dissolved solution was administered orally every other day (0.75 mg of Compound 1 was administered to each mouse).
  • As a control 500 ⁇ l of methylcellulose solution was orally administered every other day.
  • Experiments were conducted with 5 mice each in the compound 1 administration group and the control group.
  • Lysis buffer 0.1 M Tris-HCl (pH 9.0), 6M Urea, 1% 2-mercapto-ethanol, 1% SDS, 1 mM EDTA, Protease inhibitor cocktail
  • the homogenized cells are centrifuged at 15,000 rpm and 4 ° C for 20 minutes, the supernatant is collected, a sample for measurement is prepared, and the expression of FLG monomer is confirmed by Western blotting after electrophoresis did.
  • the primary antibody is anti-mouse FLG antibody (anti-mouse Filaggrin antibody, COVANCE) 1 ⁇ g / ml
  • the secondary antibody is Anti-rabbitHIgG-HRP (GE Healthcare) and Amersham ⁇ ⁇ ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare) was used.
  • FIG. 17 (a) shows the result of electrophoresis.
  • PFG indicates a profilagrin band
  • FG indicates a FLG monomer band.
  • FIG. 17B is a graph showing the relative concentration of FLG monomer relative to GAPDH (average value of 5 samples). From these results, when Compound 1 was administered, it was confirmed that the production of FLG monomer was clearly promoted as compared with the control.
  • the GPR142 agonist which is an active ingredient of the therapeutic agent of the present invention, promotes the production of FLG in the skin, improves the water retention ability and barrier function of the stratum corneum, and is effective as a FLG production promoter. It was confirmed to act as an ingredient. Moreover, it can act also as an active ingredient of the therapeutic agent for skin diseases accompanying a decrease in FLG production.
  • A) N-quinolylbenzamide derivative (compound 1), B) ivermectin (compound 2) or C) phenylalaninamide derivative (compound 3), which is a kind of GPR142 agonist, can be easily synthesized by chemical synthesis. It is useful as a therapeutic agent for skin diseases associated with decreased FLG production, particularly atopic dermatitis. Furthermore, screening for therapeutic agents for diseases associated with decreased FLG production can be systematically performed using GPR142 as a target.

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Abstract

　本発明は、有効性の高いフィラグリン産生促進作用を有する物質を提供する。さらに、フィラグリン産生低下を伴う皮膚疾患、特に、アトピー性皮膚炎の治療に有用な治療薬を提供する。フィラグリン産生促進剤の探索を鋭意行った結果、Ａ）N-キノリルベンズアミド誘導体（化合物１）、Ｂ）イベルメクチン（化合物２）又はＣ）フェニルアラニンアミド誘導体（化合物３）が、皮膚におけるフィラグリンの産生を促進させ、角層の水分保持能やバリア機能を良好に改善することがわかった。本発明は、特定のN-キノリルベンズアミド誘導体又は製薬上許容されるその塩を有効成分として含有することを特徴とする、フィラグリン産生促進剤に関するものである。

Description

フィラグリン産生促進剤、フィラグリン産生低下に伴う疾患治療剤及び当該治療剤のスクリーニング方法
　本発明は、特定のG蛋白質共役型受容体（G protein-coupled receptor: GPR）アゴニストを有効成分とするフィラグリン（filaggrin: FLG）産生促進剤及びフィラグリン産生低下に伴う疾患治療剤、並びに、当該治療剤のスクリーニング方法に関する。
　表皮の最外層に位置する数層から数十層に規則正しく重なる角層（角質層）は、外部からの物質やアレルゲンの侵入、紫外線などに対するバリア層として機能している。また、角層は、外部環境の乾燥から身を守るため、体内からの水分を放出するのを抑制する作用とその角層自身の水分を保持する作用を持っている。角層自身の水分を保持する作用を有するものとしては天然保湿因子（natural moisturizing factor: NMF）が知られている。このNMFの主成分であるアミノ酸は、特に角層における水分量と高い相関性が知られており、角層の水分保持には極めて重要である。このアミノ酸は、ケラトヒアリン顆粒由来のフィラグリンが角層内で分解することによって産生される。フィラグリンは、表皮ケラチノサイトにおいてプロフィラグリンとして発現し、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積する。このプロフィラグリンは、約400KDaのヒスチジンリッチの蛋白質で、324個のアミノ酸からなるフィラグリン（以下、単に「FLG」又は「FLGモノマー」ともいう。）を繰り返し単位として、タンデムに10～12個結合したものである。その後、プロフィラグリン（プロFLG）は脱リン酸及び加水分解を経てFLGへと分解されて角層に移行する。角層においてFLGはケラチンフィラメントの凝集効率を高め、角質細胞の内部構築に関与している（J. Invest. Dermatol. (1994) 103(5): 731-740、J. Cell Science (2009) 122(9): 1285-1294）。このようにFLGは皮膚のバリア機能において重要な役割を果たしている。
　FLGと皮膚疾患との関係についての多くの報告がなされている。例えば、FLGの遺伝子変異が尋常性魚鱗癬を引き起こすことやアトピー性皮膚炎発症の主要因子であることが報告されている（Nature Genetics (2006) 38: 337-342、Nature Genetics (2006) 38: 441-446、J. Allergy Clin. Immunol. (2007) 119(2): 434-44 ）。魚鱗癬は、皮膚の表面が魚の鱗の状態で硬くなり剥がれ落ちる角質形成異常の先天性皮膚疾患である。表皮の角化がうまくいかないため、皮膚の保湿機能が低下し、外部からのアレルゲン等の侵入を防ぐ機能が損なわれる。また、日本のアトピー性皮膚炎患者において、患者全体の約1/3がFLG遺伝子変異を有しているとの報告がある（British Journal of Dermatology (2009) 161: 1387-1390）。
　アトピー性皮膚炎は、先進国では小児の約20％に認められる高頻度の難治性アレルギー疾患である。アトピー性皮膚炎の原因はまだ不明であり、遺伝的要因に加えて、環境要因、食物、精神的ストレス、全身及び局所の感染など様々な要素が関与すると考えられている。アトピー性皮膚炎は、IgE抗体量が上昇しているタイプ（外因性アトピー皮膚炎）と正常なタイプ（内因性アトピー皮膚炎）に分けることができる。内因性アトピー皮膚炎は、精神的ストレスなどの要因によるもので、このタイプではFLG遺伝子の変化がない場合が多い。これに対し、外因性アトピー皮膚炎は、上述のようなFLG遺伝子の変異が関連することが多い。
　このようなアトピー性皮膚炎の治療の基本は、発症・悪化因子の除去、異常な皮膚機能の補正及び炎症を抑制するための薬物療法を組み合わせて行われている。また、アトピー性皮膚炎における主な皮膚機能異常として、角層の水分保持能・バリア機能の低下、痒み閾値の低下、易感染性が挙げられる。
　角層の水分保持能・バリア機能の低下と痒み閾値の低下、易感染性に対する薬物療法は、その処方対象及び処方時期等において区別される。一般に痒みには、ヒスタミンや好酸球が産生する痒み物質が関与する末梢性の痒みとオピオイド受容体が関与する中枢性の痒みがある。このような痒みを治療する薬剤は、痒みの程度によって処方されるものである。痒みの程度は、「痒みを感じない」から「痒みを我慢できない」までの段階に分けて診断され、我慢できない程度の痒みが発症したときに鎮痒剤が処方される。また、アトピー性皮膚炎患者は、伝染性膿痂疹、単純ヘルペス、伝染性軟属腫など皮膚の感染症に罹りやすい、すなわち易感染性と診断された場合は、それらの感染に対する薬剤がそれぞれ処方される。一方、角層の水分保持能・バリア機能の低下に対する薬剤は、痒みの程度や痒みの発症時期、或いは、感染症発症時期に関わりなく、FLG産生の低下により角層の水分保持能やバリア機能が低下しているアトピー性皮膚炎患者に対して処方される。
　アトピー性皮膚炎において、FLG産生が低下する原因として、FLG遺伝子変異のほかに、FLG遺伝子に変異がない場合でも、何らかの理由でTh1細胞とTh2細胞の平衡バランスがTh2細胞優位側に傾き、IL-4、IL-13などのTh2サイトカインが過剰に産生され、FLGの発現を低下させることが知られている（非特許文献１：J. Investigative Dermatology (2008) 128: 2248-2258）。
　これまで、FLGの産生を促進する成分としては、ケブラニン類（特許文献１：特開2009-256269号公報）、リクイリチン（特許文献２：特開2003-146886号公報）、糖脂質類（特許文献３：特開2006-241095号公報）、ロズマリン酸及びエリオジクチオール-7-O-ルチノシド（特許文献４：特開2010-90037号公報）等の天然由来成分が提案されているが、更にアトピー性皮膚炎等の皮膚疾患の治療／予防に用いることができるような、安全で有効性の高いFLG産生促進作用を有する物質の開発が望まれている。しかしながら、そのような物質の標的受容体は不明であり、従って未だ系統的にFLG産生促進作用を有する物質のスクリーニングはできないのが現状である。
