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WO2014000722A1 - Vorrichtung zur biochemischen markierung von geweben und zellkulturen und deren verwendung - Google Patents

Vorrichtung zur biochemischen markierung von geweben und zellkulturen und deren verwendung Download PDF

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Publication number
WO2014000722A1
WO2014000722A1 PCT/DE2013/000310 DE2013000310W WO2014000722A1 WO 2014000722 A1 WO2014000722 A1 WO 2014000722A1 DE 2013000310 W DE2013000310 W DE 2013000310W WO 2014000722 A1 WO2014000722 A1 WO 2014000722A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tub
trough
cell cultures
tissues
tilting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/DE2013/000310
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Markus Cremer
Karl-Heinz Beyer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of WO2014000722A1 publication Critical patent/WO2014000722A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N1/31—Apparatus therefor
    • G01N1/312—Apparatus therefor for samples mounted on planar substrates

Definitions

  • the invention relates to a device for biochemical labeling of tissues and cell cultures and their use.
  • the tissue samples or the brain slices are applied to slides, which are usually mounted vertically in holding devices. In this case, several slides can be fixed with samples in a holder.
  • solutions are, for example, buffer solutions, dye solutions or solutions which contain radioactive markers which are brought into contact with the tissue samples, for example brain slices. This work is done manually.
  • the core of the device consists of a tub for receiving tissues, which is equipped with means for tilting the tub.
  • the tissues are preferably on slides.
  • the means for tilting the tub may be a tilting table or a rack which receives the tub.
  • the means for tilting the tub are equipped with a motor which allows tilting of the tub.
  • the lines are each in connection with storage containers, which store liquids for the respective process steps.
  • storage containers which store liquids for the respective process steps.
  • n reservoirs which receive the necessary solutions, n being able to assume, for example, a value of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12. Accordingly, the same number n is provided on lines that connect the tub with the reservoirs.
  • valves are provided which allows regulation of the inflow of liquids.
  • the valves may be positioned in the conduit, at the reservoirs and / or at the entrances to the trough.
  • the pumps are not required, but advantageous because it can be well dosed. Through the dosage, currents in the tub can be better controlled.
  • the inlet channel is arranged substantially perpendicular to the liquid flow, which is passed into the trough. It is preferably arranged to direct the liquid from the reservoirs into the side region of the trough so that the liquid flow does not run directly over the cuts and any shearing forces that may occur are reduced.
  • cover plate over the slides that can prevent evaporation of liquid.
  • a liquid discharge is further attached, for example in the form of a drain valve, which is preferably located on the opposite side of the tub lines.
  • the tub is on a tempering, which is located on the means for tilting the tub.
  • the tempering can also be integrated in the bottom of the tub.
  • the tempering element may be a metal block or a metal plate.
  • the tempering element can be equipped with cooling and heating coils, which are connected via lines with thermostats. In this case, different thermostats can be operated independently of each other in the tempering, which are connected to different thermostats that keep different temperatures constant.
  • the temperature control coils are connected via lines with valves to the respective thermostat, so that optionally different temperature control circuits can be activated.
  • a temperature control for example, water, a water-glycerin mixture or commercially available coolant into consideration.
  • a cover plate for example made of Plexiglas, which protects the tissue samples or sections from external influences and prevents evaporation of the liquids used during the exposure time, can be located above the tub.
  • a lifting device can be mounted above the trough, which allows the insertion and removal of tissues or slides with tissues, brain slices or cell cultures in order to protect the possibly unfixed examination material from damage by the liquid jet.
  • the lifting device can be, for example, a plate or a grid on which the samples are located and which are connected with cables or chains which can be conveyed up and down by means of a motor via a thread.
  • the device according to the invention can be equipped with a blower or fan, which allows drying of the marked samples.
  • the means for tilting the tub, the valves that regulate the flow of liquids from the reservoirs, the drain valve and the thermostats or individual components from this group are connected to a controller, in which the respective timing of the influx of liquids from each container , the timing of the tilting of the tub, and the time course of the temperature of the heating element is programmed and the opening and closing of valves and the tilt angle of the tub, as well as the heating of the thermostats for the different temperature control circuits and / or opening or closing of Valves of the temperature control circuits or the drain valve controls.
  • a controller in which the respective timing of the influx of liquids from each container , the timing of the tilting of the tub, and the time course of the temperature of the heating element is programmed and the opening and closing of valves and the tilt angle of the tub, as well as the heating of the thermostats for the different temperature control circuits and / or opening or closing of Valves of the temperature control circuits or the drain valve controls.
  • the storage containers are filled with the necessary liquids.
  • These may be buffers, aqueous solutions, solutions of radiolabels, dyes and other liquids which may be contacted with the tissue or cell samples according to the time sequence.
  • Tissue samples are placed on microscope slides in the tub.
  • the tissue samples may be any type of cryostat or paraffin / microtome sections, in particular one Layer thickness in one to two-digit ⁇ range, for example, brain slices act.
  • large brain slices such as cuts of human or monkey brains can be introduced into the tub.
  • smaller brain slices such as mice, can also be used as the examination object.
  • the tissue samples are then in accordance with the Test course with changing liquids from the reservoirs acted upon. This can be done by placing the samples in the tub and then opening valves for the supply of liquid from a reservoir so that the samples are flooded.
  • the flooding can be done via a feed channel, which receives the liquid and the tub at the side areas supplies, so that the tissue sections are not affected by currents.
  • the inlet channel ends at a small distance from the wall of the tub, so that the liquid can run both laterally and over the front edge of the inlet channel into the tub.
  • the tissue to be marked can be spared, since the liquids do not strike the tissue frontally.
  • the empty tub can be filled by opening a valve for the supply of a liquid from a reservoir, and then the slides with tissue or brain slices, which are located on a plate, can be lowered from above into the tub until with the liquid submitted are covered.
  • This has the advantage that the surface of the tissue samples is not attacked by the flowing liquid.
  • the liquid is discharged via the liquid outlet.
  • the tilting device is raised at an angle to the horizontal and opened a possibly existing valve at the drain.
  • the slides with the tissue samples are previously lifted out of the tub again. This has the advantage that the surface of the tissue samples is not attacked by the flowing liquid. Furthermore, the lifted tissue samples can be dried by a fan before being reinserted into the tub.
  • the process is then repeated by means of a control unit after the programmed time sequence with liquids from different storage containers.
  • Various process steps can be carried out at different temperatures, as described for example in the special part of the description.
  • temperature ranges between see 4 ° C and 60 ° C, especially 4 ° C to 37 ° C, called.
  • Typical temperatures used are 22 ° C or 4 ° C.
  • the temperature of the heating element can be changed by switching on and off the supply of various fluid circuits of the thermostats as preprogrammed.
  • a saving of radioactive ligands for example tritium [3 H] -labeled neurotransmitters
  • a saving of radioactive ligands for example tritium [3 H] -labeled neurotransmitters, can be achieved by a reduced main incubation volume.
  • the user-independent incubation steps lead to error-free compliance with times for different process sections.
  • the temperature conditions are optimized and automatic control and logging of the process is possible.
  • the device can be used with all sub-combinations of the disclosed device features for the biochemical labeling of tissues and cell cultures.
  • the figures show the device according to the invention in a schematic form.
  • FIG. 5 shows a device according to the invention with lifting device
  • FIG. 6 shows a device according to the invention with lifting device before or after
  • FIG. 1 shows a device according to the invention.
  • reference numeral 1 denotes a trough in which slides 2, 2a, 2b are received, on which are located
  • the trough 1 is located on a means for tilting the trough 3. Between the means for tilting the trough 3 and the trough 1, a tempering 4 is positioned, on which the trough 1 is.
  • the tempering 4 is connected via lines 5, 5 a with thermostats 6, 6a in combination, which keeps the tempering 4 isothermally by means of a liquid circuit.
  • the tub 1 is connected via lines 7, 7a, 7b, 7c with reservoirs 8, 8a, 8b, 8c in combination, which supply them with necessary for the marking liquids.
  • pumps 9, 9a, 9b, 9c are mounted, which allow a supply of the liquid from the reservoirs 8, 8a, 8b, 8c.
  • the means for tilting the tub 3, the thermostats 6, 6a, and the pumps 9, 9a, 9b, 9c are connected to a control unit 10 in connection, which deliver control signals for the respective process steps.
  • a control unit 10 On the tub 1 is a liquid outlet 11 with a line 12 which leads into a collecting container 13.
  • FIG. 2 shows an inflow channel 18, via which the liquids from the storage containers 8 can be filled into the trough 1.
  • the bold line 19 indicates a flowed liquid covering the slides 2, 2a, 2b ....
  • FIG. 4 shows how the liquid in the trough 1 is discharged through the line 12 into the collecting container 13.
  • the means for tilting the tub 3 in the tilted state In this case, the means for tilting the tub 3 in the tilted state.
  • the fan 16 is in a lateral arrangement to the tub 1 and the plate for receiving slides 14 is located in a lifting device 20 with lifting means 21, which are in communication with a motor 22.
  • FIG. 6 shows the device according to FIG. 5 in a position in which the plate for picking up microscope slides 14 is lifted out by means of the lifting device 20.
  • Step 1 slides 2. 2a, 2b .... with cuts are placed in the tub 1.
  • Step 2 Water bath (tempering 4) is turned on and heats the tub 1 by means of the thermostat 6 a to room temperature (22 ° C).
  • Step 3 Pump 9 is turned on and pumps buffer (VIK) from the reservoir 8 to the cuts.
  • the inlet channel 18 swirls the buffer, so that no liquid jet reaches the cuts.
  • Step 4 Set incubation time is running, eg. B. 15 min.
  • Step 5 The means for tilting the tub 3 is turned on.