　G蛋白質共役型受容体142（以下、単に「GPR142」という。）は、ロドプシンファミリーに属するオーファンG蛋白質共役型受容体（オーファンGPR）である。ヒトGPR142は462個のアミノ酸配列からなる蛋白質である（FEBS Letters 554 (2003) 381-388）。マウスのPgr（GPR142）はランゲルハンス島に発現していることが報告されている（Cell 135, 561-571, Supplemental Data (2008)）。また、マウスのGPR142のmRNAは脳、脾臓、肝臓、腎臓、精巣において発現していることが報告されている（Neuropharmacology 50 (2006): 512-520）。また、Nutrition & Metabolism (2008) 5: 23には、ゼブラフィッシュのGPR142aをアンチセンスでノックダウンしたところ、脂肪の有意な減少が見られたことから、GPR142のアンタゴニストが抗肥満治療の候補薬となり得ることが記載されている。また、242nd ACS National Meeting & Exposition, Denver, CO, United States, August 28-September 1, 2011 (2011), MEDI-134及びMEDI-135には、GPR142が膵臓のβ細胞に発現しており、II型糖尿病治療用のGPR142アゴニストとしてのフェニルアラニン誘導体及びアミノピラゾールフェニルアラニンが、GPR142依存的にインスリンの分泌を促進することの報告がなされており、それらの化合物が特許文献５（国際公開WO2010/093849号パンフレット）に記載されている。しかしながら、本発明者らの知る限り、GPR142とFLG産生効果との関連について記載する報告はない。もとより、GPR142アゴニストがFLGの産生を促進することや皮膚疾患治療に用いられることについて記載する報告もない。
　特許文献６（特開2004-175687号公報）には、ヘアレスマウスの皮膚にテープストリッピングを施して物理的に皮膚バリア破壊した後、サイクリックAMP（環状AMP又はcAMP）アンタゴニストを塗布することによって細胞内カルシウムのレベルを低下させ、当該バリアを回復することが記載されている。しかしながら、cAMPアンタゴニストがFLGの産生低下に伴う皮膚バリア破壊を回復することついての記載も、FLGの産生がGPR142を介して促進されることについての記載もない。
　特許文献７（国際公開WO2002/074341号パンフレット）には、N-(4-アミノ-2-メチル-6-キノリル)-2-[(4-エチルフェノキシ)メチル]ベンズアミドを含むN-キノリルベンズアミド誘導体などのノシセプチンアンタゴニストを、掻痒を伴う疾患、局所性掻痒症、結節性痒疹等、数多くの疾患などに伴って起こる痒みの予防や治療のための鎮痒剤として使用することが記載されている。そして、掻痒を伴う数多くの疾患の中の例示の一つとしてアトピー性皮膚炎が挙げられている。しかしながら、特許文献７には、N-キノリルベンズアミド誘導体にFLG産生促進効果があることも、GPR142に関する記載も、皮膚の水分保持能やバリア機能低下を改善してアトピー性皮膚炎等の皮膚疾患を治療する薬剤として使用し得ることを予測させるような記載も示唆もない。また、特許文献７には、具体的にアトピー性皮膚炎に伴って起こる痒みのモデルでの試験例もない。
　特許文献８（特許第3013989号公報、特開平11-335355号公報）には、ノシセプチンアンタゴニストとして、N-(4-アミノ-2-メチル-6-キノリル)-2-[(4-エチルフェノキシ)メチル]ベンズアミドを含むN-キノリルベンズアミド誘導体が開示されているが、その用途としては鎮痛剤が挙げられているものの、GPR142に関する記載もFLG産生促進効果についての記載もない。
　イベルメクチンは、商品名ストロメクトールとして、腸管糞線虫症及び疥癬の治療薬として販売されている。その他、イベルメクチンがアレルギー性喘息のマウスモデルに対する効果が報告されている（Inflammation Research (2011) 60(6): 589-596）が、GPR142に関する記載もFLG産生促進効果についての記載もない。
特開2009-256269号公報 特開2003-146886号公報 特開2006-241095号公報 特開2010-90037号公報 国際公開WO2010/093849号パンフレット 特開2004-175687号公報 国際公開WO2002/074341号パンフレット 特許第3013989号公報、特開平11-335355号公報
J. Investigative Dermatology (2008) 128: 2248-2258
　本発明は、フィラグリン（FLG）産生促進剤及びFLG産生低下に伴う疾患、特に、アトピー性皮膚炎等の皮膚疾患の治療に有用な治療剤を提供することを課題とする。さらに、当該治療剤として有用な物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、FLG産生促進剤の探索及び当該FLG産生促進剤の標的受容体の探索を鋭意行った結果、特定のG蛋白質共役型受容体（GPR）を介してFLGの産生が促進されることを見出した。さらに、特定のGPRのアゴニスト作用を有する化合物が、皮膚におけるFLGの産生を促進させ、角層の水分保持能及び／又はバリア機能を良好に改善することを見出し、本発明を完成した。
　即ち本発明は、以下よりなる。
１．GPR142アゴニストを有効成分として含有するフィラグリン（FLG）産生低下に伴う疾患治療剤。
２．FLG産生低下に伴う疾患が、皮膚疾患である前項１記載の疾患治療剤。
３．皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎である、前項２記載の疾患治療剤。
４．皮膚疾患が、尋常性魚鱗癬である、前項２記載の疾患治療剤。
５．GPR142アゴニストが、N-(4-アミノ-2-メチル-6-キノリル)-2-[(4-エチルフェノキシ)メチル]ベンズアミド又は製薬上許容されるその塩である、前項１～４のいずれか１項に記載の疾患治療剤。
６．GPR142アゴニストが、下記一般式（I）表される化合物又は製薬上許容されるその塩である、前項１～４のいずれか１項に記載の疾患治療剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 [式中、R1及びR2は各々について水素原子、ハロゲン原子又は炭素数1～3のアルキル基を表し、R3は炭素数1～3のアルキル基を表し、R4は炭素数1～3のアルコキシカルボニル基又はヒドロキシカルボニル基を表し、R5、R6及びR7は各々について水素原子又はハロゲン原子を表す。]
７．前項６記載の一般式（I）において、R1及びR2は水素原子を表し、R3はメチル基を表し、R4はエトキシカルボニル基又はヒドロキシカルボニル基を表し、R5、R6及びR7は水素原子を表すものである、前項６記載の疾患治療剤。
８．GPR142アゴニストが、イベルメクチンである、前項１～４のいずれか１項に記載の疾患治療剤。
９．FLG産生低下に伴う疾患の症状を改善するためのFLG産生低下に伴う疾患治療剤であって、GPR142アゴニストを有効成分として含有することを特徴とするFLG産生低下に伴う疾患治療剤。
１０．FLG産生低下に伴う疾患が、皮膚疾患である前項９記載の疾患治療剤。
１１．アトピー性皮膚炎に伴う皮膚の角層の水分保持能及び／又はバリア機能低下を改善するためのアトピー性皮膚炎治療剤であって、GPR142アゴニストを有効成分として含有することを特徴とするアトピー性皮膚炎治療剤。
１２．GPR142アゴニストを有効成分として含有する、FLG産生促進剤。
１３．FLG産生低下に伴う疾患の症状を呈する患者に、GPR142アゴニストを有効成分として含有する薬剤を有効量投与して、当該患者の症状を改善することを特徴とするFLG産生低下に伴う疾患を治療する方法。
１４．FLG産生が低下しているアトピー性皮膚炎患者に、GPR142アゴニストを有効成分として含有する薬剤を有効量投与して、当該患者のアトピー性皮膚炎に伴う皮膚の角層異常を改善することを特徴とするアトピー性皮膚炎を治療する方法。
１５．被験物質がGPR142の活性又は発現を促進し得るか否かを評価することを含む、FLG産生低下に伴う疾患治療剤のスクリーニング方法。
１６．以下の(a)～(c)の工程を含む、前項１５記載のスクリーニング方法。
(a) GPR142発現細胞又はその膜画分と被験物質とを接触させる工程、
(b)当該被験物質と接触させた後の当該細胞又はその膜画分におけるGPR142の活性又は発現を測定する工程、及び
(c)当該細胞又はその膜画分におけるGPR142の活性又は発現を促進し得る物質を選択する工程。
１７．FLG産生低下に伴う疾患が皮膚疾患である、前項１５又は１６記載のスクリーニング方法。
１８．皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎である、前項１７記載のスクリーニング方法。
１９．GPR142発現細胞が、GPR142遺伝子を含む発現ベクターで形質転換して得られたものである、前項１５～１８のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
２０．GPR142遺伝子が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒトGPR142遺伝子又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつGPR142の活性を保持するヒトGPR142の機能的改変体をコードする遺伝子である、前項１９記載のスクリーニング方法。
　また、本発明の他の態様として、以下よりなる。 
（Ａ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有するFLG産生促進用医薬組成物。
（Ｂ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する角層異常改善用医薬組成物。
（Ｃ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する皮膚保湿用医薬組成物。
（Ｄ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する皮膚バリア機能改善用医薬組成物。
（Ｅ）アトピー性皮膚炎の予防又は治療に用いられるものである、前記（Ａ）～（Ｄ）記載の医薬組成物。
（Ｆ）疾患が尋常性魚鱗癬の予防又は治療に用いられるものである、前記（Ａ）～（Ｄ）記載の医薬組成物。
（Ｇ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有するFLG産生低下に伴う疾患の予防用又は治療用医薬組成物。
（Ｈ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する角層異常を伴う疾患の予防用又は治療用医薬組成物。
（Ｉ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する皮膚水分保持能低下を伴う疾患の予防用又は治療用医薬組成物。
（Ｊ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩、及び製薬学的に許容される賦形剤を含有する皮膚バリア機能低下を伴う疾患の予防用又は治療用医薬組成物。
（Ｋ）疾患がアトピー性皮膚炎である、前記（Ｇ）～（Ｊ）記載の医薬組成物。
（Ｌ）疾患が尋常性魚鱗癬である、前記（Ｇ）～（Ｊ）記載の医薬組成物。
（Ｍ）FLG産生低下に伴う疾患の予防若しくは治療のためのGPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩。
（Ｎ）角層異常を伴う疾患の予防若しくは治療のためのGPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩。
（Ｏ）皮膚水分保持能低下を伴う疾患の予防若しくは治療のためのGPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩。
（Ｐ）皮膚バリア機能低下を伴う疾患の予防若しくは治療のためのGPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩。
（Ｑ）予防若しくは治療の対象がアトピー性皮膚炎患者に含まれるものである、前記（Ｍ）～（Ｐ）記載の化合物又はその塩。
（Ｒ）予防若しくは治療の対象が尋常性魚鱗癬患者に含まれるものである、前記（Ｍ）～（Ｐ）記載の医薬組成物。
（Ｓ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩の有効量を対象に投与することからなるFLG産生促進方法。
（Ｔ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩の有効量を対象に投与することからなる角層異常を伴う疾患の予防若しくは治療方法。
（Ｕ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩の有効量を対象に投与することからなる皮膚水分保持能低下を伴う疾患の予防若しくは治療方法。
（Ｖ）GPR142アゴニスト又は製薬上許容される塩の有効量を対象に投与することからなる皮膚バリア機能低下を伴う疾患の予防若しくは治療方法。
（Ｗ）対象がFLG産生低下に伴うアトピー性皮膚炎患者である、前記（Ｓ）～（Ｖ）記載の方法。
（Ｘ）対象が尋常性魚鱗癬患者である、前記（Ｓ）～（Ｖ）記載の方法。
　本発明に係るGPR142アゴニストは、皮膚におけるFLGの産生を促進させ、角層の水分保持能やバリア機能を良好に改善し、FLG産生促進剤の有効成分として作用することが確認された。また、FLG産生低下に伴う疾患治療剤、特に、アトピー性皮膚炎等の皮膚疾患の治療剤の有効成分としても作用しうる。また、GPR142を標的とすることにより、FLG産生低下に伴う疾患治療剤を系統的にスクリーニングすることができる。
（ａ）化合物１、化合物１＋カルシウム、（ｂ）比較化合物１、比較化合物１＋カルシウム、（ｃ）化合物１、比較化合物２によるFLGプロモーターの転写活性効果を、ルシフェラーゼアッセイにより確認した図である。（実施例１） NHEK細胞を予めカルシウム処理をした場合としない場合における、化合物１及び化合物２によるFLG mRNAの発現上昇効果を、リアルタイムPCRにより確認した図である。（実施例２） 化合物１又は化合物１＋カルシウム処理によるNHEK細胞におけるGPR142及びGPR22のmRNAの発現を、リアルタイムPCRにより確認した図である。（実施例４） GPR142のRNAi存在下に、化合物１又は化合物１＋カルシウム処理によるNHEK細胞におけるGPR142 mRNA及びFLG mRNAの発現量を、リアルタイムPCRにより確認した図である。（実施例５） GPR142のRNAi存在下に、化合物１、化合物２又は化合物３処理によるNHEK細胞におけるGPR142 mRNA及びFLG mRNAの発現量を、リアルタイムPCRにより確認した図である。（実施例６） GPR22のRNAi存在下に、化合物１又は化合物１＋カルシウム処理によるNHEK細胞におけるGPR22 mRNA及びFLG mRNAの発現量を、リアルタイムPCRにより確認した図である。（参考例１） GPR142過剰発現NHEK細胞における化合物１によるFLG mRNA及びGPR142 mRNAの発現を、リアルタイムPCRにより確認した図である。（実施例７） GPR142過剰発現HEK293T細胞における化合物１によるアデニル酸シクラーゼ活性に対する作用を確認した図である。（実施例８） GPR142過剰発現HEK293T細胞における化合物２、化合物３又は比較化合物２によるアデニル酸シクラーゼ活性に対する作用を確認した図である。（実施例９） 三次元培養皮膚における化合物１又は比較化合物２によるFLG mRNAの発現上昇効果を、リアルタイムPCRにより確認した図である。（実施例１０） 三次元培養皮膚における化合物１、比較化合物２又は比較化合物３によるFLGモノマーの産生能をイムノブロッティング法で確認した写真図である。（実施例１１） ヒト正常皮膚における化合物１によるFLG蛋白の産生状況を、組織免疫染色により確認した写真図である。（実施例１２） FLG遺伝子欠損ホモ及びヘテロモデルマウスに化合物１を投与したときのFLGモノマーの産生能をイムノブロッティング法で確認した写真図である。（実施例１３） アトピー性皮膚炎発症モデルマウス（NC/Nga）に化合物１を投与したときの臨床症状の経時変化を示す図である。（実施例１４の(i)） アトピー性皮膚炎発症モデルマウス（NC/Nga）に化合物１を投与したときの経皮水分蒸散量（TEWL）の測定結果を示す図である。(a)は投与開始から８週間後、(b)は１２週間後の結果を示す。（実施例１４の(ii)） アトピー性皮膚炎発症モデルマウス（NC/Nga）に化合物１を投与開始後１２週間目における当該マウスの外観を表す写真図である。(a)は対照マウス、(b)は化合物１投与マウスの結果を示す。（実施例１４の(iii)） アトピー性皮膚炎モデルマウス（NC/Nga）に化合物１を投与したときのFLGモノマーの産生能をイムノブロッティング法で確認した結果を示す。（実施例１５）
　　本発明者らは、後述の実施例に記載するように、G蛋白質共役型受容体(GPR)の一種であるGPR142を介してFLGの産生が促進されることを初めて見出した。本明細書において、GPR142依存的な細胞内シグナル伝達を介してFLGの産生を促進しうる物質を「GPR142アゴニスト」ということとする。GPR142アゴニストはFLG産生促進剤として有効であり、FLG産生低下に伴う疾患治療剤に使用し得る。
　また、GPR142を介してFLGの産生が促進されることから、このGPR142を標的受容体としてGPR142アゴニストを同定することによって、FLG産生促進剤を系統的にスクリーニングすることができる。同定されたGPR142アゴニストは、FLG産生低下に伴う疾患治療剤として有用である。
　本発明は、GPR142アゴニストを有効成分として含有することを特徴とする、FLG産生促進剤及びFLG産生低下に伴う疾患治療剤等の薬剤に関する。本発明薬剤の有効成分であるGPR142アゴニストは、GPR142に作用し、当該受容体を介してFLG mRNA及びFLG蛋白質の産生を促進しうる。本発明薬剤の有効成分であるGPR142アゴニストは、好ましくは、FLG蛋白質（すなわち、FLGモノマー）の産生を促進しうる。本発明は、GPR142アゴニストを細胞（好ましくは皮膚細胞）に接触させることにより、FLGの産生を促進する方法も包含する。
　本発明において、GPR142アゴニストとしては、例えば、N-(4-アミノ-2-メチル-6-キノリル)-2-[(4-エチルフェノキシ)メチル]ベンズアミド又は製薬上許容されるその塩が挙げられる。
　また本発明において、GPR142アゴニストとして、特許文献５（WO2010/093849号パンフレット）に記載されているようなフェニルアラニン誘導体又はアミノピラゾールフェニルアラニン又は製薬上許容されるそれらの塩が挙げられる。具体的には、例えば、下記一般式（I）表わされる化合物又は製薬上許容されるその塩が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 [式中、R1及びR2は各々について水素原子、ハロゲン原子又は炭素数1～3のアルキル基を表し、R3は炭素数1～3のアルキル基を表し、R4は炭素数1～3のアルコキシカルボニル基又はヒドロキシカルボニル基を表し、R5、R6及びR7は各々について水素原子又はハロゲン原子を表す。]
　　好ましくは、上記一般式（I）において、R1及びR2は水素原子を表す。また好ましくは、R3はメチル基を表す。好ましくは、R4はメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基又はヒドロキシカルボニル基を表す。好ましくは、R5、R6及びR7は水素原子を表す。一般式（I）で表される化合物としては、最も好ましくは、メチル2-(1-(1-メチル-3-(ピリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-5-イルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)アセテート 2塩酸塩、エチル2-(1-(1-メチル-3-(ピリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-5-イルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)アセテート 2塩酸塩、2-(1-(1-メチル-3-(ピリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-5-イルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)酢酸 2塩酸塩が挙げられる。
　さらに本発明において、GPR142アゴニストとして、イベルメクチンが挙げられる。具体的には、22,23-ジヒドロアベルメクチン（dihydroavermectin）B1a 90％以上と22,23-ジヒドロアベルメクチンB1b 10％以下の混合物が挙げられる。その他、欧州特許第0001689B1号公報やUS2010/0004200A1号公報に記載されているようなものも使用することができる。
　本明細書において、「製薬上許容されるその塩」とは、医薬品に使用可能であり、本発明疾患治療剤の有効成分であるGPR142アゴニスト、例えば上記一般式（I）で示される化合物と塩を形成するものであればいかなる塩でもよく、例えば塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸等の無機酸；又はシュウ酸、マロン酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、マンデル酸、酢酸、プロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸と反応させることにより得ることができる。本発明においては、塩酸塩が好ましい。なお、本発明においては各化合物の含水物あるいは水和物及び溶媒和物、結晶多形も包含される。
　また、本発明のGPR142アゴニストに係る各化合物のプロドラッグ及び代謝物も包含される。「プロドラッグ」とは、化学的又は代謝的に分解し得る基を有し、生体に投与された後、元の化合物に復元して本来の薬効を示す本発明化合物の誘導体であり、共有結合によらない複合体及び塩を含む。
　本発明において、GPR142アゴニストを医薬製剤として用いる場合、通常それ自体公知の製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、その他添加剤、具体的には水、植物油、エタノール又はベンジルアルコール等のアルコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアセテート、ゼラチン、ラクトース、デンプン等の炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラノリン、ワセリン等と混合して用いることができる。医薬製剤としては、液剤、ロ－ション剤、懸濁剤、乳剤、軟膏剤、ゲル剤、カプセル剤、錠剤、糖衣錠、顆粒剤、坐剤、などが挙げられる。所望により、これらの製剤に、佐剤、安定剤、湿潤又は乳化剤、緩衝剤、その他常用の添加剤を配合しうる。
　本発明治療剤の有効成分であるGPR142アゴニストは、FLG産生促進作用を有することから、FLG産生低下に伴う疾患、好ましくは、皮膚疾患治療剤として用いられる。FLG産生低下に伴う皮膚疾患の例として、例えばアトピー性皮膚炎、尋常性魚鱗癬、金属（ニッケル）アレルギー接触性皮膚炎（J. Investigative Dermatology (2008) 128: 1430-1435）、皮脂欠乏性湿疹（老人性乾皮症）（Arch Dermatol Res. (2004) 295: 448-452）等が挙げられるが、FLG産生低下に伴う皮膚疾患であれば、上記に限定されるものではない。
　背景技術の欄でも詳述したように、アトピー性皮膚炎における主な皮膚機能異常として、角層の水分保持能・バリア機能の低下、痒み閾値の低下、易感染性が挙げられるが、本発明のGPR142アゴニストは、特にアトピー性皮膚炎に伴う皮膚の角層の水分保持能及び／又はバリア機能の低下を改善するためのアトピー性皮膚炎治療剤として有用である。
　本明細書において、角層異常とは、角層の水分保持能すなわち保湿機能が損なわれている状態、角層のバリア機能が低下し、外部からのアレルゲン等の侵入を防ぐ機能が損なわれている状態をいう。
　角層は、外界との境となり、外界からの内部の防御（乾燥などの外部環境から身を守るために体内からの水分放出を調整する作用や角層自身の水分を保持する作用）や内部物質の保持（外部からの物質やアレルゲンの侵入、紫外線などに対するバリア層としての作用）などの機能を持っている。例えば、アトピー性皮膚炎では皮膚の炎症のない部分でも毛孔一致性の丘疹を伴う皮膚の乾燥（カサカサ）が認められ、体表面の１平方メートルあたりから、皮膚表面から１時間に蒸散する水分量、即ち経皮水分蒸散量（transepidermal water loss: TEWL）を測定すると健常人（7.4g/h・m2程度）に比べて上昇している。従って、本発明において、角層の水分保持能及び／又はバリア機能の確認は、経皮水分蒸散量や皮膚の乾燥（カサカサ）の程度を測定することにより行うことができる。
　ヒトにおける皮膚の水分保持能やバリア機能の測定方法は、以下の方法により行うことができる。水分保持能の測定は、例えば、J. Dermatology (2011) 38: 685-692に記載された方法に従って、行うことができる。具体的には、以下の手順による。被検体を室温21℃、湿度50±5％の部屋に20分間静置する。その際、被検体には試験用T-シャツを着用させる。試験用T-シャツを脱いだ5分後に、試験用T-シャツを水分蒸散測定装置によって経皮水分蒸散量（TEWL）を測定する、或いは、角層水分測定装置によって皮膚コンダクタンス（SCWC）を測定する。バリア機能の測定は、例えば、J. Dermatology (2011) 38: 685-692に記載された方法に従って行うことができる。具体的には、（i）視診により皮膚の乾燥（カサカサ）の程度を５段階（乾燥程度：（0）null（なし）；（1）modest（少し粗い）；（2）moderate（粗い）；（3）severe（角層の剥がれがあり明らかに粗い）；（4）significant（著明））に分けて診断する、或いは、（ii）角層の変化をダーモスコピーにより観察して、角層の異常を５段階（（0）null（滑らか）；（1）modest（少し粗い）；（2）moderate（粗い）；（3）severe（角層の剥がれがあり明らかに粗い）；（4）significant（著明））に分けて診断することができる。