  • the tub 1 with the cuts is tilted to 45 °.
  • the VIK buffer passes through the liquid drain 1 1 and the hose 12 into the collecting container thirteenth
  • Step 6 The means for tilting the tub 3 moves back again.
  • Step 7 The pump 9a (HIK) is turned on and pumps buffer (HIK) from reservoir 8a to the cuts.
  • the inlet channel 18 swirls the buffer, so that no liquid jet reaches the cuts.
  • Step 8 The set incubation time runs, eg 60 min.
  • Step 9 The means for tilting the tub 3 is turned on. The tub 1 with the cuts is tilted to 45 °. The HIK buffer overflows the liquid drain 1 1 out.
  • Step 10 The means for tilting the tub 3 moves back again. Start / end of the washing steps:
  • Step 1 1 The water bath 6a is turned on and heats the tub 1 by means of the thermostat 6b to 4 ° C.
  • Step 12 The wash buffer supply pump 9b is turned on and pumps (pre-cooled) buffer onto the cuts.
  • the inlet channel 18 swirls the buffer, so that no liquid jet reaches the cuts.
  • Step 13 The set incubation time is running, e.g. 5 min.
  • Step 14 The means for tilting the tub 3 is turned on.
  • the tub 1 with the cuts is tilted to 45 °.
  • the buffer goes beyond the liquid drain 1 1 out.
  • Step 15 The means for tilting the tub 3 moves back again.
  • Step: 16 to 19: Repeat from step 1 1-15 > 2nd wash step.
  • Step 20 Step 12: The pump 9c (distilled water) is turned on and pumps (precooled) dist. Water from container 8c on the cuts.
  • the inlet channel 18 swirls the water, so that no liquid jet reaches the cuts.
  • Step 21 Set incubation time running, e.g. 2 sec.
  • Step 22 The means for tilting the tub 3 is turned on.
  • the tub 1 with the cuts is tilted to 45 °.
  • the water goes beyond the liquid outlet 11.
  • Step 23 Acoustic signal, so that the tub 1 can be placed with the cuts under the fan 16.
  • the cover plate 15 of the tub can also be raised by motor control and the fan is controlled directly. Operation of the control unit

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur biochemischen Markierung von Geweben und Zellkulturen und deren Verwendung. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst eine Wanne (1) zur Aufnahme von Gewebeschnitten oder Zellkulturen, die sich auf Mitteln zum Kippen der Wanne (3) befindet und die über Zuleitungen (7) mit Vorratsbehältern (8) in Verbindung steht, aus denen Lösungen zur biochemischen Markierung der Gewebe und Zellkulturen bezogen werden können. Die Lösungen werden in vorgegebener Reihenfolge mittels einer Steuerung (10) in die Wanne (1) geleitet, um die Gewebe oder Zellkulturen zu beaufschlagen. Nach einer Beaufschlagung mit einer Lösung wird die Wanne (1) gekippt und entleert. Danach wird die nächste Lösung in die Wanne (1) geleitet.

Description

B e s c h r e i b u n g
Vorrichtung zur biochemischen Markierung von Geweben und Zellkulturen
und deren Verwendung
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur biochemischen Markierung von Geweben und Zellkulturen und deren Verwendung.
In der medizinischen und biologischen Forschung werden nach dem Stand der Technik Ver- fahren zur biochemischen Markierung von Geweben aber auch von Zellkulturen eingesetzt. Bekannte Methoden sind die Autoradiographie, die in-situ-Hybridisierung oder die Immun- histochemie. Bei diesen Verfahren werden Gewebe mit unterschiedlichen Mitteln markiert. So findet eine radioaktive Markierung von Neurotransmittern statt, die an Rezeptoren anbinden oder radioaktive Sonden werden zur Markierung von Genabschnitten eingesetzt. Weiter- hin können mit Farbstoff oder radioaktiv markierte Antikörper eingesetzt werden. Anwendungen finden sich auch in der Histologie. Grundsätzlich kann jedes Gewebe untersucht werden, besonders interessant ist die Untersuchung von Hirnschnitten.
Bei den nach dem Stand der Technik verwendeten Verfahren werden die Gewebeproben oder die Hirnschnitte auf Objektträger aufgebracht, die meist senkrecht in Haltevorrichtungen befestigt werden. Dabei können mehrere Objektträger mit Proben in einer Halterung fixiert werden.
Diese Proben werden dann, je nach eingesetzten Verfahren, in einer bestimmten Reihenfolge in verschiedene Gefäße mit Lösungen gegeben, die auf sie einwirken. Bei den Lösungen handelt es sich beispielsweise um Pufferlösungen, Farbstofflösungen oder um Lösungen, die radioaktive Marker enthalten, die mit den Gewebeproben, beispielsweise Gehirnschnitten, in Kontakt gebracht werden. Diese Arbeiten werden manuell ausgeführt.