　さらに、FLG産生低下の判断は、皮膚におけるFLGのmRNA量（例えば、PCR法）やFLGの蛋白量（例えば、ウエスタンブロット法）を測定することによって行うことができる。或いは、FLG産生の低下の程度は水分蒸散量や皮膚の乾燥の程度と相関する（J. Invest. Dermatol. (2009) 129(3):682-689）ので、上記の水分蒸散量を測定する方法や視診によって皮膚のカサカサ（乾燥）の程度を評価する方法などにより行うことができるが、視診によって皮膚のカサカサ（乾燥）の程度を評価して調べる方法が簡便で便利である。
　本発明の薬剤の投与方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜決定されるが、例えば経口、動脈内、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、経皮、経粘膜などの投与方法を挙げることができる。本発明の薬剤の剤形としては特に制限はなく、それぞれの目的に応じて適宜決定される。GPR142アゴニストを有効成分とする本発明の薬剤を経口投与する場合、例えば、１日の投与量としては、0.001～100 mg/kg、好ましくは、0.1～30 mg/kgの範囲で、薬剤を１日１回～複数回、又は２～４日に１回投与することができる。静脈内投与する場合は、１日の投与量としては、約0.0001～10 mg/kgが適当で、１日１回～複数回に分けて投与することができる。また、経皮剤としては、体重当たり約0.001～100 mg/kgを１日１回～複数回に分けて投与することができる。投与量は症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。本発明の治療剤によれば、後述の実施例に示すように、FLGの産生が促進される。また、アトピー性皮膚炎に伴う皮膚の角層異常（水分保持能及び／又はバリア機能低下）が改善される。
　また本発明は、FLG産生低下に伴う疾患治療剤のスクリーニング方法にも及ぶ。後述の実施例に示すように、GPR142依存的な細胞内シグナル伝達を介してFLGの産生が促進されることから、GPR142を標的受容体としてGPR142アゴニストを同定することによって、FLG産生促進剤を系統的にスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法で同定されたGPR142アゴニストは、FLG産生低下に伴う疾患治療剤として有用である。
　本発明のFLG産生低下に伴う疾患治療剤のスクリーニング方法は、GPR142の活性又は発現を促進し得るか否かを評価する工程を含み、例えば、GPR142を発現する細胞（「GPR142発現細胞」とも称する）を用いて行うことができる。
　本発明のスクリーニング方法に用いる、「GPR142発現細胞」は、GPR142ポリペプチドを内在的に発現している天然の細胞（例えば、正常ヒト表皮角化細胞（NHEK））や、GPR142遺伝子が導入された形質転換細胞のいずれであってもよく、細胞の形質転換方法としては当該分野で公知の種々の方法を使用することができる。本発明の方法においては、これらの細胞を用いることが好適であるが、GPR142を含む当該細胞の膜画分を使用することもできる。
　細胞にGPR142を発現させるために使用する「GPR142遺伝子」としては、任意の哺乳動物由来のGPR142又はその活性を保持する機能的改変体をコードする遺伝子であればよく、特に限定されないが、ヒトGPR142をコードする遺伝子を使用するのが好ましい。具体的には、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するヒトGPR142、又は配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と90％以上、好ましくは、95％以上、特に好ましくは、98％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつGPR142の活性を保持するヒトGPR142改変体をコードする塩基配列からなるヒトGPR142遺伝子を用いることができる。具体的には、GenBank accession number：NM_181790、AY288421（FEBS Lett. 554(3), 381-388(2003)）に示す配列に基づくヒトGPR142遺伝子が挙げられる。配列番号：２に記載の塩基配列を有するヒトGPR142遺伝子を特に好適に使用することができる。
　本発明の方法で使用されるGPR142遺伝子が導入された「GPR142発現細胞」は、例えば、宿主細胞に上記GPR142遺伝子を含む発現ベクターを導入して形質転換させることによって得ることができる。
　宿主細胞としては、酵母、昆虫細胞、動物細胞など公知のいずれのものも使用できるが、CHO細胞、COS細胞、HEK293（Human embryonic kidney293）細胞、NHEK（Normal Human Epidermal Keratinocytes）細胞、HaCaT（Human Skin keratinocyte）細胞、FreeStyleTM293-F細胞（インビトロジェン社）などが好適に使用することができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞の種類に応じたプロモーターを含むベクターを適宜選択する。ベクターとしては、例えば、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pCXN（Gene 108:193-199(1991)）、pUB110、pTP5、pC194、λファージ、レトロウイルス、バキュロウイルスなどが挙げられる。また、プロモーターとしてはTrpプロモーター、T7プロモーター、lacプロモーター、SPO1プロモーター、penPプロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、GALプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、AGプロモーターなどが挙げられる。
プロモーターの下流に上記GPR142遺伝子を結合した発現ベクターで、公知の方法に従って宿主細胞を形質転換して、スクリーニングに使用する「GPR142発現細胞」を作製することができる。かくして得られる「GPR142発現細胞」の培養液及び培養条件は使用する細胞の種類によって公知の範囲で適宜選択することができる。
　本発明のスクリーニング方法における「GPR142の活性」は、GPR142 依存的な細胞内シグナル伝達活性であり、被験物質が「GPR142の活性」を促進し得るか否かは、例えば、当該シグナル伝達における以下に例示するような種々の指標により評価することができる。
　例えば、GPR142のシグナル伝達活性は、アデニル酸シクラーゼ活性を指標として測定することができる。アデニル酸シクラーゼ活性は、例えば、細胞内におけるcAMP濃度（量）の測定により測定することができる。具体的には、例えば、GPR142発現細胞を、フォルスコリン、NKH-477（Colforsin daropate）、IBMX（1-メチル-3-イソブチルキサンチン）などの存在下、或いは、予めそれらで処理して当該細胞内のcAMP量を上昇させた後に被験物質と接触させ、cAMP EIA System（GEヘルスケア）、LANCE(R) cAMP Detection Kit（Perkin Elmer）、cAMP cell-based assay（Cisbio）、環状AMP EIAキット（Cayman Chemical）など用いて細胞内のcAMP量を測定することができる。GPR142アゴニストはアデニル酸シクラーゼ活性を抑制するので、GPR142の活性が促進されるとcAMPの産生が抑制される。
　また、GPR142発現細胞に、さらにCRE（cAMP response element）を介してルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子を結合したベクターを導入して共発現させた細胞を作製し、当該細胞をフォルスコリン、NKH-477、IBMXなどの存在下、或いは、予めそれらで処理した後に被験物質と接触させ、当該レポーター遺伝子の発現量を測定することもできる。
　また、GPR142の刺激によって引き起こされるMAPキナーゼカスケードによりリン酸化されるERK1/2のレベルの増減を、SureFire pERK kit（PerkinElmer）、Phospho-ERK（Cisbio）などで測定、或いは、GPR142の刺激によって引き起こされるPI3K-AKT経路におけるAKTのリン酸化のレベルをPathScan(R)（CSTジャパン）、Phospho-AKT（Cisbio）、Pan Specific Phospho-Akt ELISA Kit（Cayman Chemical）などで測定することもできる。
　また、常法に従い、Gq蛋白質のホスホリパーゼC促進活性を有する部分ポリペプチドとGi蛋白質のGPR142受容体との共役活性を有する部分ポリペプチドとのキメラであるG蛋白質キメラ（Gqi）を共発現させた形質転換細胞を作製し、当該細胞を被験物質と接触させ、カルシウムイオン濃度の変動を、例えば、FLEXstation（Molecular Devices）などで測定し、カルシウム濃度を指標とすることができる。
　本発明のスクリーニング方法において、被験物質が「GPR142の発現」を促進し得るか否かは、被験物質を接触させたGPR142発現細胞におけるGPR142のmRNA又は蛋白質の量を測定することにより評価することができ、これは、当該細胞からGPR142のmRNAや蛋白質を抽出して、定量的PCRやウエスタンブロッティングなどの常法に従い測定することができる。
　本発明のスクリーニング方法において、好ましくは、GPR142発現細胞において、被験物質不在下と比較して、被験物質存在下でGPR142の活性又は発現が増加された場合に、当該被験物質がGPR142の活性又は発現を促進する物質であると判定することができる。例えば、GPR142の活性を促進する物質としては、実施例に記載されるようなGPR142アゴニストと同程度に細胞内cAMP濃度を低下させる物質、具体的には、実施例９の条件下で10％以上、好ましくは20％以上低下させる物質を選択することが好ましい。また、GPR142の発現を促進する物質としては、実施例に記載されるようなGPR142アゴニストと同程度にGPR142のmRNAの発現量を増加させる物質、具体的には、実施例７の条件下で１．５倍以上、好ましくは２倍以上増加させる物質を選択することが好ましい。
　また、本発明においては、上記の指標によりGPR142アゴニスト活性を有するとして選択された被験物質がFLG産生低下に伴う疾患の治療に有効であるかを判断する工程をさらに含んでいてもよい。FLG産生促進活性を有するGPR142アゴニストの治療効果は、例えば、実施例１０～１４に示す方法により確認することができる。
　かくして、GPR142アゴニストをスクリーニングすることで、FLG産生低下に伴う疾患治療剤をスクリーニングすることができる。本発明のGPR142アゴニストは、FLG産生促進作用を有することから、FLG産生低下に伴う疾患、好ましくは、皮膚疾患治療剤として用いられる。FLG産生低下に伴う皮膚疾患の例として、例えば、アトピー性皮膚炎、尋常性魚鱗癬、金属（ニッケル）アレルギー接触性皮膚炎、皮脂欠乏性湿疹（老人性乾皮症）等が挙げられるが、FLG産生低下に伴う皮膚疾患であれば、上記に限定されるものではない。
　本発明の理解を深めるために、本発明を実施例に示してより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないことはいうまでもない。
　以下の各実施例において、Ａ）N-キノリルベンズアミド誘導体（化合物１）、Ｂ）イベルメクチン（化合物２）及びＣ）フェニルアラニンアミド誘導体（化合物３）の効果を確認した。比較化合物として、下記のＤ）比較化合物１、Ｅ）比較化合物２及びＦ）比較化合物３のいずれかを用いた。
Ａ）化合物１（N-キノリルベンズアミド誘導体）
　N-(4-アミノ-2-メチル-6-キノリル)-2-[(4-エチルフェノキシ)メチル]ベンズアミド 塩酸塩（N-(4-Amino-2-methyl-6-quinolyl)-2-[(4-ethylphenoxy)methyl]benzamide hydrochloride;N-(4-Amino-2-methylquinolin-6-yl)-2-[(4-ethylphenoxy)methyl]benzamide hydrochloride）
Ｂ）化合物２
　イベルメクチン（TOCRIS社）
Ｃ）化合物３（フェニルアラニンアミド誘導体）
　メチル2-(1-(1-メチル-3-(ピリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-5-イルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)アセテート 2塩酸塩（Methyl 2-(1-(1-methyl-3-(pyridine-4-yl)-1H-pyrazol-5-ylamino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-ylamino)acetate dihydrochloride）
Ｄ）比較化合物１（J113397）（特許文献７に記載の化合物）
　1-[(3R, 4R)-1-シクロオクチルメチル-3-ヒドロキシメチル-4-ピペリジル]-3-エチル-1,3-ジヒドロ-2H-ベンズイミダゾール-2-オン 塩酸塩（1-[(3R,4R)-1-(Cyclooctylmethyl)-3-(hydroxymethyl)-4-piperidyl]-3-ethyl-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one) hydrochloride）
Ｅ）比較化合物２（スクリプタイド（TOCRIS社））
　6-(1,3-ジオキソ-1H,3H-ベンゾ[de]イソキノリン-2-イル)ヘキサン酸ヒドロキシアミド
（6-(1,3-Dioxo-1H,3H-benzo[de]isoquinolin-2-yl) hexanoic acid hydroxyamide）
Ｆ）比較化合物３（3M344（TOCRIS社））
　4-ジメチルアミノ-N-（6-ヒドロキシカルバモイルヘキシル）-ベンズアミド（4-Dimethylamino-N-(6-hydroxycarbamoylhexyl) benzamide）
（実施例１）FLGプロモーターの転写活性効果
　本実施例では、NHEK細胞（正常ヒト新生児表皮角化細胞）を用いてN-キノリルベンズアミド誘導体（化合物１）によるFLGプロモーターの転写活性を確認した。FLGプロモーターの転写活性は、ルシフェラーゼアッセイにより行った。
１） NHEK細胞（クラボウ社）1.2×105個/mlを96ウェルプレートに80μl/ウェル(9.6×103個/well)播種し、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）に、hEGF (human Epidermal Growth Factor) (0.1 ng/ml)、インシュリン (10μg/ml)、ヒドロコルチゾン (0.5μg/ml), ゲンタマイシン (50μg/ml)、アムホテリシンB(50 ng/ml)及び BPE (bovine brain pituitary extract) (0.4％, v/v) を加えた培養液100μlを添加して、37℃、5％CO2の条件下にて培養した。
２）ルシフェラーゼレポーターベクター（pGL4 Luciferase Reporter Vectors, Promega社）のクローニングサイトに、FLG転写開始点（エクソン１上の「CTTTTGGTGAACAAG」）から約2.2Kb上流までのプロモーター領域を組み込んで、2.2Kb FLGプロモーターとルシフェラーゼを含むプラスミドDNAを作製した。FLG転写開始点から5'側上流のプロモーター領域を含む配列は、例えば、Ensembl Genome Browser 64：Homo sapiens-Exons-TranscriptのFLG-001（ENST00000368799）に記載されており、下記のホームページにより確認できる。
　(http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Exons?db=core;g=ENSG00000143631;r=1:152274651-152297679;t=ENST00000368799)
　上記１）の条件下にて培養１日後、96ウェルプレートの１ウェルあたり、上記プラスミドDNAを0.1μgをOPTI-MEM（Invitrogen社）10μlに加え、さらに導入用試薬（TransIT(R) -LT1 Transfection Reagent, Mirus社) 0.3μlを加えて、室温でNHEK細胞にトランスフェクションした。
３） 上記２）よりさらに培養１日後、下記Ａ）又はＢ）の薬剤をジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、１ウェルあたり1μMとなるように添加した。また、Ｃ）の薬剤を同様に１ウェルあたり1μM及び0.1μMとなるように添加した。さらに、Ａ）又はＢ）とカルシウム(Ca)を含む系についても確認した。CaとしてCaCl2（Ca換算で1.45 mM）を用いた。
Ａ）化合物１（N-キノリルベンズアミド誘導体）
Ｂ）比較化合物１（J113397）
Ｃ）比較化合物２（スクリプタイド）
　対照例としては、溶媒のみ（対照）又はCaCl2のみ（カルシウム）とした。なお、Caイオンはin vitroでの皮膚角化細胞の分化促進に関与している。
４）上記３）の薬剤添加３日後、ルシフェラーゼアッセイ用試薬（Bright-Glo(R) Luciferase Assay System, Promega社）を使用し、そのプロトコールに従ってルシフェラーゼ活性を測定した。薬剤処理した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）にて2回洗浄後、DMEM培地（Invitrogen社）を50μl加え、次いで、Bright-Glo(R) 試薬を50μl加えた。２分静置後、その70μlについてルシフェラーゼの吸光度を測定した。
　図１（ａ）（ｂ）及び（ｃ）の結果から、化合物１がFLGプロモーターの転写活性を有することが確認された。また、比較化合物２にFLGプロモーターの転写活性が見られた。これに対し、ノシセプチンアンタゴニストとして知られる比較化合物１(J113397)にはFLGプロモーターの転写活性はないことが確認された。
（実施例２）NHEK細胞におけるFLG mRNA発現上昇効果
　本実施例では、NHEK細胞を用いて化合物１又は化合物２によるFLG mRNA発現上昇効果を確認した。
１）NHEK細胞（Invitrogen社）5×104個/ウェルを24ウェルプレートに播種し、次いで、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）にhEGF (0.1 ng/ml)、インシュリン(10μg/ml)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)、アムホテリシンB(50 ng/ml)、及びBPE (bovine brain pituitary extract) (0.4％, v/v) を加えた培養液500μlを添加し、37℃、5％C02の条件下にて培養した。次に、以下の２）又は３）の条件で培養した後、サンプルを調製した。
２）上記１）の条件下にて培養１日後、化合物１又は化合物２のDMSO溶液を１ウェル当たり10 nMとなるように添加した上記１）の培養液で培地交換を行い、37℃、5％C02の条件下にて培養した。この操作を１日毎に繰り返し、３日間培養した。
３）NHEK細胞（Invitrogen社）5×104個/ウェルを24ウェルプレートに播種し、次いで、上記１）の培養液に、さらにCaとしてCaCl2（Ca換算で1.2 mM）を加えた培養液500μlを添加し、37℃、5％C02の条件下にて培養した。培養１日後に、Caを含む同培養液で培地交換して、さらに１日間培養した（カルシウムプライミング）。その後、化合物１又は化合物２のDMSO溶液を１ウェル当たり10 nMとなるように添加した上記１）の培養液で培地交換を行い、さらに１日間培養した。なお、上記２）及び３）の対照例としては溶媒のみ（vehicle）を添加した。
４）抽出試薬（TRIzol(R)、Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従って、上記２）及び３）で薬剤（化合物１又は化合物２）処理した各細胞について全RNAを抽出した。逆転写酵素試薬（Prime Script(R), Takara社）を用い、そのプロトコールに従って全RNAのcDNAを作製した。次いで、下記のプライマー及びSYBR(R) Premix Ex Taq （Takara社） を使用し、そのプロトコールに従って、CFX96リアルタイムPCR装置（バイオラッド社）でリアルタイムPCRを行い、FLG mRNA量を測定した。測定結果はGAPDH（グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素）比で示した。
　使用したプライマーの配列を以下に示す。
FLG Forward primer　: 5'-GCTGAAGGAACTTCTGGAAAAGG-3'　（配列番号：３）
FLG Reverse primer　: 5'-GTTGTGGTCTATATCCAAGTGATC-3'　（配列番号：４）
GAPDH Forward primer: 5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'　（配列番号：５）
GAPDH Reverse primer: 5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'　（配列番号：６）
　図２に示す通り、NHEK細胞において、化合物１及び化合物２が、FLG mRNAの発現を上昇させることが確認された。また、カルシウムプライミングによりそのFLG mRNAの発現をさらに上昇させることが確認された。NHEK細胞を用いてFLG産生のCell-based assayを行う場合は、カルシウムプライミングを行う方が好ましい。
（実施例３）NHEK細胞におけるG蛋白質共役型受容体（GPCR）アレイ
　本実施例では、NHEK細胞に関し、GPCRアレイを用いて化合物１によるGPCRの発現上昇効果を確認した。
１）NHEK細胞（Invitrogen社）5×104個/ウェルを24ウェルプレートに播種し、次いで、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）にhEGF(0.1 ng/ml)、インシュリン(10μg/ml)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)、アムホテリシンB (50 ng/ml)、及びBPE (bovine brain pituitary extract) (0.4％, v/v) を加えた培養液500μlを添加して、80～85％コンフルエントの状態になるまで3～4日間、37℃、5％C02の条件下にて培養した。
２）次いで、化合物１のDMSO溶液を１ウェル当たり1μMとなるように添加し、培地交換なしでさらに３日間培養した。また、CaとしてCaCl2（Ca換算で1.5 mM）のみを添加した系及び化合物１とCaとしてCaCl2（Ca換算で1.5 mM）との併用系についても同様にして３日間培養した。対照例としては溶媒のみ（vehicle）を添加した。
３）抽出試薬（TRIzol(R)、Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従って、上記２）で処理した各細胞について全RNAを抽出した。逆転写酵素試薬（Prime Script(R), Takara社）を用い、そのプロトコールに従って全RNAのcDNAを作製した。次いで、TaqMan (R) human GPCR アレイ（AB 4365295、Applied Biosystems社）を使用し、ABI PRISM(R)7900HT 遺伝子解析装置（Applied Biosystems社）により解析した。測定結果はコントロールの18SリボソームRNAとのサイクル数比較（ΔCt値）で示した（比較Ct法）。
　化合物１及び／又はカルシウム処理によって、対照に比べて発現が顕著に上昇したGPCR結果を表１に示した。表１に示す通り、NHEK細胞において、カルシウムはGPR142 mRNAの発現を誘導することが分かった。また、化合物１及び化合物１とカルシウムとの併用系はGPR142 mRNA及びGPR22 mRNAの発現を誘導することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（実施例４）NHEK細胞におけるGPR142及びGPR22の発現確認
　本実施例では、NHEK細胞に関し、化合物１によるGPR142 mRNA及びGPR22 mRNAの発現誘導効果を確認した。
１）NHEK細胞（Invitrogen社）5×104個/ウェルを24ウェルプレートに播種し、次いで、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）にhEGF(0.1 ng/ml)、インシュリン(10μg/ml)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)、アムホテリシンB(50 ng/ml)、及びBPE (bovine brain pituitary extract) (0.4％, v/v) を加えた培養液500μlを添加して、37℃、5％C02の条件下にて培養した。
２）上記１）の条件下にて培養１日後、化合物１のDMSO溶液を１ウェルあたり1μMとなるように添加した上記１）の培養液で１日毎に培地交換して３日間培養した。また、化合物１の代わりに、CaとしてCaCl2（Ca換算で1.2 mM）を使用した系及びCa（Ca換算で1.2 mM）と化合物１（１ウェルあたり1μM）との併用系についても同様に３日間培養した。対照としては溶媒のみ（vehicle）を添加した。