Bei der Vorgehensweise nach dem Stand der Technik besteht die Schwierigkeit, dass die durch eine Person durchgeführten Handlungen an eine streng vorgegebene Reihenfolge und Genauigkeit in der Durchführung gebunden sind, wobei es im Rahmen der Fehlergenauigkeit zu Abweichungen in der Durchführung kommen kann. Weiterhin werden bei dieser Vorgehensweise große Mengen an besonders wertvollen und teuren Stoffen gebraucht, was sehr hohe Kosten verursacht. Beispielsweise sind radioaktive Marker hochpreisige Substanzen, aber auch andere für die Prozesse notwendige Stoffe müssen aufwendig hergestellt werden und sind sehr teuer. Es besteht daher der Bedarf die Verfahren möglichst präzise reproduzierbar durchzuführen und teure Stoffe sparsam einzusetzen.
Es ist daher die Aufgabe der Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung von biochemischen Markierungen von Geweben, insbesondere von Gehirnschnitten oder Zellkulturen zu schaffen, mit der die Markierungsarbeiten hochpräzise und reproduzierbar durchgeführt werden können und die eine Einsparung von teurem Material, wie radioaktiven Markern und anderen wertvollen Lösungen ermöglicht.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist eine hochpräzise und reproduzierbare Durchführung von biochemischen Markierungsexperimenten möglich, die nicht vom manuellen Geschick des Experimentators abhängig ist, und es werden -gegenüber der manuellen Prozessie- rung - bis zu 60% der Kosten für Wertstoffe, wie beispielsweise radioaktive Marker, Antikörper oder Farblösungen, gegenüber dem manuellen Prozess eingespart. Die Temperaturbedingungen werden optimiert. Eine automatische Steuerung und Protokollierung wird ermöglicht.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.
Im Folgenden soll die Erfindung in ihrer allgemeinen Form beschrieben werden.
Das Kernstück der Vorrichtung besteht aus einer Wanne zur Aufnahme von Geweben, die mit Mitteln zum Kippen der Wanne ausgestattet ist. Die Gewebe befinden sich vorzugsweise auf Objektträgern.
Bei den Mitteln zum Kippen der Wanne kann es sich um einen Kipptisch oder um ein Gestell handeln, welches die Wanne aufnimmt.
Die Mittel zum Kippen der Wanne sind mit einem Motor ausgestattet, welcher ein Kippen der Wanne ermöglicht.
In die Wanne münden Leitungen ein, die sie mit verschiedenen Flüssigkeiten versorgen. Die Leitungen stehen jeweils mit Vorratsbehältern in Verbindung, die Flüssigkeiten für die jeweiligen Verfahrensschritte bevorraten. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind mindestens zwei Vorratsbehälter vorgesehen. Dabei ist ein Vorratsbehälter mit einer Lösung für die Markierung gefüllt und der andere mit einer Waschlösung. Je nach gewähltem Verfahren müssen n Vorratsbehälter vorhanden sein, die die notwendigen Lösungen aufnehmen, n kann dabei beispielsweise einen Wert von 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 oder 12 annehmen. Entsprechend ist auch die gleiche Anzahl n an Leitungen vorgesehen, die die Wanne mit den Vorratsbehältern verbinden.
Dabei sind Ventile vorgesehen, die eine Regulierung des Zustroms von Flüssigkeiten ermöglicht. Die Ventile können in der Leitung, an den Vorratsbehältern und/oder an den Eingängen zu der Wanne positioniert sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich an den Leitungen Pumpen, die die Lösungen in den Vorratsbehältern definiert fördern.
Wenn die Vorratsbehälter oberhalb der Wanne angeordnet sind, sind die Pumpen nicht erforderlich, jedoch vorteilhaft, da gut dosiert werden kann. Durch die Dosierung können auch Strömungen in der Wanne besser kontrolliert werden.
Vorteilhaft befindet sich in der Position, an der die Leitungen für die Zufuhr von Flüssigkeiten in die Wanne eintreten, eine Zulaufrinne, die die jeweilig zugeführte Flüssigkeit aufnimmt und eine ruhige Zufuhr der Flüssigkeit auf die Objektträger ermöglicht, so dass die Gewebeschnitte nicht beschädigt oder beeinträchtigt werden. Zu diesem Zweck ist es vorteilhaft, wenn die Zulaufrinne im Wesentlichen senkrecht zu dem Flüssigkeitsstrom, der in die Wanne geleitet wird, angeordnet ist. Sie ist vorzugsweise so angeordnet, dass sie die Flüssigkeit aus den Vorratsbehältern in den Seitenbereich der Wanne leitet, so dass der Flüssigkeitsstrom nicht direkt über die Schnitte läuft und möglicherweise auftretende Scherkräfte verringert werden.
Weiterhin kann sich über den Objektträgern eine Abdeckplatte befinden, die ein Verdunsten von Flüssigkeit verhindern kann.