３）抽出試薬（TRIzol(R)、Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従って、上記薬剤処理した各細胞について全RNAを抽出した。逆転写酵素試薬（Prime Script(R), Takara社）を用い、そのプロトコールに従って全RNAのcDNAを作製した。下記のプライマー及びSYBR(R) Premix Ex Taq（Takara社）を使用し、そのプロトコールに従って、CFX96リアルタイムPCR装置でリアルタイムPCRを行い、GPR142 mRNA及びGPR22 mRNAの発現量を測定した。測定結果はGAPDH比で示した。
　使用したプライマーの配列を以下に示す。
GPR142 Forward primer :5'-CTTGTCTCAGCCATTCCAGGTG-3'　（配列番号：７）
GPR142 Reverse primer :5'-GATCCTTACGCAGACACTGAGC-3'　（配列番号：８）
GPR22 Forward primer　:5'-CCACACAACATGAGGCTACAGAC-3'　（配列番号：９）
GPR22 Reverse primer　:5'-CTTTCTCGTCGTTCACGGTGTC-3'　（配列番号：１０）
GAPDH Forward primer　:5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'　（配列番号：５）
GAPDH Reverse primer　:5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'　（配列番号：６）
　図３に示す通り、NHEK細胞において、対照と比較してカルシウム、化合物１及び化合物１とカルシウムとの併用系でGPR142 mRNAの発現が誘導されていることが確認された。また、化合物１はGPR22 mRNAの発現を誘導することが確認された。これらの実験結果は、上記実施例３のGPCRアレイの結果（GPR142及びGPR22の発現）と一致することが確認された。
（実施例５）GPR142のRNAiによるブロック効果
　本実施例では、NHEK細胞に関し、化合物１による、GPR142 mRNA及びFLG mRNAの発現誘導効果がGPR142のRNAiでブロックされることを確認した。
１）NHEK細胞（Invitrogen社）5×104個/ウェルを24ウェルプレートに播種し、次いで、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）にhEGF(0.1 ng/ml)、インシュリン(10μg/ml)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)、アムホテリシンB(50 ng/ml)、及びBPE(bovine brain pituitary extract) (0.4％, v/v)を加えた培養液500μlを添加して、37℃、5％C02の条件下にて培養した。
２）上記１）の条件下にて培養１日後、上記１）の培養液に、さらにCaとしてCaCl2（Ca換算で1.2 mM）加えた培養液で培地交換し、37℃、5％C02の条件下にて培養した。培養１日後に、Caを含む同培養液で培地交換して、さらに１日間培養した。
３）上記２）のNHEK細胞に、24ウェルプレートの１ウェルあたり50 nMのsiRNAを、導入試薬リポフェクタミン RNA Max（Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従ってトランスフェクションした。
　用いた３種類のGPR142のsiRNAの配列及びコントロールのsiRNAの配列（いずれのsiRNAもInvitrogen社）を以下に示す。
GPR142-1(#HSS139493):
 Sense Sequence　　: GGCGUCAUCCCUGUCAUCUACUACA;　（配列番号：１１）
 Antisense Sequence: UGUAGUAGAUGACAGGGAUG; 　（配列番号：１２）
GPR142-2(#HSS139494):
 Sense Sequence　　: CCAACAUCCUGGAGUUUGCUGCCAA;　（配列番号：１３）
 Antisense Sequence: UUGGCAGCAAACUCCAGGAUGU; 　（配列番号：１４）
GPR142-3(#HSS179846):
 Sense Sequence　　: GCUGUCCUGAGUGCUGCCCUGUUGA;　（配列番号：１５）
 Antisense Sequence: UCAACAGGGCAGCACUCAGGAC;　（配列番号：１６）
Control -1(LOW GC, #129350-200):
 Sense Sequence　　: GGAUGUCAACUUGAGCAACUUAUUU;　（配列番号：１７）
 Antisense Sequence: AAAUAAGUUGCUCAAGUUGACAUCC;　（配列番号：１８）
Control -2(MED GC, #129350-300);
 Sense Sequence　　: GGUAGGUGAGUGUACAGACGCAAUA;　（配列番号：１９）
 Antisense Sequence: UAUUGCGUCUGUACACUCACCUACC;　（配列番号：２０）
Control-3(HIGH GC, #129350-400):
 Sense Sequence　　 :GGCGGCUCGUGCAACACAGGCGCUU;　（配列番号：２１）
 Anti Sense Sequence:AAGCGCCUGUGUUGCACGAGCCGCC;　（配列番号：２２）
４）上記３）において、siRNAでトランスフェクションして１日培養後、化合物１のDMSO溶液を１ウェルあたり10 nMとなるように添加した上記１）の培養液で培地交換し、さらに１日間培養した。対照としては溶媒のみ（vehicle）を添加した。
５）抽出試薬（TRIzol(R)、Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従って、上記薬剤処理した各細胞について全RNAを抽出した。逆転写酵素試薬（Prime Script(R), Takara社）を用い、そのプロトコールに従って全RNAのcDNAを作製した。下記のプライマー及びSYBR(R) Premix Ex Taq（Takara社）を使用し、そのプロトコールに従って、CFX96リアルタイムPCR装置でリアルタイムPCRを行い、GPR142 mRNA及びFLG mRNA発現量を測定した。測定結果はGAPDH比で示した。
　使用したプライマーの配列を以下に示す。
GPR142 Forward primer :5'-CTTGTCTCAGCCATTCCAGGTG-3'　（配列番号：７）
GPR142 Reverse primer :5'-GATCCTTACGCAGACACTGAGC-3'　（配列番号：８）
FLG Forward primer　　:5'-GCTGAAGGAACTTCTGGAAAAGG-3'　（配列番号：３）
FLG Reverse primer　　:5'-GTTGTGGTCTATATCCAAGTGATC-3'　（配列番号：４）
GAPDH Forward primer　:5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'　（配列番号：５）
GAPDH Reverse primer　:5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'　（配列番号：６）
　図４に示す通り、カルシウム、化合物１及びカルシウムと化合物１との併用系において、GPR142のsiRNAにより、GPR142 mRNA 及びFLG mRNAの発現が抑制されていることから、実施例４で示したFLG mRNAの発現は、GPR142を介するものであることが確認された。
（実施例６）GPR142のRNAiによるブロック効果
　本実施例では、NHEK細胞に関し、化合物２又は３による、GPR142 mRNA及びFLG mRNAの発現誘導効果がGPR142のRNAiでブロックされることを確認した。
　実施例５の１）～３）において、GPR142のsiRNA及びコントロールのsiRNAとして、それぞれGPR142-1(#HSS139493)とGPR142-3(#HSS179846)及びControl -1(LOW GC, #129350-200)とControl -3(HIGH GC, #129350-400)のそれぞれ２種類のsiRNAを使用するほかは、実施例５と同様に、NHEK細胞をトランスフェクションした。実施例５の４）と同様にトランスフェクションして１日培養後、化合物１のDMSO溶液、化合物２のDMSO溶液及び化合物３のメタノール溶液を、１ウェルあたりそれぞれ10 nMとなるように添加した培養液で培地交換し、さらに１日間培養した。対照としては溶媒のみ（vehicle）を添加した。実施例５の５）と同様にして、上記薬剤処理した各細胞についてリアルタイムPCRを行い、GPR142 mRNA 及びFLG mRNA量を測定した。測定結果はGAPDH比で示した。
　図５に示す通り、化合物１と同様、化合物２及び化合物３によるFLG mRNAの発現誘導もGPR142を介するものであることが確認された。
（参考例１）GPR22のRNAiによるブロック効果
　本参考例では、NHEK細胞に関し、化合物１によるFLG mRNAの発現誘導効果がGPR22のRNAiによるブロックで抑制されないことを確認した。
１）NHEK細胞（Invitrogen社）5×104個/ウェルを24ウェルプレートに播種し、次いで、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）にhEGF(0.1 ng/ml)、インシュリン(10μg/ml)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)、アムホテリシンB(50 ng/ml)、及びBPE(bovine brain pituitary extract) (0.4％, v/v)　を含む培養液を500μl添加して、37℃、5％C02の条件下にて培養した。
２）上記１）より１日後、カルシウムを加えた培地を毎日交換し、２日間培養（プライミング）した。
３）上記２）より、24ウェルプレートの１ウェルあたり10 nMのsiRNAを導入試薬リポフェクタミン RNA Max（Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従ってNHEK細胞にトランスフェクションした。
　用いたsiRNAの配列を以下に示す。
GPR22-1(#HSS104365):
 Sense Sequence　　 :UAGUCAUGGCUUAUGGAACAACUAU　（配列番号：２３）
 Anti Sense Sequence:AUAGUUGUUCCAUAAGCCAUGACUA　（配列番号：２４）
GPR22-2(#HSS104367):
 Sense Sequence　　 :GAGUUGUUUCUAUAGUAGAAGCUGA　（配列番号：２５）
 Anti Sense Sequence:UCAGCUUCUACUAUAGAAACAACUC　（配列番号：２６）
GPR22-3(#HSS178711):
 Sense Sequence　　 :GGCAGAGCUGUAAUGUUAAUGAUAU　（配列番号：２７）
 Anti Sense Sequence:AUAUCAUUAACAUUACAGCUCUGCC　（配列番号：２８）
Control-1(Low GC, #129350-200):
 Sense Sequence　　 :GGAUGUCAACUUGAGCAACUUAUUU　（配列番号：１７）
 Anti Sense Sequence:AAAUAAGUUGCUCAAGUUGACAUCC　（配列番号：１８）
Control-2(MED GC, #129350-300):
 Sense Sequence　　 :GGUAGGUGAGUGUACAGACGCAAUA　（配列番号：１９）
 Anti Sense Sequence:UAUUGCGUCUGUACACUCACCUACC　（配列番号：２０）
Control-3(HIGH GC, #129350-400):
 Sense Sequence　　 :GGCGGCUCGUGCAACACAGGCGCUU　（配列番号：２１）
 Anti Sense Sequence:AAGCGCCUGUGUUGCACGAGCCGCC　（配列番号：２２）
４）上記３）より培養１日後、化合物１をDMSOに溶解し、24ウェルの１ウェルあたり、10 nMとなるように添加した培地に交換し、１日間培養した。対照例としては溶媒のみ（vehicle）を添加した。
５）抽出試薬（TRIzol(R)、Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従って、上記薬剤処理した各細胞について全RNAを抽出した。逆転写酵素試薬（Prime Script(R), Takara社）を用い、そのプロトコールに従って全RNAのcDNAを作製した。SYBR(R) Premix Ex Taq（Takara社）を使用し、そのプロトコールに従って、CFX96リアルタイムPCR装置でリアルタイムPCRを行い、GPR22 mRNA及びFLG mRNA量を測定した。測定結果はGAPDH比で示した。
　図６に示す通り、カルシウム、化合物１及びカルシウムと化合物１の併用系において、GPR22のsiRNAにより、GPR22 mRNAの発現がコントロールに比べて抑制されたが、FLG mRNAの発現は抑制されなかった。実施例５及び６の結果から、化合物１によるFLG mRNAの発現はGPR142を介するものであることが確認された。
（実施例７）GPR142過剰発現NHEK細胞における化合物１のFLG mRNA産生効果
　本実施例では、GPR142過剰発現NHEK細胞に関し、化合物１によるFLG mRNAの発現誘導効果を確認した。
１）NHEK細胞（Invitrogen社）5×104個/ウェルを24ウェルプレートに播種し、次いで、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）にhEGF(0.1 ng/ml)、インシュリン(10μg/ml)、ヒドロコルチゾン(0.5μg/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)、アムホテリシンB(50 ng/ml)及びBPE(bovine brain pituitary extract) (0.4％, v/v)を加えた培養液を添加して、37℃、5％C02の条件下にて培養した。
２）配列番号：２に示す塩基配列を含むヒトGPR142遺伝子コーディング領域を哺乳類発現ベクターpCXN（Gene 108:193-199(1991)）のクローニングサイトの制限部位EcoRIに組み込み、GPR142pCXN哺乳類発現ベクターを作製した。
３）上記１）の条件にて１日培養後、１ウェルあたり0.5μgのGPR142哺乳類発現ベクターpCXNを、導入試薬Fugene(R)HD（Promega社）を用い、そのプロトコールに従ってNHEK細胞にトランスフェクションした。コントロールとして哺乳類発現ベクターpCXNのみをトランスフェクションした。
４）上記によりトランスフェクションして１日培養後、化合物１のDMSO溶液を、１ウェルあたり10 nMとなるように添加した培養液で培地交換し、さらに１日間培養した。対照としては溶媒のみ（vehicle）を添加した。
５）抽出試薬（TRIzol(R)、Invitrogen社）を用い、そのプロトコールに従って、上記薬剤処理した各細胞について全RNAを抽出した。逆転写酵素試薬（Prime Script(R), Takara社）を用い、そのプロトコールに従って全RNAのcDNAを作製した。実施例４で使用したGPR142、FLG及びGAPDHと同様のプライマー及びSYBR(R) Premix Ex Taq（Takara社）を使用し、そのプロトコールに従って、CFX96リアルタイムPCR装置でリアルタイムPCRを行い、GPR142 mRNA 及び、FLG mRNA量を測定した。測定結果はGAPDH比で示した。
　図７に示す通り、GPR142を過剰発現するNHEK細胞において、化合物１によって、FLG mRNAの発現が増加することが確認された。これらのことから、GPR142がFLGの発現に関与しており、化合物１はGPR142を介してFLGを発現していることが確認された。さらにまた、化合物１によりGPR142がNHEK細胞に誘導されることが確認された（GPR142 mRNAの発現量が対照に比べて約2.2倍増加した。）。
（実施例８）アデニル酸シクラーゼ活性に対する作用の測定
　本実施例では、化合物１によるcAMPの産生抑制効果を確認した。
１）HEK293T細胞 6×104個/ウェルをコラーゲンコート24ウェルプレートに播種し、DMEM培地（Invitrogen社）にペニシリン(50μg/ml)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、FBS（ウシ胎仔血清）(10％, v/v)を加えた培養液を添加して、37℃、5％C02の条件下にて培養した。
２）実施例７の２）と同様にしてGPR142PCXN哺乳類発現ベクターを作製した。
３）上記１）の条件にて１日培養後、１ウェルあたり0.2μgのGPR142PCXN哺乳類発現ベクターを、導入試薬Fugene(R)HD（Promega社）を用い、そのプロトコールに従ってHEK293T細胞にトランスフェクションした。コントロールとしてPCXN哺乳類発現ベクターのみをトランスフェクションしたものを用いた。
４）上記によりトランスフェクションして１日培養後、HEK293T細胞を1 mMのcAMPホスフォジエステラーゼ阻害物質であるイソブチルメチルキサンチン(IBMX)を添加後、10分間、37℃で培養した。
５）次いで、化合物１のDMSO溶液を、１ウェルあたり0.1 nM～1000 nM、10μMフォルスコリン、1mM IBMXとなるように添加した培養液で培地に交換し、さらに20分間、37℃で培養した。対照としては溶媒（vehicle）、10μMフォルスコリン、1 mM IBMXを添加した。
６）上記５）で培養した細胞をHCl 0.1 mol/Lで溶解した。細胞内cAMP濃度を、環状AMP EIAキット（Cayman Chemical社）を使用し、そのプロトコールに従って測定した。結果は対照例のcAMP濃度を100％とし、それに対する化合物１で処理した細胞のcAMP濃度の割合（％）で表した。
　図８に示すように、化合物１はGPR142を介して用量依存的にcAMPの産生を低下させることが確認された。
（実施例９）アデニル酸シクラーゼ活性に対する作用の測定
　本実施例では、化合物２又は３によるcAMPの産生抑制効果を確認した。
　実施例８の１）～４）と同様にしてHEK293T 細胞を培養した。次いで、実施例８の５）において、化合物１の代わりに、化合物３のメタノール溶液、化合物２のDMSO溶液及び比較化合物２のDMSO溶液をそれぞれ１ウェルあたり1000 nMとなるように使用するほかは、実施例８の５）と同様にして培養した。培養した細胞を、実施例８の６）と同様にしてcAMP濃度を測定した。
　図９に示すように、化合物３及び化合物２はGPR142を介してcAMPの産生を低下させること（それぞれ約24%および約20%の低下）が確認された。一方、比較化合物２による刺激においてはcAMPの産生抑制作用は見られなかった。
（実施例１０） 三次元培養皮膚におけるFLG mRNAの発現上昇効果
　本実施例では、三次元培養皮膚を用いて化合物１によるFLG mRNAの発現上昇効果を調べた。FLG mRNAの発現は、リアルタイムPCR法により測定した。
１）市販のヒト皮膚三次元モデル（TEST SKIN(R) LSE-013, TOYOBO社）を、TEST SKIN LSE ASSAY MEDIUM(TOYOBO社)を用い、そのプロトコールに従って培養した。
２）培養２日後、下記Ａ）又はＣ）の薬剤をDMSOに溶解し、1μMとなるように培地に加え、細胞の薬剤処理を行った。
Ａ）化合物１（N-キノリルベンズアミド誘導体）
Ｃ）比較化合物２（スクリプタイド）
　対照例としては、溶媒のみ（vehicle）を添加した。
３）さらに培養２日後（培養開始後４日目）、上記薬剤を加えた培地で培地交換した。さらに培養３日後（培養開始後７日目）、三次元培養した皮膚を回収し、液体窒素で凍結後-30℃で保存した。
４） RNA抽出用試薬（RNeasy(R), QIAGEN社）を用い、そのプロトコールに従って、上記薬剤処理した各細胞について全RNAを抽出した。逆転写酵素試薬（Prime Script(R), TaKaRa社）を用い、そのプロトコールに従って全RNAからcDNAを作製した。 Light Cycler 480 SYBR Green I Master（Roche社）を使用し、そのプロトコールに従ってリアルタイムPCRを行い、FLG mRNA量を測定した。測定結果はGAPDH比で示した。
　図１０に示す通り、ヒト皮膚三次元モデルにおいて、化合物１及び比較化合物２は、FLGのmRNAの発現を上昇させることが確認された。
（実施例１１）三次元培養皮膚におけるFLGモノマーの発現上昇効果
　本実施例では、三次元培養皮膚を用いて化合物１によるFLGモノマーの発現上昇効果を調べた。FLGモノマーの発現は、ウエスタンブロッティング法により確認した。
　本実施例では、まず上記実施例１０の１）～３）と同じ操作を行った。但し、薬剤としてＤ）比較化合物３（M344）についても実施例１０のＡ）化合物１、Ｃ）比較化合物２と同様に行った。
　４）実施例１０の１）～３）と同手法により三次元培養した皮膚を回収し、ハサミでバラバラにした後、Lysis緩衝液（0.1 M Tris-HCl(pH 9.0), 6M Urea, 1％ 2-mercapto-ethanol, 1％ SDS, 1 mM EDTA, Protease inhibitor cocktail）を100μｌ加え、電動ペッスルでホモジナイズした。ホモジナイズした細胞を15,000 rpm、4℃で20分間遠心処理し、その上清を回収し、測定用試料とした。プロテインアッセイ試薬（BIO-RAD社）を使用し、プロトコールに従って試料中の全蛋白質を定量した。各試料について、15μg/laneとなるように蛋白質を調整し、SDS-PAGE（Invitrogen社、NuPAE Novex Bis-Tris mini Gel 4-12％）で、100V、2時間の条件で電気泳動を行なった。マーカーとしてPrecision Plus Protein Standards（BIO-RAD社）を用いた。電気泳動で分離した蛋白質をPVDF膜に転写（ブロッティング）し、抗FLG抗体（Filaggrin AKH1, Santa Crus社）によりFLGモノマーの発現を確認した。その際、二次抗体としてAnti-mouse IgG-HRP（GE Healthcare社）を使用し、発色剤としてAmersham ECL Plus Western Blotting Detection Reagents（GE Healthcare社）を使用した。
　図１１の結果から、化合物１は多くのプロFLGを産生していることが分かった。また、化合物１の場合は明瞭なFLGモノマーの産生が確認された。これに対し、比較化合物２及び比較化合物３の場合は、明瞭なFLGモノマーの産生は見られなかった。
（実施例１２）ヒト正常皮膚の培養におけるFLGモノマーの発現上昇効果
　本実施例では、ヒト正常皮膚を用いて化合物１（N-キノリルベンズアミド誘導体）によるFLGモノマーの発現上昇効果を調べた。FLGモノマーの発現は、抗ヒトFLG抗体による組織免疫染色法により確認した。培地は、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（HuMedia-KG2, クラボウ社）を用いた。なお、本実施例では、皮膚疾患部の摘出術に伴い余剰となった正常皮膚の部分を、京都大学の倫理委員会を経て提供者の承諾の下に使用した。
１）ヒト正常皮膚（5×5×5mm角）を24ウェルトランスウエルプレートのトランスウェルにのせ、下方に化合物１(1μM)又は対照（vehicle(DMSO)）を添加した培地を500μl加え、の条件下にて培養した。２日後同じ培地で培地交換した。
２）４日後に上記培養した皮膚を回収し、10％ホルマリンに一晩浸けた後、常法に従い6mm厚のパラフィン切片を作製した。常法により脱パラフィン後、一次抗体として抗ヒトFLG抗体（抗ヒトFilaggrin抗体sc-66192, Santa Cruz社）を用い、二次抗体としてビオチン化抗マウスIgG抗体（eBioscience社）を用い、ジアミノベンジジン（DAB）にて発色させ、組織免疫染色によりFLG蛋白の発現状況を確認した。
　図１２（ｂ）において、点線で囲んだ部位で染色が顕著な部分を矢印で示した。（ａ）及び（ｂ）の結果から、化合物１を添加した（ｂ）の角層は、対照（ａ）に比べて発達しており、また、皮膚内部のFLG蛋白が大幅に増加していることが確認された。
（実施例１３）モデル動物におけるFLGの発現上昇効果
　本実施例では、FLG遺伝子のホモ又はヘテロ変異型マウス（Jackson Laboratory、flaky tail mice）を用いて、化合物１（N-キノリルベンズアミド誘導体）によるFLGモノマーの発現上昇効果を確認した。FLG蛋白の発現は、ウエスタンブロッティング法により確認した。
１）超純水（milliQ、ミリポア社）に溶解した化合物１(1μM)を、FLGのホモ又はヘテロ変異型マウスの左右の耳に皮内注射(10μl/ear)した。対照として、超純水（milliQ、ミリポア社）を同様に皮内注射した。
２）３日後、さらに化合物１又は超純水を同様に皮内注射した。
３）８日後、各マウスの耳を麻酔下で切り取り、当該切り取った耳の軟骨を挟んで耳の皮膚を剥がし、真皮側を20 mM EDTA含有PBSに37 ℃で30分間浸けた。次に耳の表皮を剥がし50 mlの Lysis緩衝液（0.1 M Tris-HCl(pH 9.0), 6M Urea, 1％ 2-mercapto-ethanol, 1％ SDS, 1 mM EDTA, Protease inhibitor cocktail）を加えて電動ペッスルでホモジナイズ後、上記実施例１１の４）と同様に試料を調製し、電気泳動後ウエスタンブロット法により、FLGモノマーの発現を確認した。一次抗体は抗マウスFLG抗体（抗マウスFilaggrin抗体、COVANCE社）1μg/mlを使用し、二次抗体としてAnti-rabbit IgG-HRP（GE Healthcare社）を使用し、発色剤としてAmersham ECL Plus Western Blotting Detection Reagents（GE Healthcare社）を使用した。