An der Wanne ist weiterhin ein Flüssigkeitsablass beispielsweise in Form eines Ablassventils angebracht, das sich vorzugsweise auf der den Leitungen gegenüberliegenden Seite der Wanne befindet. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform steht die Wanne auf einem Temperierelement, welches sich auf dem Mittel zum Kippen der Wanne befindet. Das Temperierelement kann auch im Boden der Wanne integriert sein. Bei dem Temperierelement kann es sich um einen Metallblock bzw. eine Metallplatte handeln. Das Temperierelement kann mit Kühl- und Heizschlangen ausgestattet sein, die über Leitungen mit Thermostaten in Verbindung stehen. Dabei können in dem Temperierelement verschiedene unabhängig voneinander betreibbare Temperierschlangen vorliegen, die an verschiedenen Thermostaten angeschlossen sind, die unterschiedliche Temperaturen konstant halten. Die Temperierschlangen sind über Leitungen mit Ventilen mit dem jeweiligen Thermostaten verbunden, so dass wahlweise verschiedene Temperierkreisläufe aktiviert werden können. Als Temperiermittel kommen beispielsweise Wasser, ein Wasser-Glyceringemisch oder handelsübliche Kühlmittel in Betracht.
Über der Wanne kann sich eine Abdeckplatte, beispielsweise aus Plexiglas, befinden, die die Gewebeproben oder Schnitte vor äußeren Einwirkungen schützt und ein Verdunsten der eingesetzten Flüssigkeiten während der Einwirkdauer verhindert.
Vorteilhaft kann über der Wanne eine Hebevorrichtung angebracht sein, die ein Einbringen und Herausnehmen von Geweben bzw. Objektträgern mit Geweben, Hirnschnitten oder Zellkulturen ermöglicht, um das eventuell unfixierte Untersuchungsmaterial vor Beschädigungen durch den Flüssigkeitsstrahl zu schützen. Die Hebevorrichtung kann beispielsweise eine Platte oder ein Gitter sein, auf der sich die Proben befinden und die mit Seilen oder Ket- ten verbunden sind, die mittels eines Motors über ein Gewinde hoch und herunter gefördert werden kann.
Weiterhin kann die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem Gebläse bzw. Ventilator ausgestattet sein, welcher ein Trocknen der markierten Proben ermöglicht.
Die Mittel zum Kippen der Wanne, die Ventile, die den Zustrom von Flüssigkeiten aus den Vorratsbehältern regeln, das Ablassventil sowie die Thermostaten oder einzelne Komponenten aus dieser Gruppe sind an eine Steuerung angeschlossen, in der der jeweilige zeitliche Ablauf des Zustromes von Flüssigkeiten aus jedem Behälter, der zeitliche Ablauf der Kippung der Wanne, sowie der zeitliche Verlauf der Temperierung des Heizelements programmiert ist und die das Öffnen und Schließen von Ventilen und den Kippwinkel der Wanne, sowie die Beheizung der Thermostaten für die verschiedenen Temperierkreisläufe und/oder Öffnung bzw. Schließung von Ventilen der Temperierkreisläufe oder des Ablassventils steuert. Damit kann jedes gewünschte Verfahren automatisiert durchgeführt werden.
Bei Betrieb werden die Vorratsbehälter mit den notwendigen Flüssigkeiten befüllt. Dabei kann es sich um Puffer, wässrige Lösungen, Lösungen von Radiomarkern, Farbstoffen und anderen Flüssigkeiten handeln, die entsprechend der zeitlichen Abfolge mit den Gewebeoder Zellproben in Kontakt gebracht werden können.
In die Wanne werden Gewebeproben auf Objektträgern gelegt. Bei den Gewebeproben kann es sich um jedwede Art von Cryostat- oder Paraffin-/Mikrotomschnitten, insbesondere einer Schichtdicke im ein- bis zweistelligen μιη-Bereich, beispielsweise Hirnschnitte, handeln. Insbesondere große Hirnschnitte, wie Schnitte von Human- oder Affengehirnen können in die Wanne eingebracht werden. Es können jedoch auch kleinere Gehirnschnitte, wie beispielsweise von Mäusen, als Untersuchungsobjekt eingesetzt werden. Die Gewebeproben werden dann gemäß dem
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Versuchsverlauf mit wechselnden Flüssigkeiten aus den Vorratsbehältern beaufschlagt. Das kann geschehen, indem die Proben in der Wanne vorgelegt werden und anschließend Ventile für die Zuleitungen der Flüssigkeit aus einem Vorratsbehälter geöffnet werden, so dass die Proben geflutet werden. Die Flutung kann über eine Zulaufrinne erfolgen, die die Flüssigkeit aufnimmt und der Wanne an deren Seitenbereichen zuführt, so dass die Gewebeschnitte nicht durch Strömungen beeinträchtigt werden. Vorzugsweise endet die Zulaufrinne in einem geringen Abstand von der Wand der Wanne, so dass die Flüssigkeit sowohl seitlich als auch über die Vorderkante der Zulaufrinne in die Wanne laufen kann. Durch diese Maßnahmen kann das zu markierende Gewebe geschont werden, da die Flüssigkeiten nicht frontal auf das Gewebe auftreffen.