　図１３の結果から、FLGのヘテロ変異型マウスにおいて、化合物１によりFLGモノマーの産生が確認された。一方、FLGのホモ変異型マウスにおいてはFLGモノマーの産生は見られなかった。これらは、化合物１によりFLGの遺伝子が転写されてプロFLGが発現し、次いで、脱リン酸化、加水分解の一連の反応によってFLGモノマーが産生したことを示しているものと推測される。
（実施例１４）アトピー性皮膚炎モデルマウス（NC/Nga）における皮膚炎改善効果
　６～１０週齢のダニ付きアトピー性皮膚炎発症NC/Ngaマウス（日本SLC社）を通常の環境下で飼育しながら実験を行った。すなわち、耳介及び頭部を中心に皮膚炎が出現しているNC/Ngaマウスに化合物１をメチルセルロース溶液（0.5 W/V％Methyl Cellulose 400 Solution、Wako、133-14255）に0.75 mg/mlとなるように溶解した溶液500μlを隔日で内服投与（マウスに1回当たり、化合物１を0.375 mg投与）して、皮膚炎の改善効果を測定した。対照としてメチルセルロース溶液500μlを隔日で内服投与した。
(i) 皮膚炎の臨床症状の観察
　臨床症状に関して、紅斑、浮腫、びらん、鱗屑の４項目について、視診により、なし（0）、弱い（1）、普通（2）、ひどい（3）の４段階に分けて評価を行った。内服開始前（0 wk）、内服４週間後（4 wk）、８週間後（8 wk）において、上記４項目の評価を合算してスコア化し、モデルマウスの臨床症状をクリニカルスコアとして測定した。さらに、内服８週間で内服を終了し、その後、同条件下で飼育を継続した。内服終了してから４週間後（内服開始から12 wk）に臨床症状を同様にしてスコア化した。それらの結果を図１４に示した。
　図１４から明らかなように、化合物１の内服開始後８週後において皮膚炎の症状は改善されていた。また、内服終了後４週間目においても対照に比べて皮膚炎の症状は抑えられていた。
(ii) 水分蒸散量（TEWL）の測定
　上記(i)において、内服開始後８週間及び１２週間におけるTEWLの計測を帯型閉鎖チャンバー方式水分蒸散量測定装置VAPO SCAN AS-VT100RS（ASAHI BIOMED社）を使用し、そのマニュアルに従って行った。その結果を図１５（ａ）及び（ｂ）に示した。
　図１５（ａ）から明らかなように、対照の発症NC/Ngaマウスでは８週間後におけるTEWLは約60 g/h・m2と高い値であったのに対し、化合物１を内服した発症NC/Ngaマウスでは約10 g/h・m2と低い数値であった。未発症NC/NgaマウスのTEWLが5～10 g/h・m2であることから、化合物１により水分蒸散量が未発症マウスと同程度まで改善されたことが分かった。また、図１５（ｂ）から、内服終了後４週間目（内服開始後１２週間）においても、対照に比べて水分蒸散量が抑えられていることが分かった。これらの結果から、化合物１は、アトピー性皮膚炎に伴う皮膚の角層異常の改善に有用であることが分かった。
(iii) 内服開始１２週間後の発症NC/Ngaマウスの外観
　上記(i)において、内服開始から１２週間目（８週間目で内服を終了）における発症NC/Ngaマウスの外観を図１６（ａ）及び（ｂ）に示した。
　図１６（ａ）から明らかなように、対照のマウスにおいては、眼の周り、頭部、耳介部分の臨床症状が劣悪な状態であった。また、頭部の脱毛も観察された。一方、図１６（ｂ）から明らかなように、化合物１を投与したマウスにおいては、内服投与を終了してから４週間後においても、耳介部分に一部軽度の湿疹の再発が観察されたが、ほぼ良好な臨床症状が維持されていた。
（比較例２）特許文献６（特開2004-175687号公報）に記載の技術について
　特許文献６（特開2004-175687号公報）にはヘアレスマウスの皮膚にテープストリッピングを施して物理的に皮膚バリア破壊した後、cAMPアンタゴニストを塗布することによって細胞内カルシウムのレベルを低下させ、当該バリアを回復することが記載されている。
　当該特許文献にcAMPアンタゴニストとして例示されている多くの化合物（（－）－キンピロール塩酸塩、（＋）－PD128907、PD168077、８－ヒドロキシPIPAT、オキソトレモリン、（S）-3,4-DCPG、SNC80、SB205607、BRL-52537、SCH23390、CY208-243、RS39604、RS23597-190、ピモジド、ICI-118,551、ベタキソール）について、FLG mRNAの発現促進効果を確認した。
　HaCaT細胞を、J. Investigative Dermatology (2011)131:1660-1667に記載された培養条件下に、上記化合物1～10μMの濃度で処理した後、全RNAを抽出してRT-PCRにてFLG mRNAを測定したが、FLG mRNAの発現は見られなかった。これにより、cAMPアンタゴニストであれば、必ずFLGの産生促進活性があるということではないことが確認された。
　これに対し、GPR142アゴニストは、cAMPアンタゴニストとしての作用を有するものの、上記各実施例に示したように、FLGの産生促進作用を有する。従って、本願発明は、特許文献６に記載の発明とは明らかに相違することが確認された。
（実施例１５）アトピー性皮膚炎モデルマウス（NC/Nga）におけるFLGモノマー産生効果
　６～１０週齢のダニ付きアトピー性皮膚炎発症NC/Ngaマウス（日本SLC社）を通常の環境下で飼育しながら実験を行った。すなわち、耳介及び頭部を中心に皮膚炎が出現しているNC/Ngaマウスに、化合物１をメチルセルロース溶液（0.5W/V％Methyl Cellulose 400 Solution、Wako、133-14255）に1.5mg/mlとなるように溶解した溶液500μlを隔日で内服投与（マウスに1回当たり、化合物１を0.75mg投与）した。対照としてメチルセルロース溶液500μlを隔日で内服投与した。化合物１投与群及び対照群共、それぞれ５頭のマウスで実験を行った。
　投与開始後2週間目に、各マウスの耳を麻酔下で切り取り、当該切り取った耳の軟骨を挟んで耳の皮膚を剥がし、真皮側を20 mM EDTA含有PBSに37 ℃で30分間浸けた。次に耳の表皮を剥がし50 mlの Lysis緩衝液（0.1 M Tris-HCl(pH 9.0), 6M Urea, 1％ 2-mercapto-ethanol, 1％ SDS, 1 mM EDTA, Protease inhibitor cocktail）を加えて電動ペッスルでホモジナイズ後、ホモジナイズした細胞を15,000 rpm、4℃で20分間遠心処理し、その上清を回収し、測定用試料を調製し、電気泳動後ウエスタンブロット法により、FLGモノマーの発現を確認した。一次抗体は抗マウスFLG抗体（抗マウスFilaggrin抗体、COVANCE社）1μg/mlを使用し、二次抗体としてAnti-rabbit IgG-HRP（GE Healthcare社）を使用し、発色剤としてAmersham ECL Plus Western Blotting Detection Reagents（GE Healthcare社）を使用した。
　図１７（ａ）に電気泳動の結果を示した。PFGはプロフィラグリンのバンドを示し、FGはFLGモノマーのバンドを示す。また、図１７（ｂ）に、GAPDHに対するFLGモノマーの相対濃度（５サンプルの平均値）をグラフで示した。これらの結果から、化合物１を投与した場合、対照に比べて明らかなFLGモノマーの産生促進が確認された。
　以上詳述したように、本発明治療剤の有効成分であるGPR142アゴニストは、皮膚におけるFLGの産生を促進させ、角層の水分保持能やバリア機能を良好に改善し、FLG産生促進剤の有効成分として作用することが確認された。また、FLG産生低下に伴う皮膚疾患治療剤の有効成分としても作用しうる。また、GPR142アゴニストの一種であるＡ）N-キノリルベンズアミド誘導体（化合物１）、Ｂ）イベルメクチン（化合物２）又はＣ）フェニルアラニンアミド誘導体（化合物３）は、化学合成により容易に合成することができ、FLG産生低下に伴う皮膚疾患、特に、アトピー性皮膚炎の治療薬として有用である。さらに、GPR142を標的とし、FLG産生低下に伴う疾患治療剤のスクリーニングを系統的に行うことができる。

Claims (20)

  1. GPR142アゴニストを有効成分として含有するフィラグリン（FLG）産生低下に伴う疾患治療剤。
  2. FLG産生低下に伴う疾患が、皮膚疾患である請求項１記載の疾患治療剤。
  3. 皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎である、請求項２記載の疾患治療剤。
  4. 皮膚疾患が、尋常性魚鱗癬である、請求項２記載の疾患治療剤。
  5. GPR142アゴニストが、N-(4-アミノ-2-メチル-6-キノリル)-2-[(4-エチルフェノキシ)メチル]ベンズアミド又は製薬上許容されるその塩である、請求項１～４のいずれか１項に記載の疾患治療剤。
  6. GPR142アゴニストが、下記一般式（I）表される化合物又は製薬上許容されるその塩である、請求項１～４のいずれか１項に記載の疾患治療剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    [式中、R1及びR2は各々について水素原子、ハロゲン原子又は炭素数1～3のアルキル基を表し、R3は炭素数1～3のアルキル基を表し、R4は炭素数1～3のアルコキシカルボニル基又はヒドロキシカルボニル基を表し、R5、R6及びR7は各々について水素原子又はハロゲン原子を表す。]
  7. 請求項６記載の一般式（I）において、R1及びR2は水素原子を表し、R3はメチル基を表し、R4はエトキシカルボニル基又はヒドロキシカルボニル基を表し、R5、R6及びR7は水素原子を表すものである、請求項６記載の疾患治療剤。
  8. GPR142アゴニストが、イベルメクチンである、請求項１～４のいずれか１項に記載の疾患治療剤。
  9. FLG産生低下に伴う疾患の症状を改善するためのFLG産生低下に伴う疾患治療剤であって、GPR142アゴニストを有効成分として含有することを特徴とするFLG産生低下に伴う疾患治療剤。
  10. FLG産生低下に伴う疾患が、皮膚疾患である請求項９記載の疾患治療剤。
  11. アトピー性皮膚炎に伴う皮膚の角層の水分保持能及び／又はバリア機能低下を改善するためのアトピー性皮膚炎治療剤であって、GPR142アゴニストを有効成分として含有することを特徴とするアトピー性皮膚炎治療剤。
  12. GPR142アゴニストを有効成分として含有する、FLG産生促進剤。
  13. FLG産生低下に伴う疾患の症状を呈する患者に、GPR142アゴニストを有効成分として含有する薬剤を有効量投与して、当該患者の症状を改善することを特徴とするFLG産生低下に伴う疾患を治療する方法。
  14. FLG産生が低下しているアトピー性皮膚炎患者に、GPR142アゴニストを有効成分として含有する薬剤を有効量投与して、当該患者のアトピー性皮膚炎に伴う皮膚の角層異常を改善することを特徴とするアトピー性皮膚炎を治療する方法。
  15. 被験物質がGPR142の活性又は発現を促進し得るか否かを評価することを含む、FLG産生低下に伴う疾患治療剤のスクリーニング方法。
  16. 以下の(a)～(c)の工程を含む、請求項１５記載のスクリーニング方法。
    (a) GPR142発現細胞又はその膜画分と被験物質とを接触させる工程、
    (b)当該被験物質と接触させた後の当該細胞又はその膜画分におけるGPR142の活性又は発現を測定する工程、及び
    (c)当該細胞又はその膜画分におけるGPR142の活性又は発現を促進し得る物質を選択する工程。
  17. FLG産生低下に伴う疾患が皮膚疾患である、請求項１５又は１６記載のスクリーニング方法。
  18. 皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎である、請求項１７記載のスクリーニング方法。
  19. GPR142発現細胞が、GPR142遺伝子を含む発現ベクターで形質転換して得られたものである、請求項１５～１８のいずれか１項に記載のスクリーニング方法。
  20. GPR142遺伝子が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒトGPR142遺伝子又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつGPR142の活性を保持するヒトGPR142の機能的改変体をコードする遺伝子である、請求項１９記載のスクリーニング方法。
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