Alternativ kann die leere Wanne durch Öffnen eines Ventils für die Zufuhr einer Flüssigkeit aus einem Vorratsbehälter gefüllt werden, und anschließend können die Objektträger mit Gewebe- bzw. Hirnschnitten, die sich auf einer Platte befinden, von oben in die Wanne herabgelassen werden, bis sie mit der vorgelegten Flüssigkeit bedeckt sind. Das hat den Vorteil, dass die Oberfläche der Gewebeproben durch die strömende Flüssigkeit nicht angegriffen wird.
Nach einer vorgegebenen Einwirkzeit wird die Flüssigkeit über den Flüssigkeitsablass abgeführt. Dazu wird die Kippvorrichtung in einem Winkel zur Horizontalen angehoben und ein ggf. vorhandenes Ventil an dem Ablass geöffnet. In einer vorteilhaften Ausgestaltung werden die Objektträger mit den Gewebeproben zuvor wieder aus der Wanne herausgehoben. Das hat den Vorteil, dass die Oberfläche der Gewebeproben durch die strömende Flüssigkeit nicht angegriffen wird. Weiterhin können die herausgehobenen Gewebeproben durch einen Ventilator getrocknet werden, bevor sie wieder in die Wanne eingeführt werden.
Der Prozess wird dann mittels einer Steuereinheit nach der programmierten Zeitfolge mit Flüssigkeiten aus verschiedenen Vorratsbehältern wiederholt. Verschiedene Prozessschritte können bei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt werden, wie sie beispielsweise im speziellen Beschreibungsteil beschrieben sind. Beispielhaft können Temperaturbereiche zwi- sehen 4°C und 60°C, insbesondere 4°C bis 37°C, genannt werden. Typische zum Einsatz kommende Temperaturen sind 22°C oder 4°C.
Während den verschiedenen Befüllungszyklen kann die Temperatur des Heizelements durch Zu- und Abschalten der Zufuhr verschiedener Flüssigkeitskreisläufe der Thermostaten, wie vorprogrammiert, geändert werden.
Durch den Betrieb mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann eine Einsparung radioaktiver Liganden, beispielsweise Tritium [3 H] -markierte Neurotransmitter, durch ein reduziertes Hauptinkubationsvolumen erzielt werden. Die benutzerunabhängigen Inkubationsschritte führen zu einem fehlerfreien Einhalten von Zeiten für verschiedene Verfahrensabschnitte. Die Temperaturbedingungen sind optimiert und es ist eine automatische Steuerung und Protokollierung des Verfahrens möglich.
Erfindungsgemäß kann die Vorrichtung mit allen Unterkombinationen der offenbarten Vor- richtungsmerkmale für die biochemische Markierung von Geweben und Zellkulturen verwendet werden.
Spezieller Beschreibungsteil:
Im Folgenden wird die erfindungsgemäße Vorrichtung an Hand von Beispielen beschrieben, ohne dass diese Beispiele einschränkend auszulegen sind.
Die Figuren zeigen die erfindungsgemäße Vorrichtung in schematischer Form.
Es zeigen die Figuren:
Fig.1 : eine erfindungsgemäße Vorrichtung
Fig.2: eine erfindungsgemäße Vorrichtung in der Seitenansicht
Fig.3: eine erfindungsgemäße Vorrichtung während des Einfüllens von Pufferflüssig- keit
Fig.4: eine erfindungsgemäße Vorrichtung in Kippstellung
Fig.5: eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit Hebevorrichtung
Fig.6: eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit Hebevorrichtung vor oder nach der
Markierung von Proben. In Figur 1 ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung dargestellt. In ihr bezeichnet das Bezugszeichen 1 eine Wanne, in der Objektträger 2, 2a, 2b aufgenommen sind, auf denen sich
Gewebeschnitte oder Zellkulturen befinden. Die Wanne 1 befindet sich auf einem Mittel zum Kippen der Wanne 3. Zwischen dem Mittel zum Kippen der Wanne 3 und der Wanne 1 ist ein Temperierelement 4 positioniert, auf dem die Wanne 1 steht. Das Temperierelement 4 steht über Leitungen 5, 5 a mit Thermostaten 6, 6a in Verbindung, die das Temperierelement 4 mittels eines Flüssigkeitskreislaufes isotherm hält. Die Wanne 1 steht über Leitungen 7, 7a, 7b, 7c mit Vorratsbehältern 8, 8a, 8b, 8c in Verbindung, die sie mit für die Markierung notwendigen Flüssigkeiten versorgen. An den Leitungen 7, 7a, 7b, 7c sind Pumpen 9, 9a, 9b, 9c angebracht, die eine Zufuhr der Flüssigkeit aus den Vorratsbehältern 8, 8a, 8b, 8c ermöglichen. Das Mittel zum Kippen der Wanne 3, die Thermostaten 6, 6a, und die Pumpen 9, 9a, 9b, 9c stehen mit einer Steuereinheit 10 in Verbindung, die für die jeweiligen Verfahrensschritte Steuersignale abgeben. An der Wanne 1 befindet sich ein Flüssigkeitsablass 11 mit einer Leitung 12, die in einen Auffangbehälter 13 führt.
In Figur 2 haben gleiche Vorrichtungsmerkmale dieselben Bezugszeichen. In ihr ist in der Wanne 1 eine Platte zur Aufnahme der Objektträger 14 dargestellt. Über der Wanne 1 befindet sich eine Abdeckplatte 15. Oberhalb der Wanne ist ein Ventilator 16 angebracht. Die gestrichelten Linien bezeichnen Steuerleitungen 17 für das Kippen des Mittels zum Kippen der Wanne 17a, für das Öffnen und Verschließen des Ablassventils 17b, für das Regulieren der Thermostaten 17c, 17d und für das Öffnen und Schließen der Ventile bzw. Pumpen 17e und für die Regulierung der Zufuhr der Flüssigkeiten 17f . Das Bezugszeichen 18 beziffert eine Zulaufrinne. In Figur 3 wird eine Zulaufrinne 18 dargestellt, über die die Flüssigkeiten aus den Vorratsbehältern 8 in die Wanne 1 eingefüllt werden können. Die fett gedruckte Linie 19 bezeichnet eine geströmte Flüssigkeit, welche die Objektträger 2, 2a, 2b.... bedeckt.
In Figur 4 ist dargestellt, wie die sich in der Wanne 1 befindliche Flüssigkeit durch die Lei- tung 12 in den Auffangbehälter 13 abgelassen wird. Dabei ist das Mittel zum Kippen der Wanne 3 in gekipptem Zustand. In Figur 5 befindet sich der Ventilator 16 in seitlicher Anordnung zur Wanne 1 und die Platte zur Aufnahme von Objektträgern 14 befindet sich in einer Hebevorrichtung 20 mit Hebemitteln 21, die mit einem Motor 22 in Verbindung stehen.
Figur 6 zeigt die Vorrichtung gemäß Figur 5 in einer Position, in der die Platte zur Aufnahme von Objektträgern 14 mittels der Hebevorrichtung 20 herausgehoben ist.
Beispiel:
Die Arbeitsweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird an folgendem Ablauf, der in der Steuerung programmiert ist, beispielhaft dargestellt.
Start/Ende der Vorinkubation (VIK):
• Schritt 1 : Objektträger 2. 2a, 2b.... mit Schnitten werden in die Wanne 1 gelegt.
Schritt 2: Wasserbad (Temperierelement 4) wird eingeschaltet und heizt die Wanne 1 mittels des Thermostaten 6a auf Raumtemperatur (22°C).
• Schritt 3 : Pumpe 9 wird eingeschaltet und pumpt Puffer (VIK) aus dem Vorratsbehälter 8 auf die Schnitte.
Die Zulaufrinne 18 verwirbelt den Puffer, damit kein Flüssigkeitsstrahl auf die Schnitte gelangt.
• Schritt 4: Eingestellte Inkubationszeit läuft, z. B. 15 min.
• Schritt 5: Das Mittel zum Kippen der Wanne 3 wird eingeschaltet. Die Wanne 1 mit den Schnitten wird auf 45° gekippt. Der VIK-Puffer läuft über den Flüssigkeitsablass 1 1 und den Schlauch 12 in den Auffangbehälter 13.
• Schritt 6: Das Mittel zum Kippen der Wanne 3 fährt wieder zurück.
Start/Ende der Hauptinkubation (ΉΙΚ):
• Schritt 7: Die Pumpe 9a (HIK) wird eingeschaltet und pumpt Puffer (HIK) aus Vorratsbehälter 8a auf die Schnitte.
Die Zulaufrinne 18 verwirbelt den Puffer, damit kein Flüssigkeitsstrahl auf die Schnitte gelangt.
• Schritt 8: Die eingestellte Inkubationszeit läuft, z.B. 60 min. Schritt 9: Das Mittel zum Kippen der Wanne 3 wird eingeschaltet. Die Wanne 1 mit den Schnitten wird auf 45° gekippt. Der HIK-Puffer läuft über den Flüssigkeitsablass 1 1 hinaus.
Schritt 10: Das Mittel zum Kippen der Wanne 3 fährt wieder zurück. Start/Ende der Waschschritte:
Schritt 1 1 : Das Wasserbad 6a wird eingeschaltet und heizt die Wanne 1 mittels des Thermostaten 6b auf 4°C.
Schritt 12: Die Pumpe 9b für die Zufuhr von Waschpuffer wird eingeschaltet und pumpt (vorgekühlten) Puffer auf die Schnitte.
Die Zulaufrinne 18 verwirbelt den Puffer, damit kein Flüssigkeitsstrahl auf die Schnitte gelangt.
Schritt 13: Die eingestellte Inkubationszeit läuft, z.B. 5 min.
Schritt 14: Das Mittel zum Kippen der Wanne 3 wird eingeschaltet. Die Wanne 1 mit den Schnitten wird auf 45° gekippt. Der Puffer läuft über den Flüssigkeitsablass 1 1 hinaus.
Schritt 15: Das Mittel zum Kippen der Wanne 3 fährt wieder zurück.
Schritt: 16 bis 19: Wiederholung von Schritt 1 1-15 => 2. Waschschritt.
Start/Ende der Waschung mit dest. Wasser:
Schritt 20: Schritt 12: Die Pumpe 9c (dest. Wasser) wird eingeschaltet und pumpt (vorgekühltes) dest. Wasser aus Behälter 8c auf die Schnitte.
Die Zulaufrinne 18 verwirbelt das Wasser, damit kein Flüssigkeitsstrahl auf die Schnitte gelangt.
Schritt 21 : Eingestellte Inkubationszeit läuft, z.B. 2 sec.
Schritt 22: Das Mittel zum Kippen der Wanne 3 wird eingeschaltet. Die Wanne 1 mit den Schnitten wird auf 45° gekippt. Das Wasser läuft über den Flüssigkeitsablass 11 hinaus.
Schritt 23: Akustisches Signal, damit die Wanne 1 mit den Schnitten unter den Ventilator 16 gestellt werden kann. Optional kann die Abdeckplatte 15 der Wanne auch per Motorsteuerung angehoben werden und der Ventilator wird direkt angesteuert. Arbeitsweise der Steuereinheit
• Es werden (Steuerungs-) Impulse zu bestimmten Zeitpunkten abgegeben, z. B.„Ein => Start Motor".
• Moderne Komponenten (z. B. Labor-Pumpen oder Kipptisch) verfugen bereits über Schnittstellen, die mit der„Labview"-Software angesteuert bzw. ausgelesen werden können.
Nachfolgend ein Beispiel für die Steuerung der verschiedenen Komponenten:
Start: Ende: Ende: Start: Ende: Start: Start: usw. VIK VIK VIK HIK HIK WaWaschen schen
Pumpe 9 X
(VIK) VIK- Puffer
läuft
rein
Pumpe X
9a HIK-
(HIK) Puffer
läuft rein
Pumpe X
9b Wasch-
(WaPuffer schen) läuft
rein
Pumpe
9c
(Dest.)
KippX X
motor VIK- HIK- heben 3 Puffer Puffer
läuft ab läuft ab
KippX X
motor Wanne Wanne
senken 3 zurück in zurück in
AusAusgangsgangsposition position
TempeX X
ratur
6b:
4°C
TempeX X X X
ratur
6a:
22°C
Zeitach0 min 15 min 15 min 15 min 75 min 75 min 75 min usw. se 5 sec 10 sec 10 sec 15 sec 20 sec

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Vorrichtung zur biochemischen Markierung von Geweben oder Zellkulturen mit
- einer Wanne (1),
- Mitteln zum Kippen der Wanne (3),
- einem Flüssigkeitsablass (1 1), der sich an der Wanne (1) befindet,
- mindestens zwei Vorratsbehältern (8, 8a),
- Leitungen (7, 7a), die die Vorratsbehälter (8, 8a) und die Wanne 1 verbinden,
- Pumpen und/oder Ventile (9, 9a,), die eine Regulierung des Zustroms von Flüssigkeit von den Vorratsbehältern (8, 8a) zu der Wanne (1) ermöglichen sowie mit
- einer Steuereinheit (10), welche die Mittel zum Kippen der Wanne (3) und die Pumpen und/oder Ventile (9, 9a) ansteuert.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1
dadurch gekennzeichnet,
dass die Wanne (1) mit einem Temperierelement (4) in Kontakt steht oder es beinhaltet.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Temperierelement (4) mit mindestens einem Thermostaten (6) in Verbindung steht.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass an der Position der Wanne (1), in die die Zuleitungen (7, 7a...) münden, eine Zulaufrinne (18) angebracht ist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass sie eine Platte zur Aufnahme von Objektträgern (14) besitzt.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet, dass sie über eine Hebevorrichtung (20) mit Hebemitteln (21) verfügt, die die Platte zur Aufnahme der Objektträger (14) heben kann.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass sich über der Wanne (1) eine Abdeckplatte (15) befindet.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass sie über einen Ventilator (16) verfugt, der ein Trocknen von Proben ermöglicht.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
dass sich der Flüssigkeitsablass (1 1) an der Seite der Wanne (1) befindet, die dem Eintritt der Leitungen (7, 7a) gegenüber liegt.
10. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur biochemischen Markierung von Geweben und Zellkulturen.
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